CN104560869A

CN104560869A - 一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法

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Publication number: CN104560869A
Application number: CN201410795197.2A
Authority: CN
Inventors: 曾桂芳; 李陶; 胡祥; 刘沐芸; 杨威仁; 方小燕
Original assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd; JIANGSU BEIKE BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd; JIANGSU BEIKE BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2014-12-18
Filing date: 2014-12-18
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-12-18
Also published as: CN104560869B

Abstract

本发明提供了一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法,包括无菌采集胎盘；分离绒毛膜组织；获取绒毛膜间充质干细胞；培养绒毛膜间充质干细胞；绒毛膜间充质干细胞的冻存；绒毛膜间充质干细胞的复苏。本发明的方法具有如下技术效果：防范污染方法，从采集源头减少污染几率，多次冲洗表面，有效减少污染几率；减少混杂细胞污染；采用单一酶消化，可精简流程；使用无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞性能稳定，可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持细胞形态、增殖能力、MSC表面标记表达、分化能力，还可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持端粒酶表达、癌基因稳定表达、核型稳定；酶消化和冻存复苏对细胞无伤害。

Description

一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法，属于干细胞技术领域。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是来源于发育中胚层的一类多能干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，它在特定诱导条件下可分化为多种类型的组织细胞，可形成骨、软骨、脂肪、心肌等多种组织。间充质干细胞最早主要来源于骨髓，但人骨髓中的间充质干细胞(BMMSC)含量极低。近年来，已有具备干/祖细胞特征的间充质细胞自外周血、密质骨、软骨、肌肉、脐带和胎盘等多种组织中分离出来。从胎盘组织分离而来的间充质细胞可以在不同的条件下分化为多种具有特定功能的细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、肌细胞等。绒毛膜间充质干细胞从胎盘绒毛膜组织中分离出来，具有潜在的存储和医疗价值。

绒毛膜间充质干细胞常采用酶消化绒毛膜组织获得，多用含10％FBS的培养基培养，多用含10％DMSO的冻存液冻存。

现有技术中，制备绒毛膜间充质干细胞的方法通常会存在以下不足之处：

1)胎盘采集及绒毛膜分离的现有技术缺少有效减少污染措施，防污染措施作用有限，原代培养污染率高，缺少从源头开始减少污染的方法，目前在培养环节添加抗生素只能在培养过程中抑制污染菌繁殖，不能有效减少污染；培养体系中一直添加抗生素，不利于绒毛膜干细胞的临床应用。

2)现有酶消化方法复杂，需多次酶消化；

3)酶消化、冻存复苏等操作对细胞有可能造成细胞损伤；

4)干细胞培养过程中细胞易衰老，细胞扁平，增值缓慢或停止增殖，失去分化能力等，目前尚未有方法或技术经验阐述有效维持绒毛膜间充质干细胞形态，防止细胞老化，维持细胞在增殖过程中保留分化能力；

5)间充质干细胞长期传代后可能发生端粒酶失活、癌基因表达增高抑癌基因表达下降、核型改变等风险，目前缺少绒毛膜间充质干细胞这方面的研究资料。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法。

本发明的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)无菌采集胎盘，采集后0～30min内用胎盘清洗液冲洗外表1-3次，将胎盘浸泡于胎盘清洗液中；

2)48h内运至实验室，将胎盘再次用清洗液清洗1-3次，剪去脐带，撕除羊膜，剪取羊膜下0～1cm厚度范围内绒毛膜组织，清洗干净后，放入清洗液浸泡0～30min，然后将绒毛膜组织剪碎成0.5～4mm³大小的组织块；

3)通过胶原酶消化法从绒毛膜组织块获取绒毛膜间充质干细胞；

4)使用无血清培养基培养绒毛膜间充质干细胞，其中P0代绒毛膜间充质干细胞长满至80％密度后，使用0.25％胰酶消化，消化时间为3-5min，P0代之后，细胞在传代操作后48-72h内进行传代，要求传代时细胞密度80％-90％，传代后细胞按3-8)×10³个/cm²密度接种，培养过程中注意观察培养基PH值变化，一旦变黄添加新鲜培养基并去除培养器皿中等量旧培养基，细胞从P0代传代，传至P1～P30中间的任何一代次；

其中，

所说的步骤1)和步骤2)中清洗液为0.9％的生理盐水；

所说的步骤3)中的胶原酶消化法中所用的胶原酶为终浓度为2mg/ml的胶原酶II；

所说的步骤4)中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12、血小板源生长因子PDGF-BB、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子β1(TGF)-β1、表皮生长因子EGF和转铁蛋白Transferrin；其中，PDGF-BB含量为50～100ng/mL；bFGF含量为0～50ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30ng/mL；Transferrin含量为2.0～4.5mg/mL。

所述的步骤1)和步骤2)中的清洗液还含有抗生素，所说的抗生素为青霉素、链霉素或两性霉素B。

所述的步骤3)中的酶消化法的步骤如下：将绒毛膜组织块放入37℃温度中，振荡消化15～60min，加入组织块体积1～5倍体积生理盐水，2500转离心5min，去上清，将底部消化后产物，转入培养器皿，按1ml绒毛膜组织块加入10ml无血清培养基，所述的步骤3)中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12、血小板源生长因子PDGF-BB、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子β1(TGF)-β1、表皮生长因子EGF和转铁蛋白Transferrin；其中，PDGF-BB含量为50～100ng/mL；bFGF含量为0～50ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30ng/mL；Transferrin含量为2.0～4.5mg/mL。

所述的步骤3)中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12+80ng/mLPDGF-BB+20ng/mL bFGF+10ng/mL(TGF)-β1+10ng/mL EGF+3.0mg/mL转铁蛋白。

所述的步骤3)中的无血清培养基中还添加有抗生素，所说的抗生素为青霉素、链霉素或两性霉素B。

所述的步骤4)中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12+80ng/mLPDGF-BB+20ng/mL bFGF+10ng/mL(TGF)-β1+10ng/mL EGF+3.0mg/mL转铁蛋白。

所述的步骤4)中的P0代细胞培养用的无血清培养基中还添加有抗生素，所说的抗生素为青霉素、链霉素或两性霉素B。

所述的绒毛膜间充质干细胞的冻存方法如下：每10⁶-10⁷细胞加入1ml冻存液，放入冻存盒，转入-80℃冰箱，12～24h后转入-196℃液氮或气氮中保存备用，所述冻存液由基础液和渗透性冷冻保护剂组成，所说的渗透性冷冻保护剂浓度为1-1.4mol/L,所说的基础液为培养液DMEM/F12；所说的渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜。

本发明的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，具有如下技术效果：

1)防范污染方法，从源头减少污染几率，多次冲洗表面，有效减少污染几率；

2)限定绒毛膜取材区域:剪取羊膜下0～1cm厚度范围内绒毛膜组织，减少混杂细胞污染；

3)本专利方法中在分离绒毛膜间充质干细胞时候，采用单一酶单次消化，可精简流程；

4)使用无血清培养基培养减少动物源成分使用，细胞可按此方法从P0代传代至P30维持性能稳定，可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持细胞形态、增殖能力、MSC表面标记表达、分化能力，还可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持端粒酶表达、癌基因稳定表达、核型稳定；

5)本方法中酶消化和冻存复苏对细胞无伤害。

附图说明

图1是制得的绒毛膜间充质干细胞的形态图；

图2是制得的绒毛膜间充质干细胞的表面标记检测结果图；

图3是经消化酶消化后的绒毛膜间充质干细胞的形态图；

图4是经消化酶消化后的绒毛膜间充质干细胞的生长曲线检测结果图；

图5是采用无血清培养基培养的P0～P10代绒毛膜间充质干细胞形态图；

图6是采用无血清培养基培养的P2、P5和P10代绒毛膜间充质干细胞，与老化细胞和未分化细胞形态的对照图；

图7是生长曲线测定检测结果图；

图8是成骨、成脂、成软骨诱导分化检测结果图；

图9是流式检测结果图；

图10是端粒酶检测结果图；

图11是癌基因检测结果图；

图12是G显带核型分析结果图。

具体实施方式

实施例1制备绒毛膜间充质干细胞

本实施例中的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

1)胎盘采集：

胎盘从母体脱离后，操作人员着无菌手套握取胎盘，操作过程中防止胎盘接触可能带来污染的物体(如地面等)，用胎盘清洗液冲洗外表3次，清洗液为0.9％生理盐水，清洗液中可以加入或不加入抗生素，加入的抗生素为青霉素、链霉素或两性霉素B。用无菌纱布擦拭表面，去除表面血迹，至胎盘表面无液体滴落后浸泡于含清洗液的胎盘采集盒中。

2)绒毛膜处理：

48h内将胎盘运至实验室后，放置于40cm×40cm×20cm(长×宽×高)的盘子当中，用无菌清洗液冲洗外表3次，清洗液为0.9％生理盐水，清洗液中可以加入或不加入抗生素，加入的抗生素为青霉素、链霉素或两性霉素B。

正置胎盘，剪去脐带，撕除羊膜，剪取羊膜下1cm厚度范围内绒毛膜组织，剪取的绒毛膜组织用无菌液体洗净，加入无菌液体浸泡30min。将绒毛膜组织剪碎成0.5～4mm³大小的组织块。

上述胎盘源头开始处理后，在后续的培养过程中，污染率有效降低。胎盘源头未消毒，后续污染发生率为(25.3±7.2％)，按本方法进行污染发生率降低到(2.4±1.5％)，显著降低污染发生。

3)分离绒毛膜间充质干细胞

按每1ml组织块加入1-5ml消化酶的体积比加入消化酶(gibco)，所说的消化酶为终浓度为1-5mg/ml的胶原酶II(gibco)。

消化步骤如下：将加了消化酶的绒毛膜组织块置于37℃温度中，振荡消化60min，振荡由振荡器提供。再加入体积为组织块体积1-5倍的0.9％生理盐水(贵州天地)，2500转离心5min，去上清。将底部消化后产物，转入培养器皿，按1ml绒毛膜组织块加入10ml无血清培养基(gibco)的比例添加无血清培养基。至绒毛膜间充质干细胞爬出后继续培养5～20天。

无血清培养基的成分为：DMEM/F12(invitrogen)+80ng/mLPDGF-BB(gibco)+20ng/mLbFGF(invitrogen)+10ng/mL(TGF)-β1(Peprotech)+10ng/mL EGF(gibco)+3.0mg/mL转铁蛋白(sigma)。

无血清培养基中可以加入含有抗生素，抗生素为青霉素(gibco)、链霉素(gibco)、两性霉素B(sigma)。

采用上述方法，节约每份组织的操作时间，减少离心管、生理盐水等耗材试剂使用；使用单一酶消化，简化流程，操作简单，污染率降低；消化时间缩短，由两步法的90min缩短为60min。得到细胞传代形态良好，如图1所示；表面标记符合ISCT对间充质干细胞检测标准，如图2所示；消化酶直接作用细胞后，细胞维持良好形态，如图3所示；并且细胞生长能力未受影响，如图4所示；并且表面标记未受消化酶消化的影响，如表1所示；说明本消化液配方对绒毛膜组织内间充质干细胞和绒毛膜间充质干细胞都不产生影响。

表1

4)培养绒毛膜间充质干细胞

绒毛膜间充质干细胞用无血清培养基培养。

培养P0代绒毛膜间充质干细胞使用的无血清培养基可以加入抗生素，抗生素为青霉素(gibco)、链霉素(gibco)、两性霉素B(sigma)。

使用无血清培养基培养绒毛膜间充质干细胞，P0代绒毛膜间充质干细胞长满至80％密度后，使用0.25％胰酶(gibco)消化，消化时间为3-5min。P0代后的代次使用不含抗生素的培养基培养。

P0代之后，细胞在传代操作后48～72h内进行传代，要求传代时细胞密度达到80％-90％，传代后细胞按3×10³-8×10³个/cm2密度接种。培养过程中注意观察培养基PH值变化，一旦PH变黄添加新鲜培养基。观察记录细胞形态。

如图5所示，采用无血清培养基培养的P0～P10代绒毛膜间充质干细胞形态良好。

P0～P30代中间任何一次都可进行形态观察、增殖测试、诱导分化、流式、端粒酶、癌基因表达、核型检测。

①形态观察记录细胞形态，与老化细胞和未分化细胞形态进行对比，检测结果如图6所示，可以看出传代后细胞形态维持良好，未老化；

②增殖测试包括：生长曲线测定，检测结果如图7所示，可以看出多次传代后细胞维持较强的增殖活力；

③诱导分化检测包括：成骨、成脂、成软骨检测，检测结果如图8所示，可以看出多次传代后细胞维持分化能力；

④流式检测包括：CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45、CD79-α、HLA-DR，检测结果如图9所示，可以看出多次传代后细胞表面标记表达维持稳定，符合MSC检测标准；

⑤端粒酶检测方法为：采用Telomerase Detection Kit试剂盒检测，检测结果如图10所示，可以看出多次传代后细胞未丧失端粒酶活性；

⑥癌基因检测包括：Real-time PCR检测癌基因(c-Myc，c-fos，k-ras)和抑癌基因(P53，P21，RB，P16)表达，检测结果如图11所示，可以看出癌基因和抑癌基因表达表达较稳定；

⑦核型检测：采用G显带核型分析，检测结果如图12所示，可以看出细胞经多次传代后核型正常；

因此，本发明的制备方法得到的绒毛膜间充质干细胞细胞在体外传代过程中，能维持细胞形态、增殖能力、MSC表面标记表达、分化能力，还可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程，维持端粒酶表达、癌基因稳定表达、核型稳定。

5)冻存绒毛膜间充质干细胞：

每10⁶～10⁷细胞加入1ml冻存液，放入冻存盒，转入-80℃冰箱，24h后转入-196℃液氮或气氮中保存。

绒毛膜间充质干细胞冻存液由基础液和渗透性冷冻保护剂组成，所说的渗透性冷冻保护剂浓度为1mol/L，所说的基础液为培养液DMEM/F12(invitrogen)；所说的渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜(gibco)。

6)复苏绒毛膜间充质干细胞：

将要复苏的绒毛膜间充质干细胞或绒毛膜组织块从液氮罐取出，放入37℃水浴锅中孵育2min,用4℃预冷的生理盐水洗3遍后，离心去上清，加入无血清培养基。

本步骤中所用无血清培养基成分与步骤4)中相同。

冻存复苏成功率：冻存复苏120次，成功率100％。细胞形态良好、流式检测合格，分化能力检测合格。

本发明中涉及的各种检测的具体方法步骤分别如下。所涉及的参数是由下述仪器测定的：OLYMPUS倒置显微镜、莱卡正置(laica)显微镜、FACSAira流式细胞仪、紫外可见分光光度计、Biorad荧光PCR仪、BioradPCR仪、培养箱、低温冰箱、液氮罐等。

(一)OLYMPUS显微镜拍照

培养出的P2代绒毛膜间充质干细胞融合至80-90％以上，将其置于倒置显微镜下拍照，细胞形状为短梭形，大小均一，排列整齐，如图6所示。

(二)生长曲线的绘制

取制备好的细胞，消化至单细胞悬液；无血清培养基调整浓度至1×104/ml，点加入96孔板中；设13组每组8个复孔，每孔200μl，置于37℃、含5％的CO2、饱和湿度的培养箱中培养；每2天换液，分别在培养至1-13天后，每孔加20μl的浓度为5mg/mL的噻唑蓝(MTT)(sigma,M5655)，继续培养；4小时后小心移去培养上清；每孔加入100μl的二甲基亚砜(takara,67-68-5)，微量振荡器震荡5分钟；置酶标仪(Thermo)上测570nm或490nm下的光吸收值，统计学分析后绘制出生长曲线。消化以后细胞生长曲线如图4所示，多次传代后细胞生长曲线如图7所示。

(三)多向分化能力鉴定

将1×10⁴/ml的P2代细胞悬液接种于24孔培养板中，0.5ml/孔；细胞融合至60-80％，换成成骨诱导完全培养基(gibco)，0.5ml/孔；每3-4天全量更换诱导培养液；诱导24天后，茜素红(国药集团)染色后拍照，可见有大量钙结节产生，如图8所示。

将1×10⁴/m的P2代细胞悬液接种于24孔培养板中，0.5ml/孔；细胞融合至80-90％，换成成脂诱导完全培养基(gibco)，0.5ml/孔；每3-4天全量更换诱导培养液；诱导14天后，油红O(gibco)染色后拍照，可见所有细胞内均有脂滴产生，如图8所示。

将5×10⁵的P2代细胞悬液接种于15ml的离心管中，离心后培养，第二天换成成软骨诱导完全培养基(gibco)，0.5ml/孔；每3-4天全量更换诱导培养液；诱导21天后，切片，阿尔新蓝(国药集团)染色拍照，可见所有细胞内均有软骨产生，如图8所示。

(四)流式细胞检测

将5×10⁶细胞消化成单细胞悬液；以PBS洗涤两遍后调整浓度至1×10⁵/ml，流式细胞仪(BD,FACSAira)检测细胞表面标记阳性指标CD90、CD73和CD105，阴性指标CD34、CD14、CD45、CD79a、HLA-DR，阳性细胞率均超过95％，阴性指标符合低于2％，符合间充质干细胞的特征，如图9所示。

(五)端粒酶检测

取1*10⁶细胞根据Telomerase Detection Kit(milipore)试剂盒的说明书提取样品进行鉴定，检测结果如图10所示，可以看出多次传代后细胞未丧失端粒酶活性。

(六)癌基因与抑癌基因检测

取绒毛膜间充质干细胞1x10⁶细胞提取RNA(参照QIAGEN RNA提取试剂盒说明书)，逆转录为CDNA(TOYOBO First Strand cDNA Synthesis Kit)，加入癌基因以及抑癌基因进行荧光定量PCR(biorad)检测。使用2^-△△Ct方法分析实验数据，检测相关原癌基因与抑癌基因的表达是否发生显著变化。Real-time PCR检测癌基因(c-Myc，c-fos，k-ras)和抑癌基因(P53，P21，RB，P16)表达，检测结果如图11所示，可以看出癌基因和抑癌基因表达表达较稳定。

(七)核型分析

取培养中的绒毛膜间充质干细胞用秋水仙素处理，消化，离心收集，PBS洗涤。低渗KCL(0.075M)处理，处理时间在20-40分钟，滴加少量固定液，离心1500rpm/5min去上清，保留1ml上清，轻轻吹打悬起，缓慢加入固定液(甲醇：冰醋酸按照3：1比例混合)，边加边振荡,直至满管。离心去上清，轻轻拍打悬起，缓慢加入固定液，边加边振荡,直至满管。4度过夜，离心去上清。滴片，载玻片事先放在0度冰水浴，取出玻片后从高处滴片。快速过火或空气干燥，吉姆萨染色后，镜下(laica)观察。

Claims

1.一种制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4)使用无血清培养基培养绒毛膜间充质干细胞，其中P0代绒毛膜间充质干细胞长满至80%密度后，使用0.25%胰酶消化，消化时间为3-5min，P0代之后，细胞在传代操作后48-72h内进行传代，要求传代时细胞密度80%-90%，传代后细胞按（3-8）×10³个/cm²密度接种，培养过程中注意观察培养基PH值变化，一旦变黄添加新鲜培养基并去除培养器皿中等量旧培养基，细胞从P0代传代，传至P1～P30中间的任何一代次；

其中，

所说的步骤1）和步骤2）中清洗液为0.9%的生理盐水；

所说的步骤3）中的胶原酶消化法中所用的胶原酶为终浓度为1-5mg/ml的胶原酶II；

所说的步骤4）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12、血小板源生长因子PDGF-BB、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子β1 （TGF）-β1、表皮生长因子EGF和转铁蛋白Transferrin；其中，PDGF-BB含量为50～100 ng/mL；bFGF含量为0～50 ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL;Transferrin含量为2.0～4.5 mg/mL。

2.根据权利要求1所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤1）和步骤2）中的清洗液还含有抗生素，所说的抗生素为青霉素、链霉素或两性霉素B。

3.根据权利要求1所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤3）中的酶消化法的步骤如下：将绒毛膜组织块放入37℃温度中，振荡消化15～60min，加入组织块体积1-5倍体积生理盐水，2500转离心5min，去上清，将底部消化后产物，转入培养器皿，按1ml绒毛膜组织块加入10ml无血清培养基，所述的步骤3）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12、血小板源生长因子PDGF-BB、碱性成纤维细胞生长因子bFGF、转化生长因子β1 （TGF）-β1、表皮生长因子EGF和转铁蛋白Transferrin；其中，PDGF-BB含量为50～100 ng/mL；bFGF含量为0～50 ng/mL；(TGF)-β1含量为0～20ng/mL；EGF含量为0～30 ng/mL;Transferrin含量为2.0～4.5 mg/mL。

4.根据权利要求3所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤3）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12+80ng/mL PDGF-BB+ 20ng/mL bFGF+ 10ng/mL (TGF)-β1+10ng/mL EGF+3.0mg/mL转铁蛋白。

5.根据权利要求3或4所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤3）中的无血清培养基中还添加有抗生素，所说的抗生素为青霉素、链霉素或两性霉素B。

6.根据权利要求1所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤4）中的无血清培养基由以下成分组成：DMEM/F12+80ng/mL PDGF-BB+ 20ng/mL bFGF+ 10ng/mL (TGF)-β1+10ng/mL EGF+3.0mg/mL转铁蛋白。

7.根据权利要求1或6所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的步骤4）中的P0代细胞培养用的无血清培养基中还添加有抗生素，所说的抗生素为青霉素、链霉素或两性霉素B。

8.根据权利要求1所述的制备绒毛膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的绒毛膜间充质干细胞的冻存方法如下：每10⁶-10⁷细胞加入1ml冻存液，放入冻存盒，转入-80℃冰箱，12～24h后转入-196℃液氮或气氮中保存备用，所述冻存液由基础液和渗透性冷冻保护剂组成，所说的渗透性冷冻保护剂浓度为1-1.4 mol/L,所说的基础液为培养液DMEM/F12；所说的渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜。