CN109913416B

CN109913416B - 一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法

Info

Publication number: CN109913416B
Application number: CN201910318399.0A
Authority: CN
Inventors: 王灵娟; 张怡; 刘艳青
Original assignee: Tianqing Stem Cell Co ltd
Current assignee: Tianqing Stem Cell Co ltd
Priority date: 2019-04-19
Filing date: 2019-04-19
Publication date: 2022-09-09
Anticipated expiration: 2039-04-19
Also published as: CN109913416A

Abstract

一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，本发明涉及一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法。本发明的目的是为了解决现在使用生理盐水进行复苏冷冻的脐带血造血干细胞的前期处理，细胞很容易聚团、细胞碎片增多、活率降低以及细胞数量减少的问题，方法为：一、配置缓冲液；二、去除纤维蛋白的血浆；三、向缓冲液中加入低分子肝素钠、羟乙基淀粉和聚乙二醇；最后加入去除纤维蛋白的血浆，即完成。本发明保护剂能够有效保护细胞的活率，细胞不容易聚团，细胞集落形成较好，能够有效保护复苏后造血干细胞细胞的活性，细胞数量，细胞不聚团，保证集落的形成力；本发明应用于造血干细胞复苏后保护剂的配制领域。

Description

一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法

技术领域

本发明涉及一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法。

背景技术

脐血指的是新生儿出生后，经脐带结扎断脐时静脉切开或是穿刺，收集引流获得的胎盘和脐带近胎儿一侧血管内的血液。脐血中间质干细胞和造血干细胞含量较为丰富。脐血造血干细胞是一种原始细胞，具有较强的分化潜能，且形成集落的能力和增殖分化能力，受到特定因素的诱导或是影响，脐血造血干细胞可以分化为各种组织或是细胞。CD34⁺细胞在脐血有核细胞中所占比重在1％左右，这一特征比较接近骨髓，且其含量明显高于外周血。

脐带血因具有来源广泛、采集方便、免疫配型要求低、移植后移植物抗宿主病(GVHD)发生率低等优点,为造血干细胞(HSC)的重要来源之一,为需要接受异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)的患者提供1种可靠的HSC来源。脐血和脐带来源的干细胞除了可以治疗血液疾病外，还能用于自身免疫性疾病、黏多糖病等其他疾病，如可以用来治疗恶性肿瘤疾病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、骨髓异常增殖综合症等、血红蛋白与血液异常病(如地中海性贫血)、先天性代谢性疾病、先天性免疫缺陷疾患、自身免疫性疾患(如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮)、某些实体肿瘤(如小细胞肺癌、神经母细胞瘤等)。

自1989年Gluckman等在世界上首例用脐血造血干细胞代替骨髓移植治疗Fanconic贫血获得成功。大量研究表明，脐血中多能造血干细胞比较高，并含有一定量发育不成熟的前身辅助T细胞和前身细胞毒T细胞，这些T细胞亚群的发育不成熟表型表达不足，对同种异体抗原的应答能力较弱，使得脐血移植后GVHD的发生较少而不太严重，另外由于其免疫学上的不成熟还可使供体和受体HL匹配范围更大，加之脐血容易采集，制备提取有核细胞后能够在液氮中长期保存不失其特性，急用时可立即获取。脐血造血干细胞(HSCs)在扩增能力和免疫反应性方面较骨髓HSCs具有显著的优越性，而且脐血无伦理学限制，应用脐血干细胞移植(CBSCT)治疗造血系统疾病，重建造血能力，已取得较好的临床效果。

脐血造血干细胞移植技术具有较高的临床应用价值，以及广阔的应用前景，然而，这一治疗技术还存在部分有待于进一步解决的难题，包括急性移植物抗宿主病和复发、移植后免疫重建延迟、单份脐血中造血干细胞数量有限等。目前CBSCT存在的主要问题是单份脐血所含HSCs数量少，由于脐带血的体积小、细胞数量有限,其所含的造血干/祖细胞(HS/PC)数量有限,往往不能满足高体重儿童及成年患者allo-HSC移植使用，利用脐血干细胞具有的高增殖和体外扩增潜能，有可能解决单份脐血HSCs数量不足的限制。

发明内容

本发明的目的是为了解决现在使用生理盐水进行复苏冷冻的脐带血造血干细胞的前期处理，细胞很容易聚团、细胞碎片增多、活率降低以及细胞数量减少的问题，提供了一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法。

本发明一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，按以下步骤进行：一、配置缓冲液：称取氯化钠3～3.5g、氯化钾0.1～0.2g、氯化镁0.1～0.2g、醋酸钠1～1.5g、枸橼酸钠0.2～0.3g、葡萄糖酸钙0.3～0.4g和海藻糖0.2～0.3g；然后将氯化钠、氯化钾、氯化镁、枸橼酸钠依次溶于480～520mL去离子水中，搅拌至完全融化，加入葡萄糖酸钙和海藻糖，搅拌至溶解，静止8～12min，加入醋酸钠，搅拌均匀，静止4～6min,调节pH值在7.0-7.2之间，得到缓冲液；二、去除纤维蛋白的血浆：向血浆中加入氯化钙溶液，振摇4～6min，通过密度梯度离心，取液相，得到去除纤维蛋白的血浆，于4℃低温或-20℃冷冻保存；三、向步骤一配置的缓冲液中加入低分子肝素钠，混匀，加入羟乙基淀粉，混匀，加入聚乙二醇，混匀后，4℃预冷，得到保护剂，保护剂中低分子肝素钠终浓度为14-16mol/mL；羟乙基淀粉终浓度为9-11mol/mL，聚乙二醇的体积浓度为2-3％；四、向步骤三配制的保护剂中加入去除纤维蛋白的血浆，去除纤维蛋白的血浆和保护剂的体积比为1：4，即得到用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂。

本发明的保护剂用于冷冻后脐血造血干细胞复苏后的保护，由于细胞长时间在室温条件下，会对细胞的活率产生一定的影响，使细胞活率及各方面功能降低而影响回输后的临床治疗效果。本发明中的保护剂添加大分子保护剂，能够在一定时间内有效保护细胞的活率，细胞不容易聚团，细胞集落形成较好，细胞数量优于其他种类保护剂，冻存前细胞数量为5.15*10⁸，数小时后细胞数量为4.81*10⁸；本研究发明的造血干细胞复苏后的保护剂，能够有效保护复苏后造血干细胞细胞的活性，细胞数量，细胞较散，不聚团，能够保证集落的形成力；本发明的保护剂能够保护复苏后的造血干细胞，冻存前细胞活率95.2％，数小时后，活率为90.2％，活率变化不显著，显著优于其他三种保护剂；本研究发明的保护剂，也可用于其他种类的细胞复苏后的保护，能够有效保护细胞的活性和细胞数，细胞增殖功能及分化能力等，本发明涉及的三种试剂均可安全用于人体和动物回输，用于临床试验；本发明涉及的三种试剂成本较低，单份样本的用量较少，方便购买和使用。

附图说明

图1为保护剂为生理盐水时的流式检测细胞检测图；

图2为保护剂为细胞培养基时的流式检测细胞检测图；

图3为保护剂为复方电解质时的流式检测细胞检测图；

图4为采用实施例一制备的保护剂时的流式检测细胞检测图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，按以下步骤进行：一、配置缓冲液：称取氯化钠3～3.5g、氯化钾0.1～0.2g、氯化镁0.1～0.2g、醋酸钠1～1.5g、枸橼酸钠0.2～0.3g、葡萄糖酸钙0.3～0.4g和海藻糖0.2～0.3g；然后将氯化钠、氯化钾、氯化镁、枸橼酸钠依次溶于480～520mL去离子水中，搅拌至完全融化，加入葡萄糖酸钙和海藻糖，搅拌至溶解，静止8～12min，加入醋酸钠，搅拌均匀，静止4～6min,调节pH值在7.0-7.2之间，得到缓冲液；二、去除纤维蛋白的血浆：向血浆中加入氯化钙溶液，振摇4～6min，通过密度梯度离心，取液相，得到去除纤维蛋白的血浆，于4℃低温或-20℃冷冻保存；三、向步骤一配置的缓冲液中加入低分子肝素钠，混匀，加入羟乙基淀粉，混匀，加入聚乙二醇，混匀后，4℃预冷，得到保护剂，保护剂中低分子肝素钠终浓度为14-16mol/mL；羟乙基淀粉终浓度为9-11mol/mL，聚乙二醇的体积浓度为2-3％；四、向步骤三配制的保护剂中加入去除纤维蛋白的血浆，去除纤维蛋白的血浆和保护剂的体积比为1：4，即得到用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂。

本实施方式的保护剂用于冷冻后脐血造血干细胞复苏后的保护，由于细胞长时间在室温条件下，会对细胞的活率产生一定的影响，使细胞活率及各方面功能降低而影响回输后的临床治疗效果。本实施方式中的保护剂添加大分子保护剂，能够在一定时间内有效保护细胞的活率，细胞不容易聚团，细胞集落形成较好，细胞数量优于其他种类保护剂，本研究发明的造血干细胞复苏后的保护剂，能够有效保护复苏后造血干细胞细胞的活性，细胞数量，细胞较散，不聚团，能够保证集落的形成力；本实施方式的保护剂能够保护复苏后的造血干细胞，冻存前细胞活率95.2％，数小时后，活率为90.2％，活率变化不显著，显著优于其他三种保护剂；本研究发明的保护剂，也可用于其他种类的细胞复苏后的保护，能够有效保护细胞的活性和细胞数，细胞增殖功能及分化能力等，冻存前细胞数量为5.15*10⁸，数小时后细胞数量为4.81*10⁸；本实施方式涉及的三种试剂均可安全用于人体和动物回输，用于临床试验；本实施方式涉及的三种试剂成本较低，单份样本的用量较少，方便购买和使用。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中称取氯化钠3.12g、氯化钾0.15g、氯化镁0.11g、醋酸钠1.025g、枸橼酸钠0.254g、葡萄糖酸钙0.322g和海藻糖0.25g。其他与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中将氯化钠、氯化钾、氯化镁、枸橼酸钠依次溶于500mL去离子水中。其他与具体实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中加入葡萄糖酸钙和海藻糖，搅拌至溶解，静止10min，加入醋酸钠，搅拌均匀，静止5min。其他与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一中采用质量浓度为1％的氢氧化钠或质量浓度为1％的盐酸调节pH值至7.0-7.2。其他与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中血浆和氯化钙溶液的比例为1:8。其他与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤二中氯化钙溶液的质量浓度为1％。其他与具体实施方式一至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：保护剂中低分子肝素钠终浓度为15mol/mL；羟乙基淀粉终浓度为10mol/mL。其他与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：保护剂中聚乙二醇的体积浓度为2.5％。其他与具体实施方式一至八之一相同。

采用以下实施例验证本发明的有益效果：

试验1：一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，按以下步骤进行：一、配置缓冲液：称取氯化钠3.12g、氯化钾0.15g、氯化镁0.11g、醋酸钠1.025g、枸橼酸钠0.254g、葡萄糖酸钙0.322g和海藻糖0.25g；然后将氯化钠、氯化钾、氯化镁、枸橼酸钠依次溶于500mL去离子水中，搅拌至完全融化，加入葡萄糖酸钙和海藻糖，搅拌至溶解，静止10min，加入醋酸钠，搅拌均匀，静止5min，采用质量浓度为1％的氢氧化钠或质量浓度为1％的盐酸调节pH值在7.0-7.2之间，得到缓冲液；二、去除纤维蛋白的血浆：向血浆中加入质量浓度为1％的氯化钙溶液，振摇5min，通过密度梯度离心，取液相，得到去除纤维蛋白的血浆，于4℃低温或-20℃冷冻保存；三、向步骤一配置的缓冲液中加入低分子肝素钠，混匀，加入羟乙基淀粉，混匀，加入聚乙二醇，混匀后，4℃预冷，得到保护剂，保护剂中低分子肝素钠终浓度为15mol/mL；羟乙基淀粉终浓度为10mol/mL，聚乙二醇的体积浓度为2.5％；四、向步骤三配制的保护剂中加入去除纤维蛋白的血浆，去除纤维蛋白的血浆和保护剂的体积比为1：4，即得到用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂。

脐带血的无菌采集，加入HES分步离心，除去血浆和红细胞，(血浆后期使用，保存在-20℃冰箱中)。排出红细胞，剩余20ml左右，停止排红细胞，进行取样1ml，用作分离后冷冻前细胞计数和流式检测。冷冻前将分离后的有核细胞在4℃冰箱内保存。将遇冷到4℃的冻存液从冰箱内拿出，设定注射泵和摇床具体参数(流速40ml/h，注入体积8ml，摇床转速120rpm/min)。注射结束后，将冷冻袋中多余的气体排出，4℃保存静止30min,转入液氮中冷冻保存，待复苏。

分离造血干细胞在液氮中冷冻3个月以上时间后，取出进行37℃水浴复苏2min，将复苏后的样本转移离心管内，加入本实施例配置好的保护剂，离心清洗，747g,15min,4℃。通过使用不同的保护剂(生理盐水，细胞培养基，复方电解质，本实施例配置的保护剂)，对同一份样本分为不同组进行同样的操作处理，分别对其复苏后的造血干细胞的活率、细胞数进行检测，细胞聚团情况、集落形成情况，细胞流式进行检测分析，验证本实施例所配置的保护剂对复苏后的细胞的保护作用。

将相同体积和细胞数的冷冻脐带血复苏后，通过使用生理盐水，复方电解质，培养基和本发明配置的保护剂分别进行清洗，对放置0.5h,1.5h,3h分别进行其细胞进行计数(表2)，计活(表1)，细胞结团情况及细胞团的细胞数量(表3)，集落形成情况(表4)，流式表达情况进行检测，

表1使用不同保护剂细胞活率对比研究结果

从表1可以看出，冻存前细胞活率95.2％，采用本实施例配制的保护剂保护复苏后的造血干细胞数小时后，活率为90.2％，活率变化不显著，显著优于其他三种保护剂。

表2使用不同保护剂细胞数对比研究结果

从表2可以看出，冻存前细胞数量为5.15*10⁸，采用本实施例配制的保护剂保护复苏后的造血干细胞数小时后细胞数量为4.81*10⁸。

表3使用不同保护剂细胞聚团情况对比

从表3可以看出，采用本实施例配制的保护剂保护复苏后的造血干细胞，细胞松散，聚团直径仅为0.1cm，聚团细胞活率90.5％。

表4不同保护剂处理细胞后集落形成情况对比

从表4可以看出，采用本实施例配制的保护剂保护复苏后的造血干细胞，集落形成数更多，说明细胞增殖功能及分化能力更好。

流式检测细胞检测图如图1-4所示，由图1-图4可知，不同保护剂保护的细胞表型差异不显著。

综上所述，放置相同时间生理盐水，培养基，复方电解质清洗后的细胞活率，细胞数量及细胞聚团数量显著低于本发明保护剂(p≤0.01)，并且细胞聚团较显著，吹打细胞团后计数，细胞数量减少，死亡细胞多，细胞碎片增多，导致活率显著降低，通过使用本发明配置的保护剂处理后的造血干细胞的细胞数和细胞活率较冻存前活率和数量相比呈差异不显著，并且显著高于其它三种保护剂；通过集落培养发现，不同保护剂保护复苏后的造血干细胞后，本发明的保护剂保护后的细胞损伤较小，集落形成能力高于其它三种保护剂；通过流式检测细胞表型发现，不同保护剂保护的细胞表型差异不显著。

Claims

1.一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，其特征在于该配制方法按以下步骤进行：一、配置缓冲液：称取氯化钠3～3.5g、氯化钾0.1～0.2g、氯化镁0.1～0.2g、醋酸钠1～1.5g、枸橼酸钠0.2～0.3g、葡萄糖酸钙0.3～0.4g和海藻糖0.2～0.3g；然后将氯化钠、氯化钾、氯化镁、枸橼酸钠依次溶于480～520mL去离子水中，搅拌至完全融化，加入葡萄糖酸钙和海藻糖，搅拌至溶解，静止8～12min，加入醋酸钠，搅拌均匀，静止4～6min,调节pH值在7.0-7.2之间，得到缓冲液；二、去除纤维蛋白的血浆：向血浆中加入氯化钙溶液，振摇4～6min，通过密度梯度离心，取液相，得到去除纤维蛋白的血浆，于4℃低温或-20℃冷冻保存；三、向步骤一配置的缓冲液中加入低分子肝素钠，混匀，加入羟乙基淀粉，混匀，加入聚乙二醇，混匀后，4℃预冷，得到保护剂，保护剂中低分子肝素钠终浓度为14-16mol/mL；羟乙基淀粉终浓度为9-11mol/mL，聚乙二醇的体积浓度为2-3％；四、向步骤三配制的保护剂中加入去除纤维蛋白的血浆，去除纤维蛋白的血浆和保护剂的体积比为1：4，即得到用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂。

2.根据权利要求1所述的一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，其特征在于步骤一中称取氯化钠3.12g、氯化钾0.15g、氯化镁0.11g、醋酸钠1.025g、枸橼酸钠0.254g、葡萄糖酸钙0.322g和海藻糖0.25g。

3.根据权利要求1所述的一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，其特征在于步骤一中将氯化钠、氯化钾、氯化镁、枸橼酸钠依次溶于500mL去离子水中。

4.根据权利要求1所述的一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，其特征在于步骤一中加入葡萄糖酸钙和海藻糖，搅拌至溶解，静止10min，加入醋酸钠，搅拌均匀，静止5min。

5.根据权利要求1所述的一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，其特征在于步骤一中采用质量浓度为1％的氢氧化钠或质量浓度为1％的盐酸调节pH值至7.0-7.2。

6.根据权利要求1所述的一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，其特征在于步骤二中血浆和氯化钙溶液的比例为1:8。

7.根据权利要求1或6所述的一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，其特征在于步骤二中氯化钙溶液的质量浓度为1％。

8.根据权利要求1所述的一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，其特征在于保护剂中低分子肝素钠终浓度为15mol/mL；羟乙基淀粉终浓度为10mol/mL。

9.根据权利要求1所述的一种用于冷冻的脐带血造血干细胞复苏后保护剂的配制方法，其特征在于保护剂中聚乙二醇的体积浓度为2.5％。