CN109468271A - 一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法 - Google Patents

一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法。该方法采用少量多次加液方式，使小组织块也能达到优良的贴壁效果；使用自主研发的成纤维细胞选择性培养基，使成纤维原代细胞快速爬出生长，纯度在95％以上；发明人还提供了一种纯化成纤维细胞的培养方法，可以将成纤维细胞纯度提高到99％。本发明提供的方法可大大减小皮肤组织块提供者创伤面积，有效缩短成纤维原代细胞培养时间，对组织块伤害小，可以稳定进行多次成纤维细胞原代培养，操作简便。本发明不仅适用于人和小鼠等皮肤组织块成纤维原代细胞培养，也适用于脐带来源、胎盘来源干细胞、癌旁组织等原代细胞培养，具有广阔的应用前景。

Description

一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法。
背景技术
成纤维细胞是人真皮结缔组织中最常见的细胞，它可以合成胶原蛋白和弹性蛋白，构成皮肤组织的结构框架；可合成细胞外的纤维、基质和蛋白多糖，为新生的血管和增生的细胞提供支架；能促进软组织的强化作用和促进组织的再生作用；可以为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)细胞技术的研究提供种子细胞等。如何从皮肤组织中分离获得足够数量且具有很好活力的成纤维细胞是以上研究的关键步骤。
目前，皮肤成纤维细胞的分离培养方法主要有两类：酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法利用胰蛋白酶、胶原酶等对皮肤组织进行消化，去除组织表皮后，进行离心、重悬和培养，得到皮肤成纤维细胞；该方法可以把单个细胞从组织块中分离出来，在短时间内爬出纯度较高的成纤维细胞，但操作较为繁琐，对操作员要求较高，并且胶原酶对细胞存在不利影响，导致细胞的贴壁率低，活性不高。组织块法是将皮肤组织块直接接种于培养皿中进行培养，该方法操作简单，但组织块贴壁率较低，成纤维细胞爬出较慢，一般5～7天方有单细胞游出，20天以上才可进行传代，并且细胞纯度低。
本发明提供了一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法。该方法在常规组织块贴壁法的基础上，加以优化改良：采用少量多次加液方式，使小组织也能达到优良的贴壁效果；同时使用自主研发的成纤维细胞选择性培养基，使成纤维原代细胞快速爬出生长，且纯度在95％以上；在此基础上，发明人还提供了一种纯化成纤维细胞的培养方法，可将细胞纯度提高到99％。本发明提供的方法可大大减小皮肤组织块提供者创伤面积，有效缩短成纤维原代细胞培养时间，对组织块伤害小，可以稳定进行多次成纤维细胞原代培养，操作简便，实用性强，因此本发明在成纤维原代细胞培养及其应用等方面具有广阔的应用前景。本发明不仅适用于人和小鼠等皮肤组织块成纤维原代细胞培养，同时也适用于脐带来源干细胞、胎盘来源干细胞、癌旁组织等原代细胞培养。
发明内容
为了解决现有技术中存在的种种缺陷，本发明在常规组织块贴壁法的基础上，加以优化改良，旨在提供一种操作简单的皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，在保证细胞活率高的同时，有效提高贴壁率，缩短从皮肤组织获得稳定高纯度成纤维细胞所需要的原代培养时间。具体地，本发明提供了以下技术方案，以实现上述目的：
第一方面，本发明提供了一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，包括以下步骤：
步骤(1)：先用碘酒或酒精擦拭取皮区皮肤消毒，用活检取样器、手术刀或其他工具择一取皮肤组织块，取皮方式按照“活检取样法”或手术取样的标准流程操作将取下的皮肤组织块浸泡于组织块保存液(或含双抗的PBS、生理盐水)中；
步骤(2)：将浸泡后皮肤组织块转移至含双抗的PBS(或生理盐水)中洗涤5～8遍，以在分离细胞前洗去血丝，并防止污染；
步骤(3)：修剪皮肤组织并去除皮下组织、脂肪及残留毛细血管，把皮肤组织剪切成小块；
步骤(4)：将皮肤组织块转移至培养皿里，加选择性培养基润湿组织块，使组织块不易干燥，并促进成纤维细胞爬出。放置37℃，5％CO2培养箱静置1～2h。期间不可移动培养皿。
步骤(5)：将装有皮肤组织块的培养皿取出，补加选择性培养基至没过皮肤组织块。放置37℃，5％CO2培养箱培养；
步骤(6)：三天更换一次新鲜的选择性培养基，继续培养，直至获得皮肤成纤维原代细胞；
步骤(7)：获得皮肤成纤维原代细胞后，更换含营养物质比例更高的选择性培养基继续培养，细胞汇合度达80％～90％时，即进行消化传代。
优选地，在上述皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法中，步骤(1)至(7)中所述的双抗为青霉素-链霉素溶液，其含量优选为1％。
优选地，在上述皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法中，步骤(1)至(7)中所述的选择性培养基组成为，含青霉素-链霉素溶液、促成纤维细胞生长的因子、血清或血清替代物择一的细胞基础培养基。
优选地，在上述皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法中，步骤(3)至(6)包括：修剪皮肤组织并去除皮下组织、脂肪及残留毛细血管，皮肤组织块尽可能剪成小块，以便于单个细胞快速分离。并加一滴选择性培养基润湿组织块，在37℃、5％CO2的培养箱中静置培养1h。然后，补加选择性培养基至没过皮肤组织块，继续培养。值得说明的是，刚加一滴培养液润湿组织块后，立马放到培养箱静置的1～2h，必须静置；换言之，在此期间切忌移动培养皿以免影响细胞的贴壁。
第二方面，本发明提供了一种纯化成纤维细胞的培养方法，包括以下步骤：
a.根据权利要求1～9中所述的皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法制得成纤维原代细胞；
b.待步骤a中制得的皮肤成纤维原代细胞的汇合度达到80％后，进行传代培养：先把培养液上清弃去，用PBS洗涤成纤维原代细胞，把PBS弃去。用质量百分比浓度为0.05％～0.3％的胰蛋白酶液进行消化，快速轻拍培养皿壁使细胞脱落；接着加入新鲜选择性培养基停止消化，把细胞悬液吸出，得到成纤维细胞；
c.离心，弃上清，用选择性培养基重悬细胞并接种到新培养皿培养，细胞汇合度达80％～90％时得到更高纯度的成纤维细胞。
优选地，在上述皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法中，步骤(b)至(c)中所述的选择性培养基组成为，含促成纤维细胞生长的因子、血清或血清替代物择一的细胞基础培养基。
优选地，在上述纯化皮肤成纤维细胞的培养方法中，步骤a～c中包括：利用成纤维细胞传代方法使成纤维细胞脱落进行传代，使用自主研发的成纤维细胞选择培养基可以提高成纤维细胞生长速度，增加成纤维细胞生长的竞争优势，并且抑制杂细胞生长，从而获得纯度更高的成纤维细胞。
具体实施方式
[实施例1]
步骤(1)：选取小鼠。用断颈法处死。取皮方式按照手术取样标准流程操作。用碘酒或酒精擦拭取皮区皮肤消毒，用手术刀取皮肤组织块，将取下的皮肤组织块浸泡于含双抗的保存液中运输到细胞房超净工作台；
步骤(2)：将浸泡后皮肤组织块转移至另一含双抗的PBS中洗涤5遍，以在分离细胞前洗去血丝，并防止污染；
步骤(3)：修剪皮肤组织并去除皮下组织、脂肪及残留毛细血管，把皮肤组织剪切成小块；
步骤(4)：将皮肤组织块转移至100mm培养皿里，加含双抗、促成纤维细胞生长的因子和牛血清的选择性培养基润湿组织块。放置37℃，5％CO2培养箱静置1h；
步骤(5)：将装有皮肤组织块的100mm培养皿取出，补加含双抗、促成纤维细胞生长的因子和牛血清的选择性培养基至没过组织块。放置37℃，5％CO2培养箱培养；
步骤(6)：三天更换一次新鲜的含双抗、促成纤维细胞生长的因子和牛血清的选择性培养基，继续培养，直至获得皮肤成纤维原代细胞；
步骤(7)：获得皮肤成纤维原代细胞后，更换含双抗比例不变，但含促成纤维细胞生长的因子和牛血清比例更高的选择性培养基继续培养，细胞汇合度达80％～90％时，即进行消化传代；
步骤(8)：待步骤(7)中制得的皮肤成纤维原代细胞的汇合度达到80％后，进行传代培养：先把培养液上清弃去，用PBS洗涤成纤维原代细胞，把PBS弃去，用质量百分比浓度为0.2％的胰蛋白酶液进行消化，快速轻拍培养皿壁使细胞脱落；接着加入含促成纤维细胞生长的因子和牛血清的选择性培养基停止消化，把细胞悬液吸出，得到成纤维细胞；离心，弃上清，用新鲜的含促成纤维细胞生长的因子和牛血清的选择性培养基重悬细胞并接种到新培养皿培养。
在本案例中，组织块于第3天开始爬出成纤维细胞，并于培养后的第7天细胞汇合度达80％～90％。P0细胞的纯度达到95％，P3细胞的纯度达到99％。
[实施例2]
步骤(1)：选取志愿者，年龄25岁。皮肤组织来源于整形外科手术剩余的皮肤组织，将皮肤组织块浸泡于组织块保存液中，运输至细胞房超净工作台进行处理；
步骤(2)：将浸泡后皮肤组织块转移至含双抗的PBS中洗涤6遍，以在分离细胞前洗去血丝，并防止污染；
步骤(3)：修剪皮肤组织并去除皮下组织、脂肪及残留毛细血管，把皮肤组织剪切成小块；
步骤(4)：将皮肤组织块转移至100mm培养皿里，加含双抗、促成纤维细胞生长的因子和血清的选择性培养基润湿组织块。放置37℃，5％CO2培养箱静置0.5h；
步骤(5)：将装有皮肤组织块的100mm培养皿取出，补加含双抗、促成纤维细胞生长的因子和血清的选择性培养基至刚好能浸过组织块。放置37℃，5％CO2培养箱培养；
步骤(6)：三天更换一次新鲜的含双抗、促成纤维细胞生长的因子和血清的选择性培养基，继续培养，直至获得皮肤成纤维原代细胞；
步骤(7)：获得皮肤成纤维原代细胞后，更换含双抗比例不变，但含促成纤维细胞生长的因子和血清比例更高的选择性培养基继续培养，细胞汇合度达80％～90％时，即进行消化传代；
步骤(8)：待步骤(1)至(7)中制得的皮肤成纤维原代细胞的汇合度达到90％后，进行传代培养：先把培养液上清弃去，用PBS洗涤成纤维原代细胞，把PBS弃去，用质量百分比浓度为0.3％的胰蛋白酶液进行消化，快速轻拍培养皿壁使细胞脱落；接着加入促成纤维细胞生长的因子和血清的选择性培养基停止消化，得到成纤维细胞；离心，弃上清，用新鲜的促成纤维细胞生长的因子和血清的选择性培养基选择性培养基重悬细胞并接种到新培养皿培养。
在本案例中，组织块于第3天开始爬出成纤维细胞，并于培养后的第8天细胞汇合度达80％～90％。P0细胞的纯度达到95％，P3细胞的纯度达到99％。
[实施例3]
步骤(1)：选取志愿者，年龄50岁。取皮方式按照“活检取样法”的标准流程操作。先用碘酒或酒精擦拭取皮区皮肤消毒，用3mm取样器取3个皮肤组织块，将取下的皮肤组织块浸泡于组织块保存液中运输至实验室处理；
步骤(2)：将浸泡后皮肤组织块转移至含双抗的PBS中洗涤5遍，以在分离细胞前洗去血丝，并防止污染；
步骤(3)：把皮肤组织剪切成小块；
步骤(4)：将皮肤组织块转移至100mm培养皿里，加含双抗、促成纤维细胞生长的因子和牛血清的选择性培养基润湿组织块。放置37℃，5％CO2培养箱静置0.5h；
步骤(5)：将装有皮肤组织块的100mm培养皿取出，补加含双抗、促成纤维细胞生长的因子和牛血清的选择性培养基至刚好能浸过组织块。放置37℃，5％CO2培养箱培养；
步骤(6)：三天更换一次新鲜的含双抗、促成纤维细胞生长的因子和牛血清的选择性培养基，继续培养，直至获得皮肤成纤维原代细胞；
步骤(7)：获得皮肤成纤维原代细胞后，更换含双抗比例不变，但含促成纤维细胞生长的因子和牛血清比例更高的选择性培养基继续培养，细胞汇合度达80％～90％时，即进行消化传代；
步骤(8)：待步骤(1)至(7)中制得的皮肤成纤维原代细胞的汇合度达到85％后，进行传代培养：先把培养液上清弃去，用PBS洗涤成纤维原代细胞，把PBS弃去；用质量百分比浓度为0.25％的胰蛋白酶液进行消化，快速轻拍培养皿壁使细胞脱落；加入新鲜的含促成纤维细胞生长的因子和牛血清的选择性培养基停止消化，把细胞悬液吸出，得到成纤维细胞；离心，弃上清，用新鲜的含促成纤维细胞生长的因子和牛血清的选择性培养基重悬细胞并接种到新培养皿培养。
在本案例中，组织块于第3天开始爬出成纤维细胞，并于培养后的第8天细胞汇合度达80％～90％，P0细胞的纯度达到95％，P3细胞的纯度达到99％。
综上所述，本发明提供了一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法。皮肤成纤维细胞的分离培养方法主要有两类：酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法利用胰蛋白酶、胶原酶等对皮肤组织进行消化，去除组织表皮后，进行离心、重悬和培养，得到皮肤成纤维细胞；该方法操作较为繁琐，消化时间较长，且胶原酶对细胞存在不利影响，导致细胞的贴壁率低，活性不高。组织块法是将皮肤组织块直接接种于培养皿中进行培养，该方法操作简单，但组织块贴壁率较低，成纤维细胞爬出较慢，一般5-7天方有单细胞游出，20天以上才可进行传代，细胞纯度低。本发明之方法在常规组织块贴壁法的基础上，加以优化改良：采用少量多次加液方式，使小组织也能达到优良的贴壁效果；同时使用自主研发的成纤维细胞选择性培养基，使成纤维原代细胞快速爬出生长，纯度达95％以上；在此基础上，发明人还提供了一种纯化成纤维细胞的培养方法，可以将成纤维细胞纯度提高到99％。
成纤维细胞是人真皮结缔组织中最常见的细胞，它可以合成胶原蛋白、弹性蛋白和细胞外基质，构成皮肤组织的结构框架；可合成细胞外的纤维、基质和蛋白多糖，为新生的血管和增生的细胞提供支架；能促进软组织的强化作用和促进组织的再生作用；可以为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)细胞技术的研究提供种子细胞等。本发明提供的方法可大大减小组织块提供者创伤面积，有效缩短成纤维原代细胞培养时间，对组织块伤害小，可以稳定进行多次成纤维细胞原代培养，操作简便，实用性强，本发明在成纤维原代细胞培养及其应用等方面具有广阔的应用前景。本发明不仅适用于人和小鼠等皮肤组织块成纤维原代细胞培养，同时也适用于脐带来源干细胞、胎盘来源干细胞、癌旁组织等原代细胞培养。

Claims (10)

1.一种皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：用活检取样器、手术刀或其他工具择一取皮肤组织块，将取下的皮肤组织块浸泡于组织块保存液(或含双抗的PBS、生理盐水)中；
步骤(2)：将皮肤组织块转移至含双抗的PBS(或生理盐水)中洗涤5～8遍；
步骤(3)：修剪皮肤组织并去除皮下组织、脂肪，把皮肤组织剪切成小块；
步骤(4)：将皮肤组织块转移至培养皿里，加一滴选择性培养基润湿组织块，放置37℃，5％CO2培养箱静置1～2h；
步骤(5)：将装有皮肤组织块的培养皿取出，补加选择性培养基至没过组织块，放置37℃，5％CO2培养箱培养；
步骤(6)：三天更换一次新鲜选择性培养基，继续培养，直至获得皮肤成纤维原代细胞；
步骤(7)：获得皮肤成纤维原代细胞后，更换含营养物质比例更高的选择性培养基继续培养，细胞汇合度达80％～90％时，即进行消化传代。
2.根据权利要求1所述的皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤(1)至(7)中所述的皮肤组织块为人皮肤组织块、动物皮肤组织块。
3.根据权利要求1所述的皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤(1)至(7)中所述的组织块培养方法同时适用脐带来源干细胞、胎盘来源干细胞、癌旁组织等原代细胞培养。
4.根据权利要求1所述的皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的组织块保存液组成为含双抗的细胞基础培养基。
5.根据权利要求1所述的皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤(4)至(6)的加液方法为少量多次，具体为：将皮肤组织块转移至培养皿里，加入1～2滴选择性培养基润湿组织块，防止组织块干燥，放置37℃，5％CO2培养箱静置1～2h，期间不可移动培养皿。然后，将装有皮肤组织块的培养皿取出，补加选择性培养基至刚好没过组织块。之后每3天更换一次新鲜选择性培养基，继续培养。
6.根据权利要求1所述的皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，所述的选择性培养基为含有双抗、促成纤维细胞生长的因子、血清或血清替代物择一的细胞基础培养基，其中所述选择性培养基组成为：含1％～2％双抗、0.001％～0.003％促成纤维细胞生长的因子、10％～15％血清或血清替代物的细胞基础培养基。
7.根据权利要求1所述的皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法，其特征在于，步骤(1)至(7)中所述的双抗优选为青霉素-链霉素溶液，其含量优选为1％。
8.一种纯化成纤维细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.根据权利要求1～7中所述的皮肤组织来源成纤维细胞快速分离培养方法制得成纤维原代细胞；
b.待步骤a中制得的皮肤成纤维原代细胞的汇合度达到80％后，进行传代培养：先把培养液上清弃去，用PBS洗涤成纤维原代细胞，把PBS弃去，用质量百分比浓度为0.05％～0.3％的胰蛋白酶液进行消化，快速轻拍或用吸管等吹打培养皿壁使细胞脱落；接着加入新鲜选择性培养基停止消化，把细胞悬液吸出，得到成纤维细胞；
c.离心，弃上清，用选择性培养基重悬细胞并接种到新培养皿培养。
9.根据权利要求8所述的纯化成纤维细胞的培养方法中，其特征在于步骤b中所述的胰蛋白酶液优选为质量百分比浓度为0.25％。
10.根据权利要求8所述的纯化成纤维细胞的培养方法中，其特征在于，所述的选择性培养基为含有促成纤维细胞生长的因子、血清或血清替代物择一的细胞基础培养基，其中所述选择性培养基组成为：含0.001％～0.003％促成纤维细胞生长的因子、10％～15％血清或血清替代物的细胞基础培养基。
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