CN105378064B - 向生物学组织赋予血管系统的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在体外向生物学组织赋予血管系统的方法，其包括将生物学组织与血管细胞及间质细胞共培养。由上述方法被赋予血管系统的生物学组织。组织或器官的制作方法，其包括将上述生物学组织移植到非人动物，分化为血管网构建的组织或器官。组织或器官的再生或功能恢复方法，其包括将上述生物学组织移植到人或非人动物，分化为血管网构建的组织或器官。非人嵌合体动物的制作方法，其包括将上述生物学组织移植到非人动物，分化为血管网构建的组织或器官。评价药剂的方法，其使用选自上述生物学组织、由上述方法制作的组织及器官、以及由上述方法制作的非人嵌合体动物的至少1个。再生医疗用组合物，其含由上述方法赋予血管系统的生物学组织。
Description
【技术领域】
本发明涉及向生物学组织赋予血管系统的方法，更具体而言涉及从自多能性干细胞等诱导的组织或自个体分离的正常组织或癌组织等的组织，制作有血管网的三维组织的方法。
【背景技术】
近年，关注利用自个体分离的正常/癌组织或自多能性干细胞诱导的组织实现用于开发新的药品的药物开发筛选或弥补缺失的器官的功能的再生医疗。
作为从多能性干细胞等诱导三维组织的尝试，在肝脏、胰腺或神经等的区域中，形成球形状的小型组织，进行细胞的分化诱导的研究被报告(非专利文献1：Takayama K,etal.Biomaterials.2013 Feb；34(7)：1781-9；非专利文献2：Saito H,et al.PLoSONE.2011；6(12)：e28209；非专利文献3：Eiraku M,et al.Nature 2011、472,51-56)。但是，用任何方法诱导的组织均不存在血管结构。血管结构在移植后，不仅有将对于组织生存必要的氧及营养素等送达组织内部的作用，(即使是内部流入血液以前也)再现伴随血管的三维的组织结构或细胞极性被认为对于细胞的分化－增殖－维持重要。从而，无血管的组织在简单移植后，不仅不定着而内部坏死，达不成伴随血管化的组织的成熟化，难以发挥充分的功能。
从而，以向三维的组织附加血管结构作为目的，考虑了将自个体分离的胰岛等的组织接种到载体(支架材料)，进行与血管内皮细胞或成纤维细胞等共培养的方法等(非专利文献4：Kaufman-Francis K,et al.PLoS ONE 2012、7(7)：e40741)。
但是，存在由支架材料的空间的配置的制约而细胞行为受大的影响，构建如活体组织一样的精密的结构变待困难，适当的细胞间的相互作用不再现。从而，由于组织中的细胞的成熟或增殖被抑制，或功能性的血管网的再构成延迟而发生了移植后的定着差的等的问题。再者，在移植等中使用时，支架材料发生异物反应，导致炎症等也被认为是大的问题。
如上所述，在推定产业应用或再生医疗应用时，尽管期望具备血管网的三维组织的再构建，但现状是，不依赖于支架材料，在体外使用组织构建具备血管的组织体的方法尚未确立。
【现有技术文献】
【非专利文献】
非专利文献1：Takayama K,et al.Biomaterials.2013 Feb；34(7)：1781-9。
非专利文献2：Saito H,et al.PLoS ONE.2011；6(12)：e28209
非专利文献3：Eiraku M,et al.Nature 2011、472,51-56
非专利文献4：Kaufman-Francis K,et al.PLoS ONE 2012、7(7)：e40741
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
为了旨在对肝脏－胰腺－肾脏－肠道－肺脏等的疾病的药品开发或再生医疗的实现，再现伴随血管化的三维的组织结构或细胞极性是必须的。即，为了最大化自多能性干细胞诱导的组织或自个体分离的组织的功能，使血管网的再构建成为可能的三维组织体的形成是必要的。
另一方面，本发明人通过活用不同的细胞谱系统之时空的相互作用，确立实现“基于器官的再构成的器官细胞的分化诱导”的革新性的三维培养技术(Nature,499：481-484,2013、WO2013/047639：组织及器官的制作方法)。即，通过再现化对于器官发生的初期过程必须的器官细胞和血管细胞和间质细胞的细胞间相互作用而诱导立体的器官的原基(器官的种)，确立使有血管网的功能性的器官的创造成为可能的基础技术。但是，在本法中，以器官细胞作为对象，通过使用小型组织(组织)，可创造有血管网的三维组织原基是未被解明的。
本发明旨在提供以组织作为对象，不依赖于支架材料，在体外构建具备血管的组织体的方法。
【解决课题的技术方案】
本发明人发现，通过成为器官的基元的器官细胞与血管内皮细胞及间质细胞具有密的细胞间相互作用，进行自律性的组织结构的构建和伴随细胞分化的立体组织形成(Nature,499：481-484,2013、WO2013/047639：组织及器官的制作方法)。但是，以组织作为对象，血管网的附加可能尚不明了。
本发明通过人为地再现这样的器官发生的早期过程，以组织作为对象，为了在试管内人为地制作伴随血管网的立体组织而进行了尝试。再者，通过向活体内移植在培养系统中诱导的立体组织而使血流开始，进行附加可实现组织功能的成熟－维持的血管系统的立体组织的制成。
本发明人将自个体分离的组织(至10～3,000μm左右)或自多能性干细胞诱导的组织(至10～3,000μm左右)以适宜的混合比率与血管细胞及间质细胞共培养。在立体组织的诱导中采用下述的方法。
1.在基质胶等的支持体上，通过共培养组织和血管－间质细胞，形成三维组织。
2.通过在底面细胞集合的形状的板上共培养组织和血管－间质细胞，形成三维组织。
通过由上述记载的方法进行短期间培养，可在试管内诱导附加微小血管结构的立体性的组织。
再者，通过向活体内移植在培养系统中诱导的立体组织，通过诱导功能性的血管网的再构成而使血液灌流开始，成功制作有与成体组织同等的高度有秩序的组织结构的组织－器官。
通过如此组织，尝试诱导由细胞间相互作用的自律性的组织化，组织－器官的三维的再构建的方法在过去不存在，被认为是新颖性极其高的方法。
本发明的要点如下。
(1)在体外向生物学组织赋予血管系统的方法，其包括将生物学组织与血管细胞及间质细胞共培养。
(2)(1)所述的方法，其不使用支架材料，将生物学组织与血管细胞及间质细胞共培养。
(3)(1)或(2)所述的方法，其通过将生物学组织与血管细胞及间质细胞共培养，向生物学组织赋予血管系统，生物学组织的功能维持及/或升高。
(4)生物学组织，其由(1)～(3)之任一项所述的方法被赋予血管系统。
(5)组织或器官的制作方法，其包括将(4)所述的生物学组织移植到非人动物，分化为血管网构建的组织或器官。
(6)组织或器官的再生或功能恢复方法，其包括将(4)所述的生物学组织移植到人或非人动物，分化为血管网构建的组织或器官。
(7)非人嵌合体动物的制作方法，其包括将(4)所述的生物学组织移植到非人动物，分化为血管网构建的组织或器官。
(8)评价药剂的方法，其使用选自(4)所述的生物学组织、由(5)所述的方法制作的组织及器官、以及由(7)所述的方法制作的非人嵌合体动物的至少1个。
(9)再生医疗用组合物，其含(4)所述的生物学组织。
(10)(9)所述的组合物，其为了制作组织或器官而使用。
(11)(9)所述的组合物，其为了进行组织或器官的再生或功能恢复而使用。
(12)(9)～(11)之任一项所述的组合物，其被移植到活体后，生物学组织分化为有血管网的组织或器官。
由本发明，对于从个体分离的正常组织或癌组织、自多能性干细胞等诱导的组织等，通过在适宜的环境下进行血管细胞和间质细胞的共培养，在试管内构建赋予血管网的立体性的组织体变得可能。通过赋予对于组织的成熟－维持－修复等必须的血管网，再构建高功能性的组织，期待成为用于制造对于药物开发筛选或再生医疗有益的组织体的基础技术。
以往、从多能性干细胞由分化诱导得到的组织体与构成成体组织的功能细胞比较止于未成熟的分化阶段。这是囡为，在以往的分化诱导法中功能细胞的终末分化未被诱导。
由本发明，被附加血管网的组织变得可再构建，期待人功能细胞的终末分化的诱导法的确立(例如，对血管结构的细胞极性的再构成等)、从而作为人功能细胞的创造技术价值高。
另一方面，自个体提取的器官来源的组织，分离后立即功能显著地降低，难以维持它们。由本发明，通过向组织赋予血管网，达成功能的升高－维持，则有可对于由于不存在血管系统，由以往的组织移植医疗效果不充分的患者(例如胰岛移植治疗等)、提供有飞跃性的治疗效果的移植方法的可能性。另外，将各种各样的器官的功能在试管内、乃至，在活体内最大化变得可能，从而在进行药物开发筛选之上，期待成为有益的基础技术。
再者，由本发明再构建有血管系统的立体性的人组织结构体是可能的。从而，用至今的技术完全达不成的，制作血管系统适宜地配置的有血流的组织－器官变得可能。由此，期待可提供评价药剂的效果表达和血管的关联性等，在现存的评价系统中解析困难的，药品的效果的完全新的解析系统。
另外，作为对通过具有器官细胞和血管内皮细胞及间质细胞的密切的细胞间相互作用，进行自律性的组织结构的构建和伴随细胞分化的立体组织形成的方法(Nature,499：481-484,2013，WO2013/047639)的显著性，可举例如下。
1.向由扩增困难的细胞(例如胰腺β细胞、肾肾小球上皮－尿细管上皮细胞、肝细胞、肠道上皮细胞、肺胞上皮细胞、肿瘤细胞、营养外胚层细胞、iPS细胞来源内胚层细胞、iPS细胞来源中胚层细胞、iPS细胞来源外胚层细胞、iPS细胞来源组织干－前体细胞等)构成的组织(例如，胰岛、肾肾小球、肝组织、肠道阴窝、肺胞、肿瘤组织、营养外胚层组织、iPS细胞来源内胚层细胞来源球形、iPS细胞来源中胚层细胞来源球形、iPS细胞来源外胚层细胞来源球形、iPS细胞来源组织干－前体细胞来源球形等))也可赋予血管系统。
2.可向更大的组织赋予血管系统。可由Nature,499：481-484,2013、WO2013/047639的方法制作的组织仅是在使用单离的细胞时，但用本申请发明的方法，确认可向10～3,000μm左右的大小的组织(不是细胞)赋予血管系统。
3.通过向iPS细胞等的干细胞来源的小型的组织赋予血管系统，可再现与活体组织的发生过程类似的环境，可达成有效地向构成作为目的的组织的功能细胞的分化诱导。
【发明效果】
由本发明，通过将从个体分离的正常组织或癌组织、自多能性干细胞等诱导的组织与血管细胞和间质细胞共培养，在试管内构建赋予血管网的立体性的组织体变得可能。由此技术，向人功能细胞的创造、器官移植、药物开发筛选、评价药剂的效果表达和血管的关联性等的新的解析系统等的应用是可能的。
本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请、特愿2013-153056的说明书及/或附图中记载的内容。
【附图说明】
【图1A】显示向胰岛组织的血管网的赋予。(A)使用LIVE/DEAD(注册商标)细胞成像试剂盒的小鼠胰岛用培养基的验证(绿：活细胞、红：死细胞)。
【图1B】显示向胰岛组织的血管网的赋予。(B)(A)的定量数据。
【图1C】显示向胰岛组织的血管网的赋予。(C)使用小鼠胰岛(无色)、血管内皮细胞(绿)、间质干细胞(红)的3维组织构建过程时间推移成像。
【图1DE】显示向胰岛组织的血管网的赋予。(D)培养24小时后的小鼠胰岛。(E)共培养24小时后的小鼠胰岛、血管内皮细胞、间质干细胞。(E’)(E)中创造的3维组织的免疫组织学解析(绿：胰岛素、红：人CD31)。
【图1F】显示向胰岛组织的血管网的赋予。(F)使用LIVE/DEAD(注册商标)细胞成像试剂盒的小鼠胰岛细胞的生死判断(绿：活细胞、红：死细胞)。
【图1G】显示向胰岛组织的血管网的赋予。(G)(F)的定量数据。
【图1H】显示向胰岛组织的血管网的赋予。(H)从进行共培养的小鼠胰岛的胰岛素释放浓度的增强。
【图1I】显示向胰岛组织的血管网的赋予。(I)试管内的糖装载试验。
【图1J-1】显示向胰岛组织的血管网的赋予。(J-1)由与血管内皮细胞及间质干细胞的共培养而表达显著地增强的基因组。
【图1J-2】显示向胰岛组织的血管网的赋予。(J-2)(J-1)的续。
【图1J-3】显示向胰岛组织的血管网的赋予。(J-3)(J-2)的续。
【图2A】显示小型血管化胰岛的制作。(A)使用如在底面组织集合的培养基材的小型血管化胰岛的自律的形成(变更小鼠胰岛数时也形成血管化组织)。
【图2B】显示小型血管化胰岛的制作。(B)血管内皮细胞数、间质干细胞数的条件探讨。
【图2C】显示小型血管化胰岛的制作。(C)小型血管化胰岛形成过程时间推移成像(由共培养的细胞的形态变化、小鼠胰岛(青)、血管内皮细胞(绿)、间质干细胞(红))。
【图2D】显示小型血管化胰岛的制作。(D)制作的小型血管化胰岛、小鼠胰岛(红)、血管内皮细胞(绿)、间质干细胞(无色)。
【图2E】显示小型血管化胰岛的制作。(E)小型血管化胰岛的组织学解析、小鼠胰岛(红)、血管内皮细胞(绿)、间质干细胞(无色)、小鼠CD31(青)。
【图3AB】显示由血管化组织的移植的功能的验证。(A)血管化胰岛移植部位的宏观成像(黄色的箭头显示血液的流入)。(B)胰岛单体移植部位(对照组)的宏观成像。
【图3CD】显示由血管化组织的移植的功能的验证。(C)向血管化胰岛内部的血液回流、小鼠胰岛(绿)、血管内皮细胞(无色)、间质干细胞(无色)、葡聚糖(红)。(D)向移植胰岛周围的血液回流、小鼠胰岛(绿)、血管内皮细胞(无色)、间质干细胞(无色)、葡聚糖(红)。
【图3E】显示由血管化组织的移植的功能的验证。(E)向使用糖尿病模型小鼠的肾被膜下的血管化胰岛移植、血糖推移。
【图3F】显示由血管化组织的移植的功能的验证。(F)糖尿病模型小鼠的血糖推移。
【图3G】显示由血管化组织的移植的功能的验证。(G)糖尿病模型小鼠的体重推移。
【图3H】显示由血管化组织的移植的功能的验证。(H)糖尿病模型小鼠的生存率。
【图3I】显示由血管化组织的移植的功能的验证。(I)活体内的糖装载试验。
【图3JK】显示由血管化组织的移植的功能的验证。(J)向CW移植的血管化胰岛的组织学解析。(K)向CW移植的胰岛的组织学解析。
【图3L】显示由血管化组织的移植的功能的验证。(L)向肾被膜下移植的血管化胰岛的组织学解析、胰岛素(绿)、层粘连蛋白(红)、DAPI(青)。
【图3M】显示由血管化组织的移植的功能的验证。(M)向肾被膜下移植的胰岛的组织学解析、胰岛素(绿)、层粘连蛋白(红)、DAPI(青)。
【图4】显示向肾肾小球的血管网的赋予。(A)使用24孔皿的小鼠肾肾小球、血管内皮细胞、间质干细胞来源3维组织的自律的形成。(B)使用如在底面细胞集合的培养基材的小鼠肾肾小球、血管内皮细胞、间质干细胞来源3维组织的自律的形成(使用小鼠肾肾小球(绿)、血管内皮细胞(红)、间质干细胞(青)的3维组织时间推移成像)。(C)使用24孔皿的培养24小时后血管化的三维小鼠肾肾小球组织的肉眼像。(D)使用96孔皿的培养24小时后血管化的三维小鼠肾肾小球组织的肉眼像。(E)血管化肾肾小球移植部位的血管化及植活的确认。(F)血管化肾肾小球移植部位的活体成像(小鼠肾肾小球(红)、人血管内皮细胞(绿)、小鼠血管内皮细胞(青))。
【图5】显示向肿瘤组织的血管网的赋予。(A)使用24孔皿的人胰腺肿瘤组织(红)、血管内皮细胞(绿)、间质干细胞(无色)来源3维组织的自律的形成。(B)使用24孔皿的培养24小时后的自小鼠胰腺癌组织、血管内皮细胞、间质干细胞自律性地形成的3维组织的推移成像。(C)由血管化组织的形成的癌干细胞标志物(CD44)的表达增强。
【图6】显示向肝组织的血管网的赋予。(A)小鼠肝组织(绿)、血管内皮细胞(红)、间质干细胞(无色)来源3维组织形成过程时间推移成像。(B)使用细胞在底面集合的培养基材的小鼠肝组织(绿)、血管内皮细胞(红)、间质干细胞(无色)来源3维组织的自律的形成。(C)血管化肝组织移植部位的宏观成像。(D)在血管化肝组织内部的血管系统的再构成。
【图7】显示向肠组织的血管网的赋予。(A)使用小鼠肠组织(红)、血管内皮细胞(绿)、间质干细胞(无色)的3维组织形成过程时间推移成像。(B)使用细胞在底面集合的培养基材的肠组织(红)、血管内皮细胞(绿)、间质干细胞(无色)来源3维组织的自律的形成。(C)血管化肠组织移植部位的宏观成像。(D)血管化肠组织移植部位的体内活体成像(小鼠肠组织(红)、血管内皮细胞(绿)、间质干细胞(无色))。
【图8】显示向肺组织的血管网的赋予。(A)使用小鼠肺组织(红)、血管内皮细胞(绿)、间质干细胞(无色)的3维组织的自律的形成。(B)血管化肺组织移植部位的宏观成像。(C)血管化肺组织移植部位的体内活体成像(小鼠肺组织(红)、血管内皮细胞(绿)、间质干细胞(无色)、小鼠CD31(青))。
【图9】显示向iPS细胞来源内胚层组织的血管网的赋予。(A)向人iPS细胞来源内胚层细胞球形的应用方法概略。(B)使用人iPS细胞来源小型内胚层组织、血管内皮细胞、间质干细胞的3维组织的自律的形成。(C)自人iPS细胞来源小型内胚层组织(无色)、血管内皮细胞(红)、间质干细胞(无色)构建的3维组织的荧光图像观察。
【实施方式】
以下，详细地说明本发明。
本发明提供在体外向生物学组织赋予血管系统的方法，其包括将生物学组织与血管细胞及间质细胞共培养。
在本说明书中，“生物学组织”是指由多个细胞构建的结构体，可例示从个体分离的正常－异常组织或癌组织、自多能性干细胞(人工多能性干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)等)、组织干－前体细胞、分化细胞等诱导的组织)等。生物学组织可主要使用人来源的，但也可使用人以外的动物(例如，用于实验动物、伴侣动物、使役动物、赛马、斗犬等的动物、具体而言，小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾、蟹等)来源的生物学组织。
在本说明书中，“血管系统”是指由血管内皮细胞及其支持细胞构成的结构，血管系统不仅维持组织，在其成熟化过程中也担负重要的作用。血管结构在移植后，认为不仅有将对于组织生存必要的氧及营养素等送达组织内部的作用，(即使在血液流入内部以前，也)再现伴随血管的三维的组织结构或细胞极性对于细胞的分化－增殖－维持重要。从而，无血管的组织，在简单移植后，不仅不定着而内部坏死，还达不成伴随血管化的组织的成熟化，难以发挥充分的功能。
在本说明书中，“赋予血管系统”及“血管化”是指由血管内皮细胞及支持细胞组成的血管系统与作为对象的组织直接统合，将赋予血管系统的生物学组织移植到活体，则观察到血管的成熟化，与宿主血管连接，血管灌流开始，向有血管网的功能性的组织－器官的诱导变得可能。
血管细胞可自血管组织分离，但不限于自血管组织分离的细胞，也可为自iPS细胞或ES细胞等的有全能性或多能性的细胞分化诱导的。作为血管细胞，优选为血管内皮细胞，在本说明书中，“血管内皮细胞”是指构成血管内皮的细胞、或者可分化为那样的细胞的细胞(例如，血管内皮前体细胞、血管内皮干细胞等)。某细胞是不是血管内皮细胞，可通过研究标志物蛋白质、例如TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、CD31表达与否来确认(上述标志物蛋白质之任何一个或多个表达则可判断为血管内皮细胞)。另外，作为血管内皮前体细胞的标志物，有c-kit、Sca-1等被报告，由这些标志物的表达，可确认是血管内皮前体细胞(SFang，et al.PLOS Biology.2012；10(10)：e1001407.)。在本领域技术人员间使用的用语之中，内皮细胞、脐静脉内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞、血管性祖细胞、成血管细胞(HJ.Joo,et al.Blood.25；118(8)：2094-104.(2011))等包含在本发明中的血管内皮细胞中。血管细胞主要使用人来源的，但也可使用人以外的动物(例如，用于实验动物、伴侣动物、使役动物、赛马、斗犬等的动物、具体而言，小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾、蟹等)等的动物来源的血管细胞。血管细胞自脐带血、脐带血管、新生儿组织、肝脏、大动脉、脑、骨髓、脂肪组织等得到。
在本说明书中，“间质细胞”是指主要是存在于中胚层来源的结缔组织，形成在组织中发挥功能的细胞的支持结构的结缔组织细胞，决定向间质细胞的分化命运，但也含尚未向间质细胞分化的细胞的概念。在本发明中使用的间质细胞可为分化细胞，也可为未分化细胞，但优选为使用未分化间质细胞。某细胞是否是未分化间质细胞可通过研究标志物蛋白质、例如Stro-1、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD133、CD271、Nestin表达与否来确认(上述标志物蛋白质之任何一个或多个表达，则可判断为未分化间质细胞。)。另外，不表达前项的标志物之任何的间质细胞可判断为分化间质细胞。在本领域技术人员间使用的用语之中，间质干细胞、间质祖细胞、间质细胞(R.Peters,et al.PLoS One.30；5(12)：e15689.(2010))等含在间质细胞中。间质细胞主要使用人来源的，但也可使用人以外的动物(例如，用于实验动物、伴侣动物、使役动物、赛马、斗犬等的动物、具体而言，小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾、蟹等)来源的间质细胞。
与血管细胞及间质细胞共培养的生物学组织的大小可为10～500μm左右的大小，但不限于此。优选为100～300μm左右的大小，更优选为100～150μm左右的大小。
共培养中使用的血管细胞和间质细胞各自是，每1个150μm左右的大小的生物学组织，可为2×102～1×105个左右，优选为2×102～5×104个左右，更优选为1×104个左右。
共培养中的血管细胞和间质细胞的培养比只要是在向生物学组织赋予血管系统的范围内，就不特别限定，但适宜的细胞的数比是血管细胞:间质细胞＝10～3:3～1。
共培养中的生物学组织的数只要是在向生物学组织赋予血管系统的范围内，就不特别限定，但作为适宜的组织数，对于1×104个血管细胞及间质细胞的混合物，直径100～150μm左右的大小的生物学组织是1～100个。
另外，血管细胞和间质细胞之任何一方或两方也可用自血管细胞分泌的因子、自间质细胞分泌的因子、通过血管细胞和间质细胞的两方存在而分泌的因子等的物质代替。
作为自血管细胞分泌的因子、自间质细胞分泌的因子、及通过血管细胞和间质细胞的两方存在而分泌的因子等的物质的例，可例示FGF2、FGF5、BMF4、BMP6、CTGF、血管生成素2、趋化因子(C-C基序)配体14、von Willebrand因子等，但不限于这些。
作为这些物质的添加量，对于FGF2是，每1×106个细胞，10～100ng/ml是适当的，优选为20ng/ml左右，对于BMF4是，每1×106个细胞，10～100ng/ml是适当的，优选为20ng/ml左右。
培养时使用的培养基，只要是向生物学组织赋予血管系统，就可为任何培养基，但优选使用血管细胞(特别是血管内皮细胞)培养用的培养基、生物学组织培养用的培养基、混合上述2种培养基的等。血管细胞(特别是，血管内皮细胞)培养用的培养基也可使用任何培养基，但优选使用含hEGF(重组人上皮细胞生长因子)、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、氢化可的松、bFGF、抗坏血酸、IGF1、FBS、抗生素(例如，庆大霉素、两性霉素B等)、肝素、L-谷氨酰胺、酚红、BBE的至少1种的培养基。作为血管内皮细胞培养用的培养基，可使用EGM-2BulletKit(Lonza公司制)、EGM BulletKit(Lonza公司制)、VascuLife EnGS Comp Kit(LCT公司制)、人内皮-SFM基础生长培养基(Invitrogen公司制)、人微小血管内皮细胞增殖培养基(TOYOBO公司制)等。生物学组织培养用的培养基也可使用任何培养基，但作为胰岛组织用培养基，优选为向RPMI1640(Wako)或EGM(注册商标)BulletKit(注册商标))(LonzaCC-4133)中加10％胎牛血清(BWT Lot.S-1560)、20mmol/L L-谷氨酰胺(Gibco)、100μg/ml青霉素/链霉素(Gibco)的培养基，作为肾组织(例如，肾肾小球)用培养基，优选为向RPMI1640(Wako)中加20％胎牛血清(BWT Lot.S-1560)、100μg/ml青霉素/链霉素(Gibco)、胰岛素-转铁蛋白-硒X(GIBCO)的培养基，作为肠组织(例如，隐窝片段)用培养基，优选为向RPMI1640(Wako)中加20％胎牛血清(BWT Lot.S-1560)、100μg/ml青霉素/链霉素(Gibco)、胰岛素-转铁蛋白-硒X(GIBCO)的培养基，作为肝组织用培养基，优选为向DMEM/F12(invitrogen)中加10％胎牛血清(ICN Lot.7219F)、2mmol/L L-谷氨酰胺(GIBCO)、100μg/mL青霉素/链霉素(Gibco)、10mmol/L烟酰胺(SIGMA)、50μmol/L 2-巯基乙醇、1×107mol/L6.5％地塞米松(SIGMA)、2.6×104M L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物(SIGMA)、5mmol/LHEPES(DOJINDO)、1μg/mL酵母中表达的人重组胰岛素(Wako)、50ng/mL Sf21昆虫细胞中表达的人重组HGF(SIGMA)、20ng/mL小鼠颌下腺EGF(SIGMA)的培养基，作为iPS细胞来源内胚层组织用培养基，优选为向RPMI1640(WAKO)中加1％B27补充物X50(INVITROGEN 17504-044)、10nG/ML BFGF重组人(WAKO 060-04543)、20nG/ML BMP4重组人(R和D 314-BP)的培养基，作为iPS细胞来源肝内胚层组织用培养基，优选为向从肝细胞专用培养基试剂盒(HCMTMBulletKitTM lonza CC3198)中除hEGF(重组人上皮细胞生长因子)的培养基中加0.1μM地塞米松(Sigma-Aldrich)、10ng/ml抑瘤素M(R和D)、10ng/mlHGF(PromoKine)的培养基，作为癌组织或肺组织用培养基，优选与血管用培养基相同的培养基。
生物学组织被接种到凝胶等的支持体上，优选为进行与血管细胞及间质细胞的共培养。支持体可为有0.5～25kPa的硬度的基材，作为那样的基材，可例示凝胶(例如原液～4倍稀释基质胶(注册商标)、琼脂糖凝胶、丙烯酰胺凝胶、水凝胶、胶原凝胶、氨基甲酸酯凝胶等)，但不限于此。
另外，也可在底面细胞集合的形状的板上共培养生物学组织和血管细胞及间质细胞。使用的板只要是在底面细胞集合的形状，就不特别限定，但可使用PrimeSurface(注册商标)96孔U板(住友Bakelite公司制)等。
培养时的温度不特别限定，但优选为作为30～40℃，更优选为作为37℃的的。
培养期间不特别限定，但优选为作为12～144小时，胰岛等的向成体组织的血管化更优选为作为12～24小时左右，向iPS细胞等来源的组织的血管化是48～72小时左右、向癌组织的血管化还优选为作为12～72小时左右。
由本发明的方法赋予血管系统的生物学组织可为以复合组织的形成在全部细胞－组织自律性地发生作为特征的结构体。另外，由本发明的方法赋予血管系统的生物学组织可为血管系统直接统合(即附着、连接、或者连续)于组织的复合组织。
在本发明的方法中，通过将生物学组织与血管细胞及间质细胞共培养，可不使用支架材料而向生物学组织赋予血管系统。
通过将生物学组织与血管细胞及间质细胞共培养，向生物学组织赋予血管系统，则可维持及/或升高生物学组织的功能。除生物学组织的功能的维持－升高之外，移植效率改善，可提供有飞跃性的治疗效果的治疗法。
另外，由于由本发明，血管系统再构建变得可能，与从iPS细胞、ES细胞等的多能性干细胞来源的组织有效诱导终末分化细胞的方法的确立关联。
由本发明的方法，赋予血管系统的生物学组织可为在活体内血管系统可快速发挥功能的复合组织。即，将由本发明的方法赋予血管系统的生物学组织移植到活体(宿主)与使用支架材料时比较，从与宿主血管的吻合至血液的流入时间可大幅地缩短(例：使用支架材料时＝12天(Engineered blood vessel networks connect to host vasculature viawrapping-and-tapping anastomosis.Blood.2011 Oct 27；118(17)：4740-9.)、本发明的方法＝1～2天(参照后述的实施例))。
通过将由本发明的方法赋予血管系统的生物学组织移植到非人动物，在移植的组织中构建血管网，血管灌流开始，可创造有高度有秩序的组织结构的组织或器官。从而，本发明提供组织或器官的制作方法，其包括将由与血管细胞及间质细胞的共培养赋予血管系统的生物学组织移植到人或非人动物，分化为血管网构建的组织或器官。作为使用的非人动物，可举出用于实验动物、伴侣动物、使役动物、赛马、斗犬等的动物、具体而言，小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾、蟹等。另外，使用的非人动物为了回避免疫排斥反应，优选是免疫缺陷动物。
赋予血管系统的生物学组织的移植部位只要是可移植的，就也可为何部位，可例示颅内、肠系膜、肝脏、脾脏、肾脏、肾被膜下、门静脉上等。在移植到颅内时，可移植在体外制作的1～12个左右的500μm大的生物学组织，在移植到肠系膜时，可移植在体外制作的1～12个左右的3-8mm大的生物学组织，在移植到门静脉上时，可移植在体外制作的1～12个左右的3-8mm大的生物学组织。在移植到肾皮膜时，可移植在体外制作的1～6个左右的3-8mm大的生物学组织，在移植到肝脏－脾脏－肾脏－淋巴节－血管内时，可移植在体外制作的100～2000个左右的100～200μm大的生物学组织。
如上所述制作的组织及器官可用于药物开发筛选或再生医疗等。
从而，本发明提供组织或器官的再生或功能恢复方法，其包括将由与血管细胞及间质细胞的共培养赋予血管系统的生物学组织移植到人或非人动物，分化为血管网构建的组织或器官。作为非人动物，可举出用于实验动物、伴侣动物、使役动物、赛马、斗犬等的动物、具体而言，小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾、蟹等。
另外，本发明提供含通过与血管细胞及间质细胞共培养赋予血管系统的生物学组织的再生医疗用组合物。
将本发明的组合物移植到活体内，可制作组织或器官。另外，将本发明的组合物移植到活体内，可进行组织或器官的再生或功能恢复。作为活体，人之外、可举出用于实验动物、伴侣动物、使役动物、赛马、斗犬等的动物、具体而言，小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾、蟹等。
本发明的组合物被移植到活体后，生物学组织可分化为有血管网的组织或器官。可在其血管网发生血管灌流。通过血管网发生血管灌流，认为创造有与成体组织同等或与其相近的高度有秩序的组织结构的组织－器官变得可能。
在本发明的组合物中，也可添加FGF2、HGF、VEGF等的组织血管化促进剂、伴随移植的止血用明胶海绵(商品名：Spongel、Astellas株式会社)、及移植组织的固定中使用的BOLHEAL(帝人Pharma株式会社)·Beriplast(CSLBehring株式会社)·TachoComb(CSLBehring株式会社)等的组织粘接剂等。
另外，本发明也提供非人嵌合体动物的制作方法，其包括将由与血管细胞及间质细胞的共培养赋予血管系统的生物学组织移植到非人动物，分化为血管网构建的组织或器官。移植赋予血管系统的生物学组织的非人动物(例如，小鼠)可模仿赋予血管系统的生物学组织的来源生物种(例如人)的生理功能。作为非人动物，可举出用于实验动物、伴侣动物、使役动物、赛马、斗犬等的动物、具体而言，小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾、蟹等。非人动物，为了回避免疫排斥反应，优选是免疫缺陷动物。
再者，本发明也提供评价药剂的方法，其使用选自由上述的方法赋予血管系统的生物学组织、由赋予血管系统的生物学组织制作的组织及器官、及移植赋予血管系统的生物学组织的非人嵌合体动物的至少一个。作为药剂的评价，例如，可举出药物代谢的评价(例如，药物代谢表征的预测)、药效评价(例如，筛选作为药品有效的药剂，确认药剂的效果和血管的关联性等的药品的效果等)、毒性评价、药物相互作用评价等。
药物代谢的评价在移植赋予血管系统的生物学人组织、自赋予血管系统的生物学组织制作的人组织及器官、及赋予血管系统的生物学人组织的非人嵌合体动物中，通过采集－解析施用药品的候选化合物后的生物样品，可取得人型的药物代谢表征。由此预测在用以往的技术极其难达成的人的药品的分布－代谢－排泄过程变得可能，期待可飞跃性地加速安全且有效果的药品的开发。
作为药品有效的药剂的筛选是，以自疾病患者建立的细胞－自组织诱导的组织作为对象，使用移植赋予血管系统的生物学组织、自赋予血管系统的生物学组织制作的组织及器官、及赋予血管系统的生物学组织的非人嵌合体动物，通过施用新颖的药品候选化合物解析变得可能。由此，期待用以往的体外试验不充分，可大幅地改善实际人中施用时的药效的预测精度的可能性。
药剂的效果和血管的关联性的确认是以移植赋予血管系统的生物学组织、自赋予血管系统的生物学组织制作的组织及器官、及赋予血管系统的生物学组织的非人嵌合体动物作为对象，施用任意的药剂后，可通过测定血管近傍的组织中的药剂的浓度分布或对细胞的作为目的的效果来取得。
例如，在肿瘤组织中，以成为临床上再发或转移的原因的癌干细胞等作为目标被认为是重要的治疗战略。另一方面，当癌干细胞存在于血管近傍时，已知由于血管透过性降低而抗癌剂难以浸润，或自血管分离时抗癌剂的扩散不充分等，在以它们作为目标的药剂的开发中，再构成以血管作为起点的3维的肿瘤组织，评价中使用是重要的。使用本法，使基于以往无法完全达成的作为血管的细胞－组织极性的药效评价变得可能，使实施治疗效果更高的药剂的开发变得可能。
毒性评价使用移植赋予血管系统的生物学组织、自赋予血管系统的生物学组织制作的组织及器官、及赋予血管系统的生物学组织的非人嵌合体动物，施用被验物质后，通过测定组织障碍标志物等，使障碍预测的精度升高变得可能。
成为以抗癌剂为首的毒性的问题的药品的开发，为了评价药物毒性而要求莫大的成本和长期的开发期间成为问题。从而，通过使用血管化组织造出模仿活体内的微小环境，利用以至今评价困难的组织作为对象的毒性试验变得可能。即，通过进行对血管，疾病细胞或正常细胞的毒性评价，期待新的药品的研究开发飞跃性地迅速化。
药物相互作用评价可通过使用移植赋予血管系统的生物学组织、自赋予血管系统的生物学组织制作的组织及器官、及赋予血管系统的生物学组织的非人嵌合体动物，施用多个药剂后，进行其后的各药剂的分布－代谢－排泄过程等的药物动态或毒性评价、药效评价来进行。
在以往的多能性干细胞的分化诱导法中，得到的细胞的功能水平与成体组织的功能细胞比，止于未成熟的阶段。由本发明，只要可自从多能性干细胞等诱导的组织得到终末分化的功能细胞，就作为革新性的分化诱导技术，成为向人功能细胞的工业的制造的重要的基础技术。例如，通过从由本发明人为地制作的人肝脏组织分离人肝细胞或人肝干细胞，大量地制造在药物开发中必要的人成熟肝细胞变得可能。
另外，通过向癌组织或正常组织等赋予立体性的血管网，作为药物开发中的课题的药剂的效果表达和血管的空间的配置的相关等，期待成为从完全新的着眼点评价药效的革新性的筛选技术。
以往、以糖尿病等作为对象的移植医疗是，移植从脑死供体等来源的个体提取的胰岛组织等的组织移植疗法是主体。但是，组织移植疗法由于无血管系统而移植后的植活显著地低，治疗效果有限成为课题。由本发明，使提供可解决这样的问题的赋予血管系统的移植材变得可能。使工业上制造赋予血管网的治疗用的人组织－器官变得可能，则可提供可期待高的治疗效果的新的移植用组织－器官，期待变得革新性的医疗技术。
【实施例】
以下，由实施例还详细地说明本发明。
【实施例1：向胰岛组织的血管网的赋予】
〔方法〕
【1.小鼠胰岛的单离法】
小鼠胰岛的单离主要根据Dong等的方法进行(文献名：A protocol for isletisolation from mouse pancreas)。使用二乙基醚(Wako)将麻醉的C57BL/6J小鼠(日本SLC)的腹部用70％乙醇消毒后，开腹，结扎作为总胆管和十二指肠的结合部的法特壶腹。其后，向胆囊管和肝管的合流部插入27G注射针，注入3ml用Hanks缓冲液(HBSS,GIBCO)调制的胶原酶XI液(1,000U/ml)(Sigma,cat.No.C7657)，向胰腺全体填充胶原酶XI液。切出胰腺，向放入胶原酶XI液的50ml管放入，于37.5℃震荡15分钟。消化胰腺后，添加25ml冰冷却的HBSS(含CaCl21mM)而清洗、离心(290g,30秒钟,4℃)后，除去上清。再次、进行清洗、离心之后，添加15ml的HBSS，使用70μm目的细胞滤器过滤，使用独自调制残留物的培养基(以EGM(注册商标)BulletKit(注册商标)(Lonza CC-4133)作为基础而为胰岛的培养用独自改变的)，将全量移到陪替培养皿。
【2.小鼠胰岛的筛选法】
将1中单离的小鼠胰岛在实体显微镜下观察，则可确认橙色球状的小鼠胰岛(直径150～250μm)。将其用自动移液器采集到胰岛用培养基。
【3.小鼠胰岛的初代培养法】
使用向独自调制的培养基(EGM(注册商标)BulletKit(注册商标))(Lonza CC-4133)中加10％胎牛血清(BWT Lot.S-1560)、20mmol/L L-谷氨酰胺(Gibco)、100μg/ml青霉素/链霉素(Gibco)的培养基，在37℃、5％CO2的温育器内培养。
【4.细胞培养】
正常人脐带静脉内皮细胞(Normal Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC)(Lonza CC-2517)是，使用为HUVEC培养用调制的专用的培养基(EGM(注册商标)BulletKit(注册商标))(Lonza CC-4133)，以保证继代次数(5次)以内的继代次数培养。人间质干细胞(human Mesenchymal Stem Cell：hMSC)(Lonza PT-2501)是，使用为hMSC培养调制的专用的培养基(MSCGMTMBulletKit(注册商标))(Lonza PT-3001)，以保证继代数(5次)以内的继代次数培养。各自的细胞在37℃、5％CO2的温育器内培养。
【5.由反转录病毒载体的荧光标记】
全部的基因重组实验在得到横浜市立大学DNA重组委员会的批准的情况下，在P2水平安全柜内施行。
病毒载体pGCDΔNsamEGFP及pGCDΔNsamKO的产出用以下的方法进行。将293GPG/pGCDΔNsamEGFP细胞(Masafumi Onodera氏提供)及293GPG/pGCDΔNsamKO细胞(MasafumiOnodera氏提供)接种到用聚-L-赖氨酸包被的皿，使用为专用调制的培养基(表示为293GPG培养基)培养。即，使用在DMEM(SIGMA)中含10％胎牛血清(Gibco)、2mmol/L L-谷氨酰胺(Gibco)、1青霉素/链霉素(Gibco)、1μg/mL四环素盐酸盐(SIGMA T-7660)、2μg/mL嘌呤霉素(SIGMA P-7255)、0.3mg/mL G418(SIGMA A-1720)的培养基。培养在37℃、10％CO2的温育器内培养。培养至约80％汇合状态后，将培养基从293GPG培养基取代为除去四环素盐酸盐、嘌呤霉素、G418的培养基(表示为293GP培养基)(作为第0天)。在第3天交换培养基后，从第4天起每培养基回收病毒，再用293GP培养基补给。将回收的培养基用0.45μm滤器过滤而暂时于4℃储存。将以上述的顺序至第7天回收的以6000G、4℃、离心16小时，向沉淀添加400μL的Stempro(invitrogen)，于4℃、振荡72小时后，将其于-80℃回收－保存。(以100倍浓缩病毒溶液表示)。
将HUVEC培养至成30～50％汇合状态，向培养基加Protamine(Sigma)至终浓度成0.4μm/mL，向HUVEC添加pGCDΔNsamEGFP。在37℃、5％CO2的温育器内感染4小时，用PBS清洗2次后，将培养基更换为新鲜的培养基，再在37℃、5％CO2温育器内培养。将此操作重复4次，将细胞荧光标记。
【6.小鼠胰岛用培养基的探讨】
使用RPMI1640(Wako)和内皮细胞用培养基(EGM(注册商标)BulletKit(注册商标))(Lonza CC-4133)各自调制胰岛用培养基。在用各培养基填充的PrimeSurface(注册商标)96孔U板(住友Bakelite)的1孔中静置1个小鼠胰岛，在37℃的温育器内培养。其后，添加20μl的LIVE/DEAD(注册商标)细胞成像试剂盒(Life Technologies·日本)，在37℃、5％CO2的温育器内培养15分钟，使用共聚焦显微镜(LEICA TCS-SP5)观察。
【7.使用24孔平底板的有人血管结构的3维组织的制作】
作为经时观察用，将EGFP-HUVEC以2.0×106个细胞、将hMSC以4.0×105个细胞的细胞数混合，以950rpm进行离心5分钟。其后，除去上清而在20μl的胰岛用培养基中悬浮，固定凝胶(每1孔各放入300μl将基质胶(BD)和胰岛用培养基以1:1的比例混合的溶液，在37℃、5％CO2的温育器内静置10分钟以上而固定)、向静置小鼠胰岛300个的24孔平底板(BD)的1孔接种细胞。接种后，在37℃的温育器内静置10分钟。10分钟后，沿1ml孔的壁轻轻地加胰岛用培养基，在37℃的温育器中培养1天。
【8.使用96孔U板的有人血管结构的3维组织的制作】
在填充胰岛用培养基的PrimeSurface(注册商标)96孔U板(住友Bakelite)的1孔中静置小鼠胰岛，向其中接种HUVEC、hMSC。其后，在37℃的温育器中培养1天。
【9.使用实体显微镜的细胞共培养的经时观察】
为了追踪在实体显微镜下的经时变化而进行共培养。在PrimeSurface(注册商标)96孔U板的1孔中静置10个小鼠胰岛，向其中将HUVEC以1.0×104个细胞、将hMSC以1.0×103个细胞的细胞数接种。接种后，向实体显微镜(LeicaDFC300FX)设置板，由细胞共培养，观察形态变化。
【10.使用转孔板的胰岛细胞生存率的验证】
在24孔转孔板的底面部静置30个小鼠胰岛。将插入物放入别的24孔板内，接种1×105个细胞的HUVEC，接种2×104个细胞hMSC，将HUVEC以1×105个细胞、将MSC以2×104个细胞混合而接种的放入静置小鼠胰岛的24孔板，将这些在37℃、5％CO2的温育器内培养一晚。培养后，向静置小鼠胰岛的24孔板添加200μl的LIVE/DEAD(注册商标)细胞成像试剂盒(Life Technologies·日本)，在37℃、5％CO2的温育器内培养15分钟，其后，使用共聚焦显微镜(LEICATCS-SP5)进行观察。
【11.使用96孔U板的胰岛细胞生存率的验证】
向8中制作的3维组织的培养基中添加20μl的LIVE/DEAD(注册商标)细胞成像试剂盒(Life Technologies·日本)，在37℃、5％CO2的温育器内培养15分钟，其后，使用共聚焦显微镜进行观察。
【12.使用转孔板的胰岛素分泌量的测定】
在24孔转孔板的底面部静置100个小鼠胰岛。将插入物放入别的24孔板内，将HUVEC以1×105个细胞、将hMSC以2×104个细胞混合而接种的和未接种细胞的放入静置小鼠胰岛的24孔板，将这些在37℃、5％CO2的温育器内培养一晚。培养后，采集静置小鼠胰岛的24孔板中之上清，将其用胰岛素测定试剂盒(柴山羊,cat.No.AKRIN-011H)测定。
【13.试管内的糖装载试验】
将不含葡萄糖的RPMI1640(Wako)调制成胰岛用培养基，通过添加葡萄糖制作葡萄糖低浓度培养基(60mg/100ml)和高浓度培养基(360mg/100ml)。向静置100个小鼠胰岛的24孔转孔板的插入物填充葡萄糖低浓度培养基，向HUVEC接种1×105个细胞、hMSC接种2×104个细胞的混合接种孔移插入物，在37℃、5％CO2的温育器内培养1小时。其后，将插入物内的培养基取代为葡萄糖高浓度培养基，向别的孔移插入物，在温育器内培养1小时。培养后，采集插入物和孔中的上清，将其用胰岛素测定试剂盒(柴山羊)测定。
【14.实验动物】
将作为移植动物使用的NOD/SCID小鼠(Sankyo Labo Service Co.,Tokyo,Japan)在SPF环境下以昼间10小时－夜间14小时的明暗周期饲育。实验动物的饲育委托横浜市立大学医学部动物实验中心，另外遵守本学校定的伦理规定进行实验。
【15.继续观察用颅窗(CW)小鼠的制作】
CW小鼠的制作主要根据Yuan等的方法进行(文献名：Vascular permeability andmicrocirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat andmouse cranial windows.)。麻醉是将氯胺酮(Sankyo Yell Yakuhin Co.,Tokyo,Japan)90mg/kg，赛拉嗪(Sigma Chemical CO.,St.Louis,MO，USA)9mg/kg用灭菌处理的PBS调整至1个体200μl的施用量，由腹腔注射实施(氯胺酮－赛拉嗪混合麻醉)。氯胺酮根据麻药管理法使用。麻醉后，用电动毛剪除去头部的毛，用70％乙醇消毒NOD/SCID小鼠头部，切开头部皮肤，由绵棒除去颅骨表面的骨膜后，使用齿科用微钻(Fine Sciencd Tools,USA)将颅骨削成圆形，慎重去除。接下来使用镊子剥离硬膜。在出血时，使用Spongel(Astellas Co.,Tokyo,Japan)进行止血。确认未见出血后，用生理盐水(Otuka Pharmaceutical Co.,Tokyo,Japan)填满脑表面，将直径7mm的特订圆形载玻片(MATSUNAMI,Osaka,Japan)放到表面，由将コートレープラスチック粉末(Yoshida,Tokyo,Japan)和ARONα(Toagosei CO.,Tokyo,Japan)混合成水泥状的粘接剂强固地封入。从CW制作1周经过后，使用手术部未见出血或炎症的小鼠。
【16.糖尿病模型小鼠的制作】
通过向SCID Ins-TRECK-Tg小鼠(由东京都临床医学综合研究所提供)施用白喉毒素(DT)，制作糖尿病模型小鼠。将DT 1μg/kg用生理盐水调制成1个体200μl的施用量，由腹腔注射施用。施用后，每日17时进行平常血糖和体重的测量，将3天以上连续记录平常血糖值是300mg/dl的小鼠作为糖尿病模型小鼠使用。血糖值测量是，从尾静脉采集血液，用GLUTESTneo传感器(注册商标)(Panasonic东京)进行测量。
【17.向CW小鼠的移植】
通过除去15中制作的CW小鼠的头部观察窗的玻璃，使脑表面露出而进行移植。使用的CW小鼠使用未见脑表面的出血、炎症或感染等的小鼠。麻醉后，将头部观察窗周边用70％乙醇消毒，从特订圆形载玻片和ARONα的界线，使18G的针尖侵入，脑表面无伤地剥离特订圆形载玻片，使脑表面露出。其后，用生理盐水进行清洗，向脑表面之中心附近静置移植组织，放上特订圆形载玻片。此时、为了不残留间隙，将玻璃和脑表面之间用生理盐水填满之后，与制作时同样地，用由コートレープラスチック粉末和ARONα的粘接剂进行封入。
【18.向肾被膜下的移植】
对于在16中制作的糖尿病模型小鼠，使用实验动物用麻醉装置(SINANO制作所)，用异氟烷进行麻醉。麻醉后，将小鼠背侧之左半身用电动毛剪除去毛，用70％乙醇消毒后，由1.5～2cm切开使肾脏露出。肾脏露出后，固定，切开一部分肾脏腹侧的被膜，从开口部向被膜下移植在7中制作的3维组织。移植后，将肾脏返回体内，进行肌膜和皮肤的缝合。
【19.由共聚焦显微镜的向CW移植小鼠移植的组织的追尾定点观察】
在17中进行向CW移植的3维组织的观察。
对移植的CW小鼠，与11中使用的同样地，用氯胺酮－赛拉嗪混合麻醉进行麻醉，将CW小鼠在25×60mm微盖玻片(MATSUNAMI)之上，以与头部观察窗水平地仰卧位固定，使用共聚焦显微镜(LEICA TCS-SP5)观察有移植的血管网的3维组织的形态变化。
【19-1.小鼠血流的可视化】
为了进行自移植的宿主小鼠侧的血流的可视化，进行与15同样的麻醉，对于20g体重小鼠，从小鼠尾静脉使用29G的微注射器施用100μl将异硫氰酸荧光素-葡聚糖(SIGMAUSA)由生理盐水调制的荧光染料。其后用与19同样的方法进行观察。
【19-2.宿主侧血管内皮细胞的可视化】
给移植的细胞制作的血管网之中，为了可视化宿主来源血管，进行与15同样的麻醉，对于体重20g小鼠从小鼠尾静脉用29G的注射器施用100μl的Alexa-Flour647抗-小鼠CD31(Biolegend)抗体。其后用与19同样的方法进行观察。
【20.正常胰岛组织的可视化】
使用Pdx-DsRed小鼠(由Douglous Melton氏提供)、用CAG-GFP小鼠(日本SLC)，可视化正常胰岛组织内的结构。使用实验动物用麻醉装置，用异氟烷实施麻醉。由电动毛剪除去小鼠背侧毛后，进行0.5～1cm切开，使脾脏露出到外部，进行粘接到脾脏附近的胰腺的露出。露出后保持小鼠至胰腺贴附到10cm皿底面。在保持的状态下，通过向皿注入冷却至37℃的1.5％琼脂糖凝胶溶液，固定露出胰腺的状态的小鼠。将固定的小鼠由共聚焦显微镜，观察正常胰岛组织。
【21.活体内的糖装载试验】
将葡萄糖溶液3g/kg用生理盐水调制成1个体200μl的施用量，由腹腔注射施用。施用后，每15分钟从尾静脉采集血液，用GLUTESTneo传感器(注册商标)(Panasonic东京)测量血糖值。
【22.冷冻切片的制作】
进行移植后样品的摘出之后，用PBS清洗，用4％多聚甲醛(PFA)固定1天。其后，用10、20％的各浓度的蔗糖溶液进行蔗糖取代至样品沉降，20％蔗糖溶液中的样品沉降后，用30％蔗糖溶液进行1天蔗糖取代。将取代后的样品包埋于O.C.T.化合物(Funakoshi Co)中，于4℃渗透10分钟之后，放到浮到液氮之上的铝箔制的台上，冷冻。
由低温恒温器(Leica CM1950)以5μm薄切，粘接到载玻片(MATSUNAMI)上。使冷冻切片风干而作为冷冻切片使用。
【23.石蜡切片的制作】
进行移植后样品的摘出之后，用PBS进行清洗，用4％PFA固定1天。固定后用PBS清洗3次，用50、70、80、90、95、100％的各浓度的乙醇进行各1小时脱水，用100％乙醇脱水1小时后，用新的100％乙醇进行1天脱水。脱水后，用二甲苯进行各1小时3次取代，在设定于65℃的石蜡包埋用恒温槽内，在石蜡：二甲苯＝1：1混合溶液中渗透1小时，在石蜡中各2小时渗透3次。渗透后，在石蜡中包埋而制作石蜡块。
将制作的石蜡块由切片机薄切成5μm，作为石蜡切片使用。
【24.HE(苏木精/曙红)染色】
用自来水清洗冷冻切片2分钟，进行脱OCT。用离子交换水清洗后，用苏木精(Wako)进行9分钟核染色。用离子交换水洗掉染色液，放入自来水中10分钟，进行水浸。其后，用离子交换水清洗后，用曙红(武藤化学)进行10分钟细胞质染色。将额外的曙红用离子交换水洗脱后，用升高乙醇系列脱水，用二甲苯进行透彻处理，封入。
将石蜡切片用100％二甲苯进行各5分钟3次渗透，向100、90、80、70、60、50％乙醇各浸3分钟，进行脱石蜡而使亲水。其后，与上述的冷冻切片同样地，用离子交换水清洗后，进行HE染色。
【25.免疫组织化学染色】
各切片的脱OCT－脱石蜡后，将切片用PBS经5分钟清洗3次，用4％PFA于4℃进行固定10分钟。其后，用PBS经5分钟清洗3次，使用含10％第二抗体制成动物(山羊)的正常血清的封闭溶液，将组织于4℃封闭1晚。接下来，添加用PBS稀释200倍的第一抗体，于4℃反应1晚之后，用PBS进行5分钟、清洗3次。作为第一次单克隆抗体，将抗小鼠/猪鼠胰岛素抗体、抗人/小鼠CD31、抗小鼠/大鼠CD31、抗人/小鼠胶原4、抗人/兔层粘连蛋白抗体、抗小鼠/兔半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3抗体组合使用。再者，添加用PBS稀释500倍的第二抗体，在室温的遮光条件下反应1小时之后，用PBS经5分钟清洗3次，用添加了4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI,invitrogen)的封入剂封入，用荧光显微镜进行观察和摄影。作为第2抗体(Molecular probe)，将Alexa 488、555标记山羊抗兔IgG(H+L)抗体、Alexa 488、555，647标记山羊抗大鼠IgG(H+L)抗体、Alexa 488、555标记山羊抗猪鼠IgG(H+L)抗体、Alexa 488、555，647标记山羊抗小鼠IgG(H+L)抗体组合使用。
【26.由全量法的免疫组织学的解析】
回收创造的血管化胰岛，放入4％PFA溶液而进行1天固定，用PBS进行3次10分钟的清洗。固定后，放入含3％BSA的0.1％Triton-PBS溶液，在室温环境进行1小时封闭。封闭后用0.1％Triton-PBS溶液进行3次10分钟的清洗，向用0.1％Triton-PBS溶液稀释的第1抗体液放入移植片，于4℃反应1天。反应后，用0.1％Triton-PBS溶液进行3次10分钟的清洗，向用0.1％Triton-PBS溶液稀释的第2抗体液放入移植片，在室温环境反应4小时。反应后，用0.1％Triton-PBS溶液进行3次10分钟的清洗，添加放入DAPI的封入材，使用共聚焦显微镜进行观察。
〔结果〕
【1.由小鼠胰岛、血管内皮细胞、间质干细胞的共培养的3维组织的创造】
以胰岛细胞的生存率作为指标进行培养基的验证(图1A)。培养72小时后，各条件的胰岛每面积的死细胞数是，在使用RPMI1640培养基的胰岛中是14个细胞/mm2、在RPMI1640和内皮细胞用培养基的混合培养基中是1.8个细胞/mm2、在内皮细胞用培养基中存在0.8个细胞/mm2(图1B)。
如方法7一样进行培养。在培养刚开始后的状态下，细胞散在于胰岛周边，无法确认可目测的3维组织。但是，培养开始4小时后，细胞之间的相互作用开始，散在的细胞开始密集，培养进行的8小时后，细胞凝集至覆盖胰岛，缓慢地构建3维的结构。进而，培养24小时后，还进行自律性的组织化，构建血管化的3维组织(图1C上段、1E)。另一方面，在不进行共培养而仅培养胰岛时，别说是血管化，连3维组织的形成也确认不到(图1D)。
另外，通过如方法8一样进行培养，在底面细胞－组织集合的培养基材之中图血管化的3维组织的小型化(图2)。将小鼠胰岛组织1、5、10、20个各自与HUVEC、MSC进行共培养时，在培养开始24小时后构建3维组织，48小时后仍维持形态(图2A)。再者，探讨对于血管化的3维组织的构建最小限度必要的HUVEC、MSC的细胞数(图2B)。在小鼠胰岛是10个时，以HUVEC是1.0×104个细胞、MSC是1×103个细胞进行共培养，则培养开始2小时后，由细胞间粘接，散在的细胞开始凝集。在培养进行9小时后，细胞凝集至覆盖胰岛，构建3维组织(图2C左)。为了追踪细胞的形态变化，使用荧光标记的小鼠胰岛和各种细胞进行共培养实验(图1A下段、2C右、2D)。将自Pdx-DsRed小鼠单离的胰岛(图1A，2D：红、2C：青)、导入绿色荧光蛋白(GFP)的HUVEC(图1A，2C，2D：绿)、MSC(图2C：红)共培养，用共聚焦显微镜观察细胞形态时，确认培养开始后立即，HUVEC不偏地散在于胰岛周边。再者显示，HUVEC不仅直接附着于胰岛组织，与在一部分胰岛内部的血管内皮细胞连接(图2E)。
如上所述，通过将小鼠胰岛、HUVEC、MSC的3种细胞在适宜的条件下共培养，确证血管化的3维组织被自律性地创造。
【2.由血管内皮细胞和间质干细胞的共培养的小鼠胰岛功能的升高】
如方法10一样进行培养，比较在各条件的小鼠胰岛细胞的生存率(图1F活细胞：绿、死细胞：红)。培养24小时后，各条件的胰岛每面积的死细胞数是，在胰岛单独培养中是53个细胞/mm2、在与HUVEC的共培养中是14个细胞/mm2、在与MSC的共培养中是2个细胞/mm2、在HUVEC和MSC的共培养中存在0.1个细胞/mm2(图1G)。从以上得出，通过与HUVEC和MSC进行共培养，小鼠胰岛细胞的生存率升高。
另外，如方法12一样进行培养，测定自小鼠胰岛分泌的胰岛素量(图1H)。培养开始24小时后，与用胰岛单独培养时比较，在与HUVEC、MSC共培养的小鼠胰岛中，胰岛素分泌量增加。在试管内进行糖装载试验时，在胰岛单独培养组中，胰岛素分泌量增加1.37倍、在共培养组中胰岛素分泌量增加1.97倍(图1I)。以贡献于这样的胰岛的功能升高的分子组作为特定的目的，由微阵列解析解析在HUVEC及MSC的共培养前后的一并基因表达的变化。结果，作为通过共培养而表达增强2倍以上的基因，提取到214的候选基因(图1J)。如上所述，通过与HUVEC·MSC进行共培养而引发各种各样的基因的表达变动，提示小鼠胰岛功能升高。
【3.由血管化胰岛移植的追尾定点观察】
给小鼠移植结果1中创造的血管化胰岛，追踪组织的形态变化(图3)。另外，为了探讨组织创造中的血管化的必要性，给小鼠单独移植小鼠胰岛，比较。使用17的方法，给头部观察窗(CW)小鼠进行移植，使用19的方法追踪形态变化。
单独移植小鼠胰岛后，在小鼠头部，至移植后第2天，见不到肉眼的变化，见不到向移植胰岛的血液灌流等，但随着经移植后天数，生存的胰岛减少(图3B)。另外，使用荧光标记，观察细胞形态变化时，也同样地见不到变化，但缓慢地移植胰岛减少。再者，进行血流的可视化时，在移植后第7天，不存在向胰岛内部的血液灌流(图3D胰岛：绿、血流：红)。但是，在移植血管化胰岛的小鼠头部，在移植后第2天，对于移植位置全体进行血液灌流(图3A)。另外，使用共聚焦显微镜进行观察时，在移植后第7天，确认向移植胰岛内部的血液灌流(图3C胰岛：绿、血流：红)。
从这些的结果显示，通过移植血管化胰岛，诱发向移植胰岛内部的早期血流再开，移植后的胰岛生存率升高。
【4.由血管化胰岛移植的糖尿病治疗效果的验证】
将在5个胰岛的条件下共培养的40个血管化胰岛移植到糖尿病模型小鼠的肾被膜下，测定治疗效果(图3E)。移植后1天见到血糖降低，移植2周往后，稳定保持正常血糖值(图3F)。再者，见到大幅的体重增加(图3G)、生存率升高(图3H)。进行活体内的糖装载试验时，显示与正常小鼠无大变化的胰岛素分泌应答(图3I)。
以上表明，通过移植血管化胰岛，显示糖尿病治疗效果。
【5.血管化胰岛的组织学解析】
将共培养1天后的血管化胰岛组织学、免疫组织学解析。进行HE染色时，无中心坏死，观察到与HUVEC、MSC邻接的胰岛组织(图2E上)。再者，进行免疫染色，将胰岛(1E’：绿、2E：红)使用胰岛素抗体，将HUVEC(1E’：红、2E：绿)使用人血管内皮细胞抗体，将小鼠血管(2E：青)使用小鼠血管内皮细胞抗体各自染色(图1E’、2E下)。在胰岛素阳性的胰岛内部确认HUVEC的存在，再者，接合有HUVEC和小鼠血管。
另外，将移植到头部观察窗后第30天的血管化胰岛(图3J)、胰岛(图3K)各自组织学、免疫组织学解析。进行HE染色时，在脑组织上确认植活的胰岛。另外，进行免疫染色的结果，在血管化胰岛中，在胰岛素阳性位置存在人血管内皮细胞，再者，发现是分泌作为细胞外基质的层粘连蛋白、胶原IV的稳定的人血管。但是，在进行胰岛单独移植的胰岛内部见不到血管内皮细胞的存在。
再者，将向肾被膜下移植后第28天的血管化胰岛(图3L)、胰岛(图3M)各自组织学、免疫组织学解析。进行HE染色时，确认在肾脏实质和被膜间存在的胰岛(图3L左下、3M左下)。再者，进行免疫染色，将胰岛(绿)使用胰岛素抗体，将血管内皮细胞(红)使用层粘连蛋白抗体各自染色(图3L右下、3M右下)。在血管化胰岛中，在胰岛素阳性的胰岛内部中，确认层粘连蛋白阳性的血管内皮细胞的表达。但是，在进行胰岛单独移植的胰岛内部见不到血管内皮细胞的存在。
以上表明，从组织学、免疫组织学的着眼点，血管化胰岛是伴随人血管的胰岛组织。
【实施例2：向肾肾小球的血管网的赋予】
〔方法〕
【1.小鼠肾小球的单离法】
将使用二乙基醚(Wako)麻醉的C57BL/6-Tg小鼠(日本SLC)的腹部用70％乙醇消毒后，开腹，摘出肾脏。从摘出的肾脏去除肾皮膜，用生理盐水洗之后，用手术刀轮切肾脏。将肾盂和髓质用夹子去除，回收皮质。在冰上切碎回收的皮质，使用100μm目的细胞滤器一点点添加含0.1％牛血清的白蛋白(BSA,SIGMA)的Hanks缓冲液(HBSS,GIBCO)着过滤。将流通物使用70μm目的细胞滤器过滤，最后，将流通物使用40μm目的细胞滤器过滤。将残留在40μm目的细胞滤器的细胞块使用含0.1％BSA的Hanks缓冲液回收。再者，将回收物用100μm目的细胞滤器过滤。
【2.小鼠肾小球的筛选法】
将1中单离的小鼠肾小球在实体显微镜下观察，则可确认球状的小鼠肾小球(直径50～100μm)。将其用自动移液器回收到肾小球用培养基。
【3.小鼠肾小球的初代培养法】
使用向RPMI1640(Wako)中加20％胎牛血清(BWT Lot.S-1560)、100μg/ml青霉素/链霉素(Gibco)、胰岛素-转铁蛋白-硒X(GIBCO)的培养基在37℃、5％CO2的温育器内培养。
【4.细胞培养】
正常人脐带静脉内皮细胞(Normal Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC)(Lonza CC-2517)使用为HUVEC培养用调制的专用的培养基(EGM(注册商标)BulletKit(注册商标))(Lonza CC-4133)，以保证继代次数(5次)以内的继代次数培养。人间质干细胞(human Mesenchymal Stem Cell：hMSC)(Lonza PT-2501)使用为hMSC培养调制的专用的培养基(MSCGMTM BulletKit(注册商标))(Lonza PT-3001)，以保证继代数(5次)以内的继代次数培养。各自的细胞在37℃、5％CO2的温育器内培养。
【5.有血管系统的3维组织的制作】
作为经时观察用，在填充肾小球用培养基的PrimeSurface(注册商标)96孔U板(住友Bakelite)的1孔中静置1、5、10个小鼠肾小球，向其中将HUVEC以5×104个细胞、将hMSC以5×103个细胞的细胞数接种。其后，在37℃的温育器中培养1天。另外，在24孔板的1孔中静置100个小鼠肾小球，向其中将HUVEC以2×106个细胞、将hMSC以2×105个细胞的细胞数接种。
【6.使用实体显微镜的经时观察】
为了追踪在实体显微镜下的经时变化而进行共培养。在24孔板的1孔中静置20个小鼠肾小球，向其中将HUVEC以2×106个细胞、将hMSC以2×105个细胞的细胞数接种。接种后，在实体显微镜(LeicaDFC300FX)上设置板，由细胞共培养，观察形态变化。
【7.实验动物】
将作为移植动物使用的NOD/SCID小鼠(Sankyo Labo Service Co.,Tokyo,Japan)在SPF环境下以昼间10小时－夜间14小时的明暗周期饲育。实验动物的饲育委托给横浜市立大学医学部动物实验中心，另外遵守本学校定的伦理规定进行实验。
【8.向CW小鼠的移植】
通过除去制作的CW小鼠的头部观察窗的玻璃，使脑表面露出而进行移植。使用的CW小鼠使用未见脑表面的出血、炎症或感染等的小鼠。麻醉后，将头部观察窗周边用70％乙醇消毒，从特订圆形载玻片和ARONα的界线，使18G的针尖侵入，不伤脑表面地剥离特订圆形载玻片，使脑表面露出。其后，用生理盐水进行清洗，在脑表面的中心附近静置移植组织，放上特订圆形载玻片。此时、为了不残留间隙，将玻璃和脑表面之间用生理盐水填满之后，与制作时同样地，用由コートレープラスチック粉末和ARONα的粘接剂进行封入。
【9.由共聚焦显微镜的向CW移植小鼠移植的组织的追尾定点观察】
在8中进行向CW移植的3维组织的观察。
对移植的CW小鼠，与11中使用的同样地，用氯胺酮－赛拉嗪混合麻醉进行麻醉，将CW小鼠在25×60mm微盖玻片(MATSUNAMI)之上，以与头部观察窗水平地仰卧位固定，使用共聚焦显微镜(LEICA TCS-SP5)观察有移植的血管网的3维组织的形态变化。
〔结果〕
【1.由小鼠肾小球、血管内皮细胞、间质干细胞的共培养的血管化3维组织的创造】
如方法6一样进行培养。在培养刚开始后的状态下，细胞散在于肾小球周边，无法确认可目测的3维组织。但是，培养开始4小时后，细胞之间的相互作用开始，散在的细胞开始密集，培养进行的8小时后，细胞凝集至覆盖肾小球，缓慢地构建3维的结构。进而，培养24小时后，还进行自律性的组织化，构建血管化的3维组织(图4A、4B)。另一方面，在不进行共培养而仅培养肾小球时，别说是血管化，连3维组织的形成都确认不到(图4C)。
另外，通过如方法5一样进行培养，在底面细胞－组织集合的培养基材之中图血管化的3维组织的小型化(图4C)。将小鼠肾小球5、10、15个各自与HUVEC、MSC进行共培养时，培养开始24小时后构建3维组织。为了追踪细胞的形态变化，使用荧光标记的小鼠肾小球和各种细胞进行共培养实验(图4B、4C、4D)。将自小鼠单离的肾小球(绿)、导入Kusabira橙(KO)的HUVEC(图4B,4C,4D，：红)、MSC(图4B,4D，：青)共培养，用共聚焦显微镜观察细胞形态时，培养刚开始后确认，HUVEC不偏地散在于肾小球周边。
如上所述，通过将小鼠肾小球、HUVEC、MSC的3种细胞在适宜的条件下共培养，确证血管化的3维组织被自律性地创造。
【2.由血管化肾小球移植的追尾定点观察】
将结果1中创造的血管化肾小球移植给小鼠，追踪组织的形态变化(图4E，)。使用8的方法，向头部观察窗(CW)小鼠进行移植，使用9的方法追踪形态变化。
在移植血管化肾小球的小鼠头部，在移植后第3天，对于移植位置全体进行血液灌流(图4E)。再者，从在使用共聚焦显微镜的移植后第10天的活体观察的结果得知，移植后不仅维持肾小球结构，肾小球内部中的小鼠血管还与在其周围人血管(HUVEC)直接吻合，内部血液交通(图4F)。从这些的结果显示，通过移植血管化肾小球，确认向移植肾小球内部的早期血流再开，有效植活。
【实施例3：向肿瘤组织的血管网的赋予】
〔方法〕
【1.人胰腺肿瘤组织的回收】
将自弥漫性胰岛细胞增殖症患者切除的人胰腺肿瘤组织在洁净台环境下进行由PBS的清洗，移到放入HBSS培养基的6cm皿而细切成1mm画后，在往后的实验中使用。
【2.向人胰腺肿瘤组织的血管网赋予】
用自动移液器回收20个切断为1mm画的人胰腺肿瘤组织，将EGFP-HUVEC以2×106、将MSC以2×105的细胞数混合，以950rpm离心后，除去上清而用EGM培养基1ml悬浮，接种到预先放入基质胶的24孔板而进行由共聚焦显微镜的形态变化的追踪。
【3.小鼠胰腺癌组织的回收】
从使再现胰腺癌的多阶段发癌成为可能的胰腺癌模型小鼠(Pd×1-cre；LSL-KrasG12D；CDKN2A-/-：从NCI购入)胰腺癌回收组织，由PBS进行清洗而在洁净台环境下移到放入HBSS培养基的6cm皿。将回收的癌组织细切成1mm画后，在往后的实验中使用。
【4.向小鼠胰腺癌组织的血管网赋予】
回收20个细切为1mm画的胰腺癌组织，将EGFP-HUVEC以2×106个细胞、将MSC以2×105个细胞的细胞数混合，以950rpm的速度进行5分钟离心。离心后除去上清而接种到加1ml的EGM(注册商标)BulletKit(注册商标)(LonzaCC-4133)培养基而预先放入基质胶的24孔板，放入37℃的温育器，每日进行培养基更换，培养4天。
24孔板是将EGM培养基和BD MatrigelTM基底膜基质(日本BD 356234)以1:1混合，将制作的溶液300μl加到24孔板的1孔、放入37℃的温育器内固定10分钟。
〔结果〕
【1.人胰腺肿瘤组织的血管化】
由共聚焦显微镜的观察的结果，确认由共培养在细切成1mm画的人胰腺组织周边构建血管网，在24～48小时左右自律性地创造血管化的3维组织(图5A)。
【2.小鼠胰腺癌组织的血管化】
通过将切断为1mm画的胰腺癌组织与HUVEC、MSC在固相化到24孔板的基质胶上共培养，成功创造血管化的3维组织(图5B、上段)。作为对照实验，即使在仅固相化1mm画的胰腺癌组织的基质胶上进行培养，确认不到3维组织的形成或血管化，见不到特别的变化(图5B、下段)。
将4天培养后形成的血管化3维组织的基因表达由定量PCR进行解析。结果确证，作为重要的癌干细胞标志物被知的CD44的基因表达与单独培养组比，升高1.6倍左右的表达水平(图5C)。
由此提示，以往在体外难以维持的癌干细胞扩增。在以往的平面培养中，由于是与施用到活体内时的反应性大不同的环境，将抗癌剂的有效性事前作为评价系统的利用是困难的。通过使用本法期待，也含血管系统，可良好地再现活体内的癌组织中的反应性，是作为开发新的抗癌剂时的药剂筛选系统的利用被大地期待的培养技术。
【实施例4：向肝组织的血管网的赋予】
〔方法〕
【1.小鼠肝组织的分离法】
将使用二乙基醚(Wako)麻醉的C57BL/6-Tg小鼠(日本SLC)的腹部用70％乙醇消毒后，开腹，进行经心腔的灌流。摘出肝脏，用生理盐水洗之后，用夹子切碎肝脏。将切碎的肝脏使用100μm目的细胞滤器一点点添加含0.1％牛血清白蛋白(BSA,SIGMA)的Hanks缓冲液(HBSS,GIBCO)着过滤。将流通物使用70μm目的细胞滤器过滤。将残留在70μm目的细胞滤器的细胞块使用含0.1％BSA的Hanks缓冲液回收。
【2.小鼠肝组织的初代培养法】
使用向DMEM/F12(invitrogen)中加10％胎牛血清(ICN Lot.7219F)、2mmol/L L-谷氨酰胺(GIBCO)、100μg/mL青霉素/链霉素(Gibco)、10mmol/L烟酰胺(SIGMA)、50μmol/L2-巯基乙醇、1×107mol/L 6.5％地塞米松(SIGMA)、2.6×104M L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁盐水合物(SIGMA)、5mmol/L HEPES(DOJINDO)、1μg/mL酵母中表达的人重组胰岛素(Wako)、50ng/mL Sf21昆虫细胞中表达的人重组HGF(SIGMA)、20ng/mL小鼠颌下腺EGF(SIGMA)的培养基在37℃、5％CO2的温育器内培养。
【3.细胞培养】
将正常人脐带静脉内皮细胞(Normal Human Umbilical Vein EndothelialCells：HUVEC)(Lonza CC-2517)使用为HUVEC培养用调制的专用的培养基(EGM(注册商标)BulletKit(注册商标))(Lonza CC-4133)，以保证继代次数(5次)以内的继代次数培养。将人间质干细胞(human Mesenchymal Stem Cell：hMSC)(Lonza PT-2501)使用为hMSC培养调制的专用的培养基(MSCGMTM BulletKit(注册商标))(Lonza PT-3001)，以保证继代数(5次)以内的继代次数培养。各自的细胞在37℃、5％CO2的温育器内培养。
【4.有血管网的3维组织的制作】
作为经时观察用，在填充肝组织用培养基的PrimeSurface(注册商标)96孔U板(住友Bakelite)的1孔中静置2个小鼠肝组织，向其中将HUVEC以5×104个细胞、将hMSC以5×103个细胞的细胞数接种。其后，在37℃的温育器中培养1天。
【5.实验动物】
将作为移植动物使用的NOD/SCID小鼠(Sankyo Labo Service Co.,Tokyo,Japan)在SPF环境下以昼间10小时－夜间14小时的明暗周期饲育。实验动物的饲育委托给横浜市立大学医学部动物实验中心，另外遵守本学校定的伦理规定进行实验。
【6.向CW小鼠的移植】
通过除去8中制作的CW小鼠的头部观察窗的玻璃，使脑表面露出而进行移植。使用的CW小鼠使用未见脑表面的出血、炎症或感染等的小鼠。麻醉后，将头部观察窗周边用70％乙醇消毒，从特订圆形载玻片和ARONα的界线，使18G的针尖侵入，不伤脑表面地剥离特订圆形载玻片，使脑表面露出。其后，用生理盐水进行清洗，在脑表面的中心附近静置移植组织，放上特订圆形载玻片。此时、为了不残留间隙，将玻璃和脑表面之间用生理盐水填满之后，与制作时同样地，用由コートレープラスチック粉末和ARONα的粘接剂进行封入。
【7.由共聚焦显微镜的向CW移植小鼠移植的组织的追尾定点观察】
在6中进行向CW移植的3维组织的观察。
对移植的CW小鼠，与11中使用的同样地，用氯胺酮－赛拉嗪混合麻醉进行麻醉，将CW小鼠在25×60mm微盖玻片(MATSUNAMI)之上，以与头部观察窗水平地仰卧位固定，使用共聚焦显微镜(LEICA TCS-SP5)观察有移植的血管网的3维组织的形态变化。
〔结果〕
【1.由小鼠肝组织、血管内皮细胞、间质干细胞的共培养的3维组织的创造】
如方法4一样进行培养。在培养刚开始后的状态下，细胞散在于肝组织周边，无法确认可目测的3维组织。但是，培养开始4小时后，细胞之间的相互作用开始，散在的细胞开始密集，培养进行的8小时后，细胞凝集至覆盖肝组织，缓慢地构建3维的结构。进而，培养24小时后，还进行自律性的组织化，构建血管化的3维组织(图6A、6B)。另一方面，在不进行共培养而仅培养肝组织时，别说是血管化，连3维组织的形成都确认不到(图6B)。
另外，如方法4一样进行培养，在底面细胞－组织集合的培养基材之中图血管化的3维组织的小型化(图6A)。将小鼠肝组织各自与HUVEC、MSC进行共培养时，培养开始24小时后构建3维组织。为了追踪细胞的形态变化，使用荧光标记的小鼠肝组织和各种细胞进行共培养实验(图6A)。将自小鼠单离的肝组织(图6A，：红、6B、6D：绿)、导入绿色荧光蛋白(GFP)的HUVEC(图6B)、MSC共培养，用共聚焦显微镜观察细胞形态时确认，培养刚开始后，HUVEC不偏地散在于肝组织周边。
如上所述，通过将小鼠肝组织、HUVEC、MSC的3种细胞在适宜的条件下共培养，确证血管化的3维组织被自律性地创造。
【2.由血管化肝组织移植的追尾定点观察】
给小鼠移植结果1中创造的血管化肝组织，追踪组织的形态变化(图6C)。使用6的方法，给头部观察窗(CW)小鼠进行移植，使用7的方法追踪形态变化。
在移植血管化肝组织的小鼠头部，在移植后第3天，对于移植位置全体进行血液灌流(图6C)。另外，使用共聚焦显微镜进行观察时，确认向移植肝组织内部的血液灌流(图6D)。
从这些的结果显示，通过移植血管化肝组织，诱发向移植肝组织内部的早期血流再开。
【实施例5：向肠组织的血管网的赋予】
〔方法〕
【1.小鼠肠组织的单离法】
将使用二乙基醚(Wako)麻醉的C57BL/6-Tg小鼠(日本SLC)的腹部用70％乙醇消毒后，开腹，切离小肠口侧约20cm。将切离的小肠内腔用生理盐水50ml清洗后，加纵切开而露出粘膜而作为约5cm的细片。接下来，在含2mM乙二胺四乙酸(EDTA，同仁化学研究所)和0.5mM二硫苏糖醇(DTT,SIGMA CHEMICALCOMPANY)的PBS之中，37℃·20分钟处理。使该上清通过100μm目的细胞滤器，用PBS清洗3次。最后，将流通物使用40μm目的细胞滤器过滤。将残留在40μm目的细胞滤器的细胞块使用含0.1％BSA的Hanks缓冲液回收。
【3.小鼠肠组织的初代培养法】
使用向RPMI1640(Wako)中加20％胎牛血清(BWT Lot.S-1560)、100μg/ml青霉素/链霉素(Gibco)、胰岛素-转铁蛋白-硒X(GIBCO)的培养基，在37℃、5％CO2的温育器内培养。
【4.细胞培养】
将正常人脐带静脉内皮细胞(Normal Human Umbilical Vein EndothelialCells：HUVEC)(Lonza CC-2517)使用为HUVEC培养用调制的专用的培养基(EGM(注册商标)BulletKit(注册商标))(Lonza CC-4133)，以保证继代次数(5次)以内的继代次数培养。将人间质干细胞(human Mesenchymal Stem Cell：hMSC)(Lonza PT-2501)使用为hMSC培养调制的专用的培养基(MSCGMTMBulletKit(注册商标))(Lonza PT-3001)，以保证继代数(5次)以内的继代次数培养。各自的细胞在37℃、5％CO2的温育器内培养。
【5.有血管网的3维组织的制作】
作为经时观察用，在填充肠组织用培养基的PrimeSurface(注册商标)96孔U板(住友Bakelite)的1孔中静置20个小鼠肠组织，向其中将HUVEC以5×104个细胞、将hMSC以5×103个细胞的细胞数接种。其后，在37℃的温育器中培养1天。
【6.使用实体显微镜的细胞共培养的经时观察】
为了追踪在实体显微镜下的经时变化而进行共培养。在24孔板的1孔中静置小鼠肠组织，向其中将HUVEC以2×106个细胞、将hMSC以2×105个细胞的细胞数接种。接种后，在实体显微镜(LeicaDFC300FX)上设置板，由细胞共培养，观察形态变化。
【7.实验动物】
将作为移植动物使用的NOD/SCID小鼠(Sankyo Labo Service Co.,Tokyo,Japan)在SPF环境下以昼间10小时－夜间14小时的明暗周期饲育。实验动物的饲育委托给横浜市立大学医学部动物实验中心，另外遵守本学校定的伦理规定进行实验。
【8.向CW小鼠的移植】
通过除去制作的CW小鼠的头部观察窗的玻璃，使脑表面露出而进行移植。使用的CW小鼠使用未见脑表面的出血、炎症或感染等的小鼠。麻醉后，将头部观察窗周边用70％乙醇消毒，从特订圆形载玻片和ARONα的界线，使18G的针尖侵入，不伤脑表面地剥离特订圆形载玻片，使脑表面露出。其后，用生理盐水进行清洗，在脑表面之中心附近静置移植组织，放上特订圆形载玻片。此时、为了不残留间隙，将玻璃和脑表面之间用生理盐水填满足之后，与制作时同样地，用由コートレープラスチック粉末和ARONα的粘接剂进行封入。
【9.由共聚焦显微镜的向CW移植小鼠移植的组织的追尾定点观察】
在8中进行向CW移植的3维组织的观察。
对移植的CW小鼠，与11中使用的同样地，用氯胺酮－赛拉嗪混合麻醉进行麻醉，将CW小鼠在25×60mm微盖玻片(MATSUNAMI)之上，以与头部观察窗水平地仰卧位固定，使用共聚焦显微镜(LEICA TCS-SP5)观察有移植的血管网的3维组织的形态变化。
〔结果〕
【1.由小鼠肠组织、血管内皮细胞、间质干细胞的共培养的3维组织的创造】
如方法4一样进行培养。在培养刚开始后的状态下，细胞散在于肠组织周边，无法确认可目测的3维组织。但是，培养开始4小时后，细胞之间的相互作用开始，散在的细胞开始密集，培养进行的8小时后，细胞凝集至覆盖肠组织，缓慢地构建3维的结构。进而，培养24小时后，还进行自律性的组织化，构建血管化的3维组织(图7A、7B)。另一方面，在不进行共培养而仅培养肠组织时，别说是血管化，连3维组织的形成都确认不到(图7B)。
另外，如方法4一样进行培养，在底面细胞－组织集合的培养基材之中图血管化的3维组织的小型化(图7B)。将小鼠肠组织各自与HUVEC、MSC进行共培养时，培养开始24小时后构建3维组织。为了追踪细胞的形态变化，使用荧光标记的小鼠肠组织和各种细胞进行共培养实验(图7B)。将自小鼠单离的肠组织(图7B：红)、导入绿色荧光蛋白(GFP)的HUVEC(图7B)、MSC共培养，用共聚焦显微镜观察细胞形态时，确认在培养刚开始后，HUVEC不偏地散在于肠组织周边。
如上所述，通过将小鼠肠组织、HUVEC、MSC的3种细胞在适宜的条件下共培养，确证血管化的3维组织被自律性地创造。
【2.由血管化肠组织移植的追尾定点观察】
给小鼠移植在结果1中创造的血管化肠组织，追踪组织的形态变化(图7C)。使用6的方法，给头部观察窗(CW)小鼠进行移植，使用7的方法追踪形态变化。
在移植血管化肠组织的小鼠头部，在移植后第3天，对于移植位置全体进行血液灌流(图7C)。另外，使用共聚焦显微镜进行观察时，在移植后第3天，确认向移植肠组织内部的血液灌流(图7D)。
从这些的结果显示，通过移植血管化肠组织，诱发向移植肠组织内部的早期血流再开。
【实施例6：向肺组织的血管网的赋予】
〔方法〕
【1.小鼠肺组织的分离法】
将使用二乙基醚(Wako)麻醉的C57BL/6-Tg小鼠(日本SLC)的腹部用70％乙醇消毒后，开腹，摘出肺。用生理盐水洗之后，用夹子切碎肺。将切碎的肺使用100μm目的细胞滤器一点点添加含0.1％牛血清白蛋白(BSA,SIGMA)的Hanks缓冲液(HBSS,GIBCO)着过滤。将流通物使用40μm目的细胞滤器过滤。将残留在40μm目的细胞滤器的细胞块使用含0.1％BSA的Hanks缓冲液回收。
【2.细胞培养】
将正常人脐带静脉内皮细胞(Normal Human Umbilical Vein EndothelialCells：HUVEC)(Lonza CC-2517)使用为HUVEC培养用调制的专用的培养基(EGM(注册商标)BulletKit(注册商标))(Lonza CC-4133)，以保证继代次数(5次)以内的继代次数培养。将人间质干细胞(human Mesenchymal Stem Cell：hMSC)(Lonza PT-2501)使用为hMSC培养调制的专用的培养基(MSCGMTM BulletKit(注册商标))(Lonza PT-3001)，以保证继代数(5次)以内的继代次数培养。各自的细胞在37℃、5％CO2的温育器内培养。
【3.有血管网的3维组织的制作】
作为经时观察用，在填充肺组织用培养基的PrimeSurface(注册商标)96孔U板(住友Bakelite)的1孔中静置20个小鼠肺组织，向其中将HUVEC以5×104个细胞、将hMSC以5×103个细胞的细胞数接种。其后，在37℃的温育器中培养1天。另外，在24孔板的1孔中静置小鼠肺组织，向其中将HUVEC以2×106个细胞、将hMSC以2×105个细胞的细胞数接种。
【4.使用实体显微镜的细胞共培养的经时观察】
为了追踪在实体显微镜下的经时变化而进行共培养。在24孔板的1孔中静置20个小鼠肺组织，向其中将HUVEC以2×106个细胞、将hMSC以2×105个细胞的细胞数接种。接种后，在实体显微镜(LeicaDFC300FX)上设置板，由细胞共培养，观察形态变化。
【5.实验动物】
将作为移植动物使用的NOD/SCID小鼠(Sankyo Labo Service Co.,Tokyo,Japan)在SPF环境下以昼间10小时－夜间14小时的明暗周期饲育。实验动物的饲育委托给横浜市立大学医学部动物实验中心，另外遵守本学校定的伦理规定进行实验。
【6.向CW小鼠的移植】
通过除去8中制作的CW小鼠的头部观察窗的玻璃，使脑表面露出而进行移植。使用的CW小鼠使用未见脑表面的出血、炎症或感染等的小鼠。麻醉后，将头部观察窗周边用70％乙醇消毒，从特订圆形载玻片和ARONα的界线，使18G的针尖侵入，不伤脑表面地剥离特订圆形载玻片，使脑表面露出。其后，用生理盐水进行清洗，在脑表面之中心附近静置移植组织，放上特订圆形载玻片。此时、为了不残留间隙，将玻璃和脑表面之间用生理盐水填满之后，与制作时同样地，用由コートレープラスチック粉末和ARONα的粘接剂进行封入。
【7.由共聚焦显微镜的向CW移植小鼠移植的组织的追尾定点观察】
在9中进行向CW移植的3维组织的观察。
对移植的CW小鼠，与11中使用的同样地，用氯胺酮－赛拉嗪混合麻醉进行麻醉，将CW小鼠在25×60mm微盖玻片(MATSUNAMI)之上，以与头部观察窗水平地仰卧位固定，使用共聚焦显微镜(LEICA TCS-SP5)观察有移植的血管网的3维组织的形态变化。
〔结果〕
【1.由小鼠肺组织、血管内皮细胞、间质干细胞的共培养的3维组织的创造】
如方法6一样进行培养。在培养刚开始后的状态下，细胞散在于肺组织周边，无法确认可目测的3维组织。但是，培养开始4小时后，细胞之间的相互作用开始，散在的细胞开始密集，培养进行的8小时后，细胞凝集至覆盖肺组织，缓慢地构建3维的结构。进而，培养24小时后，还进行自律性的组织化，构建血管化的3维组织(图8A)。另一方面，在不进行共培养而仅培养肺组织时，别说是血管化，连3维组织的形成都确认不到(图8A)。
另外，如方法4一样进行培养，在底面细胞－组织集合的培养基材之中图血管化的3维组织的小型化(图2)。与小鼠肺组织、HUVEC、MSC进行共培养时，培养开始24小时后构建3维组织。为了追踪细胞的形态变化，使用荧光标记的小鼠肺组织和各种细胞进行共培养实验(图8A)。将自小鼠单离的肺组织(图8A：红、)、导入绿色荧光蛋白(GFP)的HUVEC(图8A：绿)、MSC共培养，用共聚焦显微镜观察细胞形态时，确认在培养刚开始后，HUVEC不偏地散在于肺组织周边。
如上所述，通过将小鼠肺组织、HUVEC、MSC的3种细胞在适宜的条件下共培养，确证血管化的3维组织被自律性地创造。
【2.由血管化肺组织移植的追尾定点观察】
给小鼠移植结果1中创造的血管化肺组织，追踪组织的形态变化(图8B)。使用16的方法，给头部观察窗(CW)小鼠进行移植，使用7的方法追踪形态变化。
在移植血管化肺组织的小鼠头部，在移植后第3天，对于移植位置全体进行血液灌流(图8B)。另外，使用共聚焦显微镜进行观察时，在移植后第7天，确认向移植肺组织内部的血液灌流(图8C)。
从这些的结果显示，通过移植血管化肺组织，诱发向移植肺组织内部的早期血流再开。
【实施例7：向iPS细胞来源内胚层组织的血管网的赋予】
〔方法和结果〕
【1.iPS的分化诱导】
将保持着未分化状态而增殖的iPS细胞(由东京大学、中内博士提供。TkDA3克隆。由皮肤成纤维细胞建立。)用清洗培养基(DMEM/F12Life Technologies11320)清洗1次，对于1个100mm皿加1ml的培养细胞分离液(船越AT104)，将细胞回收到50ml离心管，进行900rpm 5min离心操作。对细胞数进行计数后，向实施基质胶包被的1个60mm皿以1.5×106个细胞的细胞数接种。基质胶包被是，将BD MatrigelTM基底膜基质(日本BD 356234)用DMEM(Life Technologies11965118)稀释30倍，向60mm皿加2ml，于室温静置2小时。此时的培养液使用向iPS培养基添加ROCK抑制剂Y-27632(calbiochem 688000)的培养液。在37℃的温育器中培养24小时，使细胞粘接之后，将培养液更换为分化诱导培养基。分化诱导培养基使用向RPMI-1640(和光纯药189-02025)将B-27(注册商标)Supplement Minus胰岛素(LifeTechnologies0050129SA)1/100稀释、以100ng/μl添加激活素A(味之素)的培养基。2天1次进行培养基更换，进行6天培养，向胚体内胚层(Definitive Endoderm)进行分化诱导。向内胚层系列的分化度由定量PCR和免疫染色进行确认。
【2.iPS细胞来源内胚层组织的制作】
将实施向胚体内胚层分化诱导的人iPS细胞以1.0×106个细胞的细胞数接种到EZSPHERETM(旭硝子4810-9006孔-平底)的1孔。培养液使用将肝细胞专用培养基试剂盒(HCMTM BulletKitTM Lonza CC3198)和EGM(注册商标)BulletKit(注册商标)(Lonza CC-4133)以1:1混合的培养基。用37℃的温育器进行2天1次、一边更换半量的培养基培养8天，制成有50～500μm的直径的立体的内胚层组织。
【3.使用96孔U板的有人血管结构的3维组织的制作】
在填充2的iPS细胞来源内胚层组织用培养基的PrimeSurface(注册商标)96孔U板(住友Bakelite)的1孔中静置1～20个iPS细胞来源内胚层组织，向其中将HUVEC以1.0×104个细胞、将hMSC以1.0×103个细胞的细胞数接种。其后，在37℃的温育器中4天培养。
结果表明，通过将内胚层组织与人血管内皮细胞、间质干细胞共培养，自律性地诱导三维的组织(图9B)。在被诱导的组织中确证，人血管内皮细胞形成管腔样的结构，血管化的组织形成(图9C)。由于这样的三维组织形成在iPS细胞来源内胚层组织单独培养组中完全确认不到，表明使用本法对于血管化组织的制作必须(图9B)。
将本说明书中引用的全部的刊物、专利及专利申请作为直接参考并入本说明书中。
【工业实用性】
由本发明赋予血管系统的生物学组织可向评价人功能细胞的创造、器官移植、药物开发筛选、药剂的效果表达和血管的关联性等的新的解析系统等应用。
Claims (51)
1.在体外向生物学组织赋予血管系统的方法，其包括将生物学组织与血管细胞及未分化间质细胞在支持体或在细胞集合在底面的形状的板上共培养而形成三维组织。
2.权利要求1所述的方法，其中所述血管细胞和未分化间质细胞的细胞数比是血管细胞:未分化间质细胞＝10～3:3～1。
3.权利要求1所述的方法，其中相对于1×104个血管细胞及未分化间质细胞的混合物，直径100～150μm大小的生物学组织是1～100个。
4.权利要求1所述的方法，其中不使用支架材料，将生物学组织与血管细胞及未分化间质细胞共培养。
5.权利要求1所述的方法，其中通过将生物学组织与血管细胞及未分化间质细胞共培养，向生物学组织赋予血管系统，生物学组织的功能维持及/或升高。
6.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中所述生物学组织选自：从个体分离的正常、异常组织或癌组织，及自多能性干细胞、组织干－前体细胞、分化细胞诱导的组织。
7.权利要求6所述的方法，其中所述多能性干细胞选自：人工多能性干细胞和胚胎干细胞。
8.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中所述生物学组织选自：胰岛、肾小球、胰腺肿瘤组织、肝组织、肠组织、肺组织和人工多能性干细胞来源内胚层组织。
9.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中所述生物学组织来源于选自下列的动物：人、小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾和蟹。
10.权利要求9所述的方法，其中所述生物学组织来源于选自下列的动物：人和小鼠。
11.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中所述血管细胞获自：脐带血、脐带血管、新生儿组织、肝脏、大动脉、脑、骨髓或脂肪组织。
12.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中所述血管细胞是血管内皮细胞、血管内皮前体细胞或血管内皮干细胞。
13.权利要求12所述的方法，其中所述血管内皮细胞选自：脐带静脉内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞、血管性祖细胞和成血管细胞。
14.权利要求12所述的方法，其中所述血管内皮细胞是脐带静脉内皮细胞。
15.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中所述血管细胞来源于选自下列的动物：人、小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾和蟹。
16.权利要求15所述的方法，其中所述血管细胞来源于选自下列的动物：人和小鼠。
17.权利要求14所述的方法，其中所述脐带静脉内皮细胞是人脐带静脉内皮细胞。
18.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中所述未分化间质细胞是间质干细胞或间质祖细胞。
19.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中所述未分化间质细胞是间质干细胞。
20.权利要求1～5之任一项所述的方法，其中所述未分化间质细胞来源于选自下列的动物：人、小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾和蟹。
21.权利要求20所述的方法，其中所述未分化间质细胞来源于选自下列的动物：人和小鼠。
22.权利要求20所述的方法，其中所述间质干细胞是人间质干细胞。
23.生物学组织，其由权利要求1～22之任一项所述的方法被赋予血管系统。
24.权利要求23所述的生物学组织用于制造在组织或器官的制作中使用的组合物的用途。
25.权利要求23所述的生物学组织用于制造在组织或器官的再生或功能恢复中使用的组合物的用途。
26.权利要求23所述的生物学组织用于制造在非人嵌合体动物的制作中使用的组合物的用途。
27.权利要求23所述的生物学组织用于评价药剂的用途。
28.权利要求23所述的生物学组织用于制造评价药剂用的组织或器官、或者实验动物的用途。
29.再生医疗用组合物，其含权利要求23所述的生物学组织。
30.在体外维持及/或升高生物学组织的功能的方法，其包括将生物学组织与血管细胞及未分化间质细胞在支持体或在细胞集合在底面的形状的板上共培养而形成三维组织。
31.权利要求30所述的方法，其中所述血管细胞和未分化间质细胞的细胞数比是血管细胞:未分化间质细胞＝10～3:3～1。
32.权利要求30所述的方法，其中相对于1×104个血管细胞及未分化间质细胞的混合物，直径100～150μm大小的生物学组织是1～100个。
33.权利要求30所述的方法，其中不使用支架材料，将生物学组织与血管细胞及未分化间质细胞共培养。
34.权利要求30所述的方法，其中通过将生物学组织与血管细胞及未分化间质细胞共培养，向生物学组织赋予血管系统。
35.权利要求30～34之任一项所述的方法，其中所述生物学组织选自：从个体分离的正常、异常组织或癌组织，及自多能性干细胞、组织干－前体细胞、分化细胞诱导的组织。
36.权利要求35所述的方法，其中所述多能性干细胞选自：人工多能性干细胞和胚胎干细胞。
37.权利要求30～34之任一项所述的方法，其中所述生物学组织选自：胰岛、肾小球、胰腺肿瘤组织、肝组织、肠组织、肺组织和人工多能性干细胞来源内胚层组织。
38.权利要求30～34之任一项所述的方法，其中所述生物学组织来源于选自下列的动物：人、小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾和蟹。
39.权利要求38所述的方法，其中所述生物学组织来源于选自下列的动物：人和小鼠。
40.权利要求30～34之任一项所述的方法，其中所述血管细胞获自：脐带血、脐带血管、新生儿组织、肝脏、大动脉、脑、骨髓或脂肪组织。
41.权利要求30～34之任一项所述的方法，其中所述血管细胞是血管内皮细胞、血管内皮前体细胞或血管内皮干细胞。
42.权利要求41所述的方法，其中所述血管内皮细胞选自：脐带静脉内皮细胞、内皮祖细胞、内皮前体细胞、血管性祖细胞和成血管细胞。
43.权利要求41所述的方法，其中所述血管内皮细胞是脐带静脉内皮细胞。
44.权利要求30～34之任一项所述的方法，其中所述血管细胞来源于选自下列的动物：人、小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾和蟹。
45.权利要求44所述的方法，其中所述血管细胞来源于选自下列的动物：人和小鼠。
46.权利要求43所述的方法，其中所述脐带静脉内皮细胞是人脐带静脉内皮细胞。
47.权利要求30～34之任一项所述的方法，其中所述未分化间质细胞是间质干细胞或间质祖细胞。
48.权利要求30～34之任一项所述的方法，其中所述未分化间质细胞是间质干细胞。
49.权利要求30～34之任一项所述的方法，其中所述未分化间质细胞来源于选自下列的动物：人、小鼠、大鼠、兔、猪、狗、猴、牛、马、绵羊、鸡、鲨、鳐、银鲛、鲑、虾和蟹。
50.权利要求49所述的方法，其中所述未分化间质细胞来源于选自下列的动物：人和小鼠。
51.权利要求49所述的方法，其中所述间质干细胞是人间质干细胞。
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