ES2929758T3 - Métodos para la fabricación in vitro de tejido del fondo gástrico y composiciones relacionadas con el mismo - Google Patents

Abstract

La presente descripción se refiere a métodos para convertir células de endodermo definitivo (DE) de mamíferos en tejido(s) u órgano(s) específico(s) mediante diferenciación dirigida. En particular, la descripción se refiere a la formación de tejido del fondo gástrico y/u organoides formados a partir del endodermo definitivo diferenciado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la fabricación in vitro de tejido del fondo gástrico y composiciones relacionadas con el mismo

Antecedentes

A pesar de la prevalencia mundial de la enfermedad gástrica, existen pocos modelos adecuados para estudiar el epitelio del fondo del estómago humano. El desarrollo de organoides gástricos de tipo fúndico humano (hFGO) sería un sistema modelo novedoso y poderoso para estudiar las bases moleculares de la fisiología gástrica humana, la fisiopatología y el descubrimiento de fármacos.

La tesis doctoral "Mechanisms of endoderm patterning and directed differentiation of human stem cells into foregut tissues" de McCracken, KW, así como también la publicación relacionada de Mc Cracken y otros. (McCracken KW, Catá EM, Crawford CM, Sinagoga KL, Schumacher M, Rockich BE, Tsai YH, Mayhew CN, Spence JR, Zavros Y, Wells JM. Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids. Nature. 18 de diciembre de 2014;516(7531):400-4) y el documento w O 2015/183920 A2 describen un método para generar un organoide gástrico que comprende tejido del fondo que comprende las etapas de generar un endodermo definitivo (DE) a partir de una célula madre pluripotente mediante el uso de activina A y BMP4; poner en contacto dicho endodermo definitivo con FGF4, un agente que activa la vía de WNT, por ejemplo, Wnt3a o CHIR99021, el agente noggin que inhibe la vía de BMP, y ácido retinoico para generar un tejido del intestino anterior posterior. El intestino anterior posterior; se pone en contacto con EGF, ácido retinoico, el agente que activa la vía de WNT y el agente que inhibe la vía de BMP para generar un tejido del fondo. Sin embargo, los métodos no incluyen una etapa para promover la diferenciación en células parietales funcionales que expresen bombas de protones.

El documento WO 2012/178215 A1 describe un método para producir líneas progenitoras endodérmicas autorrenovables generadas a partir de células madre pluripotentes humanas.

Breve resumen

La presente descripción se refiere a métodos para convertir células de endodermo definitivo (DE) de mamífero adherentes en tejido(s) u órgano(s) específico(s) mediante diferenciación dirigida. En particular, la descripción se refiere a la formación de tejido del fondo gástrico y/u organoides formados a partir del endodermo definitivo diferenciado mediante un método de acuerdo con las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

Los expertos en la técnica entenderán que los dibujos, descritos a continuación, son solo para fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.

Figura 1. Se requiere la señalización de Wnt/p-catenina para la especificación del fondo embrionario en ratones. a, Pdxl y Sox2 se expresaron en el antro (a), mientras que Pdxl estuvo ausente en el fondo (f), identificado por células parietales que expresan Atp4b en E18.5. b, la tinción con X-gal de un intestino anterior en E10.5 a partir de un embrión indicador Axin2:LacZ mostró que la actividad de Wnt estaba restringida al dominio anterior del estómago pero excluida del estómago posterior. c, La eliminación de p-catenina en el epitelio gástrico provocó una expansión anterior de Pdxl en la región fúndica del estómago. d, En embriones ShhCre/+p-cateninafl/fl (cKO) en E18.5, Pdxl se expresó en todo el estómago, excepto en algunos parches restantes del epitelio que contiene células parietales. Los recuadros 1a-c y 2a-c muestran regiones encuadradas en el estómago control y cKO, respectivamente. e, En el estómago cKO, Ctnnb1 exhibió eliminación en mosaico, y las células parietales solo se diferenciaron en epitelio suficiente para Ctnnb1. Barras de escala, 250 pm (a), 200 pm (c) y 500 pm (d y e).

Figura 2. La activación de p-catenina promueve el desarrollo del fondo a partir de esferoides progenitores del intestino anterior humano. a, Diagrama esquematizado del protocolo de diferenciación para hGO fúndicos y antrales. b, c, En el día 9, los organoides tratados con CHIR mostraron una reducción en PDX1, un aumento en IRX2, IRX3 e IRX5, y ningún cambio en los marcadores gástricos SOX2 o GATA4. *, p<0,05; prueba t de Student de dos colas; n=3 réplicas biológicas, datos representativos de 4 experimentos independientes. d, Los hFGO crecieron de manera comparable a los hAGO, pero también exhibieron morfogénesis de gemación glandular (puntas de flecha blancas). e, Ambos hGO contenían epitelio que expresó CDH1, KRT8 y CTNNB1, así como también los marcadores gástricos GATA4 y CLDN18. Los hAGO exhibieron una expresión de PDX1 casi ubicua, mientras que los hFGO no. Barras de escala, 50 pm (c), 500 pm (d) y 100 pm (e). Las barras de error representan el s.e.m.

Figura 3. Diferenciación de linajes de células mucosas y endocrinas en los hGO. a, Esquema de los linajes compartidos y distintos que se encuentran en las glándulas fúndicas y antrales del estómago. b, Tanto los hGO antrales como fúndicos contenían células mucosas superficiales positivas para MUC5AC y células mucosas del cuello positivas para MUC6. c, d, Los hFGO contenían células endocrinas que expresan el marcador pan-endocrino SYP. Se identificaron diversos tipos de células hormonales en los hFGO, lo que incluye células endocrinas que expresan GHRL, SST e histamina. El marcador GAST de células G específico del antro se expresó en hAGO pero no en hFGO; por el contrario, GHRL estaba enriquecido en hFGO. **, p<0,01; prueba t de Student de dos colas; n=8 y 24 réplicas biológicas en hAGO y hFGO respectivamente, datos representativos de 6 experimentos independientes. e, los hAGO, pero no los hFGO, fueron competentes para dar lugar a células endocrinas que expresan GAST específicas del antro en respuesta a la expresión del actor de transcripción proendocrino NEUROG3 (+dox). *, p<0,01; prueba t de Student de dos colas; n=4 réplicas biológicas, datos representativos de 3 experimentos independientes. Las barras de error representan el s.e.m.

Figura 4. Formación de células principales en hFGO. a, Los hFGO tenían células positivas tanto para MIST1 como para Pepsinógeno C (PGC). b, Gran aumento de la región encuadrada en el panel (a) que muestra una glándula con un grupo de células con tinción apical de PGC. c, Los hFGO tenían una expresión significativamente mayor de los principales marcadores celulares PGA5 (1000 veces), PGC (100 veces) y MIST1 (>10 veces) en comparación con los hAGO. **, p<0,05; Prueba t de Student de dos colas. n=3 réplicas biológicas, datos representativos de 4 experimentos independientes. d, Micrografía electrónica de transmisión de una célula de hFGO que contiene gránulos de zimógeno densos, indicativo de una célula principal. e, Contenido de proteína pepsinógeno en hFGO en comparación con hAGO en presencia o ausencia del inhibidor de MEK (PD03). **, p<0,0001 en comparación con hAGO, prueba t de Student de dos colas, n = 8, 12 y 11 réplicas biológicas en hAGO, hFGO de control y hFGO (sin PD03), respectivamente. Barras de escala, 200 pm (a), 25 pm (b) y 10 pm (d). Las barras de error representan el s.e.m.

Figura 5. Identificación de vías que impulsan la diferenciación de células parietales funcionales en hFGO. a, La expresión de los genes de células parietales ATP4, ATP4B y GIF exhibió un aumento de 10-100 veces en hFGO en comparación con las antrales al inicio del estudio, pero aumentó drásticamente al exponer los hFGO a un pulso de PD03/BMP4 por dos días. **, p<0,05 en comparación con hAGO; #, p<0,05 en comparación con hFGO de control, prueba t de Student de dos colas, n = 4 réplicas biológicas, datos representativos de 15 experimentos independientes. b, Diferenciación estimulada de células parietales que expresan ATP4B después del tratamiento con PD03/BMP4. c, Las células parietales derivadas del hFGO semejaban las encontradas en el epitelio fúndico de ratón en maduración in vivo. d, Micrografía electrónica de transmisión de una célula hFGO con estructura canalicular reminiscentes de células parietales. e, El epitelio de las glándulas fúndicas humanas y el epitelio de hFGO se organizaron en células que expresan MUC5AC en el epitelio superficial y células parietales que expresan ATP4B en las unidades glandulares. f, Análisis del pH luminal en organoides en respuesta a la histamina mediante inyección luminal de SNARF-5F. El pH luminal en los hFGO cayó rápidamente, mientras que los hAGO no mostraron respuesta. La acidificación se bloqueó al pretratar los organoides con famotidina u omeprazol. n=9, 9, 7 y 4 réplicas biológicas en hFGO (histamina), hFGO (histamina y famotidina), hFGO (histamina y omeprazol) y hAGO (histamina), respectivamente; datos representativos de tres experimentos independientes. g, Acumulación de colorante naranja de acridina (AO) inducida por histamina en un patrón de tipo canalicular en glándulas gástricas de ratón aisladas y en los hFGO después de 60 minutos. Barras de escala, 100 pm (b), 10 pm (c), 10 pm (d), 100 pm (e; fondo humano), 20 pm (e; hFGO) y 10 pm (g). Las barras de error representan el s.e.m.

Figura 6. Definición de dominios moleculares en el estómago en desarrollo in vivo. a, El análisis de Sox2, Pdxl y Gata4 en el estómago embrionario de ratón (E14.5) mostró que el fondo (f) era Sox2+Gata4+Pdxl-, mientras que el antro (a) era Sox2+Gata4+Pdx1+. El estómago anterior (fs) expresó Sox2 pero ni Gata4 ni Pdx1. b, Estereomicrografía de campo claro que muestra regiones diseccionadas del estómago de ratón E14.5 que se analizaron mediante qPCR. fs, estómago anterior; f, fondo; a, antro; d, duodeno. c, Las regiones diseccionadas en b se analizaron mediante qPCR para determinar marcadores expresados regionalmente conocidos (Sox2, P63, Gata4, Pdxl y Cdx2) para validar la precisión de la microdisección. El análisis qPCR de las regiones estomacales E14.5 diseccionadas mostró que los marcadores putativos del fondo Irx1, Irx2, Irx3, Irx5 y Pitx1 estaban enriquecidos en el fondo en comparación con el antro. n=4 réplicas biológicas por región diseccionada. Barra de escala, 500 pm. Las barras de error representan la s.d.

Figura 7. Análisis de embriones cKO p-catenina. a, Para E12.4 y E14.5, se observó expresión ectópica de Pdxl en todo el epitelio gástrico dorsal, así como también en el epitelio gástrico más proximal del embrión cKO. b, El análisis de qPCR de las regiones diseccionadas (Figura 6, b) del intestino anterior cKO en E14.5 mostró una regulación positiva significativa de Pdxl en los dominios del fondo y del estómago anterior. Por el contrario, Irx2, Irx3 e Irx5 se redujeron notablemente en estas regiones proximales. *, p<0,05; Prueba t de Student de dos colas n = 3 réplicas biológicas por región diseccionada para cada genotipo. c, Las estereomicrografías de vísceras diseccionadas en E18.5 demostraron que los embriones cKO exhibieron agenesia pulmonar como se informó previamente. El tracto gastrointestinal, particularmente el estómago, se redujo drásticamente de tamaño. d, La tinción inmunofluorescente en E18.5 reveló un patrón de eliminación en mosaico de Ctnnb1. Las regiones encuadradas se muestran en la Figura 1,e, en el estómago E18.5 cKO, las glándulas recombinadas que carecían de tinción con Ctnnb1 no contenían células parietales, mientras que se observó una diferenciación robusta de células parietales en las glándulas positivas para Ctnnb1. Barras de escala, 200 pm (a), 500 pm (d) y 50 pm (e). Las barras de error representan la s.d.

Figura 8. Inducción estable del destino fúndico en hGO y eficiencia del protocolo. a, El solicitante investigó cuánto tiempo fue necesario el tratamiento CHIR para establecer la identidad del fondo. El tratamiento CHIR breve (d6-9) y el posterior crecimiento de organoides en medio de crecimiento de control hasta el día 34 dieron como resultado organoides fúndicos que expresan el marcador antral PDX1, lo que sugiere que el tratamiento CHIR breve no produjo un destino fúndico estable. A continuación, el solicitante probó si se requerían exposiciones más prolongadas a CHIR para retener el destino fúndico y descubrió que solo el tratamiento continuo hasta al menos el día 29 podía mantener una expresión baja del marcador antral PDX1. *, p<0,05 en comparación con los hGO antrales de control; Prueba t de Student de dos colas. n = 3 réplicas biológicas, datos representativos de 2 experimentos independientes. b, c, En el transcurso del protocolo, PDX1 permaneció bajo en los organoides tratados con CHIR, mientras que la expresión de IRX5 fue persistentemente elevada. *, p<0,05; prueba t de Student de dos colas; n = 3 réplicas biológicas por punto temporal. d, La conversión de esferoides del intestino anterior posterior d6 en organoides gástricos en etapa temprana (d20) tiene una eficiencia superior al 80 % tanto en los protocolos de hAGO como en hFGO. e, En el d20, el epitelio de hFGO es ~90 % GATA4+/SOX2+/PDX1- mientras que el epitelio de hAGO es ~90 % GATA4+/SOX2+/PDX1+. **, p<0,001, prueba t de Student de dos colas, n=4 réplicas biológicas por experimento, se muestran dos experimentos individuales. Barras de escala, 100 pm (c) y 200 pm (d).

Figura 9. Dependencia de BMP de la activación por Wnt/p-catenina para inducir el destino intestinal a partir de progenitores del intestino anterior. a, El factor de transcripción específico del intestino CDX2 no se indujo significativamente en hGO tratados con CHIR en el día 9 o en el día 20. b, Ni los hGO fúndicos ni los antrales expresaron genes asociados con tipos de células intestinales, lo que incluye MUC2, CCK y SCT, cuando se comparan con organoides intestinales humanos (hlO). *, p<0,05 en comparación con hlO; Prueba t de Student de dos colas. n = 3 réplicas biológicas. c, El destino anterior-posterior está controlado coordinadamente por la actividad de WNT y de BMP. En presencia del inhibidor de BMP Noggin, todos los organoides se mantuvieron en el intestino anterior (SOX2+) independientemente de la actividad de la vía de Wnt/p-catenina; sin embargo, en presencia de BMP4, todos los organoides se posteriorizaron (CDX2+). La activación de Wnt (CHIR) en un estado inhibido de BMP dio como resultado un patrón de fondo (SOX2+, PDX1-, CDX2-), mientras que la activación de WNT (CHIR) y la adición de BMP4 dieron como resultado un destino intestinal (CDX2+). *, p<0,05 en comparación con la condición análoga tratada con Noggin; Prueba t de Student de dos colas. n = 3 réplicas biológicas. d, La tinción inmunofluorescente de tejidos humanos reveló que CLDN18 era un marcador epitelial gástrico específico que no se encuentra en el intestino. Barra de escala, 200 pm. Las barras de error representan el s.e.m.

Figura 10. Los hFGO contienen glándulas organizadas soportadas por una capa mesenquimal asociada. a, Las micrografías electrónicas de transmisión demostraron que las glándulas de hFGO exhibieron una arquitectura organizada con membranas apicales estrechas. b, Tanto los hFGO como los hAGO contenían una capa de soporte de fibroblastos no diferenciados FOXF1+/VIM+. Barras de escala, 5 pm (a) y 100 pm (b).

Figura 11. Citodiferenciación específica de región en organoides gástricos humanos. a, Los hGO antrales y fúndicos exhibieron una expresión comparable de los marcadores de células mucosas MUC5AC y MUC6. b, Como se muestra en la micrografía electrónica de transmisión, los hFGO contenían abundantes células que exhibían un patrón de gránulos consistente con las células mucosas del cuello, los precursores de las células principales diferenciadas. c, La expresión exógena de NEUROG3 en hGO derivados de la línea de hESC deficiente en NEUROG3 indujo una diferenciación robusta de células endocrinas positivas para SYP. Aunque tanto los hAGO como los hFGO formaron células endocrinas que expresan GHRL y SST, la especificación de células G GAST+ solo se observó en los hAGO. d, Comparación de la expresión de marcadores de linaje celular en hGO y tejido de biopsia gástrica humana. Los análisis de qPCR demostraron que los hGO exhibieron niveles de expresión comparables de varios marcadores de linaje (MUC5AC, ATP4B), mientras que otros genes se expresaron en niveles mucho más bajos (ATP4A, PGA5 y PGC) que los encontrados en el estómago humano maduro completamente diferenciado. Barras de escala, 5 pm (b) y 100 pm (c). Las barras de error representan la s.d. (a) y el s.e.m. (b).

Figura 12. Análisis del desarrollo de la célula principal murina. a, A diferencia de las células parietales, que expresaron marcadores funcionales (Atp4b) ya en etapas embrionarias tardías, los productos genéticos de las células principales no fueron detectables hasta etapas de desarrollo mucho más tardías. En el estómago embrionario (E18.5) y juvenil (P12), Gif y Pgc aún no se expresaron, lo que indica que las células principales maduran mucho más tarde en el desarrollo que otros linajes en el epitelio gástrico. b, A pesar de la ausencia de Pgc, el estómago de ratón P12 contenía abundantes células glandulares que expresaban Mist1 nuclear, un marcador específico de células principales. Por tanto, las células principales de hecho se especificaron antes, pero tardaron varias semanas en desarrollar una expresión robusta de marcadores de diferenciación terminal. Barras de escala, 100 pm (a) y 200 pm (b).

Figura 13. Tamizaje de vías que promuevan la diferenciación de células parietales en hGO fúndicos. a, Para probar los factores de crecimiento/moléculas pequeñas capaces de inducir la diferenciación de células parietales, los hFGO se expusieron durante dos días (30-32) al agonista o antagonista indicado y después se analizaron el día 34. En un experimento de tamizaje de diferentes vías, solo se encontró que la inhibición de MEK con PD03 inducía de manera robusta la expresión de ATP4A/B. b, La reducción o eliminación de EGF del medio de cultivo no fue suficiente para reproducir el efecto de la inhibición de MEK. c, La capacidad de PD03/BMP4 para inducir el desarrollo de células parietales era exclusiva de los hGO fúndicos, ya que los hGO antrales no expresaron marcadores fúndicos en respuesta a PD03/BMP4. d, La exposición a PD03/BMP4 aumentó rápidamente la expresión de ATP4A y ATP4b en hGO fúndicos. e, La inducción de la generación de células parietales con PD03/BMP4 no tuvo un impacto significativo en la diferenciación de las células principales (PGA5 y PGC) y de las células endocrinas (CHGA). f, Las manipulaciones en cada etapa del protocolo de diferenciación de hFGO fueron necesarias para una diferenciación robusta de las células parietales, ya que la eliminación de cualquier etapa individual condujo a la pérdida de la expresión de ATP4A/B. Las barras de error representan la s.d. (a-c) y el s.e.m. (d-f).

Figura 14. Monitoreo del pH in vitro en organoides gástricos. a, El colorante SNAFR5F exhibe capacidad de respuesta en un intervalo de pH de 5 a 8, lo que lo hace muy adecuado para detectar cambios fisiológicos en respuesta a la secreción de ácido mediada por células parietales. b, Mediciones de pH luminal y del medio registradas antes (círculos cerrados) y 60 minutos después de la adición de histamina (círculos abiertos). Los hGO antrales no respondieron, mientras que el pH luminal del hGO fúndico disminuyó en respuesta a la histamina. La acidificación se inhibió mediante el pretratamiento de los organoides con famotidina u omeprazol. Además, el omeprazol fue suficiente para elevar el pH en los organoides fúndicos antes de la exposición a la histamina, lo que sugiere una secreción ácida inicial en los organoides fúndicos. El pH del medio no cambió en ninguno de los organoides. ***, p<0,001 en comparación con antes de la histamina; $$$, p<0,001 en comparación con el pH luminal sin histamina; ###, p<0,001 en comparación con el pH luminal con histamina; Prueba t de Student de dos colas. c, Los hFGO contenían glándulas densas en células parietales en las que se acumulaba naranja de acridina (AO) en casi todas las células que revisten la luz de la glándula. d, Se observó acumulación de AO en un patrón de tipo canalicular en células parietales en hFGO. Barras de escala, 10 pm. Las barras de error representan la s.d.

Figura 15. Pases en serie de organoides gástricos humanos. a, Representación esquemática de experimentos para determinar la presencia de células madre gástricas en los hGO. b, Cuando los fragmentos se cultivaron en medio de cultivo que contenía solo EGF, no crecieron ni se expandieron para formar nuevos organoides. Sin embargo, la adición de CHIR y FGF10 al medio de cultivo fue suficiente para soportar el crecimiento de fragmentos individuales en organoides recién formados. c, Después de dos pases, los hFGO aún expresaban genes consistentes con un fenotipo gástrico, lo que incluye PGC, MUC6, MUC5AC y GHRL. Esta capacidad de someterse a pases en serie con el mantenimiento de la identidad gástrica respalda la conclusión de que los hFGO contienen células con propiedades análogas a las de las células madre gástricas adultas. d, Aunque los hFGO pasados expresaron marcadores asociados con varios tipos de células gástricas diferenciadas, no expresaron genes asociados con células parietales tales como ATP4b . Además, la diferenciación de las células parietales no pudo inducirse a través de la inhibición de MEK como podría ocurrir antes del pase. Las barras de error representan la s.d.

Descripción detallada de la invención

A menos que se indique de cualquier otra manera, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos en la técnica relevante.

Como se usa en la presente descripción, el término "tejido del fondo gástrico" significa un tipo fúndico de epitelio gástrico que se encuentra en el cuerpo que contiene tipos de células fúndicas, lo que incluye, pero no se limita a, células parietales productoras de ácido y células principales productoras de proteasa.

Como se usa en la presente descripción, el término "célula endodérmica definitiva (DE)" significa una de las tres capas germinales primarias producidas mediante el proceso de gastrulación.

Como se usa en la presente descripción, el término "vía de señalización de wnt" significa la vía wnt/beta-catenina y es una vía de transducción de señales que está mediada por ligandos Wnt y receptores de superficie celular frizzled que actúa a través de la proteína beta-catenina.

Como se usa en la presente descripción, el término "activador" con respecto a una vía, tal como una "vía de wnt" significa una sustancia que activa la vía Wnt/beta-catenina de manera que aumentan los objetivos de Wnt/betacatenina.

Como se usa en la presente descripción, el término "activador de la vía de señalización de FGF" significa una sustancia que activa la vía de FGF de manera que aumentan los objetivos de FGF.

Como se usa en la presente descripción, el término "inhibidor de la vía de señalización de BMP" significa una sustancia que interfiere con la vía de BMP y provoca que disminuyan los objetivos de BMP.

Como se usa en la presente descripción, el término "factor de crecimiento" significa una sustancia capaz de estimular procesos celulares que incluyen, pero no se limitan a, el crecimiento, la proliferación, la morfogénesis o la diferenciación.

Como se usa en la presente descripción, el término "linaje fúndico" significa tipos de células que se encuentran en el epitelio fúndico en el cuerpo del estómago.

Como se usa en la presente descripción, el término "epitelio SOX2+GATA+PDX1-" significa el epitelio que expresa las proteínas enumeradas.

Como se usa en la presente descripción, el término "expresión estable" de un marcador significa la expresión que no cambia tras la modificación del entorno de crecimiento.

Como se usa en la presente descripción, el término "células madre totipotentes" (también conocidas como células madre omnipotentes) son células madre que pueden diferenciarse en tipos de células embrionarias y extraembrionarias. Dichas células pueden construir un organismo completo y viable. Estas células se producen a partir de la fusión de un óvulo y un espermatozoide. Las células producidas por las primeras divisiones del óvulo fertilizado también son totipotentes.

Como se usa en la presente descripción, el término "células madre pluripotentes (PSC)", también conocidas comúnmente como células PS, abarca cualquiera de las células que pueden diferenciarse en casi todas las células, es decir, células derivadas a partir de cualquiera de las tres capas germinales (epitelio germinal), lo que incluye el endodermo (revestimiento interior del estómago, tracto gastrointestinal, los pulmones), mesodermo (músculo, hueso, sangre, urogenital) y ectodermo (tejidos epidérmicos y sistema nervioso). Las PSC pueden ser descendientes de células totipotentes u obtenerse mediante la inducción de una célula no pluripotente, tal como una célula somática adulta, al forzar la expresión de ciertos genes.

Como se usa en la presente descripción, el término "células madre pluripotentes inducidas (iPSC)", también abreviada comúnmente como células iPS, se refiere a un tipo de células madre pluripotentes derivadas artificialmente de una célula normalmente no pluripotente, tal como una célula somática adulta, al inducir una expresión "forzada" de ciertos genes.

Como se usa en la presente descripción, el término "célula precursora" abarca cualquier célula que pueda usarse en los métodos descritos en la presente descripción, a través de los cuales una o más células precursoras adquieren la capacidad de autorrenovarse o diferenciarse en uno o más tipos de células especializadas. En algunas modalidades, una célula precursora es pluripotente o tiene la capacidad de volverse pluripotente. En algunas modalidades, las células precursoras se someten al tratamiento de factores externos (por ejemplo, factores de crecimiento) para adquirir pluripotencia. En algunas modalidades, una célula precursora puede ser una célula madre totipotente; una célula madre pluripotente (inducida o no inducida); una célula madre multipotente; y una célula madre unipotente. En algunas modalidades, una célula precursora puede ser de un lactante, un niño o un adulto. En algunas modalidades, una célula precursora puede ser una célula somática sometida a tratamiento de manera que la pluripotencia se confiera mediante manipulación genética o tratamiento de proteína/péptido.

En biología del desarrollo, la diferenciación celular es el proceso mediante el cual una célula menos especializada se convierte en un tipo de célula más especializada. Como se usa en la presente descripción, el término "diferenciación dirigida" describe un proceso a través del cual una célula menos especializada se convierte en un tipo de célula objetivo especializada particular. La particularidad del tipo de célula objetivo especializada puede determinarse mediante cualquiera de los métodos aplicables que puedan usarse para definir o alterar el destino de la célula inicial. Los métodos ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, manipulación genética, tratamiento químico, tratamiento de proteínas y tratamiento de ácidos nucleicos.

Como se usa en la presente descripción, el término "constituyentes celulares" son genes individuales, proteínas, genes que expresan ARNm y/o cualquier otro componente celular variable o actividades proteicas tales como el grado de modificación de la proteína (por ejemplo, fosforilación), por ejemplo, que se mide típicamente en experimentos biológicos (por ejemplo, mediante micromatrices o inmunohistoquímica) por los expertos en la técnica. Los descubrimientos significativos relacionados con las complejas redes de procesos bioquímicos que subyacen a los sistemas vivos, las enfermedades humanas comunes y el descubrimiento de genes y la determinación de la estructura ahora pueden atribuirse a la aplicación de datos de abundancia de constituyentes celulares como parte del proceso de investigación. Los datos de abundancia de constituyentes celulares pueden ayudar a identificar biomarcadores, discriminar subtipos de enfermedades e identificar mecanismos de toxicidad.

Células madre pluripotentes

Se describe además en la presente descripción que pueden obtenerse células madre que son pluripotentes o que pueden inducirse a que se vuelvan pluripotentes. Se describe además que las células madre pluripotentes pueden obtenerse por medio de un proceso en el que los embriones humanos no se destruyen. Se describen células madre adicionales en la base de datos alojada en el National Stem Cell Bank (NSCB), Human Embryonic Stem Cell Research Center en la Universidad de California, San Francisco (UCSF); WISC cell Bank en el Wi Cell Research Institute; la University of Wisconsin Stem Cell and Regenerative Medicine Center (UW-SCRMC); Novocell, Inc. (San Diego, California); Cellartis AB (Gotemburgo, Suecia); ES Cell International Pte Ltd (Singapur); Technion en el Israel Institute of Technology (Haifa, Israel); y la base de datos de células madre alojada en la Princeton University y en la University of Pennsylvania. Las células madre embrionarias de referencia incluyen, pero no se limitan a, SA01 (SA001); SA02 (SA002); ES01 (HES-1); ES02 (HES-2); ES03 (HES-3); ES04 (HES-4); ES05 (HES-5); ES06 (HES-6); BG01 (BGN-01); BG02 (BGN-02); BG03 (BGN-03); TE03 (13); TE04 (14); TE06 (16); UC01 (HSF1); UC06 (HSF6); WA01 (H1); WA07 (H7); WA09 (H9); WA13 (H13); WA14 (H14).

Como referencia, pueden encontrarse más detalles sobre las células madre embrionarias en, por ejemplo, Andrews y otros, 2005, "Embryonic stem (ES) cells and embryonal carcinoma (EC) cells: opposite sides of the same coin", Biochem Soc Trans 33:1526-1530; Martin 1980, "Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis". Science 209 (4458):768-776; Evans y Kaufman, 1981, "Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos", Nature 292(5819): 154-156; Klimanskaya y otros, 2005, "Human embryonic stem cells derived without feeder cells", Lancet 365 (9471): 1636-1641.

Células madre pluripotentes inducidas (iPSC)

En algunas modalidades, las iPSC se derivan por transfección de ciertos genes asociados a células madre en células no pluripotentes, tales como fibroblastos adultos. La transfección se logra típicamente a través de vectores virales, tales como los retrovirus. Los genes transfectados incluyen los reguladores transcripcionales maestros Oct-3/4 (Pouf51) y Sox2, aunque se sugiere que otros genes potencian la eficiencia de la inducción. Después de 3-4 semanas, pequeñas cantidades de células transfectadas comienzan a volverse morfológicamente y bioquímicamente similares a las células madre pluripotentes, y típicamente se aíslan mediante selección morfológica, tiempo de duplicación o mediante un gen indicador y selección de antibióticos. Como se usa en la presente descripción, las iPSC incluyen, pero no se limitan a, iPSC de primera generación, iPSC de segunda generación en ratones y células madre pluripotentes inducidas humanas. En algunas modalidades, puede usarse un sistema retroviral para transformar fibroblastos humanos en células madre pluripotentes mediante el uso de cuatro genes fundamentales: Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc. En modalidades alternativas, se usa un sistema lentiviral para transformar células somáticas con OCT4, SOX2, NANOG y LIN28. Los genes cuya expresión puede inducirse en las iPSC incluyen, pero no se limitan a, Oct-3/4 (por ejemplo, Pou5f1); ciertos miembros de la familia de genes Sox (por ejemplo, Sox1, Sox2, Sox3 y Sox15); ciertos miembros de la familia Klf (por ejemplo, Klf1, Klf2, Klf4 y Klf5), ciertos miembros de la familia Myc (por ejemplo, C-myc, L-myc y N-myc), Nanog y LIN28.

En algunas modalidades, se emplean tecnologías no basadas en virus para generar las iPSC. En algunas modalidades, puede usarse un adenovirus para transportar los cuatro genes necesarios al ADN de las células de la piel y del hígado de los ratones, lo que da como resultado células idénticas a las células madre embrionarias. Dado que el adenovirus no combina ninguno de sus propios genes con el huésped objetivo, se elimina el peligro de crear tumores. En algunas modalidades, la reprogramación puede realizarse mediante un plásmido sin ningún sistema de transfección de virus, aunque con eficiencias muy bajas. En otras modalidades, se usa el suministro directo de proteínas para generar las iPSC, lo que elimina de este modo la necesidad de virus o de modificación genética. En alguna modalidad, la generación de las iPSC de ratón es posible mediante el uso de una metodología similar: un tratamiento repetido de las células con ciertas proteínas canalizadas hacia las células mediante anclajes de poliarginina fue suficiente para inducir la pluripotencia. En algunas modalidades, la expresión de genes de inducción de pluripotencia también puede aumentarse mediante el tratamiento de células somáticas con FGF2 en condiciones de bajo oxígeno.

Pueden encontrarse más detalles sobre las células madre embrionarias, por ejemplo, en Kaji y otros, 2009, "Virus free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors", Nature 458:771-775; Woltjen y otros, 2009, "piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells", Nature 458:766-770; Okita y otros, 2008, "Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors", Science 322(5903):949-953; Stadtfeld y otros, 2008, "Induced Pluripotent Stem Cells Generated without Viral Integration", Science 322(5903):945-949; y Zhou y otros, 2009, "Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins", Cell Stem Cell 4(5):381-384.

En algunas modalidades, las líneas celulares de iPS ilustrativas incluyen, pero no se limitan a, iPS-DF19-9; iPS-DF19-9; iPS-DF4-3; iPS-DF6-9; iPS(Prepucio); iPS(IMR90); e iPS(IMR90).

Pueden encontrarse más detalles sobre las funciones de las vías de señalización relacionadas con el desarrollo del DE, por ejemplo, en Zorn y Wells, 2009, "Vertebrate endoderm development and organ formation", Annu Rev Cell Dev Biol 25:221-251; Dessimoz y otros, 2006, "FGF signaling is necessary for establishing gut tube domains along the anterior-posterior axis in vivo", Mech Dev 123:42-55; McLin y otros, 2007, "Repression of Wnt/{beta}-catenin signaling in the anterior endoderm is essential for liver and pancreas development". Development, 134:2207-2217; Wells y Melton, 2000, Development 127:1563-1572; de Santa Barbara y otros, 2003, "Development and differentiation of the intestinal epithelium", Cell Mol Life Sci 60(7): 1322-1332.

Cualquier método para producir endodermo definitivo a partir de células pluripotentes (por ejemplo, iPSC o ESC) es aplicable a los métodos descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, las células pluripotentes se derivan de una mórula. En algunas modalidades, las células madre pluripotentes son células madre. Las células madre usadas en estos métodos pueden incluir, pero no se limitan a, células madre embrionarias. Las células madre embrionarias o células germinales pueden originarse a partir de una variedad de especies animales lo que incluye, pero no se limita a, diversas especies de mamíferos, lo que incluye los seres humanos. En algunas modalidades, se usan células madre embrionarias humanas para producir endodermo definitivo. En algunas modalidades, se usan células germinales embrionarias humanas para producir endodermo definitivo. En algunas modalidades, las iPSC se usan para producir endodermo definitivo.

En la presente descripción se describen métodos para diferenciar células madre pluripotentes (PSC) humanas en organoides gástricos que contienen epitelio fúndico. El solicitante primero identificó y después reprodujo eventos clave en el desarrollo del fondo embrionario para llegar a las composiciones reivindicadas. El solicitante descubrió que la interrupción de la señalización de Wnt/p-catenina en embriones de ratón condujo a la conversión de epitelio fúndico en epitelio antral, mientras que la activación de p-catenina en progenitores del intestino anterior derivados de hPSC promovió el desarrollo de organoides gástricos de tipo fúndico humano (hFGO). A continuación, el solicitante usó hFGO para identificar funciones temporalmente distintas para múltiples vías de señalización en la morfogénesis epitelial y la diferenciación de tipos de células fúndicas, lo que incluye las células principales y las células parietales funcionales. Si bien los hFGO son un modelo nuevo y poderoso para estudiar el desarrollo del fondo humano y sus linajes, también representan un nuevo sistema modelo fundamental para estudiar la base molecular de la fisiología gástrica humana, la fisiopatología y el descubrimiento de fármacos.

En un aspecto, se describe un método in vitro para inducir la formación de un tejido del fondo gástrico, en donde el tejido del fondo gástrico es un tipo fúndico de epitelio gástrico que se encuentra en el cuerpo que contiene tipos de células fúndicas, lo que incluye, pero no se limita a, células parietales productoras de ácido y células principales productoras de proteasa. El método puede comprender las etapas de:

a) poner en contacto una célula de endodermo definitivo (DE) de mamífero adherente con el activador de la vía de wnt CHIR99021, el activador de la vía de señalización de FGF FGF4, el inhibidor de la vía de señalización de BMP Noggin y ácido retinoico, durante un primer período. La señalización de Wnt se activa con CHIR99021 que inhibe GSK3p. El primer período puede ser de tres días ± 24 horas. El ácido retinoico se añade para el tercer día del primer período ± 24 horas. El primer período se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para formar un esferoide tridimensional del intestino anterior posterior a partir del endodermo definitivo.

b) suspender dicho esferoide tridimensional del intestino anterior posterior en una matriz de membrana basal con un factor de crecimiento, el activador de la vía de señalización de Wnt, el activador de la vía de señalización de EGF, el inhibidor de la vía de señalización de BMP y ácido retinoico durante un segundo período. El segundo período puede ser de tres días ± 24 horas. El segundo período se lleva a cabo durante un período de tiempo suficiente para inducir un linaje fúndico que comprende hGO fúndicos (hFGO) suspendidos en la matriz de la membrana basal.

c) cultivar los hFGO de la etapa b) con el activador de la vía de señalización de wnt y el activador de la vía de señalización de EGF durante un tercer periodo. El tercer período puede ser, por ejemplo, de 11 días ± 24 horas. d) cultivar los hFGO de la etapa c con un activador de la vía de señalización de wnt, un activador de la vía de señalización de EGF y FGF10 durante un cuarto período. El cuarto período puede ser, por ejemplo, de 10 días ± 24 horas.

e) poner en contacto dichos hFGO de la etapa d con un inhibidor de MEK durante un quinto periodo. El inhibidor de MEK puede ser, por ejemplo, PD0325901. El quinto período puede ser durante un período de dos días ± 24 horas, o durante un período de tiempo suficiente para formar un tejido del fondo gástrico que comprenda un tipo de célula fúndica funcional.

En un aspecto, la etapa e) puede comprender además la etapa de poner en contacto los hGO del fondo con un activador de la señalización de BMP4. En ciertos aspectos, la etapa e puede llevarse a cabo durante un período de tiempo suficiente para desarrollar epitelio SOX2+GATA+PDX1-.

En un aspecto, el tipo de célula fúndica funcional puede ser una célula parietal que expresa proteínas de bomba de protones y que secreta ácido. En un aspecto, el tipo de célula fúndica funcional puede ser una célula principal que secreta pepsinógeno.

En un aspecto, la etapa d y la etapa e se llevan a cabo durante un período de tiempo suficiente para conferir una expresión estable de los marcadores de linaje MUC5AC, MUC6, PGC y GHRL.

En un aspecto, el endodermo definitivo puede derivarse a partir de una célula precursora seleccionada de una célula madre embrionaria, una célula germinal embrionaria o una célula madre pluripotente inducida. Se describe, pero no se reivindica, derivar el endodermo definitivo a partir de una célula del mesodermo, una célula del endodermo definitivo, una célula del endodermo posterior, una célula del endodermo posterior y una célula del intestino posterior, un endodermo definitivo derivado de una célula madre pluripotente, un endodermo definitivo derivado de una célula madre pluripotente seleccionada de una célula madre embrionaria, una célula madre adulta o una célula madre pluripotente inducida.

En un aspecto, el endodermo definitivo se deriva de poner en contacto una célula madre pluripotente con una o más moléculas seleccionadas de activina A. Se describe, pero no se reivindica, derivar el endodermo definitivo de poner en contacto el endodermo definitivo con otras moléculas seleccionadas de los subgrupos de BMP de la superfamilia TGF-beta de factores de crecimiento; Nodal Activina B, BMP4, Wnt3a y combinaciones de los mismos.

Se describen, pero no se reivindican, otras formas distintas de CHIR99021 para activar la vía de Wnt/beta-catenina (ver http://web.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/). Algunos activadores adecuados de las vías de señalización de wnt existentes incluyen pero no se limitan a:

Se describen, pero no se reivindican, activadores basados en proteínas: ligandos de Wnt que incluyen, pero no se limitan a, Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt8, y otros; modificadores de la actividad del ligando de Wnt, que incluyen, pero no se limitan a, receptores frizzled de Wnt activados, correceptores (LRP), proteínas R-espondina, proteínas Dkk, reguladores de la secreción y el tráfico de ligandos de Wnt (Wntless, Porcupine), inhibición de la degradación de beta-catenina e inhibición de APC y GSK3beta, beta-catenina activada, proteínas TCF/Lef activas constitutivamente.

Otros activadores químicos descritos pero no reivindicados además de CHIR99021: existen más de 28 sustancias químicas conocidas que activan o inhiben la señalización de Wnt/beta-catenina. Algunos activadores incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de GSK3-beta BIO, LY2090314, SB-216763, litio, inhibidores de puercoespín IWP, LGK974, C59, inhibidor de SFRP WAY-316606, activador de beta-catenina DCA.

Se describen, pero no se reivindican, activadores de la vía WNT seleccionados de Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11 y Wnt16, por ejemplo, Wnt3a, o por ejemplo, Wnt3a a una concentración entre aproximadamente 50 a aproximadamente 1500 ng/ml.

Se describen, pero no se reivindican, otros activadores de la vía de señalización de FGF adecuados además de FGF4 que incluyen: ligandos de FGF FGF2, 5, 8, y otros. Formas activadas de receptores de FGF. Proteínas y productos químicos que estimulan el receptor de FGF y los componentes de señalización aguas abajo de los receptores incluyen las proteínas MAPK, MEK, ERK y los productos químicos que modulan su actividad. La señalización de FGF puede activarse al inhibir los inhibidores de las vías de señalización de FGF, lo que incluye, pero no se limita a, los miembros de la familia de proteínas Sprouty.

Se describen, pero no se reivindican, otros inhibidores de la vía de señalización de BMP distintos de Noggin seleccionados de dorsomorfina, LDN189, DMH-1 y combinaciones de los mismos, por ejemplo. La célula precursora puede ponerse en contacto con un inhibidor de BMP a una concentración entre aproximadamente 50 a aproximadamente 1500 ng/ml.

En un aspecto, las etapas se realizan in vitro.

En un aspecto, se describe una composición que comprende tejido gástrico producido de acuerdo con el(los) método(s) mencionado(s) anteriormente. El tejido gástrico puede caracterizarse, por ejemplo, por estar libre de inervación y/o de vasos sanguíneos.

En un aspecto, se describe un método in vitro para inducir la formación de un tejido del fondo gástrico. El método puede comprender las etapas de poner en contacto un hGO fúndico (hFGO) con el agente activador de la vía de wnt CHIR99021 y el agente activador de la vía de señalización de EGF, EGF durante un primer período, y un inhibidor de MEK durante un segundo período, en donde dicho inhibidor de MEK es PD0325901, en donde dichos períodos primero y segundo se llevan a cabo durante un período de tiempo suficiente para formar un tipo de célula fúndica funcional;

en donde dicho hFGO se obtiene al poner en contacto un esferoide tridimensional del intestino anterior posterior en una matriz de membrana basal con un factor de crecimiento, el agente activador de la vía de wnt CHIR99021, el activador de la vía de señalización de EGF, EGF, el inhibidor de la vía de señalización de BMP Noggin y ácido retinoico durante un período de tiempo suficiente para convertir dicho esferoide tridimensional del intestino anterior posterior en dicho hFGO;

en donde dichos esferoides tridimensionales del intestino anterior posterior se obtienen al poner en contacto células de endodermo definitivo (DE) de mamífero adherentes con el agente activador de la vía de wnt CHIR99021, el agente activador de la vía de señalización de FGF FGF4, el inhibidor de la vía de señalización de BMP Noggin y ácido retinoico.

Ejemplos

Recientemente, se ha logrado un progreso considerable en el desarrollo de sistemas organoides tridimensionales in vitro12. Los organoides han demostrado ser poderosos modelos experimentales que combinan la complejidad arquitectónica y la diversidad celular con la manejabilidad y escalabilidad de los métodos de cultivo celular tradicionales. La generación de organoides mediante la diferenciación dirigida de células madre pluripotentes (PSC; que comprenden PSC inducidas) ofrece varias ventajas sobre otros enfoques, lo que incluye una fuente ilimitada de material de partida, la no necesidad de adquisición quirúrgica de tejido y la facilidad de manipulaciones genéticas. Además, los métodos basados en PSC permiten la investigación directa de los mecanismos subyacentes al desarrollo humano normal y aberrante3. Sin embargo, la diferenciación de las PSC en tipos de organoides específicos depende de un robusto conocimiento molecular del desarrollo normal de los órganos. Para algunos órganos, tales como el estómago, existen grandes lagunas en la comprensión de las vías moleculares que impulsan el desarrollo embrionario.

El estómago es uno de los órganos estructuralmente más diversos entre los mamíferos4. En los humanos, la mucosa gástrica generalmente consiste en dos tipos de glándulas epiteliales5,6. Ubicadas en los dominios anatómicos más proximales (el cuerpo y el fondo) del estómago, las glándulas oxínticas comprenden células parietales secretoras de ácido, células principales productoras de proteasa, células productoras de moco y células endocrinas. Las glándulas de tipo antral, ubicadas en el antro y el píloro más distales, contienen principalmente células mucosas y endocrinas. Para simplificar los sistemas de nomenclatura anatómicos y específicos de especie, los términos "fondo" y "antro" se usan para describir ampliamente estos dos tipos histológicos de epitelio gástrico. El solicitante ha desarrollado previamente un método para dirigir la diferenciación de hPSC en tejido gástrico tridimensional (organoides gástricos humanos; hGO) que contenía un epitelio antral puro con tipos de células antrales normales7. Si bien los hGO antrales (hAGO) son un sistema robusto para estudiar la asignación del linaje antral y las interacciones huésped-microbio en el estómago, no permiten estudios de biología y enfermedad fúndica. Más recientemente, Noguchi y otros diferenciaron exitosamente ^e S^c de ratón en organoides que comprenden diversos tipos de tejido gástrico de ratón8. Sin embargo, este enfoque que usó la agregación de ESC de ratón y la diferenciación espontánea dio como resultado organoides que eran heterogéneos, evidenciado por la presencia de epitelios estratificados. Además, las diferencias entre especies hacen que el estómago del ratón sea subóptimo para modelar la enfermedad gástrica humana9. Por tanto, un modelo robusto y eficiente derivado de PSC del epitelio del fondo humano representaría un avance significativo en el campo de la biología gástrica.

El desarrollo de órganos embrionarios está guiado por una serie de señales instructivas entre tejidos vecinos1011, y la diferenciación de hPSC en linajes específicos se ha basado en gran medida en el uso de estas señales para dirigir la diferenciación in vitro. El solicitante identificó previamente un enfoque de diferenciación escalonado para generar hAGO, por el cual las hPSC se diferenciaron en endodermo definitivo, se modelaron en el intestino anterior posterior y después se especificaron en presunto epitelio antral7. El solicitante planteó la hipótesis de que el fondo y el antro se derivan de una población común de progenitores del intestino anterior posterior, que podrían dirigirse hacia el linaje fúndico si se les proporcionan las señales apropiadas. Sin embargo, dado que los mecanismos que impulsan el desarrollo del fondo in vivo no se conocían previamente, el solicitante primero tuvo que identificar las vías de señalización que modelan el estómago embrionario a lo largo del eje proximal-distal.

Formación del patrón del estómago embrionario

Para ayudar a la investigación de las vías que regulan la especificación en fondo durante el desarrollo embrionario, el solicitante analizó embriones de ratón para identificar los marcadores moleculares que pudieran distinguir entre los presuntos fondo, antro y estómago anterior. En E14.5, el solicitante descubrió que Sox2 se expresaba en todos los linajes de órganos del intestino anterior, mientras que Gata4 estaba restringido al epitelio glandular del estómago. Dentro del dominio Gata4+, Pdxl era específico de la presunta región antral (Figura 6, a); por tanto, se cree que el dominio del fondo embrionario es Sox2+Gata+Pdx1-. Además, el solicitante analizó conjuntos de datos de micromatrices publicados (GSM326648-GSM32665012 y GSM80809-GMS8081613) y regiones diseccionadas del intestino anterior E14.5 para demostrar que la expresión de los factores de transcripción Irx2, Irx3 e Irx5 estaba más de diez veces enriquecida en el fondo embrionario en comparación con el antro (Figura 6, b-c), lo que indica que su expresión puede distinguir aún más entre regiones del epitelio gástrico glandular.

A nivel molecular, los presuntos dominios fúndico y antral del estómago ya estaban establecidos en E10.5 (Figura 6, a). En ese punto del desarrollo, la vía de señalización canónica de Wnt estaba activa en el estómago proximal pero exhibió poca o ninguna actividad en el estómago distal14, como se muestra mediante el uso de la cepa de ratón indicadora de Wnt Axin2-lacZ (Figura 1b). Si bien se conoce que la regulación de la señalización de Wnt/p-catenina desempeña una función en el establecimiento del límite pilórico-duodenal1415, no se ha investigado su función en el patrón del epitelio gástrico. Para determinar si se requería funcionalmente la señalización de Wnt/p-catenina para establecer el fondo in vivo, el solicitante eliminó la p-catenina (Ctnnb1) en el epitelio del intestino anterior mediante el uso de Shh-cre (Shh-cre;p-cateninafl/fl = cKO). La interrupción de la señalización de Wnt/p-catenina dio como resultado la pérdida de la identidad fúndica, demostrada por la expresión ectópica de Pdxl en el fondo en E10.5 (Figura 1, c). El Pdxl ectópico se restringió inicialmente a la mitad ventral del epitelio fúndico, consistente con la actividad de recombinación informada previamente mediante el uso de esta línea Shh-cre16, pero después se expandió con el tiempo para incluir la mayor parte del estómago proximal y la curvatura mayor en E14.5 (Figura 7, a). Adicionalmente, la expresión de los marcadores del fondo Irx2, Irx3 e Irx5 se redujo drásticamente en los embriones cKO (Figura 7, b). Conjuntamente, estos datos respaldan la conclusión de que la señalización de Wnt/p-catenina epitelial regula la formación del patrón gástrico, ya que se requiere para la especificación inicial de la identidad del fondo a la vez que se reprime el destino antral en el estómago embrionario de ratón.

Para determinar el impacto de las anomalías del patrón mediadas por Wnt/p-catenina tempranas y la citodiferenciación posterior, el solicitante analizó embriones cKO en E18.5. El estómago en embriones cKO estaba malformado y reducido en tamaño en E18.5 (Figura 1, d y Figura 7, c-d), lo que sugiere una función para Wnt/p-catenina en la promoción del crecimiento del estómago durante las etapas tardías del desarrollo. Además, el estómago cKO tenía un patrón completamente erróneo con expresión ectópica de Pdxl en todas las regiones más proximales del epitelio (Figura 1, d). Las células parietales, un tipo de célula fúndica marcada por la expresión de Atp4b, estaban reducidas en el estómago CKO (Figura 1, d) y completamente ausentes en el epitelio deficiente en f3-catenina (Figura 1, e). Por el contrario, las células parietales que sí se desarrollaron solo se observaron en el epitelio que expresa p-catenina (Figura 1, e y Figura 7, d-e). En conjunto, estos datos in vivo respaldan un modelo mediante el cual la señalización de Wnt/p-catenina induce la especificación en fondo e inhibe la identidad antral. Además, la interrupción de este patrón temprano coincide con la subsecuente pérdida autónoma celular de células parietales, lo que sugiere que la citodiferenciación se ve afectada secundaria a defectos del patrón de desarrollo.

Ejemplo de referencia: diferenciación de hGO fúndicos a partir de hPSC

A continuación, el solicitante investigó la función de la señalización de Wnt/p-catenina en el establecimiento del patrón fúndico-antral del estómago humano en desarrollo. Para modelar las etapas tempranas de la diferenciación del estómago, el solicitante comenzó con un protocolo descrito previamente para diferenciar las hPSC en organoides gástricos similares al antro, que reproduce las etapas normales del desarrollo gástrico temprano con alta fidelidad7. A partir de esferoides tridimensionales del intestino anterior posterior (S0X2+HNF1p+), el solicitante sometió a prueba si la estimulación de la señalización de Wnt/p-catenina dirigiría el epitelio del intestino anterior posterior hacia el linaje fúndico (S0X2+GATA+PDX1-) en lugar de hacia el antro (SOX2+GATA+PDX1+) durante la etapa de especificación gástrica (Figura 2, a). De hecho, la activación de f3-catenina con el inhibidor de GSK3p CHIR99021 (CHIR) durante tres días dio como resultado una represión casi completa de PDX1 en el día 9, acompañada de una expresión significativamente mayor de IRX2, IRX3 e IRX5 (Figura 2, b-c). Es importante destacar, que los niveles de SOX2 y GATA4 no se vieron afectados por el tratamiento con CHIR, lo que confirma que los esferoides conservaron su identidad gástrica. Por tanto, la exposición a CHIR dio como resultado la formación de epitelio SOX2+GATA+PDX1-con una mayor expresión de IRX, una firma consistente con el presunto epitelio fúndico.

A continuación, el solicitante buscó determinar si los esferoides tratados con CHIR se desarrollarían aún más en hGO más maduros que contienen un epitelio similar al fondo. Curiosamente, un pulso de CHIR de tres días a partir de los días 6-9 no fue suficiente para especificar de manera irreversible una identidad fúndica, ya que los hGO finalmente revirtieron hacia un fenotipo antral PDX1+ en etapas tardías. Sin embargo, la estimulación continua de Wnt mediante el tratamiento con CHIR durante hasta al menos el día 29 condujo a una inducción estable de la expresión del gen fúndico (Figura 8,a). Esto fue consistente con la actividad prolongada de la señalización de Wnt/p-catenina durante el desarrollo del estómago embrionario in vivo. Aunque estudios previos indicaron que la activación ectópica de Wnt en el estómago embrionario promovió el destino intestinal1415, los hGO tratados con CHIR no exhibieron un aumento significativo en los marcadores intestinales CDX2, MUC2, CCK o SCT (Figura 8, e y Figura 9, a-b). El solicitante demostró además que CDX2 permaneció suprimido a pesar de la activación de Wnt/p-catenina debido a la inhibición concomitante de la señalización de BMP, ya que reemplazar Noggin con BMP4 condujo a una expresión robusta del factor de transcripción intestinal (Figura 9, c).

Una vez que se establecen los dominios regionales en el desarrollo temprano, el epitelio gástrico primitivo experimenta períodos de crecimiento, morfogénesis glandular y diferenciación de tipos celulares definitivos. El solicitante demostró previamente que los hAGO experimentaron una progresión similar de desarrollo morfológico y celular7. Los hFGO tratados con CHIR crecieron a una velocidad y eficiencia similares en comparación con los hAGO, ya que el 75-90 % de todos los esferoides sembrados en placas se convirtieron en organoides (Figura 8, d). En el día 20, ambos tipos de hGO contenían epitelios que expresaban la firma gástrica SOX2/GATA4 en >90 % de las células, mientras que PDX1 estaba restringido a hAGO (87,1 ± 8,4 % en hAGO y 3,9 ± 2,0 % en hFGO, p=3,07 * 10'6, Figura 8, e). Los organoides mantuvieron sus respectivas identidades gástricas a lo largo de su desarrollo (Figura 8, b-c). Para el día 34, los hFGO y los hAGO comprendían epitelios columnares polarizados CDH1+CTNNB1+KRT8+ que expresaban de forma ubicua la claudina específica del estómago17 CLDN18 (Figura 2, e y Figura 9, d), así como también células mesenquimales no diferenciadas comparables (Figura 10, b). Una diferencia notable fue que los hFGO tenían una arquitectura distintiva con glándulas organizadas que brotan del epitelio organoide (Figura 2, d-e y Figura 10, a), mientras que los hAGO tenían un plegamiento complejo y una organización primitiva similar a una glándula, pero rara vez brotes glandulares7. Por tanto, el nuevo mecanismo dependiente de Wnt/p-catenina para especificar el fondo se conserva en humanos y puede manipularse para generar hFGO tridimensionales con un epitelio glandular que se asemeja molecularmente al fondo en desarrollo.

Citodiferenciación gástrica específica de región

Los tipos de células gástricas antrales diferenciadas se detectaron por primera vez en hAGO alrededor del día 27 y después aumentaron hacia el día 347, de manera análoga a las primeras pocas semanas de desarrollo postnatal en el estómago de ratón18. En el día 34, los hFGO contenían tanto células mucosas superficiales MUC5AC+ como células mucosas del cuello MUC6+ como se esperaba, similar a los hAGO (Figura 3, a-b y Figura 11, a). Los hFGO también formaron una variedad de tipos de células endocrinas (Figura 3, c), pero la expresión de la hormona GAST fue específica de hAGO, mientras que GHRL estaba enriquecida 10 veces en hFGO (Figura 3, d), consistente con el patrón gastroendocrino normal19. Para definir funcionalmente la competencia específica de región de los hGO, el solicitante usó un sistema inducible para sobreexpresar el factor de transcripción proendocrino NEUROG3. La expresión de NEUROG3 en ambos subtipos de hGO dio como resultado una expresión robusta del marcador panendocrino SYP, así como también de las hormonas gástricas comunes SST y GHR^l (Figura 11, c). Sin embargo, solo los hAGO y no los hFGO fueron competentes para dar lugar a células G que expresan GAST (Figura 3, e y Figura 11, c), consistente con la distribución específica del antro de las células G en el estómago humano19.

Las células principales, el linaje secretor específico del fondo, residen en la base de las glándulas oxínticas y se han propuesto como un tipo de célula madre de reserva20. Los hFGO exhibieron expresión epitelial del factor de transcripción específico de células principales21 MIST1 (Figura 4, a), tuvieron aumentos de 100-1000 veces en las transcripciones para las proenzimas PGA5 y PGC (Figura 4, c) y contenían un contenido de pepsinógeno significativamente mayor medido por ELISA (Figura 4, e). Sin embargo, los niveles de transcripción fueron inferiores al 1 % de los encontrados en el estómago humano adulto (Figura 11, d) y las células positivas para pepsinógeno rara vez fueron detectables mediante inmunohistoquímica (Figura 4, b-c). Consistente con esto, se identificaron células22 que contenían gránulos de zimógeno mediante TEM (Figura 4, d) pero fueron raras. Por el contrario, abundaban las células con un patrón de gránulos mucosos más inmaduros (Figura 11, b). Dado que las células principales in vivo no exhiben una expresión robusta de pepsinógeno durante las primeras pocas semanas de vida (Figura 12, a-b), el solicitante concluyó que las células principales estaban presentes en hFGO pero eran inmaduras. Por lo tanto, los hFGO representan una plataforma robusta para analizar los mecanismos intrínsecos y extrínsecos que regulan la maduración de las células principales.

Vías que controlan la diferenciación de células parietales

Al inicio del estudio, los hFGO contenían solo una pequeña cantidad de células parietales (PC; Figura 5, a-b), el tipo de célula definitoria de las glándulas fúndicas que acidifican la luz gástrica a través de la bomba de protones (que consiste en subunidades ATP4A y ATP4B). La identificación de métodos eficientes para aumentar las poblaciones de PC se ha mantenido difícil de alcanzar debido a la falta de comprensión de los mecanismos de señalización que impulsan su desarrollo. Por lo tanto, el solicitante usó hFGO derivados de PSC como una plataforma para tamizar funcionalmente vías de señalización candidatas para determinar una función en la regulación de la diferenciación de PC. Para el tamizaje, el solicitante expuso los hFGO el día 30 a agonistas o antagonistas de señalización durante dos días y analizó la diferenciación de PC el día 34. Si bien la mayoría de las manipulaciones de la señalización no tuvieron un efecto apreciable, la inhibición transitoria de la vía MEK con PD0325901 (PD03) dio como resultado una regulación positiva sustancial tanto de ATP4A como de ATB4B (Figura 13, a). Además, mientras que BMP4 sola no afectó la expresión del gen PC, pudo potenciar el efecto de PD03 (datos no mostrados). De esta forma, un pulso de dos días de PD03/BMP4 fue suficiente para inducir una expresión rápida y robusta de los marcadores de PC ATP4A, ATP4B y GIF (Figura 5, a-b y Figura 13, d). Curiosamente, este efecto no se observó al eliminar simplemente el EGF o FGF del medio de cultivo (Figura 13, b), lo que sugiere que es probable que existan interacciones de señalización endógena aguas arriba de MEK/ERK que son responsables de limitar la diferenciación de PC en cultivos de hFGO. Además, el tratamiento con PD03/BMP4 solo afectó el linaje de PC (Figura 13, e) y fue capaz de inducir PC en los hAGO (Figura 13, c), lo que enfatiza aún más que la formación temprana del patrón del epitelio gástrico define su potencial de diferenciación final.

En el día 34, el epitelio de hFGO exhibió una organización comparable a la del estómago humano, con células mucosas que revisten el dominio superficial y PC concentradas en la porción glandular (Figura 5, e). Además, la morfología de las células parietales se asemejaba mucho a las células parietales en maduración in vivo (Figura 5, c). Dada su semejanza con las PC in vivo y su ultraestructura túbulovesicular como se observa en TEM (Figura 5, d), el solicitante planteó la hipótesis de que las PC en hFGO exhibirían la capacidad de secretar ácido en respuesta a los estímulos apropiados. Medidos mediante el uso de un colorante sensible al pH (SNARF5F) con microscopía confocal en tiempo real (Figura 14, a), los hFGO produjeron una disminución rápida y marcada en el pH luminal en respuesta a la histamina que fue bloqueada por el antagonista de H2 famotidina o el antagonista de ATPasa H+K+- omeprazol (Figura 5, f y Figura 14, b). Para visualizar la respuesta celular a la histamina, se cultivaron los hGO con el colorante fluorescente naranja de acridina (AO), que cambia a un color naranja cuando se secuestra en compartimentos ácidos23. De forma similar a las glándulas gástricas de ratón aisladas, el AO se acumuló en vesículas celulares acidificadas en glándulas de hFGO en respuesta a la histamina (Figura 5, g y Figura 14, c-d). Estos datos indican que las PC experimentaron cambios apropiados en la estructura canalicular secretora en respuesta a estímulos inductores de ácido.

Se cree que los linajes de células gástricas diferenciadas in vivo se derivan de un grupo común de células madre o progenitoras no diferenciadas. Aquí, el solicitante ha demostrado la capacidad de alterar las proporciones relativas de tipos de células en hFGO, ya sea a través de medios genéticos (regulación de células endocrinas mediada por NEUROG3) o mediante la manipulación de vías de señalización extrínsecas (PD03/BMP4 para PC). Estas observaciones condujeron a la hipótesis de que los hFGO podrían contener una población de células madre gástricas análogas a las que se han aislado del estómago de un adulto. De hecho, el solicitante descubrió que los hFGO disociados del día 34 podrían pasarse en serie para dar lugar a nuevos organoides (Figura 15, a-b). El nuevo crecimiento de organoides a partir de hFGO pasados era dependiente de un medio de cultivo alto en Wnt y alto en FGF, similar al que se usa para cultivar organoides primarios de tejido gástrico2425. Después de dos rondas de pases, los hFGO mantuvieron la expresión de los marcadores de linaje MUC5AC, MUC6, p Gc y GHRL; sin embargo, no contenían PC y eran refractarios a la inducción de linaje parietal mediada por PD03/BMP4 (Figura 15, c-d). Este hallazgo fue similar a lo que se ha observado en organoides gástricos derivados de células madre adultas, que no producen PC de manera robusta a pesar de derivarse de la mucosa oxíntica auténtica2026. Por tanto, será importante identificar las condiciones que preservan la competencia de las PC en cultivos a largo plazo de hGO y organoides gástricos adultos.

En resumen, el solicitante ha aplicado directamente estudios basados en descubrimientos in vivo e in vitro para la diferenciación de hPSC en un nuevo tipo de tejido. El solicitante ha definido una función novedosa de la señalización de Wnt/p-catenina en especificar el dominio fúndico durante el desarrollo del estómago en ratones, y usó la modulación de Wnt como base mecanicista para dirigir la diferenciación de hPSC en organoides tridimensionales fúndicos humanos. Tanto en ratones como en humanos, la especificación en fondo mediada por Wnt condujo a la posterior formación de PC. Las manipulaciones específicas del fondo en cada etapa de este protocolo de diferenciación dirigida condujeron a una inducción robusta de PC (Figura 13, f). Informes previos identificaron que el factor mesenquimal Barxl actúa indirectamente para reprimir la señalización de Wnt y eso ayuda a prevenir la expresión de genes intestinales en el estómago1415. Dado que el estudio actual identificó una función de Wnt/p-catenina epitelial, y el trabajo previo identificó una vía mesenquimal, parece probable que Wnt/p-catenina pueda tener distintas funciones en el epitelio frente al mesénquima. Por ejemplo, la función mesenquimal de Wnt/p-catenina podría modular otras vías de señalización tales como BMP27, que nuestros datos muestran se sinergiza con Wnt para promover la especificación intestinal a partir del endodermo temprano (Figura 7 y Figura 9, c). Los sistemas organoides gástricos humanos podrían ser útiles, en combinación con modelos animales, para analizar cómo interactúan estas vías de señalización en el mesénquima y el epitelio para coordinar el desarrollo gastrointestinal embrionario temprano.

También faltan las vías que controlan la diferenciación de las células progenitoras gástricas en distintos linajes. El solicitante ha demostrado la utilidad de esta nueva plataforma de hGO para identificar que la señalización de MEK/ERK reprime de forma potente la especificación en células parietales. Consistente con estos hallazgos, la activación transgénica de las vías dependientes de MEK/MAPK condujo a la pérdida de células parietales in vivo2829. Por lo tanto, los hGO son un sistema modelo humano nuevo y manejable para identificar y estudiar los mecanismos de señalización involucrados en la homeostasis celular normal en el fondo y el antro. Además, la regulación aberrante de los programas de desarrollo también puede contribuir a la enfermedad gástrica, ya que la patología del cuerpo/fondo a menudo se asocia con atrofia de las células parietales30'32, histología de tipo antral33 e incluso expresión errónea de Pdx134. Por tanto, el direccionamiento de estas vías podría tener utilidad clínica, ya que Choi y otros demostraron recientemente que la inhibición farmacológica de MEK fue suficiente para restaurar la diferenciación normal de las células parietales en un modelo de ratón de metaplasia35. Adicionalmente, ahora que se han establecido hGO tanto de tipo antral como fúndico, es posible estudiar cómo estos tejidos gástricos humanos interactúan fisiológicamente, responden de manera diferencial a infecciones y lesiones, y responden a tratamientos farmacológicos.

Métodos

Experimentos con ratones

Las siguientes cepas genéticas de ratones se obtuvieron del Laboratorio Jackson, ubicado en la Research Foundation animal facility en el Cincinnati Children's Hospital, y se mantuvieron de acuerdo con el protocolo IACUC (0B09074): Axin2:LacZ (núm. de inventario 009120), shh:Cre (núm. de inventario 005622) y p-cateninflanqueada (núm. de inventario RS 004152). Se usaron apareamientos programados, con la mañana en que se observó el tapón vaginal indicado como E0.5, para generar embriones en diversas etapas que se cosecharon para tinción de preparación completa o disección de tejido. Se analizaron al menos dos camadas de embriones en cada etapa de desarrollo examinada. Se analizaron embriones tanto de hembras como de machos.

Cultivo de células madre pluripotentes

La línea de células madre embrionarias humanas WA01 (HI; obtenida de WiCell) fue suministrada por la Pluripotent Stem Cell Facility en el Cincinnati Children's Hospital Medical Center. La identidad celular se confirmó mediante un análisis repetido en tándem corto (Análisis STR de microsatélite; Applied Biosystems), y las células se sometieron a prueba de forma rutinaria para detectar contaminación por micoplasma (Kit de detección de micoplasma MycoAlert; Lonza). Las células pluripotentes se mantuvieron en condiciones sin alimentador en Matrigel calificado para HESC (BD Biosciences) en medio mTesR1 (Stern Cell Technologies). Las colonias se pasaron cada cuatro días mediante el uso de dispasa (Invitrogen).

Ejemplo de referencia: diferenciación de esferoides del intestino anterior posterior

El protocolo para la diferenciación dirigida de organoides gástricos se adaptó de nuestro protocolo anterior, y la Tabla 1 contiene la lista completa de medios y factores de crecimiento para cada etapa. Para la diferenciación, las hPSC se disociaron en células individuales mediante el uso de acutasa (Stern Cell Technologies) y se sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de aproximadamente 200 000 células por pocillo en mTesR1 con Y-27632 (10 pM; Stemgent). Al día siguiente, las células se diferenciaron en endodermo definitivo (DE) mediante la adición de activina A (100 ng/ml; Cell Guidance Systems) en medio RPMI 1640 (Invitrogen) durante tres días. Los medios también se suplementaron con NEAA (IX; Gibco) y FBS definido (dFBS; Invitrogen) al 0 %, 0,2 % y 2,0 % en los días 1, 2 y 3, respectivamente. Adicionalmente, se añadió BMP4 (50 ng/ml; R&D Systems) el primer día. Posteriormente, DE se diferenció a endodermo del intestino anterior posterior al exponer las células a CHIR99021 (2 pM; Stemgent), FGF4 (500 ng/ml; R&D Systems) y Noggin (200 ng/ml; R&D Systems) durante tres días en RPMI 1640 suplementado con NEAA y dFBS al 2,0 %. Se añadió ácido retinoico (2 pM; Sigma Aldrich) para el último día. El medio se cambió todos los días. Este proceso dio como resultado la formación espontánea de esferoides tridimensionales del intestino anterior posterior.

Cultivo tridimensional de esferoides-organoides gástricos del intestino anterior

Se recolectaron esferoides del intestino anterior posterior y se transfirieron a un sistema de cultivo tridimensional como se describió previamente36. Brevemente, los esferoides se suspendieron en 50 j l de Matrigel (BD Biosciences) y se sembraron como gotas en placas de 24 pocillos. Se permitió que el matrigel se solidificara durante 10 minutos en la incubadora de cultivo de tejidos, después se cubrió con medio intestinal básico (BGM) que contenían factores de crecimiento y/o agonistas de molécula pequeña. BGM consistió en medio DMEM/F12 avanzado (Gibco) suplementado con N2 (IX; Invitrogen), B27 (IX; Invitrogen), HEPES (10 jM ; Gibco), L-glutamina, penicilina/estreptomicina y EGF (100 ng/ml; R&D Systems). Durante los días 6-9, se cultivaron los esferoides con RA y noggin para especificar el linaje antral. Para la especificación fúndica, se añadió CHIR durante esta etapa. Los hGO antrales se cultivaron posteriormente en BGM con solo EGF. Los hGO fúndicos se expusieron continuamente a CHIR del día 6-30. Además, se añadió FGF10 (50 ng/ml; R&D Systems) a los hGO fúndicos del día 20-30, ya que se demostró que potencia la morfogénesis glandular impulsada por CHIR (datos no mostrados). El día 20, se recolectaron los organoides y se volvieron a sembrar en placas a una dilución de 1:10-1:20.

Para los experimentos de tamizaje para identificar los factores que aumentan la diferenciación de las células parietales, los hFGO se cultivaron hasta el día 30, después se expusieron durante dos días a agonistas y antagonistas de las vías de señalización individuales: DAPT (1 jM ; Stemgent), SB431542 (10 jM ; Stemgent), BMP4 (50 ng/ml; R&D Systems), PD0325901 (2 jM ; Stemgent), Gastrina (10 nM; Sigma Aldrich), Dexametasona (50 nM; Sigma Aldrich) y Wnt5a (50 ng/ml; R&D Systems). Después del tratamiento, los hFGO se cultivaron durante dos días más hasta el día 34 y después se analizaron mediante qPCR.

Aislamiento de ARN y qPCR

El ARN total se aisló mediante el uso del kit Nucleospin RNA II (Machery Nagel) y se convirtió en ADNc como se describió previamente7. La qPCR se realizó en Quantstudio 6 (Applied Biosystems) mediante el uso de la mezcla maestra Quantitect SYBR-Green (Qiagen), y las secuencias de los cebadores se enumeran a continuación.

Secuencias de cebador

Los cebadores usados para la qPCR fueron los siguientes:

hATP4A, directo 5'-TGGTAGTAGCCAAAGCAGCC-3', inverso 5'-TGCCATCCAGGCTAGTGAG-3'; hATP4B, directo 5'-ACCACGTAGAAGGCCACGTA-3', inverso 5'-TGGAGGAGTTCCAGCGTTAC-3'; hAXIN2, directo 5'-CTGGTGCAAAGACATAGCCA-3', inverso 5'-AGTGTGAGGTCCACGGAAAC-3'; hCCK, directo 5'-CGGTCACTTATCCTGTGGCT-3', inverso 5'-CTGCGAAGATCAATCCAGCA-3';

hCDX2, directo 5'-CTGGAGCTGGAGAAGGAGTTTC-3', inverso 5'-ATTTTAACCTGCCTCTCAGAGAGC-3'; hCHGA, directo 5'-TGACCTCAACGATGCATTTC-3', inverso 5'-CTGTCCTGGCTCTTCTGCTC-3'; hGAPDH, directo 5'-CCCATCACCATCTTCCAGGAG-3', inverso 5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGACG-3'; hGAST, directo 5'-CAGAGCCAGTGCAAAGATCA-3', inverso 5'-AGAGACCTGAGAGGCACCAG-3'; hGATA4, directo 5'-TCCAAACCAGAAAACGGAAGC-3', inverso 5'-GCCCGTAGTGAGATGACAGG-3'; hGHRL, directo 5'-GCTGGTACTGAACCCCTGAC-3', inverso 5'-GATGGAGGTCAAGCAGAAGG-3';

hGIF, directo 5'-CATTTTCCGCGATATTGTTG-3', inverso 5'-GCACAGCGCAAAAATCCTAT-3';

hIRX2, directo 5'-GTGGTGTGCGCGTCGTA-3', inverso 5'-GGCGTTCAGCCCCTACC-3';

hIRX3, directo 5'-GGAGAGAGCCGATAAGACCA-3', inverso 5'-AGTGCCTTGGAAGTGGAGAA-3';

hIRX5, directo 5'-GGTGTGTGGTCGTAGGGAGA-3', inverso 5'-GCTACAACTCGCACCTCCA-3';

hMIST1, directo 5'-TGCTGGACATGGTCAGGAT-3', inverso 5'-CGGACAAGAAGCTCTCCAAG-3'; hMUC2, directo 5'-TGTAGGCATCGCTCTTCTCA-3', inverso 5'-GACACCATCTACCTCACCCG-3'; hMUC5AC, directo 5'-CCAAGGAGAACCTCCCATAT-3', inverso 5'-CCAAGCGTCATTCCTGAG-3';

hMUC6, directo 5'-CAGCAGGAGGAGATCACGTTCAAG-3', inverso 5'-GTGGGTGTTTTCCTGTCTGTCATC-3'; hPDXI, directo 5'-CGTCCGCTTGTTCTCCTC-3', inverso 5'-CCTTTCCCATGGATGAAGTC-3';

hSCT, directo 5'-GGTTCTGAAACCATAGGCCC-3', inverso 5'-GTCAGGGTCCAACATGCC-3';

hSOX2, directo 5'-GCTTAGCCTCGTCGATGAAC-3', inverso 5'-AACCCCAAGATGCACAACTC-3'; mCdx2, directo 5'-TCTGTGTACACCACCCGGTA-3', inverso 5'-GAAACCTGTGCGAGTGGATG-3'; mGata4, directo 5'-CCATCTCGCCTCCAGAGT-3', inverso 5'-CTGGAAGACACCCCAATCTC-3';

mGapdh, directo 5'-TTGATGGCAACAATCTCCAC-3', inverso 5'-CGTCCCGTAGACAAAATGGT-3';

mIrxl, directo 5'-AATAAGCAGGCGTTGTGTGG-3', inverso 5'-CTCAGCCTCTTCTCGCAGAT-3';

mIrx2, directo 5'-AGCTGGTATGGATAGGCCG-3', inverso 5'-GGCTTCCCGTCCTACGTG-3';

mIrx3, directo 5'-ATAAGACCAGAGCAGCGTCC-3', inverso 5'-GTGCCTTGGAAGTGGAGAAA-3';

mIrx5, directo 5'-GGAGTGTGGTCGTAGGGAGA-3', inverso 5'-GCTACAACTCGCACCTCCA-3';

mPdxl, directo 5'-ACGGGTCCTCTTGTTTTCCT-3', inverso 5'-TGGATGAAATCCACCAAAGC-3';

mPitxl, directo 5'-GTCCATGGAGGTGGGGAC-3', inverso 5'-GCTTAGGCGCCACTCTCTT-3';

mSox2, directo 5'-AAAGCGTTAATTTGGATGGG-3', inverso 5'-ACAAGAGAATTGGGAGGGGT-3'; mTrp63, directo 5'- AGCTTCTTCAGTTCGGTGGA-3', inverso 5'-CCTCCAACACAGATTACCCG-3'.

Tinción inmunofluorescente

Los tejidos se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante la noche a 4 °C y después se lavaron minuciosamente en PBS. Para la tinción inmunofluorescente de preparación completa, los embriones se procesaron como se describió previamente37. Brevemente, se permeabilizaron en Dent's Bleach (4:1:1 EtOH: DMSO: H2O2 al 30 %) durante dos horas a temperatura ambiente y se rehidrataron a través de una serie de lavados con metanol. Después, los embriones se bloquearon durante una hora, se incubaron en el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C, se lavaron en PBS, se incubaron en el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C y se lavaron minuciosamente. Para la inclusión en parafina, los tejidos se deshidrataron a través de una serie de lavados con etanol, se lavaron con xileno y después se incluyeron en parafina. Para la tinción, las láminas portaobjetos se desparafinizaron y rehidrataron. La recuperación del antígeno se realizó en tampón de citrato durante 45 minutos en vaporera. Los anticuerpos primarios se incubaron durante la noche a 4 °C. Seguido del anticuerpo primario, las láminas portaobjetos se lavaron en PBS y después se incubaron con el anticuerpo secundario (a una dilución de 1:500) durante una hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos secundarios (Jackson ImmunoResearch Laboratories) se fabricaron en burro y se conjugaron con Alexa Fluor 488, 594 o 647.

Anticuerpos primarios

Los anticuerpos usados para la tinción inmunofluorescente se enumeran con el antígeno, la especie huésped, el fabricante y el número de catálogo, y la dilución usada para la tinción. Atp4b, conejo, Santa Cruz sc84304, 1:500; Cdh1, cabra, R&D Systems AF648, 1:500; Cdh1, ratón, BD Biosciences 610182, 1:500; Cdx2, ratón, Biogenex MU392A, 1:500, Cldn18, conejo, Sigma HPA018446, 1:200; Ctnnb1, conejo, Santa Cruz sc7190, 1:100; FoxF1, cabra, R&D Systems F4798, 1:500, Gastrina, conejo, Dako A0568, 1:1000; Gata4, cabra, Santa Cruz sc1237, 1:200; Gif, conejo, Sigma HPA040774, 1:100; Ghrl, cabra, Santa Cruz sc10368, 1:200; Histamina, conejo, Immunostar 22939, 1:1000; Krt8, rata, DSHB troma-1-s; 1:100; Mist1, conejo, Sigma HPA047834, 1:200; Muc5ac, ratón, Abcam ab3649, 1:500; Muc6, ratón, Abcam ab49462, 1:100; Pdxl, cabra, Abcam ab47383, 1:5000; Pgc, oveja, Abcam ab31464, 1:10000; Sst, cabra, Santa Cruz sc7819, 1:100; Syp, conejillo de indias, Synaptic Systems 101004, 1:1000; Vimentina, cabra, Santa Cruz sc7557, 1:200

Obtención de imágenes

La obtención de imágenes confocales se realizó en un microscopio confocal invertido Nikon AlRsi. Para la obtención de imágenes de preparación completa, los embriones se deshidrataron en metanol y se aclararon en aclarador de Murray (benzoato de bencilo: alcohol bencílico 2:1) justo antes de la obtención de imágenes. Después de la tinción, los portaobjetos se montaron con Fluoromount G (SouthernBiotech) y se secaron al aire durante la noche a temperatura ambiente.

Microscopio electrónico de transmisión

Para TEM, los hGO se procesaron como se describió previamente7. Brevemente, los organoides se fijaron en glutaraldehído al 3 %, se lavaron en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M y se incubaron durante una hora con tetróxido de osmio al 4 %. Posteriormente se lavaron, después se deshidrataron en series de etanol y finalmente se incluyeron en óxido de propileno/LX112. Después, se seccionó el tejido y se tiñó con acetato de uranilo al 2 % seguido de citrato de plomo. Las imágenes se visualizaron en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi.

ELISA de pepsinógeno

El ELISA se realizó mediante el uso del kit de ELISA de pepsinógeno humano I (PGI) (Thermo Scientific, EHPGI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, los hGO del día 34 se recolectaron y se incubaron en solución de recuperación de células (Corning) durante una hora a 4 °C y después se lavaron en PBS. Los organoides se lisaron con tampón RIPA seguido de agitación enérgica a alta velocidad durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los lisados se sedimentaron y el sobrenadante se recolectó y se almacenó a -80 °C. Para el ELISA, las muestras y los estándares se realizaron en réplicas técnicas. Las reacciones se midieron en un lector de placas de microplacas jQuant (Bio Tek). Se midió la absorbancia a 450 nm y se restó la absorbancia a 570 nm.

Ensayos de secreción de ácido

Los ensayos de secreción de ácido se realizaron como se describió previamente (Schumacher y otros, 2015). Los hGO se cultivaron en el cubreobjetos de vidrio con cámara (Thermo Scientific) y la cámara se colocó en un microscopio confocal invertido (Zeiss LSM 710), y los experimentos se realizaron en condiciones de CO2 al 5 % y 37 °C (cámara de incubación, PeCon, Erbach, Alemania).

Se incubaron glándulas fúndicas gástricas de ratón recién aisladas o hGO cultivados con naranja de acridina (10 ^j M), después se excitó la fluorescencia de naranja de acridina a 458 nm o 488 nm y se recolectaron imágenes a 600-650 nm (rojo) o 500-550 nm (verde), respectivamente. Por otro lado, para monitorear el pH luminal de los hGO, se microinyectó (46-92 nl) el colorante sensible al pH radiométrico, 5-(y-6)-carboxi SNARF-5F (solución madre 5 mM: EX 560 nm, EM 565-605 (Verde) y 620-680 (Rojo) nm: Invitrogen) en el lumen y se monitoreó. También se añadió colorante fluorescente al medio. Se añadió histamina (100 ^j M; Sigma) al medio, mientras que famotidina (100 ^j M; Sigma) u omeprazol (100 j M; Sigma) se preincubaron al menos 30 min antes que la histamina. Las imágenes se analizaron mediante el uso del programa informático MetaMorph (Molecular Devices, Downingtown, PA). Los valores de relación de 620-680/565-605 nm con corrección del fondo se convirtieron a pH mediante el uso de una curva estándar.

Análisis estadístico

La significancia estadística se determinó mediante el uso de la prueba T de Student no pareada o ANOVA unidireccional con la prueba post-hoc de comparaciones múltiples de Dunnett. Se consideró significativo un valor de p <0,05.

Estadísticas y reproducibilidad experimental

No se usó ningún análisis estadístico para determinar el tamaño de la muestra experimental, no se usó ningún método específico de aleatorización y los investigadores no trabajaron a ciegas durante los experimentos. Los métodos estadísticos y las medidas se describen en las leyendas de las figuras. El protocolo para la diferenciación de los hGO fúndicos se completó con éxito >20 veces por siete usuarios independientes en el laboratorio. En todos los casos, los datos mostrados se derivan de un solo experimento que es representativo de múltiples experimentos.

Combinaciones ilustrativas

Los siguientes ejemplos se refieren a diversas formas no exhaustivas en las que pueden combinarse o aplicarse las enseñanzas de la presente descripción. Debe entenderse que los siguientes ejemplos no pretenden restringir la cobertura de cualquier reivindicación que pueda presentarse en cualquier momento en esta solicitud o en presentaciones posteriores de esta solicitud. No se pretende descargo de responsabilidad. Los siguientes ejemplos se proporcionan únicamente con propósitos simplemente ilustrativos. Se contempla que las diversas enseñanzas de la presente descripción pueden organizarse y aplicarse de muchas otras formas. También se contempla que algunas variaciones pueden omitir ciertas características a las que se hace referencia en los ejemplos a continuación. Por lo tanto, ninguno de los aspectos o características a los que se hace referencia a continuación debe considerarse crítico a menos que los inventores o un sucesor en interés de los inventores lo indiquen explícitamente de cualquier otra manera en una fecha posterior. Si se presenta cualquier reivindicación en esta solicitud o en presentaciones posteriores relacionadas con esta solicitud que incluyan características adicionales más allá de las que se refieren a continuación, no se presumirá que esas características adicionales se han añadido por ninguna razón relacionada con la patentabilidad.

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Todos los porcentajes y relaciones se calculan en peso a menos que se indique de cualquier otra manera.

Todos los porcentajes y relaciones se calculan basado en la composición total a menos que se indique de cualquier otra manera.

Debe entenderse que cada limitación numérica máxima dada a lo largo de esta memoria descriptiva incluye cada limitación numérica inferior, como si dichas limitaciones numéricas inferiores estuvieran expresamente escritas en la presente descripción. Cada limitación numérica mínima dada a lo largo de esta memoria descriptiva incluirá cada limitación numérica más alta, como si dichas limitaciones numéricas más altas estuvieran expresamente escritas en la presente descripción. Cada intervalo numérico dado a lo largo de esta memoria descriptiva incluirá cada intervalo numérico más estrecho que se encuentre dentro de dicho intervalo numérico más amplio, como si dichos intervalos numéricos más estrechos estuvieran todos expresamente escritos en la presente descripción.

Las dimensiones y los valores descritos en la presente descripción no deben entenderse estrictamente limitados a los valores numéricos exactos mencionados. En cambio, a menos que se especifique de cualquier otra manera, se pretende que cada dimensión signifique tanto el valor mencionado como un intervalo funcionalmente equivalente que rodea ese valor. Por ejemplo, una dimensión descrita como "20 mm" pretende significar "aproximadamente 20 mm". La cita de cualquier documento no es una admisión de que es un estado de la técnica con respecto a cualquier invención descrita o reivindicada en la presente descripción o que solo, o en combinación con cualquier otra referencia

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para inducir la formación de un tejido del fondo gástrico, en donde el tejido del fondo gástrico es un tipo fúndico de epitelio gástrico que se encuentra en el cuerpo que contiene tipos de células fúndicas, lo que incluye, pero no se limita a, células parietales productoras de ácido y células principales productoras de proteasa, que comprende las etapas de:

a) poner en contacto una célula de endodermo definitivo (DE) de mamífero adherente con un activador de la vía de señalización de wnt, un activador de la vía de señalización de FGF, un inhibidor de la vía de señalización de BMP y ácido retinoico, durante un primer período;

en donde el activador de la vía de señalización de wnt es CHIR99021; el activador de la vía de señalización de FGF es FGF4; y el inhibidor de la vía de señalización de BMP es Noggin;

en donde dicho primer período es de tres días ± 24 horas y en donde dicho ácido retinoico se añade durante el tercer día del primer período ± 24 horas para formar un esferoide tridimensional del intestino anterior posterior en suspensión a partir de dicho endodermo definitivo adherente;

b) suspender dicho esferoide tridimensional del intestino anterior posterior en una matriz de membrana basal con un factor de crecimiento, dicho activador de la vía de señalización de wnt, un activador de la vía de señalización de EGF, dicho inhibidor de la vía de señalización de BMP y ácido retinoico durante un segundo período, en donde dicho segundo período es de tres días ± 24 horas para inducir un linaje fúndico que comprende organoides gástricos humanos fúndicos (hFGO) suspendidos en la matriz de membrana basal, y en donde el activador de la vía de señalización de EGF es EGF;

c) cultivar dichos hFGO de la etapa b) con dicho activador de la vía de señalización de wnt y dicho activador de la vía de señalización de EGF durante un tercer período que es de 11 días ± 24 horas;

d) cultivar dichos hFGO de la etapa c) con dicho activador de la vía de señalización de wnt, dicho activador de la vía de señalización de EGF y FGF 10 durante un cuarto período que es de 10 días ± 24 horas;

e) poner en contacto dichos hFGO de la etapa d) con el inhibidor de MEK PD0325901 durante un quinto período, en donde dicho quinto período es un período de dos días ± 24 horas para formar dicho tejido del fondo gástrico que comprende un tipo de célula fúndica funcional.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la etapa e) comprende además la etapa de poner en contacto dichos organoides gástricos humanos fúndicos con BMP4.

3. El método de la reivindicación 1, en donde dicho tipo de célula fúndica funcional es una célula parietal que expresa proteínas de bomba de protones y secreta ácido.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho tipo de célula fúndica funcional es una célula principal que secreta pepsinógeno.

5. El método de la reivindicación 1, en donde los hFGO de la etapa e) desarrollan epitelio SOX2+GATA+PDX1-.

6. El método de la reivindicación 1, en donde los hFGO de la etapa e) comprenden la expresión estable de los marcadores de linaje MUC5AC, MUC6, PGC y GHRL.

7. El método de la reivindicación 1, en donde dicho endodermo definitivo se deriva de una célula precursora seleccionada de una célula madre embrionaria, una célula germinal embrionaria o una célula madre pluripotente inducida.

8. El método de la reivindicación 1, en donde dicho endodermo definitivo se deriva de poner en contacto una célula madre pluripotente con activina A.

9. Una composición que comprende un hFGO producido de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde dicho hFGO se caracteriza por:

a) estar libre de inervación y/o vasos sanguíneos,

b) regulación positiva de ATP4A y ATP4B, y

c) comprender células parietales que expresan proteínas de bomba de protones y secretan ácido.