JP7174408B2 - 肝線維症のモデル系ならびにその作製および使用方法 - Google Patents
肝線維症のモデル系ならびにその作製および使用方法 Download PDFInfo
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この出願は、２０１６年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２９３，４６９号の利益を主張し、その仮出願の開示は、全体として参照により本明細書の一部をなすものとする。
この出願は、２０１６年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／２９３，４６９号の利益を主張し、その仮出願の開示は、全体として参照により本明細書の一部をなすものとする。
様々な原因による慢性肝傷害が肝線維症を引き起こし得、肝線維症は、肝星細胞（ＨＳＣ）の活性化、増殖、および肝臓における細胞外マトリックスの進行性蓄積によって特徴づけられる。肝臓の急性線維症は、典型的には、無症候性で可逆性であるが、慢性線維症は、肝臓に永久的損傷を引き起こし得、今日に至るまで唯一の効果的な処置は肝臓移植である。
肝線維症のための効果的な処置がまだ得られていないが、疾患および／または毒性に誘発される肝線維症の発生の根底にある機構の研究が進行中である。そのような研究のために細胞株または生存肝切片を用いる細胞培養モデルの使用が報告されている。しかしながら、これらの試験プラットフォームは、本物の肝組織への適切性の深刻な限界および／または生存能の欠如を有する。
したがって、肝線維症の向上したモデル系、特に、抗線維化剤のスクリーニングに有用なモデル系が必要とされている。
抗線維化活性のための作用物質のスクリーニングに有用であり、肝臓における線維症の機構の研究に有用であるなどの、肝線維症のモデル系が本明細書において提供される。
したがって、いくつかの実施形態によれば、肝臓細胞外マトリックス（例えば、脱細胞化肝臓ディスク（ｄｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｋ）などの脱細胞化肝組織）、および前記マトリックス上の哺乳動物肝細胞（例えば、初代肝細胞）の組合せを含む、肝線維症のためのモデル系が本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、肝細胞の組合せは、（ａ）肝臓前駆細胞、（ｂ）クッパー細胞、および（ｃ）肝星細胞を含む。いくつかの実施形態において、その組合せは、数で、７０パーセントから９０パーセントまでの肝臓前駆細胞、５パーセントから２０パーセントまでのクッパー細胞、および５パーセントから２０パーセントまでの肝星細胞を含む。
いくつかの実施形態において、肝星細胞は、活性化肝星細胞および／または筋線維芽細胞（例えば、ＥＺＨ２を発現する）である。
いくつかの実施形態において、系は、組織培養皿にて提供される。いくつかの実施形態において、系は、モジュラーおよび／またはマイクロ流体デバイスにて提供される。いくつかの実施形態において、系はインビボに埋め込み可能である。
肝線維症を調節することにおける関心対象の作用物質の活性をスクリーニングする方法もまた提供され、その方法は、（ａ）本明細書で教示されているようなモデル系を提供するステップ、（ｂ）前記関心対象の作用物質を前記モデル系に接触させるステップ、（ｃ）前記モデル系において線維症を測定するステップ、および（ｄ）肝線維症を調節することにおける関心対象の作用物質の活性をスクリーニングするために、線維症が前記接触に応答して増加するか、または減少するかを決定するステップとを含み得る。
いくつかの実施形態において、前記測定ステップは、モデル系においてＥＺＨ２の活性を測定するステップを含む。いくつかの実施形態において、前記測定ステップは、光学的透明化（例えば、ｉｎＣＩＴＥ光学的透明化）および分析を含む。
いくつかの実施形態において、関心対象の作用物資は、ＥＺＨ２阻害剤（例えば、ＧＳＫ－１２６）、アンジオテンシン１型（ＡＴ１）受容体遮断剤（例えば、ロスタチン）、ハロフジノン、リジルオキシダーゼもしくはｌｏｘ様酵素阻害剤、Ａ２Ｂアデノシン受容体アンタゴニスト、またはモノクローナル抗体（例えば、ＧＳ－６６２４（シムツズマブ））である。
本明細書で教示されているようなモデル系を作製する方法であって、（ａ）肝臓細胞外マトリックスを供給するステップ、（ｂ）前記肝臓前駆細胞、クッパー細胞、および肝星細胞を前記肝臓細胞外マトリックス上に播種するステップ、ならびに（ｃ）肝線維症のための前記モデル系を形成するために、インビトロで、前記マトリックス上で前記細胞を成長させるステップとを含み得る方法がさらに提供される。
いくつかの実施形態において、その方法はさらに、前記モデル系に線維形成促進性サイトカインまたは化学物質を投与することにより前記肝星細胞を活性化するステップを含む。
本発明は、本明細書における図面および下に示された明細書においてより詳細に説明されている。本明細書において引用された全ての米国特許参考文献の開示は、全体として本明細書の一部をなすものとする。
本発明は今、本発明の実施形態が示されている添付の図面を参照して、以下、より完全に記載される。しかしながら、この発明は、多くの異なる形で具体化され得、本明細書に示された実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、この開示が、徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。
本明細書に用いられる用語法は、特定の実施形態を記載することのみを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書に用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に指示しない限り、同様に複数形を含むものとする。この明細書に用いられる場合の用語「含む」または「含むこと」は、述べられた特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分、および／もしくは群、またはそれらの組合せの存在を特定するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、要素、成分、および／もしくは群、またはそれらの組合せの存在または追加を排除しない。
本明細書に用いられる場合、用語「および／または」は、関連する列挙された項目の、ありとあらゆる可能な組合せまたは１つもしくは複数、加えて、選択肢（「または」）に解釈される場合の組合せの欠如を含む。
他に規定がない限り、本明細書に用いられる全ての用語（技術的および科学的用語を含む）は、当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。一般的に用いられる辞書に定義されているものなどの用語は、本明細書および特許請求の範囲の関連におけるそれらの意味と一致する意味をもつと解釈されるべきであり、本明細書において明確にそのように定義されていることがない限り、理想的な、または過度に形式的な感覚で解釈されるべきではない。よく知られた機能または構築物は、簡潔さおよび／または明快さのために詳細には記載されない場合がある。
本明細書に用いられる場合、「細胞」は、一般的に、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、マウス、ウサギ、ラット、フェレットの細胞などの哺乳動物細胞である。いくつかの好ましい実施形態において、細胞はヒト細胞である。適切な細胞は公知で、市販されており、および／または公知の技術に従って産生され得る。例えば、米国特許第６，７３７，２７０号参照。いくつかの実施形態において、本発明に従って用いられる細胞は、細胞株のもの（例えば、腫瘍細胞、または人工的に不死化され、連続的に成長する細胞集団）とは対照的に、組織から採取され、かつ全く集団倍加されずに、またはごく少数回（例えば、１～３回）、集団倍加して用いられる初代細胞である。
「肝臓前駆細胞」は知られており、例えば、米国特許第８，７０９，８００号、第８，２７８，１０５号、第９，１０７，９１０号、Ｕ．Ｓ．２０１０／０００３７５２、Ｕ．Ｓ．２０１１／０１２９４３９に記載されている。
当技術分野において知られているような「クッパー細胞」は、類洞の壁を裏打ちする、肝臓の特殊化したマクロファージである。
「肝星細胞」または「ＨＳＣ」は、肝臓の類洞周囲の空間に見出される細胞である。本明細書に用いられる場合、「活性化」肝星細胞は、ＥＺＨ２の発現のレベルが増加しており、および／または筋線維芽細胞表現型を示すＨＳＣである。線維性肝臓における活性化ＨＳＣ／筋線維芽細胞の他のマーカーには、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、線維芽細胞特異的タンパク質（ＦＳＰ）、α－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）、ＩＬ－６、ＴＧＦ－β、コラーゲンＩ、およびビメンチンが挙げられるが、それらに限定されない。
インビボで肝線維症を誘発する方法は知られており、それには、肝実質細胞へ化学的損傷を誘発する四塩化炭素（ＣＣｌ４）の投与、および肝臓内の胆管の閉塞を含む胆管結紮が挙げられるが、それらに限定されない。インビトロで線維症を誘発する方法には、ＣＣｌ４、メトトレキサート、アリルアルコール、アセトアミノフェン、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）、ジメチルニトロサミンなどの線維形成促進性サイトカインまたは化学物質の投与が挙げられ得るが、それらに限定されない。
がんの処置における化学療法および放射線治療は、肝毒性処置の最も一般的な型のうちの２つである。がんを処置するために用いられる肝毒性薬物には、アドリアマイシン、メトトレキサート、６メルカプトプリン、カルボプラチン、ＤＴＩＣ（ダカルバジン）、ＢｉＣＮＵ、Ｌ－アスパラギナーゼ、およびペントスタチンが挙げられるが、それらに限定されない。
本明細書で教示されているようなモデル系において肝線維症を誘発するために用いられ得る他の作用物質または薬物には、アセブトロール、アセトアミノフェン、アクチノマイシンｄ、副腎皮質ステロイド、アドリアマイシン、アロプリノール、アモキシシリン／クラブラン酸、タンパク質同化ステロイド、抗炎症薬、抗甲状腺薬、アスピリン、アテノロール、アザチオプリン、カプトプリル、カルバマゼピン、カルビマゾール、カルムスチン、セファロスポリン類、クロルジアゼポキシド、クロルプロマジン、クロルプロマジン／バルプロ酸、クロルプロパミド、クロルプロパミド／エリスロマイシン（併用）、シメチジン、クロキサシリン フレカイニド、シクロホスファミド、シクロホスファミド／シクロスポリン、シクロスポリン、ダカルバジン、ダナゾール、ダントロレン、ジアゼパム、ジクロフェナク、ジルチアゼム、ジソピラミド、エナラプリル、エンフルラン、エリスロマイシン、エタンブトール、エチオナミド、フルラゼパム、フルタミド、グリブリド、金、グリセオフルビン、ハロペリドール、ハロタン、ヒドララジン、イブプロフェン、イミプラミン、インドメタシン、イソニアジド、ケトコナゾール、ラベタロール、マプロチリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メチルドパ、メチルテストステロン、メトプロロール、ミアンセリン、マイトマイシン、ナプロキセン、ニコチン酸、ニフェジピン、ニトロフラントイン、非ステロイド系、ノルエタンドロロン、経口避妊薬、オキサシリン、パラアミノサリチル酸、ペニシラミン、ペニシリン、ペニシリン類、フェネルジン、フェニンジオン、フェノバルビタール、フェノチアジン、フェニルブタゾン、フェニロイン（ｐｈｅｎｙｌｏｉｎ）、フェニロイン トロレアンドマイシン、ピロキシカム、プロベネシド、プロカインアミド、プロポキシフェン、ピラジンアミド、キニジン、キニーネ、ラニチジン、サリシラート類、スルホンアミド類、スリンダク、タモキシフェン、テルビナフィンＨＣｌ（Ｌａｍｉｓｉｌ、Ｓｐｏｒａｎｏｘ）、テストステロン、テトラサイクリン類、チアベンダゾール、チオクアニン（ｔｈｉｏｑｕａｎｉｎｅ）、トロトラスト、トルブタミド、三環系抗うつ薬、バルプロ酸、ベラパミル、ビンクリスチン、およびビタミンＡが挙げられ得るが、それらに限定されない。Ｂｅｌａｒｄｉｎｅｌｌｉらの米国特許第８，６０９，６７１号参照。
肝線維症をモニターし、または検出するための方法には、組織学的検査および／またはＥＺＨ２などのある特定のマーカーの発現を測定することが挙げられ得るが、それらに限定されない。測定され得る肝線維症に関する他のマーカーは、Ｈｓｉｅｈらの米国特許第７，９７２，７８５号に提供されている。
「ＥＺＨ２」または「ｚｅｓｔｅホモログ２のエンハンサー」は、メチルトランスフェラーゼであり、活性化ＨＳＣにおけるポリコーム抑制複合体（ＰＲＣ）の構成要素である。ＥＺＨ２は、いくつかのがんの増殖に関与し、したがって、ＥＺＨ２阻害剤は、がん治療用として研究中である。
肝線維症を調節することにおける関心対象の作用物質には、ＥＺＨ２阻害剤、およびクロマチン修飾酵素の他の阻害剤（例えば、ＧＳＫ－１２６、３－デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、ＭＣ１９４８、ＭＣ１９４５など）が挙げられ得るが、それらに限定されない。ＥＺＨ２の阻害剤は知られており、多くは、そのタンパク質のＳＥＴドメイン活性部位を標的にする。例えば、本明細書に参照により組み入れられている、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３５３３６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３５３４０、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３５３４４を参照されたい。
関心対象の他の作用物質には、アンジオテンシン１型（ＡＴ１）受容体遮断薬（例えば、ロスタチン）；ハロフジノンなどのコラーゲン阻害剤（米国特許第８，６６８，７０３号参照）；リジルオキシダーゼまたはｌｏｘ様酵素阻害剤；モノクローナル抗体（例えば、ＧＳ－６６２４）；Ｌｅｉらの米国特許第８，９５７，０１９号に見出されるものなどのオリゴペプチド；ＹａｎｇのＵＳ２０１０／０１１３５９６に見出されるものなどのレチノイン酸誘導体；３－ｎ－プロピルキサンチン（エンプロフィリン）、１，３－ジプロピル－８－（ｐ－アクリリック）フェニルキサンチン、またはＫａｌｌａらの米国特許第６，８２５，３４９号、Ｂｅｌａｒｄｉｎｅｌｌｉらの第８，６０９，６７１号に見出されるものなどのＡ２Ｂアデノシン受容体アンタゴニスト；Ｉｓｈｉｋａｗａらの米国特許第７，８４７，１３２号に見出されるものなどの化合物などが挙げられ得るが、それらに限定されない。
本明細書に用いられる場合、「肝臓細胞外マトリックス」は、Ｙ．Ｚｈａｎｇら、米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０２８８３７５号（その開示は参照により全体として本明細書の一部をなす）に記載されたものなどの、通常肝臓において見出される細胞外マトリックスタンパク質を含有するスキャフォールドを意味する。例えば、肝臓に通常見出される細胞外マトリックスタンパク質を提供するために、脱細胞化肝組織は凍結乾燥され粉末にされて、それはその後、バイオポリマー（例えば、コラーゲン、キトサン、ヒアルロン酸など）と組み合わされてハイドロゲルを形成し得る。肝臓細胞外マトリックスはまた、脱細胞化肝臓器官またはその部分（例えば、個々の肝葉、またはそれから生じた組織ディスク）の使用により提供され得る。肝組織の脱細胞のための方法は、知られており、参照により全体として本明細書の一部をなすＵＳ２０１３０２８８３７５に記載されている。Ｂａｐｔｉｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０１１， ５３（２）： ６０４－６１７も参照。肝臓細胞外マトリックスは、任意の適切なヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、マウス、ウサギ、ラットなどの由来であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、肝臓細胞外マトリックスはフェレット由来である。
いくつかの実施形態において、肝臓細胞外マトリックスは、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、ラミニン、およびフィブロネクチンから選択される１つまたは複数のタンパク質を含む。
本明細書に教示されているような肝線維症のためのモデル系として有用な肝臓構築物（またはオルガノイド）は、（ａ）肝臓前駆細胞、（ｂ）クッパー細胞、および／または（ｃ）肝星細胞を組み合わせて含み得る。一般的に、細胞は、組織培養皿（例えば、４８ウェルの皿中の肝臓ＥＣＭディスク）においてなどインビトロで供給された肝臓細胞外マトリックス（例えば、脱細胞化肝臓またはその部分）上に播種され得る。いくつかの実施形態において、肝臓前駆細胞は、数で７０パーセントから９０パーセントまで（最も好ましくは約８０パーセント、例えば、３×１０５個）の量で播種され得、クッパー細胞は、数で５パーセントから２０パーセントまで（最も好ましくは約１０パーセント、例えば、４×１０４個）の量で含まれ得、および／または肝星細胞は数で５パーセントから２０パーセントまで（最も好ましくは１０パーセント、例えば、４×１０４個）の量で含まれ得る。
いくつかの実施形態において、（例えば、スフェロイドの形をとる）播種された構築物は、成熟肝臓構造を形成するために、例えば、１週間から４週間まで、または１週間から３週間まで、または２週間から３週間まで、インビトロで成長させる。そのような成熟肝臓構造は、例えば、胆管構造、クラスター化した肝実質細胞などを含み得る。
装置。本発明のモデル系でのインビトロ化合物スクリーニングに有用な装置は、（ａ）少なくとも１つのチャンバー（そのチャンバーは好ましくは、入口および出口の開口部が形成されている）が形成されている支持体または装置本体（例えば、組織培養皿、マイクロ流体デバイスなど）を供給するステップ、および（ｂ）上記のような少なくとも１つの構築物（それ自体、またはハイドロゲルと組み合わせたその組成物としての）を前記チャンバー内に置くステップにより提供され得る。装置は、ポンプ、培地リザーバ、検出器などを含むより大きい装置への「プラグイン」または挿入のためのカートリッジの形で提供され得る。
装置本体は、それ自体、任意の適切な材料または材料の組合せで形成され得る。例として、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリアクリルアミド、官能化ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧジアクリレート、ＰＥＧジアクリルアミド、ＰＥＧジメタクリレートなど、またはマルチアームの形をとる前述のＰＥＧのいずれかなど）を含むポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、架橋または硬化することができる天然ポリマーまたはタンパク質（例えば、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、アルギン酸塩など（架橋を支援するために化学基で官能化されているそれらの誘導体を含む））、およびそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。装置本体は、任意の適切な過程、例えば、成形、鋳造、積層造形（３ｄ印刷）、リトグラフなど（それらの組合せを含む）により形成され得る。
装置の保管および運送。いったん製造されたならば、カートリッジの形での上記のような装置は、すぐに用いられ得、または保管および／もしくは輸送のために調製され得る。
その製造物を保管し、および輸送するために、水と混合されたゼラチンなどの、室温（例えば、２５℃）で流動性液体であるが、冷蔵温度（例えば、４℃）でゲルまたは凝固体である、一時的保護支持媒体が、チャンバー、および好ましくは、任意の付随した導管も、実質的にまたは完全に満たすように装置へ加えられ得る。任意の入口および出口は、適切なキャッピング要素（例えば、プラグ）またはキャッピング材料（例えば、ワックス）でキャッピングされる。その後、装置は、冷却要素（例えば、氷、ドライアイス、熱電冷却機）と共に包装され、全て、（好ましくは、絶縁された）梱包材中に置かれる。
あるいは、その製造物を保管し、および輸送するために、冷却温度（例えば、４℃）で流動性液体であるが、室温（例えば、２０℃）または体温（例えば、３７℃）などの温められた温度でゲルまたは凝固体である、一時的保護支持媒体、例えば、ポリ（Ｎ－イソプロピルアクリルアミド）とポリ（エチレングリコール）のブロックコポリマーが供給され得る。
受け取ると、エンドユーザーは、付随した梱包材および冷却要素から装置を簡単に取り出し、（一過性保護支持媒体の選択に応じて）温度を上昇または下降させ、いかなるポートもキャップを取り除き、一過性保護支持媒体をシリンジで（例えば、成長培地で洗い流すことにより）除去し得る。
装置の使用方法。上記の装置は、薬理学的および／または毒物学的活性について関心対象の作用物質（または関心対象の複数の作用物質）のインビトロスクリーニング（ハイスループットスクリーニングを含む）に用いることができる。そのようなスクリーニングは、（ａ）上記のような装置を供給するステップ、（ｂ）構築物に化合物を（例えば、構築物を含有するチャンバーを通して流入されることになっている成長培地に加えることにより）投与するステップ、ならびにその後、（ｃ）構築物の少なくとも１個の細胞からの化合物に対する薬理学的および／または毒物学的応答を検出するステップにより実行することができる。応答の検出ステップは、任意の適切な技術により実行され得、その技術には、検出されることになっている特定の応答または一連の応答に依存して、顕微鏡法、組織診断、イムノアッセイなど、およびそれらの組合せが挙げられる。そのような応答は、細胞死（老化およびアポトーシスを含む）、細胞成長（例えば、良性および転移性細胞成長）、化合物の吸収、分布、代謝、もしくは排泄（ＡＤＭＥ）、または生理学的応答（例えば、少なくとも１個の細胞による化合物の産生の上方制御または下方制御）、または肝線維症に関する薬理学的および／もしくは毒物学的活性に関連した任意の他の生物学的応答であり得る。
いくつかの実施形態において、肝臓モデルは、光学的透明度のために処理される。いくつかの実施形態において、肝臓モデルは、固定され、組織評価のための屈折率整合した透明画像化によりそれから脂質を除去することにより処理される（「組織をガラスへ変える」）。器官（またはオルガノイド）全体が完全な細胞レベル分解能として１μＭスケールで可視化することができる、ｉｎＣＩＴＥ光学的透明化および分析技術は、２０１５年８月７日に出願され、２０１６年２月１１日にＷＯ２０１６０２３００９として公開された、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０４４３７６に記載されている（その出願は、参照により全体として本明細書の一部をなす）。その方法は、例えば、固定化組織を、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルミリスチルアンモニオ）プロパンスルホナート（ＳＢ３－１４）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ－１００などの非イオン性界面活性剤、デオキシコール酸ナトリウム、および塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、および／またはメタホウ酸ナトリウム）を含む組成物と接触させることにより、実施され得る。いくつかの実施形態において、その組成物は、ホスホリパーゼＡ２を含み得る。その後、組織を、画像化のために調製するために、２’２’－チオジエタノールと接触させ得る。「シースルー」またはガラス様「ゼリービーン」のように見える透明化組織を、その後、顕微鏡対物レンズに対して屈折率整合させ、画像化することができる。各マウント組織全体は、透明化のために最長１０日間、必要とし得る。この画像化技術からのデータは、完全に定量化することができ、線維症に関する硬さの測定基準（線維長さ、幅、配向、線維症の量、異方性など）を評価し、現在の標準Ｍｅｔｖｉｒ病理学的スコアリングと比較することができる。
組織は、例えば、アクリルアミド、およびパラホルムアルデヒド、ホルマリン、Ｚｅｎｋｅｒ固定液、Ｈｅｌｌｙ固定液、Ｂ－５固定液、Ｂｏｕｉｎ溶液、Ｈｏｌｌａｎｄｅ液、Ｇｅｎｄｒｅ溶液、Ｃｌａｒｋｅ溶液、Ｃｒｏｎｏｙ溶液、Ｍｅｔｈａｃａｒｎ、ホルマリン－酢酸－アルコールなどの固定液を含む溶液と組織を接触させ、またはその溶液を組織に注入することにより、固定され得る。その溶液はまた、サポニンを含み得る。その後、組織は、固定されるのに十分な時間（例えば、２日間、３日間、４日間、または５日間、）、溶液と接触させたまま（例えば、穏やかに撹拌させながら４℃で）にされ得る。
本発明は、以下の非限定的実施例においてより詳細に説明される。
［実施例１］
初代肝細胞を含有する生物工学的肝臓モデルを、肝臓細胞外マトリックス（脱細胞化肝臓ディスク）上に作製した。３週間にわたるインビトロでの成熟により、生物工学的肝臓は、天然の肝臓解剖学的形態および肝臓関連機能を有する、小さいオルガノイドを形成した。
初代肝細胞を含有する生物工学的肝臓モデルを、肝臓細胞外マトリックス（脱細胞化肝臓ディスク）上に作製した。３週間にわたるインビトロでの成熟により、生物工学的肝臓は、天然の肝臓解剖学的形態および肝臓関連機能を有する、小さいオルガノイドを形成した。
インサイチュのオルガノイドモデル：肝臓の生物工学的作製について、肝臓の循環を通しての界面活性剤の灌流は、天然肝臓ＥＣＭで構成され、かつ特徴的な３Ｄ構造および形状を保持する、無細胞肝臓スキャフォールドを生じた（図１Ａ）。顕著なことには、血管網のチャネルが開いているように見える。非ヒト肝臓スキャフォールド上へ初代ヒト細胞を、血管チャネルを覆うために血管内皮細胞（ＥＣ）を、および実質組織を再構成するためにヒト胎児肝臓前駆細胞（ＬＰＣ）を播種した（図１Ｂ）。そのような細胞播種された構築物は、３週間以上の期間、灌流バイオリアクターにおいて保持され得、その間、その細胞は、アルブミン発現性肝実質細胞クラスターおよびＣＫ１９陽性胆管構造を含む、正常肝臓のもののような組織構造へ組織化する（図１Ｃ）。さらに、これらのオルガノイドは、アルブミンの合成、尿素の分泌、および肝臓オルガノイドのＣＹＰ３Ａ染色を確認する、ジアゼパムの相Ｉ代謝産物；テマゼパムおよびノルダゼパム（それぞれ、ＣＹＰ２ＣおよびＣＹＰ３Ａにより生成される）への代謝を含む一般的な肝機能を実施した（図１Ｂ）。
単純化し、より高いハイスループット用途に適応させるために、小さい（直径８ｍｍ、厚さ３００μｍ）脱細胞化肝臓ＥＣＭディスクを、ＬＰＣを播種するために調製した（図１Ｃ）。ＬＰＣは肝臓ＥＣＭを再配置させ、天然肝臓のものと類似した肝実質細胞および小管構造を含有する３Ｄスフェロイド構造（オルガノイド）へ自己組織化した（図１Ｃ）。さらに、進行性細胞組織化および分化が観察された。肝芽細胞マーカー（ＡＬＢ＋／ＣＫ１９＋／ＥｐＣＡＭ＋）、およびα－フェトプロテイン（ＡＦＰ）とアルブミンの両方を発現する細胞の大きなクラスターが、１週間の培養後、観察され、肝芽細胞への系統限定を示唆した（図２Ａ、上部）。３週間後、ＡＬＢ－／ＣＫ１９＋／ＥｐＣＡＭ＋小管構造およびＡＬＢ＋／ＣＫ１９－／ＥｐＣＡＭ－クラスター、ならびにＡＦＰ発現の完全な喪失を含む細胞表現型における明らかな変化があり、分極胆管細胞および肝実質細胞、それぞれへの並行的系統特定を示唆した（図２Ａ、下部）。遺伝子発現分析により、ＦＬＰＣと比較して、オルガノイドにおいて徐々に増加した、ＨＮＦ４α、肝実質細胞分化制御因子、およびＨＮＦ６、胆管細胞分化主要制御因子の発現が示された（図２Ｂ）。肝臓オルガノイドは、培養プレートにおいて分化したＬＰＣと比較して、有意により高いアルブミンおよび尿素分泌を示し（図２Ｃ）、胆管構造は、一次繊毛（α－アセチル化チューブリンについて染色された）、および頂端膜における胆汁酸塩輸送体（ＡＳＢＴ）の存在により示される、典型的な頂端－基底の極性を示した（図２Ｄ）。
結局、これらの結果は、無細胞肝臓ディスクが、ＬＰＣが組織化し、成熟し、天然肝臓組織と類似した解剖学的形態を有する機能的肝臓オルガノイドを形成するための適切な条件を提供することを示している。
埋め込まれた肝臓オルガノイドへのＣＣｌ４処理の効果：肝臓オルガノイドはインビトロで発生し、機能性と肝組織解剖学的形態の両方を示した。しかし、インビトロ培養条件は、インビボで存在する複数の因子を欠き、その因子には、例を挙げれば、血液および免疫細胞の成分がある。したがって、本発明者らは、ヌードマウスの肝臓の上部にオルガノイドを、生検パンチで小さな穴を作り、それらをフィブリン接着剤で固定化することにより埋め込んだ。１週間後に採取されたオルガノイドは、多くの生存ヒト肝実質細胞、および多数の複数の増殖性間質（星状）および内皮細胞を示した（図３、上部パネル）。並行して、本発明者らは、埋め込みがなされたマウスの一部をオリーブ油中４ｍｌ／ｇのＣＣｌ４（１：１）で、隔週の皮下注射により処理した。肉眼で見て、１週間のＣＣｌ４処理後に採取されたオルガノイドは、対照マウスと著しい違いを示さなかった。しかしながら、綿密な検査により、オルガノイド内の有核ヒト肝実質細胞の欠損および線維症の初期徴候が示された。３週間のＣＣｌ４処理後に採取されたオルガノイドは、より多数の増殖性間質および内皮細胞を示した。これらの結果は、肝臓オルガノイドが埋め込みにより生存し、ＣＣｌ４での処理で線維症の徴候を示したことを示す。血管新生もまた、おそらく宿主肝臓のＣＣｌ４誘発性傷害により、オルガノイド内に観察された。
線維性肝組織において、筋線維芽細胞の約９０％がＨＳＣ由来であり（Ｌｉｅｄｔｋｅ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ： ｕｐｄａｔｅ ｏｎ ａｎｉｍａｌ ｍｏｄｅｌｓ， ｌｅｇａｌ ｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｓｐｅｃｔｓ． Ｆｉｂｒｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｐａｉｒ， ２０１３． ６（１）： ｐ． １９）、ＥＺＨ２は、ＨＳＣの活性化および筋線維芽細胞への移行のエピジェネティック制御因子であり得る。筋線維芽細胞（ＭＦ－１０）のように、ＨＳＣ細胞株（ＬＸ－２）はＥＺＨ２およびＰＲＣ構成要素をインビトロで発現することが示された（図４Ａ、図４Ｂ）。ＬＸ－２のＴＧＦβとのインキュベーションは、ＥＺＨ２活性、およびＳｕｚ１２を含むＰＲＣ機構、および活性マーカーＨ３Ｋ２７ｍｅ３を誘導することが次に実証された（図４Ｃ、図４Ｄ）。
ＥＺＨ２特異的小分子阻害剤ＧＳＫ－１２６は、インビトロで、リンパ腫および小細胞肺がん細胞株においてＨ３Ｋ２７ｍｅ３を阻止するのに効果的である。事実、ＥＺＨ２活性化変異を有するがん細胞株においてＥＺＨ２を阻害するためにＧＳＫ－１２６を用いることは、これらのそれぞれの細胞株においてＥＺＨ２への依存性による細胞死を生じ、一方、細胞が活性化ＥＺＨ２変異を有しない場合、高用量でさえもそれは非致死性である。
腫瘍関連線維芽細胞（ＴＡＦ）のＧＳＫ－１２６とのインキュベーションは、Ｈ２Ｋ２７ｍｅ３の完全な喪失を生じた（図４Ｅ、図４Ｆ）。
［実施例２］
肝臓オルガノイドは、肝臓前駆細胞（ＬＰＣ）、肝星細胞（ＨＳＣ）、およびクッパー細胞（ＫＣ）を同時播種することにより形成される。線維化誘発条件に応答して、ＨＳＣは、オルガノイドにおいて活性化状態になり、増殖し、線維化過程を惹起する。線維性肝臓オルガノイドは、範囲定量的測定により厳密に検査される。インビトロおよびインビボにおける実験は、ＨＳＣの筋線維芽細胞への移行／活性化におけるＥＺＨ２の役割を決定するために、ＨＳＣにおけるＥＺＨ２発現の評価により（相関的測定）、および特異的ＥＺＨ２阻害を用いることにより（直接的測定）、実施され得る。
肝臓オルガノイドは、肝臓前駆細胞（ＬＰＣ）、肝星細胞（ＨＳＣ）、およびクッパー細胞（ＫＣ）を同時播種することにより形成される。線維化誘発条件に応答して、ＨＳＣは、オルガノイドにおいて活性化状態になり、増殖し、線維化過程を惹起する。線維性肝臓オルガノイドは、範囲定量的測定により厳密に検査される。インビトロおよびインビボにおける実験は、ＨＳＣの筋線維芽細胞への移行／活性化におけるＥＺＨ２の役割を決定するために、ＨＳＣにおけるＥＺＨ２発現の評価により（相関的測定）、および特異的ＥＺＨ２阻害を用いることにより（直接的測定）、実施され得る。
肝星細胞（ＨＳＣ）は、肝線維症の主要な駆動要素である。今まで、インビトロでＨＳＣを研究するためのたいていの実験モデルは、単純なＨＳＣのみの２Ｄ培養系を用い、その系は、インビボでの肝線維症におけるそれらの役割を十分に表していない。本明細書に教示される生物工学的肝臓オルガノイドは、より良いモデルであり、ＨＳＣおよび肝線維症に影響する因子を解明する。
胎児肝組織（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を消化し、低速度で遠心し、赤血球を除去し、コラーゲン４およびラミニンでコーティング化された皿上へ蒔く。約１０日後に出現したＬＰＣコロニーを消化し、密度勾配遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を用いて、実質細胞（ＬＰＣ）を非実質（星）細胞から分離する。ヒトクッパー細胞（ＫＣ）は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から購入することができる。異なる肝細胞型の天然の割合を反復するために、４８ウェルの皿の内側に置かれたＥＣＭディスクに、約８０％ＬＰＣ（３×１０５個）、約１０％ＨＳＣ（４×１０４個）、および約１０％ＫＣ（４×１０４個）を播種する。これらの数は、成熟オルガノイドの組織学的結果に基づいて最適化され得る。１％ウシ胎仔血清に加えて既知組成の補給剤（デキサメタゾン、ｃＡＭＰ、プロラクチン、グルカゴン、ナイアシンアミド、α－リポ酸、トリヨードチロニン、ＥＧＦ、ＨＤＬ、ＨＧＦ、ＧＨ）を含むＲＰＭＩ培地が、３Ｄ肝臓ＥＣＭスキャフォールド上でのＬＳＣ成長および分化を援助する。
オルガノイドを２週間成熟させ、これは、典型的には、この時点までには小管構造および肝実質細胞病巣が明瞭に目に見えるからである。線維症は、１）３つの既知の線維症誘発性成長因子である、ＴＧＦｂ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、およびＴＮＦαでのＨＳＣの活性化により直接的に、２）オルガノイドをＬＰＳおよびＩＬ２に曝し、それにより、ＫＣを刺激して、線維症誘発因子を分泌させることにより間接的に、および、３）肝実質細胞を損傷するＣＣｌ４を用いて肝臓に「傷害」を誘発し、それにより線維症誘発性毒物の放出を引き起こす、という３つの異なる様式を用いて誘発される。有意な細胞死なしに線維症を誘発するだろう濃度を決定するために、用量漸増実験が実施され得る。
これらのオルガノイドは、ハイスループット試験のために大量生産することができ、オルガノイドの各成分は操作され、肝線維症へのそれの影響について評価することができる。オルガノイドは、活性化ＨＳＣにおいてＥＺＨ２（メチルトランスフェラーゼであり、かつポリコーム抑制複合体（ＰＲＣ）の構成要素）の高レベルの発現を示し、ＨＳＣの筋線維芽細胞表現型への活性化を実証している。
免疫蛍光組織化学：線維性肝臓またはオルガノイド切片を、ｉｎＦｏｒｍソフトウェアパッケージを用いて調べる。切片を、Ｈ＆Ｅにより染色して、線維症を実証する。線維性肝臓またはオルガノイドをまた、筋線維芽細胞マーカー、例えば、コラーゲンＩ、デスミン、およびαＳＭＡについて染色する。ｃｅｌｌＳｅｎｓ画像化ソフトウェアを用いて、全ての３つのマーカーを、マルチスペクトル的に画像化して、線維性肝臓内の筋線維芽細胞マーカー発現の共局在を決定する。画像化後、ｉｎＦｏｒｍを利用して、（コラーゲンＩ、デスミン、および／またはαＳＭＡ陽性染色により示されるような）筋線維芽細胞のパーセンテージを決定する。肝臓切片をまた、ＥＺＨ２と筋線維芽細胞存在との間の相関について、ＥＺＨ２／Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３の筋線維芽細胞マーカーとの共局在により分析する。
［実施例３］
インビトロおよびインビボで、オルガノイドにおいて肝線維症を調節するためにＨＳＣを操作する。例えば、線維症が誘発され、ＥＺＨ２活性は、そのような活性について知られた作用物質（例えば、ＧＳＫ１２６）で阻害され得る。オルガノイドにおいてＨＳＣの大部分があるが、それらは標準肝臓分化／維持培地下で線維性表現型を誘発しないことが見出された。これは、これらが初代／静止ＨＳＣであるという事実による可能性がある。
インビトロおよびインビボで、オルガノイドにおいて肝線維症を調節するためにＨＳＣを操作する。例えば、線維症が誘発され、ＥＺＨ２活性は、そのような活性について知られた作用物質（例えば、ＧＳＫ１２６）で阻害され得る。オルガノイドにおいてＨＳＣの大部分があるが、それらは標準肝臓分化／維持培地下で線維性表現型を誘発しないことが見出された。これは、これらが初代／静止ＨＳＣであるという事実による可能性がある。
インビトロで、および前臨床モデル（例えば、マウス肝臓）における埋め込みの際、オルガノイドにおける線維症を測定するための測定法を割り当てるために、一式の定量画像化方法論を用いることができる。線維性表現型の複数の側面は、ＨＳＣおよびＫＣ活性化、肝組織の解剖学的形態、機能、および損傷、ならびにＥＣＭ性質のカテゴリーのそれぞれについての主要な測定法で測定され得る。
肝臓オルガノイドモデルは、現在ヒト患者において試験されることになっているクロマチン修飾酵素の阻害剤などの、抗線維化治療剤の迅速なスクリーニングを可能にし、その治療剤を臨床試験へ迅速に移行させることができる。
参考文献
前述は、本発明を例証するものであり、それを限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲により定義され、その特許請求の範囲の等価物はそれに含まれ得る。
Claims (19)
- 肝線維症のためのモデル系であって、前記系が、肝臓細胞外マトリックスと、前記マトリックス上における哺乳動物肝細胞の組合せとを含み、前記組合せが、
（ａ）肝臓前駆細胞、
（ｂ）クッパー細胞、および
（ｃ）肝星細胞
を含み、前記肝星細胞が、ＥＺＨ２を発現する活性化肝星細胞および／または筋線維芽細胞を含み、前記マトリックス上における前記哺乳動物肝細胞の組合せが１～４週間インビトロで培養されている、モデル系。 - 前記肝臓細胞外マトリックスおよび前記マトリックス上における前記哺乳動物肝細胞の組合せが、スフェロイドの形で提供される、請求項１に記載のモデル系。
- 前記組合せが、数で、７０パーセントから９０パーセントまでの肝臓前駆細胞、５パーセントから２０パーセントまでのクッパー細胞、および５パーセントから２０パーセントまでの肝星細胞を含む、請求項１または請求項２に記載のモデル系。
- 前記肝臓細胞外マトリックスが、脱細胞化肝組織（例えば、脱細胞化肝臓ディスク）を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載のモデル系。
- 前記系が組織培養皿にて提供される、請求項１～４のいずれか１項に記載のモデル系。
- 前記系が、モジュラーおよび／またはマイクロ流体デバイスにて提供される、請求項１～５のいずれか１項に記載のモデル系。
- 前記系がインビボに埋め込み可能である、請求項１～６のいずれか１項に記載のモデル系。
- 前記肝臓前駆細胞、クッパー細胞、および／または肝星細胞がヒト細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載のモデル系。
- 前記肝臓細胞外マトリックスが非ヒト哺乳動物の肝臓細胞外マトリックスである、請求項１～８のいずれか１項に記載のモデル系。
- 胆管構造および／またはクラスター化した肝実質細胞のような肝臓構造を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載のモデル系。
- 肝線維症を調節することにおける関心対象の作用物質の活性をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１～１０のいずれか１項に記載のモデル系を提供するステップ、
（ｂ）前記関心対象の作用物質を前記モデル系に接触させるステップ、
（ｃ）前記モデル系において線維症を測定するステップ、および
（ｄ）線維症が前記接触に応答して増加するか、または減少するかを決定するステップ
を含み、それにより肝線維症を調節することにおける関心対象の作用物質の活性をスクリーニングする、方法。 - 前記モデル系が組織培養皿にて提供される、請求項１１に記載の方法。
- 前記モデル系が、モジュールおよび／またはマイクロ流体デバイスにて提供される、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
- 肝線維症を調節することにおける関心対象の作用物質の活性をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１～１０のいずれか１項に記載のモデル系を提供するステップ、
（ｂ）前記関心対象の作用物質を前記モデル系に接触させるステップ、
（ｃ）前記モデル系において線維症を測定するステップ、および
（ｄ）線維症が前記接触に応答して増加するか、または減少するかを決定するステップ
を含み、ここで、前記モデル系が、インビボで非ヒト肝組織上または非ヒト肝組織中に埋め込まれており、それにより肝線維症を調節することにおける関心対象の作用物質の活性をスクリーニングする、方法。 - 前記測定ステップが、前記モデル系においてＥＺＨ２の活性を測定することを含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記測定ステップが光学的透明化（例えば、ｉｎＣＩＴＥ光学的透明化）および分析を含む、請求項１１～１５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記関心対象の作用物資が、ＥＺＨ２阻害剤（例えば、ＧＳＫ－１２６）、アンジオテンシン１型（ＡＴ１）受容体遮断剤（例えば、ロスタチン）、ハロフジノン、リジルオキシダーゼもしくはｌｏｘ様酵素阻害剤、Ａ２Ｂアデノシン受容体アンタゴニスト、またはモノクローナル抗体（例えば、ＧＳ－６６２４（シムツズマブ））である、請求項１１～１６のいずれか１項に記載の方法。
- 請求項１～１０のいずれか１項に記載のモデル系を作製する方法であって、
（ａ）前記肝臓細胞外マトリックスを供給するステップと、
（ｂ）前記肝臓前駆細胞、クッパー細胞、および肝星細胞を前記肝臓細胞外マトリックス上に播種するステップと、その後
（ｃ）インビトロで、前記マトリックス上で前記細胞を成長させるステップと
を含み、ここで、前記成長させるステップが、１週間から３週間までの期間にわたり実行され、それにより、肝線維症のための前記モデル系を形成させる、方法。 - 線維形成促進性サイトカインまたは化学物質を前記モデル系に投与することにより、前記肝星細胞を活性化するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
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| J. Hepatobiliary Pancreat. Surg.，2002年，Vol. 9，p. 697-703 |
| Toxicology Letters，2015年，Vol. 238S，p. S281，P13-020 |
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