BRPI0613375A2

BRPI0613375A2 - células progenitoras do fìgado

Info

Publication number: BRPI0613375A2
Application number: BRPI0613375-4A
Authority: BR
Inventors: Maria Beatriz Herrera Sanchez; Benedetta Bussolati; Giovanni Camussi; Stefano Buttiglieri
Original assignee: Fresenius Medical Care De Gmbh
Priority date: 2005-05-26
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2011-01-11
Also published as: ATE486126T1; CN101228266B; CA2609523A1; CN101228266A; JP2008541717A; WO2006126236A1; EP1888742A1; JP5144505B2; US9334479B2; WO2006126219A8; PL1888742T3; CA2609523C; BRPI0613375B1; US20100003752A1; CN103396989A; EP1888742B1; ES2355327T3; DE602006017833D1; DK1888742T3; WO2006126219A1

Abstract

Células progenitoras do fígado. O presente invento se refere a linhagens celulares progenitoras pluripotentes de fígado humano que expressam marcadores celulares hepáticos tais como albumina e <244>-fetoproteína e não expressam alguns dos marcadores que são típicos de células-tronco ovais. Também são descritos um método para isolar as linhagens celulares do presente invento, métodos para diferenciar ditas células numa pluralidade de linhagens celulares diferentes, métodos para imortalização condicional e seleção metabólica de ditas células, bem como o uso das linhagens celulares do presente invento para preparar medicamentos com atividade de diferenciação osteogênica ou atividade de regeneração de dano no fígado.

Description

Células progenitoras do fígado.

Refere-se o presente invento a um método de isolamento decélulas progenitoras de um tecido de fígado adulto, células progenitoras do fígadoisoladas pelo método do presente invento, bem como a métodos de indução dediferenciação das células progenitoras do fígado isoladas e métodos de imortalizaçãocondicional e seleção metabólica das células progenitoras do fígado. Maisespecificamente, o presente invento se refere às células progenitoras do fígado que,embora sejam derivadas do fígado, são morfologicamente diferentes das células-troncohepáticas ovais e não expressam os marcadores típicos das células-tronco hepáticasovais. Adicionalmente, as células progenitoras do fígado de acordo com o presenteinvento exibem capacidade de auto-renovação e potencial de diferenciação multi-linhagem, características que permitem categorizar estas células como célulasprogenitoras pluripotentes.

As células-tronco do fígado, incluindo as células-tronco dofígado humano, são descritas no estado da técnica, por exemplo, nos pedidos de patenteWO 03/078588, WO 00/03001, EP 1394263, US 2003/0138951. As células-tronco dofígado mais conhecidas são designadas como células-tronco ovais hepáticas, devido aoseu formato oval característico. As células-tronco ovais são um tipo bem definido decélulas-tronco do fígado. As características principais delas são, além de sua morfologiaoval característica, a expressão de um ou mais marcadores de superfície que são típicosde células-tronco hematopoiéticas, tais como c-kit (CD117), CD34 e Sca-1, sugerindo queas células-trçnco ovais se originam de células-tronco hematopoiéticas. Além disso, ascélulas-tronco ovais são progenitores bipotentes capazes de gerar ambos hepatócitos ecolangiócitos in vivo (Petersen B. E., Goff J. P1 Greenberger J. S., Michalopoulos G. K.(1998) "Rat oval cells express the hematopoietic stem cell marker Thy-1 in the rat."Hepatology 27, 433-445; Petersen B. E., Grossbard B., Hatch H., Pi L., Deng J., ScottE.W. (2003) "Mouse A6-positive hepatic oval cells also express several hematopoieticstem cell markers". Hepatology 37, 632-640).

Os presentes inventores descobriram surpreendentementeum método para isolar células progenitoras de tecido de fígado adulto que resulta noisolamento de uma nova população de células progenitoras que é caracterizada pelaexpressão de alguns marcadores celulares que são típicos de células hepáticas, taiscomo albumina e α-fetoproteína, e pela ausência de características morfológicas emoleculares típicas das células-tronco ovais. As novas células progenitoras de fígado dopresente invento são de fato epitelióides no formato preferencialmente a serem deformato oval.

Além disso tais células não parecem expressar alguns dosmarcadores celulares hemopoiéticos que são típicos das células-tronco ovais hepáticas.Conseqüentemente, num primeiro aspecto, o presenteinvento provê um método de isolar uma linhagem celular progenitora de fígado humanoexpressando marcadores celulares hepáticos, preferencialmente albumina e a-fetoproteína, dita linhagem celular preferencialmente não expressando marcadorescelulares hemopoiéticos, o método compreendendo as etapas de:

(i) cultivar hepatócitos humanos maduros derivados do fígado em um meio de culturacelular até a morte dos hepatócitos maduros e seleção de uma população de célulassobreviventes tendo morfologia epitelióide;

(ii) expandir a população de células sobreviventes cultivando em um meio de culturacontendo soro, glicose, suplementado com hEGF (fator de crescimento epitelialhumano) e bFGF (fator de crescimento de fibroblasto básico) e compreendendo ossais inorgânicos usuais, aminoácidos e vitaminas necessários para o crescimento decélulas de mamíferos.

Os hepatócitos maduros empregados no método dopresente invento são obtidos a partir de tecido de fígado adulto de acordo com qualquerprocedimento conhecido per se para o isolamento de hepatócitos do fígado de mamífero,preferencialmente do fígado humano. O significado da expressão "tecido de fígadoadulto" como usado aqui está bem estabelecido no estado da técnica e significa tecido defígado obtido a partir de um organismo pós-natal. O significado da expressão "hepatócitosmaduros" é também bem estabelecido no estado da técnica. Esta expressão abrangehepatócitos completamente diferenciados que não têm a habilidade de se proliferar invitro. Os marcadores de diferenciação freqüentemente usados para hepatócitos madurossão marcadores bioquímicos, tais como albumina, tirosina aminotransferase (TAT),citocromo P450, TO, serina desidratase (SDH), Cxs 32 e 26, bem como marcadoresmorfológicos, tais como formação de dutos biliares, junções de hiato, peroxisomas comnucleóides cristalinos, um alto número de mitocôndrias (vide por exemplo Mitaka T.(2002). "Reconstruction of hepatic organoid by hepatic stem cells". J. HepatobiliaryPancreat Surg.; 9 (6): 697-703).

Os hepatócitos maduros podem ser opcionalmentecongelados em um meio de cultura contendo soro na presença de um agente crioprotetorantes da cultivação. Os hepatócitos são preferencialmente congelados num meio líquidocompreendendo 20% de soro fetal de bezerro (FCS) ou soro humano (HS) termo-inativado e contendo dimetilsulfóxido (DMSO) como agente crioprotetor. Alternativamente,qualquer outro composto conhecido por ter propriedades crioprotetoras pode ser usadocomo agente crioprotetor, tais como por exemplo glicerol, etilenoglicol, poli(etilenoglicol),ou polivinilpirrolidona. O congelamento é preferencialmente executado em temperaturasmuito baixas, por exemplo colocando a amostra das células a -80°C e subseqüentementeem nitrogênio líquido.O método de isolamento do presente invento compreendeuma primeira etapa em que a cultura primária de hepatócitos maduros é submetida àseleção negativa e numa segunda etapa em que a população de células sobreviventes éexpandida.

Na primeira etapa, os hepatócitos são cultivados emcondições severas até que seja induzida a morte da cultura primária de hepatócitosmaduros. Para este fim, os hepatócitos podem ser semeados numa densidade de cercade 1,0 a 1,5 χ 105 células viáveis por cm2 sobre placas de cultura revestidas comcolágeno e cultivadas num meio de cultura celular de hepatócitos por cerca de pelomenos 2 semanas. Após cerca de 2 semanas, a grande maioria dos hepatócitos moremas uma população de células formadoras de aglomerados sobrevive. Tais célulasformadoras de aglomerados são prontamente distinguíveis dos hepatócitos maduros porsua morfologia epitelióide.

Na segunda etapa, os aglomerados de células sobreviventessão removidos, plaqueados em diluição Iimitante e cultivados em um meio de cultura ricocontendo soro e glicose suplementado com hEGF e bFGF, o meio sendo capaz desustentar o crescimento dos aglomerados celulares. A concentração de hEGF no meiorico é preferencialmente compreendida entre 2 e 10 ng/mL; a concentração de bFGF épreferencialmente compreendida entre 10 e 50 μg/mL. Mais preferencialmente, o meio decultura rico usado na etapa de expansão é uma mistura de alfa Meio Essencial Mínimo(aMEM) e Meio Basal Endotelial (EBM) (3:1 v/v), suplementado com FCS e/ou HS1glutamina e antibióticos. O Meio Basal Endotelial (EBM) compreende concentraçõesadequadas dos fatores de crescimento hEGF e bFGF. Um agente tampão pode seradicionado ao meio rico a fim de manter o pH em cerca de valores neutros(preferencialmente pH 7,4). A aparência de colônias individuais anexadas é observadaapós cerca de 3 semanas em cultura. Os clones individuais são sub-cultivados,expandidos e analisados quando se aproximam da confluência.

As células progenitoras do fígado humano obtidas pelométodo descrito acima são incapazes de crescer em aMEM suplementado com 10% FCSe 10% HS, que é o meio de cultura freqüentemente usado para células-troncomesenquimais.

Vinte e quatro clones celulares diferentes foram obtidos pelométodo descrito acima. Os clones foram mantidos em cultura e em meio nãodiferenciador por de 2 a 3 meses. Cerca de 200 milhões de células foram geradas a partirde um único clone, indicando uma longevidade de 200 a 250 duplicações. Estes dadosindicam que as células progenitoras derivadas do fígado do presente invento sãocapazes de auto-renovação.

De acordo com uma forma preferida de realização dométodo do presente invento, as células tendo morfologia epitelióide obtidas na etapa (ii)podem opcionalmente ser submetidas a imortalização condicional e seleção metabólica.

A imortalização condicional prove linhagens celularesimortalizadas com funções metabólicas estáveis. A imortalização condicional pode seralcançada por exemplo pela sub-clonagem de antígenos Grande T de SV40 ou dequalquer outro gene tendo a atividade de induzir ou manter a entrada no ciclo celular, taiscomo, p.ex., Bmi-1, h-TERT ou c-Myc, em um vetor não viral tal como pcDNA4/TO(Invitrogen) que inclui os elementos regulatórios do operon de resistência tetraciclina (Tet)codificado por E. coli TnIO (Hillen and Berens, 1994; Hillen et al., 1983). A adição de umsegundo vetor regulatório tal como pcDNA6/TR (Invitrogen) que expressa altos níveis degene TetR, induz a expressão do gene imortalizante e do crescimento celular controlado.

As células imortalizadas são então submetidas a seleçãometabólica pela substituição de glicose no meio de cultura celular por galactose que émetabolisada somente pelas células hepáticas.

Um outro aspecto do presente invento são as célulasderivadas do fígado obtidas como descrito acima. Tais células mostraram diferenciaçãosob condições de cultura adequadas em hepatócitos maduros ou células produtoras deinsulina, marcando estas células como células progenitoras do fígado. Adicionalmente, aslinhagens celulares do presente invento mostraram sofrer diferenciação osteogênica eendotelial quando cultivadas no meio de diferenciação apropriado. Além disso, aslinhagens celulares do presente invento são caracterizadas por um perfil único deexpressão de marcador celular que, do conhecimento do depositante, nunca foi descritoaté agora e que é diferente do perfil de expressão das células-tronco ovais do fígado,sugerindo que um novo tipo de células foi identificado.

A caracterização por FACS (Ordenação celular ativada porfluorescência), Imunofluorescência e RT-PCR do perfil de expressão de váriosmarcadores celulares das linhagens celulares progenitoras humanas derivadas do fígadodo presente invento mostra a presença de vários marcadores de células-tronco emarcadores específicos de tecido do fígado. Os seguintes antígenos celulares foramtestados: CD34, C-kit, SCA-1, CD29, CD73, CD45, CD133, CD146, CD105, CD44, CD90,CD117, CD14, HLA-A,B,C, α-fetoproteína, citoqueratina 19, albumina e citoqueratina 18.

Os resultados são resumidos na tabela I abaixo.

TABELA I

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Os resultados indicam que as células progenitoras humanasderivadas do fígado do presente invento expressam marcadores de ambas células-troncoe células do fígado, confirmando com isso que tais células são precursoras do fígado.Particularmente, a fig. 1 mostra que as células progenitoras humanas do fígado não ovaisobtidas (chamadas na Tabela I e nas seguintes como "HuHEP") expressam albumina (A),α-fetoproteína (C) e citoqueratina 18 (E) como detectado pela imunofluorescência usandoanticorpos específicos. B, D e F são os respectivos controles isotípicos negativos (x 400).

A expressão de albumina, α-fetoproteína e citoqueratina 18é típica de células hepáticas e caracteriza as linhagens celulares do presente inventocomo células progenitoras do fígado, na ausência de marcadores típicos de célulasmaduras do fígado tais como citocromo P450 e a capacidade de sintetizar uréia.

A morfologia e os marcadores de superfície detectados elistados na tabela I acima, caracterizam uma população que é diferente das células-tronco ovais hepáticas. Particularmente, as linhagens celulares do presente invento nãoexpressam CD-117 (c-Kit) nem CK19 (citoqueratina 19), que são marcadores típicos decélulas-tronco ovais. Um outro marcador típico de células-tronco ovais, i.e., CD34,também está ausente das linhagens celulares do presente invento.

Além disso, as linhagens celulares do presente invento nãoexpressam marcadores celulares de superfície que são típicos de células-troncohematopoiéticas (tais como CD117, CD34, CD45 e CD133) contrário a outras células-tronco do fígado tais como as células-tronco hepáticas primitivas humanas descritas nopedido de patente WO 03/078588 e as células-tronco ovais. Por outro lado, as linhagenscelulares do presente invento expressam vários marcadores celulares de superfície quesão típicos de outras células-tronco, por exemplo CD29, CD73, CD146, CD105(endoglina), CD44, CD90 (Thy-1) e HLA-A1B1C.

Uma característica extremamente vantajosa das linhagenscelulares progenitoras do presente invento é que elas são capazes de se diferenciarnuma pluralidade de linhagens celulares diferentes. Particularmente, as linhagenscelulares progenitoras do presente invento são capazes de se diferenciar em célulasmaduras do fígado, células produtoras de insulina, células osteogênicas e célulasendoteliais quando cultivadas sob condições adequadas de diferenciação.

Para diferenciação em células maduras de fígado, as célulasdo presente invento são cultivadas em um meio de cultura contendo soro,preferencialmente MEM-EBM (3:1) + 10% FCS e/ou HS1 suplementados com fator decrescimento de hepatócito (HGF) e fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGF-4).

Para diferenciação em células produtoras de insulina, ascélulas do presente invento são cultivadas em um meio de cultura contendo soro,preferencialmente DMEM suplementado com 2% FCS e/ou HS, na presença de pelomenos 2g/L de glicose, preferencialmente de 4,5 g/L de glicose. Mais preferencialmente,a nicotinamida é adicionada ao meio de cultura contendo soro após cerca de 1 mês decultura na presença de glicose. Uma concentração adequada de nicotinamida no meio decultura é de cerca de 10 mM.

Para diferenciação osteogênica, as células do presenteinvento são cultivadas em um meio de cultura contendo soro, preferencialmente a-MEM,suplementado com ascorbato-2-fosfato e dexametasona com fosfato inorgânico.

Para diferenciação endotelial, as células do presente inventosão cultivadas em um meio basal celular endotelial, preferencialmente EBM-2,suplementado com VEGF (fator de crescimento endotelial vascular).

As células progenitoras de fígado não ovais do presenteinvento foram inoculadas subcutaneamente em camundongos SCID para avaliar osurgimento de tumores. Nenhum tumor foi observado após seis meses. Uma vez que,como mencionado acima, as linhagens celulares progenitoras do fígado não ovais dopresente invento podem ser expandidas, mantidas em cultura por várias passagens,criopreservadas e diferenciadas, e também em vista de suas propriedades dediferenciação, tais células são úteis em várias aplicações incluindo, entre outras, o usocomo um substrato para culturas de vírus de hepatite, o uso como um modelo in vitropara teste de drogas, a aplicação na terapia regenerativa e a aplicação nodesenvolvimento de um fígado bioartificial.

Os seguintes exemplos são fornecidos a título de ilustraçãoe não se destinam a limitar o escopo do presente invento, como determinado pelasreivindicações anexas.

EXEMPLOS

Criopreservação

Os hepatócitos maduros humanos normais obtidos de tecidode fígado humano adulto foram criopreservados em soro fetal de bezerro (FCS) termoinativado suplementado com 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) esterilizado a filtro e osfrascos foram armazenados em nitrogênio líquido. Os hepatócitos foram degelados paracontrolar a viabilidade celular após congelamento, determinando o número de célulasviáveis pelo ensaio de exclusão por corante usando o corante azul Trypan. Osexperimentos mostraram que a viabilidade celular foi de > 90% e que as célulasdegeladas mantinham seu fenótipo e capacidades de diferenciação.

Isolamento e cultura de células progenitoras de fígado humano não ovais (HuHEP)

Os hepatócitos foram obtidos a partir de 8 preparaçõesdiferentes de fígado humano normal, incluindo 2 preparações a partir de fígado fresco e 6preparações de hepatócitos criopreservados (obtidos de Cambrex Bio Science, Verviers,Bélgica, http://www.cambrex.com).

Preparação do tecido de fígado fresco

Os hepatócitos humanos foram isolados de amostrascirúrgicas de pacientes sofrendo hepatectomia. O tecido de fígado sadio (de 5 a 20 g) foiusado para isolar hepatócitos por digestão com colagenase. Brevemente, os tecidos defígado foram isolados e irrigados com 350 mL de tampão morno (37°C) isento de Ca(Liver Perfusion Médium, Gibco, Grand Island1 NY; http://www.invitrogen.com/).

Então os tecidos de fígado foram digeridos em meio dedigestão de fígado (Gibco) a 37°C. Isto resultou no empalidecimento, amolecimento edissociação do tecido do fígado e proveu a completa digestão do fígado dentro de 10 a12 min. Os hepatócitos foram liberados por moagem e pipetagem com uma pipeta de furogrande. A suspensão celular foi filtrada através de uma tela esterilizada de nylon de 100μm em um béquer colocado em gelo, sedimentada por centrifugação a 50g por 5 min.,resuspendida e lavada de 2 a 3 vezes em meio de lavagem frio (Hepatocyte WashMédium, Gibco).

Seleção negativa

Os hepatócitos obtidos como descrito acima foraminicialmente plaqueados em meio Williams Médium E (Gibco) adicionalmentesuplementado com glutamina e com 5% de soro fetal de bezerro (FCS, Euroclone,Wetherby1 UK, http://www.euroclone.net). As células não anexadas foram vertidas de 2 a3 h mais tarde e então foi substituído por um meio hepatócito isento de soro(Hepatozyme-SFM, Gibco), um meio de Chees altamente modificado suplementado com1,25 μς/αη2 de colágeno para prover uma matriz sanduíche. As culturas foramrealímentadas com Hepatozyme SFM (sem colágeno) a 24 h e a cada 48 h depois disso.Os hepatócitos foram semeados numa densidade de 1,0 a 1,5 χ 105 células viáveis [80%de células viáveis determinado pelo azul Trypan (Gibco)] por cm2 sobre as placas decultura revestidas com colágeno em Hepatozyme-SFM mantido a 37°C, 5% de CO2 por 2semanas. Após cerca de 2 semanas em cultura, foi observada a extensiva morte doshepatócitos.

Expansão

O meio de cultura foi substituído por alfa-Meio EssencialMínimo/Meio Basal Endotelial-1 (aMEM/EBM) (3:1) (Gibco/Cambrex) suplementado comL-glutamina (5 mM), Hepes (12 mM, ph 7,4), penicilina (50 UI/mL), estreptomicina (50μg/mL) (todos de Sigma-AIdrich, St. Louis, MO; http://www.sigmaaldrich.com/), FCS(10%) e soro de cavalo (10%, HS1 Gibco). As células anexadas individuais foramidentificadas no disco de cultura após outras 3 semanas. Quando as colônias estavamevidentes, os anéis de clonagem foram postos em torno delas, e elas foram sub-cultivadas numa cavidade individual de uma placa de cultura de 24 cavidades. As célulasexpandidas foram transferidas para um frasco de 75 cm2 e analisadas quando seaproximaram da confluência.

Hepatócitos criopreservados

Hepatócitos humanos normais criopreservados foramcultivados sob as mesmas condições de cultura (seleção negativa e expansão) descritasacima, proporcionando resultados similares.

Imortalização condicional

As células cultivadas por cerca de 10 passagens foramdestacadas e submetidas a eletroporação a 180 V por 20 ms usando 5 μg de vetorpcDNA4/TO (Invitrogen) portando o antígeno grande T de SV40 subclonado. As célulasforam selecionadas com zeocina (5 μg/mL) por 3 semanas.

As células foram então submetidas a uma segundaeletroporação a 180 V por 20 ms com 5 μg de vetor pcDNA6/TR (Invitrogen) e escolhidaspor 3 semanas com blasticidina (5 μg/mL) na presença de desoxiciclina (1 μg/mL). Ascélulas foram alimentadas a cada 3 dias em meio DMEM (DMEM: MEM de Dulbecco)suplementado com 10% FCS na presença de desoxiciclina (1 μg/mL).

Seleção metabólica

As células imortalizadas obtidas como descrito acimainduzidas a crescer com desoxiciclina (1 μg/mL) foram cultivadas em meio RPMI isentode glicose compreendendo 1 μg/mL de galactose e 3% de FCS por 30 dias, a fim deescolher as células que são especificamente capazes de usar galactose em vez deglicose, que é uma característica típica de células hepáticas. As células foram testadas ecriopreservadas.

Diferenciação de HuHEP em hepatócitos e em células produtoras de insulina

A fim de verificar se as células HuHEP eram capazes de sediferenciar em hepatócitos maduros, foi avaliada a expressão de citocromo P450, i.e., aenzima de oxidação metabólica, sob diferentes condições de cultura. As células foramcultivadas por 15 dias nas seguintes condições de cultura:

As células HuHEP foram cultivadas num bioreator com meioMEM/EBM suplementado com 10% de FCS/HS + HGF/FGF-4. Após 15 dias de cultura,as células HuHEP foram avaliadas se positivas para citocromo P450. De 20 a 25% dapopulação total de HuHEP cultivada em MEM/EBM com 10% de FCS/HS + HGF/FGF-4eram positivas para citocromo P450. A concentração de uréia estava na faixa de 3 a 4mg/dL, a glicose estava na metade da glicose total inicialmente presente no meio fresco,e não havia modificação no total de proteína, indicando que os hepatócitos diferenciadosestavam metabolicamente ativos.

Além disso, as células HuHEP foram diferenciadas emcélulas produtoras de insulina com incubação em meio DMEM (DMEM: MEM deDulbecco) suplementado com 2% de FCS/HS e um alto teor de glicose (pelo menos 2 g/Lde glicose, preferencialmente 4,5 g/L de glicose) por 1 mês, e opcionalmente por de 5 a 7dias na presença de 10 mM de nicotinamida. As células começaram a formar pequenosaglomerados celulares esferóides no topo da monocamada celular confluente quemorfologicamente lembravam ilhotas pancreáticas. Estes aglomerados celularestridimensionais mancharam positivamente com o anticorpo policlonal contra insulinahumana e com o anticorpo monoclonal contra transportador de glicose humano do tipo 2(Glut2) que é um transportador de glicose (fig. 2). Além disso, os aglomerados celularestridimensionais mancharam com o Zn-ditizona, que é específico para grânulos contendoinsulina. Estes resultados são mostrados na fig. 2, que mostra a aparência morfológica deHuHEP não estimulada (painel A), HuHEP estimulada com o meio diferenciador queinduz a formação de estruturas similares às ilhotas pancreáticas (painel B). Fig. 2, painéisCeD: manchamento por imunofluorescência para insulina humana; painéis EeF:manchamento por imunofluorescência para Glut2 humano; painéis GeH: manchamentocom controles isotípicos negativos; painel I: manchamento com Zn-ditizona. (A, B, D, F, G,H, 1x250; Ce Ex 150).

Diferenciação osteogênica in vitro

Para induzir a diferenciação osteogênica, as células foramcultivadas em aMEM suplementado com 10% de FCS1 10% de HS1 100 UI/mL depenicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 12 mM de L-glutamina, 20 mM de fosfato de β-glicerol, 50 ng/mL de tiroxina, 1 nM de dexametasona e 0,5 μΜ de ascorbato 2-fosfato(todos de Sigma-AIdrich). O meio foi substituído com meio fresco duas vezes por semanapor 3 semanas. Para avaliar a diferenciação, as células foram fixadas com 4% deparaformaldeído por 20 minutos em temperatura ambiente e manchada com vermelho dealizarina, pH 4,1 (Sigma) por 20 minutos em temperatura ambiente.

As células cultivadas por 3 semanas em meio dediferenciação osteogênica exibiram depósitos de cálcio e expressão de osteocalcina eosteopontina, indicando diferenciação osteogênica. Além disso, as células se tornaramnegativas para albumina, AFP e CK18.

Após 6 semanas no mesmo meio mas sem fosfatoinorgânico, não foi detectada a acumulação de lipídeo.

Diferenciação endotelial in vitro

A diferenciação celular endotelial foi obtida cultivando ascélulas em meio EBM-2 (Cambrex) por 10 dias com fator de crescimento endotelialvascular (VEGF, 10 ng/mL, Sigma). Quando cultivadas em EBM suplementado comVEGF, as células expressaram os marcadores endoteliais CD31, CD34, KDR (VEGFR-2),CD114 (VE-caderina), e fator de von Willebrand que estavam negativos nas condiçõesnão diferenciadas, indicando uma diferenciação endotelial. Durante a diferenciaçãoendotelial, a albumina, AFP e CK18 foram perdidas.

Efeitos da injeção de HuHEP em dano ao fígado induzido por acetaminofeno em SCID

A hepatotoxicidade de acetaminofeno é um modelo bemreconhecido de necrose hepática. Os níveis aumentados de N-acetil-p-benzoquinona-imina (NAPQI), o metabólito tóxico de acetaminofeno, são responsáveis pela necrosehepática.

Modelo animal e transplante de HuHEP

Os camundongos SCID eram de Charles River (JacksonLaboratories, Bar Harbor, ME). Eles foram alojados num ambiente isento de patógenosespecíficos. Os camundongos SCID de 8 semanas de idade foram usados para osexperimentos. Os experimentos foram realizados de acordo com as orientações doNational Institute of Health. Após um período de 16 horas, os camundongos foraminjetados intraperitonealmente com 250 mg/kg de acetaminofeno (Sigma, St. Louis, MO)dissolvido em tampão salino esterilizado ou somente com tampão salino esterilizadocomo controle de veículo. Após a injeção com acetaminofeno, os camundongos foramalimentados ad Iibitum com ração.

O pico de dano ao fígado foi observado 1 dia após a injeçãode acetaminofeno. Após este tempo, as células HuHEP (passagem lll-IV) foram colhidasusando tripsina-EDTA, lavadas com PBS1 rotuladas com o kit Iigante de células vermelhofluorescente PKH26 (Sigma), contadas numa câmara microcitométrica e ressuspensasem PBS (1 χ 106 em 250 μL de PBS).

Medidas de aminotransferase no plasmaOs níveis de plasma ou soro de aspartato deaminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) foram medidos em 37°C comum kit disponível no mercado (Sigma Diagnostic).

Histologia

O tecido hepático foi fixado com formalina e embebido emparafina antes de seccionar. As seções do fígado foram manchadas com hemotoxilina-eosina.

Para preservação criostática, os tecidos hepáticos forammantidos em solução 4% de formaldeído de um dia para o outro. No dia seguinte, oformaldeído foi removido e substituído por 70% de EtOH. Então os tecidos foram fixadosem OCT.

A análise quantitativa da extensão da necrose do tecido foirealizada após a obtenção de imagens digitais de três campos de alta potência por slidede forma aleatória e cega. As áreas de necrose de tecido ou de necrose iminente foramidentificadas de acordo com a presença de eosinofilia diminuída, perda de arquiteturacelular, vacuolização, rompimento celular ou cariólise.

Imunofluorescência

As seções criostáticas de fígado foram incubadas comanticorpo monoclonal de camundongos anti HLA-A1B1C humano conjugado a FITC(BioLegend1 San Diego1 CA) (1:200), ou com o IgGi monoclonal de camundongos decontrole, por 1 hora à temperatura ambiente. Três seções não seqüenciais foramexaminadas para cada amostra.

Resultados para os experimentos in vivo

Dano necrótico extensivo do fígado induzido poracetaminofeno. A injeção das células HuHEP rotuladas 24 horas após a indução dedanos hepáticos resultou no recrutamento local de HuHEP no local do dano ao fígado. Ascélulas contribuíram para a regeneração do fígado uma vez que estavam detectáveis nofígado dos camundongos SCID após 15 dias do dano ao fígado.

Os resultados experimentais in vitro e in vivo acima indicamque as linhagens celulares progenitoras de fígado humano do presente invento sãoadequadas para uso para preparar um medicamento tendo atividade de diferenciaçãoosteogênica bem como um medicamento tendo atividade de regeneração de dano aofígado.

Claims

1. "Linhagem de células progenitoras pluripotentes não ovaisdo fígado humano", caracterizada pelo fato de expressar marcadores celulareshepáticos.

2. "Linhagem", de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de expressar os marcadores celulares hepáticos albumina e a-fetoproteína.

3. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 ou 2, caracterizada pelo fato de expressar o marcador celular hepático CK18.

4. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de expressar os marcadores de células-tronco CD44, CD29, CD73, CD146, CD105 e CD90.

5. "Linhagem", de acordo com qualquer uma das sreivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de não expressar marcadores celulareshemopoiéticos.

6. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de não expressar o marcador de célula-tronco hematopoiética CD133.

7. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de não expressar os marcadores decélula oval CD117 (C-kit), CK 19 e CD34.

8. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de não expressar o marcador de célulahepatócita madura citocromo P450 e não sintetizar uréia.

9. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de se diferenciar em células maduras dofígado e em células produtoras de insulina.

10. "Linhagem", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de ser imortalizada.

11. "Método para isolar uma linhagem celular progenitorapluripotente não-oval de fígado humano", a linhagem de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:(i) cultivar hepatócitos humanos maduros derivados do fígado adulto em um meio decultura celular até a morte dos hepatócitos maduros e seleção de uma população decélulas sobreviventes tendo morfologia epitelióide;(ii) expandir a população de células sobreviventes cultivando em um meio de culturacontendo soro, glicose, suplementado com hEGF (fator de crescimento epitelialhumano) e bFGF (fator de crescimento de fibroblasto básico) e compreendendo ossais inorgânicos usuais, aminoácidos e vitaminas necessários para o crescimento decélulas de mamíferos.

12. "Método", de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato que os hepatócitos maduros são congelados em um meio decultura contendo soro na presença de um agente crioprotetor e então degelados antes dacultura de acordo com a etapa (í).

13. "Método", de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato que o agente crioprotetor é dimetilsulfóxido.

14. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 11 a 13, caracterizado pelo fato que o meio de cultura celular da etapa(i) é um meio de cultura celular de hepatócitos.

15. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 11 a 14, caracterizado pelo fato que o meio de cultura contendo soroda etapa (ii) é uma mistura de aMEM-EBM (3:1 v/v) suplementado com soro fetal debezerro (FCS) ou soro humano (HS), antibióticos e glutamina.

16. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 11 a 15, caracterizado pelo fato que os hepatócitos maduros sãocultivados de acordo com a etapa (i) por pelo menos duas semanas.

17. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 11 a 16, caracterizado pelo fato que a linhagem celular progenitorapluripotente não-oval de fígado humano isolada é adicionalmente submetida aimortalização condicional.

18. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 11 a 17, caracterizado pelo fato que a linhagem celular progenitorapluripotente não-oval de fígado humano isolada é adicionalmente submetida a seleçãometabólica substituindo glicose por galactose no meio de cultura.

19. "Método de diferenciação de linhagem celularprogenitora pluripotente não-oval de fígado humano em células maduras de fígadocapazes de expressar o marcador celular de hepatócito humano citocromo P450 ecapazes de sintetizar uréia", a linhagem sendo de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de compreender cultivar dita linhagemcelular em um meio de cultura contendo soro suplementado com fator de crescimento dehepatócito (HGF) e fator de crescimento de fibroblasto 4 (FGF-4).

20. "Método", de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato que dito meio de cultura contendo soro é MEM-EBMsuplementado com 10% FCS ou HS, HGF e FGF-4.

21. "Método de diferenciação de linhagem celularprogenitora pluripotente não-oval de fígado humano em células produtoras de insulina", alinhagem sendo de acordo com as reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato decompreender cultivar dita linhagem celular em um meio de cultura contendo soro napresença de pelo menos 2 g/L de glicose.

22. "Método", de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato que o meio de cultura contendo soro adicionalmente compreendenicotinamida.

23. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 ou 22, caracterizado pelo fato que o meio contendo soro é DMEMsuplementado com 2% de FCS ou HS1 4,5 g/L de glicose e 10 mM de nicotinamida.

24. "Método de diferenciação de linhagem celularprogenitora pluripotente não-oval de fígado humano em células osteogênicas", alinhagem sendo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10,caracterizado pelo fato de compreender cultivar dita linhagem celular em um meio decultura contendo soro suplementado com ascorbato-2 - fosfato e dexametasona comfosfato inorgânico.

25. "Método", de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato que o meio de cultura contendo soro é aMEM suplementado com ^ 10% FCS, 10% HS, 1 nM de dexametasona e 0,5 μΜ de ascorbato 2 - fosfato.

26. "Método de diferenciação de linhagem celularprogenitora pluripotente não-oval de fígado humano em células endoteliais", a linhagemsendo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelofato de compreender cultivar dita linhagem celular em um meio de cultura basal celularendotelial suplementado com fator de crescimento endotelial vascular (VEGF).

27. "Método", de acordo com a reivindicação 26,caracterizado pelo fato que o meio basal celular endotelial é EBM-2 suplementado com 10 ng/mLde VEGF.

28. "Método", de acordo com qualquer uma dasreivindicações de 19 a 27, caracterizado pelo fato que dita linhagem celular progenitorapluripotente não-oval de fígado humano é cultivada em um bioreator.

29. "Uso de linhagem celular progenitora pluripotente não-oval de fígado humano", de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10,caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento tendo atividade dediferenciação osteogênica.

30. "Uso de linhagem celular progenitora pluripotente não-oval de fígado humano", de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10,caracterizado pelo fato de ser para preparar um medicamento tendo atividade deregeneração de dano hepático.