CN115161273A

CN115161273A - 一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法

Info

Publication number: CN115161273A
Application number: CN202211021476.4A
Authority: CN
Inventors: 林煌; 马嘉兴; 赵银花; 崔玥
Original assignee: Beijing Anzhen Hospital
Current assignee: Beijing Anzhen Hospital
Priority date: 2022-08-24
Filing date: 2022-08-24
Publication date: 2022-10-11

Abstract

本发明提供了一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法，包括将皮肤组织处理为组织碎片贴于培养瓶中进行湿盒贴壁培养的步骤。本方法免去胰蛋白酶消化对细胞的损伤，以细小碎片的方式，将皮肤组织均匀贴附于培养瓶中，在相同组织大小的条件下，最大程度提高组织贴壁面积和贴壁效率；采用湿盒贴壁法，可以保持培养瓶内湿度，减少细胞干燥死亡，延长组织贴壁时间，降低贴壁时间控制的难度，提高组织贴壁的成功率；优化组织间隔，最大化细胞间相互作用，促进增殖，并使用无血清的成纤维细胞完全培养基培养，在体外培养阶段避免伦理问题。

Description

一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法

发明领域：

本申请涉及细胞培养，特别是自体成纤维细胞培养技术领域。具体地，本申请提供了一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法。

背景技术：

成纤维细胞是真皮组织中最主要的组成部分，在伤口的愈合过程中起到至关重要的作用。成纤维细胞在皮肤修复和再生中的潜力逐渐被认识，如：体外培养并通过基因转染将其诱导转化为“类心肌细胞”对慢性心力衰竭进行细胞移植治疗成为热点；自体成纤维细胞移植通过分泌生长因子及细胞因子促进伤口再上皮化、细胞外基质形成、抑制疤痕增长，对烧伤和糖尿病足的治疗起到非常显著的效果。自体真皮成纤维细胞诱导了皮肤功能的正常恢复和最小的瘢痕。与同种异体真皮成纤维细胞相比，移植自体真皮成纤维细胞具有更好的生存能力，促进了伤口的再上皮化和伤口愈合。

改善法令纹、面部松弛、除皱、雄激素性脱发等长期以来都是以手术治疗作为主要手段，其效果虽然持久，然而术后长时间的恢复期，和术后并发症如：瘢痕，术后水肿及感染等都给求美者带来了很大不便。因此对于微创治疗的需求随之增加，如今越来越多的填充材料及药物应用于临床，肉毒素以及如透明质酸等美容填充材料被广泛开发。然而因为填充材料在注射部位的吸收、代谢，因此需要不断地定期进行注射才能维持效果。此外如；过敏、皮肤色素沉淀、皮下结节、栓塞等并发症也是填充治疗的一大难题。成纤维细胞在皮肤结构和完整性中起到至关重要的作用。使用自体成纤维细胞作为填充物注射到真皮，可以有效的避免异体填充物所导致的过敏，并且自体成纤维细胞持续分泌的胶原蛋白和各种细胞外基质蛋白可以使治疗的持续时间大大延长。

自体成纤维细胞作为一种细胞治疗的方法，安全性是有所保证的。2011年，FDA批准将自体成纤维细胞注入真皮，以改善成年人中度至严重的面部鼻唇沟皱纹的外观(LAVIV，Fibrocell Technologies，Exton，PA，USA)。在欧洲，自体成纤维细胞疗法被认为是一种具有医院豁免的高级治疗药物产品(ATMP-HE)，符合医药产品要求的药品自体小规模非常规细胞治疗的生产不需要EMA(欧洲药品管理局)的集中上市许可。目前研究表明，成纤维细胞具有极强的稳定性，在培养中增殖后仍然保持其功能特性。自体成纤维细胞注射入体内后不会形成肿瘤样生长或诱发肿瘤。

目前成纤维细胞常规培养方法分为消化法和组织块法。消化法操作复杂，组织需求量大，胰酶和胶原酶消化会对细胞造成极大损伤，导致细胞增殖能力和活性降低，培养成纤维细胞纯度较低。组织块法中组织块过大，浪费组织并不利于细胞爬出。此外贴壁过程容易干燥，不易掌控组织块贴壁时间，导致细胞尚未贴壁或干枯死亡。此外常规培养过程，成纤维细胞培养基中含有的胎牛血清应用于细胞增殖培养，也会增免疫排斥等风险。

成纤维细胞在体外培养随着时间，其形态及细胞功能都会发生改变，培养所需时间越久细胞的转化就会愈加明显。并且原代细胞培养时间长短，极大程度影响细胞的增殖、分泌细胞外基质的能力。本方法极大程度增加组织利用率，缩短培养时间，提高培养效率。对于维持成纤维细胞表型及功能，以及后续自体血清培养自体成纤维细胞提供了更为可靠的基础。此外免去血清的使用，可以有效提高自体细胞移植中所用细胞的安全性，减少和杜绝自体移植过程中免疫排斥等危险，并大大降低培养成本。目前自体细胞移植需求火爆，价格高昂，相较自体细胞培养成本，具有极大利润空间；此外培养过程无需过多人工成本，培养周期更短，具有极高经济效益。

发明内容

本发明针对现有胰酶消化法及组织块贴壁法现有的技术缺陷，提供了一种在较少组织情况下，避免使用胰蛋白酶损伤组织样本，提高原代成纤维细胞增殖活性及培养成功率，降低原代成纤维细胞增殖过程中细胞衰老程度，高效获取大量未衰老的自体成纤维细胞的培养方法。

一方面，本申请提供了一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法，包括将皮肤组织处理为组织碎片贴于培养瓶中进行贴壁培养。

进一步地，所述贴壁培养在湿盒中进行。

进一步地，所述贴壁培养中将组织碎片贴壁的培养瓶倒置，在贴壁之前向倒置培养瓶的下部中加入培养基。

进一步地，所述组织碎片大小为0.1mm*0.1mm-0.5mm*0.5mm。

进一步地，所述组织碎片大小为0.2mm*0.2mm。

进一步地，将所述组织碎片间隔1mm-5mm贴于培养瓶中。

进一步地，将所述组织碎片间隔3mm贴于培养瓶中。

进一步地，所述方法包括用含青霉素或链霉素的无菌缓冲液的容器转移皮肤组织的步骤；以及用含青霉素或链霉素的无菌缓冲液清洗并减去多余组织的步骤。

进一步地，所述方法包括将培养瓶倒置后，加入成纤维细胞无血清完全培养基培养的步骤。

进一步地，加入的培养基为4ml成纤维细胞无血清完全培养基。

进一步地，所述培养在5％CO₂，37℃培养箱中进行。

另一方面，本申请提供了上述方法在制备美容用、伤口治疗用成纤维细胞中的用途。

本申请中的皮肤组织可取各种皮肤组织，不限于实施例中所示的眼部皮肤组织。

由于实际操作条件的制约，本申请中的组织碎片大小为约数，本领域技术人员可以通过适当的操作来提供所需的组织碎片大小。

本申请中的“湿盒”是指基本密闭的，用于培养细胞的培养瓶容器。本申请中的“湿盒”引用了“免疫组化中湿盒”的原理，将组织碎片贴壁的培养瓶倒置，并将本应于贴壁结束后加入的培养基，提前加入到细胞贴壁面朝上的倒置培养瓶中，以确保贴壁过程中的环境湿润，保护细胞碎片中的细胞在贴壁过程中免受二次损伤。

本申请中所述的美容包括但不限于出于医疗目的或者非医疗目的处理法令纹、皮肤松弛、皱纹、脱发等的方法。

本申请中的自体成纤维细胞包括各种来源和种类的自体成纤维细胞；本申请中的“自体”是指成纤维细胞来源为取自人或动物个体的成纤维细胞，而非市售或者保藏的细胞。“自体”并不限定整个培养过程必须依赖于具体个体的细胞来完成，即本申请的方法完全可以在产业上应用。

与现有的贴壁培养法相比，本发明将皮肤组织块处理为碎片贴于培养瓶中进行贴壁，最大程度提高组织贴壁面积和贴壁效率，使得培养所需组织样本量远小于常规培养方法。此外常规贴壁法由于组织块过大，贴壁时间不易掌控，时间过短，则加入培养基后组织块漂浮，细胞无法爬出生长；时间过长，则组织块干枯，细胞坏死。为解决上述问题，本方法使用湿盒法贴壁进行细胞培养，可以保持培养瓶内湿度，减少细胞干燥死亡，延长组织贴壁时间，降低贴壁时间控制的难度，提高组织贴壁的成功率。此外本方法优化组织间隔，最大化细胞间相互作用，促进增殖，抵抗原代细胞提取与增殖过程中的细胞过度衰老问题。与胰酶消化法相比，本方法避免使用胰蛋白酶、中性蛋白酶、胶原酶等对成纤维细胞的损伤及衰老，并使用高选择性无血清的成纤维细胞完全培养基培养，在体外培养阶段避免伦理问题。

本发明的方法在组织块培养中，首次将皮肤处理为组织碎片贴于培养瓶中进行贴壁；为防止组织碎片干燥和细胞死亡，使用湿盒法贴壁进行细胞培养。并规范组织碎片处理方法和碎片间隔的最优距离，最大化细胞间相互作用，促进增殖，大幅提升各个组织碎片间细胞融合速度。本发明的方法免去胰蛋白酶消化对细胞的损伤。并以细小碎片的方式，将皮肤组织均匀贴附于培养瓶中，在相同组织大小的条件下，最大程度提高组织贴壁面积和贴壁效率。以往贴壁法由于组织块过大，贴壁时间不易掌控，时间过短，则加入培养基后组织块漂浮，细胞无法爬出生长；时间过长，则组织块干枯，细胞坏死。本方法采用湿盒贴壁法，可以保持培养瓶内湿度，减少细胞干燥死亡，延长组织贴壁时间，降低贴壁时间控制的难度，提高组织贴壁的成功率。此外本方法优化组织间隔，最大化细胞间相互作用，促进增殖，并使用无血清的成纤维细胞完全培养基培养，在体外培养阶段避免伦理问题。

本发明相比常规组织块成纤维细胞培养法，在贴壁组织块的处理上进行了改进，相同大小皮肤，处理后的组织碎片贴壁面积相较常规方法提高5倍。并改良使用湿盒法防止碎片在贴壁过程中过度干燥，大大提高碎片组织贴壁的成功率。在培养过程中使用不含血清的成纤维细胞完全培养基，在体外培养阶段避免伦理问题。本方法在获取皮肤、组织碎片处理、细胞原代和传代培养中操作简单，所需器械和设备简易。本方法具有可行性，可以进行大规模规范化生产。

成纤维细胞在体外培养随着时间，其形态及细胞功能都会发生改变，培养所需时间越久细胞的转化就会愈加明显。并且原代细胞培养时间长短，极大程度影响细胞的增殖、分泌细胞外基质的能力。本方法极大程度增加组织利用率，缩短培养时间，提高培养效率。对于维持成纤维细胞表型及功能，以及后续自体血清培养自体成纤维细胞提供了更为可靠的基础。此外免去血清的使用，可以有效提高自体细胞移植中所用细胞的安全性，减少和杜绝自体移植过程中免疫排斥等危险，并大大降低培养成本。目前自体细胞移植需求高，价格高昂，相较自体细胞培养成本，具有极大利润空间；此外培养过程无需过多人工成本，培养周期更短，具有极高经济效益。

人体细胞培养正在蓬勃发展，以取代各种人体组织，加之我国一直大力发展自体再生、细胞移植等高新技术，市场前景一片广阔。目前，自体成纤维细胞应用于皮肤修复已成为一个重要的临床研究方向。FDA已经批准临床使用自体成纤维细胞(LAVIVTM)改善成人的鼻唇沟皱纹，有多项临床研究证实自体成纤维细胞移植的安全性。随着经济飞快增长，物质需求富足，人们对于容貌及面部抗衰、除皱及年轻化以及外烧伤治疗、瘢痕增生的需求也在日益增加。此多，市场上微创注射治疗在整形与美容领域占比也在剧烈增加，自体成纤维细胞注射具有无排异性、注射效果稳定、持续时间长等优点，且目前自体细胞移植在烧伤整形和医疗美容方面正处于空白期，如果市场开拓后，考虑全国医疗美容患者人数，市场十分广阔。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的成纤维细胞贴壁培养3天爬出情况图；

图2为本发明成纤维细胞贴壁培养7天爬出情况图；

图3为本发明第2代成纤维细胞波形蛋白免疫荧光鉴定图；

图4为本发明第2代成纤维细胞DAPI细胞核免疫荧光染色图；

图5为本发明第2代成纤维细胞免疫荧光Merge染色图；

图6为本发明第4代成纤维细胞CCK-8增殖曲线检测图；

图7为本发明的第8代成纤维细胞β半乳糖苷酶染色检测衰老成纤维细胞图。

具体实施方式

实施例1：人自体原代成纤维细胞提取与增殖。

(1)人自体原代成纤维细胞提取

1)取材：外科重睑手术废弃皮肤组织，取下组织后用含1％青霉素/链霉素的PBS无菌离心管在2-8℃下转移至细胞培养间，在取下后4小时内提取细胞。

2)组织清洗：在无菌台上使用含1％青霉素/链霉素的PBS冲洗3次，用高压灭菌的眼科剪剪去出多余脂肪、眼轮匝肌以及结缔组织。

3)修剪组织：将组织剪成0.2mm*0.2mm大小组织碎片。用眼科镊将组织块碎片真皮面向下间隔3mm均匀贴附于25cm²培养瓶中。

4)湿盒倒置贴壁：将步骤3)中培养瓶以组织碎片贴附面朝上倒置后，向培养瓶下层加入4ml成纤维细胞无血清完全培养基，放入5％CO₂，37℃培养箱过夜8-10小时。

5)培养细胞：贴壁固定后将培养瓶正置放入培养箱中继续培养，每日观察成纤维细胞从组织碎片中爬出情况。

从图1实验结果显示，培养至第3天实验组组织碎片中有细胞成功迁移出来，对照组(对照组采用常规组织块贴壁法培养成纤维细胞，皮肤组织用含1％青霉素/链霉素的PBS无菌离心管在2-8℃下转移至细胞培养间，在取下后4小时内提取细胞。将皮肤组织裁剪成1mm*1mm的组织块，均匀贴附于培养瓶中，放入5％CO2，37℃培养箱中贴壁4h。待组织块完全贴壁后向培养瓶中加入4ml 10％DMEM完全培养基，进行培养。每日观察成纤维细胞从组织碎片中爬出情况)未见有细胞迁移出来的迹象，表明实验组的组织碎片湿盒贴壁法有助于提高细胞爬出效率。

6)换液：待观察到有成纤维细胞从组织碎片中爬出后，改为每隔3日换液一次。

7)传代：待细胞增殖至融合度达到70-80％后(从图2中可以观察到，在培养至第7天时，实验组中的成纤维细胞生长密度已经达到70％左右，而对照组细胞融合度不到70％，无法进行传代)，吸弃培养瓶中上清液后，使用含1％青霉素/链霉素的PBS清洗3遍，加入2ml0.25％EDTA-胰酶类似物消化1分钟后，加入等体积的2ml细胞消化终止液终止消化。随后轻轻用移液枪将细胞吹打悬浮，并收集细胞于15ml离心管，得到原始P0细胞，1000r/min离心5分钟。使用成纤维细胞无血清完全培养基重悬后，进行细胞计数后，按照9000/cm²接种于培养瓶中。

实施例2：湿盒碎片贴壁法培养P1成纤维细胞鉴定

1)制作细胞爬片：将P1代细胞消化离心后，用培养基重悬，调节密度至5×10⁴个/mL，以1ml/孔接种于铺好爬片的12孔板中，设置3个复孔。随后将12孔板放入37℃，5％CO₂培养箱中进行培养。

2)细胞固定：在P1代细胞增殖到80％密度时，吸弃培养基，并使用PBS清洗3次，每次5分钟。吸除PBS后，向每孔中加入1mL 4％多聚甲醛固定液，常温固定细胞15分钟。

3)细胞通透：吸除4％多聚甲醛后，使用PBS清洗3次，每次5分钟。吸除PBS后，向每孔中加入1mL 0.4％Triton X-100，常温通透细胞10分钟。

4)封闭细胞：吸除0.4％Triton X-100后，使用PBS清洗3次，每次5分钟。吸除PBS后，向每孔中加入1ml 3％BSA，常温封闭1小时。

5)孵育抗体：将12孔板中的细胞爬片取出后，用PBS清洗3遍，使用波形蛋白一抗(1:100)，在4℃孵育过夜。次日将细胞爬片用PBS清洗3遍后，使用FITC山羊抗兔荧光二抗(1:200)，常温避光孵育2小时。

6)DAPI染色和封片：将细胞爬片使用PBS清洗3遍，并使用含DAPI抗衰减封片剂，在载玻片上进行染色封片。封片后在避光环境下使用荧光显微镜对细胞爬片进行观察。

从图3-5中可以观察到，实验组中P1代细胞中成纤维细胞纯度极高，说明本发明提取的成纤维细胞能够满足临床应用需求。

实施案3：成纤维细胞活力检测

1)分组：将实施例1中增殖成纤维细胞作为实验组，将常规组织贴壁培养的成纤维细胞作为对照组。每组设置5个小组(分别对应1-5天)，每个小组分别设置5个复孔。

2)将各组细胞按实施例1中换液和传代方法培养。收取各组P4代细胞，调节浓度至7.5×10³个细胞/mL浓度，向96孔板中加入每孔200μL细胞悬液，放入37℃，5％CO²培养箱中培养。

3)分别在1d、2d、3d、4d、5d时，吸除培养基，并重新添加成纤维细胞无血清完全培养基，再向每孔中加入20μL CCK-8检测试剂在37℃，5％CO₂培养箱中孵育2小时。随后使用酶标仪在450nm激发光下进行检测，记录数据并分析

从图6可以看出，实验组中使用本方法培养的P4代成纤维细胞，对比对照组有更高的细胞增殖能力。

实施例4：P8代成纤维细胞衰老检测

1)分组：将实施例1中增殖成纤维细胞继续进行传代，将P8代细胞作为实验组，将常规组织贴壁培养的成纤维细胞传代到P8代作为对照组。

2)将实验组和对照组细胞，吸除培养液。用PBS洗涤1次，加入1mlβ-Gal固定液，室温固定15min。

3)吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3min。

4)按照比例配置染色工作液。吸除β-Gal清洗液，每孔加入1ml染色工作液。

5)37℃孵育过夜，用封板膜封住培养瓶防止蒸发。

6)普通光学显微镜下拍照观察。

从图7中可以看出，对照组中的P8代成纤维细胞β-半乳糖苷酶染色明显多于实验组P8代成纤维细胞，说明常规贴壁培养法培养自体成纤维细胞在进行多次传代增殖后，其衰老速度高于本改良方法。

在组织块培养中，首次将皮肤处理为组织碎片贴于培养瓶中进行贴壁；为防止组织碎片干燥和细胞死亡，使用湿盒法贴壁进行细胞培养。并规范组织碎片处理方法和碎片间隔的最优距离，最大化细胞间相互作用，促进增殖，大幅提升各个组织碎片间细胞融合速度。

供以进行自体细胞增殖培养的皮肤数量极少，往往导致在原代培养中组织少、细胞稀疏，生长速度缓慢、活性差。本发明相比常规组织块成纤维细胞培养法，在贴壁组织块的处理上进行了改进，相同大小皮肤，处理后的组织碎片贴壁面积相较常规方法细胞爬出时间缩短到3日，培养的自体成纤维细胞活力对比常规方法有显著提升。并且本改良法使用湿盒法防止碎片在贴壁过程中过度干燥，大大提高碎片组织贴壁的成功率。在培养过程中使用不含血清的成纤维细胞完全培养基，在体外培养阶段避免伦理问题。

本改良方法在细胞的爬出速度、首次传代时间、细胞增殖活力以及细胞的抗衰老能力均高于常规贴壁法所培养的自体成纤维细胞，并且所培养的细胞纯度较高。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims

1.一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法，其特征在于，所述方法包括将皮肤组织处理为组织碎片贴于培养瓶中进行贴壁培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述贴壁培养在湿盒中进行。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述贴壁培养中将组织碎片贴壁的培养瓶倒置，在贴壁之前向倒置培养瓶的下部中加入培养基。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中所述组织碎片大小为0.1mm*0.1mm-0.5mm*0.5mm。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述组织碎片大小为0.2mm*0.2mm。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中将所述组织碎片间隔1mm-5mm贴于培养瓶中。

7.根据权利要求6所述的方法，其中将所述组织碎片间隔3mm贴于培养瓶中。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述方法包括用含青霉素或链霉素的无菌缓冲液的容器转移皮肤组织的步骤；以及用含青霉素或链霉素的无菌缓冲液清洗并减去多余组织的步骤。

9.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其中所述方法包括将培养瓶倒置后，加入成纤维细胞无血清完全培养基培养的步骤。

10.根据权利要求9所述的方法，其中加入的培养基为4ml成纤维细胞无血清完全培养基。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述培养在5％CO₂，37℃培养箱中进行。

12.根据权利要求1-11任一项所述的方法在制备美容用、伤口治疗用成纤维细胞中的用途。

13.根据权利要求12所述的方法在制备美容用、伤口治疗用成纤维细胞中的用途，所述的美容包括但不限于出于医疗目的或者非医疗目的处理法令纹、皮肤松弛、皱纹、脱发的方法。