CN101228266A - 肝祖细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人肝多能祖细胞系，其表达肝细胞标记，例如白蛋白和α－甲胎蛋白，不表达代表卵圆干细胞的某些标记。还公开了一种分离本发明细胞系的方法、分化所述细胞为多种不同细胞谱系的方法、所述细胞的条件永生化和代谢选择的方法以及本发明的细胞系制备具有成骨分化活性或肝损伤再生活性的药物的用途。

Description

肝祖细胞
本发明涉及由成体肝脏组织分离祖细胞的方法、通过本发明方法分离的肝祖细胞以及诱导分离的肝祖细胞分化的方法和肝祖细胞条件永生化与代谢选择的方法。更具体地说，本发明涉及肝祖细胞，其尽管是肝来源的，但在形态上与肝卵圆干细胞不同，不表达代表肝卵圆干细胞的标记。另外，本发明的肝祖细胞显示出自我更新能力和多谱系分化潜力，这些特征使得可以将这些细胞分类为多能祖细胞。
例如在WO 03/078588、WO 00/43498、WO 00/03001、EP 1394263、US 2003/0138951的现有技术中公开了肝干细胞，包括人肝干细胞。大部分已知的肝干细胞由于其特征性的卵圆形而被称为肝卵圆干细胞。卵圆干细胞是已明确鉴别的肝干细胞类型。其典型特征除了其特征性卵圆形态以外，还有一种或多种代表造血干细胞的表面标记的表达，例如c-kit(CD117)、CD34和Sca-1，提示卵圆干细胞起源于造血干细胞。而且，卵圆干细胞是能够在体内产生肝细胞和胆管细胞这二者的双能祖细胞(Petersen B.E.Goff J.P.Greenberger J.S.Michalopoulos G.K.(1998)Rat oval cells express the hematopoietic stemcell marker Thy-1 in the rat.Hepatology 27，433-445；Petersen B.E.Grossbard B.Hatch H.Pi L.Deng J.Scott E.W.(2003)Mouse A6-positive hepatic oval cells also express several hematopoietic stem cellmarkers.Hepatology 37，632-640)。
现在，本发明人令人惊奇地发现了一种由成体肝脏组织分离祖细胞的方法，该方法产生分离的新祖细胞群，该新祖细胞群的特征在于表达某些代表肝细胞的细胞标记，例如白蛋白和α-甲胎蛋白，以及没有代表卵圆干细胞的形态和分子特征。实际上，本发明的新肝祖细胞在形状上为上皮样的，而不是卵圆形的。而且，这些细胞似乎不表达代表肝卵圆干细胞的某些造血细胞标记。
因此，在第一个方面，本发明提供一种分离非卵圆人肝祖细胞系的方法，所述细胞系表达肝细胞标记，优选为白蛋白和α-甲胎蛋白，所述细胞系优选不表达造血细胞标记，所述方法包括以下步骤：
(i)在细胞培养基中培养成体肝脏来源的人成熟肝细胞，直至成熟肝细胞死亡，并选择具有上皮样形态的存活细胞群；
(ii)通过在含血清、含葡萄糖的培养基中培养扩增存活细胞群，所述培养基补加hEGF(人上皮生长因子)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，并包含哺乳动物细胞生长必需的常见无机盐、氨基酸和维生素。
按照本身已知用于由哺乳动物肝脏(优选人肝脏)分离肝细胞的任意方法，由成体肝脏组织获得用于本发明方法的成熟肝细胞。本文所用表述“成体肝脏组织”的含义在现有技术中已得到充分确认，其指由出生后生物获得的肝脏组织。表述“成熟肝细胞”的含义在现有技术中也已得到充分确认。该表述包括不具有体外增殖能力的完全分化的肝细胞。成熟肝细胞的常用分化标记是生物化学标记，例如白蛋白、酪氨酸转氨酶(TAT)、细胞色素P450、TO、丝氨酸脱水酶(SDH)、Cxs32和26以及形态标记，例如胆小管形成、间隙连接、具有晶状类核体的过氧化物酶体、大量线粒体(参见例如Mitaka T(2002).Reconstruction of hepatic organoid by hepatic stem cells.J HepatobiliaryPancreat Surg.9(6)：697-703)。
成熟肝细胞任选可在培养前在防冻剂存在下冷冻在含血清培养基中。肝细胞优选地冷冻在液体培养基中，所述液体培养基含20％热失活胎牛血清(FCS)或人血清(HS)，并含二甲亚砜(DMSO)作为防冻剂。或者，已知具有防冻特性的任意其它化合物都可用作防冻剂，例如甘油、乙二醇、聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮。冷冻优选在非常低的温度下进行，例如通过将细胞样品放置于-80℃，随后放置在液氮中。
本发明的分离方法包括第一步和第二步，在第一步中，对成熟肝细胞的原代培养物进行负选择，在第二步中，扩增存活细胞群。
在第一步中，肝细胞在严格条件下培养，直至诱导成熟肝细胞的原代培养物死亡。为此，肝细胞可以约1.0-1.5×105个存活细胞/cm2的密度接种在包被胶原蛋白的培养皿上，并在肝细胞培养基中培养约至少2周。在约2周后，大量肝细胞死亡，但一群形成聚群的细胞存活。这种形成聚群的细胞依据其上皮样形态易于与成熟肝细胞区分开来。
在第二步中，取出存活细胞的聚群，以有限稀释度接种，并在含血清、含葡萄糖、补加hEGF和bFGF的丰富培养基中培养，该培养基能够维持细胞聚群的生长。丰富培养基中的hEGF浓度优选为2-10ng/ml；bFGF浓度优选为10-50μg/ml。更优选地，在扩增步骤中使用的丰富培养基是α最小必需培养基(αMEM)和内皮细胞基础培养基(EBM)的混合物(3∶1体积/体积)，该混合物补加FCS和/或HS、谷氨酰胺和抗生素。内皮细胞基础培养基(EBM)包含适宜浓度的生长因子hEGF和bFGF。可将缓冲剂加入丰富培养基，以便将pH保持在约中性值(优选地，pH 7.4)。在培养约3周后观察单个附着集落的外观。传代培养单个克隆，扩增，并在它们接近汇合时分析。
通过上述方法获得的人肝祖细胞不能在补加10％FCS和10％HS的αMEM中生长，所述补加10％FCS和10％HS的αMEM是间叶干细胞的常用培养基。
通过上述方法获得24个不同细胞克隆。将克隆在未分化培养基中保持培养2-3个月。由单个克隆产生约2亿个细胞，表明获得200-250次倍增的寿命。这些数据表明，本发明的肝脏来源的祖细胞能够自我更新。
按照本发明方法的优选实施方案，在步骤(ii)获得的具有上皮样形态的细胞任选可进行条件永生化和代谢选择。
条件永生化提供了具有稳定代谢功能的永生化细胞系。例如，可通过将大T抗原亚克隆入非病毒载体中，实现条件永生化(Hillen和Berens，1994；Hillen等，1983)，所述大T抗原来自SV40，或来自任意其它具有诱导或保持进入细胞周期的活性的基因，例如Bmi-1、h-TERT或c-Myc，所述非病毒载体例如为pcDNA4/TO(Invitrogen)，其包含大肠杆菌Tn10-编码的四环素(Tet)抗性操作子的调节元件。加入第二个调节载体，例如表达高水平TetR基因的pcDNA6/TR(Invitrogen)，诱导永生化基因的表达和受控的细胞生长。
然后通过用仅肝细胞代谢的半乳糖替换细胞培养基中的葡萄糖对永生化细胞进行代谢选择。
本发明的另一方面是如上所述获得的肝脏来源的细胞。业已表明，这类细胞在适宜培养条件下分化为成熟肝细胞或产胰岛素细胞，指示这些细胞为肝祖细胞。另外，业已表明，本发明的细胞系在适宜的分化培养基中培养时经历成骨和内皮分化。而且，本发明细胞系的特征在于特有的细胞标记表达谱，据本申请人所知，此表达谱迄今还没有被公开过，与肝卵圆干细胞的表达谱不同，提示已鉴别出新细胞类型。
利用FACS(荧光活化细胞分选法)、免疫荧光和RT-PCR表征本发明的肝脏来源人祖细胞系的众多细胞标记的表达谱表明，存在几种干细胞标记和肝组织特异性标记。检验以下的细胞抗原：CD34、C-kit、SCA-1、CD29、CD73、CD45、CD133、CD146、CD105、CD44、CD90、CD117、CD14、HLA-A、B、C、α-甲胎蛋白、细胞角蛋白19、白蛋白和细胞角蛋白18。结果总结于下表I。
表I
    标记     HuHEP克隆的FACS分析(阳性细胞％：平均值±SD)
 CD34CD45CD14CD73CD29CD44CD117(c-Kit)CD90(Thy-1)CD146CD133CD105(endoglin)     ---+++-+--+
 标记     HuHEP克隆的免疫荧光分析(阳性细胞％：平均值±SD)
 α-甲胎蛋白(AFP)CK18CK19白蛋白(ALB)HLA-A、B、C     ++-++
结果表明，本发明的肝来源的人祖细胞既表达干细胞标记，又表达肝细胞标记，由此证实此细胞是肝脏前体。具体地说，图1表明，获得的非卵圆肝人祖细胞(在表I和在下文中称为“HuHEP”)表达白蛋白(A)、α-甲胎蛋白(C)和细胞角蛋白18(E)，这通过使用特异性抗体的免疫荧光检测。B、D、F是各自的同种型阴性对照。(×400)。
在没有典型成熟肝细胞标记例如细胞色素P450和合成尿素能力的情况下，白蛋白、α-甲胎蛋白和细胞角蛋白18的表达代表肝细胞，将本发明的细胞系表征为肝祖细胞。
在以上表I中检测和列出的形态和表面标记表征了与肝卵圆干细胞不同的群。具体地说，本发明的细胞系不表达CD-117(C-kit)也不表达CK19(细胞角蛋白19)，CD-117和CK19是卵圆干细胞的典型标记。卵圆干细胞的另一个典型标记，即CD34，也是本发明细胞系所没有的。
而且，本发明细胞系不表达代表造血干细胞的细胞表面标记(例如CD117、CD34、CD45和CD133)，与其它肝干细胞(如描述于WO03/078588的人原肝干细胞)和卵圆干细胞相反。另一方面，本发明的细胞系表达代表其它干细胞的几种细胞表面标记，例如CD29、CD73、CD146、CD105(endoglin)、CD44、CD90(Thy-1)和HLA-A、B、C。
本发明祖细胞系的极为有利的特征在于它们能够分化为多种不同细胞谱系。具体地说，本发明的祖细胞系能够在适宜分化条件下培养时分化为成熟肝细胞、产胰岛素细胞、成骨细胞和内皮细胞。
为分化为成熟肝细胞，本发明的细胞在补加肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子4(FGF-4)的含血清培养基中培养，优选在MEM-EBM(3∶1)+10％FCS和/或HS中培养。
为分化为产胰岛素的细胞，本发明的细胞在至少2g/l葡萄糖、优选4.5g/l葡萄糖存在下在含血清培养基中培养，优选补加2％FCS和/或HS的DMEM。更优选地，在葡萄糖存在下培养约1个月后向含血清培养基加入烟酰胺。培养基中适宜的烟酰胺浓度为约10mM。
为进行成骨分化，本发明的细胞在补加抗坏血酸-2-磷酸酯和地塞米松以及无机磷酸盐的含血清培养基中生长，优选在αMEM中生长。
为进行内皮细胞分化，本发明的细胞在补加VEGF(血管内皮生长因子)的内皮细胞基础培养基中培养，优选在EBM-2中培养。
将本发明的非卵圆肝祖细胞皮下接种入SCID小鼠中，以评价肿瘤外观。在6个月后未观察到肿瘤。从那以后，如上所述，可扩增本发明的非卵圆肝祖细胞系，保持培养几代，冷藏并分化，此外还根据其分化特性，这些细胞可用于众多用途，尤其包括用作肝炎病毒培养物的底物、用作药物检验的体外模型、用于再生疗法和用于生物人工肝的开发。
提供以下实例仅是为了阐述，无意限制由所附权利要求书确定的本发明范围。
实施例
冷藏
将由成体人肝脏组织获得的正常人成熟肝细胞冷藏在补加10％除菌过滤的二甲亚砜(DMSO)的热失活胎牛血清(FCS)中，并将小瓶储存于液氮中。融化肝细胞，通过使用染料锥虫蓝的染料排除实验测定存活细胞数来控制冷冻后的细胞活力。实验表明，细胞活力＞90％，融化的细胞保持其表型和分化能力。
非卵圆人肝祖细胞(HuHEP)的分离和培养
肝细胞得自8种不同的正常人肝脏制备物，包括2种来自新鲜肝脏的制备物和6种冷藏肝细胞制备物(得自Cambrex(Bio Science，Verviers，Belgium，http://www.cambrex.com)。
来自新鲜肝组织的制备物
人肝细胞分离自进行肝切除术的患者的新鲜手术标本。使用健康肝组织(5-20g)通过胶原蛋白酶消化分离肝细胞。简而言之，分离肝组织，并用350 ml热(37℃)的无钙缓冲液(肝灌注培养基，Gibco，GrandIsland，NY；http://www.invitrogen.com/)灌注。然后，于37℃在肝消化培养基(Gibco)中消化肝组织。这导致肝组织变白、软化和解离，在10-12分钟内提供完全消化的肝。通过用大内径移液管切细和吸取释放肝细胞。通过无菌的100μm尼龙筛将细胞悬浮液过滤入放置于冰上的破碎机中，通过以50g离心5分钟沉降，重悬浮，并在冷清洗培养基(Hepatocyte Wash Medium，Gibco)中清洗2-3次。
负选择
首先将如上所述获得的肝细胞接种在Williams Medium E培养基(Gibco)中，该培养基还补加谷氨酰胺和5％胎牛血清(FCS，Euroclone，Wetherby，UK，http://www.euroclone.net)。2-3小时后倒出未附着的细胞，然后用肝细胞无血清培养基(Hepatozyme-SFM，Gibco)-一种补加1.25μg/cm2胶原蛋白的高度改良型Chees′培养基替换，以提供多层基质。在24小时时以及此后每48小时用Hepatozyme SFM(无胶原蛋白)再喂饲培养物。将肝细胞以1.0-1.5×105个存活细胞[以锥虫蓝(Gibco)测定80％的存活细胞]/cm2的密度接种在包被胶原蛋白的培养皿上的Hepatozyme-SFM中，于37℃、5％CO2中保持2周。约培养2周后，观察到肝细胞大范围死亡。
扩增
培养基用补加L-谷氨酰胺(5mM)、Hepes(12 mM，pH 7.4)、青霉素(50IU/ml)、链霉素(50μg/ml)(全部来自Sigma-Aldrich，St.Louis，MO；http://www.sigmaaldrich.com/)、FCS(10％)和马血清(10％，HS，Gibco)的α-最小必须培养基/内皮细胞基础培养基-1(CCMEM/EBM)(3∶1)(Gibco/Cambrex)替换。在另3周后鉴别培养皿上的单个附着细胞。当集落明显时，将克隆环置于它们周围，将它们传代培养至24孔培养板的单个孔中。将扩增的细胞转移至75-cm2摇瓶，并在它们接近汇合时分析。
冷藏的肝细胞
在如上所述的相同培养条件(负选择和扩增)下培养冷藏的人正常肝细胞，产生相似的结果。
条件永生化
分离培养约10代的细胞，并用5μg携带亚克隆的SV40大T抗原的载体pcDNA4/TO(Invitrogen)以180 V进行20秒电穿孔。用zeocin(5μg/ml)选择细胞3周。
然后用5μg栽体pcDNA6/TR(Invitrogen)以180V对细胞进行20秒的第二次电穿孔，并在强力霉素(1μg/ml)存在下用杀稻瘟菌素(5μg/ml)选择3周。每3天在强力霉素(1μg/ml)存在下以补加10％PCS的DMEM培养基(DMEM：Dulbecco′s MEM)喂饲细胞。
代谢选择
用强力霉素(1μg/ml)将如上所述获得的永生化细胞诱导至生长，将该永生化细胞在含1μg/ml半乳糖和3％FCS的无葡萄糖RPMI培养基中培养30天，以便选择能够特异性地使用半乳糖代替葡萄糖的细胞，这种代替是肝细胞的典型特征。检验并冷藏细胞。
HuHEP分代为肝细胞和产胰岛素细胞
为了确认HuHep细胞是否能够分化为成熟肝细胞，评价在不同培养条件下细胞色素P450(即代谢氧化酶)的表达。在以下培养条件下培养
在含补加10％FCS/HS+HGF/FGF-4的MEM/EBM培养基的生物反应器中培养HuHEP。在培养15天后评价细胞色素P450-阳性HuHEP。在MEM/EBM+10％FCS+HGF/FGP-4中培养的20-25％的总HuHEP群是细胞色素P450-阳性的。尿素浓度在3-4mg/dL的范围内葡萄是初始存在于新鲜培养基中的总葡萄糖的一半，总蛋白没有改变，表明分化的肝细胞有代谢活性。
而且，在补加2％FCS/HS和高葡萄糖含量(至少2g/l葡萄糖，优选4.5g/l葡萄糖)的DMEM培养基(DMEM：Dulbecco′sMEM)中温育1个月，任选在10mM烟酰胺存在下温育5-7天，HuHEP分化为产胰岛素细胞。细胞开始在汇合细胞单层上部形成小球形细胞聚群，其在形态上类似于胰岛。此三维细胞聚群用抗人胰岛素的多克隆抗体和抗人葡萄糖转运蛋白2(Glut2)(其为葡萄糖转运体)的单克隆抗体正染色(图2)。而且，用对含胰岛素的颗粒特异性的Zn-螯合剂双硫腙染色三维细胞聚群。这些结果示于图2。该图显示了未受刺激的HuHEP的形态外观(图A)、用诱导胰岛样结构形成的分化培养基刺激的HuHEP的形态外观(图B)。图2的图C和D：人胰岛素的免疫荧光染色；图E和F：人Glut2的免疫荧光染色；图G和H：用阴性同种型对照染色；图I：用Zn-螯合剂双硫腙染色。(A、B、D、F、G、H、I×250；C和E×150)。
体外成骨分化
为诱导成骨分化，在补加10％FCS、10％HS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、12mM L-谷氨酰胺、20mM β-磷酸甘油、50ng/mL甲状腺素、1nM地塞米松和0.5μM抗坏血酸-2-磷酸酯(全部来自Sigma-Aldrich)的oMEM中培养细胞。一周2次用新鲜培养基替换培养基持续3周。为评价分化，用4％多聚甲醛于室温固定细胞20分钟，并用Alizarin Red，pH 4.1(Sigma)于室温染色20分钟。
在成骨分化培养基中培养达3周的细胞表现出钙沉积以及骨钙素和骨桥蛋白的表达，指示成骨分化。而且，细胞对白蛋白、AFP和CK18变成阴性的。
在没有无机磷酸盐的相同培养基中6周后，未检测到脂质累积。
体外内皮细胞分化
通过在具有血管内皮生长因子(VEGF，10ng/ml，Sigma)的EBM-2培养基(Cambrex)中培养10天获得内皮细胞分化。当在补加VEGF的EBM中培养时，细胞表达内皮细胞标记CD31、CD34、KDR(VEGFR-2)、CD144(VE-钙粘附素)和在未分化条件下为阴性的vonWillebrand因子，指示内皮分化。在内皮分化过程中，白蛋白、AFP和CK18消失。
HuHEP注射在SCID中的醋氨酚诱导肝损伤中的作用
醋氨酚肝毒性是一种广为所知的肝坏死模型。增加水平的醋氨酚毒性代谢物-N-乙酰基-对-苯醌亚胺(NAPQI)是肝坏死的原因。
动物模型和HuHEP移植
SCID小鼠得自Charles River(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。它们圈养在无特定病原体的环境中。8周龄雄性SCID小鼠用于实验。实验按照NIH的指引进行。在16小时禁食后，用溶解在无菌盐水中的250mg/kg醋氨酚(Sigma，St.Louis，MO)或作为载体对照的单独无菌盐水腹膜内注射小鼠。在注射醋氨酚后，用标准饲料随意喂饲小鼠。
在醋氨酚注射后1天观察到肝损伤的峰值。此时，使用胰蛋白酶-EDTA收集HuHEP(III-IV代)，用PBS清洗，用PKH26红色荧光细胞连接物试剂盒(Sigma)标记，在微血细胞计数室中计数，重悬浮在PBS中(在250μl PBS中有1×106个)。
血浆转氨酶检测
于37℃用商品化试剂盒(Sigma Diagnostic)检测天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的血浆或血清水平。
组织学
在切片前对肝组织进行福尔马林固定和石蜡包埋。肝切片用苏木精-伊红染色。
为进行冷藏，将肝组织过夜保持在4％多聚甲醛溶液中。第二天，去除甲醛，代之以70％EtOH。然后将组织固定在OCT中。
在以随机和盲方式数字成像每个载玻片的3个高倍视野后，进行组织坏死程度的定量分析。按照出现嗜曙红性减少的存在、失去细胞结构、空泡形成、细胞破裂或核溶解确定组织坏死或临近坏死的面积。
免疫荧光
冷冻肝切片与缀合FITC的小鼠抗人HLA-A、B、C单克隆抗体(BioLegend，San Diego，CA)(1∶200)或对照小鼠单克隆IgG1于室温温育1小时。每个标本检验3个不连续切片。
体内实验的结果
醋氨酚诱导肝脏的大范围坏死损伤。在诱导肝损伤后24小时注射标记的HuHEP导致HuHEP在肝损伤部位的局部募集。发现该细胞有助于肝再生，因为在肝损伤后15天在SCID小鼠的肝中可检测到它们。
以上体外和体内实验结果表明，本发明的非卵圆人肝祖细胞系适用于制备具有成骨分化活性的药物以及具有肝损伤再生活性的药物。

Claims (30)

1.一种非卵圆人肝多能祖细胞系，其表达肝细胞标记。
2.权利要求1的细胞系，所述细胞系表达肝细胞标记白蛋白和蛋白。
3.权利要求1或2的细胞系，所述细胞系表达肝细胞标记CK18。
4.权利要求1-3中任一项的细胞系，所述细胞系表达干细胞标记CD29、CD73、CD146、CD105和CD90。
5.权利要求1-4中任一项的细胞系，所述细胞系不表达造血细胞
6.权利要求1-5中任一项的细胞系，所述细胞系不表达造血干细CD133。
7.权利要求1-6中任一项的细胞系，所述细胞系不表达卵圆细胞D117(C-kit)、CK19和CD34。
8.权利要求1-7中任一项的细胞系，所述细胞系不表达成熟肝细细胞色素P450，不合成尿素。
9.权利要求1-8中任一项的细胞系，所述细胞系能够分化为成熟胞和产胰岛素细胞。
10.权利要求1-9中任一项的细胞系，所述细胞系是永生化的。
11.一种分离权利要求1-9中任一项的非卵圆人肝多能祖细胞系，所述方法包括以下步骤：
  )在细胞培养基中培养成体肝脏来源的人成熟肝细胞，直至成熟死亡，并选择具有上皮样形态的存活细胞群；
  i)通过在含血清、含葡萄糖、补加hEGF(人上皮生长因子)和(碱性成纤维细胞生长因子)并包含哺乳动物细胞生长必需的常盐、氨基酸和维生素的培养基中培养，扩增具有上皮样形态的胞群。
12.权利要求11的方法，其中所述成熟肝细胞在防冻剂存在下冷冻在含血清培养基中，然后在按照步骤(i)培养前融化。
13.权利要求12的方法，其中所述防冻剂是二甲亚砜。
14.权利要求11-13中任一项的方法，其中步骤(i)的细胞培养基是肝细胞培养基。
15.权利要求11-14中任一项的方法，其中步骤(ii)的含血清培养基是补加胎牛血清(FCS)或人血清(HS)、抗生素和谷氨酰胺的αMEM-EBM(3∶1体积/体积)的混合物。
16.权利要求11-15中任一项的方法，其中所述成熟肝细胞按照步骤(i)培养至少2周。
17.权利要求11-16中任一项的方法，其中所述分离的非卵圆人肝多能祖细胞系还进行条件永生化。
18.权利要求11-17中任一项的方法，其中还通过在培养基中用半乳糖代替葡萄糖，使所述分离的非卵圆人肝多能祖细胞系进行代谢选择。
19.一种将权利要求1-10中任一项的非卵圆人肝多能祖细胞系分化为成熟肝细胞的方法，所述成熟肝细胞能够表达成熟肝细胞标记细胞色素P450并能够合成尿素，所述方法包括在补加肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细胞生长因子4(FGF-4)的含血清培养基中培养所述细胞系。
20.权利要求19的方法，其中所述含血清培养基是补加10％FCS或HS、HGF和FGF-4的MEM-EBM。
21.一种将权利要求1-10中任一项的非卵圆人肝多能祖细胞系分化为产胰岛素细胞的方法，所述方法包括在至少2g/l葡萄糖存在下在含血清培养基中培养所述细胞系。
22.权利要求21的方法，其中所述含血清培养基还包含烟酰胺。
23.权利要求21或22的方法，其中所述含血清培养基是补加2％FCS或HS、4.5g/l葡萄糖和10mM烟酰胺的DMEM。
24.一种将权利要求1-10中任一项的非卵圆人肝多能祖细胞系分化为成骨细胞的方法，所述方法包括在补加抗坏血酸-2-磷酸酯和地塞米松以及无机磷酸盐的含血清培养基中培养所述细胞系。
25.权利要求24的方法，其中所述含血清培养基是补加10％FCS、10％HS、1nM地塞米松和0.5μM抗坏血酸-2-磷酸酯的αMEM。
26.一种将权利要求1-10中任一项的非卵圆人肝多能祖细胞系分化为内皮细胞的方法，所述方法包括在补加血管内皮生长因子(VEGF)的内皮细胞基础培养基中培养所述细胞系。
27.权利要求26的方法，其中所述内皮细胞基础培养基是补加10ng/ml VEGF的EBM-2。
28.权利要求19-27中任一项的方法，其中所述非卵圆人肝多能祖细胞系在生物反应器中培养。
29.权利要求1-10中任一项的非卵圆人肝多能祖细胞系用于制备药物的用途，所述药物具有成骨分化活性。
30.权利要求1-10中任一项的非卵圆人肝多能祖细胞系用于制备药物的用途，所述药物具有肝损伤再生活性。
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