CN107304410A - 一种提高冷冻原代肝细胞复苏后细胞活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属生物技术领域,涉及生物材料保存技术,具体涉及一种体外哺乳动物肝细胞系统的复苏方法。本发明方法中将冷冻的原代肝细胞从液氮中取出水浴解冻后，将原冻存细胞液直接加入到含1 ml的incubation buffer，蓝染色后细胞计数并计算细胞活率；本方法省略了复苏原代肝细胞中的离心步骤，简化缩短了复苏原代肝细胞的方法时间；结果证明，通过避开离心步骤，能提高原代肝细胞的实际回收率和活性，便于后面试验的利用，以及未离心导致的DMSO的残留对原代肝细胞的代谢能力和活性无影响，本方法可以广泛被使用到药物在肝细胞中的代谢稳定性、肝细胞对药物的摄取评价等试验中。

Description

一种提高冷冻原代肝细胞复苏后细胞活性的方法

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及生物材料保存技术，具体涉及一种体外哺乳动物肝细胞系统的保存方法；尤其是一种提高冷冻原代肝细胞复苏后细胞活性的方法。

背景技术

在现代生物医药研发中，体外药物代谢动力学以及药物间的相互作用的研究是药物在非临床阶段的非常重要的评价方法。而人和动物的原代肝细胞是药物体外评价体系中不可缺少的试验材料。例如：对药物在肝细胞中的代谢稳定性评价，肝细胞对药物的转运性摄取评价，药物对肝细胞中的药物代谢酶的诱导以及抑制作用的评价等等都需要用到原代肝细胞作为测试体系。

研究显示，原代肝细胞作为无增殖能力的细胞，相对一般的实验用细胞株而言比较“脆弱”更容易受到外源性物质的影响。因此，保证原代肝细胞复苏后的高活性是顺利进行上述体外试验的重要因素。现有技术的复苏肝细胞的一般方法是需要经过低速500rpm，5分钟的离心后使原代肝细胞集中在离心管底部，以便去除冻存液。但实践显示，离心后的原代肝细胞的密度以及细胞活性与未离心的相比明显有下降趋势，表明离心对原代肝细胞的活性以及数量有影响，以致影响后续试验评价的准确性。基于此，本申请的发明人拟提供一种提高冷冻原代肝细胞复苏后细胞活性的方法。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术存在的问题，提供一种方便、有效的提高冷冻原代肝细胞复苏后的细胞活性和密度的方法。本方法不需要离心步骤能使复苏后的原代肝细胞提高活性，使其能够更好地正常地工作，便于体外药物评价试验的有效进行。

具体的，本发明的一种提高冷冻原代肝细胞复苏后细胞活性的方法，其特征在于，其包括：

将冷冻的原代肝细胞从-160°C液氮中取出，37°C水浴解冻后，将原冻存细胞液（大约1ml）直接加入到含有1 ml的incubation buffer，台盼蓝染色后，细胞计数并计算细胞活率；然后继续用incubation buffer将细胞密度稀释到试验所需条件，最后根据试验需求，铺板培养或者直接使用。

本发明使用的冻存细胞液配方如表1所示。

表1

本发明的一个实施例中，使用复苏原代肝细胞进行体外药物评价试验前，采用本方法对冷冻原代肝细胞复苏，结果显示，能有效提高原代肝细胞的实际回收率和活性，有利于后续试验的利用；本发明的另一个实施例中，采用本方法对冷冻原代肝细胞复苏，结果显示，未离心导致的DMSO的残留对原代肝细胞的代谢能力和活性无影响。

本发明的体外哺乳动物肝细胞系统的复苏方法，省略了复苏原代肝细胞一般方法中的离心步骤，简化缩短了复苏原代肝细胞的方法时间；结果证明了通过避开离心步骤，提高了原代肝细胞的实际回收率和活性，便于后面试验的利用；以及未离心导致的DMSO的残留对原代肝细胞的代谢能力和活性无影响。本方法可以广泛使用于药物在肝细胞中的代谢稳定性、肝细胞对药物的摄取评价等试验中。

具体实施方式

实施例1 比较离心后和未离心复苏的大鼠原代肝细胞的活性和密度试验

离心样本处理方法：将冷冻的大鼠原代肝细胞解冻后，加入到40 ml的thawingbuffer，500rpm低速离心5分钟后，去除上清，加入1 ml的incubation buffer后，台盼蓝染色，细胞计数并计算细胞活率；

未离心样本处理方法：将冷冻的大鼠原代肝细胞解冻后，直接加入到1 ml的incubation buffer，台盼蓝染色，细胞计数并计算细胞活率；

结果显示，未离心的肝细胞密度及活性基本与冷冻前的肝细胞的密度活率一致；然而，离心后的肝细胞，无论是在细胞密度还是活性上均显示有明显的下降，离心样本中肝细胞的活性和密度明显低于未离心的样本。

两组的细胞密度和活率比较如表2所示：

表2

实施例2 比较离心和未离心复苏的大鼠原代肝细胞对睾酮代谢能力试验

基于一般常规冷冻肝细胞复苏方法中离心的主要目的是去除冻存液中的DMSO。DMSO虽然作为常用的细胞冷冻保护剂被广泛使用，但是其自身对细胞具有一定的毒性作用。通常，如实施例1所述的未离心的方法中通过incubation buffer的稀释可明显降低DMSO的含量，但不能排除其对肝细胞的影响，本实施例进一步通过比较离心和未离心复苏的大鼠原代肝细胞对睾酮代谢能力判断DMSO对肝细胞机能是否存在影响。

本实施例中，按实施例1的方法将大鼠原代肝细胞解冻复苏后，用incubationbuffer将肝细胞密度稀释至2.0×10⁶cells/ml，将50 μl的肝细胞I相代谢标准底物-睾酮（终浓度1 μM）与50 μl的肝细胞溶液混匀，在37°C、5% CO₂条件下，孵育0和120 分钟，反应结束时加入400 μl预冷的含内标的甲醇终止反应，涡旋振荡1分钟，12,000 rpm 离心5分钟，取上清液，用LC-MS/MS方法测定睾酮的母体峰面积并计算睾酮的母体消失率；每个组别均设三个平行样本；

结果显示，未离心样本中含有的DMSO对肝细胞的代谢能力无明显影响，离心样本中的肝细胞代谢掉约97.7%的睾酮，而未离心的刚细胞代谢掉约92.8%的睾酮，统计显示，两组间的代谢能力无明显差异，实验结果表明，未离心样本中含有的DMSO对肝细胞的代谢能力无明显影响（如表3所示）。

表3

Claims (6)

1.一种提高冷冻原代肝细胞复苏后细胞活性的方法，其特征在于，其包括：

将冷冻的原代肝细胞从液氮中取出，水浴解冻后，将原冻存细胞液直接加入到含有1ml的incubation buffer，台盼蓝染色后，细胞计数并计算细胞活率；然后继续用incubation buffer将细胞密度稀释到试验所需条件。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液氮为-160°C。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，其中将原冻存细胞液1 ml直接加入到含有1ml的incubation buffer。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，其中采用37°C水浴解冻。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，将细胞密度稀释到试验所需条件后根据试验需求，铺板培养或者直接使用。

6.权利要求1所述的提高冷冻原代肝细胞复苏后细胞活性的方法在用于药物在肝细胞中的代谢稳定性以及肝细胞对药物的摄取评价试验中的用途。