CN113999876B - 一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型及其建立方法和应用 - Google Patents

一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型及其建立方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及癌症动物模型建立技术领域，具体涉及一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型及其建立方法和应用。建立方法包括以下步骤：使用原癌基因转化肝卵圆细胞，获得肝癌干细胞；将肝癌干细胞原位移植到受体小鼠的肝脏，获得原发性小鼠肝癌模型；所述受体小鼠是经过X射线辐照处理的野生型小鼠。本方案针对现有原发性肝癌动物模型的局限，建立了模拟原发性肝癌整个发生发展自然过程的新型原发性模型，从而可以精确研究特定基因在原发性肝癌发生发展中的作用及机制，验证该基因是否能够作为一个有效治疗靶点。利用本方案的模型可以筛选潜在原发性肝癌治疗新靶标以及新药物，为研究开发出新型的治疗原发性肝癌的药物或者治疗方法创造条件。

Description

一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型及其建立 方法和应用
技术领域
本发明涉及癌症动物模型建立技术领域，具体涉及一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型及其建立方法和应用。
背景技术
动物模型是研究人类疾病机制、鉴定治疗靶点及评估治疗方式和药物的重要工具之一，其中，原发性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC，又称肝细胞性肝癌)的小鼠模型在研究原发性肝癌的发生发展机制研究中发挥了不可或缺的作用。小鼠因其遗传背景单纯，在生理上又与人类极为相似，且成本较低、周期较短、基因修饰技术更容易实现，因此，小鼠肝癌模型是研究人类肝癌发生机制、评估药物的重要和有效的动物模型。
目前常用的原发性小鼠肝癌模型有：致癌物诱发小鼠肝癌模型、基因修饰性(转基因)小鼠肝癌模型。致癌物诱发小鼠肝癌模型包括使用遗传毒性和非遗传毒性的致癌物来诱导小鼠致癌，小鼠的性别、年龄、品系和遗传背景对肝癌发生会产生较大的影响，成为使用该方法构建模型的瓶颈。基因修饰性小鼠肝癌模型与其他常用原发性肝癌动物模型相比，在研究特殊基因在原发性肝癌发生过程中的作用或不同基因间的相互作用，以及与肝脏特异性致癌物之间的关系中具有独特优势。然而传统的制备方式主要是通过重组基因敲入(Knock-in)或目的基因敲除(Knock-out)构建。现有的转基因原发性肝癌小鼠模型多采用过表达cMYC与其他基因进行联合构建，如TGF-β、PTEN、P53等，该方法的造模成本高、耗时长、成瘤率不均一，并且不易用于评价相关基因在肝癌发生和发展过程中的作用，进而限制了限制转基因原发性肝癌小鼠模型的用途和价值。因此，利用基因编辑技术研发建立能反映肝癌生物特性的、模拟肝癌肿瘤微环境的、易于获取的且经济适用的理想肝癌模型，对于探究肝癌发生的分子机制、癌症信号通路、新型生物标记物、靶向药物的开发等具有重要意义。
发明内容
本发明意在提供一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型的建立方法，以解决使用现有的原发性肝癌小鼠模型不能精确研究特定基因在肝癌发生发展过程中的作用机制的技术问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型的建立方法，包括以下依次进行的步骤：
S1：使用原癌基因转化肝卵圆细胞，获得肝癌细胞；
S2：将肝癌细胞原位移植到受体小鼠的肝脏，获得原发性小鼠肝癌模型；所述受体小鼠是经过X射线辐照处理的野生型小鼠。
本方案还提供了一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型的建立方法制备获得的原发性小鼠肝癌模型。
本方案还提供了原发性小鼠肝癌模型在评价基因在肝癌发生和发展过程中的作用中的应用；原发性小鼠肝癌模型在评价具有治疗肝癌功效的药物中的应用；原发性小鼠肝癌模型在筛选原发性肝癌治疗靶点中的应用。
采用上述技术方案的原理以及有益效果：
本方案通过在对正常野生型小鼠进行先辐射处理再转染癌细胞的方法，成功建立了原发性肝癌小鼠模型。本方案克服了现有的原发性肝癌动物模型的局限，本方案的模型可以模拟原发性肝癌整个发生发展得自然过程的新型原发性模型，从而可以精确研究特定基因在原发性肝癌发生发展中的作用及机制，验证其是否能够作为原发性肝癌的一个有效治疗靶点，以及利用该模型筛选潜在原发性肝癌治疗新靶标以及新药物。
在本方案中，制备肿瘤模型的荷瘤小鼠不再使用一般的裸鼠，而是使用野生型的小鼠，克服了针对于野生型小鼠建立肿瘤模型的技术难点。本方案采用的新思路使造模时间变得可调节、可快速尝试不同基因组合，同时又能达到类似转基因鼠杂交的效果。采用野生型小鼠，既能最大限度的反映肝癌的生物特性，模拟肝癌肿瘤微环境，又能研究特殊基因在原发性肝癌发生起始阶段的作用及不同基因间的相互作用，同时还可以调节造模时间，弥补转基因小鼠模型造模成本高、耗时长、不易用于评价相关基因在肝癌发生和发展过程中的作用等局限，构建相对理想、快速高效的小鼠HCC原发模型。
原发性肝癌小鼠模型是如今比较流行的、能够模拟肿瘤在肝脏中生长的小鼠模型，其运用比较广泛，对于肿瘤的生长，发育，转移的研究均有重要的意义，原发性肝癌主要是肝脏细胞由于外界因素自身出现恶变，而非其他脏器肿瘤转移导致，本方案的模型是基于小鼠自身肝卵圆细胞恶性化导致的原发性肿瘤，具有基因背景统一，成瘤快，工业化程度较高等特点。本方案获得的小鼠模型可以应用于评价基因在肝癌发生和发展过程中的作用、评价具有治疗肝癌功效的药物和筛选原发性肝癌治疗靶点等研究工作中。
进一步，在S2中，X射线辐照处理的剂量为5.5Gy。实验数据显示，5.5Gy的辐射剂量可以有效促进野生型小鼠成瘤。辐射剂量过小，原癌基因转染无法有效致瘤。而辐射剂量过大，致瘤效果更为显著地降低，发明人分析，这是由于辐射影响到了注射到小鼠体内的肝癌细胞的致瘤能力的结果。发明人首次将辐射这一手段引入到动物模型的制备的研究当中，并发现了外源癌细胞致瘤效果随着辐射剂量的增加先增加再减小这一规律。发明人利用该规律，找到了对野生型小鼠致瘤并制备原发性肿瘤模型的关键影响因素，成功制备该模型，为评价基因在肝癌发生和发展过程中的作用、评价具有治疗肝癌功效的药物和筛选原发性肝癌治疗靶点等研究工作创造了条件。
进一步，在S2中，将肝癌细胞原位移植到受体小鼠的肝脏的方法为：在所述受体小鼠接受X射线辐照处理的第二天，向受体小鼠的肝门静脉注射所述肝癌细胞，肝癌细胞的注射量为每只小鼠106个。通过肝门静脉注射的方法并控制注射量为每只小鼠106个，可以有效地实现肝癌细胞对野生型小鼠的正常肝脏的转染。
进一步，在S1中，所述原癌基因包括cMYC、kRAS、P53、PTEN、KLF6和P16中的至少一种。cMYC、kRAS、P53、PTEN、KLF6和P16是本领域中比较公认的成瘤的基因，使用这些原癌基因可以诱导卵圆细胞恶性化，使得细胞保持无限增殖能力，进而促进肝癌细胞形成。
进一步，在S1中，所述肝卵圆细胞由如下方法制备：首先，构建DDC小鼠模型；然后从DDC小鼠模型的肝脏组织中分离得到所述肝卵圆细胞；最后，将所述肝卵圆细胞培养于永生化培养基中，所述永生化培养基中含有小鼠白血病抑制因子、小鼠肝细胞生长因子及小鼠表皮生长因子。
进一步，所述永生化培养基中含有10ug/L的肝细胞生长因子、20ug/L的表皮生长因子、10ug/L的白血病抑制因子、100U/mL的双抗和2mmol/L的L-谷氨酰胺。
采用上述技术方案，在基础培养基中添加肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)和白血病抑制因子(LIF)，可有效促进小鼠肝卵圆细胞(HOC)的永生化进程，HOC在离体条件下至少可以保持8周以上的细胞增殖活性，且未见细胞分化，细胞呈圆形或卵圆形。
本技术方案使用到的三种因子，LIF可应用于维持胚胎干细胞的未分化状态，HGF是一种可调节多种细胞生长、运动和形态发生的多功能因子，EGF可促进靶细胞的DNA合成及有丝分裂。将这三种因子应用于同一培养基中，并对HOC进行永生化培养，上述应用尚属首次。单用其中任一物质，均会一定程度上造成HOC的分化。但是，三者连用却能够保证细胞在培养到8周以上后未出现任何分化的情况。这说明，三种物质联合使用产生了协同作用，克服了HOC容易发生分化的技术问题，获得了预料不到的技术效果。
附图说明
图1为本发明实施例1的过表达cMYC诱导卵圆细胞恶性化显微观察结果。
图2为本发明实施例2的转染后卵圆细胞体内成瘤结果。
图3为本发明实施例2的肿瘤与癌旁组织相关标志物对比结果。
图4为本发明实施例2的模型小鼠肿瘤及癌旁组织病理切片对比结果。
图5为本发明实施例2的不同辐射剂量的成瘤效果研究结果。
图6为本发明实施例3的DDC小鼠模型构建后肝脏病理组织切片。
图7为本发明实施例3的肝脏成熟细胞与肝脏卵圆细胞相关标志物Western blot检测结果。
图8为本发明实施例3的成熟肝细胞与卵圆细胞相关标志物免疫荧光检测结果。
图9为本发明实施例4的肝脏卵圆细胞体外分离及培养结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1：小鼠肝癌细胞系的建立
(1)逆转录病毒载体的构建以及病毒液的制备
原始逆转录病毒表达载体为MSCV-IRES-ZsGreen1，对MSCV-IRES-ZsGreen1进行改造，插入cMYC基因，获得目的质粒，测序正确后提取和纯化高质量的不含内毒素的目的质粒(即MSCV-CMYC-IRES-ZsGreen1)。cMYC基因是现有技术中已知的一种原癌基因，可促进细胞分裂增殖，该基因的检测被作为肿瘤筛查的辅助手段，也可以用作肿瘤动物模型的建立中，促进肿瘤形成。在本方案中，使用到的cMYC基因的接收号为110535641。本方案以cMYC为例进行说明，除了该原癌基因，还可根据实际需要选择kRAS、P53、PTEN、KLF6和P16等现有技术公认的原癌基因，进行肿瘤模型的构建。
然后利用293T细胞进行病毒包装，包病毒前一晚在六孔板中铺293T细胞(1640基础培养基+10％血清+1％双抗)，每孔铺1×106个细胞，等细胞密度达到80-90％进行质粒转染包病毒。包病毒前1h，将细胞培养基换成DMEM培养基(1:4000加入氯喹)，放入细胞孵箱中。配制目的质粒质粒MSCV-CMYC-IRES-ZsGreen1和包装质粒pcl-Eco混合物，组成以及配比如表1所示。将表1中的混合物(预混试剂)与500μL 2×HBS混匀，滴加到293T细胞的培养板中，进行病毒包装和生产，收集病毒液，并进行浓缩；最后利用3T3细胞测定病毒滴度和Western blot分析实验结果。上述操作过程均按照本领域的载体构建和包病毒的惯用技术手段进行。
表1：病毒质粒和包装质粒混合物
(2)原癌基因转化的肝癌细胞系的建立
原代肝卵圆细胞(HOC)经培养3-5代后便可进行病毒的转染和恶性化转化。使用病毒液对HOC进行转染，使用含有病毒液的培养基对传代后的HOC细胞进行转染。转染体系的组成为：永生化培养基1ml(自制，参见实施例4)，病毒液1ml(滴度为107)和HOC细胞106个。以3000G/s的条件对转染体系进行高速离心转染，90min后将转染体系取出放置入孵箱进行静置，3h后换液(更换成为不含病毒液的培养基)进行正常培养，获得本方案的肝癌细胞(恶性化肝卵圆细胞)。图1为过表达cMYC诱导卵圆细胞恶性化显微观察结果。过表达cMYC的病毒感染肝卵圆细胞后，转染成功的细胞出现大量增殖，形成大量克隆并且保持无限增殖能力，而未转染细胞逐渐凋亡。图1中MIG-cMYC为(1)中制备的病毒液转染获得的恶性化肝卵圆细胞，MIG为使用空载体制备的病毒液转染获得的细胞。MIG-cMYC组较MIG组，细胞增殖快，并产生大量的绿色荧光。
实施例2：小鼠原位肝癌模型的建立
在本实施例中，通过肝门静脉注射法将培养的肝癌细胞原位移植到受体小鼠肝脏并成功构建小鼠肝癌模型。在注射前一天对C57BL/6小鼠以5.5Gy的剂量进行X射线辐照(RS2000pro，Radsource，美国)(320KV进行X光照射270s)，以备第二天使用。将已制备完成的恶性化肝卵圆细胞进行消化并计数，使用PBS重悬，制备成107/mL的细胞悬液，放入冰上备用。将小鼠进行异氟烷麻醉，置于操作台上固定四肢。常规碘伏消毒，沿腹中线剪到小鼠剑突下2-3cm，暴露腹腔，用湿棉签暴露肝门静脉并轻柔挑起，于近端缓慢注射细胞悬液100μl；注射完毕后，用干棉签按压止血3-5min；最后关腹并常规应用抗生素预防感染。
图2为转染后卵圆细胞体内成瘤结果(上为形态学图像，下为生存曲线)，将转染后出现无限增殖能力的肝卵圆细胞通过肝门静脉注射法进行小鼠肝脏原位移植，第三周左右成功形成肿瘤。在图2中，PVI-PBS表示门静脉注射PBS组；PVI-MIG表示门静脉注射空载病毒的卵圆细胞组；PVI-MIG-cMYC表示门静脉注射过表达cMYC病毒卵圆细胞组；形态学图像为术后4周处死动物后获得。图3展示了肿瘤与癌旁组织相关标志物对比结果。处死模型小鼠，收集肿瘤及癌旁组织并进行Western blot检测，发现正常肝组织(LT)表达ALB，CK19等标志物，而肿瘤组织(CT)高表达AFP，并且ALB与CK19的表达量与正常肝组织无明显差异，说明肿瘤组织为肝癌组织。图4展示了模型小鼠肿瘤及癌旁组织病理切片对比结果。对肿瘤及癌旁组织并进行HE染色，可见肿瘤细胞排列无序，形态呈多边形，胞核不清，部分出现空泡样变，符合肿瘤样变化。
在本技术方案中，5.5Gy的辐射剂量对模型动物成功致瘤非常关键，高于5.5Gy时，小鼠生长状态不佳且成瘤效果差，低于5.5Gy时，小鼠成瘤时间较长甚至无法成瘤，具体试验结果见图5(左为形态学图像，右上为生存曲线，右下为肿瘤尺寸统计图)。图5中的肿瘤组织的图片为术后4周处死动物后获得。在柱状统计图中，每种剂量设置5个重复。本方案首次使用了野生型小鼠来制备，并利用辐射来促进小鼠成瘤。本方案采用5.5Gy的辐射强度的时候，发现小鼠成瘤的尺寸与其他辐射强度下小鼠成瘤的尺寸存在显著差异。
在常规使用裸鼠或免疫缺陷鼠进行成瘤模型实验室，由于肿瘤细胞与荷瘤小鼠之间的基因背景差异，往往会导致一些和不可控的差异因素从而影响肿瘤的生长。再者，裸鼠或免疫缺陷鼠作为荷瘤小鼠时，由于其免疫系统已经丧失，在研究肿瘤生长与其微环境的关系时会存在无法匹配正常肿瘤生长环境的情况。而我们的模型不仅保证了肿瘤细胞与荷瘤小鼠基因背景的一致性，并且通过辐射处理成功形成肿瘤，成瘤之后，小鼠整体的状况处肿瘤外，其他生理情况特别是免疫系统的情况与野生型小鼠无明显差异，从而减少了模型之间的差异性。
实施例3：原代肝卵圆细胞的获取
采用8周雄性C57BL/6小鼠,使用含有0.1％ DDC(3,5–diethoxycarbonyl-1,4-dihydro-collidine)的饮用水持续喂饲2周，然后处死小鼠，进行检测DDC模型是否构建成功。图6展示了DDC小鼠模型构建成功后肝脏病理情况，出现明显胆汁淤积性胆管炎，通过免疫组化染色显示，肝脏汇管区门静脉周围出现卵圆细胞聚集增生并表达CK19和ALB。
将DDC模型小鼠进行异氟烷麻醉,开腹并暴露肝门静脉,使用37℃预热的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗小鼠肝脏,再用0.01％IV型胶原酶以2mL/min速度灌注10min。然后将肝组织放入含0.01％胶原酶IV的DMEM/F12培养基中,剪碎后吹打分散细胞,并过100目筛网。使用离心法分离肝脏非实质细胞,加入含0.01％pronaseE和0.005％ DnaseI的消化液并在37℃下消化30min，然后通过Percoll梯度离心提取HOC。对获得的HOC进行Western blot检测，并与肝脏成熟细胞进行对比，实验结果参见图7，可见卵圆细胞同时表达ALB、AFP以及CK19而成熟肝细胞只表达ALB而不表达AFP和CK19。对本方案获得的HOC进行免疫荧光检测，并与肝脏成熟细胞进行对比，实验结果参见图8，可见肝卵圆细胞同时表达ALB、AFP以及CK19而成熟肝细胞只表达ALB而不表达AFP和CK19。
实施例4：原代肝卵圆细胞的传代
将实施例3中获得的原代HOC以每孔104数量接种于六孔板中，加入2mL永生化培养基,在37℃，5％ CO2条件下培养。培养过程中对细胞进行常规传代以及更换培养基，传代和更换培养基均为本领域的常规手段，在此不做赘述。永生化培养基的情况如下：永生化培养基的基础成分为DMEM/F12(1:1)培养基(Gibco，11320033)，其中，DMEM/F12(1:1)培养基是由DMEM培养基和F12培养基组成，DMEM培养基和F12培养基的体积比为1:1。在基础成分中添加多种添加因子，包括肝细胞生长因子(小鼠，Abcam，ab123229)、表皮生长因子(小鼠，Abcam，ab206643)、白血病抑制因子(Abcam，ab209118)、双抗(Gibco，15140163)、L-谷氨酰胺(35050061)和胎牛血清(Gibco，10091148)。肝细胞生长因子、表皮生长因子、白血病抑制因子、双抗、L-谷氨酰胺和胎牛血清在永生化培养基中的含量分别为10μg/L、20μg/L、10μg/L、100U/ml、2mmol/L和10％(体积百分数)。
使用本方案的永生化培养基的培养结果参见图9的第一排。本方案的永生化培养基通过合理配比可实现分离得到的原代HOC的快速增殖和长期培养，HOC在离体条件下至少可以保持8周以上的细胞增殖活性。刚分离纯化出的原代HOC呈游离状态，漂浮于培养液中，24h后大部分贴壁生长。贴壁细胞呈圆形或卵圆形，呈铺路石样排列。参见图1的第一排，培养的卵圆细胞约在第七天逐渐聚集呈集落状，第十四天呈克隆样增殖，第二十天开始大量增殖。
发明人对培养基中各成分的配比进行了大量的研究和筛选，培养基使用情况和实验结果参见表2。对比培养基1-10的成分组成为：在含有10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基上添加如表2所示的成分。对比培养基1中没有加入任何的细胞因子(不含EGF和HGF，但含有LIF)，对比培养基2中不含有LIF(但含EGF和HGF)，细胞培养情况分别参见图9的第二排和第三排。使用永生化培养基的卵圆细胞始终保持正常的形态，而缺乏全部细胞因子或LIF的细胞在第二周会出现分化。更具体地，对比培养基1为：基础成分为DMEM/F12(1:1)培养基，对比培养基1中，肝细胞生长因子、表皮生长因子、白血病抑制因子、双抗、L-谷氨酰胺和胎牛血清在永生化培养基中的含量分别为0μg/L、0μg/L、10μg/L、100U/ml、2mmol/L和10％(体积百分数)；对比培养基2为：基础成分为DMEM/F12(1:1)培养基，对比培养基2中，肝细胞生长因子、表皮生长因子、白血病抑制因子、双抗、L-谷氨酰胺和胎牛血清在永生化培养基中的含量分别为10μg/L、20μg/L、0μg/L、100U/ml、2mmol/L和10％(体积百分数)。
使用本方案的永生培养基对原代HOC进行培养，实验结果如下：HOC保持8周以上的细胞增殖活性且不出现细胞分化；在培养至8周左右的时候，细胞增殖迅速，可以实现2-3天进行一次传代；8周后对细胞表面标志物进行检测(WB和/免疫荧光)，可检测到AFP以及CK19。对比培养基1没有加入HGF和EGF，仅加入了LIF(图9第二排)，使用对比培养基1对原代HOC进行培养时，HOC细胞增殖速度慢，具体表现在，将原代HOC接种7天后，细胞融合度仍然不能达到80％以上；除此之外，在培养8天之后，HOC细胞全部分化为成纤维细胞，并同时对细胞进行表面标志物检测，不能检测到AFP以及CK19。对比培养基2中没有加入LIF，但加入了HGF和EGF(图9最后一排)，使用对比培养基2对原代HOC进行培养时，HOC能保持8周以上的细胞增殖活性，在培养至8周左右的时候，可以实现2-3天进行一次传代；但在第二周30％的细胞出现分化，第4周90％以上的细胞出现分化；对4周时的HOC进行表面标志物检测，其不表达HOC相关标志物AFP以及CK19。将对比培养基1(含LIF)和对比培养基2(含HGF和EGF)的培养结果与永生化培养基(含LIF、HGF和EGF)的培养结果相比较，使用对比培养基1和2时，HOC均在不同培养时间发生分化，但是永生化培养基将LIF、HGF和EGF联合使用，HOC细胞在培养第8周的时候仍然未发生分化，这说明，三种物质联合使用产生了协同作用，克服了HOC容易发生分化的技术问题，获得了预料不到的技术效果。
其中，在本技术方案中，判定细胞是否分化的标准为：镜下观察细胞形态，如果视野下贴壁细胞均呈圆形或卵圆形，则判定为细胞未分化，如果细胞呈现出其他形态(例如成纤维细胞)，则判定细胞出现分化。细胞增殖活性是指细胞分裂形成新细胞的进行细胞数目扩增的速度，具体体现在细胞接种后铺满细胞培养容器的速度。一般细胞在培养容器中的融合度达到80％需要进行传代，以保证细胞适合的生长条件，可以以传代的频次来反应细胞增殖的活性。
另外，还配置了对比培养基3，其组成为：基础成分为DMEM/F12(1:1)培养基，肝细胞生长因子、表皮生长因子、白血病抑制因子、双抗、L-谷氨酰胺和胎牛血清在永生化培养基中的含量分别为10μg/L、20μg/L、10μg/L、100U/ml、0mmol/L和10％(体积百分数)。对比培养基3中，没有使用L-谷氨酰胺。使用对比培养基3对原代HOC进行培养时，HOC能保持8周以上的细胞增殖活性，但是增殖速度较慢，在第8周的时候，传代的频率为7天一次；在第8周的时候，约20％左右的细胞出现了分化现象。这说明LIF、HGF和EGF，需要配合L-谷氨酰胺使用，才能获得较为理想的维持HOC永生化的效果。
还配置了对比培养基4，组成为：基础成分为DMEM/F12(1:1)培养基，肝细胞生长因子、表皮生长因子、白血病抑制因子、双抗、L-谷氨酰胺和胎牛血清在永生化培养基中的含量分别为0μg/L、0μg/L、0μg/L、100U/ml、2mmol/L和10％(体积百分数)。对比培养基4中没有加入HGF、EGF和LIF，HOC无法有效增殖，大量细胞逐渐死亡，8天后只剩下少量细胞。
还配置了对比培养基5，组成为：基础成分为DMEM/F12(1:1)培养基，肝细胞生长因子、表皮生长因子、白血病抑制因子、双抗、L-谷氨酰胺和胎牛血清在永生化培养基中的含量分别为10μg/L、20μg/L、20μg/L、100U/ml、2mmol/L和10％(体积百分数)。使用对比培养基5对原代HOC进行培养时，HOC细胞无法增殖，生长受到抑制，无法进行传代。细胞大量死亡，在第八天的时候，只剩下了少量的细胞。这说明，LIF的用量过高，会引起生长抑制，将其浓度维持在一定水平，并配合适当浓度的HGF和EGF，才能有效促进HOC的永生化。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (4)

1.一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型的建立方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：
S1：使用原癌基因转化肝卵圆细胞，获得肝癌细胞；所述原癌基因为cMYC；
所述肝卵圆细胞由如下方法制备：首先，构建DDC小鼠模型；然后从DDC小鼠模型的肝脏组织中分离得到所述肝卵圆细胞；最后，将所述肝卵圆细胞培养于永生化培养基中，所述永生化培养基中含有10ug/L的肝细胞生长因子、20ug/L的表皮生长因子、10ug/L的白血病抑制因子、100U/mL的双抗和2mmol/L的L-谷氨酰胺；
S2：将肝癌细胞原位移植到受体小鼠的肝脏，获得原发性小鼠肝癌模型；所述受体小鼠是经过X射线辐照处理的野生型小鼠，X射线辐照处理的剂量为5.5Gy；
将肝癌细胞原位移植到受体小鼠的肝脏的方法为：在所述受体小鼠接受X射线辐照处理的第二天，向受体小鼠的肝门静脉注射所述肝癌细胞，肝癌细胞的注射量为每只小鼠106个。
2.使用权利要求1所述的一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型的建立方法所获得的原发性小鼠肝癌模型在评价基因在肝癌发生和发展过程中的作用中的应用。
3.使用权利要求1所述的一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型的建立方法所获得的原发性小鼠肝癌模型在评价具有治疗肝癌功效的药物中的应用。
4.使用权利要求1所述的一种基于肝卵圆细胞恶性化的原发性小鼠肝癌模型的建立方法所获得的原发性小鼠肝癌模型在筛选原发性肝癌治疗靶点中的应用。
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