CN108699514B - 汇集肝细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备冷冻保存的细胞(例如，肝细胞)的汇集或混合群体的新颖方法。具体地，本发明需要对由单个个体供给的细胞(例如肝细胞)进行快速解冻，混合所述细胞以产生异质群体然后冷冻保存。本发明还涉及多冷冻保存细胞的制备以在临近使用前增加活力。该过程需要减少暴露于化学和物理应力，以增加最终的活细胞数量。

Description

汇集肝细胞的方法
著作权声明
本专利申请文件的一部分公开内容包含受版权保护的材料(包括附图)。著作权所有人不反对任何人对美国专利商标局存档或记录中出现的专利文件或专利公开内容进行复制，但在其他任何方面保留所有著作权。
交叉引用和相关申请
本申请要求以下共同待审申请中的每一项的权益：2015年2月27日提交的美国专利申请号62/121,619，其全部内容通过引用纳入本文。
发明领域
本发明大致涉及汇集和冷冻保存来自多个供体的肝细胞。
背景技术
肝细胞构成肝脏中大约80％的细胞，并且对于许多药物化合物、毒素或外源性物质的活化和最终解毒都是关键的。在批准上市之前，对新药的需求和可及性的增加以及更严格的监管和安全性测试使得分离的原代肝细胞成为在实验室环境中研究药物代谢、功效和毒性的宝贵资源。
近年来，在原代供体肝细胞的分离和冷冻保存方面取得了显著进步，可以将原代供体肝细胞快速解冻并立即用于实验。然而，因为性别、年龄、种族、健康状况、遗传背景和其他因素的差异性使测试结果存在偏差，因此，研究从一个人类肝脏(个体供体)中分离出来的肝细胞中的肝脏代谢不能准确地反映总群体的肝功能。更准确地测定肝脏代谢使用的是各单个供体细胞的混合物或“汇集物”，以产生异质的肝细胞群。
现已提出了用于汇集肝细胞的许多方法。这些方案通常采用冗长的程序，其中细胞暴露于会减少活细胞总数的物理和化学应力。例如，美国专利7,604,929中的方法在第二和最终冷冻保存步骤前采用密度梯度离心步骤。这使细胞受到化学和机械应力，导致细胞减损(图1A-B)或使细胞变弱，使得它们在冷冻保存期间死亡。在WO 2014/045202A2中公开的另一方法在整个汇集过程中将肝细胞维持在冷冻保护剂溶液中。冷冻保护剂溶液包含有毒试剂，例如已知会导致细胞死亡的二甲基亚砜(DMSO)。
所提出的系统和方法寻求采用降低细胞减损的技术，从而增加整个过程中活细胞的总数。
发明内容
本申请力图增加肝细胞汇集过程中获得的活细胞的数量。一种用于冷冻保存来自多个来源的肝细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
A)解冻来自多个来源的肝细胞；
B)将来自多个来源的肝细胞汇集到保存溶液中；
C)将汇集的肝细胞进行离心以引起活肝细胞和无活力肝细胞成团；
D)去除保存溶液；
E)将成团的活肝细胞和成团的无活力肝细胞与冷冻保存剂合并；
F)将汇集的肝细胞分配到小瓶中；以及
G)将在小瓶中的肝细胞进行冷冻保存。
上述方法可以使用不同类型的肝细胞，所述肝细胞包括选自下组的那些：人肝细胞、猪肝细胞、猿肝细胞、犬肝细胞、猫肝细胞、牛肝细胞、马肝细胞、绵羊肝细胞和啮齿动物肝细胞。
各个体来源可以基于性别、种族、年龄，代谢状态或健康状况进行汇集。在某些情况下，基于当时存在的样本集，汇集物可以是随机的。
可以使用的保存溶液类型包括：威斯康星大学溶液(University of Wisconsinsolution)、Hypo Thermosol(低热熔胶)培养基、或Hypo Thermosol-FRS、以及降低冷冻保存剂的毒性和/或为肝细胞提供必需营养物质的其它类似保存溶液。例如，保存溶液可包括胎牛血清。
离心步骤没有密度梯度，以减少细胞上的物理和化学应力。该离心步骤使得活肝细胞和无活力肝细胞成团。
可以先将团块与与冷冻保护剂合并，再进行冷冻。当冷冻保存剂与成团细胞合并时，上下抽吸、涡旋、来回摇动小瓶、轻拍小瓶、或类似过程可用于使得细胞重悬于冷冻保存剂溶液中。
当通过等分试样或其它方法将成团的肝细胞分配到小瓶中时，汇集的细胞可以800-1500万个细胞/毫升的密度进行分配。在一实施方式中，使用1333万个细胞/毫升。
在汇集的肝细胞最终解冻后，使用者可以在进行实验之前立即进行密度梯度分离以分离开活细胞和无活力细胞。在一些情况下，密度梯度离心步骤在50RCF至200RCF之间进行。密度梯度分离可以包括通过涂覆有聚乙烯基吡咯烷酮的胶体二氧化硅颗粒(Percoll)进行密度离心。
可以对这些过程中使用的肝细胞进行铺板或在悬浮液中使用。
附图说明
图1A-B显示了在具有或有具有Percoll梯度的连续离心后活大鼠肝细胞的产率。
图2是用于汇集和冷冻保存来自个体供体的预先冷冻保存的肝细胞的方法示意图。
图3是从图2的最后一个冷冻保存步骤中分离出活细胞和无活力细胞的方法示意图。
具体实施方式
本文描述了用于从来自个体供体的预先冷冻保存的肝细胞制备冷冻保存的细胞(例如肝细胞)汇集物的得以改进的系统和方法的说明。该系统和方法减少了在汇集过程中对肝细胞的物理和化学应力，同时在最终使用者进行解冻后离心步骤期间，提高了汇集的活细胞的回收率。通常，该系统和方法包括解冻个体供体肝细胞的小瓶并将它们汇集到保存溶液中。然后，将汇集的细胞短暂离心，使得活细胞和无活力细胞成团，随后以高密度冷冻保存在多个小瓶中。然后，最终使用者可以在实验使用之前即刻进行密度梯度离心以使活细胞与无活力细胞分离。所提出方法的一些优点在于，在对汇集的肝细胞进行实验之前，减少了曝露于使活细胞数量减少的机械、化学和其它环境因素。
在一实施方式中，将来自个体供体的之前分离且冷冻保存的肝细胞储存在至少-150℃下的液氮气相中。可以随机或基于特定的代谢活性(例如ECOD、细胞色素P450、一般I期或II期)、年龄、种族，性别、族群或其它表型决定因素来选择待汇集的个体供体小瓶。解冻的小瓶数量取决于混合群中包含的个体数量和待生成的汇集物大小。例如，用于每个肝细胞集合物的个体小瓶数量可以是2至50个个体。每个汇集物的范围可以是300至1000个小瓶。例如，具有300个小瓶的10个供体的汇集物将会需要来自每个供体的约30个小瓶。
通过将小瓶浸没在保持在37℃的水浴中约2分钟或直到几乎看不到冰轴，然后将内容物迅速倒入包含4℃保存溶液的容器中来解冻各个供体肝细胞。保存溶液用于稀释冷冻保存剂中发现的DMSO(和/或对肝细胞有毒的任何其它试剂)。在一些情况下，保存溶液还为肝细胞提供必需营养物质，以促进汇集过程中的活力。保存溶液的体积取决于待产生的汇集物的大小，但可以包含，例如保存溶液与1mL冷冻保存细胞为1:1的比例。保存溶液可包括威斯康星大学溶液(10mM乳糖酸钾、25mM KH2P04、5mM MgSO4、30mM棉子糖、5mM腺苷、3mM谷胱甘肽、1mM别嘌呤醇和50g/L羟乙基淀粉)；HypoThermosol培养基(HTS培养基)，HypoThermosol-FRS(HTS-FRS)，或添加或不添加胎牛血清(FBS)的其它此类培养基。将肝细胞保持在4℃的保存溶液中，同时将多个小瓶的肝细胞解冻并在同一容器中进行混合以产生多个供体细胞的“汇集”群体。取决于要解冻的小瓶数量，解冻的肝细胞可以在保存溶液中保留2-10小时。
在解冻并汇集了多个小瓶的肝细胞后，将细胞在50-200相对离心力(RCF)的范围内离心8-10分钟，以使得活细胞和无活力细胞成团。例如通过吸吮从成团的细胞中去除保存溶液。此时在该过程中使用没有密度梯度的离心步骤，降低了第二次冷冻保存之前肝细胞上的物理和化学应力。图1A-B显示了与没有密度梯度的离心相比，密度梯度(例如Percoll)离心对肝细胞可能具有的影响。在随后的每次旋转的情况下，相对于没有Percoll离心的肝细胞，在具有密度梯度(Percoll)的情况下，活细胞的总数减少。这些结果表明用具有密度梯度的溶液离心减少了活细胞的总数。
在使细胞成团并去除了保存溶液后，立即将它们重悬在冷冻保护剂溶液中，该溶液例如可以包含含有10％DMSO的
Figure BDA0001776583000000051
然后，将汇集的无活力肝细胞和活肝细胞以1000-1500万细胞/毫升以每小瓶1-1.5mL等分分布。应该注意的是，细胞计数可以在没有或具有例如台盼蓝、吖啶橙或碘化丙锭的情况下沿着该过程的任何步骤进行。
合并或重悬过程可以包括向成团的肝细胞中加入冷冻保存剂。然后可以将合并的团块和冷冻保存剂上下抽吸、涡旋、来回摇动小瓶、轻拍小瓶、或进行一些其他类似过程，以使得团块粉碎并将肝细胞分散在整个冷冻保存剂中。
使用程序降温仪来冷冻含有汇集的肝细胞的小瓶，并在运输前在至少-150℃下在液氮中保持至少3天且不超过10年。可将小瓶在干冰或气相液氮(例如杜瓦瓶)上运输给最终使用者，并储存在至少-150℃的液氮中。在临近使用之前，最终使用者可以通过将小瓶浸没在保持在37℃的水浴中大约2分钟或直到几乎看不到冰轴来解冻汇集的肝细胞。
汇集的无活力肝细胞和活的肝细胞可以施加于涂覆有聚乙烯吡咯烷酮(Percoll)梯度的20-30％胶体二氧化硅，并在50-200RCF下离心8-10分钟以使活细胞和无活力细胞分离。因此，在临近使用前分离出了最大数量的活细胞，而不使它们进一步暴露于冷冻保存剂或另外的冷冻-解冻循环。该过程可允许回收500万个和多达800+万个活细胞并立即用于实验。实验可包括但不限于活力试验；代谢活性；转运活性；和外源性物质摄取、代谢、功效和毒性。
实施例1
用于从冷冻保存的个体供体肝细胞制备汇集的肝细胞的方法如图2所述，并在以下操作中阐述：
1-A.将来自10个个体供体的冷冻保存的肝细胞小瓶在37℃水浴中解冻约2分钟，直到几乎看不到冰轴。应该注意，一些汇集物可以包括500至900个小瓶，或者在本实施例中为50至90个小瓶/供体。
1-B.将解冻的肝细胞悬浮液(1mL)移液到含有500mL Hypo Thermosol-FRS保存溶液的1L烧杯中并保持在4℃以产生肝细胞汇集物。
1-C.将汇集的肝细胞在100G下从保存溶液(FRS)中离心出，离心10分钟以使活肝细胞和无活力肝细胞成团。
1-D.通过吸吮去除保存溶液，并将细胞在冷冻保护剂
Figure BDA0001776583000000061
CS 10培养基中温和重悬(例如，来回摇动)。使用台盼蓝排除法对细胞进行计数以确定细胞密度，并且如果需要，添加额外的冷冻保护剂溶液以实现约13.3×10Λ6个细胞/毫升。
1-E.将1.5毫升或约2000万个细胞等分到各个小瓶中。
1-F.将汇集的肝细胞小瓶在程序降温仪中冷冻保存，并储存在最低-150℃的液氮气相中。
最终使用者所进行的从汇集的肝细胞分离出活细胞的过程如图2所示，并在以下操作中阐述：
2-A.将汇集的肝细胞小瓶在37℃水浴中解冻约2分钟，直到几乎看不到冰轴。
2-B.将肝细胞悬浮液小心地施加至20-30％Percoll密度梯度。
2-C.将样品在200RCF下离心10分钟以分离活细胞和无活力细胞。
2-D.回收至少500万个活细胞并立即用于实验。
应该注意的是，活细胞的产率可以随着稀释比例和汇集过程中的暴露时间而变化。例如，在较大的批次中，有时成本过高或(汇集容器的体积)难以使保存溶液与解冻的冷冻保存剂的比例为1：1。此外，需要更多时间来解冻大量的小瓶。因此，细胞更长时间地暴露于浓度增加的冷冻保存剂毒素。有时，更容易对较小的批次进行操作，其中冷冻保存剂更稀并且汇集时间缩短，这通常导致活肝细胞的产率更高。例如，对于较大批次，步骤2-D可以产生500万个活细胞，但是在较小批次中产生了高达且超过800万个活细胞。在较小的批次中，保存溶液相对于解冻的冷冻保存剂的比例可以是4：1。
本文的方法可以应用于在悬浮液或铺板中使用的肝细胞。
尽管实施例描述的是肝细胞，但是该方法和过程可以应用于其他细胞类型。
本文所说明和所述的这些实施方式和特征是示例性的，并不意图进行限制，也不是对本申请的最后列出的权利要求书进行限制。多个组合和等效的组成部分、范围和步骤也被认为在本申请的范围内。

Claims (10)

1.一种用于冷冻保存来自多个来源的肝细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
A)解冻来自多个来源的肝细胞，所述来自多个来源的肝细胞保存在包含DMSO的冷冻保存溶液中；
B)将300至1000个小瓶的所述来自多个来源的肝细胞汇集到保存溶液中，从而稀释DMSO的浓度；
C)在50-200相对离心力(RCF)的范围内对汇集的肝细胞进行离心8-10分钟以引起活肝细胞和无活力肝细胞成团，离心步骤没有用密度梯度；
D)去除保存溶液；
E)将成团的活肝细胞和成团的无活力肝细胞与冷冻保存剂合并，形成汇集的成团的肝细胞；
F)将汇集的肝细胞分配到小瓶中；
G)对在小瓶中的肝细胞进行冷冻保存，形成汇集的冷冻保存的肝细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝细胞选自下组：人肝细胞、猪肝细胞、猿肝细胞、犬肝细胞、猫肝细胞、牛肝细胞、马肝细胞、绵羊肝细胞和啮齿动物肝细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多个来源包括基于性别、种族、年龄、代谢状态或健康状态的随机或预选组。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，保存溶液包含威斯康星大学溶液。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述保存溶液还包含胎牛血清。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，分配汇集的细胞以大于1000万个细胞/毫升的密度进行。
7.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括解冻来自步骤(G)的汇集的冷冻保存的肝细胞并施加密度梯度分离过程。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，密度梯度离心过程包括密度梯度离心，其在50相对离心力至200相对离心力之间进行。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述密度梯度分离包括通过涂覆有聚乙烯基吡咯烷酮的胶体二氧化硅颗粒进行密度离心。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将成团的肝细胞与冷冻保存剂合并还包括以下一个或多个步骤：上下抽吸、涡旋、来回摇动小瓶、或轻拍小瓶。
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