CN109511651A - 一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及冻存液技术领域，且公开了一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法。该人脐带间充质干细胞无血清冻存液，包括以下组成及其体积百分比：基础培养基20‑80%；血小板裂解液5‑30%；速溶蛋白多糖母液1‑10%；海藻糖母液5‑25%。该人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，通过用血小板裂解液及海藻糖替换原有的动物血清和DMSO，具有可长时间维持UC‑MSCs的活性，显著提高细胞的存活率，制备简单、安全等优点。有效的解决了DMSO作为渗透性保护剂，它能快速渗入细胞内，减少细胞暴露在有害环境的时间，但是它在常温下对细胞有毒性作用，常温下操作时间需尽快；FBS会增加动物病原污染的机率，这都会给细胞以后的使用增加不确定因素的问题。

Description

一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法

技术领域

本发明涉及冻存液技术领域，具体为一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法。

背景技术

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）是来源于早期中胚层的成体干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是造血微环境中的一种重要的细胞成分，可以向多种组织如骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱、脂肪及基质细胞增殖分化，而且免疫原性弱，是组织工程立项的种子细胞来源。人脐带间充质干细胞（human umbilical cordmesenchymal stem cells，hUC-MSCs）来源于新生儿脐带中的华通氏胶，除具有MSCs的所有特性外，还具有含量丰富，细胞纯净，免疫原性更低，细胞原始、分化能力更强，无伦理限制等优势，可为实验和临床提供充足的细胞来源，具有广阔的临床应用前景，虽然UC-MSC在脐带组织中的含量很丰富，但若是每次科研或临床使用都直接原代培养，很不现实，这就需要对新鲜分离的UC-MSCs进行冻存，这是实现UC-MSCs应用价值的必要步骤。

海藻糖作为一种非还原性糖，自身性质稳定，广泛存在于生物界中，它既是一种贮藏性糖类，又是应急代谢的重要产物，能够保护生物细胞和生物活性物质（如蛋白质、核酸等）在干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下免遭破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。海藻糖的这一独特功能特性是自然界其他糖类均不具备的，与许多生物在胁迫环境下表现出的抗逆耐受力有直接关系。

血小板裂解液是血小板经细胞裂解后的液态衍生物，不仅去除了细胞结构，降低了免疫原性，而且还释放并保留了存在于血小板内部的多种生长因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子β、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、白细胞介素1等。血小板裂解液中包含的这些因子对于UC-MSC的增殖具有促进作用，与动物血清培养的MSCs相比，细胞形态、免疫表型、分化能力等生物学特性没有影响。

现有的细胞冷冻保护剂基本都是细胞基础培养基（如DMEM，RPMI1640等）+胎牛血清（FBS）10~20%+二甲基亚砜（DMSO）10%。DMSO属于渗透性保护剂，它能快速渗入细胞内，减少细胞暴露在有害环境的时间，但是它在常温下对细胞有毒性作用，常温下操作时间需尽快；FBS会增加动物病原污染的机率，这都会给细胞以后的使用增加不确定因素，并且现有技术中的细胞冻存液除了安全问题外，细胞活性下降快，很难长时间维持细胞活率也是急需解决的。因此，寻找一种可以替代DMSO和动物血清冻存细胞的冻存液，具有非常重要的意义。

发明内容

（一）解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，具备不含胎牛血清、DMSO等不安全成分，可长时间维持UC-MSCs的活性，显著提高细胞的存活率，制备简单、安全等优点，解决了现有的细胞冷冻保护剂基本都是细胞基础培养基+胎牛血清（FBS）10~20%+二甲基亚砜（DMSO）10%，DMSO属于渗透性保护剂，它能快速渗入细胞内，减少细胞暴露在有害环境的时间，但是它在常温下对细胞有毒性作用，常温下操作时间需尽快；FBS会增加动物病原污染的机率，这都会给细胞以后的使用增加不确定因素的问题。

（二）技术方案

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液，包括以下组成及其体积百分比：

基础培养基20-80%；

血小板裂解液5-30%；

速溶蛋白多糖母液1-10%；

海藻糖母液5-25%。

进一步的，包括以下组成及其体积百分比：

基础培养基58%；

血小板裂解液25%；

速溶蛋白多糖母液2%；

海藻糖母液15%。

进一步的，所述基础培养基为DMEM/F12，所述血小板裂解液来源于人脐带血，所述速溶蛋白多糖母液来源于螺旋藻。

进一步的，所述速溶蛋白多糖母液浓度为50mg/ml，所述海藻糖母液浓度为1mol/L。

进一步的，所述速溶蛋白多糖母液和海藻糖母液均经0.2μm滤膜过滤除菌。

进一步的，一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下制备方法：

S1、制备原料：取适量的F12培养基和DMEM培养基，按体积比为I:I进行混合，得到DMEM/F12培养基，从螺旋藻中提取出速溶蛋白多糖，并与纯净水混合，得到浓度为50mg/ml的速溶蛋白多糖母液，取适量的海藻糖与纯净水混合，得到浓度为1mol/L的海藻糖母液。

S2、过滤除菌：取适量的速溶蛋白多糖母液和海藻糖母液通过0.2μm滤膜进行过滤除菌。

S3、混合搅拌：取基础培养基20-80%倒入无菌试剂瓶内，然后取血小板裂解液5-30%倒入无菌试剂瓶内，最后取过滤后的速溶蛋白多糖母液1-10%和海藻糖母液5-25%倒入无菌试剂瓶内，通过血清移液管进行吹打混匀，得到人脐带间充质干细胞无血清冻存液。

本发明提供了一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，具备以下有益效果：

该人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，通过设置血小板裂解液，血小板裂解液是全血经过密度梯度离心获得浓缩血小板，再经多次反复冻融后，血小板裂解而获得的液体成分，其特点是去除了血小板膜和其他细胞残片，降低了免疫原性，而且还释放并保留了存在于血小板内部的多种生长因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子β、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、白细胞介素1等。血小板裂解液中包含的这些因子对于UC-MSC的增殖具有促进作用，与动物血清培养的MSCs相比，细胞形态、免疫表型、分化能力等生物学特性没有影响。通过用血小板裂解液和海藻糖替换原有的动物血清和DMSO，使该人脐带间充质干细胞无血清冻存液，不含胎牛血清、DMSO等不安全成分，可长时间维持UC-MSCs的活性，显著提高细胞的存活率，制备简单、安全等优点，有效的解决了现有的细胞冷冻保护剂基本都是细胞基础培养基+胎牛血清（FBS）10~20%+二甲基亚砜（DMSO）10%，DMSO属于渗透性保护剂，它能快速渗入细胞内，减少细胞暴露在有害环境的时间，但是它在常温下对细胞有毒性作用，常温下操作时间需尽快；FBS会增加动物病原污染的机率，这都会给细胞以后的使用增加不确定因素的问题，同时，通过设置速溶蛋白多糖母液，速溶蛋白多糖母液中使用的速溶蛋白多糖，是来源于螺旋藻，螺旋藻内的蛋白质为水溶性蛋白，所含的18种氨基酸之间含量的比例又与人体吸收的比例非常接近，不需要经过复杂的加工即可被人和动物直接消化吸收，便于UC-MSCs吸收所需蛋白质。

该人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括海藻糖母液，海藻糖作为一种非还原性糖，自身性质稳定，广泛存在于生物界中，它既是一种贮藏性糖类，又是应急代谢的重要产物，能够保护生物细胞和生物活性物质（如蛋白质、核酸等）在干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下免遭破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。海藻糖的这一独特功能特性是自然界其他糖类均不具备的，有效的提高了在干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下，UC-MSCs的存活率。

附图说明

图1为本发明冻存前细胞形态图；

图2为本发明人脐带间充质干细胞无血清冻存液保存的细胞复苏以后培养的细胞形态图片；

图3为本发明常规冻存液保存的细胞复苏以后培养的细胞形态图片；

图4为本发明人脐带间充质干细胞无血清冻存液冻存1年后的人脐带间充质干细胞用油红O染色液试剂盒进行成脂鉴定图片；

图5为本发明人脐带间充质干细胞无血清冻存液冻存1年后的人脐带间充质干细胞用茜素红染色液进行成骨鉴定图片。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

具体实施方式

实施例一：

1.一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液，包括以下组成及其体积百分比：

基础培养基58%；

血小板裂解液25%；

速溶蛋白多糖母液2%；

海藻糖母液15%。

一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下制备方法：

S1、制备原料：取适量的F12培养基和DMEM培养基，按体积比为I:I进行混合，得到DMEM/F12培养基，从螺旋藻中提取出速溶蛋白多糖，并与纯净水混合，得到浓度为50mg/ml的速溶蛋白多糖母液，取适量的海藻糖与纯净水混合，得到浓度为1mol/L的海藻糖母液。

S2、过滤除菌：取适量的速溶蛋白多糖母液和海藻糖母液通过0.2μm滤膜进行过滤除菌。

S3、混合搅拌：取基础培养基58%倒入无菌试剂瓶内，然后取血小板裂解液25%倒入无菌试剂瓶内，最后取过滤后的速溶蛋白多糖母液2%和海藻糖母液15%倒入无菌试剂瓶内，通过血清移液管进行吹打混匀得到人脐带间充质干细胞无血清冻存液。

2. 细胞存活率检测及形态观察

利用台盼蓝染色法检测冻存前细胞活率，并显微镜下观察其形态（见图1）。

将本发明制备的人脐带间充干细胞无血清冻存液以及对照组，加入需冻存的细胞后，程序降温后保存于液氮罐中，冻存1年后于37℃水浴中快速解冻复苏，每组设5个重复。分别检测两组的细胞活率，并于显微镜下观察其形态（见图2和图3）。

1．细胞活率检测结果

表1 细胞活率实验结果

由表1中可以看出，由本发明人脐带间充质干细胞无血清冻存液冻存的人脐带间充质干细胞，冻存一年后复苏，细胞活率均在92%以上，比对照组平均高了4.4%，与冻存前相比，细胞活率平均仅下降了5.36%，每月下降仅为0.45%。

本实验说明，本发明人脐带间充质干细胞无血清冻存液可以长时间维持细胞活率。

实施例二：本发明人脐带间充质干细胞无血清冻存液冻存1年后细胞特性检测

1. 流式细胞术检测细胞表面标志物的表达水平

取与实施例一中相同批次的细胞，冻存前进行表面标志物表达水平检测；冻存1年后，发明组和对照组于37℃水浴中快速复苏，培养48h后进行表面标志物表达水平检测。

结果发现，本发明人脐带间充质干细胞无血清冻存液及对照组冻存1年后，细胞复苏48h后的细胞高表达CD44、CD73、CD90、CD105，不表达或低表达CD34、CD45、HLA-DR，与冻存前细胞无显著性差异，说明冻存1年后的细胞仍符合MSCs的生物学特性。

2. 细胞成脂诱导分化潜能

取与实施例一中人脐带间充质干细胞无血清冻存液，冻存1年后复苏培养的同一批次的人脐带间充质干细胞，以5×10³个/cm²的密度接种于6孔板中，添加人脐带间充质干细胞无血清培养基进行培养，待细胞汇合达80%时，将培养基吸出，并加入成脂诱导分化培养基（购自STEMCELL公司，货号05412），每隔3天换液一次，培养20天后，用油红O染色液试剂盒（购自索莱宝公司，货号G1262）进行成脂鉴定，结果如图4所示。从图中可知，本发明冻存液冻存1年后的人脐带间充质干细胞仍具有成脂诱导分化潜能。

3. 细胞成骨诱导分化潜能

取与实施例一中人脐带间充质干细胞无血清冻存液，冻存1年后复苏培养的同一批次的人脐带间充质干细胞，以5×10³个/cm²的密度接种于6孔板中，添加人脐带间充质干细胞无血清培养基进行培养，待细胞汇合达80%时，将培养基吸出，并加入成骨诱导分化培养基（购自STEMCELL公司，货号05404），每隔3天换液一次，培养28天后，用茜素红染色液进行成骨鉴定，结果如图5所示。从图中可知，本发明冻存液冻存1年后的人脐带间充质干细胞仍具有成骨诱导分化潜能。

实施例三：

一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液，包括以下组成及其体积百分比：

基础培养基80%；

血小板裂解液5%；

速溶蛋白多糖母液10%；

海藻糖母液5%。

一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下制体积比为I:I进行混合，得到DMEM/F12培养基，从螺旋藻中提取出速溶蛋白多糖，并与纯净水混合，得到浓度为50mg/ml的速溶蛋白多糖母液，取适量的海藻糖与纯净水混合，得到浓度为1mol/L的海藻糖母液。

S2、过滤除菌：取适量的速溶蛋白多糖母液和海藻糖母液通过0.2μm滤膜进行过滤除菌。

S3、混合搅拌：取基础培养基80%倒入无菌试剂瓶内，然后取血小板裂解液5%倒入无菌试剂瓶内，最后取过滤后的速溶蛋白多糖母液10%和海藻糖母液5%倒入无菌试剂瓶内，通过血清移液管进行吹打混匀得到人脐带间充质干细胞无血清冻存液。

实施例四：

一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液，包括以下组成及其体积百分比：

基础培养基35%；

血小板裂解液30%；

速溶蛋白多糖母液10%；

海藻糖母液25%。

一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下制备方法：

S1、制备原料：取适量的F12培养基和DMEM培养基，按体积比为I:I进行混合，得到DMEM/F12培养基，从螺旋藻中提取出速溶蛋白多糖，并与纯净水混合，得到浓度为50mg/ml的速溶蛋白多糖母液，取适量的海藻糖与纯净水混合，得到浓度为1mol/L的海藻糖母液。

S2、过滤除菌：取适量的速溶蛋白多糖母液和海藻糖母液通过0.2μm滤膜进行过滤除菌。

S3、混合搅拌：取基础培养基35%倒入无菌试剂瓶内，然后取血小板裂解液30%倒入无菌试剂瓶内，最后取过滤后的速溶蛋白多糖母液10%和海藻糖母液25%倒入无菌试剂瓶内，通过血清移液管进行吹打混匀得到人脐带间充质干细胞无血清冻存液。

实施例五：

一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液，包括以下组成及其体积百分比：

基础培养基70%；

血小板裂解液10%；

速溶蛋白多糖母液10%；

海藻糖母液10%。

一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，包括以下制备方法：

S1、制备原料：取适量的F12培养基和DMEM培养基，按体积比为I:I进行混合，得到DMEM/F12培养基，从螺旋藻中提取出速溶蛋白多糖，并与纯净水混合，得到浓度为50mg/ml的速溶蛋白多糖母液，取适量的海藻糖与纯净水混合，得到浓度为1mol/L的海藻糖母液。

S2、过滤除菌：取适量的速溶蛋白多糖母液和海藻糖母液通过0.2μm滤膜进行过滤除菌。

S3、混合搅拌：取基础培养基70%倒入无菌试剂瓶内，然后取血小板裂解液10%倒入无菌试剂瓶内，最后取过滤后的速溶蛋白多糖母液10%和海藻糖母液10%倒入无菌试剂瓶内，通过血清移液管进行吹打均匀得到人脐带间充质干细胞无血清冻存液

基于上述，本发明优点在于，该人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，通过设置血小板裂解液，血小板裂解液是血小板经裂解后的液态成分，不仅去除了血小板膜和其他细胞残片，降低了免疫原性，而且还释放并保留了存在于血小板内部的多种生长因子，如血小板源性生长因子、转化生长因子β、表皮生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、白细胞介素1等。血小板裂解液中包含的这些因子对于UC-MSC的增殖具有促进作用，与动物血清培养的MSCs相比，细胞形态、免疫表型、分化能力等生物学特性没有影响，通过用血小板裂解液和海藻糖替换原有的动物血清和DMSO，使该人脐带间充质干细胞无血清冻存液，不含胎牛血清、DMSO等不安全成分，可长时间维持UC-MSCs的活性，显著提高细胞的存活率，制备简单、安全等优点，有效的解决了现有的细胞冷冻保护剂基本都是细胞基础培养基+胎牛血清（FBS）10~20%+二甲基亚砜（DMSO）10%，DMSO属于渗透性保护剂，它能快速渗入细胞内，减少细胞暴露在有害环境的时间，但是它在常温下对细胞有毒性作用，常温下操作时间需尽快；FBS会增加动物病原污染的机率，这都会给细胞以后的使用增加不确定因素的问题，同时，通过设置速溶蛋白多糖母液，速溶蛋白多糖母液中使用的速溶蛋白多糖，是来源于螺旋藻，螺旋藻内的蛋白质为水溶性蛋白，所含的18种氨基酸之间含量的比例又与人体吸收的比例非常接近，不需要经过复杂的加工即可被人和动物直接消化吸收，便于UC-MSCs吸收所需蛋白质，并且，通过海藻糖母液，海藻糖作为一种非还原性糖，自身性质稳定，广泛存在于生物界中，它既是一种贮藏性糖类，又是应急代谢的重要产物，能够保护生物细胞和生物活性物质（如蛋白质、核酸等）在干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下免遭破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征。海藻糖的这一独特功能特性是自然界其他糖类均不具备的，有效的提高了在干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下，UC-MSCs的存活率。

Claims (6)

1.一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液，其特征在于：包括以下组成及其体积百分比：

基础培养基20-80%；

血小板裂解液5-30%；

速溶蛋白多糖母液1-10%；

海藻糖母液5-25%。

2.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液，其特征在于：包括以下组成及其体积百分比：

基础培养基58%；

血小板裂解液25%；

速溶蛋白多糖母液2%；

海藻糖母液15%。

3.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液，其特征在于：所述基础培养基为DMEM/F12，所述血小板裂解液来源于人脐带血，所述速溶蛋白多糖母液来源于螺旋藻。

4.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液，其特征在于：所述速溶蛋白多糖母液浓度为50mg/ml，所述海藻糖母液浓度为1mol/L。

5.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液，其特征在于：所述速溶蛋白多糖母液和海藻糖母液均经0.2μm滤膜过滤除菌。

6.根据权利要求1所述的一种人脐带间充质干细胞无血清冻存液的制备方法，其特征在于：包括以下制备方法：

S1、制备原料：取适量的F12培养基和DMEM培养基，按体积比为I:I进行混合，得到DMEM/F12培养基，从螺旋藻中提取出速溶蛋白多糖，并与纯净水混合，得到浓度为50mg/ml的速溶蛋白多糖母液，取适量的海藻糖与纯净水混合，得到浓度为1mol/L的海藻糖母液；

S2、过滤除菌：取适量的速溶蛋白多糖母液和海藻糖母液通过0.2μm滤膜进行过滤除菌；

S3、混合搅拌：取基础培养基20-80%倒入无菌试剂瓶内，然后取血小板裂解液5-30%倒入无菌试剂瓶内，最后取过滤后的速溶蛋白多糖母液1-10%和海藻糖母液5-25%倒入无菌试剂瓶内，通过血清移液管进行吹打混匀，得到人脐带间充质干细胞无血清冻存液。