CN115161269B - 一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法 - Google Patents
一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115161269B CN115161269B CN202210803916.5A CN202210803916A CN115161269B CN 115161269 B CN115161269 B CN 115161269B CN 202210803916 A CN202210803916 A CN 202210803916A CN 115161269 B CN115161269 B CN 115161269B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture
- cell
- cells
- tissue
- fibroblasts
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 title claims abstract description 47
- 238000000926 separation method Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 241000282330 Procyon lotor Species 0.000 title abstract description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 241001482564 Nyctereutes procyonoides Species 0.000 claims abstract description 25
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 75
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 33
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 28
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 26
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 22
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 22
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 22
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 18
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 18
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 claims description 15
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 14
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 14
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 14
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 14
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 14
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 12
- 239000003761 preservation solution Substances 0.000 claims description 11
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 claims description 10
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 claims description 10
- 239000012879 subculture medium Substances 0.000 claims description 10
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 9
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 6
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 6
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 claims description 3
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 claims description 3
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 2
- WCGUUGGRBIKTOS-GPOJBZKASA-N (3beta)-3-hydroxyurs-12-en-28-oic acid Chemical compound C1C[C@H](O)C(C)(C)[C@@H]2CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@@]5(C(O)=O)CC[C@@H](C)[C@H](C)[C@H]5C4=CC[C@@H]3[C@]21C WCGUUGGRBIKTOS-GPOJBZKASA-N 0.000 claims 1
- 229940096998 ursolic acid Drugs 0.000 claims 1
- PLSAJKYPRJGMHO-UHFFFAOYSA-N ursolic acid Natural products CC1CCC2(CCC3(C)C(C=CC4C5(C)CCC(O)C(C)(C)C5CCC34C)C2C1C)C(=O)O PLSAJKYPRJGMHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 34
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 4
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 2
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000007798 antifreeze agent Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0656—Adult fibroblasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/02—Preservation of living parts
- A01N1/0205—Chemical aspects
- A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
- A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，具体公开一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法。所述乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法包括样品采集、原代培养、传代培养、细胞冻存以及细胞复苏过程。本发明提供的乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法能够获得高纯度、高活率的乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞，且分离培养过程中成纤维细胞易贴壁生长以及消化脱壁，只需2次传代就可将成纤维细胞分离纯化。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法。
背景技术
乌苏里貉，隶属于食肉目犬科貉属，主要用于生产毛皮，是制作高档大衣、皮领、皮帽等裘皮制品的优质原料，具有很高的经济价值。
乌苏里貉是我国特有的优秀毛皮动物种质资源，具有地方品种遗传多样性的特点。随着工业化城镇化进程加快、气候环境变化以及畜牧业生产方式的转变，畜禽种质资源群体数量和区域分布发生很大变化，地方品种消失风险加剧，一旦消失灭绝，其蕴含的优异基因、承载的传统农耕文化也将随之消亡，生物多样性也将受到影响，种质资源保存工作已成当务之急。因此，随着体外培养技术和体细胞克隆技术的发展，体细胞保存等方法已成为畜禽种质资源保存的理想方法和途径，分离培养乌苏里貉成纤维细胞对于解决研究材料的问题十分必要。畜禽基因资源的体细胞保存作为一种安全、稳定的体外保存方法，不仅能够在细胞水平上将畜禽基因资源长期保存下来，还能为从细胞和分子水平开展遗传学、生物学研究提供宝贵的试验材料。但目前的乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法分离培养的乌苏里貉成纤维细胞存在纯度和活率低、需要的传代次数多、不易贴壁生长以及贴壁生长的细胞不易消化脱壁的问题，致使乌苏里貉基因资源的体细胞不能安全、稳定的保存。
发明内容
针对现有乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法存在的上述问题，本发明提供一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，该乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法能够获得高纯度、高活率的乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞，且分离培养过程中成纤维细胞易贴壁生长以及消化脱壁，只需2次传代就可将成纤维细胞分离纯化。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，包括以下步骤：
a、以活体乌苏里貉为采集对象，对其耳部进行去毛和消毒，然后剪下0.5cm2-1.5cm2的耳缘组织，消毒、清洗，保存备用；所述清洗所用的清洗液为含500IU/mL青霉素和500IU/mL链霉素的FBS高糖DMEM，所述FBS高糖DMEM中FBS的体积含量为8-12％；所述保存所用的保存液为含3-4g/L的HEPES、100IU/mL的青霉素和100IU/mL链霉素的FBS高糖DMEM；所述FBS高糖DMEM中FBS的体积含量为8-12％；
b、将所述耳缘组织放入装有dispaseⅡ消化液的离心管中进行消化，取出所述耳缘组织，去除表皮，剪碎，得到耳缘组织碎片；将所述耳缘组织碎片置于原代培养基中培养，待所述耳缘组织碎片完全贴壁后，每间隔2d-3d天更换一次原代培养基，待所述耳缘组织碎片周围长出新细胞，即为原代细胞；
c、当所述原代细胞生长至汇合度达到80％-90％时，用PBS清洗，并加入胰蛋白酶消化液进行消化，所述胰蛋白酶消化液的加入量为耳缘组织碎片体积的3-5倍，当所述原代细胞由纤维状变为球状时，加入传代培养基终止消化并混匀，得到细胞悬浮液；将所述细胞悬浮液加入到细胞培养瓶中，进行第一次传代培养，待细胞贴壁后吸出培养液，并加入新的传代培养基继续培养，待细胞汇合度到达80％-90％，进行下一次传代培养；经过2-3次传代培养后，得到纯化后的乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞；
d、向所述纯化后的乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞中加入冻存液，进行细胞冻存，所述细胞冻存液的配制方法为：将DMSO、FBS和高糖DMEM按照1:7-9:0.8-1.2的体积比混合后，加入蔗糖，使所述蔗糖在所述细胞冻存液中的浓度达到65-70g/L；
c、将冻存的细胞进行细胞复苏。
相对于现有技术，本发明提供的乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法中，采用酶消化法和植块法相结合的方式分离培养耳缘组织成纤维细胞，不仅保留了组织中各种生长因子的活性及其对细胞增殖的促进作用，而且经过酶消化后使组织块贴壁更加牢靠，缩短了原代细胞长出时间。在组织消化过程采用了含dispaseⅡ的消化液，有效减少了消化过程中对细胞的损伤，能够维持细胞膜的完整性，使分离培养的成纤维细胞稳定性强，培养过程中不易受温度、血清组分的影响。同时，在传代过程中，通过控制胰蛋白酶的用量及消化时间，以及新的传代培养基的更换时机，可以有效淘汰掉成纤维细胞上的上皮细胞，提高了成纤维细胞的纯度和纯化速度，有效减少传代培养次数。
此外，上述保存液的选择为乌苏里貉耳缘组织提供了足够的营养成分，保证了组织离体后继续保持代谢活性。同时，保存液中加入的HEPES能够保证当组织离开机体后，在CO2之外的其他环境中进行长时间运输或操作时，维持组织保存液的pH值和组织细胞的活性。
在细胞冻存液中添加蔗糖成分，起到细胞外抗冻剂的作用，促进了冻存液的渗透维持，使细胞脱水，避免过度膨胀和渗透冲击，与DMSO细胞内低温保护剂协同使用，能更好的减少细胞损伤，从而更好的维持细胞形态、融合及细胞活率。
优选的，步骤a中，所述消毒所用的消毒液为75％的酒精溶液。
优选的，步骤a中，所述清洗的次数为2-3次。
优选的，步骤b中，所述dispaseⅡ消化液为含0.18-0.22mg/mL的dispaseⅡ的高糖DMEM，所述耳缘组织与所述dispaseⅡ消化液的体积比为1:4-6。
优选的，步骤b中，所述消化的温度为35℃-40℃、时间为1h-2h。
优选的，步骤b中，所述耳缘组织碎片的大小为1mm2-2mm2。
优选的，步骤b中，所述原代培养基为含100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的FBS高糖DMEM，所述FBS高糖DMEM中FBS的体积含量为18-22％。
优选的，步骤b中，所述培养的温度为35℃-40℃，CO2浓度为4％-6％，湿度为饱和湿度。
优选的，步骤c中，所述用PBS清洗的次数为2-3次。
优选的，步骤c中，所述胰蛋白酶消化液为含2-3g/L的胰蛋白酶、0.35-0.40g/L的EDTA·4Na和9-11mg/L的酚红的Hanks平衡盐溶液。
优选的，步骤c中，所述传代培养的温度为35℃-40℃，CO2浓度为4％-6％，湿度为饱和湿度。
优选的，步骤c中，所述传代培养基是含100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的FBS高糖DMEM，所述FBS高糖DMEM中FBS的体积含量为8-12％。
优选的，步骤d中，所述细胞冻存的方法为：将所述纯化后的乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞用胰蛋白酶消化，待细胞形态变圆后，加入冻存液混匀，先在4℃冷藏20min-30min，再置于-20℃冷冻20min-30min，取出在-80℃冰箱冷冻8h-12h，最后投入液氮中，完成细胞冻存。
优选的，步骤e中，所述细胞复苏的方法为：将冻存的细胞取出放入37℃-42℃的水浴锅中解冻，转入细胞培养瓶中，加入所述原代培养基，混匀后，35℃-40℃、4％-6％CO2和饱和湿度条件下培养8h-12h，弃掉培养液，用PBS清洗细胞2-3次，加入所述传代培养基混匀，完成细胞复苏。
附图说明
图1是本发明实施例1中的耳缘组织周围的原代细胞的生长形态图；
图2是本发明实施例1中的耳缘组织原代细胞生长至汇合度达80％-90％时的生长形态图；
图3是本发明实施例1中传代过程中经过胰蛋白酶消化后的细胞形态图；
图4是本发明实施例1中传代过程中成纤维细胞贴壁后的细胞形态图；
图5是本发明实施例1中的得到的纯化的成纤维细胞的细胞形态图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例所采用的主要仪器和实验试剂：
1、仪器:生物安全柜、CO2培养箱、倒置显微镜、普通冰箱、超低温冰箱、液氮罐、低速离心机、水浴锅。
2、试剂：高糖DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)、PBS缓冲液、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、青链双抗、胰蛋白酶消化液(均为Gibio公司产品)；二甲基亚砜(DMSO)、dispaseⅡ(均为Sigma公司产品)。
保存液：含3.5g/L的HEPES、100IU/mL的青霉素和100IU/mL链霉素的FBS高糖DMEM；FBS高糖DMEM中FBS的体积含量为10％
清洗液：含500IU/mL青霉素和500IU/mL链霉素的FBS高糖DMEM，FBS高糖DMEM中FBS的体积含量为10％；
dispaseⅡ消化液：含0.2mg/mL的dispaseⅡ的高糖DMEM；
原代培养基：含100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的FBS高糖DMEM，FBS高糖DMEM中FBS的体积含量为20％；
传代培养基：含100IU/mL青霉素和100IU/mL链霉素的FBS高糖DMEM，FBS高糖DMEM中FBS的体积含量为10％；
冻存液：将DMSO、FBS和高糖DMEM按照1:8:1的体积比混合后，加入蔗糖，使所述蔗糖在所述细胞冻存液中的浓度达到68.4g/L；
胰蛋白酶消化液：含2.5g/L的胰蛋白酶、0.38g/L的EDTA·4Na和10mg/L的酚红的Hanks平衡盐溶液；
其中，上述FBS高糖DMEM为加入FBS的高糖DMEM。
实施例1
一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，包括步骤如下：
a、样品采样：以6月龄活体乌苏里貉为采样对象，用75％酒精棉球对耳部要剪部位进行大致擦拭，除掉绒毛表面的灰尘、细菌；用高压灭菌的剪毛剪将采集部位绒毛减掉，露出皮肤，用75％的酒精棉球仔细消毒剪毛部位，重复擦拭3次；然后用灭菌剪刀剪下1cm2大小的耳缘组织，投入75％的酒精中浸泡30s，取出后用清洗液冲洗2次；最后将耳缘组织放入装有保存液的15mL离心管中，拧紧盖儿、记录、密封后备用。
b、原代培养：将步骤a所得的装有耳缘组织的15mL离心管在生物安全柜外用75％的酒精棉进行擦拭消毒2次；消毒干净后拿进生物安全柜内打开盖子，用高压灭菌的镊子取出耳缘组织，置于清洗液内，清洗6次；将清洗干净的耳缘组织放入装有dispaseⅡ消化液(耳缘组织与dispaseⅡ消化液的体积比为1:5)的15mL离心管中，37℃消化1.5小时；在生物安全柜内将消化好的组织从dispaseⅡ消化液中取出，置于60mm培养皿中，用镊子分离耳缘组织的表皮和真皮，用清洗液清洗去除表皮的耳缘组织2次；将去除表皮的耳缘组织转移至新的60mm培养皿内，用灭菌剪将其剪成1-2mm2大小的碎片，在这过程中可滴加少量原代培养基以防组织干燥；然后用巴氏吸管将剪碎的组织样品均匀排布在培养皿上，吸去培养皿中多余的原代培养基，置于培养箱中(37℃、5％CO2、饱和湿度)3h让组织贴壁；之后向培养皿中加入少量原代培养基，以保证培养液铺满培养皿但耳缘组织碎片没有漂浮为宜，继续置于培养箱中(37℃、5％CO2、饱和湿度)12h，待耳缘组织碎片完全贴壁后向培养皿中加入足量的原代培养基；每天观察细胞长出情况，每2天更换一次原代培养基，培养5天后在倒置显微镜下观察到组织块周围有细胞长出，如图1所示，即为原代细胞。
c、传代及纯化：当步骤b所得的乌苏里貉耳缘组织原代细胞生长至汇合度达80％～90％时，如图2所示，即可传代；传代过程中，先用PBS清洗细胞2次，弃掉PBS，用巴氏吸管吸出培养瓶中未倒净的PBS；向培养皿中加入0.5mL的胰蛋白酶消化液(胰蛋白酶消化液的加入量约为耳缘组织碎片体积的4倍)，使胰酶轻轻地均匀地淌过细胞表面，让胰蛋白酶与细胞充分接触，消化2min后，在显微镜下观察可看到细胞质回缩，胞间隙增大，细胞形态由长梭形变为圆形，如图3所示，此时向培养皿中加入8mL的传代培养基终止消化，可因不同细胞对胰蛋白酶消化液敏感性不同而分离出成纤维细胞；用吸管反复多次吹打培养基使细胞悬浮，吸取细胞悬液接种入T25培养瓶中，置于培养箱(37℃、5％CO2、饱和湿度)培养40min；待成纤维细胞贴壁后，轻轻晃动培养瓶可使上皮细胞顺利悬浮于培养液中，吸出并弃掉悬浮上皮细胞的培养液，即可筛除上皮细胞；然后向T25培养瓶重新注入5mL传代培养基，置于培养箱(37℃、5％CO2、饱和湿度)培养6小时，此时成纤维细胞贴壁牢靠，如图4所示；继续培养2天，待细胞汇合度到达80％～90％，即可进行下一次传代，通过2次传代后，即可得到纯化的成纤维细胞，如图5所示。通过成纤维细胞特异性标记物(鼠抗波形蛋白)检测，统计结果显示得到的成纤维细胞纯度达96％。
d、细胞冻存：步骤c所得的成纤维细胞生长至80％～90％汇合度时，可进行冻存；冻存时，先弃掉培养液，用PBS清洗细胞两次后，用巴氏吸管吸将T25培养瓶内的PBS吸干弃掉；向培养瓶中加入0.5mL胰蛋白酶消化液，待显微镜观察看到细胞质回缩，细胞间隙增大，细胞形态由长梭形变为圆形，此时向培养瓶中加入1mL冻存液并混匀；然后将培养瓶中的液体全部转移至冻存管中保存，先在4℃冷藏30min，之后至-20℃冷冻30min，然后在-80℃冰箱冷冻12h，最后投入液氮中长久保存。
e、细胞复苏：将步骤c得到的冻存的成纤维细胞从液氮中取出，马上放入37℃水浴中快速解冻，用镊子夹住冻存管来回晃动使其快速解冻；解冻后，将冻存液连同细胞一起转入T25培养瓶中，并加入10mL的原代培养基，轻轻吹打成单细胞悬液后，放置于培养箱(37℃、5％CO2、饱和湿度)内培养过夜，第二天弃掉培养液，用PBS清洗细胞2次，之后注入5mL传代培养液。
对比例1
一种乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞的分离培养方法，将保存液替换为不含HEPES的保存液(含100IU/mL的青霉素和100IU/mL链霉素的FBS高糖DMEM，FBS高糖DMEM中FBS的体积含量为10％)，其他方法和参数与实施例1相同，得到乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞。
对比例2
一种乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞的分离培养方法，将保存液替换为含100IU/mL的青霉素和100IU/mL链霉素的PBS缓冲液，其他方法和参数与实施例1相同，得到乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞。
试验例1
检测实施例1和对比例1-3中的组织样本的存活率
通过观察耳缘组织原代细胞分离长出情况来计算组织存活率。将步骤b中的1-2mm2大小的组织碎片均匀排布在细胞培养皿中，每个培养皿中接种20个组织碎片，置于培养箱(37℃、5％CO2、饱和湿度)中培养5-7天，观察每个组织碎片的细胞长出情况。组织存活率＝长出细胞的组织碎片数/组织碎片总数×100％。
结果显示：实施例1和对比例1-2中的组织样本存活率分别为78.33％、65.00％和63.33％，可见实施例1中的培养方法所获得的组织样本存活率最高。
对比例3
一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，胰蛋白酶消化液的加入量为1mL，其他方法和参数与实施例1相同，得到乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞。
对比例4
一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，步骤d中冻存液替换为：将DMSO、FBS和高糖DMEM按照1:8:1的体积比混合，其他方法和参数与实施例1相同，得到乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞。
试验例2
细胞活率测定
采用台盼蓝拒染试验检测实施例1和对比例3-4的细胞活性。将步骤c和步骤e所得的细胞分别制成悬液，与0.4％台盼蓝溶液按9:1的比例进行混合，混匀后静置3min，然后将混合液滴在细胞计数板上，在倒置显微镜下观察，分别记录染色细胞和未染色细胞数量。细胞活率＝未染色细胞/细胞总数×100％。
结果显示：实施例1和对比例3和4的细胞活率分别为95.2％、89.3％和88.5％，其中实例1的培养方法所获得的细胞活率最高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、以活体乌苏里貉为采集对象，对其耳部进行去毛和消毒，然后剪下0.5cm2-1.5cm2的耳缘组织，消毒、清洗，保存备用；所述清洗所用的清洗液为含500IU/mL青霉素、500IU/mL链霉素和8-12％体积含量FBS的高糖DMEM；所述保存所用的保存液为含3-4g/L的HEPES、100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和8-12％体积含量FBS的高糖DMEM；
b、将所述耳缘组织放入装有dispaseⅡ消化液的离心管中进行消化，取出所述耳缘组织，去除表皮，剪碎，得到耳缘组织碎片；将所述耳缘组织碎片置于原代培养基中培养，待所述耳缘组织碎片完全贴壁后，每间隔2d-3d天更换一次原代培养基，待所述耳缘组织碎片周围长出新细胞，即为原代细胞；所述dispaseⅡ消化液为含0.18-0.22mg/mL的dispaseⅡ的高糖DMEM，所述耳缘组织与所述dispaseⅡ消化液的体积比为1:4-6；所述消化的温度为35℃-40℃、时间为1h-2h；所述原代培养基为含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和8-12％体积含量FBS的高糖DMEM；
c、当所述原代细胞生长至汇合度达到80％-90％时，用PBS清洗，并加入胰蛋白酶消化液进行消化，所述胰蛋白酶消化液的加入量为耳缘组织碎片体积的3-5倍，当所述原代细胞由纤维状变为球状时，加入传代培养基终止消化并混匀，得到细胞悬浮液；将所述细胞悬浮液加入到细胞培养瓶中，进行第一次传代培养，待细胞贴壁后吸出培养液，并加入新的传代培养基继续培养，待细胞汇合度到达80％-90％，进行下一次传代培养；经过2-3次传代培养后，得到纯化后的乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞；所述传代培养基是含100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素和8-12％体积含量FBS的高糖DMEM；
d、向所述纯化后的乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞中加入细胞冻存液，进行细胞冻存，所述细胞冻存液的配制方法为：将DMSO、FBS和高糖DMEM按照1:7-9:0.8-1.2的体积比混合后，加入蔗糖，使所述蔗糖在所述细胞冻存液中的浓度达到65-70g/L；
e、将冻存的细胞进行细胞复苏。
2.如权利要求1所述的乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤a中，所述消毒所用的消毒液为75％的酒精溶液；
步骤a中，所述清洗的次数为2-3次。
3.如权利要求1所述的乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤b中，所述耳缘组织碎片的大小为1mm2-2mm2。
4.如权利要求1所述的乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤b中，所述培养的温度为35℃-40℃，CO2浓度为4％-6％，湿度为饱和湿度。
5.如权利要求1所述的乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤c中，所述用PBS清洗的次数为2-3次；
和/或步骤c中，所述胰蛋白酶消化液为含2-3g/L的胰蛋白酶、0.35-0.40g/L的EDTA·4Na和9-11mg/L的酚红的Hanks平衡盐溶液。
6.如权利要求1所述的乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤c中，所述传代培养的温度为35℃-40℃，CO2浓度为4％-6％，湿度为饱和湿度。
7.如权利要求1所述的乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤d中，所述细胞冻存的方法为：将所述纯化后的乌苏里貉耳缘组织成纤维细胞用胰蛋白酶消化，待细胞形态变圆后，加入细胞冻存液混匀，先在4℃冷藏20min-30min，再置于-20℃冷冻20min-30min，取出在-80℃冰箱冷冻8h-12h，最后投入液氮中，完成细胞冻存。
8.如权利要求1所述的乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法，其特征在于：步骤e中，所述细胞复苏的方法为：将冻存的细胞取出放入37℃-42℃的水浴锅中解冻，转入细胞培养瓶中，加入所述原代培养基，混匀后，35℃-40℃、4％-6％CO2和饱和湿度条件下培养8h-12h，弃掉培养液，用PBS清洗细胞2-3次，加入所述传代培养基混匀，完成细胞复苏。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210803916.5A CN115161269B (zh) | 2022-07-07 | 2022-07-07 | 一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210803916.5A CN115161269B (zh) | 2022-07-07 | 2022-07-07 | 一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115161269A CN115161269A (zh) | 2022-10-11 |
| CN115161269B true CN115161269B (zh) | 2023-05-30 |
Family
ID=83492341
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210803916.5A Active CN115161269B (zh) | 2022-07-07 | 2022-07-07 | 一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115161269B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102978154A (zh) * | 2012-12-23 | 2013-03-20 | 内蒙古大学 | 一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法 |
| CN112391337A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-02-23 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种鸽嗉囊成纤维细胞的分离及原代培养方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101870962B (zh) * | 2010-06-12 | 2012-07-04 | 中国科学院西北高原生物研究所 | 藏羚羊皮肤成纤维细胞系的构建方法 |
| CN102719394B (zh) * | 2012-06-20 | 2013-07-31 | 山东农业大学 | 山羊真皮成纤维细胞系的构建方法 |
| CN104059874A (zh) * | 2014-04-10 | 2014-09-24 | 金华市农业科学研究院 | 金华猪耳真皮成纤维细胞系的构建方法 |
| CN114317412A (zh) * | 2022-01-14 | 2022-04-12 | 中国计量大学 | 一种绵羊皮肤成纤维细胞及其制备方法 |
-
2022
- 2022-07-07 CN CN202210803916.5A patent/CN115161269B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102978154A (zh) * | 2012-12-23 | 2013-03-20 | 内蒙古大学 | 一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法 |
| CN112391337A (zh) * | 2020-11-30 | 2021-02-23 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种鸽嗉囊成纤维细胞的分离及原代培养方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115161269A (zh) | 2022-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TWI773693B (zh) | 從臍帶的羊膜分離間質幹細胞的方法、從臍帶的羊膜分離的間質幹細胞群以及用於從臍帶的羊膜分離間質幹細胞的細胞培養基 | |
| CN101611139B (zh) | 利用微载体的产后来源的细胞的体外扩增 | |
| KR100908481B1 (ko) | 중간엽 줄기세포 배양 배지 및 이를 이용한 중간엽줄기세포의 배양 방법 | |
| CN107810948B (zh) | 一种人脐带间充质干细胞的无血清冻存液 | |
| CN103275922B (zh) | 一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法 | |
| CN104726406B (zh) | 一种诱导牙髓间充质干细胞分化为神经细胞的方法 | |
| CN106465710B (zh) | 脂肪组织冻存液及脂肪组织冻存方法 | |
| CN105713871A (zh) | 一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法 | |
| CN114317443B (zh) | 乳腺癌类器官培养液及其培养试剂组合和培养方法 | |
| CN102660494A (zh) | 山羊乳腺上皮细胞的建系方法 | |
| WO2007117565A9 (en) | Standardization of processes for culturing primary cells | |
| CN102634480A (zh) | 一种分离培养肝脏原代细胞的方法 | |
| CN114480273A (zh) | 用于获得间充质干细胞及其外泌体的培养基及其制备方法 | |
| CN104651305A (zh) | 一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法 | |
| CN109468271A (zh) | 一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法 | |
| CN101353644B (zh) | 一种血管内皮细胞及其制备方法与应用 | |
| CN115161269B (zh) | 一种乌苏里貉成纤维细胞的分离培养方法 | |
| CN109468267B (zh) | 一种子宫内膜干细胞的制备方法 | |
| CN108660108A (zh) | 一种可增强脐带间充质干细胞免疫调节能力的方法 | |
| CN103509752B (zh) | 湖北白猪胎儿成纤维细胞系 | |
| CN102796697A (zh) | 克服牛体外胚胎早期发育阻滞的培养液配制和培养方法 | |
| RU2783992C2 (ru) | Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из амниотической мембраны пуповины с применением клеточной культуральной среды | |
| CN116584478A (zh) | 一种含羟乙基淀粉hes的临床用cef冷冻保存液及其制备方法 | |
| CN112458048A (zh) | 一种牙髓干细胞原代培养促贴壁基质及原代牙髓干细胞的培养方法 | |
| CN116240167A (zh) | 一种牙髓干细胞提取制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 050041 479 Shengli North Street, Shijiazhuang, Hebei Patentee after: SHIJIAZHUANG ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCES Patentee after: Beijing Sanyuan Seed Industry Technology Co.,Ltd. Feed Branch Address before: 050041 479 Shengli North Street, Shijiazhuang, Hebei Patentee before: SHIJIAZHUANG ACADEMY OF AGRICULTURE AND FORESTRY SCIENCES Patentee before: Beijing three yuan seed industry Polytron Technologies Inc. feed branch |