JP2022539418A - 膵島およびβ細胞オルガノイドの機能的な脈管形成の方法 - Google Patents

膵島およびβ細胞オルガノイドの機能的な脈管形成の方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、膵島に脈管形成するための方法であって、膵島またはβ細胞を、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞とともに、内皮細胞がＥＴＶ２転写因子を発現する条件下において培養することを含む、方法を対象とする。本開示はさらに、脈管形成されたβ細胞オルガノイドを作製するための方法であって、膵島またはβ細胞を、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞とともに、内皮細胞がＥＴＶ２転写因子を発現する条件下において培養することを含む、方法を対象とする。本開示の方法によって産生される脈管形成された膵島および脈管形成されたβ細胞オルガノイド、ならびにそれを使用するための方法もまた、開示される。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年７月３日に出願された米国仮出願第６２／８７０，２８８号からの優先権の利益を主張し、その全内容は、参照によって本明細書に組み入れられる。
参照による配列表の組込み
２０２０年６月２７日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて米国特許商標庁に提出された３７４９４ＷＯ＿８８３０－０２－ＰＣ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称の１６ＫＢのＡＳＣＩＩテキストファイルの配列表は、参照によって本明細書に組み入れられる。
糖尿病の発生は、毎年、２～５％の警告すべき速度で増加している。２０１７年の時点で、米国の人口の９．３％が、糖尿病に罹患しており、皮膚潰瘍、網膜症、腎障害、心臓および脳の血管疾患を含む微小血管の糖尿病性合併症に関連して大きな罹患率および死亡率となっている。１型糖尿病は、糖尿病の２つの主要な種類のうちの１つであり、しばしば小児期に発症し、年間７０，０００の新しい症例がある。治癒がないため、１型糖尿病は、患者およびその家族にとって、生涯の負担となる。膵島移植は、正常血糖の達成に有望であるが、その適用は、機能的でインタクトな脈管形成された非壊死性の膵島の採取が困難であることにより阻止されている。さらに、同種膵島細胞が生着し、完全な血糖管理が達成される患者の３年間の期間にわたって、平均で５０％が、正常血糖の持続に失敗する。この膵島移植の失敗は、免疫拒絶に起因するだけでなく、おそらくは膵島内毛細血管の消失に起因して、膵島が、まだ認識されていない品質の低さが原因で機能不全を起こすとも考えられている。
インスリンを産生するβ細胞が損傷しているＩ型糖尿病の頼みの綱となる処置は、同種膵島移植である。しかしながら、一人の個体に移植するのに十分な膵島を単離するための現在のアプローチは、２人またはそれ以上のドナーから膵島を得ることを必要とする。これらの膵島は、生着しないことが多く、長期持続的な正常血糖をもたらすことができない。この欠点は、膵島を単離するために必要な長いラグタイムおよび厳しい培養条件に起因し、これらによって、膵島内の血管内皮細胞（ＥＣ）の壊死および消失がもたらされることが多い。実際に、固有のニッチを形成する膵島特異的ＥＣは、膵島の急速な再脈管形成だけでなく、β細胞の適切な機能性および免疫恒常性にも必須である。注目すべきことに、重要なアンジオクリンパラクリン因子、例えば、とりわけ、Ｅｇｌｆ７およびＮｏｔｃｈリガンドを提供することによって、膵島特異的ＥＣは、β細胞の生存および機能を演出する。β細胞と膵島特異的ＥＣとの間の直接的な細胞相互作用は、免疫監視および生理学的インスリン分泌に必須である。膵島を調製する際の技術的問題のため、ドナーに由来する膵島内で毛細血管の退化があり、β細胞の消失が生じる。加えて、患者への門脈膵島移植の後に、膵島の大部分は、宿主の脈管構造に迅速に吻合することができず、低酸素細胞死により死亡する。
膵島細胞移植の現在のアプローチは、ドナー由来の膵島が、患者への移植の前に生存性および機能性を持続させることができずに、膵島細胞壊死を受けるため、非効率的である。加えて、肝臓への門脈移植の際に、生存している膵島が、残りの膵島内毛細血管に吻合することができずに、移植不全が生じる。したがって、移植の前および後に、ドナー由来の膵島の生存性を持続させるためのアプローチが、永続的な膵島生着のために必須である。
注目すべきことに、移植のためのドナー由来の膵島を得るための既存のプロトコールは、膵島をより効果的な生着のためにインタクトな状態で保つための高度な技術が欠如している。典型的に、患者は、少なくとも２人のドナーから抽出された膵島「相当物」を、体重１キログラム当たり少なくとも１０，０００個受容する。膵島は、門脈を通じて注入され、肝臓の微小循環に入り、門脈脈管構造内に生着する。平均すると、亡くなったドナーから膵島を採取した後、患者への門脈注入のための膵島の特徴付けおよび送達にさらに３～４日間を要し得る。この長い時間経過のために、移植の時点で生存している天然の膵島内内皮細胞はほとんどなくなっている。したがって、膵島内での血管ニッチ細胞からのシグナルの回復は、ドナー由来の膵島による適切な生着、分化、およびインスリン産生を回復させるであろう。したがって、膵島の脈管ネットワークを再構築できるレシピエントＥＣを用いた採取された壊れやすいドナー膵島の脈管分枝は、これらの膵島の生存、機能性、および生着性を増加させることになり、免疫拒絶も最小化する可能性がある。
実際に、膵臓には、適切な膵島機能に必要とされる特化した膵島特異的ＥＣが豊富に分枝している。重要なことに、血管は、酸素および栄養素の送達のためのただの受動的な導管ではなく、器官機能に能動的に関与している。膵島内毛細血管を含め、それぞれの器官内の組織特異的ＥＣは、器官恒常性を補助するという非常に困難な仕事が割り当てられた固有のプロフェッショナルＥＣから構成されている。注目すべきことに、本発明者らは、組織特異的ＥＣが、組織再生および正常機能を誘導する「アンジオクリン因子」として知られるパラクリン媒介因子およびトロフォゲン（ｔｒｏｐｈｏｇｅｎ）を産生するという変革的な概念を開拓した。例えば、膵島内ＥＣによるラミニンの蓄積は、適切なグルコースに媒介されるインスリン分泌に寄与する。注目すべきことに、本発明者らは、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達をモジュレートすることによりアンジオクリン因子Ｅｇｆｌ７を供給することによって、膵島内ＥＣが、β細胞の成熟を促進することを示している。
胚性器官形成および成体組織再生は、永続性があり有益な血管による脈管形成に依存する。毛細血管内の内皮細胞（ＥＣ）が適切に機能することは、組織特異的恒常性を持続させるためだけでなく、発生中および成体の再生器官の適切なパターニングおよび形態形成を導くためのパラクリン因子を供給するためにも、重要である。対照的に、血管ニッチの機能不全は、線維症ならびに腫瘍の進行および治療耐性に寄与する。しかしながら、成体ＥＣが適応性組織特異的パラクリン不均一性を獲得するかまたは腫瘍微小環境内の異常な適応不全を受ける機序は、知られておらず、ＥＣの顕著な可塑性を明らかにするためには、順応性ＥＣの開発が必要である。加えて、血行動態的に安定した順応性脈管ネットワークのインビトロ生成もまた、脱細胞化したスキャフォールド、組織特異的オンチップ器官（ｏｒｇａｎ－ｏｎ－ｃｈｉｐ）および腫瘍オルガノイド培養物、ならびにエキソビボ組織、例えば、高度に脈管形成された膵島を機能させるために重要である。
新しい血管の形成を誘導して、損傷した成体器官の修復を指示しようという試みは、課題に直面している。血管新生因子（ＦＧＦ－２およびＶＥＧＦ－Ａアイソフォームを含む）を損傷した器官に注射することは、永続性のある毛細血管を構築するのに有効ではない。安定なヒト血管をインビトロで微細加工するアプローチは、ＥＣが非血管細胞と相互作用しそれに適応する細胞自由を制限するスキャフォールドの事前製造を含め、困難かつ費用のかかる技術介入の実装が必要である。加えて、臨床的に適合性のない合成細胞外マトリックス成分、例えば、マトリゲルの使用は、正常および腫瘍原性オルガノイド培養物における推定上の毛細血管ネットワークのリモデリングおよびパターニングを制限する。
脱細胞化されたスキャフォールドを生成するための技術、オンチップ器官モデル、および３次元バイオプリンティングは、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングを大きく改善したが、生理学的に関連のある適応性血管細胞をこれらの再生モジュールに組み込むことは、後れを取っている。具体的には、これらのアプローチにおいて、組織特異的上皮および腫瘍細胞との直接的な内皮細胞の相互作用は、合成生体材料によって導入される物理的制約に起因して制限されている。さらに、総容積がおよそ２マイクロリットルであり生体材料界面が制限される空間的に制限されたスキャフォールド内に播種されたＥＣは、実質細胞と相互作用し、リモデリングを受け、正常上皮または腫瘍細胞に適応する自由を有さない。内皮細胞を越えた造血細胞とβ細胞との間の活性な相互作用を伴う１型糖尿病などの他の事例では、造血細胞および免疫細胞が灌流可能な脈管構造が、インビトロでの疾患モデリングを促進するために必須であろう。したがって、脱細胞化されたスキャフォールド、オルガノイド、またはチューモロイド、組織外植片、例えば、膵島に分枝することができる組織特異的で有益な順応性ＥＣを生成するための新しいアプローチは、器官再生、薬物スクリーニング、および腫瘍標的化を促進するため、ならびにパラクリン血管不均一性の分子決定因子を明らかにするための臨床環境への移行を改善するであろう。
ＥＴＶ２は、脈管形成の発生期の間にＥＣにおいて発現され、形成中期に脈管ネットワークがそれぞれの器官内で構築されると、即座に停止させる。ＥＴＶ２は、血管新生または腫瘍成長中、周産期またはストレスを受けた成体ＥＣのサブセットにおいて誘導される場合を除いて、成体ＥＣにおいて発現されない。本発明者らのグループらは、非血管細胞におけるＥＴＶ２の一過的な再導入が、安定なＥＣ運命を構築するのに十分であることを示した。加えて、ＥＴＶ２欠損マウスは、血液も血管系も発達しないため、ＥＴＶ２が、血管細胞の運命特定、形態形成、および可塑性を決定する重要な因子として機能するということは妥当と思われる。
本開示の方法は、糖尿病を治癒し、それによって、糖尿病と関連する長期の微小血管の合併症を予防するための、ドナー由来の精製された膵島（またはβ細胞オルガノイド）内のβ細胞の機能的インビトロでの維持、および移植後のレシピエントにおけるこれらの膵島（またはオルガノイド）の長期生着に必須である、特化した膵島内特異的血管ニッチの生成を可能にする。再プログラミングされた自家（すなわち、患者から採取された）または遺伝子的に適合する同種（すなわち、遺伝子的に適合性のある個体から採取された）内皮細胞（ＥＣ）による、精製したドナー由来の膵島（またはβ細胞オルガノイド）の再脈管形成は、ドナー由来の膵島の完全性および機能性を増加させ、移植された膵島／オルガノイドの生着および免疫完全性を増大させる。
本開示の態様は、膵島に脈管形成するための方法であって、β細胞を含む膵島を、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共培養することを含み、ＥＴＶ２転写因子が、内皮細胞において発現され、それによって、脈管形成された膵島を生成する、方法を対象とする。
一部の実施形態において、内皮細胞は、Ｓｏｘ１６転写因子をコードする外因性核酸をさらに含み、Ｓｏｘ１６は、内皮細胞において発現される。
一部の実施形態において、共培養は、少なくとも３～４週間行われる。
一部の実施形態において、膵島および内皮細胞は、さらなる期間共培養され、さらなる共培養は、内皮細胞がＥＴＶ２転写因子を発現しない条件下において生じる。
一部の実施形態において、さらなる共培養は、少なくとも１週間行われる。
一部の実施形態において、内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、脂肪由来内皮細胞、または器官特異的内皮細胞を含む。
一部の実施形態において、器官特異的内皮細胞は、心臓特異的内皮細胞、筋肉特異的内皮細胞、腎臓特異的内皮細胞、精巣特異的内皮細胞、卵巣特異的内皮細胞、リンパ系特異的内皮細胞、肝臓特異的内皮細胞、膵臓特異的内皮細胞、脳特異的内皮細胞、肺特異的内皮細胞、骨髄特異的内皮細胞、脾臓特異的内皮細胞、大腸特異的内皮細胞、および小腸特異的内皮細胞からなる群から選択される。
一部の実施形態において、共培養は、塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ－２）およびヘパリンを含む培地において培養することを含む。
一部の実施形態において、共培養は、バイオリアクターまたはマイクロ流体デバイスにおいて行われる。
一部の実施形態において、共培養は、合わせた最終濃度で約１０～約１２ｍｇ／ｍｌのラミニンおよびエンタクチンの混合物、ならびに約０．２～約０．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩＶを含む、細胞外マトリックスにおいて行われる。
一部の実施形態において、脈管形成は、動脈、静脈、毛細血管、細動脈、細静脈、リンパ管、またはこれらの組合せの形成を含む。
本開示の別の態様は、本開示の方法によって得られる脈管形成された膵島を対象とする。
本開示の別の態様は、本開示の方法によって得られる脈管形成された膵島を、必要とする対象に投与することを含む、方法を対象とする。一部の実施形態において、膵島は、対象に対して自家である。一部の実施形態において、膵島は、対象に対して同種であり、一部の実施形態において、同種膵島は、対象に遺伝子的に適合する。一部の実施形態において、膵島は、対象に、外科手術もしくはカテーテルの埋込みによって投与されるか、または血管内経路を通じて注入される。一部の実施形態において、膵島は、皮下または血管内注入を通じて対象に投与される。
本開示の別の態様は、脈管形成されたβ細胞オルガノイドを作製するための方法であって、β細胞を、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞とともに、成体内皮細胞がＥＴＶ２転写因子を発現する条件下において共培養することを含む、方法を対象とする。
一部の実施形態において、内皮細胞は、Ｓｏｘ１６転写因子をコードする外因性核酸をさらに含む。
一部の実施形態において、共培養は、塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ－２）およびヘパリンを含む培地において培養することを含む。
一部の実施形態において、共培養は、少なくとも３～４週間行われる。
一部の実施形態において、本方法は、β細胞および内皮細胞をさらなる期間共培養することをさらに含み、さらなる共培養は、内皮細胞がＥＴＶ２転写因子を発現しない条件下において行われる。一部の実施形態において、さらなる共培養は、少なくとも１週間行われる。
一部の実施形態において、内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、脂肪由来内皮細胞、または器官特異的内皮細胞を含む。一部の実施形態において、器官特異的内皮細胞は、心臓特異的内皮細胞、筋肉特異的内皮細胞、腎臓特異的内皮細胞、精巣特異的内皮細胞、卵巣特異的内皮細胞、リンパ系特異的内皮細胞、肝臓特異的内皮細胞、膵臓特異的内皮細胞、脳特異的内皮細胞、肺特異的内皮細胞、骨髄特異的内皮細胞、脾臓特異的内皮細胞、大腸特異的内皮細胞、および小腸特異的内皮細胞からなる群から選択される。
一部の実施形態において、共培養は、合わせた最終濃度で約１０～約１２ｍｇ／ｍｌのラミニンおよびエンタクチンの混合物、ならびに約０．２～約０．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩＶを含む、細胞外マトリックスにおいて行われる。
一部の実施形態において、共培養は、バイオリアクターまたはマイクロ流体デバイスにおいて行われる。
一部の実施形態において、脈管形成は、動脈、静脈、毛細血管、細動脈、細静脈、もしくはリンパ管、またはこれらの組合せの形成を含む。
本開示の別の態様は、本開示の方法によって得られる脈管形成されたβ細胞オルガノイドを対象とする。
本開示の別の態様は、本開示の方法によって得られる脈管形成されたβ細胞オルガノイドを、必要とする対象に投与することを含む、方法を対象とする。一部の実施形態において、脈管形成されたβ細胞オルガノイドは、対象に、外科手術もしくはカテーテルの埋込みによって投与されるか、または血管内経路を通じて注入される。一部の実施形態において、脈管形成されたβ細胞オルガノイド膵島は、対象に皮下投与される。
一部の実施形態において、本方法において使用されるβ細胞は、（１）胚性多能性幹細胞（ＥＳＣ）に由来するβ細胞、（２）人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）に由来するβ細胞、（３）線維芽細胞の直接的な転写変換に由来するβ細胞、および（４）成体対象から単離されたβ細胞からなる群から選択される細胞を含む。
一部の実施形態において、β細胞は、対象に対して自家である。一部の実施形態において、β細胞は、対象に対して同種であり、一部の実施形態において、同種β細胞は、対象に遺伝子的に適合する。
特許または出願書類は、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面を有するこの特許または特許出願公開のコピーは、必要に応じて、かつ必要な費用の支払いに応じて、当局により提供されるであろう。
図１Ａ～１Ｍは、Ｒ－ＶＥＣは、インビトロで３次元の永続性でルーメン化された血行動態的に安定した灌流可能な血管へと自己アセンブルする。（Ａ）マトリゲルおよびマイクロ流体デバイスにおける血管の実験設定の概要である。（Ｂ）ＣＴＲＬ－ＥＣおよびＲ－ＶＥＣの管形成の２４時間～８週間の時間過程の代表的な画像である。１００，０００個のＧＦＰ標識化対照ＥＣ（ＣＴＲＬ－ＥＣ）またはＥＴＶ２リセット血管内皮細胞（Ｒ－ＶＥＣ）を、Ｓｔｅｍ Ｓｐａｎ＋ノックアウト血清＋サイトカイン中においてマトリゲルに播種し、経時的にモニタリングした。（Ｃ）マトリゲルでの８週間の培養の様々な時点におけるＣＴＲＬ－ＥＣおよびＲ－ＶＥＣの血管領域の定量化である。シダックの事後検定を伴う２方向ＡＮＯＶＡ（ｎ＝３つの独立したＨＵＶＥＣ株、２４時間のｐ＝０．０２３４、１週間のｐ＜０．００２４、４週間のｐ＜０．０００１、８週間のｐ＜０．０００１）。（Ｄ）脂肪ＣＴＲＬ－ＥＣおよび脂肪Ｒ－ＶＥＣのマトリゲルでの管形成の２４時間～８週間の時間過程の代表的な画像である。（Ｅ）マトリゲルでの８週間の培養の脂肪ＣＴＲＬ－ＥＣおよび脂肪Ｒ－ＶＥＣの血管領域の定量化である。シダックの事後検定を伴う２方向ＡＮＯＶＡ（ｎ＝３つの独立した脂肪株、２４時間のｐ＝０．００１５、１週間、４週間、８週間のｐ＜０．０００１）。（Ｆ）１６週目の時点におけるＲ－ＶＥＣ血管の代表的な画像である。２４ウェルプレートの１つのウェル内の培養物全体にわたる安定な組織化された血管叢の存在を示すために、タイルスキャンモードでＺスタック画像を得た。（Ｇ）Ｒ－ＶＥＣ管の免疫染色は、ルーメン内部のポドカリキシン（頂端側、赤色）および血管の外側のラミニン（基底側、緑色）の適切な極性を示した。（Ｈ）マトリゲル、および定義されたラミニン、エンタクチン、コラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）マトリックスにおける８週間にわたるＲ－ＶＥＣ血管形成の定量化である。Ｒ－ＶＥＣは、マトリゲルおよびＬ．Ｅ．Ｃの両方において同様に堅強かつ安定な血管を形成した。シダックの事後検定を伴う２方向ＡＮＯＶＡ（ｎ＝３回の独立した実験、２４時間のｐ＝０．９５０４、１週間のｐ＝０．８２２６、４週間のｐ＝０．７７７８、８週間のｐ＝０．９６５９）。ｉ）ルーメンが、電子顕微鏡によって示されるように、ステージ３で、マトリゲルおよびＬ．Ｅ．Ｃ．の両方において形成されたＲ－ＶＥＣ血管に存在している。（Ｊ）マイクロ流体デバイスにおける実験設定を示す概略図である。ＣＴＲＬ－ＥＣおよびＲ－ＶＥＣ（緑色）を、マイクロ流体デバイスにおいてフィブリンゲルに撒いた。デバイスは、サイズが３×１×１ミリメートル3（３マイクロリットルの容積）～５×３×１ミリメートル3（１５マイクロリットルの容積）の範囲であった。（Ｋ）赤色蛍光ビーズ（４μｍ）を、シリンジポンプでマイクロ流体デバイス（３×１×１ミリメートル3）に注入して、血管の灌流を評価した。Ｒ－ＶＥＣ血管を重ねた蛍光ビーズ流を示す低速度撮影動画の複数の画像（右）は、Ｒ－ＶＥＣがルーメン化された灌流可能な血管を形成したことを示し、一方でＣＴＲＬ－ＥＣ（緑色）はデバイスにおいて血管を形成することができなかった（左の画像）。マイクロ流体デバイスにおける６日目時点でのＣＴＲＬ－ＥＣおよびＲ－ＶＥＣの血管領域の定量化である。両側スチューデントｔ検定（ｎ＝３回の独立した実験、ｐ＝０．０２１４）。（Ｌ）１５マイクロリットルの大型サイズのマイクロ流体チャンバー（５×３×１ミリメートル3）に、Ｒ－ＶＥＣが分枝した。１５マイクロリットルのフィブリン中の６０，０００個のＲ－ＶＥＣを、それぞれのデバイスに埋め込んだ。ヒトＶＥｃａｄに対する蛍光標識化抗体を、注入口から灌流させた後、固定の前にすべての血管を染色した。デバイス全体および正射サブセットの最大強度画像が示されている。（Ｍ）インタクトなヘパリン化ヒト全末梢血を、チャンバーの注入口から注入した。ＲＢＣ、ＷＢＣ、血小板、および非撹拌血漿のすべての成分から構成されるインタクトなヘパリン化ヒト末梢血細胞は、崩壊することも流れの妨害もなく、複数層の連続したＲ－ＶＥＣ毛細血管ネットワークを通じて容易に灌流する。それぞれの灌流実験について、１００μｌの末梢血を注入し、血行動態的な問題のいずれの兆候もなく、灌流した。灌流した血液を、培地で洗浄してもよい。デバイス内のＲ－ＶＥＣ脈管叢は、脈管が崩壊することなく、複数回の末梢血注入および洗浄ステップを耐容することができた。データは、平均±標準誤差として表す。ｎｓ＝有意差なしであり、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、および＊＊＊＜０．００１は、統計学的有意性を示す。 図１－１の続き。 図１－２の続き。 図１－３の続き。 図１－４の続き。 図１－５の続き。 図１－６の続き。 図２Ａ～２Ｈは、Ｒ－ＶＥＣは、インビボにおいて堅強で長期持続する吻合した血管へと組織化する。（Ａ）蛍光標識化したＣＴＲＬ－ＥＣまたはステージ１の誘導時Ｒ－ＶＥＣを、ラミニン、エンタクチン、コラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ）の混合物中の単一細胞懸濁液として、ＳＣＩＤベージュマウスに皮下注射した、インビボプラグ実験の概略図である。灌流される血管の形成を、複数の時点にわたって評価した。（Ｂ）ＣＴＲＬ－ＥＣおよびＲ－ＶＥＣプラグの２ヶ月時点における代表的な画像である（ｎ＝３匹のマウス）。（Ｃ）Ｒ－ＶＥＣプラグとＣＴＲＬ－ＥＣプラグとを比較した、２ヶ月の時点および５ヶ月の時点において単離したＬ．Ｅ．Ｃプラグの全載共焦点画像である（ｎ＝３匹のマウス）。Ａｌｅｘａ６４７にコンジュゲートした抗ヒトＶＥカドヘリン（ＶＥｃａｄ）抗体（白色）を、ヒト血管のマウス脈管構造への灌流および吻合について評価するために、殺処理の８分前にマウスの後眼窩に注射した。スケールバー＝１００μｍ。（Ｄ）１ヶ月、２ヶ月、および５ヶ月の時点で、複数の切片（１２～１８個の切片）においてＥＣ蛍光強度の割合として測定した血管領域の定量化である。シダックの事後検定を伴う２方向ＡＮＯＶＡ（ｎ＝３匹のマウス／条件、１ヶ月のｐ＜０．０００１、２ヶ月のｐ＝０．０００２、５ヶ月のｐ＜０．０００１）。（Ｅ）抗マウスエンドムチン抗体でマウスＥＣについて染色した、埋込みの２ヶ月後のＣＴＲＬ－ＥＣまたはＲ－ＶＥＣのＬ．Ｅ．Ｃ．プラグ全体の切片である。ヒト特異的ＶＥｃａｄ抗体を、殺処理の直前に生体内に注射し、適切に組織化されたヒトＲ－ＶＥＣがマウスエンドムチン+血管に吻合していることを特定した。（Ｆ）抗マウスＳＭＡ抗体で後染色した埋込みの２ヶ月後のＬ．Ｅ．Ｃ．におけるＲ－ＶＥＣプラグの切片である。ヒト特異的ＶＥｃａｄ抗体を、殺処理の直前に生体内に注射した。（Ｇ）マウスに、Ｌ．Ｅ．Ｃにおいて、対照ＥＣ（ｔＴＡレンチウイルスのみを形質導入したＨＵＶＥＣ）またはステージ１のドキシサイクリン誘導性ＥＴＶ２ ＥＣ（ｉＲ－ＶＥＣ：ｔＴＡおよび誘導性ＥＴＶ２レンチウイルスの両方を形質導入したＨＵＶＥＣ）のいずれかを皮下注射した、インビボプラグアッセイである。一方の群のマウスは、ドキシサイクリン食を摂り（ＥＴＶ２が継続的に作動）、もう一方の群のマウスは、１週間ドキシサイクリン食を摂り（ＥＴＶ２作動）、その後で通常食へと切り替えた（ＥＴＶ２停止）。すべてのマウスは、埋込みの２ヶ月後に殺処理した。赤色は、ｍＣｈｅｒｒｙ標識化ヒトＥＣを示し、白色：マウスを殺処理する前に後眼窩に注入した抗ＶＥｃａｄ抗体である。スケールバー＝１００μｍ。（Ｈ）ｔＴＡのみのプラグ、１週間ドキシサイクリンを摂取したマウス、および継続的にドキシサイクリン食を摂取したマウス（ＥＴＶ２作動）の、血管領域の定量化である。すべてのマウスは、埋込みの２ヶ月後に殺処理した。テューキーの事後検定を伴う１方向ＡＮＯＶＡ（ｎ＝３～４、ｔＴＡ対ｉＲ－ＶＥＣ ｄｏｘ １週間ｐ＝０．００２８、ｔＴＡ対ｉＲ－ＶＥＣ ｄｏｘ ｐ＝０．００４６、ｉＲ－ＶＥＣ ｄｏｘ １週間対ｉＲ－ＶＥＣ ｄｏｘ ｐ＝０．００２８）。データは、平均±標準誤差として表す。ｎｓ＝有意差なしであり、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、および＊＊＊＜０．００１は、統計学的有意性を示す。 図２－１の続き。 図２－２の続き。 図２－３の続き。 図２－４の続き。 図２－５の続き。 図３Ａ～３Ｋは、Ｒ－ＶＥＣのトランスクリプトーム分析により、Ｒａｐ１経路および可塑性転写シグネチャーの活性化が明らかとなる。（Ａ）２Ｄ単一層（ステージ１誘導）におけるＲ－ＶＥＣまたはＣＲＴＬ－ＨＵＶＥＣ（ｎ＝４つの独立したＥＣ株）を、ＲＮＡシーケンシングによって分析した。ＧＯターム分析を、差示的に発現される遺伝子に行った。オレンジ色の線は、それぞれのＧＯカテゴリー内の差示的に発現される（ＤＥ）遺伝子の数を表し、灰色の棒グラフは、濃縮のｐ値を表す。ＧＯカテゴリーは、ＤＥ遺伝子の数に基づく順番である。（Ｂ）上位の濃縮されたＧＯカテゴリー内の選択された遺伝子のヒートマップである。示される遺伝子を、ＤＥＳｅｑ２で差示的に発現されるとして検出した（ｌｏｇ2ＦＣ≧±１．５、調節後のｐ＜０．０５）。値は、ｌｏｇ2正規化した１００万当たりの計数（ｃｏｕｎｔｓ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）であり、中央揃えされ行ごとにスケーリングされている。それぞれの差示的に発現される遺伝子のプロモーターにおけるＣｈＩＰ－ｓｅｑからのＥＴＶ２結合が、黄緑色のヒートマップで示される。（Ｃ）ＥＴＶ２ ＣｈＩＰシーケンシングを、抗ｆｌａｇ抗体を使用して、ステージ１の誘導期（２Ｄ）のＲ－ＶＥＣに行った。マウスＩｇＧを、ＥＴＶ２ ＣｈＩＰの対照として使用した。Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、およびＨ３Ｋ２７ｍｅ３のヒストン改変ＣｈＩＰを、ＣＴＲＬ－ＥＣおよび誘導ステージ１（２Ｄ）のＲ－ＶＥＣの両方に行った。濃縮された領域を、ＣｈＩＰシーケンシングによって分析した。黒色のバー、ＥＴＶ２濃縮領域。緑色のバー、Ｋ４ｍｅ３改変の増加を有する領域。青色のバー、Ｋ２７ａｃ改変の増加を有する領域。ＥＴＶ２によって結合されるプロモーター領域は、クリーム色で強調表示されている。（Ｄ）ステージ１の誘導期において、Ｒ－ＶＥＣとＣＴＲＬ－ＥＣとを対比したＲａｐ１経路における遺伝子のＲＮＡ発現の箱ひげ図である。線は、平均値を表す。差示的に発現される遺伝子を、ＤＥＳｅｑ２を使用して検出した（調整ｐ＜０．０５）（ｎ＝４つの独立したＨＵＶＥＣ株）。（Ｅ）Ｒ－ＶＥＣ（ステージ１誘導）とＣＴＲＬ－ＥＣとにおける総Ｒａｐ１入力と比較した、活性Ｒａｐ１－ＧＴＰのプルダウンアッセイのウエスタンブロット分析である。（Ｆ）総Ｒａｐ１に対する活性Ｒａｐ１の発現レベルの定量化は、Ｒ－ＶＥＣ（ステージ１の誘導）において、ＣＴＲＬ－ＥＣよりも高いＲａｐ１活性を示した。両側対応のある比のｔ検定（ｎ＝５回の独立した実験、ｐ＝０．００１３）。（Ｇ）４週間の時点でのＲａｐ１阻害剤またはＤＭＳＯを用いたＲ－ＶＥＣ血管のＺ－スタック共焦点画像および電子顕微鏡画像である。赤色の円は、正射断面を示す。（Ｈ）１週間および４週間時点でのＲａｐ１阻害剤またはＤＭＳＯを用いたＲ－ＶＥＣ血管形成の定量化は、Ｒａｐ１経路の阻害が、血管ネットワークの形成を有意に減少させたことを示した。シダックの事後検定を伴う２方向ＡＮＯＶＡ（ｎ＝３つの生物学的複製物、１週間のｐ＝０．８２７９、４週間のｐ＝０．０１３１）。（Ｉ）Ｒ－ＶＥＣにおける２つの異なるｓｈＲＮＡによるＲＡＳＧＲＰ３のノックダウンである。ルシフェラーゼに対するｓｈＲＮＡを形質導入したＲ－ＶＥＣを、対照として使用した。（Ｊ）２週間および４週間の時点でのＲＡＳＧＲＰ３ノックダウンＲ－ＶＥＣ、ルシフェラーゼｓｈＲＮＡ Ｒ－ＶＥＣ、またはナイーブＲ－ＶＥＣを用いた血管形成の定量化である。シダックの事後検定を伴う２方向ＡＮＯＶＡ（ｎ＝３つの独立したノックダウンＲ－ＶＥＣ株、２週間：Ｒ－ＶＥＣ対ルシフェラーゼｓｈＲＮＡのｐ＝０．９８４７、４週間：Ｒ－ＶＥＣ対ルシフェラーゼｓｈＲＮＡのｐ＝０．９６９２、２週間および４週間：Ｒ－ＶＥＣ対ＲＡＳＧＲＰ３ノックダウンおよびルシフェラーゼｓｈＲＮＡ対ＲＡＳＧＲＰ３ノックダウンのｐ＜０．０００１）。（Ｋ）血管形成のそれぞれのステージ：誘導、リモデリング、安定化における差示的に発現される遺伝子のヒートマップである。差示的に発現される遺伝子を、対応のあるモデル比検定を使用して、ＤＥＳｅｑ２で検出して、誘導ステージと安定化ステージとの間の差を検出した（調整後のｐ＜０．０５）。値は、ｌｏｇ2正規化した１００万当たりの計数であり、中央揃えされ行ごとにスケーリングされている（ｎ＝３つの独立したＲ－ＶＥＣ株）。データは、平均±標準誤差として表す。ｎｓ＝有意差なしであり、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、および＊＊＊＜０．００１は、統計学的有意性を示す。 図３－１の続き。 図３－２の続き。 図３－３の続き。 図３－４の続き。 図３－５の続き。 図４Ａ～４Ｋは、Ｒ－ＶＥＣおよびｉＲ－ＶＥＣは、脱細胞化された腸の脈管構造に生着しそこで増殖し、再内皮化された腸の異所性埋込み時に、宿主の脈管構造内に生着する。（Ａ）脱細胞化された腸における異所性埋込みの実験手順を説明する概略図である。（Ｂ）採取したラット腸を、ルーメン、腸間膜動脈、および腸間膜静脈を通じてカニューレ処理した（スケールバー１ｃｍ）。（Ｃ）脱細胞化された腸は、肉眼で見て天然の脈管構造を保存している、スケールバー５ｍｍ。（Ｄ）撒かれたＲ－ＶＥＣは、均一に拡がり、遠位毛細血管に到達することができる、スケールバー５ｍｍ。（Ｅ）Ｒ－ＶＥＣおよびドキシサイクリン誘導性ＥＴＶ２ Ｒ－ＶＥＣ（ｉＲ－ＶＥＣ）は、遠位毛細血管を含む脈管構造全体で、血管の内側にある脈管構造に再配置する（スケールバー５００μｍ）。誘導性ＥＴＶ２について、ドキシサイクリンは、脱細胞化された腸に撒いた３日後に除去した。ＣＴＲＬ－ＥＣは、同じ再配置および内皮化を達成することができない。（Ｆ）対照ＥＣと比較したＲ－ＶＥＣおよびｉＲ－ＶＥＣによって被覆される領域の定量化は、Ｒ－ＶＥＣによる再内皮化の増加を示した（ｎ＝１群当たり３つの独立した腸、両側スチューデントｔ検定、内皮被覆：ＣＴＲＬ－ＥＣ対Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．００６５、ＣＴＲＬ－ＥＣ対ｉＲ－ＶＥＣのｐ＝０．００５２、Ｒ－ＶＥＣ対ｉＲ－ＶＥＣのｐ＝０．０５１２、平均血管長さ：ＣＴＲＬ－ＥＣ対Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．０３０１、ＣＴＲＬ－ＥＣ対ｉＲ－ＶＥＣのｐ＝０．００２２、Ｒ－ＶＥＣ対ｉＲ－ＶＥＣのｐ＝０．０５３８、総血管長さ：ＣＴＲＬ－ＥＣ対Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．００２６、ＣＴＲＬ－ＥＣ対ｉＲ－ＶＥＣのｐ＝０．０３６６、Ｒ－ＶＥＣ対ｉＲ－ＶＥＣのｐ＝０．５３０１、ジャンクション密度：ＣＴＲＬ－ＥＣ対Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．００９４、ＣＴＲＬ－ＥＣ対ｉＲ－ＶＥＣのｐ＝０．０２９６、Ｒ－ＶＥＣ対ｉＲ－ＶＥＣのｐ＝０．３２６７）。（Ｇ）バイオリアクターにおける７日間の培養の後、蛍光ＬＤＬでの灌流は、Ｒ－ＶＥＣの開存した血管を示した（スケールバー５０μｍ）。（Ｈ～Ｉ）再内皮化された腸の異所性埋込みは、抗ヒトＶＥカドヘリン抗体の生体内静脈注射によって示されるように、１週間および４週間後の細胞の生着、ならびに宿主の脈管構造への吻合を示す（スケールバー５０μｍ）。代表的なＨ＆Ｅ染色は、解剖学的に正常な灌流する血管を示した。（Ｊ）１週間および４週間の時点での埋め込んだ再内皮化された腸における、ＣＴＲＬ－ＥＣと比較したＲ－ＶＥＣによって被覆される領域の定量化である（ｎ＝１群当たり３～５匹の動物、両側スチューデントｔ検定、ヒトＶＥｃａｄ+細胞によって被覆されている領域、１週間のｐ＝０．０３１７、４週間のｐ＝０．００２８、ヒトＶＥｃａｄ+細胞の血管の長さ：１週間のｐ＝０．０３７８、４週間のｐ＝０．００６２、ジャンクションの総数：１週間のｐ＝０．０３４２、４週間のｐ＝０．００４）。（Ｋ）１週間および４週間の時点での埋め込んだ再内皮化された腸におけるＥＣ増殖およびアポトーシスの定量化である（ｎ＝１群当たり３匹の動物、両側スチューデントｔ検定、アポトーシス：１週間のｐ＝０．１８３２、４週間のｐ＝０．００９６、増殖：１週間のｐ＝０．７５２８、４週間のｐ＝０．０２１３）。データは、平均±標準誤差として表す。ｎｓ＝有意差なしであり、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、および＊＊＊＜０．００１は、統計学的有意性を示す。 図４－１の続き。 図４－２の続き。 図４－３の続き。 図４－４の続き。 図４－５の続き。 図４－６の続き。 図５Ａ～５Ｎは、血行動態的に安定なＲ－ＶＥＣは、インビトロでヒト膵島外植片に脈管形成し、膵島インスリン分泌を増強させる。（Ａ）４日目の時点での、単独またはＣＴＲＬ－ＥＣもしくはＲ－ＶＥＣとの共培養のいずれかのインビトロでの５０マイクロリットルの静置マトリゲルドームにおけるヒト膵島外植片の代表的な画像である。２５０，０００個のＣＴＲＬ－ＥＣまたはＲ－ＶＥＣを、２００個のヒト膵島とともに、５０μｌのマトリゲルドームに撒いた。（Ｂ）１６．７ｍＭおよび２ｍＭのグルコースでの分泌されるインスリン間の変化倍数として判定した、グルコース刺激後のマトリゲルドームにおけるインスリン分泌の変化倍数である。インスリン測定のために、２５個のヒト膵島外植片を、単独、または２００，０００個のＣＴＲＬ－ＥＣもしくはＲ－ＶＥＣとともに、４０μｌのマトリゲルドームにおいて培養し、２週間後にインスリンを測定した。テューキーの事後検定を伴う１方向ＡＮＯＶＡ（ｎ＝４人の異なるヒトドナーの非糖尿病性膵島の１１個の複製物、膵島単独対膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣのｐ＝０．９９３１、膵島単独対膵島＋Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．０２００、膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣ対膵島＋Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．０２６１）。（Ｃ）２週間の時点での膵島と直接的に相互作用する内皮細胞の血管領域、マンホイットニーのＵ検定（ｎ＝９：膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣ、およびｎ＝１４：膵島＋Ｒ－ＶＥＣ、３つの生物学的複製物から、ｐ＝０．０００３）。（Ｄ）２週間の時点でのマトリゲルドームにおいて共培養した膵島のＥｐＣＡＭおよびＶＥカドヘリン（ＶＥｃａｄ）染色である。（Ｅ）２週間の時点でのヒト膵島と共培養したＲ－ＶＥＣの正射投影である。（Ｆ）単独、ＣＴＲＬ－ＥＣの存在下、またはＲ－ＶＥＣの存在下において膵島を撒くために使用される、大容積の５×３×１ミリメートル3の容量のマイクロ流体デバイスの概要である。マイクロ流体デバイスの容積は、１５マイクロリットルであり、フィブリンゲルにおいて６０，０００個の内皮細胞および約４０個の膵島が収容された。（Ｇ）蛍光標識化したヘパリン化ヒト全血を、３つの条件下でマイクロ流体デバイスに灌流させた（４日目）。膵島をＲ－ＶＥＣの存在下で撒いたデバイスのみが、血液を灌流させることができ、相互接続された脈管ネットワークを形成していた。（Ｈ）ＥｐＣＡＭおよびＶＥｃａｄで後染色した膵島外植片のデバイス全体の代表的な最大強度投影である（４日目）。（Ｉ～Ｊ）膵島を包囲している血管を通って、および膵島に通っている血管に流れる、捕捉したヒトヘパリン化全血である。赤色の円は、ヒト膵島の周りに描かれている。（Ｋ）膵島を、マイクロ流体デバイスにおいてＲ－ＶＥＣと共培養し（４日目）、固定の前に、血管ネットワークに、ヒトＶＥｃａｄに対する抗体を灌流させた。続いて、血管ネットワーク全体を、ＥｐＣＡＭに対する抗体で後染色し、ヒト膵島を視覚化した。マイクロ流体デバイスにおいてＲ－ＶＥＣによって脈管形成され、ＶＥｃａｄ、ＥｐＣＡＭ、およびインスリンについて染色した、ヒト膵島の代表的な最大強度および正射投影である。（Ｌ）４日目の時点でのマイクロ流体デバイスにおける生理学的条件下でのグルコース刺激試験を表す図である。デバイスのサイズは、５ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍであり、１５マイクロリットルのフィブリンゲルにおいて６０，０００個の内皮細胞および約４０個の膵島を収容した。（Ｍ）それぞれのデバイスの排出口において回収された、総インスリン分泌／デバイスである。インスリンレベルを、経時的に、基礎低グルコースレベル（２ｍＭ）および高グルコース刺激（１６．７ｍＭ）で測定した。テューキーの事後検定を伴う２方向ＡＮＯＶＡ。星印（＊）は、膵島単独群と膵島＋Ｒ－ＶＥＣ群との間の比較を表し、番号記号（＃）は、膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣと膵島＋Ｒ－ＶＥＣとの間の比較を表す（データは、３人の異なるヒトドナーに由来する膵島を用いた実験から得られたものである。円形記号は、個々のデバイスを表す。膵島単独＝４つのデバイス、膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣ＝４つのデバイス、膵島＋Ｒ－ＶＥＣ＝８つのデバイス、９分：膵島単独対膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣのｐ＝０．８２０４、膵島単独対膵島＋Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．０００４、膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣ対膵島＋Ｒ－ＶＥＣのｐ＜０．０００１、２４分：膵島単独対膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣのｐ＝０．７１０９、膵島単独対膵島＋Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．００３３、膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣ対膵島＋Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．０００２）。（Ｎ）高グルコース刺激の９分後の排出口におけるインスリンの変化倍数（１６．７ｍＭにおけるインスリンレベル／２ｍＭにおけるインスリンレベル）である。ダンの事後検定を伴うクラスカルワリス検定（データは、３人の異なるヒトドナーに由来する膵島を用いた実験から得られたものである。円形記号は、個々のデバイスを表す。膵島単独＝４つのデバイス、膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣ＝４つのデバイス、膵島＋Ｒ－ＶＥＣ＝８つのデバイス、膵島単独対膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣのｐ＞０．９９９９、膵島単独対膵島＋Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．０２０７、膵島＋ＣＴＲＬ－ＥＣ対膵島＋Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．０２６７）。 図５－１の続き。 図５－２の続き。 図５－３の続き。 図５－４の続き。 図５－５の続き。 図５－６の続き。 図６Ａ～６Ｊは、ＥＴＶ２ ＥＣは、正常結腸組織に由来するオルガノイドに分枝する。（Ａ）正常結腸オルガノイドを、単独で、または２５０，０００個のＣＴＲＬ－ＥＣもしくはＲ－ＶＥＣとともに、５０マイクロリットルのマトリゲルドームに撒いた。マトリゲルにおける、患者由来のヒト正常結腸オルガノイドの、単独、またはＣＴＲＬ－ＥＣもしくはＲ－ＶＥＣとの共培養での、５０マイクロリットルのマトリゲルドーム全体の最大強度共焦点投影である。画像は、８日目に取得した（ｎ＞１５回の実験の代表的な画像）。（Ｂ）ズームインした最大強度、および（Ｃ）８日目におけるヒト正常結腸オルガノイドを伴うＲ－ＶＥＣの正射投影画像である。（Ｄ）８日目の時点でのオルガノイド当たりのＥｄＵ+細胞である。細胞に、１６時間のＥｄＵパルスを行い、ＥｐＣＡＭで後染色して、オルガノイドを特定した。ダンの事後検定を伴うクラスカルワリス検定（ｎ＝３回の独立した実験、ＥＣなし＝１０５個のオルガノイド、ＣＴＲＬ－ＥＣ＝２５８個のオルガノイド、Ｒ－ＶＥＣ＝４６７個のオルガノイド、ＥＣなし対ＣＴＲＬ－ＥＣのｐ＜０．０００１、ＥＣなし対Ｒ－ＶＥＣのｐ＜０．０００１、ＣＴＲＬ－ＥＣ対Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．００６２）。（Ｅ）８日目の時点での結腸領域（ＫＲＴ２０によって染色される）／視野の定量化である。ダンの事後検定を伴うクラスカルワリス検定（ｎ＝３回の独立した実験にわたって９ウェル、ＥＣなし対ＣＴＲＬ－ＥＣのｐ＞０．９９９９、ＣＴＲＬ－ＥＣ対Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．０２９３、Ｒ－ＶＥＣ対ＣＴＲＬ－ＥＣのｐ＝０．００２９）。（Ｆ）８日目の時点での結腸オルガノイドの数／視野の定量化である。テューキーの事後検定を伴う１方向ＡＮＯＶＡ（ｎ＝３回の独立した実験にわたって９ウェル、ＥＣなし対ＣＴＲＬ－ＥＣのｐ＞０．７７２９、ＣＴＲＬ－ＥＣ対Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．１１９１、Ｒ－ＶＥＣ対ＣＴＲＬ－ＥＣのｐ＝０．０２８９）。（Ｇ）８日目の時点での患者由来の正常結腸との共培養物におけるＣＴＲＬ－ＥＣ対Ｒ－ＶＥＣでの血管領域／視野の定量化である。ウェルチの補正を伴う両側ｔ検定（ｎ＝３回の独立した実験にわたって９ウェル、ｐ＜０．０００１）。（Ｈ）Ｌ．Ｅ．Ｃ．において患者由来の正常結腸オルガノイドと相互作用するＥＣ（Ｒ－ＶＥＣまたはＣＴＲＬ－ＥＣ）の領域の動態を、マルチゾーン共焦点顕微鏡を使用して７２時間の低速度撮影にわたって定量化した。Ｒ－ＶＥＣは、ＣＴＲＬ－ＥＣと比較して、患者由来の正常結腸と有意に相互作用した。マンホイットニーのＵ検定（ＣＴＲＬ－ＥＣについてはｎ＝１４個のオルガノイド、Ｒ－ＶＥＣについてはｎ＝１９個のオルガノイド）。（Ｉ）マイクロ流体デバイスにおいて、１５マイクロリットルのフィブリンゲル中、６０，０００個のＲ－ＶＥＣと一緒に撒かれた４０個を上回るヒト正常結腸オルガノイドの概略図である。４日後に、自己アセンブルしたＲ－ＶＥＣ血管に、注入口からＶＥｃａｄを灌流させて、脈管ネットワークを染色した。ヒト結腸オルガノイドを、ＥｐＣＡＭについて後染色することによって特定した。領域の最大強度投影を、左の画像に示した。（Ｊ）蛍光ビーズ（４μｍ）を、注入口から押入れ、それらが、マイクロ流体デバイスにおいて血管ネットワークを通じて灌流したときに、画像を捕捉した。データは、平均±標準誤差として表す。＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、および＊＊＊＜０．００１は、統計学的有意性を示す。 図６－１の続き。 図６－２の続き。 図６－３の続き。 図６－４の続き。 図６－５の続き。 図６－６の続き。 図７Ａ～７Ｉは、Ｒ－ＶＥＣは、患者由来の腫瘍結腸オルガノイドに分枝し、成長を補助する。（Ａ）結腸腫瘍オルガノイド（約１００個）を、単独で、または２５０，０００個のＣＴＲＬ－ＥＣもしくはＲ－ＶＥＣとともに、５０マイクロリットルのマトリゲルドームに撒いた。マトリゲルにおける、単独、またはＣＴＲＬ－ＥＣもしくはＲ－ＶＥＣとの共培養での、ヒト結腸腫瘍オルガノイドの代表的な共焦点画像である。オルガノイドを、共培養の８日目の時点で、４．５時間のＥｄＵパルス後に、ＫＲＴ２０およびＥｄＵについて後染色した。（Ｂ）Ｒ－ＶＥＣと共培養し、ＥｐＣＡＭおよびＶＥｃａｄについて後染色した腫瘍結腸オルガノイドの代表的な免疫蛍光画像である。最大強度、および（Ｃ）正射投影を、示す。（Ｄ）１方向ＡＮＯＶＡ後にテューキーの事後検定を行った、８日目の時点での、単独、またはＣＴＲＬ－ＥＣもしくはＲ－ＶＥＣと共培養した、結腸腫瘍オルガノイドにおけるＥｄＵのレベルの定量化である。（ＥＣなしについてｎ＝５つのウェル、ＣＴＲＬ－ＥＣについてはｎ＝６つのウェル、Ｒ－ＶＥＣについてはｎ＝６つのウェル、ｎ＝３回の独立した実験にわたって、ＥＣなし対ＣＴＲＬ－ＥＣのｐ＜０．０００１、ＣＴＲＬ－ＥＣ対Ｒ－ＶＥＣのｐ＝０．００１０、ＥＣなし対Ｒ－ＶＥＣのｐ＜０．０００１）。（Ｅ）マトリゲル（左パネル）またはＬ．Ｅ．Ｃ．（右パネル）におけるヒト腫瘍結腸オルガノイドと相互作用するＥＣ（Ｒ－ＶＥＣまたはＣＴＲＬ－ＥＣ）の表面領域の動態を、マルチゾーン共焦点顕微鏡を使用して７８時間の低速度撮影にわたって定量化した。マンホイットニーのＵ検定。マトリゲルにおける共培養実験（左パネル）では、ＣＴＲＬ－ＥＣについては合計３６個のオルガノイドおよびＲ－ＶＥＣ条件については４３個のオルガノイドを、ＥＣが組み込んでいる領域を定量化するために使用した。Ｌ．Ｅ．Ｃにおける共培養実験（右パネル）では、ＣＴＲＬ－ＥＣについては合計２０個のオルガノイドおよびＲ－ＶＥＣ条件については２６個のオルガノイドを、ＥＣが組み込んでいる領域を定量化するために使用した。（Ｆ）ＣＴＲＬ－ＥＣまたはＲ－ＶＥＣを用いた、８日目の時点でのＣＴＲＬ－ＥＣまたはＲ－ＶＥＣの共培養物における血管領域の定量化である。ウェルチの補正を伴う両側スチューデントｔ検定（３回の独立した実験にわたってｎ＝６ウェル、ｐ＝０．０００３）。（Ｇ）ＣＴＲＬ－ＥＣまたはＲ－ＶＥＣ（ｍＣｈｅｒｒｙ）（ステージ１の誘導）の単一細胞懸濁液を、マトリゲルにおいて患者由来のヒト結腸腫瘍オルガノイド（ＧＦＰ）とともに皮下に埋め込んだ。マウスを、５ヶ月後に殺処理した。Ｒ－ＶＥＣを用いた腫瘍切片の代表的な画像である（厚さ＝１００μｍ）。（Ｈ）マウスエンドムチンおよびＤＡＰＩで後染色した、ＣＴＲＬ－ＥＣまたはＲ－ＶＥＣを用いた腫瘍の切片（厚さ＝５０μｍ）である。（Ｉ）ヒト血管領域の定量化を、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光領域／切片領域の割合によって計算した。ウェルチの補正を伴う両側ｔ検定（ｎ＝３つの腫瘍／群、ｐ＝０．０１９１）。データは、平均±標準誤差として表す。＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、および＊＊＊＜０．００１は、統計学的有意性を示す。 図７－１の続き。 図７－２の続き。 図７－３の続き。 図７－４の続き。 図８Ａ～８Ｉは、３Ｄ共培養物におけるＲ－ＶＥＣと正常および腫瘍結腸オルガノイドとの相互干渉の単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ分析である。（Ａ）単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ実験の概要である。Ｒ－ＶＥＣ（２５０，０００個－ステージ１の誘導）を、単独、または約１００個の正常もしくは腫瘍結腸オルガノイドとともに、５０マイクロリットルのＬ．Ｅ．Ｃ．マトリックスドームに撒いた。１２個のドームを、それぞれの条件について、調製した。７日目に、共培養物を解離させ、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（１０ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォーム）に供した。（Ｂ）単一細胞懸濁液Ｒ－ＶＥＣ（ステージ１の誘導）を、単独、または正常結腸もしくは腫瘍結腸オルガノイドとの混合のいずれかで培養し、共培養の７日目に、１０ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ分析に供した。内皮細胞を、ＶＥｃａｄ（ＣＤＨ５）、ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）、またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）のいずれかに陽性であり、上皮細胞マーカーに陰性であるとして、オルガノイドとの共培養物から特定した。Ｒ－ＶＥＣ単独および正常結腸オルガノイドと共培養したＲ－ＶＥＣの内皮細胞画分のＵＭＡＰプロットである。（Ｃ）内皮細胞を、Ｒ－ＶＥＣ単独および正常結腸オルガノイドと共培養したＲ－ＶＥＣの群から、９つの固有なクラスターで組み合わせた。クラスター５は、正常結腸オルガノイドと共培養したＲ－ＶＥＣが、Ｒ－ＶＥＣ単独と比べて固有に濃縮されていた。（Ｄ）ヒートマップ、および（Ｅ）クラスター５からの差示的に発現される遺伝子のドットプロットである。（Ｆ）単一細胞懸濁液Ｒ－ＶＥＣ（ステージ１の誘導）を、単独、または結腸腫瘍オルガノイドとの混合のいずれかで培養し、共培養の７日目に、１０ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ分析に供した。オルガノイドとの共培養物に由来する内皮細胞を、ＶＥｃａｄ（ＣＤＨ５）、ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）、またはＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）のいずれかに陽性であり、上皮細胞マーカーに陰性であるとして、特定した。Ｒ－ＶＥＣ単独および結腸腫瘍オルガノイドと共培養したＲ－ＶＥＣの内皮細胞画分のＵＭＡＰプロットである。（Ｇ）内皮細胞を、Ｒ－ＶＥＣ単独および正常結腸オルガノイドと共培養したＲ－ＶＥＣの群から、８つの固有なクラスターで組み合わせた。クラスター８は、結腸腫瘍オルガノイドと共培養したＲ－ＶＥＣが、Ｒ－ＶＥＣ単独と比べて固有に濃縮されていた。（Ｈ）ヒートマップ、および（Ｉ）クラスター８からの差示的に発現される遺伝子のドットプロットであり、これは、結腸腫瘍オルガノイドとの培養物におけるＲ－ＶＥＣが、Ｒ－ＶＥＣ単独と比べて濃縮されている。差示的発現は、ウィルコクソンの順位和検定、ＦＤＲ ｐ＜０．０５を使用して行った。 図８－１の続き。 図８－２の続き。 図８－３の続き。 図８－４の続き。 図８－５の続き。 図８－６の続き。 図８－７の続き。 図８－８の続き。 図９Ａ～９Ｃは、膵島／Ｒ－ＶＥＣの生着が、移植の１ヶ月後に、皮下腔において見出された。（Ａ）移植のための細胞を有する液滴である。（Ｂ）膵島／Ｒ－ＶＥＣプラグを、適切な血液供給に接続した。（Ｃ）インスリン＋細胞およびＥＧＦＰを有するＲ－ＶＥＣが、プラグにおいて見出された。 図９－１の続き。 図１０Ａ～１０Ｃは、膵島／Ｒ－ＶＥＣの皮下移植により、ＳＴＺに誘導される糖尿病が緩和された。（Ａ）６時間の絶食後の血中グルコースレベルである。（Ｂ）絶食前の朝に試験した体重である。（Ｃ）体重１ｋｇ当たり２ｇとしてグルコースチャレンジした後２０分の時点における血清ヒトインスリンレベルである。 Ｒ－ＶＥＣ共培養により、ＳＣ－β成熟が促進された。（Ａ）ＥＣ共培養ありまたはなしでのＳＣ－β細胞の画像である。スケールバー：１００μｍ。（Ｂ）ＳＣ－β細胞のＧＳＩＳの変化倍数である。 Ｒ－ＶＥＣ共培養により、ＳＣ－β成熟が促進された。（Ａ）ＥＣ共培養ありまたはなしでのＳＣ－β細胞の画像である。スケールバー：１００μｍ。（Ｂ）ＳＣ－β細胞のＧＳＩＳの変化倍数である。
本開示の態様は、単離／精製した膵島を、再プログラミング（リセット）された内皮細胞（Ｒ－ＶＥＣ）とともに培養することによって、膵島に脈管形成する方法を提供する。いずれの特定の理論にも制限されるものではないが、本発明者らは、膵島をＲ－ＶＥＣと共培養することが、インビトロにおける膵島の脈管分枝を可能にし、移植時に、膵島の機能性を保護および増大させ、インビボでの宿主血管への吻合を加速させることを発見した。
本開示の別の態様は、β細胞オルガノイドを、再プログラミングされた成体ヒト内皮細胞（Ｒ－ＶＥＣ）とともに培養することによって、β細胞オルガノイドに脈管形成する方法を提供する。本開示のこの態様は、患者に移植された後にレシピエントの循環へのβ細胞オルガノイドの急速な分枝および吻合（２つの血管の間の接続を形成すること）の促進を増大させる、ＥＴＶ２+を形質導入した成体内皮細胞（Ｒ－ＶＥＣ）の能力に基づく。
一態様において、本開示は、本方法により得られる産物、例えば、脈管形成された膵島またはβ細胞オルガノイドを提供する。
さらなる態様において、本方法により得られる産物、例えば、脈管形成された膵島またはβ細胞オルガノイドは、必要とする対象、例えば、糖尿病を患う対象に投与される。
本開示全体を通じて使用される「約」という用語は、任意の所与の値の±１０％を指す。
必要とする対象
本明細書において言及される「必要とする対象」とは、糖尿病を患っているかまたは糖尿病を発症するリスクがある人物である。一部の実施形態において、対象は、１型糖尿病を患う。一部の実施形態において、対象は、１型糖尿病を発症するリスクがある。一部の実施形態において、対象は、２型糖尿病を患う。一部の実施形態において、対象は、進行した２型糖尿病、例えば、膵島質量または膵島機能の少なくとも５０％の減少を特徴とする２型糖尿病を患う。
再プログラミングされた、リセットされた血管内皮細胞（Ｒ－ＶＥＣ）
本開示のＲ－ＶＥＣ（再プログラミングされた、リセットされた内皮細胞）は、内皮細胞（ＥＣ）に由来し、それが、内皮細胞におけるＥＴＶ２をコードする外因性核酸の組込みおよび発現を通じて、「再プログラミング」または「リセット」されている。
一部の実施形態において、ＥＣは、任意の組織特異的器官から単離することができる成体ヒト内皮細胞である。一部の実施形態において、ＥＣは、ＥＣを単離することができる任意の組織に由来し得る、一般的な内皮細胞を含む。一部の実施形態において、ＥＣは、膵島またはβ細胞オルガノイドと同じドナー起源のものである。一部の実施形態において、ＥＣは、膵島またはβ細胞オルガノイドとは異なるドナー起源のものであり、一部のそのような実施形態において、ＥＣのドナーおよび膵島またはβ細胞オルガノイドのドナーは、遺伝子的に適合する。一部の実施形態において、ＥＣは、本明細書に開示される処置を必要とする組織対象から単離された自家ＥＣである。具体的な実施形態において、自家ＥＣは、対象自身の脂肪組織から単離される。一部の実施形態において、ＥＣは、遺伝子的に適合するドナーに由来する同種ＥＣである。一部の実施形態において、ＥＣは、循環または組織特異的ＥＣ前駆体または幹細胞に由来する。
一部の実施形態において、内皮細胞は、分化した（成熟）内皮細胞である。本明細書において使用される場合、「分化した」または「分化した内皮細胞」という用語は、内皮細胞が、特定の機能に特化したものとなる、例えば、細胞が、初期細胞型のものとは異なる１つまたはそれ以上の形態学的特徴および／または機能を獲得する、発達プロセスを指す。「分化」という用語は、系統決定、および細胞が成熟し完全に分化した成体内皮細胞に発達することの両方を含む。分化は、例えば、免疫組織化学法または当業者に公知の他の手順を使用して、系統マーカーの存在または不在をモニタリングすることによって、評価することができる。
内皮細胞は、当該技術分野において公知の方法によって、得ることができる。例えば、内皮細胞は、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ；１５１，５５９～５７５、（２０１２）およびＦｅｒｒａｒａらに対する米国特許第６，８９９，８２２号に記載されているコラゲナーゼに基づく消化アプローチを使用して、組織から単離することができる。内皮系統は、例えば、抗ＣＤ３１抗体、ＶＥ－カドヘリン、または抗フォンビルブランド因子抗体での染色によって検証することができる。ＥＣの単離は、磁気または蛍光活性化細胞分取（ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳ）において使用するための磁気ビーズまたはフルオロフォアに結合した、ＥＣの表面マーカー、例えば、ＶＥ－カドヘリン、ＣＤ３１、またはＶＥＧＦＲ２に特異的な抗体を使用して、達成することができる。一部の実施形態において、ＥＣは、非血管細胞、例えば、線維芽細胞の、内皮細胞運命への、直接的な転写変換に由来する。一部の実施形態において、非血管細胞は、転写因子Ｆｌｉ１およびＥｒｇを非血管細胞に導入することによって、内皮細胞へと直接的に変換される。
代替法として、内皮細胞は、市販の供給源から得ることができる。内皮細胞は、それらの分化系統および複製能力を維持する条件下において、培養および維持（拡大）することができる。そのような条件は、当該技術分野において十分に文書化されている。例えば、単離された内皮細胞を、コーティングされた組織培養皿において、内皮細胞成長補助物質を含む完全培地中で、培養することができる。内皮細胞を、次いで、分割し、使用するまで継代させてもよい。
一部の実施形態において、分化した内皮細胞は、ヒト成熟血管関連内皮細胞である。ある特定の実施形態において、分化したヒト内皮細胞は、ヒト臍帯静脈由来内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、ヒト脂肪由来内皮細胞、または組織／器官特異的ヒト胎児もしくは成体由来内皮細胞である。本方法の一部の実施形態において、分化した内皮細胞は、心臓、腎臓、精巣、卵巣、網膜、肝臓、膵臓、脳、肺、脾臓、大腸もしくは小腸、卵巣もしくは精巣、または他の内分泌器官の内皮細胞を含むがこれらに限定されない、器官特異的内皮細胞である。他の実施形態において、分化した内皮細胞は、筋肉、リンパ組織、嗅覚組織、骨形成組織、口腔（歯系）組織、または腺組織（例えば、内分泌、胸腺）に由来する組織特異的内皮細胞である。
分化した内皮細胞は、安定な３次元血管の形成を開始させるために、培養することができる。細胞は、ＤＭＥＭ（高もしくは低グルコース）、ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／ＭＣＤＢ ２０１、イーグル基礎培地、ハムＦ１０培地（Ｆ１０）、ハムＦ－１２培地（Ｆ１２）、ヘイフリック培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地（ＭＳＣＧＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ １６４０、およびＣＥＬＬ－ＧＲＯ－ＦＲＥＥ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｃｅｌｌｇｒｏ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）などであるがこれらに限定されない、内皮細胞の成長を持続させることができる任意の培地において培養することができる。培養培地には、１つまたはそれ以上の成分、例えば、ウシ胎児血清、好ましくは、約２～１５％（体積／体積）；ウマ血清；ヒト血清；ウシ胎児血清；ベータ－メルカプトエタノール、好ましくは、約０．００１％（体積／体積）；１つもしくはそれ以上の成長因子、例えば、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子－Ａ（ＶＥＧＦ－Ａ）、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、およびエリスロポエチン；アミノ酸、例えば、Ｌ－バリン；ならびに微生物混入を制御するための１つもしくはそれ以上の抗生物質および／もしくは抗真菌剤、例えば、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン硫酸塩、アムホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびナイスタチンなどを、単独または組合せのいずれかで、補充してもよい。
内皮細胞は、再プログラミングする前に、細胞数を拡大するために培養することができる。十分な数の内皮細胞を、初期サンプルから単離することができるが、許容可能な数の分化した内皮細胞が初期サンプル中に存在する場合であっても、培養での細胞の拡大により、再プログラミングのための内皮細胞のさらに優れた供給をもたらすことができる。細胞を培養および拡大する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｈｅｌｇａｓｏｎら、Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第４版、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０１３およびＭｉｔｒｙら、Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第３版、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０１２を参照されたい。
分化した内皮細胞は、分化した内皮細胞へのＥＴＶ２をコードする外因性核酸の組込みおよび発現を通じて、「再プログラミング」または「リセット」される。
内皮細胞は、管状（ルーメン化）血管および他の脈管構造を形成する内皮細胞の能力を変化させる、外因性ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現することによって、「再プログラミング」または「リセット」される（より可塑性の、適応性のある、永続性のある、血行動態的に安定した状態へと脱分化するように指向される）。
「ＥＴＶ２」または「ＥＴＶ２転写因子」という用語は、ＮＰ ０５５０２４に記載されるアミノ酸配列を有するＤＮＡ結合転写因子タンパク質をコードする、ＲｅｆＳｅｑ Ｇｅｎｅ ＩＤ ２１１６、ＮＣＢＩ参照配列番号ＮＣ＿００００１９．１０に記載されるヒトＥＴＳ転写因子バリアント２、ＥＴＶ２（ＥＲ７１、ＥＴＳＲＰ７１）を指して、本明細書で互換可能に使用される。本開示のＥＴＶ２核酸は、ＥＴＶ２ ＤＮＡ配列またはその一部分、ならびにそのＲＮＡ転写産物、例えば、受託番号：ＮＭ＿００１３００９７４．１、ＮＭ＿０１４２０９．３、およびＮＭ＿００１３０４５４９．１に記載されるものを含み得る。ＥＴＶ２の機能的誘導体およびホモログが、開示される方法における使用がさらに企図される。本明細書において使用される場合、「機能的誘導体」は、ＥＴＶ２の生物学的機能を実行する能力を有する分子である。例えば、本明細書に開示されるＥＴＶ２の機能的誘導体は、ＥＴＶ２転写因子と同様にＤＮＡに結合し、分化した内皮細胞を再プログラミングすることができる分子である。機能的誘導体には、融合タンパク質を含め、天然、合成、または組換え源に由来するフラグメント、バリアント、一部、一部分、同等物、アナログ、突然変異体、模倣体が含まれる。「ホモログ」は、共通の祖先核酸配列に由来する子孫によってＥＴＶ２転写因子に関連付けられるタンパク質である。本明細書において企図されるホモログとしては、異なる種、例えば、マウス、ラット、およびサルなどに由来するＥＴＶ２タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
本方法の具体的な実施形態において、内皮細胞に存在するＥＴＶ２をコードする外因性核酸は、配列番号３８に記載されるヒトＥＴＶ２転写因子タンパク質をコードする配列番号３７に記載されるヒトＥＴＶ２である。別の実施形態において、内皮細胞に存在するＥＴＶ２をコードする外因性核酸は、ヒトＥＴＶ２転写因子タンパク質をコードするヒトＥＴＶ２リボソーム核酸（ＲＮＡ）転写産物である。他の実施形態において、分化した内皮細胞に提供されるＥＴＶ２をコードする外因性核酸は、改変された合成ＲＮＡである。改変された合成ＲＮＡ分子は、当業者に公知の方法、例えば、Ｍａｃｈｎｉｃｋａ，ＭＡら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、４１ Ｄ２６２～Ｄ２６７頁、（２０１３）に記載されるものによって産生することができる。本発明において使用するための例示的な改変された合成分子は、安定性をモジュレートする（ヌクレアーゼ耐性を変化させる）かまたは細胞取込み（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドの、コレステロール、リンカー、脂質、ポリマー、ペプチド、もしくはアパマーへのコンジュゲーション）をモジュレートする、ＲＮＡポリヌクレオチドに対する化学的改変を含む。
ＥＴＶ２転写因子をコードする核酸は、当業者に周知の方法によって、細胞に提供され得る。例えば、ＥＴＶ２をコードする核酸は、ＥＴＶ２核酸配列を内皮細胞ゲノムに統合することができるか、または非統合型であり得る、すなわち、ＥＴＶ２遺伝子は、染色体外の位置から発現される。一部の実施形態において、ＥＴＶ２をコードする核酸配列は、核酸配列が当該技術分野において公知の技法によってクローニングされているベクターによって提供される。ベクターは、任意の好適な方法によって、例えば、トランスフェクションまたはウイルスに媒介される形質導入によって、導入され得る。
ＥＴＶ２転写因子を発現させるのに使用するためのベクターとしては、例えば、細胞に導入されると、対象のゲノム内の染色体位置に統合され、ＥＴＶ２の安定した長期発現を提供する、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および他のベクターが挙げられる。他のベクターとしては、エピソームベクター、ならびに非統合型である操作されたレンチウイルスベクターバリアントが挙げられる。本明細書において、ＥＴＶ２ヌクレオチド配列を、ベクター配列にクローニングすることができ、ベクターを、分化した内皮細胞において成長させ、本明細書に記載される方法を使用して内皮細胞を再プログラミングするために使用する。
一実施形態において、ＥＴＶ２核酸は、レンチウイルスベクターに含まれ、レンチウイルスに媒介される形質導入によって内皮細胞に提供される。具体的な実施形態において、配列番号３７のＥＴＶ２をコードする核酸は、レンチウイルスベクターを使用して、分化した内皮細胞に形質導入される。一実施形態において、レンチウイルスベクターは、レンチｐｇｋベクターである。具体的な実施形態において、配列番号３７のＥＴＶ２をコードする外因性核酸は、誘導性発現系、例えば、逆ｔｅｔトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）－ドキシサイクリン誘導性発現系などを用いた形質導入によって、内皮細胞に提供される。
他の実施形態において、ＥＴＶ２核酸は、内皮細胞に送達されるＲＮＡ転写産物である。ある特定の具体的な実施形態において、細胞に送達されるＥＴＶ２ ＲＮＡは、改変された合成ＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子を細胞に導入するための方法は、当業者に周知であり、そのような方法を、本明細書において使用することができる。例えば、ＥＴＶ２ ＲＮＡ転写産物、例えば、ｍＲＮＡ転写産物を、トランスフェクションによって、内皮細胞に送達することができる。別の非限定的な例では、ＥＴＶ２ ＲＮＡ転写産物は、エレクトロポレーションによって細胞に送達される。
本方法は、ＥＴＶ２をコードする外因性核酸を含む分化した内皮細胞を、ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現する条件下において培養することを含む。ある特定の実施形態において、ＥＴＶ２タンパク質は、構成的に発現される。他の実施形態において、ＥＴＶ２タンパク質は、例えば、誘導性プロモーターの制御下において、一過的に発現される。ある特定の実施形態において、外因性ＥＴＶ２転写因子は、ルーメン化血管を形成するように内皮細胞を誘導するために、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間、またはそれ以上、内皮細胞において発現される。具体的な実施形態において、外因性ＥＴＶ２タンパク質は、血管形成を誘導するために、少なくとも４週間発現される。別の実施形態において、外因性ＥＴＶ２タンパク質は、ルーメン形成を誘導するために、少なくとも３～４週間発現される。
他の実施形態において、本方法は、ＥＴＶ２をコードする外因性核酸を有する内皮細胞を、ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現する条件下において培養することを含み、これには、内皮細胞が外因性ＥＴＶ２を発現しない条件下におけるさらなる培養期間が続く。本明細書において、内皮細胞は、まず、第１の期間、外因性ＥＴＶ２転写因子を発現する条件下において培養され得、次いで、外因性ＥＴＶ２を発現しない条件下、例えば、誘導性プロモーターを活性化することができる物質（例えば、ドキシサイクリン、テトラサイクリン）の不在下において、第２の培養を受けてもよい。一実施形態において、ＥＴＶ２をコードする外因性核酸は、培養中に一過的なＥＴＶ２転写因子発現をもたらす、改変された合成ＲＮＡ分子である。
一部の実施形態において、本方法は、ＥＴＶ２をコードする外因性核酸を有する内皮細胞を、ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現する条件下において、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１１週間、少なくとも１２週間、またはそれ以上の期間培養することを含み、これには、外因性ＥＴＶ２を発現しない条件下、例えば、ドキシサイクリンの不在下における、数日間、数週間、または数ヶ月間の期間の第２の培養が続く。具体的な実施形態において、内皮細胞は、外因性ＥＴＶ２転写因子タンパク質を発現する条件下において、少なくとも３～４週間の期間、培養され、次いで、内皮細胞は、ＥＴＶ２転写因子を発現しない条件下において、７日間～６ヶ月間、７日間～５ヶ月間、７日間～４ヶ月間、７日間～３ヶ月間、７日間～２ヶ月間、または７日間～１ヶ月間の範囲の期間、培養される。
一部の実施形態において、本方法において使用されるＲ－ＶＥＣは、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を発現する。一部の実施形態において、Ｒ－ＶＥＣは、Ｓｏｘ１７転写因子をコードする外因性核酸をさらに発現する。
本方法の一実施形態において、ＥＴＶ２をコードする外因性核酸を含む内皮細胞は、ある期間、無血清培地において培養される。一部の実施形態において、本方法は、内皮細胞を、無血清培地において、少なくとも７日間、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、またはそれ以上培養することを含む。
他の実施形態において、本方法は、ＥＴＶ２をコードする外因性核酸を含む内皮細胞を、低酸素分圧で、無血清培地において培養することを含む。一部の実施形態において、内皮細胞は、周囲酸素分圧、すなわち、２０％よりも低くで、無血清培地において培養される。具体的な実施形態において、内皮細胞は、４％～１５％、５％～１０％、４％～８％、または４％～６％の酸素分圧で、無血清培地において培養される。一実施形態において、内皮細胞は、１％～５％の酸素分圧で、無血清培地において培養される。具体的な実施形態において、本方法は、ＥＴＶ２をコードする外因性ベクターを含む内皮細胞を、１％～５％の酸素分圧で、７日間、無血清培地において培養することを含む。
一部の実施形態において、再プログラミングのためのＥＣ培養は、バイオリアクターまたはマイクロ流体デバイスにおいて行われる。一部の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、ヒト血液、または他の特化した培地、溶液、化学物質、または生物製剤薬物もしくは試薬を輸送することができる。
膵島に脈管形成する方法
本開示の態様は、膵島に脈管形成する方法であって、膵島を、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共培養することを含み、ＥＴＶ２が、内皮細胞において発現され、それによって、脈管形成された膵島を生成する、方法を対象とする。
一部の実施形態において、膵島は、外科手術によって人物から単離される。一部の実施形態において、膵島は、健常なドナーから単離される。一部の実施形態において、膵島は、必要とする対象から単離される。一部の実施形態において、膵島は、市販供給源から得られる。一部の実施形態において、膵島は、死体（例えば、レシピエントに遺伝子的に適合する死体）から単離される。
一部の実施形態において、共培養において使用される膵島は、脱細胞化されていない、すなわち、膵島は、既存の組織構造、および分化したインスリン産生β細胞を依然として保持する。一部の実施形態において、膵島は、少なくとも、細胞外マトリックス、およびインスリンを産生するβ細胞を含む。一部の実施形態において、膵島は、β細胞以外の細胞型に由来する細胞（例えば、グルカゴンを産生するアルファ細胞、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）を産生する膵臓ポリペプチド細胞、グレリンを産生するイプシロン細胞、およびソマトスタチンを産生するデルタ細胞）を含む。
本方法によると、膵島は、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共培養され、ＥＴＶ２が、内皮細胞において発現される。
一部の実施形態において、内皮細胞は、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む血管内皮細胞であり、ＥＴＶ２が、内皮細胞において発現され、そのような血管内皮細胞は、再プログラミング／リセットされた血管内皮細胞、または「Ｒ－ＶＥＣ」とも称される。
「内皮細胞」という表現は、内皮細胞の集団を含むことが理解される。一部の実施形態において、内皮細胞の集団は、内皮細胞の実質的に純粋な集団である。一部の実施形態において、内皮細胞の実質的に純粋な集団は、集団内の細胞のうちの少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の割合が、内皮細胞、例えば、同じ起源を有し（例えば、血管内皮細胞）、ＥＴＶ２転写因子を発現するように再プログラミングされている内皮細胞である、集団を指す。
一部の実施形態において、共培養される内皮細胞は、開始濃度が少なくとも３００万個の細胞／ｍｌ、少なくとも３５０万個の細胞／ｍｌ、少なくとも４００万個の細胞／ｍｌ、少なくとも４５０万個の細胞／ｍｌ、少なくとも５００万個の細胞／ｍｌ、少なくとも５５０万個の細胞／ｍｌ、少なくとも６００万個の細胞／ｍｌ、少なくとも６５０万個の細胞／ｍｌ、または少なくとも７００万個の細胞／ｍｌである。具体的な実施形態において、内皮細胞は、開始濃度が約５００万個の細胞／ｍｌである。
一部の実施形態において、共培養は、分子、例えば、塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ－２）およびヘパリンを補充した培地において実行される。一部の実施形態において、培地は、約５ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む。一部の実施形態において、培地は、約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、または約２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む。具体的な実施形態において、培地は、約１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ－２を含む。一部の実施形態において、培地は、約２０μｇ／ｍｌ～約２００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。一部の実施形態において、培地は、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約４５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１１０μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、または約２００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。具体的な実施形態において、培地は、約１００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。
一部の実施形態において、共培養は、ＦＧＦ－２および／またはヘパリンに加えて、分子、例えば、ヒト血清アルブミン（０．０５％～２％、例えば、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約１．５％、もしくは約２％）、ヒトトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）（５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、例えば、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、もしくは約２０μｇ／ｍｌ）、エタノールアミン（２０μＭ～１００μＭ、例えば、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、もしくは約１００μＭ）、ホスホエタノールアミン（２０μＭ～１００μＭ、例えば、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、もしくは約１００μＭ）、亜セレン酸ナトリウム（３μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、例えば、約３μｇ／ｍｌ、約３．５μｇ／ｍｌ、約３．５μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約４．５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約５．５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約６．５μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約８．５μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約９．５μｇ／ｍｌ、もしくは約１０μｇ／ｍｌ）、グルコース（２ｍＭ～１０ｍＭ、例えば、約２ｍＭ、約２，５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍＭ、約９．５ｍＭ、もしくは約１０ｍＭ）、トリヨードチロニン（Ｔ３）（０．３ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、例えば、約０．３ｎｇ／ｍＬ、約０．４ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．６ｎｇ／ｍＬ、約０．６５ｎｇ／ｍＬ、約０．７ｎｇ／ｍＬ、約０．８ｎｇ／ｍＬ、約０．９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ）、プロラクチン（ＰＲＬ）（１０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２３ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約２８ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ－Ｉ（１ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ）、またはこれらの組合せがさらに補充された培地において行われる。具体的な実施形態において、培地は、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２、１００μｇ／ｍｌのヘパリン、０．１％のヒト血清アルブミン、１０μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、５０μＭのエタノールアミン、５０μＭのホスホエタノールアミン、６．７μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、５．５ｍＭのグルコース、０．６５ｎｇ／ｍＬのトリヨードチロニン（Ｔ３）、２３ｎｇ／ｍＬのプロラクチン（ＰＲＬ）、および５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ－Ｉを含む。
一部の実施形態において、共培養は、マトリックスにおいて行われる。実際に、本開示は、必須細胞外マトリックス成分、すなわち、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶを特定するが、これらは、再プログラミングされた内皮細胞を培養するために使用されると、周皮細胞、灌流、および厄介なスキャフォールドを使用することなく、インビトロおよびインビボで安定かつ機能的な３次元人工血管の形成をもたらす。したがって、ある特定の実施形態において、マトリックスは、細胞外マトリックス成分、例えば、ラミニン、エンタクチン、および／またはコラーゲンから構成される。
一部の実施形態において、共培養に使用するためのマトリックスは、合わせた濃度で少なくとも約５ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチンを含み得る。ラミニンおよびエンタクチンは、互いに結合して複合体を形成し得るため、本方法において使用するためのマトリックスは、ラミニンおよびエンタクチンの複合体を含み得る。例えば、マトリックスは、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチンの複合体を含み得る。例示的な実施形態において、共培養は、合わせた濃度で少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１４ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１５ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチンを含むマトリックスにおいて行われる。具体的な実施形態において、本方法において使用されるマトリックスは、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）の組合せから構成される。例えば、共培養は、長期持続する機能的な３次元人工血管を形成するために、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチン、ならびに少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶを含有するマトリックスにおいて行われ得る。一部の実施形態において、Ｌ．Ｅ．Ｃ．マトリックスの組合せは、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．９ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶを含む。具体的な実施形態において、Ｌ．Ｅ．Ｃ．マトリックスは、合わせた濃度で９ｍｇ／ｍＬ～１３ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチン、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶから構成される。具体的な実施形態において、Ｌ．Ｅ．Ｃ．マトリックスは、合わせた濃度で約１１ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチン、ならびに約０．２ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶから構成される。
一部の実施形態において、膵島および内皮細胞の共培養は、バイオリアクターまたはマイクロ流体デバイスにおいて行われる。一部の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、ヒト血液、または他の特化した培地、溶液、化学物質、または生物製剤薬物もしくは試薬を輸送することができる。一部の実施形態において、膵島および内皮細胞の共培養は、３Ｄゲルにおいて行われる。膵島およびＥＣ細胞を組み合わせるかまたは混合する任意の特定の様式に対する要件はない。膵島－ＥＣの混合物は、３Ｄ構造体、すなわち、脈管形成された膵島へと自己アセンブルすることができる。
一部の実施形態において、共培養は、少なくとも１～４週間行われる。一部の実施形態において、共培養は、少なくとも３～４週間行われる。一部の実施形態において、共培養は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも２４日間、少なくとも４週間、少なくとも３２日間、少なくとも５週間、少なくとも３８日間、少なくとも６週間、少なくとも４５日間、少なくとも７週間、少なくとも５２日間、少なくとも８週間行われるが、４ヶ月間を上回らないか、または３ヶ月間を上回らない。一部の実施形態において、共培養は、約３週間、約２４日間、約４週間、約３２日間、約５週間、約３８日間、約６週間、約４５日間、約７週間、約５２日間、または約８週間行われる。
一部の実施形態において、膵島および内皮細胞は、内皮細胞がＥＴＶ２転写因子を発現しない条件下において、さらなる期間共培養される。一部の実施形態において、膵島および内皮細胞は、内皮細胞におけるＥＴＶ２転写因子の発現が一過的であるかまたは低減される（低下する）条件下において、さらなる期間共培養される。一部の実施形態において、さらなる期間は、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間であるが、１８日間を上回らないか、１６日間を上回らないか、または１４日間を上回らない。
一部の実施形態において、膵島および内皮細胞は、十分な膵島脈管形成が達成されるまで、共培養され得る。脈管形成の程度は、様々な手段によって評価することができる。一部の実施形態において、脈管形成は、グルコースに刺激されるインスリン分泌の量の倍増によって測定される。一部の実施形態において、脈管形成された膵島が、グルコースに応答して、脈管形成されていない膵島（例えば、いずれの内皮細胞とも共培養されていない膵島、またはＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を発現しない野生型内皮細胞と共培養した膵島）と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍多くのインスリンを産生する場合、脈管形成は、十分であると考えられる。一部の実施形態において、膵島におけるグルコースに刺激されるインスリン分泌の増加は、膵島を、低グルコース（例えば、約１ｍＭ～約４ｍＭ）とともにインキュベートして、基礎インスリン分泌を判定し、次いで、膵島を高グルコース（約１６．７ｍＭ）とともにインキュベートして、刺激されたインスリン分泌を判定することによって、測定される。一部の実施形態において、脈管形成の程度は、目視評価に基づいて判定され、例えば、脈管形成が進行するにつれて、血管を表す管状構造が観察される。一部の実施形態において、脈管形成は、血管領域の増加によって測定される。一部の実施形態において、脈管形成された膵島における血管領域が、試験下にある膵島の全面積の少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、または少なくとも１０％に達した場合、脈管形成は、十分であると考えられる。
脈管形成された膵島
一部の実施形態において、本開示の脈管形成された膵島は、通常の膵島構造、およびＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を発現する内皮細胞によって形成される脈管構造を含む。
一部の実施形態において、脈管形成は、膵島内の動脈、静脈、毛細血管、細動脈、細静脈、リンパ管、またはこれらの組合せの形成を含む。一部の実施形態において、脈管形成された膵島は、内皮細胞によって形成された血管のネットワーク、２次元または３次元ネットワーク（「膵島の分枝」）を含む。
一部の実施形態において、脈管形成された膵島は、β細胞、および膵島への栄養素の送達を可能にし、膵島によって産生されるインスリンの除去を可能にする脈管構造（血管、例えば、動脈、静脈）を含む。一部の実施形態において、脈管形成された膵島は、組織培養物において（インビトロで）、または宿主に投与された場合に（インビボで）、グルコース感知およびインスリン産生において機能的である。一部の実施形態において、インビトロで脈管形成された膵島内に形成された脈管構造は、インビボで宿主の血管と接続することおよび／またはインビボで膵島のさらなる脈管形成を促進することが可能である。一部の実施形態において、脈管形成された膵島は、長期間、インビボでのグルコース感知およびインスリン産生において機能的なままであり得る。本明細書で使用される場合、「長期間」という語句は、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも６週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間を指す。
脈管形成されたβ細胞オルガノイドを形成する方法
本開示の態様は、脈管形成されたβ細胞オルガノイドを作製する方法であって、β細胞を、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共培養することを含み、ＥＴＶ２が、内皮細胞において発現され、それによって、脈管形成されたβ細胞オルガノイドを生成する、方法を対象とする。
本明細書で使用される場合、「β細胞オルガノイド」という用語は、全体、またはほぼ全体（９０％以上）がβ細胞でできた人工の細胞組成物を指す。一部の実施形態において、インタクトな膵島は、酵素消化を受けて、膵島内に存在する様々な内分泌細胞の単一細胞懸濁液を生成し、これは、主として、β細胞から構成される。単一懸濁細胞の再播種は、治療的脈管形成または埋込みを含む、さらなる研究に使用することができるβ細胞オルガノイドへの再アセンブリをもたらす（Ｚｈｏｕ ＱおよびＭｅｌｔｏｎ ＤＡ． Ｎａｔｕｒｅ；５５７（７７０５）：３５１－８、（２０１８））。一部の実施形態において、β細胞オルガノイドは、幹細胞または人工多能性細胞（ｉＰＳ）細胞に由来するβ細胞を含む（Ｚｈｏｕ ＱおよびＭｅｌｔｏｎ ＤＡ． Ｎａｔｕｒｅ；５５７（７７０５）：３５１－８（２０１８）、Ｈｅｂｒｏｋ Ｍ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ；２（６）：ａ００７６７４（２０１２）、いずれも、参照によって本明細書に組み入れられる）。一部の実施形態において、β細胞オルガノイドは、線維芽細胞の直接的な変換に由来するβ細胞を含む（Ｚｈｏｕ ＱおよびＭｅｌｔｏｎ ＤＡ． Ｎａｔｕｒｅ；５５７（７７０５）：３５１－８、（２０１８））。一部の実施形態において、β細胞オルガノイドは、成体対象から単離されたβ細胞を含む（Ｚｈｏｕ ＱおよびＭｅｌｔｏｎ ＤＡ． Ｎａｔｕｒｅ；５５７（７７０５）：３５１－８（２０１８））。
一部の実施形態において、β細胞オルガノイドは、対象（健常なドナー、必要とする対象、または死体）の膵臓から得られたβ細胞から作製される。一部の実施形態において、β細胞は、レシピエントに遺伝子的に適合する死体から得られる。
一部の実施形態において、内皮細胞は、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む血管内皮細胞であり、ＥＴＶ２が、内皮細胞、例えば、再プログラミング／リセットされた血管内皮細胞（Ｒ－ＶＥＣ）において発現される。
一部の実施形態において、共培養される内皮細胞は、開始濃度が少なくとも３００万個の細胞／ｍｌ、少なくとも３５０万個の細胞／ｍｌ、少なくとも４００万個の細胞／ｍｌ、少なくとも４５０万個の細胞／ｍｌ、少なくとも５００万個の細胞／ｍｌ、少なくとも５５０万個の細胞／ｍｌ、少なくとも６００万個の細胞／ｍｌ、少なくとも６５０万個の細胞／ｍｌ、または少なくとも７００万個の細胞／ｍｌである。具体的な実施形態において、内皮細胞は、開始濃度が約５００万個の細胞／ｍｌである。
一部の実施形態において、共培養は、分子、例えば、塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ－２）およびヘパリンを補充した培地において実行される。一部の実施形態において、培地は、約５ｎｇ／ｍｌ～約２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む。一部の実施形態において、培地は、約５ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１５ｎｇ／ｍｌ、または約２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む。具体的な実施形態において、培地は、約１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ－２を含む。一部の実施形態において、培地は、約２０μｇ／ｍｌ～約２００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。一部の実施形態において、培地は、約２０μｇ／ｍｌ、約３０μｇ／ｍｌ、約４０μｇ／ｍｌ、約４５μｇ／ｍｌ、約５０μｇ／ｍｌ、約６０μｇ／ｍｌ、約７０μｇ／ｍｌ、約８０μｇ／ｍｌ、約９０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ、約１１０μｇ／ｍｌ、約１２５μｇ／ｍｌ、約１５０μｇ／ｍｌ、約１７５μｇ／ｍｌ、または約２００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。具体的な実施形態において、培地は、約１００μｇ／ｍｌのヘパリンを含む。
一部の実施形態において、共培養は、ＦＧＦ－２および／またはヘパリンに加えて、分子、例えば、ヒト血清アルブミン（０．０５％～２％、例えば、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約１．５％、もしくは約２％）、ヒトトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ）（５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ、例えば、約５μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１５μｇ／ｍｌ、もしくは約２０μｇ／ｍｌ）、エタノールアミン（２０μＭ～１００μＭ、例えば、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、もしくは約１００μＭ）、ホスホエタノールアミン（２０μＭ～１００μＭ、例えば、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、約６０μＭ、約７０μＭ、約８０μＭ、約９０μＭ、もしくは約１００μＭ）、亜セレン酸ナトリウム（３μｇ／ｍｌ～１０μｇ／ｍｌ、例えば、約３μｇ／ｍｌ、約３．５μｇ／ｍｌ、約３．５μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約４．５μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約５．５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約６．５μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約７．５μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約８．５μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約９．５μｇ／ｍｌ、もしくは約１０μｇ／ｍｌ）、グルコース（２ｍＭ～１０ｍＭ、例えば、約２ｍＭ、約２，５ｍＭ、約３ｍＭ、約３．５ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍＭ、約９．５ｍＭ、もしくは約１０ｍＭ）、トリヨードチロニン（Ｔ３）（０．３ｎｇ／ｍＬ～１ｎｇ／ｍＬ、例えば、約０．３ｎｇ／ｍＬ、約０．４ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．６ｎｇ／ｍＬ、約０．６５ｎｇ／ｍＬ、約０．７ｎｇ／ｍＬ、約０．８ｎｇ／ｍＬ、約０．９ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ）、プロラクチン（ＰＲＬ）（１０ｎｇ／ｍＬ～３０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２３ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約２８ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ－Ｉ（１ｎｇ／ｍＬ～１０ｎｇ／ｍＬ、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ）、またはこれらの組合せが補充された培地において行われる。具体的な実施形態において、培地は、１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ－２、１００μｇ／ｍｌのヘパリン、０．１％のヒト血清アルブミン、１０μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、５０μＭのエタノールアミン、５０μＭのホスホエタノールアミン、６．７μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、５．５ｍＭのグルコース、０．６５ｎｇ／ｍＬのトリヨードチロニン（Ｔ３）、２３ｎｇ／ｍＬのプロラクチン（ＰＲＬ）、および５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ－Ｉを含む。
一部の実施形態において、共培養は、マトリックスにおいて行われる。本開示は、必須細胞外マトリックス成分、すなわち、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶを特定するが、これらは、再プログラミングされた内皮細胞を培養するために使用されると、周皮細胞、灌流、および厄介なスキャフォールドを使用することなく、インビトロおよびインビボで安定かつ機能的な３次元人工血管の形成をもたらす。したがって、ある特定の実施形態において、マトリックスは、細胞外マトリックス成分、例えば、ラミニン、エンタクチン、および／またはコラーゲンから構成される。
一部の実施形態において、共培養に使用するためのマトリックスは、合わせた濃度で少なくとも約５ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチンを含み得る。ラミニンおよびエンタクチンは、互いに結合して複合体を形成し得るため、本方法において使用するためのマトリックスは、ラミニンおよびエンタクチンの複合体を含み得る。例えば、マトリックスは、少なくとも５ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチンの複合体を含み得る。例示的な実施形態において、共培養は、合わせた濃度で少なくとも５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも１４ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１５ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチンを含むマトリックスにおいて行われる。具体的な実施形態において、本方法において使用されるマトリックスは、ラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ．）の組合せから構成される。例えば、共培養は、長期持続する機能的な３次元人工血管を形成するために、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチン、ならびに少なくとも約０．２ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶを含有するマトリックスにおいて行われ得る。一部の実施形態において、Ｌ．Ｅ．Ｃ．マトリックスの組合せは、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも０．９ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶを含む。具体的な実施形態において、Ｌ．Ｅ．Ｃ．マトリックスは、合わせた濃度で９ｍｇ／ｍＬ～１３ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチン、ならびに０．２ｍｇ／ｍＬ～０．５ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶから構成される。具体的な実施形態において、Ｌ．Ｅ．Ｃ．マトリックスは、合わせた濃度で約１１ｍｇ／ｍＬのラミニンおよびエンタクチン、ならびに約０．２ｍｇ／ｍＬのコラーゲンＩＶから構成される。
一部の実施形態において、β細胞および内皮細胞の共培養は、バイオリアクターまたはマイクロ流体デバイスにおいて行われる。一部の実施形態において、マイクロ流体デバイスは、ヒト血液、または他の特化した培地、溶液、化学物質、または生物製剤薬物もしくは試薬を輸送することができる。一部の実施形態において、β細胞および内皮細胞の共培養は、３Ｄゲルにおいて行われる。β細胞およびＥＣ細胞を組み合わせるかまたは混合する任意の特定の様式に対する要件はない。β細胞－ＥＣの混合物は、３Ｄ構造体、すなわち、脈管形成されたβ細胞オルガノイドへと自己アセンブルすることができる。Ｚｈｏｕ ＱおよびＭｅｌｔｏｎ ＤＡ． ５５７（７７０５）：３５１－８（２０１８）、Ｈｅｂｒｏｋ Ｍ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｍｅｄ；２（６）：ａ００７６７４（２０１２）もまた参照されたく、これらは、参照によって本明細書に組み入れられる。
一部の実施形態において、共培養は、少なくとも１週間、少なくとも１０日間、少なくとも２週間、少なくとも１８日間、少なくとも３週間、少なくとも２４日間、少なくとも４週間、少なくとも３２日間、少なくとも５週間、少なくとも３８日間、少なくとも６週間、少なくとも４５日間、少なくとも７週間、少なくとも５２日間、少なくとも８週間行われるが、４ヶ月間を上回らないか、または３ヶ月間を上回らない。一部の実施形態において、共培養は、約３週間、約２４日間、約４週間、約３２日間、約５週間、約３８日間、約６週間、約４５日間、約７週間、約５２日間、または約８週間行われる。
一部の実施形態において、β細胞および内皮細胞は、内皮細胞がＥＴＶ２転写因子を発現しない条件下において、さらなる期間共培養され得る。一部の実施形態において、β細胞および内皮細胞は、内皮細胞におけるＥＴＶ２転写因子の発現が一過的であるかまたは低減される（低下する）条件下において、さらなる期間共培養される。一部の実施形態において、さらなる期間は、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間であるが、１８日間を上回らないか、１６日間を上回らないか、または１４日間を上回らない。
一部の実施形態において、β細胞および内皮細胞は、十分な脈管形成を有するβ細胞オルガノイドが達成されるまで、共培養される。一部の実施形態において、十分な脈管形成は、グルコースに刺激されるインスリン分泌の量の倍増によって測定される。一部の実施形態において、脈管形成されたβ細胞オルガノイドは、グルコースに応答して、脈管形成されていないβ細胞オルガノイド（例えば、いずれの他の内皮細胞とも共培養されていないβ細胞オルガノイド、またはＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を発現しない野生型内皮細胞と共培養したβ細胞オルガノイド）と比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍多くのインスリンを産生する。一部の実施形態において、β細胞オルガノイドのグルコースに刺激されるインスリン分泌の増加は、オルガノイドを、低グルコース（例えば、約１ｍＭ～約４ｍＭ）とともにインキュベートして、基礎インスリン分泌を判定し、次いで、オルガノイドを、高グルコース（約１６．７ｍＭ）とともにインキュベートして、刺激されたインスリン分泌を判定することによって、測定される。
脈管形成されたβ細胞オルガノイド
一部の実施形態において、本開示の脈管形成されたβ細胞オルガノイドは、β細胞、およびＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を発現する内皮細胞によって形成される脈管構造を含む。一部の実施形態において、脈管形成は、膵島内の動脈、静脈、毛細血管、細動脈、細静脈、リンパ管、またはこれらの組合せの形成を含む。一部の実施形態において、脈管形成されたβ細胞オルガノイドは、内皮細胞によって形成された血管のネットワーク、２次元または３次元ネットワーク（「β細胞オルガノイドの分枝」）を含む。
一部の実施形態において、脈管形成されたβ細胞オルガノイドは、β細胞、および膵島への栄養素の送達を可能にし、膵島によって産生されるインスリンの除去を可能にする脈管構造（血管、例えば、動脈、静脈）を含む。一部の実施形態において、脈管形成されたβ細胞オルガノイドは、組織培養物において（インビトロで）、または宿主に投与された場合に（インビボで）、グルコース感知およびインスリン産生において機能的である。一部の実施形態において、インビトロで脈管形成されたβ細胞オルガノイド内に形成された脈管構造は、インビボで宿主の血管と接続することおよび／またはインビボでβ細胞オルガノイドのさらなる脈管形成を促進することが可能である。一部の実施形態において、脈管形成されたβ細胞オルガノイドは、長期間、インビボでのグルコース感知およびインスリン産生において機能的なままであり得る。本明細書で使用される場合、「長期間」という語句は、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも６週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間を指す。
脈管形成された膵島を投与することによる、必要とする対象を処置するための方法
別の態様において、本開示は、必要とする対象を処置する方法であって、必要とする対象に、本明細書で上述された脈管形成された膵島を投与することを含む、方法を対象とする。「処置する」とは、症状（例えば、糖尿病の症状）の重症度を緩和もしくは排除すること、または疾患（例えば、糖尿病）が発生するリスクを低減するかもしくはその発症を遅延させることを意味する。
一部の実施形態において、膵島は、レシピエント対象に対して自家である。一部の実施形態において、膵島は、レシピエント対象に対して同種であり、一部のそのような実施形態において、膵島は、レシピエント対象に遺伝子的に適合する。
一部の実施形態において、脈管形成された膵島の投与は、皮下移植、内分泌器官、肝臓、または他の関連器官への直接的な注射によって達成される。一部の実施形態において、脈管形成された膵島の投与は、外科手術またはカテーテルの埋込みによって達成される。一部の実施形態において、脈管形成された膵島の投与は、血管内経路を通じた注入によって達成される。
一部の態様において、投与された脈管形成された膵島は、インビボにおいて機能的である。本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、膵島が、血糖の変化を感知し、血中グルコースレベルの増加に応答して、血流中にインスリンを放出し、正常血糖（正常な血中グルコースレベル）をもたらすことができることを指す。一部の実施形態において、インビトロで脈管形成された膵島内に形成された脈管構造は、インビボで宿主の血管と接続し、かつ／またはインビボで膵島のさらなる脈管形成を促進する。一部の実施形態において、投与された脈管形成された膵島は、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも６週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間、生着したままであり、機能的なままである。
脈管形成されたβ細胞オルガノイドを投与することによる、必要とする対象を処置するための方法
別の態様において、本開示は、必要とする対象を処置する方法であって、必要とする対象に、本明細書で上述された脈管形成されたβ細胞オルガノイドを投与することを含む、方法を対象とする。
一部の実施形態において、脈管形成されたβ細胞オルガノイドを作製するために本方法において使用されるβ細胞は、レシピエント対象に対して自家である。一部の実施形態において、β細胞は、レシピエント対象に対して同種であり、一部のそのような実施形態において、β細胞は、レシピエント対象に遺伝子的に適合する。
一部の実施形態において、脈管形成されたβ細胞オルガノイドの投与は、皮下移植、内分泌器官、肝臓、または他の関連器官への直接的な注射によって達成される。一部の実施形態において、脈管形成されたβ細胞オルガノイドの投与は、外科手術またはカテーテルの埋込みによって達成される。一部の実施形態において、脈管形成されたβ細胞オルガノイドの投与は、血管内経路を通じた注入によって達成される。
一部の態様において、投与された脈管形成されたβ細胞オルガノイドは、インビボにおいて機能的である。本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、β細胞オルガノイドが、血糖の変化を感知し、血中グルコースレベルの増加に応答して、血流中にインスリンを放出し、正常血糖（正常な血中グルコースレベル）をもたらすことができることを指す。一部の実施形態において、インビトロで脈管形成された膵島内に形成された脈管構造は、インビボで宿主の血管と接続し、かつ／またはインビボでβ細胞オルガノイドのさらなる脈管形成を促進する。一部の実施形態において、投与された脈管形成されたβ細胞オルガノイドは、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも６週間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも１０週間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、または少なくとも１年間、生着したままであり、機能的なままである。
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等な任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることもできるが、好ましい方法および材料が、ここに記載されている。本明細書において言及されたすべての刊行物は、刊行物が引用されたものと関係する方法および／または材料について開示し、説明するために、参照によって本明細書に組み入れられる。
本方法は、以下の非限定的な実施例によって、さらに裏付けられ、例証される。
これまでの報告で、ＥＣとβ細胞との共培養が研究されていた（Ｋａｏ ＤＩら、Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔｓ；４（２）：１８１－９、（２０１５）、Ｒｕｔｔｅｒ ＧＡら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ；４６６（２）：２０３－１８、（２０１５）、Ｎｉｋｏｌｏｖａ Ｇら、Ｄｅｖ Ｃｅｌｌ；１０（３）：３９７－４０５、（２００６）、Ｌａｍｍｅｒｔ Ｅら、Ｍｅｃｈ Ｄｅｖ； １２０（１）：５９－６４、（２００３））。しかしながら、これらの研究は、一般的な成体ＥＣを使用しており、精製した膵島全体にインビトロで脈管形成する試みは、膵島内のβ細胞の大半が死滅し、成功しなかった。この最適とは言えない結果は、長期持続する膵島特異的ＥＣニッチを構築する能力が欠如している一般的な成熟成体ヒトＥＣの使用に起因する可能性が高い。加えて、成体ヒト非膵島ＥＣは、それらの生存および機能性を持続させるための、精製したヒト膵島細胞に分枝するかまたはそれと相互作用する能力が欠如している。一般的なＥＣのこのインビトロ欠損性は、これらの成体ＥＣが既存の血管に吻合することができる永続性のある長期持続する血管を形成しないため、より顕著な膵島機能の損傷をもたらし得る。インビトロで成体ＥＣから順応性内皮血管ニッチを生成することは、成熟成体ＥＣが、自家または遺伝子的に適合する脂肪ＥＣのために長期持続するルーメン化毛細血管を構築する能力が欠如しているという点で、大きな課題である。さらに、これらのＥＣは、様々な器官型ニッチ、例えば、導入される膵島内に、適応することができない。Ｒ－ＶＥＣはまた、先天的および免疫の細胞を含有するヒト末梢血すべてを輸送することができる１５マイクロリットルの大容積のマイクロ流体デバイス内で、相互接続された脈管ネットワークを構築することができる。これにより、膵島細胞に対する自己免疫性の評価も同様に可能となるであろう。
本発明者らは、転写因子ＥＴＶ２を、自家または遺伝子的に適合する同種の成体ヒトＥＣに導入することにより、これらのＥＣが、組織特異的器官形成のための適応性で永続性のある再プログラミングまたはリセットされたＥＣ（Ｒ－ＶＥＣ）に変換されることを発見した。本発明者らは、定義された細胞外マトリックス（ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ＬＥＣから構成される）における再プログラミングまたはリセットされた血管ＥＣ（Ｒ－ＶＥＣ）の３次元（３Ｄ）培養物において、市販入手したヒト膵島に容易に脈管形成することができることを示した。これらの順応性Ｒ－ＶＥＣを利用して、本発明者らはまた、Ｒ－ＶＥＣの相互作用が、グルコース上昇に応答して、β細胞によるインスリン分泌を改善することも示す。
まとめると、本発明者らは、高い効率性でヒト膵島に脈管形成することができる、適応性で永続性があり血行動態的な成体ヒトＥＣを製造するための技術を開発した。これは、定義された細胞外マトリックスを一緒に用いて、胚性制限ＥＴＳ転写因子ＥＴＶ２を一過的に発現させることで、成体ヒト組織特異的成熟ＥＣを適応性血管ＥＣ（Ｒ－ＶＥＣ）へと分子的および構造的に「リセット」することによって、可能となった。マトリゲルは、患者において使用することができないため、本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣの長期持続する管形成および移植のための膵島の封入を可能にする細胞外マトリックスの最小成分であるラミニン－エンタクチン－コラーゲンＩＶ（ＬＥＣ）を特定した。
これらの順応性および永続性ならびに適応性のＲ－ＶＥＣは、８週間を上回って持続する、長期持続する機能的に対応した（ｃｏｍｐｌｉａｎｔ）、ならびに灌流可能な脈管ネットワークにリモデリングすることができる。重要なことに、３Ｄ共培養の間、Ｒ－ＶＥＣは、約１週間以内に、３Ｄ共培養の間のマイクロ流体デバイスにおいて、ヒト膵島に効率的に分枝したが、このとき、ＣＴＲＬ－ＥＣは、ヒト膵島との相互作用をほとんど有していなかった。膵島機能を、グルコースに刺激されるインスリン分泌（ＧＳＩＳ）として試験することによって、本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣが、膵島細胞と物理的に相互作用するだけでなく、膵島機能の能動的な改善も行い、有益な作用は、少なくとも２週間持続することを見出した。大容積のマイクロ流体デバイスにおいて、Ｒ－ＶＥＣが脈管形成したヒト膵島は、グルコースを感知し、インスリンを排出口に産生することができた。これは、入手した膵島の機能性の評価および増大、ならびに糖尿病の処置のためのインビボでの埋込みのためのステージの設定を可能にする。
ＥＴＶ２は、ＥＣのインビトロにおいて長期持続する安定なパターニングされたヒト血管への自己アセンブリを可能にする
成熟した出生後および成体ヒトＥＣは、インビトロでマトリゲルにおいてまたはインビボで発生期脈管ネットワークへと組織化するが、これらの血管は、安定ではなく、インビトロで持続可能な大きな孔径のルーメンが欠如しており、リモデリング能力が制限されており、数日以内に退化する。加えて、オンチップ器官または血管スキャフォールド形成アプローチは、ＥＣと非血管細胞との緊密で物理的な細胞－細胞相互作用を損ない、それによって、細胞接触依存的共適合性ＥＣリモデリングを妨害する、半透過性合成生体材料の層による分離を必要とすることが多い（Ｈｕｈ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８、１６６２－１６６８、（２０１０）、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｃ．ら、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １６、３０６５－３０７３、（２０１６））。さらに、成熟ナイーブＥＣは、大型灌流マイクロ流体チャンバーにおいて拡張された脈管ネットワークへと自己アセンブリすることができず、それらの脈管叢体積はおよそ２マイクロリットルに制限される（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １２、８６５－８８０、（２０１７）、Ｃａｍｐｉｓｉ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １８０、１１７－１２９、（２０１８）、Ｐｈａｎ，Ｄ．Ｔ．Ｔ．ら、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １７、５１１－５２０、（２０１７））。本発明者らは、成熟ヒトＥＣにおけるＥＴＶ２の強制的な再発現により、これらの細胞が、３Ｄ血管を形成するための永続性およびパターニング可塑性を生じること、ならびにインビトロおよびインビボで非血管細胞に対する強化された細胞親和性および適応性を獲得することが可能となるであろうという仮説を立てた。
実際に、ＥＴＶ２を発現するヒトＥＣ（リセット－ＶＥＣ、Ｒ－ＶＥＣ）は、３つのステージを通じて３Ｄ血管へと移行した（図１Ａ）。第１の誘導ステージ（１～１４日目）に、ＥＴＶ２は、脈管形成因子および管形成因子を上方制御する。第２のリモデリングステージ（１４～２１日目）の間に、Ｒ－ＶＥＣは、組織化された幾何的にパターニングされたルーメン化血管へと自己アセンブルする。第３の安定化ステージでは、Ｒ－ＶＥＣは、もはや運動性でも増殖性でもなくなり、永続性かつ適応性の血管へと移行する。対照的に、ナイーブヒトＥＣは、異なる標準培地製剤（例えば、Ｓｔｅｍ Ｓｐａｎ、ＥＧＭ２、またはＥＣ培地）を使用した場合でさえも、これらのステージを通じて永続性のある血管を形成するように移行することができなかった。
ＥＴＶ２を発現するヒト臍帯静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）は、８週間にわたって、血管領域形成に５０倍の増加を示した（図１Ｂ～１Ｃ）。ＥＴＶ２がＲ－ＶＥＣを誘導するこの能力は、ＨＵＶＥＣに制限されない。ＥＴＶ２を形質導入した脂肪、心臓、大動脈、および皮膚の組織から単離されたすべての組織特異的成体ヒト成熟ＥＣ集団（４歳～５０歳以上の年齢のヒト対象から精製）は、一貫して永続性のある分枝した脈管ネットワークを有するＲ－ＶＥＣを生じた（図１Ｄ～１Ｅ）。本発明者らは、インビトロで１６週間を上回って、パターニングされたＲ－ＶＥＣ血管を維持することができた（図１Ｆ）。適切なルーメン形成が、機能的な３Ｄ血管に必要である。共焦点顕微鏡法により、Ｒ－ＶＥＣが、連続した途切れない血管のネットワークを形成したことが示された。これらの毛細血管様の大きな穴の管は、頂端側にポドカリキシンが発現され、基底側にラミニンが発現される、適切な極性化を示した（図１Ｇ）。
原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）は、Ｒ－ＶＥＣの構造剛性を評価するための理想的なツールである。ステージ１の誘導期におけるＥＴＶ２を形質導入した成体脂肪ＥＣおよびＨＵＶＥＣのいずれも、対照の非ＥＴＶ２形質導入細胞よりも剛性が低かったが、これは、脈管形成の間のルーメン形成に必要な特性である。さらに、平滑筋細胞は、Ｒ－ＶＥＣルーメン形成に必須ではないが、これらの血管周囲細胞は、安定化ステージ中に導入されると、Ｒ－ＶＥＣにより生成された血管へと容易に動員され得る。したがって、Ｒ－ＶＥＣは、ルーメン化毛細血管の３Ｄ構造を表現型模写する血管へと自己組織化する。
ＥＣ増殖は、ルーメン形成の程度をモジュレートし得るため、本発明者らはまた、ＥｄＵ標識化によって細胞増殖を経時的に測定した。平坦な２次元（２Ｄ）培養物において成長させた場合、対照およびステージ１の誘導期のＥＴＶ２を形質導入したＥＣは、類似の速度で増殖した。ステージ２のリモデリング期の間に、対照ＥＣは、Ｒ－ＶＥＣよりも高速で増殖を受けた。ステージ３の安定化期に、Ｒ－ＶＥＣは、恒常性に達し、ＥＣ代謝回転は、２Ｄ培養物中よりもはるかに低かった。
ＥＴＶ２を形質導入したヒトＥＣが、ルーメン化された管へと自発的に自己アセンブルする能力が、他のＥＴＳファミリーの転写因子の共通属性であるかどうかを判定するために、本発明者らは、ヒトＥＣに、毛細血管発達において主要な役割を果たす別のＥＴＳ転写因子であるＥＴＳ１を形質導入した。さらに、ＥＴＶ２が、主として、ＥＣの生存を増加させることよって血管機能を付与するかどうかを試験するために、本発明者らは、成熟ヒトＥＣに、構成的に活性なミリストイル化ＡＫＴ１（ｍｙｒＡＫＴ１）を形質導入した。ＥＴＳ１およびｍｙｒＡＫＴ１の活性化のいずれも、ＥＴＶ２のように、永続性のある血管の生成を作動させることはなかった。したがって、ＥＴＶ２は、人工スキャフォールド、周皮細胞被覆、または強制的なせん断応力の制約を受けずに、永続性のあるパターニングされた大きな穴の脈管へと自己アセンブルする能力を、成体ヒトＥＣに固有に付与する。
本発明者らは、ＥＴＶ２発現レベルがルーメン化血管の効率的な生成に影響を及ぼしたかどうかを解明することに着手した。ステージ１の導入期においてＲ－ＶＥＣ単一細胞クローンを、ＦＡＣＳによって単離し、ｍＲＮＡ存在度を、ｑＲＴ－ＰＣＲによって測定した。本発明者らは、クローンを、ステージ１の導入期の間のＥＴＶ２ ｍＲＮＡレベルに基づいて、低ＥＴＶ２、中ＥＴＶ２、および高ＥＴＶ２の発現パターンに分割した。ＥＴＶ２ ＲＮＡレベルは、ＥＴＶ２タンパク質レベルと緊密に相関していた。中ＥＴＶ２レベルを有するクローンは、有意に高い密度および安定性の血管を生じた。次いで、本発明者らは、異種非クローン生成Ｒ－ＶＥＣにおいて、ＥＴＶ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを経時的に定量化した。ＥＴＶ２タンパク質レベルは、ステージ２のリモデリング期の間にピークに達した。続いて、ＥＴＶ２タンパク質レベルは、ステージ３の安定化期の間に、ステージ１の誘導期と比較して、９０％を上回って下方制御された。ＥＴＶ２タンパク質レベルは、プロテアソーム阻害剤（ＭＧ１３２）の存在下において６倍回復し、翻訳後改変、例えば、ユビキチン化が、経時的なＥＴＶ２タンパク質レベルの下方制御において役割を果たすことが示された。したがって、ＥＴＶ２は、Ｒ－ＶＥＣ形成を誘導するが、血管が安定化された後は、低いレベルのＥＴＶ２しか検出されなかった。この観察により、ルーメン化されたＲ－ＶＥＣを開始させ持続させるためには、一過的なＥＴＶ２発現で十分であり得るという考えが生じた。
この可能性を試験するために、本発明者らは、ドキシサイクリンの存在によりＥＴＶ２発現を誘導する、逆ｔｅｔトランス活性化因子（ｒｔＴＡ）－ドキシサイクリン（ｄｏｘ）誘導系（以降、ｉＲ－ＶＥＣと称される）を使用した。誘導系を試験すると、効率的に停止され、ＥＴＶ２ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルが、ドキシサイクリンの除去時に無事に下方制御された。ＥＴＶ２を、ステージ１の誘導中にドキシサイクリン補充によって２週間発現させ、次いで、ｉＲ－ＶＥＣ細胞を、血管形成アッセイの間にネットワークを形成させた。次いで、ドキシサイクリンを、異なる時点：０日目（ステージ２のリモデリング期の発生）、ステージ２のリモデリング期の開始の１週間後、またはステージ２のリモデリング期の開始の４週間後に、除去した。注目すべきことに、ＥＴＶ２発現は、ルーメン化されたステージ３の安定な血管の形成を可能にするためには、ステージ２のリモデリングステージの開始後に最小１週間のみ必要であり、その後はなくても済ませられた。実際に、ｉＲ－ＶＥＣは、血管定量化および電子顕微鏡の両方によって示されるように、ＥＴＶ２を停止させた後であっても、脈管安定性を持続させた。
Ｒ－ＶＥＣは、定義されたラミニン、エンタクチン、コラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ）のマトリックスにおいて血管を形成する
インビトロでの脈管パターニングおよびオルガノイド形成のための現在のアプローチは、細胞外マトリックス、例えば、マトリゲルの粗調製物の使用を必要とする。マトリゲルは、多数の消化されたマトリックス成分を含有しているため、永続的な血管の形成またはそれらのオルガノイド細胞成分との相互作用を制御する因子を単離することが難しくなっている。血管細胞外マトリックスの多数の組合せをスクリーニングすることにより、本発明者らは、マトリゲルを使用して形成されるものと同様に、安定なルーメン化されたＥＴＶ２により作動される血管の自己アセンブリに十分である化学量論的に定義されたラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ）のマトリックスを特定した。注目すべきことに、対照のナイーブヒトＥＣは、Ｌ．Ｅ．Ｃにおいて安定な血管ネットワークを形成しなかった。Ｌ．Ｅ．Ｃおよびマトリゲルの両方において生成されたＲ－ＶＥＣ血管は、８週間まで、類似の永続性のある血管領域および分枝化を示した（図１Ｈ）。電子顕微鏡により、ステージ３のＲ－ＶＥＣが、Ｌ．Ｅ．Ｃ．およびマトリゲルの両方において、開存したルーメンおよびタイトジャンクションを有する血管を形成したことが判明した（図１Ｉ）。インテグリンＩＴＧβ１に対する中和抗体は、Ｌ．Ｅ．Ｃにおける血管形成を抑止し、Ｒ－ＶＥＣ上に発現されるインテグリンとＬ．Ｅ．Ｃマトリックスとの相互作用が、管形成に重要であることを示した。定義されたマトリックス成分を利用することにより、管形成を制御する接着分子およびケモカインとの血管周囲相互作用の特定が促進され得る。
Ｒ－ＶＥＣは、ヒト全末梢血の血行動態的層流を持続させる大容積のマイクロ流体デバイスにおいて、安定なルーメン化された灌流可能な血管へと自己組織化する。
灌流能力およびＲ－ＶＥＣ管が層流を持続させる能力を、３マイクロリットルの容積を有する３×１×１ミリメートル3のマイクロ流体デバイスに細胞を撒くことによって、試験した（図１Ｊ）。３～５日間以内に、Ｒ－ＶＥＣは、ルーメン化された血管へと組織化および自己アセンブルしたが、対照細胞は、血管を生成することができなかった（図１Ｋ）。血管ネットワークが完全に構築されると、６日目までに、本発明者らは、ｍＣｈｅｒｒｙ標識化ビーズ（４μｍ）を注入口から循環させ、Ｒ－ＶＥＣ血管は、デバイスの排出口チャネルへのビーズの流動を可能にした。本発明者らは、対照の非ＥＴＶ２形質導入ＥＣでは、チャネル全体へのビーズの流動を観察しなかった（図１Ｋ）。
比較的大きなオルガノイドおよび組織外植片、例えば、膵島または上皮および腫瘍オルガノイドを収容することを想定し、本発明者らは、フィブリンゲルマトリックス内の６０，０００個を上回るステージ１のＲ－ＶＥＣを収容することができる、５×３×１ミリメートル3（１５マイクロリットルの総容積）の大きな灌流チャンバーサイズを有するマイクロ流体デバイスを設計した。１～３日間デバイスに埋め込んだ後、Ｒ－ＶＥＣは、デバイスの注入口チャネルを排出口チャネルに接続する、３ミリメートル超に及ぶ連続的かつ広範囲な多重層のパターニングされた脈管叢へと自己アセンブルした（図１Ｌ）。
注目すべきことに、Ｒ－ＶＥＣ血管は、白血球および赤血球、ならびに血小板およびインタクトな血漿のすべてを含有するヘパリン化ヒト全末梢血（採血によって新しく得られた）の輸送を可能にする血行動態的に安定した血管へと自己組織化した（図１Ｍ）。全血細胞の灌流の間、Ｒ－ＶＥＣ毛細血管ネットワークは、開存したままであり、最小限のＲＢＣ、血小板、およびＷＢＣへの漏出を示し、マイクロ流体チャンバーの注入口から排出口への血液の均一な流動が可能となっていた。したがって、Ｒ－ＶＥＣは、血管周囲の支持要件、人工スキャフォールドの限定的な制約、または血管新生成長因子の超生理学的使用を伴うことなく、大容積の血管チャンバーにおいてマイクロ流体灌流を血行動態的に持続させることが可能な連続的な毛細血管ネットワークへと自己アセンブルする。
Ｒ－ＶＥＣ血管は、インビボでのプラグ移植片において、安定な長期持続する機能的な血管を形成する
Ｒ－ＶＥＣが、インビボで機能性のパターニングされた血管を持続させることができるかどうかを評価するために、ＳＣＩＤベージュマウスに、ｍＣｈｅｒｒｙもしくはＧＦＰ標識化対照ヒトＥＣ、またはＬ．Ｅ．Ｃマトリックス中に懸濁させたＲ－ＶＥＣを皮下に埋め込んだ。埋込みの１～５ヶ月後に、Ｒ－ＶＥＣまたはヒト脂肪Ｒ－ＶＥＣの血管持続性、および既存のマウス循環への吻合の程度を、抗ヒトＶＥカドヘリン（ＶＥｃａｄ）抗体生体内染色によって評価した（図２Ａ～２Ｃ）。Ｒ－ＶＥＣをロードしたプラグは、目視で、対照の非ＥＴＶ２細胞プラグよりも脈管形成されていた（図２Ｂ）。プラグの全載共焦点写真および切片化後の両方により、Ｒ－ＶＥＣを埋め込んだプラグにおいて、対照の非ＥＴＶ２ ＥＣプラグと比較して、はるかに高い血管ルーメン領域、組織化、およびパターニングが明らかとなった（図２Ｃ～２Ｄ）。ヒト血管領域は、Ｒ－ＶＥＣプラグでは、すべての時点において、対照ＥＣプラグよりも有意に高かった（１時点当たりｎ＝３匹のマウス／群）（図２Ｄ）。
加えて、ヒトＶＥｃａｄを対象とする抗体のマウスへの生体内注射は、Ｒ－ＶＥＣ血管が、エンドムチン+マウス脈管構造に吻合し、プラグ全体にわたってモザイク状の灌流血管を構築したことを示した（図２Ｅ）。Ｒ－ＶＥＣ血管は、抗マウス平滑筋および周皮細胞特異的抗体での後染色によって示されるように、マウス血管周囲支持細胞によって包囲されていた（図２Ｆ）。インビボでの差示的平滑筋被覆は、Ｒ－ＶＥＣ血管における血管階層を示し、より大きな動脈はより厚い平滑筋細胞層で被覆され、より小さな毛細血管では被覆がより少なかった（図２Ｆ）。インビトロでの実験と一貫して、ｉＲ－ＶＥＣはまた、Ｌ．Ｅ．Ｃにおいて、安定な血管へとアセンブルし、インビボでの１週間のドキシサイクリンが、脈管安定性を保持するのに十分であった（ｎ＝３～４匹のマウス／群の代表的な画像）（図２Ｇ～２Ｈ）。インビボプラグにおけるＲ－ＶＥＣおよびｉＲ－ＶＥＣ血管はまた、デキストランを静脈内注射した場合に、漏出せず開存されていることも示された（分子量７０ｋＤａ）。対照として、本発明者らはまた、ヒトナイーブＥＣに、プロトタイプの漏出性で脱組織化された腫瘍様の血管を形成するＫ－ＲＡＳを形質導入した。Ｒ－ＶＥＣとは極めて対照的に、Ｋ－ＲＡＳを形質導入したヒトＥＣは、漏出および脱組織化された構造を示す、血管腫を想起させる血管を形成した。
ＥＴＶ２が、血管腫の発生、転移性または血管の奇形化を起こさせ得る可能性を排除するために、本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣを、１０ヶ月間、免疫不全状態にしたＳＣＩＤベージュマウスに埋込み、腫瘍または転移病変部のなんらかの証拠について、マウスのプラグおよび器官を分析した。埋込みの１０ヶ月後に取り出したＲ－ＶＥＣプラグは、経時的な異常成長を示しておらず、正常に見え、同時に、灌流し局在化されたＲ－ＶＥＣおよび良好に組織化された血管構造を保持していた。Ｈ＆Ｅおよびマッソン染色によって１０ヶ月の時点でＲ－ＶＥＣプラグには、血管腫も腫瘍も観察されず、異常な脱組織化された構造が形成されたＫ－ＲＡＳプラグとは対照的であった。Ｒ－ＶＥＣを１０ヶ月間埋め込んだマウスの試験したその他の器官のいずれにおいても、腫瘍も転移性病変部も異常も観察されなかった。
Ｒ－ＶＥＣ、ｍｙｒＡｋｔ１、Ｋ－ＲＡＳ、およびＥＴＳ１プラグに由来するＨ＆Ｅ切片を、なんらかの悪性特徴の可能性について、公平に評価した。Ｒ－ＶＥＣ血管は、正常な脈管形成されパターニングされた毛細血管構造を構築すると評価された。対照的に、ｍｙｒＡｋｔ１ Ｅｃは、毛細血管血管腫を示す過剰に満たされ脱組織化された血管を形成していることが確認された。Ｋ－ＲＡＳ ＥＣは、肉腫様腫瘍の特徴を有する典型的な血管腫を形成していると見られた。ＥＴＳ１を形質導入したＥＣは、線形毛細血管構造を有するがルーメンが欠如していると評価された。したがって、Ｒ－ＶＥＣは、１０ヶ月間の調査期間において、血管の異常も腫瘍も伴わず、永続性のある構造的に正常かつ吻合した血管を形成する。
ＥＴＶ２は、クロマチンリモデリングおよび転写制御を通じて血管の形成を媒介する
次に、ＥＴＶ２発現が長期持続するパターニングされたルーメン化血管の形成を誘導する機序を明らかにするために、本発明者らは、ステージ１の導入期においてＥＴＶ２の形質導入なしおよびありで、ヒトナイーブＥＣのＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）分析を行った（ｎ＝４）（図３Ａ～３Ｂ）。遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析により、血管新生、ＧＴＰａｓｅ活性の正の制御、細胞外マトリックスの組織化、および機械的刺激に対する応答を制御する経路における遺伝子の上方制御が明らかとなった（図３Ａ～３Ｂ）。ステージ１の誘導期の間、Ｒ－ＶＥＣは、ＶＥｃａｄ、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）、およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）を含むＥＣ特異的マーカーの発現を持続させることによって、血管同一性を維持する。ＥＴＶ２誘導時に、４９０個の遺伝子の群が、心臓、皮膚、大動脈、および脂肪に由来するＲ－ＶＥＣを含む、様々な組織特異的成体ヒトＥＣの中で差示的に発現された。
本発明者らは、ステージ１の誘導期の間に、Ｒ－ＶＥＣに対してＥＴＶ２クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）シーケンシング（ＣｈＩＰ－ｓｅｑ）分析を行った。本発明者らはまた、Ｒ－ＶＥＣおよび対照ＥＣ（ＣＴＲＬ－ＥＣ）の両方に、ヒストンＨ３リジン４における転写活性化関連トリメチル化（Ｋ４ｍｅ３）、ヒストンＨ３リジン２７におけるアセチル化（Ｋ２７ａｃ）、およびヒストンＨ３リジン２７における転写抑制関連トリメチル化（Ｋ２７ｍｅ３）のＣｈＩＰ－ｓｅｑ分析も行った（図３Ｂ～３Ｃ）。ＣｈＩＰ－ｓｅｑ分析により、Ｒ－ＶＥＣにおけるいくつかの差示的に発現される遺伝子のプロモーター、および成熟ＥＣにおいてサイレンシングされている多数の管形成促進経路内の遺伝子のプロモーターへのＥＴＶ２の結合が、明らかとなった（図３Ｂ～３Ｃ）。したがって、ＥＴＶ２は、Ｒ－ＶＥＣにおいて誘導期の間に、管形成および血管新生遺伝子の直接的な再活性化により、成熟ＥＣのクロマチンおよびトランスクリプトームをリセットする。
Ｒａｐ１活性化は、Ｒ－ＶＥＣにおけるＥＴＶ２に媒介される管形成に必須である
小さなＧＴＰａｓｅ Ｒａｐ１の活性化に関与する遺伝子のクラスターは、ＧＯ分析によって示されるように、ステージ１の誘導時のＲ－ＶＥＣにおいて強力に上方制御された（図３Ａ～３Ｂ）。ＥＴＶ２誘導時に、３つのＧＥＦ（ＲＡＳＧＲＰ２、ＲＡＳＧＲＰ３、ＲＡＰＧＥＦ５）およびＲＡＳＩＰ１もまた、有意に上方制御された（図３Ｄ）。ＣｈＩＰ－ｓｅｑおよびＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ分析により、ＲＡＳＧＲＰ３およびＲＡＳＩＰ１のプロモーターへのＥＴＶ２の直接的な結合、ならびにそれに続くこれらの遺伝子のＫ４ｍｅ３およびＫ２７ａｃの増加が確認された（図３Ｃ）。ウエスタンブロット分析により、ＲＡＳＧＲＰ３のレベルが、Ｒ－ＶＥＣにおけるＥＴＶ２のレベルと相関することを確認した。Ｒ－ＶＥＣはまた、対照であるＥＴＳ１を形質導入したかまたはｍｙｒＡＫＴ１を形質導入したＥＣと比較して、高レベルのＲＡＳＧＲＰ３タンパク質を発現する。
Ｒａｐ１活性化は、大動脈および脈管叢の両方の形成のために、発達時のルーメン形成に重要であることが示されている47,53,54。Ｒａｐ１経路における類似の差示的に発現される遺伝子が、ＥＴＶ２過剰発現時に他の成体ヒト組織特異的ＥＣにおいて、ならびに９．５の胚生期（Ｅ９．５）のＥＴＶ２－ビーナスレポーターマウスの胚から単離したＥＴＶ２陽性ＦＡＣＳ分取ＥＣにおいて、見出された。ステージ１の誘導期の間の活性Ｒａｐ１－ＧＴＰのプルダウンは、Ｒ－ＶＥＣにおいて、ナイーブＥＣと比較して高いレベルの活性Ｒａｐ１－ＧＴＰを示した（ｎ＝５）（図３Ｅ～３Ｆ）。Ｒａｐ１阻害剤ＧＧＴＩ２９８での処置の後に、血管形成は、有意に低減され、ルーメンは存在していなかった（図３Ｇ～３Ｈ）。同様に、ｓｈＲＮＡによるＲＡＳＧＲＰ３のノックダウンは、Ｒ－ＶＥＣに媒介される血管形成の有意な破壊をもたらした（図３Ｉ～３Ｊ）。したがって、ＥＴＶ２は、Ｒａｐ１ ＧＥＦの上方制御を通じて部分的に血管およびルーメンの形成を強化する。
Ｒ－ＶＥＣは、ステージ特異的転写発現パターンを受ける
Ｒ－ＶＥＣのステージ１の誘導期に作動される前述の遺伝子に加えて、Ｒ－ＶＥＣは、誘導－リモデリング－安定化ステージにおいて、２Ｄ培養物から３Ｄ血管に移行するときに、動的転写発現を受ける（図３Ｋ）。注目すべきことに、Ｒ－ＶＥＣ血管は、それらの最終的な安定したパターニングに到達すると、それらは、インビトロで培養されたＥＣと比較して、新しく単離されたＥＣと同様の転写シグネチャーを獲得する。ステージ３の安定化期において、Ｒ－ＶＥＣは、インビトロでの成熟ＥＣの培養時に消失した機械感受性に関与する遺伝子（ＰＩＥＺＯ２、ＫＬＦ２、およびＫＬＦ４）、ならびにＥＣリモデリングに関与する遺伝子（ＡＴＦ３）を上方制御し（図３Ｋ）、したがって、ステージ３における３Ｄ安定性Ｒ－ＶＥＣ血管は、インビボにおける生理学的血管と同様に挙動する。これは、インビボプラグからＲ－ＶＥＣを単離し、それらのトランスクリプトームを、新しく単離したＨＵＶＥＣおよびＲ－ＶＥＣのステージ３の安定な血管と比較することによって、さらに確認した。注目すべきことに、３Ｄ血管におけるステージ３の差示的に発現される遺伝子、例えば、ＰＩＥＺＯ２、ＫＬＦ２、およびＫＬＦ４は、ステージＩの誘導の間にＥＴＶ２によってすでに結合されており、発現のためにエピジェネティックにプライミングされていることが見出された。したがって、ＥＴＶ２は、誘導期の間の成熟ＥＣのクロマチン範囲を、管形成促進性であり、外来シグナルに応答してリセットされ得る一般的なＥＣを想起させる可能性が高い構成にリセットする。これは、Ｒ－ＶＥＣを、以下の節に記載されるリモデリングおよび管形成のための様々な微小環境のキューに応答するようにチャンレンジする研究において裏付けられる。
Ｒ－ＶＥＣは、脱細胞化された組織スキャフォールドに脈管形成する
再細胞化し、患者に移植することができる細胞外マトリックススキャフォールドへと器官を脱細胞化することに関して、大きな進歩があった。脱細胞化手順の間、浸透圧および界面活性剤により、様々な組織において細胞物質を除去し、実質組織ならびに間質、小さな毛細血管、および大きな脈管構造を支持するマトリックスの鞘を残すことができる。この技術における近年の進歩にもかかわらず、脱細胞化されたスキャフォールドの脈管形成のための長期持続する機能的な血管、特に小口径の毛細血管の生成は、難題となっている。具体的には、脱細胞化されたスキャフォールドにおける大口径の血管は、ＥＣでコロニー形成することができるが、小さな毛細血管サイズの血管を分枝することは困難であり、これは、細胞の生存および機能特化に重要である。
この問題に取り組むために、本発明者らは、ステージ１の誘導において生成されたＲ－ＶＥＣを、エキソビボで脱細胞化されたラット腸バイオリアクターにおいて脈管構造を再構築することができる、脱細胞化された腸モデルに導入した（図４Ａ～４Ｇ）。注目すべきことに、Ｒ－ＶＥＣは、脱細胞化した腸の小さな毛細血管が豊富に存在していた（図４Ｄ）。ＣＤ３１抗体での染色により、Ｒ－ＶＥＣまたはｉＲ－ＶＥＣを使用した場合に、非ＥＴＶ２形質導入ＥＣ（ＣＴＲＬ－ＥＣ）と比較して、はるかに高い血管コーティングが明らかとなった（図４Ｅ～４Ｇ）（条件１つ当たりｎ＝３個のスキャフォールド）。注目すべきことに、大口径の血管を一過的にコーティングしたＣＴＲＬ－ＥＣと比較して、Ｒ－ＶＥＣおよびｉＲ－ＶＥＣは、脱細胞化されたスキャフォールド全体にわたって均一に狭く小さい毛細血管にコロニー形成した。
１週間のエキソビボ培養の後、再脈管形成された腸外植片を、免疫不全状態にしたマウスの大網に埋め込んだ。Ｒ－ＶＥＣにより脈管形成されたスキャフォールドは、それらの開存性を維持し、１週間および４週間の両方において生体内抗ヒトＶＥｃａｄ染色によって示されるように、マウス脈管構造に吻合した（図４Ｈ～４Ｉ）。ヒトＥＣの頻度の定量化により、Ｒ－ＶＥＣ血管が、４週間の時点まで、ＣＴＲＬ－ＥＣよりも有意に高い割合で、インビボにおいて持続したことが判明し、この持続性が、それらの完全性およびアポトーシス率の低さに部分的に起因していた（図４Ｊ～４Ｋ）。
ヒト膵島外植片の生理学的Ｒ－ＶＥＣ脈管形成
Ｒ－ＶＥＣは、市販供給源から入手した死体サンプルから得られたヒト膵島外植片にも分枝するが、ＣＴＲＬ－ＥＣはそうではない（図５Ａ～５Ｅ）。入手４日後のインタクトな膵島（２００個の膵島／実験）を、大型の５０マイクロリットルのマトリゲル静的ドームにおいて、Ｒ－ＶＥＣ（２５０，０００個の細胞）またはＣＴＲＬ－ＥＣ（２５０，０００個の細胞）と共培養した。注目すべきことに、ステージ２のＲ－ＶＥＣは、共培養の２４時間以内に膵島を急速に分枝し、この分枝化は、少なくとも２週間続いた（図５Ａ）。ヒト膵島の機能性を、２５個の膵島を単独で培養したかまたはＣＴＲＬ－ＥＣもしくはＲ－ＶＥＣと共培養した２週間後に、グルコースに刺激されるインスリン分泌（ＧＳＩＳ）試験によって、調査した（ｎ＝３人の独立した死亡対象）（図５Ｂ）。高グルコース刺激時のインスリン応答は、膵島をＲ－ＶＥＣと共培養した場合に、他の条件よりも有意に高かった。ヒト膵島と相互作用する血管領域も、定量化すると、Ｒ－ＶＥＣ共培養物において、ＣＴＲＬ－ＥＣと比較して高く、Ｒ－ＶＥＣ血管がヒト膵島に深く出芽していた（図５Ｃ～５Ｅ）。
インビボにおける天然の膵島は、グルコース感知およびインスリン分泌活動を行うように、豊富に脈管形成されているため、本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣが、インビトロで膵島外植片の生理学的灌流を可能にし得るかどうかを評価することに乗り出した。現在利用可能なデバイスは、高さが最大１５０ミクロンに制限されることが多く、これにより、２５０ミクロンの平均直径サイズを有する膵島の埋込みは、非実用的になっている。他のオンチップ器官デバイスは、内皮細胞を他の細胞型と分離する人工膜を含み、これによって、物理的相互作用および相互干渉が著しく妨害される。このため、本発明者らは、図１Ｊに示される５×３×１ミリメートル3（１５マイクロリットルの容積）の大きなサイズのチャンバーのマイクロ流体デバイスを利用し、それによって、６０，０００個のＲ－ＶＥＣと混ぜ合わせた４０個を上回るインタクトなヒト膵島を収容するが可能となった。これらの比較的かさ高い膵島を大容積のマイクロ流体デバイスに収容しそれに脈管形成する能力は、それらの生理学的機能性をモニタリングし定量化するのに必須であり、連続的なルーメン化脈管ネットワークへと自己アセンブルするＲ－ＶＥＣの能力によって実現した（図５Ｆ）。
平均で、Ｒ－ＶＥＣとヒト膵島との１～３日間の共埋込みのうちに、マイクロ流体デバイス内の膵島の大半に、Ｒ－ＶＥＣが分枝した（図５Ｇ～５Ｈ）。膵島に取り込まれた血管の血行動態的安定性を評価するために、本発明者らは、図１Ｍに示されるように、未希釈のヘパリン化ヒト全末梢血（新たな採血によって得た）を、マイクロ流体デバイスの注入口から注入した（図５Ｆ～５Ｇ）。デバイス全体で、造血細胞が、ヒト膵島内に分枝または深く入り込んだＲ－ＶＥＣ血管に十字交差することを観察することができた。これは、膵島単独（ＥＣなし）またはＣＴＲＬ－ＥＣを有する膵島を埋め込んだ場合の、デバイスにおける蛍光標識した血液細胞の灌流の欠如とは際立って対照的であった（図５Ｇ～５Ｉ）。加えて、マイクロ流体デバイスの注入口からの蛍光コンジュゲートしたＶＥ－カドヘリンに対する抗体の生体内注射により、ＥｐＣＡＭ+インスリン+膵島に脈管形成している血管のほぼすべてが、灌流可能であり、血液および流体を輸送することが可能であったことが示された（図５Ｊ～５Ｋ）。したがって、Ｒ－ＶＥＣ血管は、広範囲の連続的な血行動態的に安定したネットワークへと自己組織化することができるだけでなく、インタクトな膵島に取り込まれ、それに脈管形成することができる。
次に、Ｒ－ＶＥＣ血管が、膵島の生理学的脈管形成を行うことができることを示すために、本発明者らは、マイクロ流体脈管チャンバーの注入口を通じたグルコースの注入によって、グルコース刺激試験を行った（図５Ｌ）。Ｒ－ＶＥＣと共培養したヒト膵島は、９および２４分の時点で排出口において測定されるように、高レベルのグルコースを適切に検出し、インスリンを分泌することによってそれに応答した（ｎ＝３人の独立した死亡対象）（図５Ｍ）。平均すると、本発明者らは、グルコース刺激時のインスリン産生に７倍の増加を検出した（図５Ｍ～５Ｎ）。ヒト膵島単独またはＣＴＲＬ－ＥＣを有する膵島を含有するマイクロ流体チャンバーは、排出口において、非常に低いインスリン産生を示し、機能的な脈管形成または流体の間質対流輸送が最小限であることが示された（図５Ｍ～５Ｎ）。したがって、ＥＴＶ２は、ＥＣが、膵島外植片を生理学的に灌流し、ヒトインスリン産生ベータ細胞の機能性を維持する交差相互作用性脈管叢を形成することを可能にする。
Ｒ－ＶＥＣは、組織特異的オルガノイドに効率的に分枝する
本発明者らはまた、生理学的器官形成および疾患モデルの開発を目的として、マウスおよびヒト正常または悪性上皮オルガノイド培養物に分枝するＲ－ＶＥＣの能力を調べた。このアプローチはまた、Ｒ－ＶＥＣの潜在的な組織および腫瘍特異的適応応答の発見も可能にするであろう。患者の生検から構築されたヒト正常結腸オルガノイドを、５０マイクロリットルの総体積を構築する６ｍｍの直径の静的マトリックスドームにおいて、ＣＴＲＬ－ＥＣまたはステージ１の誘導期Ｒ－ＶＥＣと混合した。Ｒ－ＶＥＣは、高度に組織化され相互接続された血管へとリモデリングすることができ、５０マイクロリットルのマトリックスドーム全体にわたって結腸上皮細胞と会合したが、ＣＴＲＬ－ＥＣは、オルガノイドの存在下において安定な血管を形成することができなかった（図６Ａ～６Ｃ）。８日目に、ヒト結腸オルガノイドは、Ｒ－ＶＥＣと共培養した場合に、ＣＴＲＬ－ＥＣとのものまたはＥＣなしの場合よりも、有意に高い頻度のＥｄＵ+増殖細胞、ならびに数およびサイズの増加を有した（図６Ｄ～６Ｆ）。
ヒト結腸オルガノイドを、ＭＵＣ２によって杯細胞についても染色し、Ｒ－ＶＥＣと共培養した個々のオルガノイドの染色強度に、ＣＴＲＬ－ＥＣと共培養したかまたは単独のオルガノイドと比較して、減少があった。３つすべての共培養条件にわたって、培養したヒト結腸オルガノイドにおける様々な分化ならびに幹細胞および前駆体マーカーのｑＲＴ－ＰＣＲによる有意差はなかった（ｎ＝５回の独立した実験）。しかしながら、ｑＲＴ－ＰＣＲにより、バランスの傾きを示すＲ－ＶＥＣとの共培養時におけるＮｇｎ３の上方制御およびＭＵＣ２レベルの減少の傾向、ならびにヒト結腸オルガノイドの杯細胞分化ではなく内分泌系前駆体運命の傾向が明らかとなった。したがって、Ｒ－ＶＥＣは、最も高い可能性としてパラクリン因子の放出を通じて、ヒト正常結腸オルガノイドの増殖および完全性を持続させるが、全体として、それらの分化状態能力を維持する。
血管領域は、Ｒ－ＶＥＣウェルにおいて、ＣＴＲＬ－ＥＣと比較して有意に高く、Ｌ．Ｅ．Ｃ．におけるＲ－ＶＥＣおよびＣＴＲＬ－ＥＣの両方とヒト正常結腸オルガノイドとの直接的な相互作用を、マルチゾーン共焦点顕微鏡を通じて低速度撮影動画でさらに評価した（図６Ｆ）。Ｒ－ＶＥＣ血管とそれぞれのオルガノイドとの間の緊密な相互作用を、３Ｄの１５０μＭのｚスタックで、７２時間にわたって追跡した。ＣＴＲＬ－ＥＣとＲ－ＶＥＣとの共培養物の比較のために、本発明者らは、ｚスタック共焦点画像の投影を行い、経時的に動員され、オルガノイドと相互作用した血管ネットワークの領域を追跡するように記述されたカスタムＭＡＴＬＡＢコードによって、オルガノイドと相互作用する血管ネットワークの程度を定量化した（図６Ｈ）。上皮細胞の有意により大きな表面領域を被覆し、相互接続された脈管ネットワークのウェブにおいてオルガノイドに取り込まれた、Ｒ－ＶＥＣを定量化した。本発明者らはまた、Ｒ－ＶＥＣが、マウス小腸オルガノイドを熱心に探し出しそれに分枝することを示した。オルガノイドと相互作用する内皮出芽の血管領域および数は、Ｒ－ＶＥＣを使用した場合に、ＣＴＲＬ－ＥＣと比較して有意に高かった。
次に、本発明者らは、大容積の１５マイクロリットルのマイクロ流体デバイスにおいて、ヒト結腸オルガノイドに生理学的に脈管形成するＲ－ＶＥＣの能力を調べた（図６Ｉ～６Ｊ）。本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣが、結腸オルガノイドと緊密に相互作用しながら、１５マイクロリットル容積のマイクロ流体デバイス全体に広がる相互接続された複数層の血管ネットワークへと自己アセンブルすることを見出した。結腸オルガノイドとの共培養物におけるＲ－ＶＥＣ脈管の開存性および灌流性を、デバイス全体にわたって全脈管ネットワークを染色することができる、蛍光標識したＶＥｃａｄ抗体をデバイスの注入口に注入することによって、示した。さらに、ルーメンの開存性を、蛍光標識したマイクロビーズを流すことによって確認した（図６Ｉ～６Ｊ）。
Ｒ－ＶＥＣは、腫瘍オルガノイドを熱心に探し出し、それに適応する
腫瘍血管床に動員された内皮細胞は、構造的および機能的に異常な毛細血管を形成することが多い。次に、破損した腫瘍ＥＣは、腫瘍成長を促進する異常な因子を供給する。Ｒ－ＶＥＣが、腫瘍血管の不適応特性を獲得し得るかどうかを判定するために、本発明者らは、ステージ１の誘導期Ｒ－ＶＥＣを、患者由来の結腸直腸腫瘍オルガノイドと共培養した（図７Ａ～７Ｃ）。２４時間以内に、Ｒ－ＶＥＣは、腫瘍オルガノイドに遊走し、そこに分枝した。８日間にわたって、すべてのオルガノイドに、密なＲ－ＶＥＣ血管集団が分枝したが、一方でＣＴＲＬ－ＥＣは、そうなることができなかった（図７Ａ）。上皮マーカーＥｐＣＡＭについての染色により、腫瘍結腸オルガノイド細胞とＲ－ＶＥＣとの間の緊密な細胞－細胞相互作用が明らかとなった（図７Ｂ～７Ｃ）。腫瘍細胞の定量化により、Ｒ－ＶＥＣ共培養物において、有意に高い割合のＥｄＵ+増殖性腫瘍細胞が示された（図７Ｄ）。
３ＤマトリックスにおけるＣＴＲＬ－ＥＣおよびＲ－ＶＥＣと腫瘍オルガノイドとの動的相互作用を、マトリゲルおよびラミニン－エンタクチン－コラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ）マトリックスの両方において、７８時間にわたる１５０μＭのｚスタック動画の生細胞イメージングを行って、マルチゾーンの共焦点顕微鏡によって評価した。ｚ投影画像およびカスタムＭＡＴＬＡＢコードを使用して、本発明者らは、ＣＴＲＬ－ＥＣおよびＲ－ＶＥＣの両方について、腫瘍オルガノイドに組み込まれた相互接続された血管ネットワークの領域を定量化した。正常結腸オルガノイドと同様に、Ｒ－ＶＥＣと結腸チューモロイドとの相互作用は、マトリゲルおよびＬ．Ｅ．Ｃマトリックスの両方において、ＣＴＲＬ－ＥＣのものよりも有意に高かった（図７Ｅ）。脈管領域もまた、Ｒ－ＶＥＣ共培養物において、ナイーブ非ＥＴＶ２形質導入共培養物ウェルと比較して、高かった（図７Ｆ）。トリプルネガティブ乳房腫瘍を含む、他の患者由来の腫瘍オルガノイドは、同様の結果をもたらした。
次に、本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣが、インビボにおいてヒト化腫瘍脈管形成を持続させることができるかどうかを評価し、ステージ１の誘導期ｍＣｈｅｒｒｙ標識化Ｒ－ＶＥＣまたはＣＴＲＬ－ＥＣを、結腸腫瘍オルガノイド（ＧＦＰ標識化）と混合し、ＳＣＩＤベージュマウスの皮下に埋め込み、５ヶ月後に殺処理した。Ｒ－ＶＥＣは、ＣＴＲＬ－ＥＣとは異なり、成長する結腸腫瘍オルガノイド内でそれらの脈管ネットワークパターニングおよび脈管形成を維持および持続させた（図７Ｇ～７Ｉ）。Ｒ－ＶＥＣは、マウス循環に吻合し、エンドムチン+染色マウスＥＣとのモザイク状の脈管を構築した（図７Ｇ）。ヒトＥＣによる腫瘍塊の脈管被覆は、Ｒ－ＶＥＣの存在下において、ＣＴＲＬ－ＥＣと混合したものと比較して、増大した（図７Ｉ）。したがって、Ｒ－ＶＥＣは、インビトロおよびインビボの両方において、チューモロイドからのシグナルに応答し、腫瘍オルガノイドに有益に分枝する適応能力を備えている。このアプローチは、腫瘍ＥＣがそれらの異常な腫瘍脈管構造特性を獲得する機序を解読することを可能にした。
単一細胞トランスクリプトミクスは、正常または腫瘍オルガノイドと相互干渉するＲ－ＶＥＣの差示的適応性を明らかにする
ＥＣとオルガノイドとの間の相互干渉についての研究は、これまで、３Ｄ培養物におけるＣＴＲＬ－ＥＣの脈管完全性が限られていることに起因して、厄介なものであった。このため、本発明者らは、多数のＲ－ＶＥＣがそれらの３Ｄ脈管完全性を長時間持続させる能力を利用することに乗り出し、様々な正常および悪性オルガノイドとの共培養物において、微小環境シグナルに応答するそれらの能力を評価した。実際、図６および図７において観察されるオルガノイドを用いたＲ－ＶＥＣの相互的な応答性および適応性リモデリングは、これらの細胞型の間での緊密な相互通信を示す。この相互作用の分子プロファイルを調査するために、本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣと正常または悪性結腸との３Ｄ共培養物に、トランスクリプトミクス分析を行い、ＲＮＡ発現プロファイルの変化を、３Ｄマトリックスにおいて単独で培養したＲ－ＶＥＣと比較した。
７日間の共培養後に、単独で培養したＲ－ＶＥＣ、および付随する正常または悪性結腸細胞と共培養したものの全集団を単離し、１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームを使用して、単一細胞ＲＮＡ－シーケンシング（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）に供した（図８Ａ～８Ｈ）。内皮細胞および上皮細胞のクラスターを、統合したサンプルにおいて特定した。ＥＣを、脈管特異的マーカーであるＶＥカドヘリン（ＣＤＨ５）、ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）、およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）を発現する単一細胞に焦点を当てることによって特定し、上皮細胞は、上皮マーカーであるＥｐＣＡＭ、ＣＤＨ１、およびＫＲＴ１９の発現によって特定した。
内皮細胞画分において、悪性または正常オルガノイドと共培養したＲ－ＶＥＣは、Ｒ－ＶＥＣ単独と比較して、それらのクラスター形成パターンおよび遺伝子発現に有意な変化を示した（図８Ｂ～８Ｅ）。正常結腸上皮細胞と相互作用したＲ－ＶＥＣは、器官型ＥＣマーカー、例えば、ＰＬＶＡＰおよびＴＦＦ３（クラスター５）を発現するＥＣが濃縮されていた（Ａｕｇｕｓｔｉｎ，Ｈ．Ｇ．＆Ｋｏｈ，Ｇ．Ｙ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５７、ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｌ２３７９、（２０１７）、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｃ．ら、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １６、３０６５－３０７３、（２０１６））（図８Ｄ～８Ｅ）。対照的に、結腸チューモロイドに分枝したＲ－ＶＥＣは、プロトタイプの腫瘍ＥＣによって発現されることがこれまでに示されている因子、例えば、ＩＤ１、ＪＵＮＢ、およびＡＤＡＭＴＳ４（クラスター８）が上方制御されている細胞のクラスターが濃縮されていたが、ジャンクションの完全性を担う遺伝子、例えば、クローディン－５（クラスター５、クラスター７）は逆に選択されていた（Ｌｙｄｅｎ，Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４０１、６７０、（２０１９））（図８Ｆ～８Ｉ）。したがって、Ｒ－ＶＥＣは、定義された遺伝子セットを作動させることによって、外来性微小環境刺激に応答する。注目すべきことには、ナイーブヒトＥＣが数日間を上回ってオルガノイドの分枝化を持続させることがないため、これらの実験は、ナイーブヒトＥＣを用いて行うことができず、そのため、それらとオルガノイドとの相互干渉は、評価することができなかった。
同じ理由で、上皮細胞自体が、Ｒ－ＶＥＣとの相互作用を反映して、それらの分子プロファイルに変化を示した。注目すべきことに、Ｒ－ＶＥＣとの会合に応答して、高いＭＳＬＮレベル（Ｌｉ，Ｓ．ら、ｉｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｖｏｌ． ８、１３５５－１３６１（２０１７））、ならびに低いＭＴ１Ｇ、ＭＴ１Ｘ、およびＭＴ２Ａのレベル（Ｓｉ，Ｍ．＆Ｌａｎｇ，Ｊ．、 Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ Ｖｏｌ． １１、（２０１８））を含め、予後不良および高い転移性と関連するマーカーを有する細胞を、結腸腫瘍細胞におけるＲ－ＶＥＣとの共培養に選択した。
膵島／Ｒ－ＶＥＣは、皮下腔において適切な血液供給を構築した
膵島を、４０μＬの３Ｄマトリックス液滴においてＲ－ＶＥＣと共培養することによって、事前に脈管形成された膵島を調製した。図９Ａに示されるように、Ｒ－ＶＥＣのみが、接続された脈管ネットへと自己アセンブルし、ＨＵＶＥＣはそうならなかった。５滴のそのような事前に脈管形成された膵島を、次いで、ＳＣＩＤベージュマウスの背部の皮下腔に挿入した。グラフトを、１ヶ月後に試験した。膵島／ＨＵＶＥＣを受容したマウスにおいては何も見出すことができなかったが、生着した膵島／Ｒ－ＶＥＣは、適切な血液供給を有するプラグをもたらした（図９Ｂ）。プラグを切片化および染色することにより、Ｒ－ＶＥＣによって形成された血管が脈管形成されたインスリン＋細胞を有する皮下膵島が明らかとなった（図９Ｃ）。
皮下移植により、体重減少が低減され、高血糖が逆転する
本発明者らは、次に、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）の腹腔内注射によって、ＳＣＩＤベージュマウスに糖尿病を誘導した。糖尿病の発症は、非絶食時血中グルコースが３日間連続して３００ｍｇ／ｄｌよりも高いことによって確認した。糖尿病の発症後、一般的な症状は、体重の減少、血中グルコースの増加、および血漿インスリンの低減である。マウスを処置するために、本発明者らは、細胞を含むマトリックスを、背部の皮下腔に移植した。それぞれのマウスに、細胞を含むマトリックスを５滴受容させた。それぞれの液滴は、４０μＬであり、約２００個の膵島のみ、ＨＵＶＥＣとの共培養物、またはＲ－ＶＥＣとの共培養物を含有する（図９Ａ）。したがって、それぞれのマウスは、およそ１０００個のヒト膵島を受容した。予測した通り、膵島単独の皮下移植は、高血糖をほとんど緩和しなかった。
一方で、膵島／Ｒ－ＶＥＣは、移植後の１週目から血中グルコースの迅速な低減が開始され、少なくとも１２週間の観察期間の残りの間、血中グルコースを２００ｍｇ／ｄｌ周辺で安定に制御した（図１０Ａ）。このような結果により、Ｒ－ＶＥＣが、皮下環境に迅速に適応し、長期持続する脈管ニッチを維持して、生着したヒト膵島の機能および／または生存を補助したことが示唆される。注目すべきことに、膵島／ＨＵＶＥＣ外植片は、４週目にのみ血中グルコースを劇的に低減させ、血中グルコースレベルは、その後約２週間以内に３００ｍｇ／ｄｌを上回るまでに跳ね返った。したがって、膵島のみまたは膵島／ＨＵＶＥＣを受容したマウスの体重は、すべての時点で異常に低いままであり、膵島／Ｒ－ＶＥＣマウスの体重は、４週目で正常範囲へと戻り、その後徐々に増加した（図１０Ｂ）。
緩和が実際に、事前に脈管形成された膵島の生着によるものであったことをさらに検証するために、本発明者らは、血清中のヒトインスリンの存在をさらに試験した。まず、マウスを６時間絶食させ、次いで、高用量のグルコースを腹腔内注射で受容させた。２０分間のグルコースチャレンジの後に、血清を採取し、ヒトインスリンについて試験した。図１０Ｃに示されるように、実質的なレベルのヒトインスリンが、膵島／Ｒ－ＶＥＣマウスにおいて検出され、膵島／ＨＵＶＥＣサンプルでははるかに低く、膵島のみのサンプルではほとんど皆無であった。興味深いことに、すべての群において、本発明者らは、ヒトインスリンのレベルのピークが４週目であることを見出したが、これは、膵島／Ｒ－ＶＥＣマウスが、４週目に体重が回復し始めたこと、および膵島／ＨＵＶＥＣマウスが４週目に一時的な正常血糖を有することと完全に一致している。本明細書において、本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣによって事前に脈管形成されたヒト膵島が、ＳＴＺにより誘導される糖尿病マウスにおいて、生存し、生理学的様式で、高血糖を逆転させるように機能するという説得力のある根拠を提供する。皮下腔における膵島／Ｒ－ＶＥＣグラフトの動的適応プロセスをさらに調べることもまた魅力的である。
成熟した成体ヒトＥＣは、定義されたマトリックスにおいてインビトロで、またはマウスにおいてインビボで、数日間または数週間を上回って、長期持続するルーメン化血管を構築および持続させる能力が欠如している。成体由来のＥＣはまた、安定な長期持続する脈管への適切な自己アセンブリに抵抗性であり、正常または腫瘍オルガノイドまたは膵島と有益に相互作用することができず、脱細胞化されたスキャフォールドの内部表面に低密度にコロニー形成する。これらの最適とは言えない機能は、不良な細胞適応性および成熟ヒト内皮の柔軟ではない状態に起因する可能性がある。本明細書において、本発明者らは、胎児発生中にサイレンシングされたＥＴＶ２転写因子を成体ヒトＥＣに再導入することにより、これらの成熟した組織特異的ＥＣに、原始的な脈管形成、管形成、および適応性の能力を付与するように「分子リセット」を誘導することができることを示す。Ｒ－ＶＥＣは、インビトロおよびインビボの両方において、５～１０ヶ月間、幾何パターニング、ルーメン安定性、および分枝ハブの頻度を維持する３Ｄルーメン化脈管ネットワークへと自己組織化することができる、固有の永続性がある大規模管形成能力を有する。Ｒ－ＶＥＣは、ヒトヘパリン化全末梢血を輸送し、ヒト膵島および結腸オルガノイドの生理学的脈管形成を補助することができる脈管へと自己組織化する。注目すべきことに、Ｌ．Ｅ．Ｃマトリックスにおいてマウスに５ヶ月間以上埋め込まれたＲ－ＶＥＣは、毛細血管ネットワークパターニングを維持しながら、マウス循環に吻合する能力を持続させた。本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣプラグを有するマウスが、埋込みの１０ヶ月後でさえも、腫瘍も転移病変部も形成しなかったことを示す。長期持続する安定な血管を構築し、オルガノイド、膵島、または脱細胞化組織の脈管形成を促進する、Ｒ－ＶＥＣのこれらの属性は、Ｒ－ＶＥＣの能力を、脈管不均一性を明らかにし、器官修復のステージを設定するために利用することを可能にするであろう。
Ｒ－ＶＥＣが、これらの脈管順応性特性を獲得する機序は、成熟した組織特異的成体ヒトＥＣにおいて失われる多数の脈管形成、形態形成、および血管新生因子のバランスの取れた活性化を通じて媒介される。おそらくは、ＥＴＶ２の再活性化が、成熟ＥＣの管形成および自己アセンブリ属性を増大させるサイレンシングされた脈管プログラムを、事前に製造されるスキャフォールドの制約、強制的な灌流および周皮細胞の投入の要件なしに、作動させる。この考えは、主として原始的脈管叢において発現される多数のシグナル伝達経路の誘導を明らかにするＲ－ＶＥＣの分子プロファイリングによって裏付けられる。卵黄嚢における大動脈発生および一次血管形成と同様に、これは、脈管形成によって生じる。Ｒ－ＶＥＣは、複数のＲａｐ１－ＧＥＦおよびＲＡＳＩＰ１エフェクターを通じてＲａｐ１経路を活性化して、流動および周皮細胞に依存しない細胞自律的な様式でルーメン形成を可能にする。脈管形成経路を回復させることによって、ＥＴＶ２は、脈管エピジェネティック記憶を初期の柔軟なステージにリセットして、Ｒ－ＶＥＣを、正常な実質または悪性組織から中継される微小環境キューに対してより受容性にしている。
Ｒ－ＶＥＣは、５０マイクロリットルの静置マトリックスドームにおけるオルガノイドおよび膵島外植片の分枝化、ならびに大容積の１５マイクロリットルのマイクロ流体デバイスにおけるこれらのオルガノイドおよび膵島の生理学的脈管形成を加速させる。いずれのモデルにおいても、事前に製造されるスキャフォールドによる強制的なパターンニングに依存することなく、複数層の相互接続された脈管構造へと自己アセンブルするＲ－ＶＥＣの堅強な能力は、Ｒ－ＶＥＣに、合成障壁の制約を受けることなく、様々な上皮および腫瘍細胞と有益に相互作用する細胞の自由を可能にする。これらの静置マトリックスドーム内で、Ｒ－ＶＥＣ毛細血管ネットワークは、ヒトオルガノイド内の様々な成熟および未成熟上皮細胞の維持および拡大を補助し、ヒト膵島細胞においてインスリン放出を持続させる。
本発明者らは、膵島を、単独またはＣＴＲＬ－ＥＣとともに培養した場合に、中等度のＧＳＩＳ応答を観察したが、Ｒ－ＶＥＣ共培養物は、静置マトリゲルドームおよび灌流可能なマイクロ流体デバイスにおいて、ＧＳＩＳを有意に増加させた。膵島共培養物におけるＲ－ＶＥＣの有益な作用の根本にある機序は、細胞外マトリックスタンパク質、例えば、ラミニン、および可能性として、まだ解明されていない膵島特異的アンジオクリン因子の蓄積が関与し得る。本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣ脈管ネットワークとオルガノイドとの緊密な会合が、ＥｄＵ染色によって示されるように、上皮および腫瘍オルガノイドの増殖およびサイズを増大させることを示した。したがって、Ｒ－ＶＥＣは、正常結腸オルガノイドの成長を支持し、その適切な形態形成を演出する、プロトタイプの脈管ニッチとして機能する。一方で、インビトロおよびインビボで結腸腫瘍オルガノイドに組み込まれたＲ－ＶＥＣは、パターンニングされているが、あまり組織化されていない脈管ネットワークを構築する。Ｒ－ＶＥＣと上皮細胞との２方向相互干渉を研究することにより、正常および腫瘍の脈管不均一性を示すシグナルの発見を促進することができる。
酸素および栄養素の送達のための脈管導管を生成するための現在のアプローチは、事前に製造されたスキャフォールドにおけるＥＣの培養、限定的な生体材料、強制的な灌流、および脈管周囲細胞の包含を必要とする（Ｚｈａｎｇ，Ｂ．ら、Ｎａｔ Ｍａｔｅｒ １５、６６９－６７８、（２０１６）、Ｋｉｍ，Ｓ．ら、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １３、１４８９－１５００、（２０１３）、Ｗａｎｇ，Ｘ．ら、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １６、２８２－２９０、（２０１６））。これらの微小環境の介入により、オルガノイドの脈管形成は、インビボ条件再現に近くなるが、それらはまた、重大な技術上の課題ももたらし、インビトロまたはインビボでの治療的使用のための脈管形成されたオルガノイドを構築することの実現しやすさおよび技術的実行可能性を制限する。実際、最適とは言えない脈管ネットワーク自己アセンブリに起因して、ナイーブヒトＥＣは、最大２マイクロリットルの小さな灌流可能チャンバーしか構築することができず（Ｃｈｅｎ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １２、８６５－８８０、（２０１７）、Ｃａｍｐｉｓｉ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ １８０、１１７－１２９、（２０１８）、Ｐｈａｎ，Ｄ．Ｔ．Ｔ．ら、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １７、５１１－５２０、（２０１７））、ヒト造血細胞の流動を妨げる小口径のルーメンを有する血管を有することが多い。さらに、ほとんどの事例では、これらの原始的な血管は、合成の多孔性障壁によってオルガノイドまたは他の細胞型から分離され、それによって、血管と他の細胞との間の相互干渉を制限する（Ｈｕｈ，Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２８、１６６２－１６６８、（２０１０）、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｃ．ら、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １６、３０６５－３０７３、（２０１６））。対照的に、Ｒ－ＶＥＣは、１５マイクロリットルの容量を有する大きなチャンバー内で、パターニングされた灌流可能な連続的毛細血管ネットワークへと容易に自己組織化し、結腸オルガノイドおよび膵島の生理学的脈管形成を可能にする。重要なことに、図５～７および動画２～４に示されるように、Ｒ－ＶＥＣは、オルガノイドおよび膵島外植片と容易に混ざり合い、それと相互作用する細胞の自由を有する。
本開示は、Ｒ－ＶＥＣが、膵島およびオルガノイドに生理学的に脈管形成することができる血行動態的に安定したパターニングされた脈管へと自己組織化するという根拠を提供する。最も重要なことには、大容量のマイクロ流体チャンバー内で先例のない拡張的な相互接続された脈管ウェブを形成するＲ－ＶＥＣの能力により、本発明者らが、いくつかは直径が２５０ミクロンに及ぶ大きなサイズのオルガノイドおよび膵島を収容することが可能となった。他のグループによって使用されている現在のデバイスは、平均でチャンバーの高さが最大１５０ミクロンに限定されており、これにより、大きな膵島およびオルガノイドの研究が損なわれた可能性がある。初めて、本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣが、血小板、ＲＢＣ、およびＷＢＣ細胞、ならびに非撹拌血漿のすべての成分から構成されるヘパリン化されたヒト全末梢血の灌流を可能にするルーメンおよび血行動態的完全性を有する安定な脈管を形成することができることを示す。さらに、本発明者らは、高グルコースの注入が、灌流されたチャンバーの流出口において検出可能な膵島によるインスリンの産生を誘導するため、Ｒ－ＶＥＣが、生理学的脈管形成を促進し得ることを示した。灌流可能なＲ－ＶＥＣはまた、結腸オルガノイドに脈管形成することができ、共培養されたオルガノイドの数の頻度を持続させることができる。対照である非ＥＴＶ２形質導入ヒトＥＣは、管形成血管を持続させることができず、膵島またはオルガノイド培養物の生理学的脈管形成を促進することができない。したがって、Ｒ－ＶＥＣは、組織特異的細胞と生理学的に相互作用し、それと相互干渉する柔軟性を有する、構造的に適応性のＥＣを表す。
オルガノイドを単独で埋め込むことと比較して、Ｒ－ＶＥＣが分枝されたオルガノイドモジュールのインビボ接種が、既存の血管への生着および吻合を増大させ得るというのは、妥当である。Ｒ－ＶＥＣとオルガノイドとの２方向相互干渉はまた、ＥＣがどのようにして組織特異的および腫瘍特異的不均一性を獲得し得るかを判定するステージも設定する。このように、単一細胞トランスクリプトミクス分析（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）およびエピジェネティックプロファイリングを利用して、本発明者らは、正常または腫瘍オルガノイドとの共培養に応答したＲ－ＶＥＣの順応性を見出すことができた。また、腫瘍上皮細胞は、Ｒ－ＶＥＣが分枝すると、予後不良と関連する複数のマーカーを上方制御することが見出された。この発見により、この共培養プラットフォームは、耐性腫瘍表現型のさらなる生理学的および関連する薬物スクリーニングに好適なものとなっている。腫瘍または正常オルガノイドは、従来的には、マトリゲルマトリックスを使用して生成および繁殖される。マトリゲル内に変動的に存在する様々な消化されたマトリックス成分の不確実さは、オルガノイドの自己アセンブリを可能にする接着分子およびケモカインを解明する機械論的研究を不明瞭にする。本明細書において、本発明者らは、定義されたＬ．Ｅ．Ｃマトリックスが、部分的にインテグリン、例えば、β１インテグリンとの相互作用を通じて、上皮および腫瘍オルガノイドとの脈管叢の共組込みを可能にするだけでなく、標的化された機械論的研究を行うのにも十分であることを示す。
本発明者らの研究にＥＴＶ２を利用する主なきっかけは、胚発生の間に一過的にしか発現されず、ストレスを受けた成体ＥＣにおいてのみ作動される、このＥＴＳ転写因子の固有性であった。ＥＴＶ２のこの一時的な発現の生理学的重要性は、調査されているが、その強力な脈管形成促進作用を発揮するためには、短い間隔で発現させる必要があるパイオニア因子としてのその重要な機能を指摘することができる。レンチウイルスＥＴＶ２構成的強制発現の間でさえも、ステージ３の安定な３Ｄ脈管が、低く減少したＥＴＶ２レベルを発現するＥＣから構成されるという本発明者らの発見は、血管細胞におけるＥＴＶ２発現の複雑な制御の証拠である。実際に、本発明者らは、ユビキチン化が、ＥＴＶ２のサイレンシングにおいて役割を果たし得ることを示す。
まとめると、定義された細胞外マトリックスにおけるＲ－ＶＥＣの生成は、血行動態的に安定した柔軟性のある組織特異的ＥＣと非血管細胞との複雑な３Ｄ細胞相互作用を明らかにするための調査モデル系としての機能を果たす。
グルコースに刺激されるインスリン分泌（ＧＳＩＳ）の増大によって示されるように、Ｒ－ＶＥＣとの静置共培養は、幹細胞に由来するβ細胞（ＳＣ－β細胞）の機能を改善する。
本発明者らは、多能性由来ＳＣ－β細胞を入手し、それらを、それ自体、一般的なヒト臍帯静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）、またはＲ－ＶＥＣ（ＥＴＶ２を一過的に形質導入したＨＵＶＥＣ）とともに、３Ｄマトリックスにおいて培養した。３つすべての群において、ＳＣ－βは、３Ｄマトリックスにおいて分化が継続され、小さなサイズのスフェロイドが形成された（図１１Ａの左パネルにおいて、黄色の矢じり形で示される）。可能性として小さな膵島スフェロイドの融合体から生じる、通常の膵島のサイズ（１００～２００μＭ）を有する細胞クラスターもまた、３つすべての群において観察された（図１１Ａの左パネル）。予測された通り、Ｒ－ＶＥＣと共培養した場合にのみ、膵島様細胞クラスターに、ＥＣが脈管形成した（図１１Ａの右パネルにおけるＥＧＦＰ＋細胞）。２週間の３Ｄ培養後に、ＳＣ－β細胞の機能を、グルコースに刺激されるインスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイにより試験した。それぞれのサンプルを、まず、低グルコース（２ｍＭ）とともにインキュベートして、基礎インスリン分泌を判定し、次いで、高グルコース（１６．７ｍＭ）とともにインキュベートして、刺激されたインスリン分泌を判定した。刺激されたインスリンレベルを基礎インスリンレベルで除算することによって、ＧＳＩＳの倍数を計算した。本発明者らの仮説と一致して、ＳＣ－β／Ｒ－ＶＥＣサンプルは、ＳＣ－βのみまたはＳＣ－β／ＨＵＶＥＣのサンプルよりも有意に高いインスリン分泌倍数を示した（図１１Ｂ）。注目すべきことに、ＳＣ－β／Ｒ－ＶＥＣの基礎インスリンレベルも刺激されたインスリンレベルも、他の２つの群と有意差はなかった。むしろ、ＳＣ－β／Ｒ－ＶＥＣの高い倍数は、基礎インスリンの中等度の減少、および刺激されたインスリンレベルの中等度の増加の結果であり、これは、上述のように、ＳＣ－β細胞の機能的成熟として予測することができる最良のシナリオである。
材料および方法
内皮細胞（ＥＣ）の細胞培養物
廃棄される余りのヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト脂肪組織ＥＣを入手する許可を、Ｗｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ調査審査会を通じて得た。ＥＣを、これまでに説明されているように、コラゲナーゼに基づく消化アプローチを使用して、研究室において単離した（Ｂａｕｄｉｎ，Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２、４８１、（２００７））。細胞を、次いで、完全ＥＣ培地において０．２％ゼラチンでコーティングした組織培養皿において成長させた。培地は、４００ｍｌのＭ１９９、１００ｍｌの熱不活性化ＦＢＳ、７．５ｍｌのＨｅｐｅｓ、５ｍｌの抗生物質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１５０７００６３）、５ｍｌのｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、３５０５００６１）、５ｍｌの脂質混合物（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１９０５０３１）、および内皮細胞成長補助物質のボトルの半分（Ａｌｐｈａ Ａｅｓａｒ、Ｊ６４５１６－ＭＦ）から構成されていた。細胞に、レンチＰＧＫ－ＥＴＶ２または空のレンチベクターを、Ｐ１／Ｐ２において形質導入した。一部の事例では、細胞はまた、ＰＧＫ－ｍＣｈｅｒｒｙまたはＰＧＫ－ＧＦＰレチウイルスを使用することによって標識化した。細胞を、アキュターゼを使用して１：２に分割し、ゼラチン化プレートで継代させた。必要に応じて、２Ｄにおける細胞（誘導ステージ）を、将来的な実験で使用するために凍結させた。すべてのアッセイおよび共培養物のすべての比較は、ＥＴＶ２ありおよびなしで、同じ親内皮細胞株を使用して行った。全体として、１０個を上回る異なる単離物に由来するＨＵＶＥＣを、実験に使用した。管形成アッセイに使用した細胞は、５～１０継代目のものであった。
ヒト脂肪由来ＥＣを、機械的フラグメント化に続いてコラゲナーゼ消化を３０分間行って単離した。プラスチック製の皿に粗細胞集団を播種し、５～７日間拡大させた後、細胞を、次に、分取して、ＶＥカドヘリン+ＣＤ３１+ ＥＣ細胞を精製し、上述のように拡大させた。ヒト脂肪ＥＣを、ＨＵＶＥＣについて記載したのと同じ培地において、培養した。脂肪ＥＣの少なくとも３つの異なる単離物を、本発明者らの実験において使用した。微小管心臓（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ１２２８６）、大動脈（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ１２２７２）、および微小管皮下（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ１２２６５）ＥＣを、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌから入手し、ＥＣ成長培地ＭＶ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ２２０２０）において培養した。
ＥＣのレンチウイルス形質導入
内皮細胞に、ＥＴＶ２レンチ粒子または空のベクターレンチ粒子を形質導入した。ＥＴＶ２ ｃＤＮＡ［ＮＭ＿０１４２０９．３］を、ｐＣＣＬ－ＰＧＫレンチウイルスベクター［Ｇｅｎｅｃｏｐｅｉａ］に導入した。ＣｈＩＰ分析の目的で、トリプルＦｌａｇタグを、アミノ末端においてＥＴＶ２コンストラクトにサブクローニングした（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ １５１、５５９－５７５、（２０１２））。１週間の形質導入の後、ＥＣを、ｍＲＮＡ単離およびｑＰＣＲ分析のために収集した。相対ＥＴＶ２ ＲＮＡ単位は、ＥＴＶ２の発現のｍＲＮＡレベルの、ＧＡＰＤＨの発現のレベルに対する比を計算することによって判定した（プライマーは、表１において見出される）。
Figure 2022539418000002
別途記載されていない限り、４０～１００の範囲内の相対ＥＴＶ２ ＲＮＡ単位を有する細胞を、すべての実験で使用した。３のＭＯＩで、ｍＲＮＡ発現によって計算される６０～８０の相対発現レベルが得られた。ＭＯＩは、Ｐ２４の粒子をＩＦＵに変換し、次いで、細胞数に基づいてＭＯＩに変換することによって、計算した（キット：Ｋａｔａｒａ、６３２２００）。３のＭＯＩはまた、心臓および大動脈のＥＣに適していることがわかった。脂肪および皮膚のＥＣには、そうではなく、６のＭＯＩが必要であった。２μｇ／ｍｌのポリブレンを、形質導入のすべてに利用した。ＥＴＳ１、ｍｙｒＡＫＴ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＧＦＰもまた、ｐＣＣＬ－ＰＧＫレンチウイルスベクターに導入し、３のＭＯＩを、すべての形質導入に使用した。
ＥＴＶ２の誘導性発現のために、ＥＣに、ドキシサイクリンの存在がＥＴＶ２発現を作動させる、ドキシサイクリン誘導性ＥＴＶ２レンチウイルス（ｐＬＶ［Ｅｘｐ］－Ｐｕｒｏ－ＴＲＥ＞ｈＥＴＶ２［ＮＭ＿０１４２０９．３］、ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ ＶＢ１７０５１４－１０６２ｄｆｓ、およびｐＬＶ［Ｅｘｐ］－Ｎｅｏ－ＣＭＶ＞ｔＴＳ／ｒｔＴＡ＿Ｍ２、ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ ＶＢ１６０４１９－１０２０ｍｅｓ）を形質導入した。１週間、ＥＴＶ２のドキシサイクリン誘導の後に、細胞を収集して、相対ＥＴＶ２ ｍＲＮＡ単位を判定した。４０～１００内の相対ＥＴＶ２ ＲＮＡ単位を有する細胞を、すべての実験に使用した。誘導性ＥＴＶ２レンチウイルス粒子およびｔＴＡレンチウイルス粒子には、５０のＭＯＩが必要であった。
レンチウイルス産生
すべてのレンチウイルスプラスミドを、ＤＮＡ Ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、１２１４５）で調製した。ウイルスを、第２または第３世代のパッケージングプラスミドの共形質導入によって、２９３Ｔ細胞にパッケージングした。培養培地を、形質導入の４８時間後に回収し、ウイルス粒子を、レンチ－Ｘ濃縮装置（Ｋａｔａｒａ、６３１２３２）を使用して濃縮し、マグネシウム不含のＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、２１０４０ＣＶ）中に再懸濁させ、小アリコートにおいて－８０℃で保管した。ウイルス力価を、レンチ－Ｘ ｐ２４タイターキット（Ｋａｔａｒａ、６３２２００）で判定した。
管形成アッセイ
２４ウェルプレートを、インキュベーターにおいて３０分間、３００μｌのマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコーティングした。一方で、細胞を、ＥＴＶ２ありまたはなしで、アキュターゼ処理し、計数した。細胞を、次いで、１０％のノックアウト血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１０８２８０２８）およびサイトカイン：１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１０００－１８Ｂ）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－１１）、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＡＦ－１００－１５）、２０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、３００－０７）、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、２００－０６）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させた。ＥＴＶ２ありまたはなしのいずれかで、１００，０００個の細胞を、次いで、１ｍｌの培地中、それぞれのウェルに分散させた。培養物を、残りの実験のために、３７℃で５％酸素のインキュベーターに入れた。培地を、７５０μｌを新しい培地と置き換えることによって、１日おきに交換した。すべての培地交換の間、管を破壊しないように注意した。いくつかの場合について、ラミニン、エンタクチン混合物（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２５９）、およびコラーゲンＩＶ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２４５）（Ｌ．Ｅ．Ｃ）から構成される定義されたマトリックスの混合物を、文脈に示されるように、マトリゲルの代わりに使用した。本発明者らは、これらの定義されたマトリックスを、異なるラミニン、エンタクチン、およびコラーゲンＩＶの比で組み合わせ、最終的に、管形成アッセイに最も有効なこれらのゲル混合物の組み合わせを発見したが、それは、氷上で一緒に混合し、使用前に４℃で一晩保管した、２００μｌの（濃度はそれぞれのロット番号でわずかに変動するが、常に、まずＰＢＳ中で１６．５ｍｇ／ｍｌに希釈した）ラミニン、エンタクチン、および１００μｌのコラーゲンＩＶ（濃度はそれぞれのロット番号でわずかに変動するが、まずＰＢＳ中で０．６ｍｇ／ｍｌに希釈した）から構成されていた。最終濃度のラミニン、エンタクチン混合物（１１ｍｇ／ｍｌ）、およびコラーゲンＩＶ（０．２ｍｇ／ｍｌ）。Ｌ．Ｅ．Ｃの体積は、比／最終濃度が維持される限り、必要に応じて増加させた。血管領域を、ステージ２のリモデリングおよびステージ３の安定化期について、２４時間～１２週間の過程にわたって測定した。平滑筋実験については、２０００個のｍＣｈｅｒｒｙ標識化ヒト大動脈平滑筋細胞を、マトリゲル上のステージ３のＧＦＰ標識化Ｒ－ＶＥＣ血管に添加し、次いで、１週間後にイメージングした。ヒト大動脈平滑筋細胞を、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（Ｃ－１２５３３）から購入した。ＥＶＯＳ倒立顕微鏡を使用して、それぞれの条件および時点について、それぞれのウェルにおけるそれらの異なる／ランダム化された場所の画像を、４倍対物レンズで捕捉した。すべての画像を、次いで、ＩｍａｇｅＪを使用して血管領域を追跡して、ルーメン化された血管領域について分析した。同じ手順を、ＥＴＳ１を形質導入した細胞またはｍｙｒＡＫＴ１を形質導入したＥＣに使用した。
異なる培地配合物における管形成アッセイ
内皮細胞を、上述のように、アキュターゼ処理し、２４ウェルプレートのマトリゲル上に１００，０００個の細胞／ウェルで播種した。ＥＴＶ２ ＥＣと対照ＥＣとの対比で管形成アッセイを評価するために、本発明者らは、３つの異なる培地配合物で、それらが管状ネットワークを形成する能力を比較した。培地配合物１は、ノックアウト血清およびサイトカインを補充したＳｔｅｍＳｐａｎを含有する無血清培地である。培地配合物２は、市販のＥＣ成長培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ２２１１１）である。培地配合物３は、ＥＣを維持および繁殖させるために使用した血清を有する完全ＥＣ培地である。培地は、１日おきに交換した。画像を、異なる時点で取得した。ＩｍａｇｅＪを利用して、血管領域を経時的に測定した。
インビトロでの管の免疫蛍光染色
８～１２週間の時点で、すべての培地をウェルから除去した。管を、ＰＢＳで１回洗浄し、室温で４％ ＰＦＡにおいて３０分間固定した。次いで、それらを、ＰＢＳで再度洗浄し、室温で１時間、ブロッキング緩衝液（０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘを含有する）中に入れた。管を、次いで、４℃で一晩、ラミニン（Ｒ＆Ｄ）、コラーゲンＩＶ（Ａｂｃａｍ）、および／またはポドカリキシン（Ｒ＆Ｄ）に対する抗体で、染色した。翌日、管を、ＰＢＳ中で再度洗浄し、二次抗体とともに３時間インキュベートし、ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ、０．５μｇ／ｍｌ）で対比染色した。すべての画像は、共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ７１０によって得た。増殖研究について、１６時間のＥｄＵパルス（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵキット、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃ１０３３７）を、管形成の３つすべてのステージに使用し、次いで、細胞を上述のように染色した。
電子顕微鏡
組織を、無血清培地またはＰＢＳで洗浄し、次いで、０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２において、２．５％のグルタルアルデヒド、４％のパラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｍａｌｄｅｈｙｄｅ）、および０．０２％のピクリン酸のカルノフスキー変法固定液（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｋａｒｍｏｖｓｋｙ’ｓ ｆｉｘ）で固定した。１％の四酸化オスミウムにおける二次固定の後に、１．５％のフェリシアン化カリウムサンプルを、エタノール勾配系列に通して脱水し、エポンアナログ樹脂に包埋した。Ｌｅｉｃａ Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｓウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）で、Ｄｉａｔｏｍｅダイアモンドナイフ（Ｄｉａｔｏｍｅ、ＵＳＡ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）を使用して、超薄切片を切り出した。切片を、銅グリッドに回収し、鉛でさらに対比させ、１００ｋＶで動作するＪＥＭ １４００電子顕微鏡（ＪＥＯＬ，ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｐｅａｂｏｄｙ、ＭＡ）で確認した。画像を、Ｖｅｌｅｔａ ２Ｋｘ２Ｋデジタルカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ－ＳＩＳ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で記録した。
ＡＦＭ測定
ＡＦＭを使用して、ＨＵＶＥＣ、ならびに成体ヒト脂肪ＥＣの剛性を試験した。剛性測定の場所を決定するために、ＡＦＭのベースとして、倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１）を使用して、細胞の明視野画像を取得した（２０倍０．８ＮＡ対物レンズ）。ＭＦＰ－３Ｄ－ＢＩＯ原子間力顕微鏡（Ａｓｙｌｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、フォースマップを収集した。０．１２Ｎ／ｍの名目上のばね定数を有する５μｍのホウケイ酸ガラスビーズプローブ（Ｎｏｖａｓｃａｎ）を、すべての測定に使用した。３６０μｍ2の領域を被覆する流体条件下で、２０×２０グリッドのフォースカーブ（合計４００個のフォースカーブ）において、６０μｍ×６０μｍの領域を、それぞれのフォースマップでサンプリングした。トリガーポイント（ｔｒｉｇｇｅｄ ｐｏｉｎｔ）は、５μｍ／秒のアプローチ速度で、２ｎＮに設定した。フォース－インデンテーションカーブを、Ａｓｙｌｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｆｔｗａｒｅを利用して球状チップのヘルツモデルに適合させ、サンプルについてポアソン比の値が０．４５であると推測して、ヤング率を判定した。次いで、剛性のフォースマップを、それぞれの測定点の個々の剛性値とともに、さらなる分析のためにＡｓｙｌｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｏｆｔｗａｒｅからエクスポートした。カスタムメイドのＭＡＴＬＡＢ（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）スクリプトを書いて、細胞の剛性に関するデータを正確に分析し、ガラス底の皿から１μｍのデータのみを分析するように（あらゆる基質作用を測定から除去するため）、測定値をフィルタリングした。
マイクロ流体デバイスにおけるＣＴＲＬ－ＥＣとＲ－ＶＥＣ血管とを対比して灌流を調査するためのビーズ流の動画
デバイスを、これまでに説明されているように製造した（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０、６７１２－６７１７、（２０１３））。簡単に述べると、それぞれのデバイスは、シリコンウェハマスターから成形された二層のポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ、Ｓｙｌｇａｒｄ １８４、Ｄｏｗ－Ｃｏｒｎｉｎｇ）から構成されていた。デバイスを、プラズマエッチャ（Ｐｌａｓｍａ Ｅｔｃｈ）でプラズマ処理し、続いて、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍａ、４４０１６７）で一晩処理した。使用の前に、デバイスを、ＭｉｌｉＱ Ｈ2Ｏで一晩洗浄した。２．５ｍｇ／ｍｌのウシフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａ）および３Ｕ／ｍｌのウシトロンビン（Ｓｉｇｍａ）中の３００万個／ｍｌのＥＴＶ２ ＨＵＶＥＣまたは対照ＨＵＶＥＣの混合物を、２つの４００μｍの刺鍼用ニードル（Ｈｗａｔｏ）でデバイスに注入した。細胞およびゲル混合物を重合させた後、刺鍼用ニードルを引き出し、２つの中空チャネルが残った。翌日、ＨＵＶＥＣを、中空チャネルに撒いて、２つの親血管を形成した。デバイスは、全実験の間、プラットフォームロッカーに置いていた（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）。細胞を、内皮細胞成長培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ２２１１１）において培養し、６日目まで毎日新しくした。６日目に、デバイスを、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）に接続し、４μｍの赤色蛍光マイクロスフェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、それぞれのデバイスの親血管のうちの１つに、５０μＬ／分で注入した。デバイスに流れている蛍光ビーズの低速度撮影画を、５０ミリ秒間隔で、Ａｎｄｏｒ Ｚｙｌａ ｓＣＭＯＳ ５．５ＭＰカメラ（Ａｎｄｏｒ）を備えるＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴｉＥ（Ｎｉｋｏｎ）で捕捉した。蛍光ビーズの低速度撮影画像を、一緒にスタッキングし、ＩｍａｇｅＪを使用してＥＣ血管を重ねた。
Ｒａｐ１のプルダウンおよびウエスタンブロット
キットの製造業者のガイドラインに従って、ＨＵＶＥＣまたはＥＴＶ２を形質導入したＨＵＶＥＣ（平面２Ｄ誘導ステージ）のいずれかの１０ｃｍのプレートを、活性Ｒａｐ１アッセイ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、８８１８Ｓ）に使用した。簡単に述べると、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄し、次いで、０．５％のＢＳＡを有するＭ１９９培地において、３時間飢餓させた。細胞を、次いで、キットの溶解緩衝液中に削ぎ落として入れ、１ｇ／ｍｌで再懸濁させた。画分を、入力として保存し、残りの細胞を、Ｒａｐ１－ＧＴＰに使用した。陽性および陰性対照、ならびにビーズのみの対照を、製造業者のガイドラインに従って行った。タンパク質を、５～１５％の勾配のＴｒｉｓ－グリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥで溶解させ、ニトロセルロース膜に半乾燥で移した。膜を、次いで、ＰＢＳＴ中５％ミルクにおいてブロッキングし、提供されるＲａｐ１（１：１０００）抗体、ＧＡＰＤＨおよび／またはＥＴＶ２抗体において４８時間インキュベートした。４８時間後に、膜を、５分間、３回洗浄し、ＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体においてンキュベートした。最後に、二次洗浄後に、膜を、ＥＣＬにブロットし、化学発光シグナルを、デジタルカメラ（Ｋｉｎｄｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で捕捉し、タンパク質バンドの画像を、ＩｍａｇｅＪを使用した濃度測定による定量化のために取得した。
内皮管からのＲＮＡおよびタンパク質の回収
示される時点において、管形成アッセイから得られたＥＣの管を、ＲＮＡシーケンシングおよびウエスタンブロッティングのために回収した。細胞を回収する前に、培地を、ウェルから完全に除去した。２ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｌを、ウェルに添加して、３７℃で４５分間、内皮管を解離させた。解離した細胞を、ＰＢＳ中で１回洗浄し、続いて、ｍＲＮＡまたはタンパク質のいずれかの単離のために回収した。いくつかの場合には、管から解離した内皮細胞は、下流分析のためのｍＲＮＡおよびタンパク質の十分な単離を可能にするために、同じ内皮細胞株の複数のウェルからプールした。
ウエスタン免疫ブロット
細胞を、１倍ＳＤＳローディング緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、５％ベータ－メルカプトエタノール、２％ ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノールブルー、１０％グリセロール）中に溶解させ、続いて、超音波処理した（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ、高設定で２×３０秒間）。タンパク質を、５～１５％の勾配のＴｒｉｓ－グリシンＳＤＳ－ＰＡＧＥで溶解させ、ニトロセルロース膜に半乾燥で移した。以下の一次抗体を、示される希釈で使用した：Ｒａｐ１（ＣＳＴ、番号２３９９、１：１，０００）、ＲＡＳＧＲＰ３（ＣＳＴ、番号３３３４、１：１，０００）、ＧＡＰＤＨ（ＣＳＴ、番号５１７４、１：１０，０００）、ＡＫＴ（ＣＳＴ、３４６８５、１：５，０００）、ｐ－Ｓ４７３－Ａｋｔ（ＣＳＴ、番号４０６０、１：２，０００）、ＥＴＳ１（ＣＳＴ、番号１４０６９、１，０００）、およびＥＴＶ２（Ａｂｃａｍ、ａｂ１８１８４７、１：１，０００）。次いで、ＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体およびＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＲＰＮ２２３２）を使用した。化学発光シグナルを、デジタルカメラ（Ｋｉｎｄｌｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で捕捉し、タンパク質バンドの画像を、ＩｍａｇｅＪを使用した定量化のために取得した。
Ｒａｐ１阻害実験
ＥＴＶ２ありまたはなしでの内皮細胞の管形成アッセイを、上述のように、２４ウェルで設定した。翌日、ＤＭＳＯ中に再懸濁させたＲａｐ１阻害剤（ＧＧＴＩ－２９８、Ｔｏｃｒｉｓ）を、１：１０００希釈で、１０μＭの最終濃度でウェルに添加し、同時に、同量のＤＭＳＯを、対照ウェルに添加した。阻害剤および培地は、４週間、１日おきに交換した。画像を、１週間および４週間の時点で、上述のように取得し、計算した。
ＲＡＳＧＲＰ３ノックダウン実験
ｓｈＥＲＷＯＯＤ－ＵｌｔｒａｍｉＲ ＲＡＳＧＲＰ３ ｓｈＲＮＡレンチウイルスコンストラクト（ｐＺＩＰ－ＴＲＥ３Ｇ中）を、ＴｒａｎｓＯＭＩＣ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。クローン番号および標的とされるＲＡＳＧＲＰ３配列は、以下の通りである：ＵＬＴＲＡ－３２６５８４８、ＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＧＴＣＡＴＣＡＣＡＡＡ（配列番号３９）、ＵＬＴＲＡ－３２６５８５０、ＣＣＴＴＧＧＡＧＴＡＣＡＣＴＴＧＡＡＡＧＡ（配列番号４０）。対照ｓｈＲＮＡ（ＵＬＴＲＡ－ＮＴ、ＡＴＧＣＴＴＴＧＣＡＴＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴ（配列番号４１））は、ハエルシフェラーゼＲＮＡ配列を標的とする。レンチウイルスは、第二世代のパッケージングプラスミドを使用して、上述のように調製した。Ｒ－ＶＥＣ（ステージ１）に、ｓｈＲＮＡウイルスまたは対照ｓｈＲＮＡウイルス（ＭＯＩ＝３）のいずれかを形質導入した。ドキシサイクリンを、リモデリングステージ（ステージ２）の１日目に添加し、ドキシサイクリンを有する培地を、４週間、１日おきに置き換えた。画像を、２週間および４週間の時点で、上記で計算および説明されているように、取得した。ＲＡＳＧＲＰ３ノックダウンを確認するために、ドキシサイクリンを、ステージ１のＲ－ＶＥＣ細胞に、１週間添加し、次いで、細胞を、ウエスタンブロット分析のために回収した。
β１阻害実験
ラミニン、エンタクチン、コラーゲンＩＶ（Ｌ．Ｅ．Ｃ）を含有する事前に混合した定義されたマトリックス３００ｕＬを、２４ウェルプレートのウェルにピペットで取り、３７℃のインキュベーターで３０分間キュアリングした。Ｒ－ＶＥＣを、アキュターゼ処理し、Ｌ．Ｅ．Ｃの上に、ノックアウト血清およびサイトカイン（１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ６）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において１００，０００個の細胞／ウェルの密度で直接的に播種した。即座に、β１インテグリンのアジド不含中和抗体（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢＴ４０９）を、１μｇ／ｍｌの濃度で培養培地に添加した。培養物を、５％酸素で３７℃のインキュベーターにおいて維持し、培地を、２日ごとに新しくした。血管領域を、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。
プロテアソーム阻害実験
Ｒ－ＶＥＣ血管を、上述のように、マトリゲルにおいて調製した。安定化ステージ（４週間）において、Ｒ－ＶＥＣ管を、２０μＭのＭＧ１３２（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）またはＤＭＳＯのいずれかで６時間処理した。培地を除去し、ウェルを、ＰＢＳで１回洗浄した。Ｒ－ＶＥＣ管を、次いで、２ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（Ｓｉｇｍａ）の溶液において、３７℃で４５分間、インキュベートして、管を解離させた。２０μＭのＭＧ１３２（Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）またはＤＭＳＯは、解離期間の間、継続的に提供した。解離された細胞を回収し、ウエスタンブロッティングのために上述のようにさらに処理した。
インビボ実験
空のベクターまたはＥＴＶ２を形質導入し、ＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ（２００万個の細胞／プラグ）で標識した、ＨＵＶＥＣおよび脂肪由来のヒト内皮細胞を、雄性または雌性の８～１２週齢のＳＣＩＤベージュマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）に、皮下注射した。細胞を、まず、ＰＢＳ（５０μｌ）中に再懸濁させ、次いで、３５０μｌの最終体積まで、上述のようにマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５６２３７）またはＬ．Ｅ．Ｃ．混合物と混合した。ゲルには、ＦＧＦ２（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１０００－１８Ｂ）、ＶＥＧＦ－Ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１００－２０）、およびヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ３１４９－１００ＫＵ）も補充されていた。それぞれのマウスに、一方が対照細胞を有し、他方がＥＴＶ２を形質導入した細胞を有する、２つのプラグを受容させた。埋め込み後のマウスに、Ａｌｅｘａ－６４７（１００μｌのＰＢＳ中２５μｇ）にコンジュゲートした抗ヒトＶＥｃａｄ（クローンＢＶ９－ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または７０ｋＤａの蛍光標識化リジン固定化デキストラン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を後眼窩注射し、注射の８分後に殺処理した。全載画像を、底部カバーガラスを含むウェルを使用して、共焦点顕微鏡Ｚｅｉｓｓ ７１０で直接的に取得した。プラグを、４％ ＰＦＡ中に一晩固定し、次いで、エタノールにおいて脱水したか、またはさらなる免疫染色のためにスクロースに入れた。脱水したプラグを、さらなる処理、切片化、およびＨ＆Ｅ、Ｐｉｃｒｏｓｉｒｕｓ、またはマッソン染色のために、Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ Ｉｎｃ．へと送った。切片を、以下に記載されるように、免疫染色のために処理した。ＥＴＳ１、ｍｙｒＡＫＴ１、ｋ－ＲＡＳを形質導入したＨＵＶＥＣを用いた実験については、細胞を、マトリゲルを用いてマウスに注射した。プラグを、１ヶ月の時点で採取し、同じ手順で処理した。
切片の免疫染色
事前に４％ ＰＦＡ中に固定し、スクロース中で処理したＯＣＴ凍結切片（２０μＭ）を、ＰＢＳで１回洗浄した。次いで、スライドを、ブロッキング緩衝液（０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、５％正常ロバ血清、０．１％ ＢＳＡ）中で室温で３０分間インキュベートし、ブロッキング緩衝液中で一次抗体において４℃で一晩インキュベートした。厚い切片（５０μＭ）については、組織を、ブロッキング緩衝液４℃（０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、５％正常ロバ血清、０．１％ ＢＳＡ）において一晩ブロッキングし、次いで、４℃でブロッキング緩衝液（０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、５％正常ロバ血清、０．１％ ＢＳＡ）中で一次抗体において２日間ブロッキングした。翌日、スライドを、室温で１０分間、３回洗浄し、次いで、蛍光コンジュゲート二次抗体（１：１０００）において３時間インキュベートした。最後に、スライドを、１０分間、３回洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色した。切片を、カバーガラスに載置した。Ｚｅｉｓｓ ７１０共焦点またはＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ共焦点スピンディスク顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を利用して、画像を取得した。間質染色については、マウス抗ＰＤＧＦＲβ抗体（１：５００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または抗マウスＳＭＡ（１：２００、Ａｂｃａｍ）を使用した。周皮細胞被覆を、ＩｍａｇｅＪにおける閾値機能を使用して、蛍光標識化ヒト内皮細胞（ＧＦＰ）のシグナルに対するＰＤＧＦＲβ抗体染色のシグナルとして定量化した。マウス内皮細胞を、マウス抗エンドムチン抗体（１：１００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で対比染色した。（いくつかの画像は、それぞれのプラグの異なる層の切片から取得された）。異なるスライドから少なくとも１２枚の写真（４枚／マウス）を、それぞれの条件および時点について、取得した。画像は、ＩｍａｇｅＪを使用して処理し、それぞれの画像視野の領域にわたる血管領域の割合を、ＩｍａｇｅＪにおける閾値特性を使用して、定量化した。
腸組織の採取および脱細胞化
腸を、体重が２５０～３５０ｇの範囲のスプラーグドーリーラットから採取した。簡単に述べると、無菌条件下において、正中線開腹術を行い、腸を露出させた。５ｃｍの長さの腸のセグメントを単離し、単離されたセグメントを灌流する腸管膜動脈および腸管膜静脈を保存した。いずれの血管も、２６Ｇカニューレでカニューレ処置し、腸ルーメンは、１／４インチのバーブコネクタを使用してカニューレ処置した。単離したセグメントを脱細胞化して、蠕動式ポンプ（ｉＰｕｍｐ）を使用して、１ｍｌ／分で、脈管構造およびルーメンを通じた灌流をもたらした。脱細胞化プロセスは、２４時間のｍｉｌｌｉＱ水、４時間のデオキシコール酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、および３時間のＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ）からなっていた。脱細胞化した腸を、使用の前にガンマ線照射によって滅菌した。
バイオリアクター培養物
脱細胞化した腸に、５００万個のＧＦＰ+ＥＴＶ２+ヒト内皮細胞または５００万個のＧＦＰ+対照内皮細胞（ＣＴＲＬ－ＥＣ）のいずれかを撒いた。細胞は、腸間膜動脈および腸間膜静脈を通じて撒いた。撒かれた腸を、滅菌条件下において、カスタムメイドのバイオリアクター内に載置した。２４時間後に、蠕動式ポンプ（ｉＰｕｍｐ）を使用して、１ｍｌ／分で、腸間膜動脈を通じた灌流を開始した。細胞を、最初の５日間は、２０％の熱不活性化ＦＢＳ、１％のＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、１．５％のＨＥＰＥＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ２５－０６０－Ｃｌ）、１％のＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ ３５０５０－０６１）、１％の脂質混合物（Ｇｉｂｃｏ １１９０５－０３１）、１％のヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ｈ３１４９－１００ＫＵ）、および１５ｕｇ／ｍｌの内皮細胞成長補助物質（Ｍｅｒｃｋ ３２４８４５）を補充したＭ１９９／ＥＢＳＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３０２５０３．０１）において成長させ、次いで、細胞を、２日間、１０％のノックアウト血清（Ｔｈｅｒｍｏ １０８２８０２８）、１％のＰｅｎ－Ｓｔｒｅｐ、１％のＧｌｕｔａｔａｍａｘ、１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ １０００ １８Ｂ）、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰＨＧ０３１１）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ １００－１２）、２０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ３００－０７）、および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ２００－０６）を補充したＳｔｅｍ Ｓｐａｎ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において成長させた。７日後に、再内皮化された腸を、滅菌条件下において採取し、５×７ｍｍのセグメントを、異所性埋込みのために切り出した。残りの腸組織を、次いで、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、蛍光顕微鏡によるイメージングのために載置し、調製した。血管の開存性を評価するために、いくつかの再内皮化された腸に、蛍光標識化ＬＤＬを灌流させた。
異所性グラフト埋込み
この研究に使用した動物は、ＵＫ Ａｎｉｍａｌｓ （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ） Ａｃｔ １９８６に従って維持し、実験を行ったが、これらは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｐｒｏｃｅｓｓ（ＰＰＬ ７０／７６２２）によって承認されていた。ＵＣＬ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｒｖｉｃｅｓにおける畜産は、ＵＫ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ ｏｆ Ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎに従っていた。誘導および維持のために、８～１２週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ガンマ（ＮＳＧ）マウスに、２～５％のイソフルラン－酸素ガス混合物で麻酔を行った。０．１ｍｇ／Ｋｇのブプレノルフィンを、鎮痛のために誘導時に投与した。無菌条件下において、正中線開腹術を行った。胃を、切開部から外面化し、大網を、大彎部から引き伸ばした。操作した腸のセグメントを、次いで、大網に包み、８／０のプロレン縫合糸を使用して、大網取り巻きの閉鎖を確実にした。胃および大網を、腹部に戻し入れ、開腹部を６／０のビクリル縫合糸を使用して閉じた。動物は、外科手術後即座に通常の飲食が許容され、術後期間の間、さらなる薬品は投与されなかった。１週間または４週間後に、マウスに、蛍光標識化抗ＶＥｃａｄ（ＢＶ９ Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または蛍光標識化イソレクチンを静脈内注射し、次いで、安楽死させた。グラフトを、大網エンベロープと一緒に取り出し、蛍光顕微鏡によるイメージングのために、４％パラホルムアルデヒド中に固定し、載置し、調製した。
脱細胞化された腸の実験のための脈管パラメーターの分析
インビトロ内皮再脈管形成の定量化を、５×５の１０×視野の領域に行った。画像は、ＩｍａｇｅＪを使用して、閾値を設定し、腸領域に対してＣＤ３１シグナルによって被覆されている領域を定量化することによって、処理した。ＧＦＰおよびＶＥカドヘリンが陽性の細胞のインビボでの定量化を、３×３の２０×視野の領域を評価する共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０）で取得した画像に行った。脈管パラメーターの評価は、Ａｎｇｉｏｔｏｏｌソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を使用して行った。
脱細胞化されたスキャフォールドにおける増殖性細胞およびアポトーシス細胞の定量化
外植した腸グラフトを、４％ ＰＦＡ中に固定し、ＯＣＴに埋込み、切片化した。切片を、切断型カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９６６１Ｓ）およびＫｉ６７（Ａｂｃａｍ、ＡＢ１５５８０）について染色した。１０％ロバ血清を有するＰＢＳ＋／＋からなるブロッキング溶液を、染色の前に１時間、スキャフォールドに添加した。一次抗体を、０．５％のＴｘを添加したブロッキング溶液において、４℃で一晩インキュベートした。切断型カスパーゼ３抗体は、１：１００の濃度で使用し、Ｋｉ６７抗体は、１：２００の濃度で使用した。二次抗体を添加する前に、一次抗体緩衝液を、ＰＢＴ＋／＋で３回洗浄した。ロバ抗マウスまたはウサギ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４７または６４７、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ）に対する二次抗体を、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を有するブロッキング溶液中１：５００の希釈で使用し、室温で１時間インキュベートした。二次抗体緩衝液を、ＰＢＴ＋／＋で３回洗浄し、カバーガラスを適用する前に、ＤＡＰＩを含有する封止剤を添加した。４２５．１０μｍ×４２５．１０μｍのサイズで動物１匹当たり３つの視野を評価する共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ７１０）を用いて画像を取得し、ヒトＶＥカドヘリン（殺処理の前に生体内に注射した）と切断型カスパーゼ３またはＫｉ６７陽性細胞との間の比を計数した。
ＥＴＶ２レポーターマウスからのＥＣの単離
ＥＴＶ２－ビーナスレポーターマウスは、Ｄｒ．Ｖａｌｅｒｉｅ Ｋｏｕｓｋｏｆｆ（Ｗａｒｅｉｎｇ，ｓ．ら、Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２４１、１４５４－１４６４、（２０１２））の提供によるものであった。簡単に述べると、胚を、Ｅ９．５で、ＥＴＶ２－ビーナスレポーターマウスのプールした同腹児から単離した。それぞれの独立した生物学的複製物について、Ｅ９．５のマウスの同腹児５つを一緒にプールした。すべての胚を、３７℃で２０分間アキュターゼ処理し、次いで、ピペットで複数回粉砕した。細胞を、抗マウスＣＤ３１および抗マウスＣＤ４５抗体で後染色し、次いで、ＥＴＶ２Ｖｅｎｕｓ+、ＣＤ３１+、ＣＤ４５-またはＣＤ３１+、ＣＤ４５-のいずれかとして分類した（ＡＲＩＡＩＩ，ＢＤ）。細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ－ＬＳにそのまま分取し、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡ－ｅａｓｙ単離キットを使用して、ＲＮＡをさらに精製した。
異なる培地配合物で３Ｄマトリックスにおいて培養したＨＵＶＥＣの動画設定
対照ＨＵＶＥＣおよびＲ－ＶＥＣを、５００万個の細胞／ｍｌで、Ｌ．Ｅ．Ｃ内に埋め込んだ。ゲルを、３７℃のインキュベーターで１５分間、ガラス底の培養皿で重合させた。続いて、市販の内皮細胞培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、Ｃ－２２１１１）またはノックアウト血清およびサイトカインを補充したＳｔｅｍＳｐａｎを含有する無血清培地のいずれかを、細胞培養物に添加した。また、培地には、Ｔｒｏｌｏｘ、ビタミンＥアナログ（６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸）（Ｓｉｇｍａ）を、１００μＭで補充して、長期のイメージングを可能にした。培養物を、生細胞イメージングのために、温度および気体を制御したチャンバーに載置した。低速度撮影動画を、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｅｖｏｌｖｅ ５１２ ＥＭＣＣＤカメラを備えるＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ共焦点スピンディスク顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で、３日間にわたって、４０分間の間隔で取得した。培地は、２日ごとに新しくした。
マウス小腸オルガノイドの単離および培養
マウス小腸オルガノイドを、これまでに説明されているように単離した（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｋ．Ｐ．ら、Ｂｉｏ Ｐｒｏｔｏｃ ６ （２０１６））。１５ｃｍの近位小腸を、取り出し、低温ＰＢＳを流した。長手方向に開いた後、上清が透明になるまで、それを低温ＰＢＳ中で洗浄した。小腸を、次いで、５ｍｍ片に切り出し、１０ｍｌの低温５ｍＭ ＥＤＴＡ－ＰＢＳに入れ、１０ｍｌのピペットを使用して激しく再懸濁させた。上清を吸引し、１０ｍｌのＥＤＴＡで置き換え、４℃でベンチトップローラー上に１０分間置いた。これを、次いで、２回目は３０分間で繰り返した。上清を吸引し、次いで、１０ｍｌの低温ＰＢＳを、腸に添加し、１０ｍｌのピペットで再懸濁させた。陰窩を含有するこのＰＢＳの１０ｍｌの画分を回収した後、これを繰り返し、それぞれの後続の画分を、回収し、インタクトな腸陰窩の存在および絨毛の欠如について、顕微鏡下で試験した。１０ｍｌの画分を、次いで、１０Ｕ／ｍｌのＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｒｏｃｈｅ、０４７１６７２８００１）を含有する１０ｍｌのＤＭＥＭ基本培地（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、グルタミン、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、１ｍＭのＮ－アセチルシステインを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ Ｆ／１２（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ａ９１６５－ＳＧ））と混合し、１００μｍのフィルターを通してＢＳＡ（１％）をコーティングした管に濾過した。これを、次いで、７０μｍのフィルターを通してＢＳＡ（１％）をコーティングした管に濾過し、１２００ＲＰＭで３分間遠心処理した。上清を吸引し、細胞ペレットを、５％のＦＢＳを含有する５ｍｌの基本培地と混合し、２００ｇで５分間遠心分離した。精製した陰窩を、次いで、基本培地中に再懸濁させ、１：１０で、成長因子低減マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３０）と混合した。４０μｌの再懸濁液を、４８ウェルプレートに播種し、重合させた。オルガノイド成長培地（４０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＰＭＧ８０４３）、１００ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ２５０－３８）、および５００ｎｇ／ｍＬのＲ－スポンジン（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３４７４－ＲＳ－０５０）を含有する基本培地）を、次いで、マトリゲルの上に重ねた。一部の実験において、小腸オルガノイド成長培地は、組換えＲ－スポンジン１を発現するＨＥＫ２９３細胞株（Ｃａｌｖｉｎ Ｋｕｏの好意により提供）から回収した、条件培地由来のＲ－スポンジン１とした。
マウス小腸オルガノイドの維持
オルガノイド上の培地を２日ごとに交換し、それらを５～７日ごとに１：４で継代させた。継代させるために、成長培地を除去し、マトリゲルを、低温ＰＢＳ中に再懸濁させ、１５ｍｌのｆａｌｃｏｎチューブに移した。オルガノイドを、ｐ１０００またはｐ２００ピペットを使用して、５０～１００回ピペッティングして、機械的に解離させた。７ｍｌの低温ＰＢＳをチューブに添加し、２０回ピペッティングして、細胞を完全に洗浄した。細胞を、次いで、１０００ＲＰＭで５分間遠心分離し、上清を吸引した。それらを、次いで、ＧＦＲマトリゲル中に再懸濁させ、上述のように再播種した。凍結させるために、遠心処理した後、細胞を、１０％のＦＢＳおよび１０％のＤＭＳＯを含有する基本培地中に再懸濁させ、液体窒素中で無期限に保管した。
マウス小腸オルガノイドの共培養および染色
マウス小腸オルガノイドを、単独、またはＣＴＲＬ－ＥＣもしくはＲ－ＶＥＣとともに、４～７日間、マトリゲル中５００万個の細胞／ｍｌの最終濃度で共培養した。オルガノイドを、上述のように機械的に解離させ、内皮細胞と混合し、遠心沈殿させ、ＧＦＲマトリゲル中に再懸濁させた。次いで、混合物を、８ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩ、１５４５３４）において３０μｌの液滴中に、またはＮｕｎｃ ＩＶＦ ４ウェル皿（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４４４４４）において５０μｌの液滴中に、分散させた。培地は、上述のマウス小腸培地から構成されていた（ＥＧＦ ４０ｎｇ／ｍｌ、Ｎｏｇｇｉｎ ５０ｎｇ／ｍｌ、Ｒ－スポンジン１条件培地（１０％）＋ＦＧＦ－２（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１０００－１８Ｂ）、およびヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ３１４９－１００ＫＵ）。血管領域を、ＩｍａｇｅＪにおいて閾値機能によって定量化し、マウス小腸オルガノイドと接触している個々の出芽を、計数し、血管出芽／オルガノイドとして報告した。オルガノイドを、これまでに説明されているように染色した（Ｏ’Ｒｏｕｒｋｅ，Ｋ．Ｐ．ら、Ｂｉｏ Ｐｒｏｔｏｃ ６ （２０１６））。示される場合、１０μＭのＥｄＵを、固定の前に６時間、成長培地に添加した。成長培地を除去し、細胞を、４％ ＰＦＡ中に、２０分間固定した。それらを、次いで、０．５％のＴｒｉｔｏｎ中で２０分間透過処理し、ＩＦ緩衝液（ＰＢＳ、０．２％のＴｒｉｔｏｎ、０．０５％のＴｗｅｅｎ、１％のＢＳＡ）中で１時間ブロッキングしたか、またはＣｌｉｃｋ－ｉＴ Ｅｄｕ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃ１０３４０）とともに提供されている指示書に従って行われるＥｄｕ染色のために即座に処理した。免疫蛍光染色のために、細胞を、ＩＦ緩衝液中の一次抗体：抗ＫＲＴ２０（１：２００、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、番号１３０６３）において一晩インキュベートした。それらを、次いで、ＰＢＳ ０．１％ Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。二次抗体（１：１０００、上記と同じ試薬）を、３時間インキュベートした。溶液を除去し、ＰＢＳ中のＤＡＰＩを５分間添加し、ＰＢＳ ０．１％ Ｔｗｅｅｎで２回洗浄した。次いで、チャンバーを除去し、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ褪色防止培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｐ３６９３０）を使用して、カバーガラスを載せた。
ヒト正常結腸および腫瘍オルガノイドの単離および培養
ヒト結腸陰窩および腺腫の単離；オルガノイド培養物の培養および維持を、これまでに説明されているように行った（Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，ｓ．＆Ｓａｔｏ，Ｔ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １６１２、９７－１０５、（２０１７））。正常組織および腺腫組織を、Ｗｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄによって承認されているプロトコールに従って、結腸切除片から採取した。簡単に述べると、ヒト結腸粘膜サンプルを、外科手術により切除された標本をトリミングすることによって得た。下にある筋肉層を、立体顕微鏡下において微細な鋏を使用して除去して粘膜を残し、これを、ペトリ皿上で５ｍｍ片に切り出し、１０ｍｌの低温ＤＰＢＳを含有する１５ｍｌの遠心チューブに入れ、３回洗浄した。２．５ｍＭのＥＤＴＡを補充した１０ｍｌの低温ＤＰＢＳを、チューブに添加し、室温で１時間、穏やかに振盪させながらインキュベートした。単離した陰窩を、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３０）と混合し、２００μｌのピペットを使用して、６ウェルプレートのそれぞれのウェルの中央に分注し、３７℃で１０分間置いて、マトリゲルを固化させた。
また、正常結腸オルガノイドは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＭｉｃｈｉｇａｎにおけるＪａｓｏｎ Ｓｐｅｎｃｅの研究室から入手し、Ｔｓａｉら、２０１８（Ｔｓａｉ，Ｙ．Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ Ｈｅｐａｔｏｌ ６、２１８－２２２、（２０１８））（特に８７行目および８９行目）においてこれまでに説明されている。正常結腸オルガノイドを、機械的解離（ピペッティング）によって７日ごとに１：３で継代させ、１２ウェルの低接着プレートにおいて３０μｌのマトリゲル液滴中で成長させた。正常結腸オルガノイドを、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、４ｍＭ ｇｌｕｔａｍａｘの１％のＨＥＰＥＳ、ｐｒｉｍｏｃｉｎ（１００μｇ／ｍｌ）、５０％ Ｌ－ＷＲＮ（Ｗｎｔ３ａ、Ｒ－スポンジン、Ｎｏｇｇｉｎ）条件培地、Ｎ２、ビタミンＡなしのＢ２７、Ｎ－アセチルシステイン（１ｍＭ）、ヒト組換えＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）、Ａ－８３－０１（５００ｎＭ）、ＳＢ２０２１９０（１０μＭ）から構成される培地において培養した。Ｌ－ＷＲＮ条件培地を、Ｌ－ＷＲＮ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２７６）を使用することによって生成した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＭｉｃｈｉｇａｎにおけるＪａｓｏｎ Ｓｐｅｎｃｅの研究室からのプロトコールに従って、本発明者らは、Ｌ－ＷＲＮ条件培地を４日間収集した。条件培地をプールし、滅菌濾過し、使用するまでアリコートで凍結させた。
ヒト腫瘍オルガノイドを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ Ｗｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅを通じて入手した。腫瘍結腸オルガノイドを、１０μＭのＹ２７６３２（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を補充したＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）中で消化させることによって、７日ごとに１：３に分割した。結腸腫瘍オルガノイドを、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、１％ ｇｌｕｔａｍａｘ、１％ ＨＥＰＥＳ、Ｒ－スポンジン１条件培地（５％）、Ｎ－アセチルシステイン（１．２５ｍＭ）、ヒト組換えＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ヒト組換えＦＧＦ－１０（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ－２（１ｎｇ／ｍｌ）、Ｙ－２７６３２（１０μＭ）、Ａ－８３－０１（５００ｎＭ）、ＳＢ２０２１９０（１０μＭ）、ニコチンアミド（１０ｍＭ）、ＰＧＥ２（１μＭ）、ＮＲＧ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ｈｕｍａｎ Ｇａｓｔｒｉｎ１（１０ｎＭ）から構成される培地において維持し、ＧＦＲマトリゲルにおいて繁殖させた。
正常および腫瘍ヒトオルガノイドの内皮細胞との共培養
Ｒ－ＶＥＣまたは対照ＣＴＲＬ－ＥＣ（５００万個の細胞／ｍｌの最終濃度）を、正常結腸または患者由来の腫瘍オルガノイドと混合し、遠心沈殿させ、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３５４２３０）またはＬ．Ｅ．Ｃ混合物中に上述のように再懸濁させた。細胞を、次いで、８ウェルのチャンバースライド（Ｌａｂ－Ｔｅｋ ＩＩ、１５４５３４）またはＮｕｎｃ ＩＶＦ ４ウェル皿（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４４４４４）において、３０～７０μｌのマトリゲル（またはＬ．Ｅ．Ｃ）の液滴中に分散させ、ＦＧＦ－２（１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１０００－１８Ｂ）およびヘパリン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ Ｈ３１４９－１００ＫＵ）を添加したそれぞれのオルガノイド培地において培養した。培地を、１日おきに交換した。１６時間のＥｄＵパルスを、正常結腸オルガノイドに使用し、４．５時間のＥｄＵパルスを、すべての腫瘍オルガノイド共培養実験に使用した（Ｃｌｉｃｋ－ｉＴ ＥｄＵキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃ１０３４０）。共培養物は、２０％酸素で３７℃のインキュベーターにおいて維持した。トリプルネガティブ乳がんオルガノイドもまた、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｔ Ｗｅｉｌｌ Ｃｏｒｎｅｌｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅから入手し、維持および共培養のための培地は、上述の結腸腫瘍オルガノイドのものと同じであった（ガストリンの存在を除く）。正常および腫瘍結腸オルガノイドを、マウス小腸オルガノイド共培養物と同様に染色した。ヒトＥｐＣＡＭ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＶＥｃａｄ（Ｒ＆Ｄ）に対する抗体を、一晩インキュベートし、続いて二次抗体染色を行った。ＭＵＣ２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）での染色は、４８時間の一次抗体インキュベーションを可能にするように改変し、それぞれの洗浄は、バックグラウンドの可能性を排除するために、それぞれ３×２０分間に延長した。
単一細胞シーケンシングのために、共培養物を７日間維持した。単一細胞シーケンシングのために共培養物中の細胞を回収するために、培地を、培養物から除去し、オルガノイド－内皮細胞液滴を、２ｍｇ／ｍｌのディスパーゼ（Ｓｉｇｍａ）において、３７℃で１時間、振盪させながらインキュベートした。次いで、細胞を、遠心沈殿させ、アキュターゼにおいて３７℃でさらに１５分間インキュベートした。この時点で、内皮細胞は、ほとんどが共培養物から放出されており、４０μｍのメッシュを通した濾過によって回収された。未消化細胞の残り（主としてオルガノイドクラスター）は、細胞が単一細胞として完全に分離されるまで、３７℃でさらに３０分間、ＴｒｙｐｌＥとともにインキュベートすることによって、単一細胞へとさらに解離させた。この２段階消化により、内皮細胞およびオルガノイドの両方の生存性の増加および効率的な解離が可能となった。第１および第２の両方の画分を、単一細胞分析のためにさらに処理した。単一細胞を回収し、３５μｍのナイロン製メッシュを通して濾過し、単一細胞シーケンシングのために処理した。
ｑＰＣＲ実験のために、共培養物を、マトリゲルにおいて７日間維持した。共培養物中の細胞を回収し、オルガノイドを解離するために、本発明者らは、マトリゲル液滴をＴｒｙｐＬＥ－Ｅｘｐｒｅｓｓ酵素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３ｍｌ／マトリゲル液滴５０μｌ）とともに３７℃で４５分間、激しく振盪させながらインキュベートした。次いで、解離した細胞を、オルガノイド培養培地で１回、およびＭＡＣｓ緩衝液で１回の２回洗浄した。解離した細胞を、１００μＬのＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、抗ヒトＣＤ３１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１０μｇ／ｍｌ）を使用して、氷上で３０分間、内皮細胞について染色した。細胞懸濁液を、ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）を有するＭＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させた。続いて、細胞を、ＤＡＰＩ-ＣＤ３１-集団について分取し、回収した。Ａｃｃｕｒｕｓ ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＲＮＡ単離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、回収した細胞からＲＮＡを単離した。
インビボ実験のために、ＴｒｙｐｌＥで１０分間単一細胞に解離した５００，０００個のＧＦＰ標識化腫瘍結腸オルガノイドを、２００万個のｍＣｈｅｒｒｙ標識化ＣＴＲＬ－ＥＣまたはＲ－ＶＥＣと混合し、ＮＳＧマウスの皮下に埋め込んだ。腫瘍を、埋込みの５ヶ月後に取り出した。
連続共焦点動画において文書化した患者由来の正常および腫瘍結腸オルガノイドと相互作用する血管の定量化
腫瘍および正常結腸オルガノイドを、製造業者による取扱説明書に従ってＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３４５６５）で染色した。腫瘍および正常結腸オルガノイドを、５００万個の細胞／ｍｌのＣＴＲＬ－ＥＣまたはＲ－ＶＥＣのいずれかを有するマトリゲルまたはＬ．Ｅ．Ｃ内に埋め込んだ。ゲルおよび細胞の混合物を、ガラス底の皿にピペットで取り、３７℃のインキュベーター内で１５分間重合させた。次いで、培養物に、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および１００μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ Ｈ３１４９－１００ＫＵ）を補充したオルガノイド培地を供給した。長期イメージングを可能にするために、抗酸化剤として６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチルクロマン－２－カルボン酸（Ｓｉｇｍａ）もまた、１００μＭで培地に添加した。即座に、培養物を、温度および気体を制御したチャンバーに載置した。低速度撮影動画を、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ Ｅｖｏｌｖｅ ５１２ ＥＭＣＣＤカメラを備えるＺｅｉｓｓ Ｃｅｌｌ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ共焦点スピンディスク顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）で、３～４日間にわたって、４０分間の間隔で取得した。培地は、２日ごとに新しくした。
正常および腫瘍結腸オルガノイドと相互作用する血管を定量化するために、複数の時点で得られた低速度撮影動画のＺ－投影画像を、ＩｍａｇｅＪを使用して得た。カスタムＭＡＴＬＡＢコードを、すべての個々のオルガノイドと相互作用する血管領域を定量化するように記述した。簡単に述べると、このコードを使用して、内皮細胞がオルガノイドを取り巻きそれをタッピングしているすべての血管の周囲を手作業で追跡した。手作業で追跡した相互作用する血管の領域を定量化し、報告した。
ムチン２（ＭＵＣ２）のシグナル強度の定量化
ヒト正常結腸オルガノイドを、上述のように内皮細胞との共培養物において設定した。８日目に、培養物を固定し、ムチン２およびＥｐＣＡＭでの染色のために処理した。染色手順が完了した後、本発明者らは、７１０ Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡を使用して、１０倍乾燥対物レンズ下においてすべての培養物のウェル全体をイメージングした。異なる培養条件間の正確な比較を確実にするために、本発明者らは、すべてのサンプルのイメージングに同じ顕微鏡設定：同じ対物レンズ、同じレーザー強度、およびそれぞれのｚ－スタックに同じ数の切片を使用した。ｚ－スタック画像の最大投影を、すべての条件についてＩｍａｇｅＪで行った。最大投影画像から、いくつかのオルガノイドを、定量のためにそれぞれの条件について、無作為に選択した。カスタムＭＡＴＬＡＢコードを利用して、すべての条件にわたってすべてのオルガノイドを、同じレベルのムチン２の閾値処理に供して、バックグラウンドを除去した。ＥｐＣＡＭおよびムチン２の統合画像を使用して、次いで、個々のオルガノイドの領域を追跡して、二値画像を生成した。オルガノイド領域の二値画像に、ムチン２のシグナルを重ね、それぞれのオルガノイド内のムチン２のシグナルを単離した。次いで、本発明者らは、それぞれの個々のオルガノイドの領域当たりのムチン２の総シグナル強度を計算した。異なる条件にまたがった比較を可能にするために、ムチン２のシグナル強度を、腸オルガノイド単独での培養物から定量されたオルガノイド領域当たりのムチン２のシグナル強度の平均値に対して正規化した。
内皮細胞との静置共培養における初代ヒト膵島：
初代ヒト膵島を、Ｐｒｏｄｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入した。２５個のヒト膵島を、単独で培養したか、ＣＴＲＬ－ＥＣと共培養したか、またはＲ－ＶＥＣと共培養した。ＣＴＲＬ－ＥＣおよびＲ－ＶＥＣを、５００万個の細胞／ｍｌで使用した。ヒト膵島を、内皮細胞ありおよびなしで、４０μＬのマトリゲルと混合し、Ｎｕｎｃ ＩＶＦ ４ウェル皿（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号１４４４４４）のウェルに播種した。培地は、グルコース不含ＲＰＭＩ １６４０から構成され、０．１％のヒト血清アルブミン、１０μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、５０μＭのエタノールアミン、５０μＭのホスホエタノールアミン、６．７μｇ／ｍｌの亜セレン酸ナトリウム、１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ、１００μｇ／ｍｌのヘパリン、および５．５ｍＭのグルコースが補充されていた。２週間の共培養の後、サンプルを、グルコースに刺激されるインスリン分泌（ＧＳＩＳ）のために調製した。サンプルは、２ｍＭのグルコースを含有するクレブス－リンゲル重炭酸塩ＨＥＰＥＳ（ＫＲＢＨ）緩衝液中で２時間飢餓させ、続いて、基礎インスリン分泌として２ｍＭのグルコース中で４５分間、および刺激されたインスリン分泌として１６．７ｍＭのグルコース中で４５分間置いた。基礎および刺激期の最後に、インスリン濃度を、ＳＴＥＬＬＵＸ ＣｈｅｍｉヒトインスリンＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ）を使用して判定した。それぞれの群について、１１個の複製物があり、膵島は、４人の異なるドナーに由来していた。他の実験において、２００個のヒト膵島を、単独で培養したか、または５０μｌのマトリゲル液滴（ドーム）において２５０，０００個のＣＴＲＬ－ＥＣもしくは２５０，０００個のＲ－ＶＥＣと混合した。共培養物中のヒト膵島外植片を、染色し、１週間および２週間の時点でイメージングした。ＥｐＣＡＭおよびＶＥｃａｄ抗体を使用して、共培養物を、マウス／ヒト腸および結腸オルガノイドについて、上述のように後染色した。
ヒト膵島と相互作用する血管を定量化するために、共培養物を、１０倍対物レンズを使用してイメージングして、明視野において、ＧＦＰ標識化血管およびヒト膵島の両方を捕捉した。カスタムＭＡＴＬＡＢコードを使用して、ヒト膵島を包囲し、それを取り巻いているＧＦＰ標識化血管の領域を、ＣＴＲＬ－ＥＣおよびＲ－ＶＥＣとの両方の共培養物について追跡した。
マイクロ流体デバイスにおけるオルガノイドおよびヒト膵島の共培養。
複数のヒト正常結腸オルガノイドおよびヒト膵島をマイクロ流体デバイスにおける培養物に組み込むために、本発明者らは、フォトリソグラフィーを使用して、より大きな規模のデバイスを製造した。デバイスの寸法を、拡大し、長くした。２つの流体チャネル間の距離、またはデバイスの幅は、３ｍｍである（１ｍｍから増加）。デバイスの長さまたは流体チャネルの長さは、５ｍｍである。デバイスの高さは、高さ１ｍｍである。デバイスを、ＰＤＭＳ（Ｄｏｗ－Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用してシリコンウエハからキャストし、カバーガラスに接着した。全体として、細胞培養チャンバーは、１５マイクロリットルの大容積の５ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍのＰＤＭＳガスケットに封入されている。使用の前に、デバイスに、プラズマエッチングを行い、即座に、（３－グリシジルオキシプロピル）トリメトキシシラン（Ｓｉｇｍａ）で一晩処理した。翌日、それらを水中に沈めて、使用の前に、一晩洗浄した。ヒト正常結腸オルガノイドおよびヒト膵島用いたすべての実験は、５ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍの寸法を有するデバイスにおいて行った。すべてのデバイスは、２０％酸素で３７℃のインキュベーターにおいて保持した。
マイクロ流体デバイスにおけるオルガノイドの共培養のために、ヒト正常結腸オルガノイド（約４０個）を、５ｍｇ／ｍｌのウシフィブリノーゲンおよび３Ｕ／ｍｌのウシトロンビンにおいて、合計３０μＬまで、Ｒ－ＶＥＣと混合した。Ｒ－ＶＥＣは、３００万個の細胞／ｍｌで使用した。また、直径４００μｍの２つの刺鍼用ニードルを、細胞培養チャンバー内に挿入した。ゲルおよび細胞の混合物を、次いで、細胞培養チャンバーに注入した。フィブリンゲルの重合後に、ニードルを除去し、デバイスに２つの中空の流体チャネルを残した。１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ－２、１００μｇ／ｍｌのヘパリン、および５０００Ｕ／ｍｌのアプロチニン（Ｓｉｇｍａ）を補充した２００μＬのヒト正常結腸オルガノイド培地を、２つの流体チャネルのそれぞれに添加し、毎日新しくした。デバイスは、全実験の間、プラットフォームロッカー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ２０００）に置いていた。
ヒト膵島培養実験のために、デバイスを、ヒト正常結腸オルガノイド実験を設定したのと同様に設定した。およそ７５個のヒト膵島を、単独で、またはＣＴＲＬ－ＥＣもしくはＲ－ＶＥＣ（４００万個の細胞／ｍｌ）の細胞と、５ｍｇ／ｍｌのウシフィブリノーゲンおよび３Ｕ／ｍｌのウシトロンビンにおいて、３０μＬの総体積まで混合し、直径４００μｍの２つの刺鍼用ニードルを用いてデバイスに注入した。ニードルを、フィブリンゲル重合後に除去し、ヒト膵島共培養培地の培地２００μＬ（上述）を、流体チャネルのそれぞれに添加した。デバイスは、全実験の間、プラットフォームロッカー（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ２０００）に置いていた。
デバイスにおけるヒト膵島のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイ。
ヒト膵島を、上述のように、単独、またはＣＴＲＬ－ＥＣもしくはＲ－ＶＥＣとの共培養物のいずれかで、デバイスに入れた。死体の膵島（Ｐｒｏｄｏ Ｌａｂｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから）を、３人の別個のドナーから得、合計で、ＥＣなしについてはｎ＝４つのデバイス、ＣＴＲＬ－ＥＣについてはｎ＝４つのデバイス、Ｒ－ＶＥＣについてはｎ＝８つのデバイスであった。培養物中で４日間の後に、半動的ＧＳＩＳアッセイを、デバイス内の膵島共培養物に行った。まず、すべてのデバイスにおいて、培地を除去した。デバイスを、次いで、インキュベーターにおいて２時間、２ｍＭのグルコースで飢餓させた。飢餓の終了時に、２ｍＭのグルコースＫＲＢＨ緩衝液３００μＬを、デバイスの注入口に添加し、デバイスを、３７℃で３分間インキュベートした。重力による駆動で、ＫＲＢＨ緩衝液は、インキュベーション中に、デバイスの反対側（排出口）へと流れた。３分間のインキュベーションの後、排出口から出た流体を、ＥＬＩＳＡによるインスリン測定のために回収した。また、注入口には、いずれの残留流体もないようにした。次いで、さらに３００μＬのＫＲＢＨ緩衝液を、注入口に添加し、排出口を空にした。Ｒ－ＶＥＣ共培養デバイスでは、高い灌流速度に起因して、３０～１５０μＬの流体が、排出口で回収された。膵島単独およびＣＴＲＬ－ＥＣ共培養のデバイスでは、少量の流体（１０μＬ未満）しか、排出口において見出されなかった。サンプル回収を可能にするために、本発明者らは、膵島単独およびＣＴＲＬ－ＥＣ共培養のデバイスの排出口を、１５０μＬのＫＲＢＨ緩衝液ですすぎ、ＥＬＩＳＡによるインスリン測定のためにすべての排出口の液体を回収した。そのようなサンプル回収を、２ｍＭグルコースＫＲＢＨ緩衝液を使用して、合計８回繰り返し、１６．７ｍＭのグルコースＫＲＢＨ緩衝液を使用してさらに８回繰り返した。最後に、一連の半動的ＧＳＩＳサンプルが得られた。本発明者らは、２ｍＭおよび１６．７ｍＭのグルコースの両方の期において、３回目（ｔ＝９分）および８回目（ｔ＝２４分）の回収時に、デバイスの排出口におけるインスリン濃度を調べた。デバイス当たりのインスリンレベルは、次のように計算した：デバイス当たりのインスリン＝インスリン濃度×回収した体積。基礎インスリンレベルは、２ｍＭグルコースでの３回目および８回目の回収の平均として判定した。インスリン濃度は、ＳＴＥＬＬＵＸ ＣｈｅｍｉヒトインスリンＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ）を使用して判定した。
デバイスにおける実験のための染色プロトコール。
デバイスにおける内皮細胞の染色のために、実験を終了する直前に、本発明者らは、デバイスにおける両方の流体チャネル内のすべての培地を吸引した。１０μｇ／ｍｌでＡｌｅｘａ ６４７とコンジュゲートしたＶＥカドヘリン抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）２００μＬを、流体チャネルのうちの一方に入れ、インキュベーターにおいて１５～２０分間、一方の流体チャネルから他方の流体チャネルへ、ルーメン化Ｒ－ＶＥＣ血管を通じてゆっくりと灌流させた。次いで、デバイスを、基本培地で３回洗浄し、ＰＦＡで３０～４５分間固定した。
共培養実験を、ヒト正常結腸オルガノイドおよびヒト膵島を用いて設定した場合、同じプロトコールを利用して、Ｒ－ＶＥＣルーメン化血管についてＶＥ－カドヘリンコンジュゲート抗体で染色した。固定後に、デバイスに、０．１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘを４５分間透過させ、ＥｐＣＡＭでヒト結腸オルガノイドまたはヒト膵島のいずれかについてさらに染色した。ＥｐＣＡＭ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）について染色するために、コンジュゲート抗体を、１０μｇ／ｍｌで４８時間、４℃でロッカー上において、両方の流体チャネルに添加した。デバイスを、１倍ＰＢＳで３回洗浄し、続いて、４℃でロッカー上において、２４時間１倍ＰＢＳ中に沈めて洗浄した。類似の染色手順を、インスリンおよびＶＥｃａｄ後染色に使用したが、透過処理を一晩行い、続いて、上述のように一次抗体染色を行い、４℃でロッカー上において２４時間二次染色したことを除く。デバイスは、さらに２４時間、４℃でロッカー上において１倍ＰＢＳでの洗浄を受け、次いで、画像を、Ｚｅｉｓｓ ７１０共焦点顕微鏡を使用してイメージングした。
大規模デバイス（寸法：５ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ）におけるビーズおよび全血灌流の灌流動画。
デバイスにおけるヒト正常結腸オルガノイドを用いたビーズ動画のために、ヒト正常オルガノイドを有するデバイス（５ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍの寸法）を、上述のように設定した。４日後に、デバイスを、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡に置いた。互いに対角線上にある２つの流体リザーバが灌流実験の間開放されたままとなるように、真空グリースを使用して、本発明者らは、両方の流体チャネルの一方の末端を封止した。４μｍの蛍光マイクロビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆ８８５８）を、シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて、２０μＬ／分で流体チャネルのうちの一方の開放した入り口に灌流させた。４μｍの蛍光マイクロビーズは、流体チャネルに入り、ルーメン化されたＲ－ＶＥＣ血管を通って移動し、ビーズを入れたリザーバの対角線上にある他方のリザーバへと排出された。
血液灌流動画のために、デバイス（５ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍの寸法）を、３００万個／ｍｌのＲ－ＶＥＣ細胞で調製した。４００μＬの培地を、毎日新しくした（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）。７日目に、血液を、ヘパリン化チューブに、ＩＲＢプロトコールに従ってドナーから回収した。デバイスをヒト正常結腸オルガノイドを用いたビーズ動画のために調製したのと同様に、本発明者らは、両方の流体チャネルの一方の末端を封止して、互いに対角線上にある２つのリザーバが灌流実験の間開放されたままとなるようした。ヘパリン化ヒト全末梢血を、同意を得た健常対象から、採血により得た。即座に、２００マイクロリットルの全血を、開放されているリザーバの流体チャネルの一方にピペットで入れ、血液細胞は、インタクトな血漿とともに流体チャネルに入り、ルーメン化されたＲ－ＶＥＣ血管を通って移動し、血液を入れたリザーバの対角線上にあるリザーバへと排出された。ヒト膵島と共培養したＲ－ＶＥＣを有するデバイスにおいて血液を灌流させる実験において、本発明者らは、血液細胞を、Ｐｋｈ２６ Ｒｅｄ蛍光色素（Ｓｉｇｍａ、ＭＭＩＤＩ２６－１ＫＴ）を製造業者のプロトコールに従って用いて、氷上で５分間、染色した。蛍光標識化した血液細胞を、ピペットでリザーバに入れ、ルーメン化されたＲ－ＶＥＣ血管を通って移動し、対角線上のリザーバに排出される。他のデバイス（ＣＴＲＬ－ＥＣ＋ヒト膵島、およびヒト膵島単独）では、蛍光標識化した血液細胞は、一方の流体チャネルから他方の流体チャネルへと移動することができなかった。画像は、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｆｌａｓｈ ４．０ ｖ２、ｓＣＭＯＳカメラおよび１０倍／０．４５対物レンズを備えるＡｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１で取得した。
ＲＮＡライブラリーの調製および配列データ処理
ＱｉａｇｅｎのＲｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ＫｉｔまたはＡｃｃｕｒｕｓ ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＲＮＡ単離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＲＮＡを単離し、精製した。ＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ２１００ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して検証した。ＲＮＡライブラリー調製物は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ ｖ２（非標準化およびポリ－Ａ選択）を使用して調製および多重化し、１０ｎＭのｃＤＮＡを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ ２５００またはＨｉＳｅｑ ４０００による高スループットシーケンシングの入力として使用して、５１ｂｐの対合末端リードを得た。シーケンシングリードを、脱多重化（ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ）し、ＳＴＡＲ ｖ２．６．０ｃ（Ｄｏｂｉｎ，ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２９、１５－２１、（２０１３））をデフォルトのパラメーターで用いて適切なＮＣＢＩ参照ゲノム（ヒトサンプルについてはＧＲＣｈ３８．ｐ１２およびマウスサンプルについてはＧＲＣｍ３８．ｐ６）にマッピングした。遺伝子ごとのフラグメントを、Ｇｅｎｃｏｄｅ包括的遺伝子アノテーション（ヒトサンプルについてはリリース２８、およびマウスサンプルについてはＭ１７）と比べて、ｆｅａｔｕｒｅ Ｃｏｕｎｔｓ ｖ１．６．２（Ｌｉａｏ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ３０、９２３－９３０、（２０１４））を用いて計数した。
トランスクリプトームデータの分析
差示的遺伝子発現分析を、ＤＥＳｅｑ２ ｖ１．１８．１（Ｌｏｖｅ，Ｍ．Ｉ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １５、５５０、（２０１４））を使用して行い、ＦＤＲ調整後Ｐ値＜０．０５のみを、統計学的に有意であると考えた。差示的遺伝子発現分析の前に、最も少ない複製物数の条件で、１００万当たりの計数（ＣＰＭ）が１を上回る遺伝子のみを保持することによって、低発現の遺伝子をフィルタリングした。底２で対数変換したＣＰＭ値を、ヒートマッププロットに使用し、これを、中央揃えで行ごとにスケーリングした。視覚化の前に、組織特異的作用を、ｌｉｍｍａ ｖ３．３４．９（Ｒｉｔｃｈｉｅ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４３、ｅ４７、（２０１５））からのｒｅｍｏｖｅＢａｔｃｈＥｆｆｅｃｔ関数を使用して除去した。遺伝子オントロジー分析を、ＤＡＶＩＤ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｖ ６．８（Ｈｕａｎｇ ｄａ，Ｗ．ら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ４、４４－５７、（２００９））を使用して行った。
ＣｈＩＰおよび抗体
Ｒ－ＶＥＣまたはＣＴＲＬ－ＥＣにおけるＥＴＶ２、Ｋ４ｍｅ３、およびＫ２７ａｃ改変のゲノム全体での局在化を特定するために、ＣｈＩＰアッセイを、実験当たりおよそ１×１０7個の細胞を用いて行った。トリプルｆｌａｇ化ＥＴＶ２レンチウイルス（上述の通り）を導入した細胞を、ＥＴＶ２ ＣｈＩＰに使用した。簡単に述べると、細胞を、３７℃で１０分間、１％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で架橋させ、次いで、０．１２５Ｍのグリシンによって反応停止させた。クロマチンを、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）を使用してせん断して、２００～４００ｂｐのフラグメントを作製し、７５μｌのＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に結合させた２～５μｇの抗体またはマウスＩｇＧによって免疫沈降させ、４℃で一晩インキュベートした。磁気ビーズを洗浄し、クロマチンを溶出させた。ＣｈＩＰ ＤＮＡを、逆架橋させ、カラム精製した。すべてのＣｈＩＰ抗体は、以下の表において特定されている。
ＣｈＩＰ－ｑＰＣＲ
プライマーは、表１に列挙されている。ＣｈＩＰ実験の前（入力）または後に回収したＤＮＡサンプルを、Ｈ2Ｏ中に１：１００で希釈し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓシステムにおいて、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲマスターミックスを用いたｑＰＣＲ分析に適用した。シグナルを、遺伝子間領域と比べた濃縮倍数として計算した。
ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーの構築およびシーケンシング
ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーを、ＥＴＶ２、Ｋ４ｍｅ３、およびＫ２７ａｃ改変ＣｈＩＰからのＤＮＡについては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ ＣｈＩＰ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、ならびに小規模ＣｈＩＰアッセイから得られたＫ４ｍｅ３、Ｋ２７ａｃ、およびＫ２７ｍｅ３改変からのＤＮＡについては、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔを用いて、調製した。ＣｈＩＰ－ｓｅｑライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ４０００システムでシーケンシングした。
ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータの処理および分析
ＣｈＩＰ－ｓｅｑリードを、ＢＷＡアライメントソフトウェア（バージョン０．５．９）を使用して、参照ヒトゲノム（ｈｇ１９、ゲノム参照コンソーシアムＧＲＣｈ３７）にアライメントした（Ｌｉ，Ｈ．＆Ｄｕｒｂｉｎ，ｒ．、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５、１７５４－１７６０、（２００９））。ミスマッチのリード長の４％を上回らない単一の最良マッチ位置にマッピングされた固有のリードを、ピーク特定およびプロファイル生成のために保存した。配列データは、１００万リードに対して正規化することによって、ＩＧＶで視覚化した。ソフトウェアＭＡＣＳ２（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ９、Ｒ１３７、（２００８））を、対照として入力ＤＮＡからのシーケンシングデータとともに、ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータに適用して、ＥＴＶ２のゲノム濃縮（ピーク）を特定した。ＳＩＣＥＲ（バージョン１．１）（Ｚａｎｇ，Ｃ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５、１９５２－１９５８、（２００９））アルゴリズムを、対照として入力ＤＮＡからのシーケンシングデータとともに、ＣｈＩＰ－ｓｅｑデータに適用して、異なる細胞型において有意な濃縮の差を有するゲノム領域を特定した。結果として得られたピークを、ＥＴＶ２についてはｐ値＜０．０５、ヒストン改変についてはＦＤＲ＜０．０１によってフィルタリングした。本発明者らは、ＨＯＭＥＲによって、個々のプロモーターにおけるリード計数を計算した（Ｈｅｉｎｚ，ｓ．ら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ３８、５７６－５８９、（２０１０））。それぞれの特定されたピークを、ＨＯＭＥＲによって、プロモーター（転写開始部位から±２ｋｂ）、遺伝子体、および遺伝子間領域にアノテーションした。
１０ｘＣｈｒｏｍｉｕｍ単一細胞トランスクリプトミクスおよび分析
本発明者らが、Ｒ－ＶＥＣが分枝したオルガノイド（正常および腫瘍オルガノイド）の安定な３Ｄモデルを構築した後、本発明者らは、内皮細胞とオルガノイドとの間の分子の相互干渉を研究することを明らかにした。組織特異的内皮細胞は、インビボにおいて顕著な脈管不均一性を示し、したがって、本発明者らは、Ｒ－ＶＥＣが、インビトロで正常結腸オルガノイドまたは腫瘍結腸オルガノイドのいずれかと共培養した場合に、周囲組織に対するこの適応をモデリングすることができると提案した。単一細胞分析は、単一細胞レベルでＲ－ＶＥＣの適応または適応不全を分子的に定義し、それによって、サンプル間の不均一性だけでなく、３Ｄ共培養時の内皮細胞のサンプル間の不均一性の情報を本発明者らに提供することによって、この相互作用を解明することに役立ち得る。オルガノイドとの共培養時のＲ－ＶＥＣの適応を構築するための単一細胞ライブラリーの調製のために、以下の２つの実験を行った。
実験１：Ｒ－ＶＥＣを、単独、または正常結腸オルガノイドと一緒に、ＦＧＦおよびヘパリンを有する完全オルガノイド成長培地において、７日間共培養した。正常結腸オルガノイドもまた、単独で、ＦＧＦおよびヘパリンを有する完全オルガノイド成長培地において、７日間培養した。７日後に、３つすべての条件（Ｒ－ＶＥＣ単独、Ｒ－ＶＥＣ＋正常結腸オルガノイド、または正常結腸オルガノイド単独）を、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびＴｒｙｐｌＥで解離させ、１０ｘＣｈｒｏｍｉｕｍ単一細胞分析に供した。３つすべてのサンプルを、同時に処理および実行した。
実験２：Ｒ－ＶＥＣを、単独、または結腸腫瘍オルガノイドと一緒に、ＦＧＦおよびヘパリンを有する完全オルガノイド成長培地において、７日間共培養した。腫瘍結腸オルガノイドもまた、単独で、ＦＧＦおよびヘパリンを有する完全オルガノイド成長培地において、７日間培養した。７日後に、３つすべての条件（Ｒ－ＶＥＣ単独、Ｒ－ＶＥＣ＋結腸腫瘍オルガノイド、または腫瘍結腸オルガノイド単独）を、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、およびＴｒｙｐｌＥで解離させ、１０ｘＣｈｒｏｍｉｕｍ単一細胞分析に供した。３つすべてのサンプルを、同時に処理および実行した。
単一細胞懸濁液を、１０ｘＣｈｒｏｍｉｕｍ単一細胞機器（１０ｘＧｅｎｏｍｉｃｓ）においてウェルにロードした。バーコード処理およびｃＤＮＡ合成を、製造業者の説明に従って行った。簡単に述べると、１０ｘ（商標）ＧｅｍＣｏｄｅ（商標）技術は、数千個の細胞を、ナノリットル規模のＧｅｌ Ｂｅａｄ－Ｉｎ－ＥＭｕｌｓｉｏｎ（ＧＥＭ）へと分割し、ここで、個々の細胞から生成されたすべてのｃＤＮＡは、共通の１０ｘバーコードを共有している。ＰＣＲ重複を特定するために、固有分子識別子（ＵＭＩ）も付加した。ＧＥＭを、酵素とともにインキュベートして、全長ｃＤＮＡを得、これを、次いで、ＰＣＲによって増幅して、ライブラリー構築に十分な量を生成した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙアッセイを使用して、定性的分析を行った。１０ｘＣｈｒｏｍｉｕｍ（商標）単一細胞３’ライブラリーキットを、製造業者の独自のプロトコールに従って使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。簡単に述べると、ｃＤＮＡ増幅後に、ＳＰＲＩ選択試薬（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カタログ番号Ｂ２３３１７）を使用して、酵素によるフラグメント化およびサイズ選択を行って、ｃＤＮＡサイズを最適化した。Ｐ５、Ｐ７、サンプルインデックス、およびリード２（Ｒ２）プライマー配列を、末端修復、Ａテーリング、アダプターライゲーション、およびサンプル－インデックスＰＣＲによって付加した。最終的な単一細胞３’ライブラリーは、標準的なＩｌｌｕｍｉｎａ対合末端コンストラクト（Ｐ５およびＰ７）、リード１（Ｒ１）プライマー配列、１６ｂｐの１０ｘバーコード、１０ｂｐのランダマー、９８ｂｐのｃＤＮＡフラグメント、Ｒ２プライマー配列、ならびに８ｂｐのサンプルインデックスを含有する。ライブラリー構築後のＱＣについては、１ｕｌのサンプルを、１：１０希釈し、定性的分析のためにＡｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙチップに流した。定量化については、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＫＫ４８２４）を使用した。
ライブラリーを、以下のリード長を使用して、１５０サイクルのＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ５００キットにおいてシーケンシングした：細胞バーコードおよびＵＭＩについては２６ｂｐのリード１、サンプルインデックスについては８ｂｐのＩ７インデックス、および転写産物については１３２ｂｐのリード２。Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ ２．２．０を使用して、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ単一細胞３’ＲＮＡ－ｓｅｑ出力を処理した。第１に、「ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ｍｋｆａｓｔｑ」により、８ｂｐのサンプルインデックスリードに基づいてシーケンシングサンプルを脱多重化して、リード１およびリード２のｆａｓｔｑファイルを生成し、続いて、１６ｂｐの細胞バーコードおよび１０ｂｐのＵＭＩを抽出した。第２に、「ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ ｃｏｕｎｔ」により、リード２をｈｕｍａ Ｄｏｂｉｎ，ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２９、１５－２１、（２０１３））にアライメントした。次いで、アライメントしたリードを使用して、有効なバーコードおよびＵＭＩを有する場合にのみデータマトリックスを生成して、ＰＣＲ重複なしでエクソンにマッピングした（Ｅｎｓｅｍｂｌ ＧＲＣｈ３８）。有効な細胞バーコードは、ＵＭＩ分布に基づいて定義した。
すべての単一細胞分析は、ＲのＳｅｕｒａｔパッケージ（バージョン２．３．４）を使用して行った（Ｂｕｔｌｅｒ，ａ．ら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６、４１１－４２０（２０１８））。遺伝子－細胞のデータマトリックスを生成した後、６，０００個を上回る固有の発現遺伝子を有する細胞（細胞ダブレットの可能性があるため）を含め、品質の優れない細胞を除外した。サンプル内の３つまたはそれ以上の細胞において発現される遺伝子のみを、さらなる分析に使用した。細胞はまた、それらのミトコンドリア遺伝子の割合が１０％を上回ったか、またはそれらが６００個を下回る固有の遺伝子を発現していた場合には廃棄し、結果として、２４，４７８個の細胞にわたって２０，７７８個の遺伝子、およびデータセット全体にわたるそれぞれの細胞の中央値ＵＭＩ計数は７，８４５となり、細胞当たりの固有の遺伝子数の中央値は２，３９７となった。パッケージにおけるベストプラクティスの提案に従って、ＵＭＩ計数を、対数正規化し、ほとんどの高度に変動性の遺伝子を選択した後、データマトリックスを、ＵＭＩ計数から生じる変動を有しミトコンドリア遺伝子発現を軽減した線形モデルを使用して、スケーリングした。続いて、このマトリックスに主成分分析を行い、主成分ヒートマップおよびジャック・ストロープロットを考察した後、Ｕｎｉｆｏｒｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＭＡＰ）視覚化を、上位２９個の成分に行い、クラスタリング分解能を、視覚化については１．０に設定した。クラスター全体にわたる遺伝子マーカー発見のための差示的遺伝子発現を、Ｓｅｕｒａｔパッケージにおいて使用されるウィルコクソンの順位和検定を使用して行った。
上皮細胞を、上皮細胞マーカーＥｐＣＡＭ、ＣＤＨ１、ＫＲＴ１９によって特定し、内皮細胞を、内皮細胞マーカーＶＥカドヘリン（ＣＤＨ５）、ＰＥＣＡＭ１（ＣＤ３１）、およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）によって特定した。これに続いて、上皮細胞を、次の分析からフィルタリングして、共培養した正常および腫瘍細胞集団の内皮細胞集団内の不均一性を特定した。上皮細胞画分もまた、腫瘍および共培養サンプルにおいて単独で分析した。これらの分析の両方において、ここでも、ベストプラクティスに従って、適合する腫瘍および正常サンプルセットにおける上位２０個の成分および０．６のクラスター分解能を使用してクラスターを発見し、クラスター全体での遺伝子マーカー発現に関する差示的遺伝子発現は、Ｓｅｕｒａｔパッケージにおいて使用されるウィルコクソンの順位和検定を使用して行った。
統計学的分析：
データは、適切な統計学的方法を使用して評価および分析した。データの正規性は、コルモゴロフ－スミルノフ検定を使用して評価した。それぞれの実験のサンプルサイズおよび統計は、図の凡例に提供されている。別途示されない限り、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を、すべての統計学的分析に使用した。

Claims (33)

  1. 膵島に脈管形成するための方法であって、
    β細胞を含む膵島を、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と共培養することを含み、ＥＴＶ２転写因子が、内皮細胞において発現され、それによって、脈管形成された膵島を生成する、前記方法。
  2. 内皮細胞は、Ｓｏｘ１６転写因子をコードする外因性核酸をさらに含み、Ｓｏｘ１６が、内皮細胞において発現される、請求項１に記載の方法。
  3. 共培養は、少なくとも３～４週間行われる、請求項１または２に記載の方法。
  4. 膵島および内皮細胞をさらなる期間共培養することをさらに含み、さらなる培養は、内皮細胞がＥＴＶ２転写因子を発現しない条件下において生じる、請求項３に記載の方法。
  5. さらなる共培養は、少なくとも１週間行われる、請求項４に記載の方法。
  6. 内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、脂肪由来内皮細胞、または器官特異的内皮細胞を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 器官特異的内皮細胞は、心臓特異的内皮細胞、筋肉特異的内皮細胞、腎臓特異的内皮細胞、精巣特異的内皮細胞、卵巣特異的内皮細胞、リンパ系特異的内皮細胞、肝臓特異的内皮細胞、膵臓特異的内皮細胞、脳特異的内皮細胞、肺特異的内皮細胞、骨髄特異的内皮細胞、脾臓特異的内皮細胞、大腸特異的内皮細胞、および小腸特異的内皮細胞からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
  8. 共培養は、塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ－２）およびヘパリンを含む培地において培養することを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 共培養は、バイオリアクターまたはマイクロ流体デバイスにおいて行われる、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 共培養は、合わせた最終濃度で１０～１２ｍｇ／ｍｌのラミニンおよびエンタクチンの混合物、ならびに０．２～０．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩＶを含む、細胞外マトリックスにおいて行われる、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 脈管形成は、動脈、静脈、毛細血管、細動脈、細静脈、リンパ管、またはこれらの組合せの形成を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法によって得られる、脈管形成された膵島。
  13. 請求項１２に記載の得られた脈管形成された膵島を、必要とする対象に投与することを含む、方法。
  14. 膵島は、対象に対して自家である、請求項１３に記載の方法。
  15. 膵島は、対象に、外科手術もしくはカテーテルの埋込みによって投与されるか、または血管内経路を通じて注入される、請求項１３または１４に記載の方法。
  16. 膵島は、皮下または脈管内注入を通じて対象に投与される、請求項１３または１４に記載の方法。
  17. 脈管形成されたβ細胞オルガノイドを作製するための方法であって、β細胞を、ＥＴＶ２転写因子をコードする外因性核酸を含む内皮細胞と、成体内皮細胞がＥＴＶ２転写因子を発現する条件下において共培養することを含む、前記方法。
  18. 内皮細胞は、Ｓｏｘ１６転写因子をコードする外因性核酸をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
  19. 共培養は、塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ－２）およびヘパリンを含む培地において培養することを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 共培養は、少なくとも３～４週間行われる、請求項１７～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. β細胞および内皮細胞をさらなる期間共培養することをさらに含み、さらなる共培養は、内皮細胞がＥＴＶ２転写因子を発現しない条件下において行われる、請求項２０に記載の方法。
  22. 前記さらなる共培養は、少なくとも１週間行われる、請求項２１に記載の方法。
  23. 内皮細胞は、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、脂肪由来内皮細胞、または器官特異的内皮細胞を含む、請求項１７～２２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 器官特異的内皮細胞は、心臓特異的内皮細胞、筋肉特異的内皮細胞、腎臓特異的内皮細胞、精巣特異的内皮細胞、卵巣特異的内皮細胞、リンパ系特異的内皮細胞、肝臓特異的内皮細胞、膵臓特異的内皮細胞、脳特異的内皮細胞、肺特異的内皮細胞、骨髄特異的内皮細胞、脾臓特異的内皮細胞、大腸特異的内皮細胞、および小腸特異的内皮細胞からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
  25. 共培養は、合わせた最終濃度で１０～１２ｍｇ／ｍｌのラミニンおよびエンタクチンの混合物、ならびに０．２～０．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩＶを含む、細胞外マトリックスにおいて行われる、請求項１７に記載の方法。
  26. 共培養は、バイオリアクターまたはマイクロ流体デバイスにおいて行われる、請求項１７～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 脈管形成は、動脈、静脈、毛細血管、細動脈、細静脈、もしくはリンパ管、またはこれらの組合せの形成を含む、請求項１７～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 請求項１７～２７のいずれか１項に記載の得られた脈管形成されたβ細胞オルガノイド。
  29. 請求項２８に記載の脈管形成されたβ細胞オルガノイドを、必要とする対象に投与することを含む、方法。
  30. 脈管形成されたβ細胞オルガノイドは、対象に、外科手術もしくはカテーテルの埋込みによって投与されるか、または血管内経路を通じて注入される、請求項２９に記載の方法。
  31. 脈管形成されたβ細胞オルガノイド膵島は、対象に皮下投与される、請求項２９に記載の方法。
  32. β細胞は、（１）胚性多能性幹細胞（ＥＳＣ）に由来するβ細胞、（２）人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）に由来するβ細胞、（３）線維芽細胞の直接的な転写変換に由来するβ細胞、および（４）成体対象から単離されたβ細胞からなる群から選択される細胞を含む、請求項３０～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. β細胞は、対象に対して自家である、請求項３０～３１のいずれか１項に記載の方法。
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