CN109122665A - 以冻存脐带组织保存多种干细胞的方法、复苏方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及以冻存脐带组织保存多种干细胞的方法、复苏方法及应用，具体步骤包括：采用对脐带组织进行清洗之后剪成组织段、剥离间质华通氏胶组织；利用含有DMSO的α‑MEM保护剂预处理，置于4‑10℃进行浓度平衡10‑20分钟，后低温离心，去除上清液；加入右旋糖酐或胎牛血清与含有DMSO的α‑MEM保护剂共同构成冻存液，采用程控降温或分级降温的方式对组织进行冻存。本发明的冻存方法可有效保护冻存脐带组织，而且方便进行后续的复苏操作，且复苏后的组织培养出的细胞活性与新鲜组织中的细胞无差别。

Description

以冻存脐带组织保存多种干细胞的方法、复苏方法及应用
技术领域
本发明涉及生命科学技术领域，具体涉及以冻存脐带间质组织保存多种干细胞的方法、复苏方法及应用。
背景技术
脐带是哺乳类动物连接胎儿和胎盘的管状结构，由两条动脉和一条静脉组成，在其间隙中可以看到疏松、胶状的间充质。人脐带中的华通氏胶(Wharton’s Jelly)组织可分离得到间充质干细胞(Mesenchymol Stem Cells，MSC)、上皮干细胞(epithelial stemcell，ESC)以及内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)等多种干细胞，脐带来源的MSC具有来源广泛、取材方便、相对纯净、含量丰富及免疫原性低等优点，每15～20g脐带华通氏胶组织可以分离得到约107原代MSC。MSC目前发现的可阳性表达CD13、CD29、CD44、CD73、CD90(Thy-1)、CD105(endoglin)和CD166，但不表达CD14、CD34、CD38和CD45。2006年国际细胞治疗协会已制定并发布了MSC应具有形态学、免疫表型和诱导分化3个生物学特征指标[3]。已证实，MSC是一类可分化成中胚层多种组织的多能成体干细胞，而且已被证实[4]MSC能够分化成脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞等，而且它在体内和体外还具有调节和抑制免疫反应的能力。目前在临床对多种疾病具有一定的效果，因此储存MSC可为医学提供大量的素材。
目前，行业内脐带MSC的保存做法是，先从华通氏胶中分离得到MSC，再经过20天的培养以扩增培养到一定数量细胞后进行深低温保存。但该方法周期长，制备成本高，而且脐带中的其他类型的组织和剩余的华通氏胶组织都将被作为废弃物丢弃，造成了样本资源浪费。因此，研发一种能够保存多种干细胞即完整、快速保存脐带组织的方案显得十分重要。
中国发明专利(CN201710948676.7)公开了一种脐带组织冻存、复苏方法，该发明采用细胞团块而非单个细胞进行冻存，降低细胞受损凋亡的概率，但是此方法仍为细胞冻存，未实现真正意义上的组织冻存。本发明直接从组织块进行冻存，提高冻存及复苏效率和得率。
中国发明专利(CN201711424190.X)公开了一种脐带组织冻存复苏方法，其技术方案实际记载了冻存过程中的所用到的多种玻璃化液，其实际内容是对于冻存保护液的设计，并没有完整的脐带组织冻存方案，且冻存过程中保护液种类繁多，分三步进行冻存，且冻存包括脐静脉和华通氏胶，不同组织采用同一冻存方法可能会影响冻存效果，本发明直接采用程序降温控制降温速率，简化降温过程，有效保护冻存活性，并冻存纯的华通氏胶组织，保证冻存质量。
中国发明专利(CN201611082580.9)公开了一种脐带组织冻存液及冻存方法，其技术方案详细记载了一种冻存保护液，对于冻存过程没有详细的设计，其实际内容也是提供了一种新的冻存保护剂，未公开具体的冻存步骤.而本发明通过详细对比试验确定了最佳冻存方案。
中国发明专利(CN201810066298.4)公开了一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用，其技术方案记载了一种冻存保护液的配方及这种冻存保护液的制作步骤，而其关于脐带组织冻存中仍然记载的是对于培养后细胞团的冻存方法，未完全实现组织冻存，本发明采用分离处理后直接冻存方法，缩短制备周期，提高得率。
因此，本发明提供一套真正对脐带华通氏胶组织进行冻存及复苏的方案，用于提高脐带保存的工作效率，并且可以将整根脐带的华通氏胶全部保存，实现对多种干细胞的保存，减少样本资源浪费。现有技术中对脐带组织的预处理工序比较简单，造成冻存的组织中含水量过高，影响冻存效果。另外，现有技术中所采用的程序控制降温冻存方法都是基于细胞冻存进行设计的，在进行脐带华通氏胶组织冻存时需要进行重新设计。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明设计了一种针对人脐带全部脐带间质组织的冻存方法，该方法是以冻存组织的形式来保存其来源的多种干细胞，不仅包括间充质干细胞，还包括脐带上皮干细胞、内皮祖细胞等，包括以下步骤：
A.华通氏胶分离，生理盐水洗涤脐带2-3次，用组织剪剪去脐带两头再涮洗2次，后用尖头直剪将脐带剪成2cm的小段，之后沿其静脉血管平行方向剪开小口，剪开小口可以更容易的进行血管剥离，充分获得华通氏胶组织，再用组织镊纵向撕开，展平，将3根血管以及羊膜从脐带中剥离干净，剩余华通氏胶部分用生理盐水充分洗涤，转移至离心管中，剪至1-2cm3小块；
特别的，该方法分离的组织为单一类型的组织，适合采用某种特定的冻存方法，并且富含间充质干细胞，同时包括内皮祖细胞、上皮干细胞等；细胞与细胞之间保留了非细胞化的成分，可以更好的保护其中干细胞。
B.进行预处理，离心管中加入含有DMSO的α-MEM保护剂浸没全部组织块，4～10℃下进行浓度平衡10～20分钟，后低温离心，去除上清液，放入冻存管中；使用保护剂浸泡组织块，可使组织块充分的吸收冻存保护剂，进行离心后，可将组织块中的水分充分去除，防止因水分过多而造成冻存过程中细胞的损害；
特别的，该步骤的具体过程可以显著提高保存细胞的质量，其他已公开的专利未做明确规定。
C.组织冻存，向冻存管中加入右旋糖酐或胎牛血清，重悬华通氏胶小块，再加入含有DMSO的α-MEM保护剂构成冻存保护剂，后对组织进行降温冻存。
优选的，组织冻存包括以下三种方案：
(1)所述α-MEM保护剂中的DMSO体积比为5％-15％，加入的胎牛血清占冻存液总量的体积比为50％-65％，所述降温冻存方式为程序控制降温冻存；
(2)所述α-MEM保护剂中的DMSO体积比为5％-15％，加入的右旋糖酐占冻存液总量的体积比为50％-65％，所述降温冻存方式为程序控制降温冻存；
(3)所述α-MEM保护剂中的DMSO体积比为5％-15％，加入的右旋糖酐占冻存液总量的体积比为50％-65％，所述降温冻存方式为分级降温慢冻。
上述组织冻存方案1和2中运用的程序控制降温冻存的方法为：3～6℃保持4～10min；以2～5℃/min降至-10℃，保持12～20min；以0.5～3℃/min降至-50℃，保持5～10min；以35～55℃/min降至-90℃，保持5～15min，最后将组织装入液氮保存。
优选的，程序控制降温冻存的方法为4℃保持6min；以3℃/min降至-10℃，保持15min；以1℃/min降至-50℃，保持7min；以40℃/min降至-90℃，保持10min，最后将组织装入液氮保存。
特别的，程控降温法能够控制冻存温度和时间，使冻存过程步骤可控、冻存质量稳定、可追溯，目前公开专利未使用此方法。
上述组织冻存方案3中运用的分级降温慢冻的方法为：将组织放入预冷的程序降温盒中，转入低温冰箱24h，再转入液氮罐中。
进一步的，所述方案(1)中α-MEM保护剂中的DMSO体积比为10.5％，加入的胎牛血清占冻存液总量的体积比为55％。
进一步的，所述方案(2)中α-MEM保护剂中的DMSO体积比为12％，加入的右旋糖酐占冻存液总量的体积比为55％。
进一步的，所述方案(3)的α-MEM保护剂中的DMSO体积比为12％，加入的右旋糖酐占冻存液总量的体积比为55％。
同时本发明设计了一种脐带冻存组织的复苏方法，所述复苏方法为，a.将组织冻存管从液氮中取出快速放入已事先准备好的37℃恒温水浴中，并不停在水中划动，直到组织解冻80％，再将组织冻存管放于洁净工作台中；b.解冻的组织块快速转入已预冷的含有α-MEM培养基的离心管中，于低温离心，去除上清液；c.再于低温离心，去除上清液。
还有，本发明设计的脐带组织冻存方法可在脐带组织冻存中进行应用。
与现有技术相比，本发明设计的脐带组织冻存及复苏方法具有以下进步。首先，本发明的方法是针对完整、单一的脐带华通氏胶组织进行冻存，有效地提高了脐带华通氏胶组织的利用率，实现了同时对脐带组织中多种干细胞的保存，减少了样本资源浪费；再者，本方法所设计的脐带组织预处理方法可以更好的分离得到更多的华通氏胶组织，同时经保护剂浸泡和离心预处理可以更好的去除华通氏胶组织中的水分，避免冻存过程水分对细胞的影响；还有，本方法的程控降温冻存过程快速，整个脐带华通氏胶组织的冻存能够在很短的时间段内完成，有效地提高了华通氏胶组织的冻存效率；最后，利用本方法进行冻存的脐带华通氏胶组织冻存3个月以上，进行复苏经检测后能够保证接近100％的间充质干细胞的活性，有效提高了冻存的效果。
附图说明
图1示出了新鲜组织HE染色后低倍显微镜下的观察结果。
图2示出了新鲜组织HE染色高倍显微镜下观察的结果。
图3示出了冻存3个月后的组织HE染色低倍显微镜下观察的结果。
图4示出了冻存3个月后HE染色高倍显微镜下观察的结果。
图5示出了冻存3个月后组织分离出的MSC流式检测结果，符合MSC的表型特征。
图6示出了新鲜组织的成脂分化结果。
图7示出了冻存组织的成脂分化结果。
图8示出了新鲜组织的成脂分化结果。
图9示出了冻存组织的成骨分化结果。
从图1-4中可以看出，新鲜组织对照组和冻存组在HE染色后在低倍镜和高倍镜下均无明显差别；而从图6-9中可以看出，对照组新鲜组织块和实验组冻存3个月后的组织块获得的MSC细胞在成脂分化和成骨分化实验中均能够正常分化产生相应细胞。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
本发明的脐带组织冻存方法如下：
先将进行冻存的脐带组织进性华通氏胶的分离,在细胞培养皿中，用生理盐水将脐带充分洗涤，用组织剪将脐带两端剪去，再涮洗；而后用尖头直剪将脐带剪成小段，清洗；再将每一小段的脐带沿静脉血管平行方向剪开小口，后用组织镊纵向撕开，展平；再小心地将血管以及羊膜从脐带中剥离干净，剩余华通氏胶(Wharton’s Jelly)部分用生理盐水充分洗涤3次，剪至1～2cm3小块。
对剥离的华通氏胶组织预留出1份组织块作为对照实验进行实验。对照试验包括三部分：1、取1块新鲜组织块放入10％中性福尔马林中固定，送至委托的独立医学实验室进行HE染色观察，并记录放大10×40倍的染色结果；
2、将剩余的新鲜组织块于MSC完全培养基中培养，每天记录细胞生长数；
3、取第二代细胞，用胰酶消化呈单细胞悬液，接种于6孔板中，进行接种，每孔加入2ml完全培养基，将细胞于37℃，5％CO2培养箱中进行培养3天全量换液一次，直到细胞达到60％融合时，分成两组培养基分别更换成脂诱导和成骨诱导培养基。每隔一段时间用同样的培养基换一次液，成骨诱导组行半量换液，成脂诱导组全量换液。诱导14天后，对成脂诱导的MSC进行油红O染色观察红色油滴；诱导21天对成骨诱导的MSC进行茜素红染色，观察钙结节，并记录实验结果。
对剩余分离得到的华通氏胶进行预处理，将华通氏胶小块均分放入3只50ml的离心管中，并向其中分别加入含有体积比为5％、10.5％、12％的二甲基亚砜(DMSO)的α-MEM保护剂使组织全部浸没，分别置于4-10℃进行浓度平衡10-20min。平衡后低温离心，去上清，最后称量华通氏胶小块重量，将每一支离心管中的华通氏胶小块平分成60份进行冻存实验，其中每支离心管的60份华通氏胶小块每5份设为一组，作为平行实验，装入180支已标记好的冻存管中，共分为36组。
最后进行组织冻存，根据实验分组，向已标记的冻存管中分别加入右旋糖酐(DEX)或者胎牛血清(FBS)，重悬华通氏胶小块组织，再加入含有DMSO的α-MEM保护剂构成冻存保护剂，后对各冻存管组织进行降温冻存。
此处选用的α-MEM生产厂家为：Gibco 500ml包装；
DMSO生产厂家为：WAK 70ml包装。
所述冻存降温采用以下两种方案：
(A)程控降温冻存的程序为：4℃保持6min；以3℃/min降至-10℃，保持15min；以1℃/min降至-50℃，保持7min；以40℃/min降至-90℃，保持10min，最后将组织装入液氮保存。
(B)分级慢冻的程序为：将冻存管放入低温预冷的程序降温盒中，转入低温冰箱24h，再转入液氮罐中。
其中，加入的胎牛血清或右旋糖酐所占总冻存液的体积比以及α-MEM保护剂中的DMSO占比含量如下表1、2所示进行设计正交试验构成冻存液并编号：
表1加入胎牛血清(FBS)的冻存液中DMSO含量占比
表2加入右旋糖酐(DEX)的冻存液中DMSO含量占比
DEX含量 5％DMSO含量 10.5％DMSO含量 12％DMSO含量
50％ 11 12 13
55％ 14 15 16
65％ 17 18 19
在进行组织冻存时，将36组冻存管平均分成A组和B组两大组，两组分别按上表所示不同配比组合构成冻存保护剂编号，即为进行组织冻存时的冻存保护剂，分别编号为A1-A19和B1-B19。
按下表所示将两大组冻存管中的A1-A19采用程控降温冻存的方式进行降温冻存，B1-B19采用分级慢冻的方式进行降温冰冻，设计正交试验如下：表3
表4
36组冻存管置于液氮中冻存3个月后分别进行组织复苏，各冻存管按以下方法进行组织复苏：
a将组织冻存管从液氮中取出快速放入已事先准备好的37℃恒温水浴中，并不停在水中划动，直到组织解冻80％，再将组织冻存管放于洁净工作台中；b解冻的组织块快速转入已低温预冷的含有α-MEM培养基的离心管中，低温条件下离心，去除上清液；c再于低温条件下温度下离心，去除上清液。
取与对照组实验相同量的处理后的组织用MSC完全培养基培养，并对细胞成长情况进行记录。
从复苏的各实验组中分别取一块组织块，放入10％中性福尔马林中固定，送至委托的独立医学实验室进行HE染色观察，并记录放大10×40倍的染色结果。
对复苏的华通氏胶组织进行细胞分化潜能的确定
分别取36组培养得到的第2代细胞，用胰酶消化制成单细胞悬液，接种于6孔板中，每孔加入2ml完全培养基，将细胞于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。一段时间全量换液一次，直到细胞达到60％融合时，同一组的培养基分别更换成脂诱导和成骨诱导培养基，每隔一段时间用同样的培养基换一次液。诱导一段时间后，对成脂诱导的MSC进行油红O染色观察红色油滴，诱导一段时间后对成骨诱导的MSC进行茜素红染色，观察钙结节。同时与没有进行冻存的组织块的诱导培养实验进行对比。
实验结果
通过对MSC完全培养基培养的细胞生长情况进行观察计数并与对照组的细胞生长情况进行对比，得出实验结果如下表所示，其中每组取5个平行实验的平均数作为最后的结论数，每组细胞生长情况占对照组比例如下表所示：
表5
实验第一阶段完成36组样本冻存，从上述表5的记录结果显示：采用程序控制降温冻存的脐带华通氏胶组织冻存3个月复苏后都能达到90％以上的活性，其中采用55％胎牛血清联合程控降温冻存的A5号实验组、55％右旋糖酐联合程控降温冻存的A16号实验组可以得到100％的MSC培养细胞；采用分级降温冻存的脐带华通氏胶组织冻存3个月复苏后都能达到80％以上的活性。其中采用55％右旋糖酐联合分级降温冻存的B16号实验组，组织冻存3个月后能获得接近100％的MSC培养细胞。
实施例二
采用表1加入胎牛血清(FBS)的冻存液中DMSO含量占比中的5号实验组的冻存保护剂的配方进行脐带华通氏胶组织冻存实验。
选取一段脐带，脐带华通氏胶组织的分离与预处理过程按实施例1的方法进行，预留一份作为对照试验组。剩余均分装入15根冻存管中，加入5号实验组的冻存保护剂，每5个冻存管作为一组，进行程序控制降温冻存。
一组采用的程序控制降温冻存程序为：3℃保持4min；以2℃/min降至-10℃，保持12min；以0.5℃/min降至-50℃，保持5min；以35℃/min降至-90℃，保持5min，最后将组织装入液氮保存。
二组采用的程序控制降温冻存程序为：4℃保持6min；以3℃/min降至-10℃，保持15min；以1℃/min降至-50℃，保持7min；以40℃/min降至-90℃，保持10min，最后将组织装入液氮保存。
三组采用的程序控制降温冻存程序为：6℃保持10min；以5℃/min降至-10℃，保持20min；以3℃/min降至-50℃，保持10min；以55℃/min降至-90℃，保持15min，最后将组织装入液氮保存。
冻存三个月后按实施例1的方法进行复苏、培养、观察，并记录培养细胞生长情况，与对照组进行比较。并统计得到记录数据如表6所示：
实验组编号 一组 二组 三组
实验结果 95.9％ 100％ 95.3％
由上表通知数据可知，三中程序控制降温冻存分案得到的冻存组织冻存3个月后均可达到95％以上活性。
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。

Claims (10)

1.以冻存脐带组织保存多种干细胞的方法，其特征在于，以冻存脐带间质组织的形式保存脐带中相关的多种干细胞，冻存方法包括以下步骤：
A.华通氏胶分离：使用生理盐水洗涤脐带2-3次，用组织剪剪去脐带两头再涮洗2次，后用尖头直剪将脐带剪成2cm的小段，之后沿其静脉血管平行方向前开小口，再用组织镊纵向撕开、展平，将3根血管以及羊膜从脐带中剥离干净，剩余华通氏胶部分用生理盐水充分洗涤3次，转移至离心管中，剪至1-2cm3的小块；
B.进行预处理：离心管中加入含有DMSO的α-MEM保护剂浸没全部组织块，置于4～10℃进行浓度平衡10～20分钟，后离心，去除上清液，放入冻存管中；
C.组织冻存：向冻存管中加入右旋糖酐或胎牛血清，重悬华通氏胶小块，再加入含有DMSO的α-MEM保护剂构成冻存保护剂，后进行组织降温冻存。
2.根据权利要求1所述的冻存方法，其特征在于，其中所述冻存保护剂中的DMSO的体积比为5％-15％，加入的右旋糖酐或胎牛血清占冻存保护剂总体积的体积比为50％-65％。
3.根据权利要求2所述的冻存方法，其特征在于，其中所述组织降温冻存是按照程控降温方法进行，所述程控降温方法步骤为：3～6℃保持4～10min；以2～5℃/min降至-10℃，保持12～20min；以0.5～3℃/min降至-50℃，保持5～10min；以35～55℃/min降至-90℃，保持5～15min，最后将组织装入液氮保存。
4.根据权利要求3所述的冻存方法，其特征在于，所述程控降温方法的步骤为：4℃保持6min；以3℃/min降至-10℃，保持15min；以1℃/min降至-50℃，保持7min；以40℃/min降至-90℃，保持10min，最后将组织装入液氮保存。
5.根据权利要求2所述的冻存方法，其特征在于，其中所述组织降温冻存是按照分级慢冻方法进行，所述分级慢冻方法的步骤为：放入预冷的程序降温盒中，转入低温冰箱保存24h，再转入液氮中保存。
6.根据权利要求4所述的冻存方法，其特征在于，其中所述冻存保护剂中的DMSO体积比为10.5％，加入的胎牛血清占冻存保护剂总体积的体积比为55％。
7.根据权利要求5所述的脐带组织冻存方法，其特征在于，其中所述冻存保护剂中的DMSO体积比为10.5％，加入的胎牛血清占冻存保护剂总体积的体积比为55％。
8.根据权利要求4所述的脐带组织冻存方法，其特征在于，其中所述冻存保护剂中的DMSO体积比为12％，加入的右旋糖酐占冻存保护剂总体积的体积比为55％。
9.一种对冻存的脐带组织进行复苏的方法，其特征在于包括以下步骤：
a.将组织冻存管从液氮中取出快速放入已事先准备好的37℃恒温水浴中，并不停在水中划动，直到组织解冻80％，再将组织冻存管放于洁净工作台中；
b.解冻的组织块快速转入已预冷的含有MEM培养基的离心管中，于低温离心，去除上清液；
c.再低温离心，去除上清液。
10.权利要求1-7任一项所述的方法在脐带组织冻存中的应用。
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