CN105441377A - 一种动物皮肤成纤维细胞原代分离方法 - Google Patents

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葛啸虎
陈海佳
王一飞
吴子杰
李平
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Abstract

本发明公开了一种动物皮肤成纤维细胞原代分离方法，它通过选取消毒后的动物皮肤，做一个全层皮肤伤口；皮肤损伤3-5天内，取下损伤后皮肤区域，将皮下组织和多余血管去除干净，用含2％双抗的PBS清洗皮肤2～3次；将皮肤剪碎至0.1mm3～0.5mm3大小组织块；倒入含1％双抗的PBS，1000rpm/min低速离心5min，去除残留的漂浮组织块和上清液；将离心后的组织块，均匀接种在已包被了0.2％明胶的细胞培养皿中，加入培养基2ml？DMEM+10％FBS+2％双抗的细胞培养液，放至37℃、5％CO2培养箱中进行培养。本发明利用皮肤损伤愈合机制，选择合适的愈合时段，得到大量增殖型的成纤维细胞，同时去除皮下组织有利真皮层的成纤维细胞爬出，可以增加细胞数量，同时细胞更容易爬出，缩短细胞爬出周期，加强贴壁效率。

Description

一种动物皮肤成纤维细胞原代分离方法
技术领域
本发明涉及一种细胞原代分离方法，特别是涉及一种动物皮肤成纤维细胞原代分离方法，属于干细胞培养领域。
背景技术
目前成纤维细胞主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用。
对于成纤维细胞的获取，目前已有的原代分离方法主要有两种：(1)酶消化法。用胰蛋白酶或胶原酶对用含双抗PBS漂洗干净并剪碎的皮肤组织进行消化，直至细胞分离出来，过200筛，离心、重悬、计数细胞密度并接种培养。(2)组织块贴壁法。分别用含双抗的PBS和75％乙醇漂洗干净皮肤组织，眼科剪把皮肤组织剪碎成1mm3组织块，用培养基接种于6孔板中进行培养。
对于酶消化法，虽然能在较短时间内得到细胞，但是酶本身对细胞的贴壁有一定的影响，多次离心也对细胞造成一定的机械损伤，造成细胞活率不高，贴壁率低。而组织块贴壁法相对酶解法步骤较为简单，但是周期长，贴壁稳定性低，细胞爬出率低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种细胞活率较高、贴壁率较高的动物皮肤成纤维细胞原代分离方法。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现。
一种动物皮肤成纤维细胞原代分离方法，它包括以下步骤：
选取动物皮肤，优选腹部皮肤，皮肤经碘酒和/或酒精消毒，做一个全层皮肤伤口，优选做一个直径为1.0cm～3.0cm的圆形全层皮肤伤口。
皮肤损伤3-5天内，取下损伤后皮肤区域，将皮下组织和所有血管去除干净，用含2％双抗的PBS清洗皮肤2～3次。
将皮肤剪碎至0.1-0.5mm3大小组织块。
倒入适量的含1％双抗的PBS，1000rpm/min低速离心5min，去除漂浮的组织块和上清液。
将离心后的组织块，均匀接种在已包被了0.2％明胶的细胞培养皿中，加入培养基2ml(DMEM+10％FBS+2％双抗)细胞培养液，放至37℃、5％CO2培养箱中进行培养4-7天，优选9cm细胞培养皿。
所述包被了0.2％明胶的细胞培养皿是提前在细胞培养皿中加入0.2％明胶1-2mL/皿孵育30min。
与现有技术相比，本发明动物皮肤成纤维细胞原代分离方法具有以下优点：(1)本发明利用皮肤损伤愈合的机制，对皮肤进行损伤，以刺激成纤维细胞的生长，获得更多的成纤维细胞及高增殖低凋亡型的成纤维细胞，提高了分离效率和质量。(2)去除皮下组织有利真皮层的成纤维细胞爬出，可以增加细胞数量，同时细胞更容易爬出，缩短细胞爬出周期，加强贴壁效率。(3)在接种的时候，提前进行0.2％明胶铺板，可有效提高皮肤组织贴壁速度和贴壁率。
附图说明
图1是实施例4的小鼠皮肤成纤维细胞原代分离后的成纤维细胞增殖曲线；
图2是实施例5的对照组小鼠皮肤成纤维细胞的流式鉴定图，其中2-A是对照组加入CK15抗体的流式鉴定图；2-B是对照组加入Vimenit的流式鉴定图；
图3是实施例5的实验组小鼠皮肤成纤维细胞的流式鉴定图，其中3-A是实验组加入CK15抗体的流式鉴定图；3-B是实验组加入Vimenit的流式鉴定图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
本实施例的一种小鼠皮肤成纤维细胞原代分离方法，它包括以步骤：
1.1选取小鼠腹部皮肤，用弯头剪刀稍微把毛减掉，皮肤经碘酒、酒精消毒，做一个直径为2.0cm的圆形全层皮肤伤口，伤口暴露继续饲养。
1.2皮肤损伤(3-5)天后，处死小鼠，取下损伤后皮肤区域，将皮下组织和多余血管去除干净，用含2％双抗的PBS清洗皮肤3次。
1.3用眼科剪将皮肤剪碎至0.5mm3大小组织块。
1.4倒入适量的含1％双抗的PBS，1000rpm/min低速离心5min，去除漂浮的组织块，并倒掉上清液。
1.5提前在9cm细胞培养皿中加入0.2％明胶1mL/皿，孵育30min。
1.6离心后的组织块，均匀接种在包被了0.2％明胶的9cm细胞培养皿中，加入培养基2ml(DMEM+10％FBS+2％双抗)细胞培养液，放至37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
实施例2
本实施例是传统的常规小鼠皮肤成纤维细胞的原代分离方法，包括以下步骤：
2.1处死小鼠，用弯头剪刀稍微把毛减掉，皮肤经碘酒、酒精消毒，取下直径为2cm的皮肤组织，用含2％双抗的PBS清洗皮肤3次。
2.2用眼科剪将皮肤剪碎至0.5mm3大小组织块。
2.3倒入适量的含1％双抗的PBS，1000rpm/min低速离心5min，去除残留的胰蛋白酶漂浮的组织块并倒掉上清液。
2.4离心后的组织块，均匀接种在9cm细胞培养皿中，加入培养基2ml(DMEM+10％FBS+2％双抗)细胞培养液，放至37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
实施例3
本实施例是小鼠皮肤成纤维细胞分离后的细胞生长状态对比
分别使用实施例1(实验组)和实施例2(对照组)的方法处理三个不同批次的小鼠，接种后每天观察组织块的细胞生长情况。
表1：实验组和对照组细胞数量对比表
从表1中可见，实验组分离的细胞数是对照组的2倍以上，证明本发明方案能极大提高分离的细胞数量。
实施例4
本实施例是小鼠皮肤成纤维细胞原代分离后的成纤维细胞增殖曲线。
采用CCK-8法检测培养的成纤维细胞的增殖活力。分别按照实施例1(实验组)和实施例2(对照组)的分离方法分离，待细胞汇合度长至90％时，分别收集细胞，接种细胞于96孔板中，2000个/孔。在37℃，5％CO2培养箱中连续培养7d，分别在1d、3d、5d、7d对细胞进行检测。在待检测孔中加入10μL染色剂，37℃，5％CO2培养2h。用酶标仪测450nm处的吸光值，每个样本做3个重复。结果见表1和图1。
表2：实验组和对照组分离细胞吸光度值对比表
从表2和图1可知，实验组的增殖明显大于对照组。
实施例5
本实施例是小鼠皮肤成纤维细胞的流式鉴定。
5.1分别取实施例1和实施例2中分离长至90％以上的细胞，进行消化，终止、重悬，取1×106cells，平均分至2个EP管中，一管作为对照，1500rpm/min离心5min，弃上清。
5.2加入1mL染色缓冲液(含10％FBS的PBS)重悬细胞，1500rpm/min离心5min，弃上清。重复以上步骤1次。
5.3弃上清后，每管加入200μL染色缓冲液重悬，样本组分别加入2μL波形蛋白抗体(Vimentin)和角蛋白抗体(CK15抗体)。避光孵育20min。
5.4加入500μL染色缓冲液重悬，1500rpm/min离心5min洗掉剩余抗体。
5.5弃上清，加入500μL上样缓冲液(10％FBS+1640培养基)，过200目筛，上机检测细胞表面抗原。
表3：实验组和对照组细胞流式鉴定对比表
Vimenit CK-15
对照组(实施例2) 90.0％ 0％
实验组(实施例1) 100％ 0％
成纤维细胞表面标记物CK15表达阴性(≦2％)，Vimentin表面标记物表达达阳性(≧95％)。由图2、图3和表3可知，对照组除成纤维细胞参杂了其他细胞，而实验组中为100％成纤维细胞，该分离方法所得细胞纯度高。
根据实施例3-5，本发明的分离方法相比于传统分离方法所得的成纤维干细胞更多，增值速度更快，纯度更高。
本发明并不限于以上实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变通，这些变通也属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种动物皮肤成纤维细胞原代分离方法，它包括以下步骤：
选取动物皮肤，皮肤经碘酒和/或酒精消毒，做一个全层皮肤伤口；
皮肤损伤3-5天内，取下损伤后皮肤区域，将皮下组织和多余血管去除干净，用含2％双抗的PBS清洗皮肤2～3次；
将皮肤剪碎至0.1mm3～0.5mm3大小组织块；
倒入含1％双抗的PBS，1000rpm/min低速离心5min，去除残留的漂浮组织块和上清液；
将离心后的组织块，均匀接种在已包被了0.2％明胶的细胞培养皿中，加入培养基2mlDMEM+10％FBS+2％双抗的细胞培养液，放至37℃、5％CO2培养箱中进行培养。
2.根据权利要求1所述的一种动物皮肤成纤维细胞原代分离方法，其特征在于：所述的动物皮肤优选腹部皮肤。
3.根据权利要求1所述的一种动物皮肤成纤维细胞原代分离方法，其特征在于：所述的全层皮肤伤口为直径为1.0cm～3.0cm的圆形全层皮肤伤口。
4.根据权利要求1所述的一种动物皮肤成纤维细胞原代分离方法，其特征在于：所述培养皿为9cm细胞培养皿。
5.根据权利要求1所述的一种动物皮肤成纤维细胞原代分离方法，其特征在于：所述包被了0.2％明胶的细胞培养皿是提前在细胞培养皿中加入0.2％明胶1mL/皿，孵育30min。
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CN115161273A (zh) * 2022-08-24 2022-10-11 首都医科大学附属北京安贞医院 一种湿盒碎片贴壁自体成纤维细胞培养方法

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