CN104818245A - 一种肝脏干细胞的培养基及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种肝脏干细胞的培养基及培养方法。本发明提供的肝干细胞培养基包括基础培养基、HGF、SCF和LIF。本发明提供的肝干细胞的培养方法采用免疫磁珠于原代即对肝干细胞进行分离，然后培养于本发明提供的培养基。实验表明，在原代细胞的获得过程中，细胞损伤较小，经检测，活性维持在85％左右，且本发明提供的方法培养肝干细胞能够将增值速度提高1.5～2.8倍，经流式细胞检测，肝干细胞能够维持良好的干性。

Description

一种肝脏干细胞的培养基及培养方法

技术领域

本发明涉及干细胞培养领域，尤其涉及一种肝脏干细胞的培养基及培养方法。

背景技术

肝脏是人体的重要器官，发挥很多重要的功能，如：葡萄糖的体内平衡、异性生物质的脱毒或大分子合成。我国是“肝炎大国”，是各型发病率较高的国家，多种病毒性肝炎及相关肝病严重危害着我国人民的身体健康。肝脏功能受损会对健康产生显著影响，急或慢性肝病已成为全球第九或第五位的致死原因。目前为止，对晚期肝脏疾病的根治方法只有肝脏移植术。肝脏细胞移植是一种新兴的方法，现有技术中已有利用流产胎儿的肝脏组织培养肝脏干细胞用于治疗肝硬化或糖尿病的先例，病取得了良好的疗效。

当肝脏严重受损或成熟肝细胞增殖受阻的情况下，一些肝脏细胞可以异常激活、增殖，大量出现在肝小叶外周区域，组织学上表现为肝小叶周围体积较小、增殖活跃的细胞群体。这些细胞核质较大，胞核圆形或卵圆形，被称为肝卵圆形细胞(HOC)，1958年，Wilson等推测肝卵圆细胞可能是肝的干细胞。肝干细胞属于前体细胞，在肝细胞移植、体外人工肝、基因治疗方面有着巨大的潜力，对于了解肝细胞的发育及肝癌、肝硬化等疾病的发生机制都有重要帮助。

但是，现有的肝脏干细胞的培养方法，处理肝组织的时间长，处理步骤多易对干细胞造成污染和损伤。并且，由于现有技术培养基或培养条件选择不当，使肝干细胞在体外培养时，增殖速度慢，且会伴随自发分化；其在体外培养一段时间细胞会全部分化形成终端分化细胞。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种肝脏干细胞的培养基及培养方法。

本发明提供了一种肝干细胞培养基，包括基础培养基、HGF、SCF和LIF。

HGF(肝细胞生长因子)能刺激多种上皮和内皮细胞进行有丝分裂、运动以及促进肾小管形态发生，在组织器官损伤修复、形态发生和肿瘤转移过程中发挥重要作用，在肾脏的发育、急性损伤、再生中具有较强的作用。

SCF(干细胞生长因子)可以快速激活休眠的干细胞并促使其生长，同时可以调节机体内微环境，为干细胞提供有利的生长条件。

LIF(白血病抑制因子)能够调节细胞的增殖、分化和表型。

本发明提供的培养基在基础培养基中添加HGF、SCF和LIF，配方稳定不易分解。且配置简单，成本较低。经实验证实本发明提供的培养基能够加速细胞增殖，且能够维持细胞良好干性状态。

作为优选，基础培养基为Lonza完全培养基。

Lonza完全培养基包括：无血清培养基(Lonza UltraCULTURETM)、血清替代物(PALL Ultroser G)、谷氨酰胺和NEAA。

其中，血清代替物的质量分数为10％。

谷氨酰胺的质量分数为1％。

NEAA的质量分数为1％。

在本发明的实施例中，HGF、SCF和LIF的质量比为1:1:1。

在本发明的实施例中，HGF的浓度为10ng/mL；SCF的浓度为10ng/mL；LIF的浓度为10ng/mL。

与现有的培养基相比，本发明提供的培养基能够将细胞增殖速度提高1.5倍～2.8倍。

本发明还提供了一种肝干细胞培养方法，包括：将胎肝以I型胶原酶和II型胶原酶消化后，经免疫磁珠分离，接种于权利要求1～4任一项所述的肝干细胞培养基，培养至80％以上的细胞融合后传代。

本发明提供的方法从原代分离的细胞，经过磁珠分选后才进行接种，避免在培养过程中杂细胞与肝干细胞形成竞争，从而避免造成细胞的污染和培养周期的延长。

在本发明的实施例中，免疫磁珠分离的筛选抗体为C-kit⁺、AFP⁺和CK19⁺。

目前，由于肝干细胞表面因子较少，很难通过因子对其进行筛选和定位，本发明采用C-kit⁺、AFP⁺和CK19⁺作为筛选抗体能够更为精确的分选出肝干细胞，所获得的的肝干细胞纯度较高。并且，该方法分离得到的细胞损伤较小，活性较高。

具体的，磁珠分选的方法为：将消化后的胎肝细胞清洗后，重悬，以C-kit⁺、AFP⁺和CK19⁺为筛选抗体，4℃～8℃孵育15分钟后，通过分离柱筛选获得肝干细胞。

缓冲液稍用力冲洗，在本发明的实施例中，接种的细胞密度为1×10⁵个/mL。

在本发明的实施例中，培养的温度为37℃、5％CO₂。

在一些实施例中，消化具体为：胎肝用PBS冲洗，破碎后用I型胶原酶和Ⅱ型胶原酶，4℃消化过夜；消化后组织用200目筛网过滤，获得的细胞悬液200g离心5min，细胞沉淀用PBS洗2次。

在本发明的实施例中，I型胶原酶的质量分数为0.02％；II型胶原酶的质量分数为0.02％。

在本发明的实施例中，胎肝为大鼠胎肝。

在一些实施例中，胎肝的获得方法为：脱臼处死怀孕大鼠，经过体积分数为75％乙醇对大鼠体表消毒，无菌条件取出胎肝。

本发明提供了一种肝干细胞培养基，包括基础培养基、HGF、SCF和LIF。本发明提供的干干细胞的培养方法采用免疫磁珠于原代即对肝干细胞进行分离，然后培养于本发明提供的培养基。本发明提供的方法能够避免肝干细胞在培养过程中的污染和损伤，且与原代即对肝干细胞进行分离，从而缩短了培养时间，且该方法较柔和，保持了干细胞良好的活性。本发明采用适宜的培养基，从而提高了细胞的增殖速度，保证了细胞具有良好的干性。实验表明，在原代细胞的获得过程中，细胞损伤较小，经检测，活性维持在85％左右，且本发明提供的方法培养肝干细胞能够将增值速度提高1.5～2.8倍，经流式细胞检测，肝干细胞能够维持良好的干性。

附图说明

图1-a示对数期肝干细胞形态；

图1-b示80％融合的肝干细胞形态；

图2示不同培养基培养的肝干细胞的增殖曲线；其中，线1示培养基3培养肝干细胞的增殖曲线；线2示培养基4培养肝干细胞的增殖曲线；线3示培养基1培养肝干细胞的增殖曲线；线4示培养基2培养肝干细胞的增殖曲线；

图3-a示同型对照抗体流式细胞检测培养基3培养的肝干细胞的结果；分别表示了对照组所检测的细胞数量；以及根据对照组细胞所设定抗体CD34、CD44、CD105、HLA-DR的门；

图3-b示对培养基3培养的肝干细胞的流式细胞检测结果；分别表达CD34、CD44、CD105、HLA-DR的细胞含量。

具体实施方式

本发明提供了一种肝脏干细胞的培养基及培养方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1)获取肝脏组织：

脱臼处死怀孕大鼠，经过75％乙醇消毒后转移至超净工作台中，无菌取出胎肝。

2)肝干细胞的分离提取

胎肝用PBS冲洗数次，剪碎后用0.02％的I型胶原酶和0.02％的Ⅱ型胶原酶，4℃消化过夜，消化后组织用200目筛网过滤，获得的细胞悬液200g离心5min，细胞沉淀用PBS洗2次。细胞经免疫磁珠分离,具体步骤为：

1、制备单细胞悬液(用30um的尼龙网过滤，避免堵塞柱子)(过滤前先用缓冲液湿化过滤器)

2、加入缓冲液清洗细胞，并离心(300g,10min)(4-8℃)3:加入缓冲液重选细胞单细胞悬液，

3、再次用30um的尼龙网过滤，避免堵塞柱子)(过滤前先用缓冲液湿化过滤器)

4、细胞计数

5、离心(300g,10min)(4-8℃)后去掉上清

6、加入80ul/10⁷个细胞的缓冲液

7、加入20ul/10⁷个细胞的C-kit⁺、AFP⁺、CK19⁺

8、4-8℃混匀放置15分钟。

9、加入1ml/10⁷个细胞的缓冲液清洗细胞并离心(300g,10min，4-8℃)

10、重选细胞加入500ul/10⁸个细胞的缓冲液。

11、准备好分离柱，并用缓冲液清洗MS用500ul.

12、把细胞悬液倒入柱子中

13、用500ul的缓冲液冲洗柱子，(每次液体无残留时再加入新的液体)共三次

14.将柱子移开磁场到一合适的容器中，用1mL缓冲液稍用力冲洗，获得C-kit⁺、AFP⁺、CK19⁺细胞，即为P0代肝干细胞。

取P0代肝干细胞，调整细胞密度为1×10⁶cell/mL。按细胞悬液：0.4％台盼蓝＝3:1(v:v)充分混匀，取20uL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞活率及体积检测。检测三次，结果分别为85.64％、83.43％、83.59％。说明，本发明提供的前处理方法能够很好的保持干细胞的活性，不会对干细胞造成损伤。

实施例2

将细胞沉淀培养基中(培养基配方如表1)，吹制备成终浓度为1×10⁵ml的细胞悬液。将细胞悬液加入装25cm²培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。48h后，细胞生长达到对数期，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况并拍照(图1-a)。待细胞生长至80％以上融合后再次导致显微镜观察(图1-b)，然后，加入0.25％胰白酶0.02％EDTA消化进行重复传代培养3次，获得肝干细胞。培养过程中，每天记录细胞数量，对不同培养基培养的干细胞绘制生长曲线，结果见图2。

表1培养基配方

      

显微镜观察结果显示，肝干细胞其在体外培养时贴壁生长，长梭形；细胞边缘清晰可见，折光性强(图1-a)。当融合率达80％以上时，呈漩涡状(图1-b)，符合间充质干细胞的生物学特征。

根据细胞增殖曲线，本发明提供的培养基能够将细胞增殖速度提高1.5～2.8倍。

实施例3

对实施例2以不同培养基培养的肝干细胞进行流式结果检测，具体为：

取处于对数生长期的肝干细胞，调整细胞密度为1×10⁶的细胞悬液，分别取抗人CD34、CD44、CD105、HLA-ABC的单克隆抗体各2.5μL,加入细胞悬液500μL，室温下避光孵育20min，同时设立空白同型对照，1500r/min离心5min，弃上清，用含10％FBS的PBS洗涤2遍，用500μL 1640重悬后上机检测。数据统计结果如表2：

表2：流式细胞检测结果

      

其中，对培养基3培养的肝干细胞的的检测结果如图3-a～图3-b所示，肝干细胞是属于间充质干细胞的一种，间充质干细胞是低表达HLA-ABC和CD34(一般不超过2％)；高表达CD44、CD105(一般超过95％)。结果显示，本发明提供的方法培养肝干细胞后，细胞保持良好的干性，未见分化趋势。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种肝干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基、HGF、SCF和LIF。

2.根据权利要求1所述的肝干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基为Lonza完全培养基。

3.根据权利要求1所述的肝干细胞培养基，其特征在于，所述HGF、SCF和LIF的质量比为1:1:1。

4.根据权利要求1所述的肝干细胞培养基，其特征在于，所述HGF的浓度为10ng/mL；SCF的浓度为10ng/mL；LIF的浓度为10ng/mL。

5.一种肝干细胞培养方法，其特征在于，包括：将胎肝以I型胶原酶和II型胶原酶消化后，经免疫磁珠分离，接种于权利要求1～4任一项所述的肝干细胞培养基，培养至80％以上的细胞融合后传代。

6.根据权利要求5所述的肝干细胞培养方法，其特征在于，所述免疫磁珠分离的筛选抗体为C-kit⁺、AFP⁺和CK19⁺。

7.根据权利要求5所述的肝干细胞培养方法，其特征在于，所述接种的细胞密度为1×10⁵个/mL。

8.根据权利要求5所述的肝干细胞培养方法，其特征在于，所述培养的温度为37℃、5％CO₂。

9.根据权利要求5所述的肝干细胞培养方法，其特征在于，所述I型胶原酶的质量分数为0.02％；所述II型胶原酶的质量分数为0.02％。

10.根据权利要求5～9任一项所述的肝干细胞培养方法，其特征在于，所述胎肝为大鼠胎肝。