JP6341574B2 - 軟骨細胞の調製方法 - Google Patents
軟骨細胞の調製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6341574B2 JP6341574B2 JP2015506846A JP2015506846A JP6341574B2 JP 6341574 B2 JP6341574 B2 JP 6341574B2 JP 2015506846 A JP2015506846 A JP 2015506846A JP 2015506846 A JP2015506846 A JP 2015506846A JP 6341574 B2 JP6341574 B2 JP 6341574B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cartilage
- cells
- tissue
- chondrocytes
- growth factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 title claims description 120
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 107
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 claims description 305
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 243
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 157
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 117
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 66
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 40
- 230000002792 vascular Effects 0.000 claims description 40
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 25
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 24
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 18
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 17
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 14
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 14
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 12
- 102100036601 Aggrecan core protein Human genes 0.000 claims description 11
- 108010067219 Aggrecans Proteins 0.000 claims description 11
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 claims description 11
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 claims description 11
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 claims description 11
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 10
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 10
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 10
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 10
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 claims description 8
- 102000003967 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000380 Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 claims description 8
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 claims description 8
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 claims description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 8
- 108010039419 Connective Tissue Growth Factor Proteins 0.000 claims description 7
- 102000015225 Connective Tissue Growth Factor Human genes 0.000 claims description 7
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 7
- 102000003969 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000381 Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 claims description 7
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 claims description 7
- 101000947178 Homo sapiens Platelet basic protein Proteins 0.000 claims description 7
- 102100036154 Platelet basic protein Human genes 0.000 claims description 7
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 claims description 7
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 claims description 7
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 claims description 7
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 claims description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 6
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 claims description 6
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 5
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 5
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 238000002513 implantation Methods 0.000 claims description 5
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 5
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 5
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 5
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 5
- 208000006735 Periostitis Diseases 0.000 claims description 4
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 claims description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 claims description 4
- 230000011164 ossification Effects 0.000 claims description 4
- 230000002188 osteogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 4
- 210000003460 periosteum Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 3
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 claims description 3
- 210000000205 arytenoid cartilage Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002184 nasal cartilage Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940099456 transforming growth factor beta 1 Drugs 0.000 claims description 3
- 229940072041 transforming growth factor beta 2 Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 claims description 2
- 102100021866 Hepatocyte growth factor Human genes 0.000 claims 2
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 claims 1
- 102100024504 Bone morphogenetic protein 3 Human genes 0.000 claims 1
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims 1
- 102100022525 Bone morphogenetic protein 6 Human genes 0.000 claims 1
- 101000762366 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 2 Proteins 0.000 claims 1
- 101000762375 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 3 Proteins 0.000 claims 1
- 101000762379 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 4 Proteins 0.000 claims 1
- 101000899390 Homo sapiens Bone morphogenetic protein 6 Proteins 0.000 claims 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 91
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 56
- 230000002648 chondrogenic effect Effects 0.000 description 53
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 52
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 37
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 36
- 210000001162 elastic cartilage Anatomy 0.000 description 31
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 28
- 210000004728 ear cartilage Anatomy 0.000 description 26
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 25
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 24
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 21
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 18
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 18
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 17
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 17
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 17
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 16
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 15
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 14
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 12
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 11
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 10
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 10
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 10
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 9
- -1 for example Proteins 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 9
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 description 8
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 8
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 8
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 description 8
- 230000008081 blood perfusion Effects 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 8
- 238000010859 live-cell imaging Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 8
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 8
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 7
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 7
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 7
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 7
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 7
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 7
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 6
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 6
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 6
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 6
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 6
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 6
- 230000001857 anti-mycotic effect Effects 0.000 description 6
- 239000002543 antimycotic Substances 0.000 description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 6
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 6
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 6
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 6
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 6
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 6
- 230000009790 vascular invasion Effects 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 5
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 5
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 5
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 5
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 210000001188 articular cartilage Anatomy 0.000 description 5
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 5
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 5
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 5
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 206010061762 Chondropathy Diseases 0.000 description 4
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 4
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N L-ascorbic acid 2-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(OP(O)(O)=O)=C1O MIJPAVRNWPDMOR-ZAFYKAAXSA-N 0.000 description 4
- 241001237732 Microtia Species 0.000 description 4
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 4
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 4
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 4
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 4
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 4
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 4
- 230000002940 repellent Effects 0.000 description 4
- 239000005871 repellent Substances 0.000 description 4
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 4
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N Alexa Fluor 555 Chemical compound C=12C=CC(=N)C(S(O)(=O)=O)=C2OC2=C(S(O)(=O)=O)C(N)=CC=C2C=1C1=CC=C(C(O)=O)C=C1C(O)=O IGAZHQIYONOHQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 3
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 3
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- 241000777300 Congiopodidae Species 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 101150106167 SOX9 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 3
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 3
- 230000009816 chondrogenic differentiation Effects 0.000 description 3
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 3
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 3
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000002106 nanomesh Substances 0.000 description 3
- 238000012758 nuclear staining Methods 0.000 description 3
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 3
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 3
- WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine chloride Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O WGTODYJZXSJIAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 3
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 3
- FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 11-dehydrocorticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 FUFLCEKSBBHCMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- 229920001342 Bakelite® Polymers 0.000 description 2
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008723 Chondrodystrophy Diseases 0.000 description 2
- 108010024682 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Proteins 0.000 description 2
- 102000015775 Core Binding Factor Alpha 1 Subunit Human genes 0.000 description 2
- OMFXVFTZEKFJBZ-UHFFFAOYSA-N Corticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 OMFXVFTZEKFJBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N Cortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 2
- MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N Cortisone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(=O)CC(C)(C(CC4)(O)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 MFYSYFVPBJMHGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000003947 Knee Osteoarthritis Diseases 0.000 description 2
- 240000001307 Myosotis scorpioides Species 0.000 description 2
- 238000011789 NOD SCID mouse Methods 0.000 description 2
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 208000008919 achondroplasia Diseases 0.000 description 2
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 2
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003416 augmentation Effects 0.000 description 2
- 239000004637 bakelite Substances 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000002308 calcification Effects 0.000 description 2
- 230000003848 cartilage regeneration Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N chembl454950 Chemical compound [Cl-].C1=CC=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H]([NH+](C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O XMEVHPAGJVLHIG-FMZCEJRJSA-N 0.000 description 2
- 239000000512 collagen gel Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N corticosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@H](CC4)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N 0.000 description 2
- 229960004544 cortisone Drugs 0.000 description 2
- QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N costic aldehyde Natural products C1CCC(=C)C2CC(C(=C)C=O)CCC21C QTCANKDTWWSCMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 210000003035 hyaline cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N iso-beta-costal Natural products C1C(C(=C)C=O)CCC2(C)CCCC(C)=C21 ISTFUJWTQAMRGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 229960005205 prednisolone Drugs 0.000 description 2
- OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N prednisolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OIGNJSKKLXVSLS-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N safranin Chemical compound [Cl-].C=12C=C(N)C(C)=CC2=NC2=CC(C)=C(N)C=C2[N+]=1C1=CC=CC=C1 OARRHUQTFTUEOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- 229960004989 tetracycline hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005294 triamcinolone Drugs 0.000 description 2
- GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N triamcinolone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@@]3(F)[C@@H](O)C[C@](C)([C@@]([C@H](O)C4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 GFNANZIMVAIWHM-OBYCQNJPSA-N 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 2
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 2
- BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 1-[4-[6-amino-5-[(Z)-methoxyiminomethyl]pyrimidin-4-yl]oxy-2-chlorophenyl]-3-ethylurea Chemical compound CCNC(=O)Nc1ccc(Oc2ncnc(N)c2\C=N/OC)cc1Cl BJHCYTJNPVGSBZ-YXSASFKJSA-N 0.000 description 1
- OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 2,4-D Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(Cl)C=C1Cl OVSKIKFHRZPJSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RCEBHKDQZCVBTC-UHFFFAOYSA-N 2-acetamidothiophene-3-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)NC=1SC=CC=1C(O)=O RCEBHKDQZCVBTC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXDJCCTWPBKUKL-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-aminophenyl)-(4-imino-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]aniline;hydron;chloride Chemical compound Cl.C1=CC(=N)C(C)=CC1=C(C=1C=CC(N)=CC=1)C1=CC=C(N)C=C1 AXDJCCTWPBKUKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012114 Alexa Fluor 647 Substances 0.000 description 1
- 102100022014 Angiopoietin-1 receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000036487 Arthropathies Diseases 0.000 description 1
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 1
- 102100031650 C-X-C chemokine receptor type 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010040163 CREB-Binding Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100021975 CREB-binding protein Human genes 0.000 description 1
- 108091007854 Cdh1/Fizzy-related Proteins 0.000 description 1
- 102000038594 Cdh1/Fizzy-related Human genes 0.000 description 1
- 229920000298 Cellophane Polymers 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 241000766026 Coregonus nasus Species 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241001269524 Dura Species 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 206010058314 Dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 241000611421 Elia Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150081124 FGFR gene Proteins 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- 101000753291 Homo sapiens Angiopoietin-1 receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000922348 Homo sapiens C-X-C chemokine receptor type 4 Proteins 0.000 description 1
- 101001126417 Homo sapiens Platelet-derived growth factor receptor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000642512 Homo sapiens Transcription factor SOX-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000642517 Homo sapiens Transcription factor SOX-6 Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108010072582 Matrilin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000055008 Matrilin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100025751 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710143123 Mothers against decapentaplegic homolog 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100025748 Mothers against decapentaplegic homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710143111 Mothers against decapentaplegic homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000906034 Orthops Species 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010051742 Platelet-Derived Growth Factor beta Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100030485 Platelet-derived growth factor receptor alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100026547 Platelet-derived growth factor receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000016971 Proto-Oncogene Proteins c-kit Human genes 0.000 description 1
- 108010014608 Proto-Oncogene Proteins c-kit Proteins 0.000 description 1
- 241000219061 Rheum Species 0.000 description 1
- 208000025747 Rheumatic disease Diseases 0.000 description 1
- 241001183191 Sclerophthora macrospora Species 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100036692 Transcription factor SOX-5 Human genes 0.000 description 1
- 102100036694 Transcription factor SOX-6 Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000004060 Transforming Growth Factor-beta Type II Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010082684 Transforming Growth Factor-beta Type II Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 description 1
- 108010053100 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100033179 Vascular endothelial growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000003872 anastomosis Effects 0.000 description 1
- 230000019552 anatomical structure morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000015100 cartilage disease Diseases 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229940096422 collagen type i Drugs 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 210000004714 cranial suture Anatomy 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 101150108726 dex gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 210000000624 ear auricle Anatomy 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 210000004177 elastic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 230000004578 fetal growth Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000000968 fibrocartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003566 hemangioblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000048851 human CD44 Human genes 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001621 ilium bone Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000001746 injection moulding Methods 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000031142 liver development Effects 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000011360 lung alveolus development Effects 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 239000012567 medical material Substances 0.000 description 1
- 201000008350 membranous glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 230000005486 microgravity Effects 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000013425 morphometry Methods 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000000399 orthopedic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000015031 pancreas development Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002278 reconstructive surgery Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000002435 rhinoplasty Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229920000260 silastic Polymers 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001258 synovial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002437 synoviocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000534 thyroid cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000030968 tissue homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 230000004218 vascular function Effects 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 230000000982 vasogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/32—Bones; Osteocytes; Osteoblasts; Tendons; Tenocytes; Teeth; Odontoblasts; Cartilage; Chondrocytes; Synovial membrane
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
- A61L27/3612—Cartilage, synovial fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3808—Endothelial cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
- A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
- A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
- A61L27/3817—Cartilage-forming cells, e.g. pre-chondrocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/06—Materials or treatment for tissue regeneration for cartilage reconstruction, e.g. meniscus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/10—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of tendons or ligaments
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/113—Acidic fibroblast growth factor (aFGF, FGF-1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/12—Hepatocyte growth factor [HGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/165—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/28—Vascular endothelial cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Botany (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Hematology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Virology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
Description
1.分化誘導に必要な試薬のコストが高額で、分化誘導に莫大な費用が生じる。
2.軟骨細胞への分化誘導までに長期間(2〜4ヶ月の)の培養期間を要するために、腫瘍形成など医療応用上のリスクが高まる。
3.分化誘導された軟骨細胞はゲル状であり、移植時に形態を制御することが著しく困難である。
1.担体が生体にとり異物であることから、感染や炎症、それらに起因する瘢痕組織形成などが生じる。
2.軟骨形成細胞を担体に充填ないし付着させるため、軟骨細胞への適切な分化プロセスが再現されない。
3.終末分化した軟骨細胞への分化誘導効率が低いために、均一で、充分な量の3次元軟骨組織を得ることが困難である。
(1)軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することを含む、軟骨細胞の調製方法。
(2)軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することで、軟骨形成細胞が増幅する(1)記載の方法。
(3)支持体上で軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより、三次元組織が形成される(1)又は(2)記載の方法。
(4)支持体が0.5〜25 kPaの硬度を有する基材である(3)記載の方法。
(5)底面に細胞が集まるような形状のプレート上で軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより、三次元組織が形成される(1)又は(2)記載の方法。
(6)線維芽細胞増殖因子2(bFGF(FGF2))、線維芽細胞増殖因子4(FGF4)、線維芽細胞増殖因子5(FGF5)、骨形成因子2(BMP2)、骨形成因子3(BMP3)、骨形成因子4(BMP4)、骨形成因子6(BMP6)、結合組織増殖因子(CTGF)、トランスフォーミング増殖因子β1(TGF-β1)、トランスフォーミング増殖因子β2(TGF-β2)、トランスフォーミング増殖因子β3(TGF-β3)、インスリン様成長因子1(IGF-1)、肝細胞増殖因子(HGF)、アグリカン(Aggrecan)、ヒアルロン酸(Hyaluronic Acid)、内皮細胞成長因子(ECGF)、内皮細胞増殖因子(ECGS)、内皮細胞由来成長因子(ECDGF)、上皮成長因子(EGF)、酸性線維芽細胞成長因子(acidic FGF)、マクロファージ由来成長因子(MDGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、腫瘍血管新生因子(TAF)、血管内皮増殖因子(VEGF)ウシ脳抽出液(BBE)、ウシ脳下垂体抽出液(BPE)、糖質コルチコイド、コレステロール、各種ビタミンからなる群より選択される少なくとも1つの成分の存在下で、軟骨形成細胞を血管細胞と共培養する(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)軟骨形成細胞と血管細胞を1:0.3〜1の混合比で共培養する(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)軟骨形成細胞が、軟骨細胞、未熟軟骨細胞、軟骨前駆細胞又は軟骨幹細胞のいずれかである(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)軟骨細胞が、肋骨軟骨、鼻軟骨、耳軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨、環状軟骨、腱、靭帯、関節間軟骨及び椎間板からなる群より選択される組織から得られたものである(8)記載の方法。
(10)未熟軟骨細胞、軟骨前駆細胞又は軟骨幹細胞が、軟骨、軟骨膜、骨髄、胎盤、臍帯、皮膚、筋肉、脂肪及び骨膜からなる群より選択される組織から得られたものである(8)記載の方法。
(11)軟骨形成細胞と血管細胞が同じ個体に由来する(1)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(12)軟骨形成細胞と血管細胞が異なる個体に由来する(1)〜(10)のいずれかに記載の方法。
(13)(1)〜(12)のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞を含む、軟骨再生医療用組成物。
(14)生体内に移植し、軟骨組織を形成させるために用いられる(13)記載の組成物。
(15)生体内に移植した後、血管網が構築される(14)記載の組成物。
(16)血管網に血管潅流が生じる(15)記載の組成物。
(17)血管網が構築された後、消失し、血管構造を欠く軟骨組織が形成される(16)記載の組成物。
(18)(1)〜(12)のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞、該軟骨細胞から形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、医薬品として有効な薬剤をスクリーニングする方法。
(19)(1)〜(12)のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞、該軟骨細胞から形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、軟骨細胞が産生する基質を調製する方法。
(20)(1)〜(12)のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞を生体内に移植し、軟骨組織を形成させることを含む、軟骨再生方法。
2.サイトカインなど分化誘導に必要な誘導因子を低減することができ、莫大なコスト削減につながる。
3.軟骨形成細胞の分化誘導に必要な培養期間を短縮することができる。
4.培養時に一定の強度を有した3次元組織が形成されるため、移植直後も形状を保ったまま移植することが可能となる。したがって、移植後に得られる3次元組織の形状予測が一定程度可能となる。
5.軟骨形成細胞の移植生着効率・終末分化誘導効率が高いために、少ない細胞数でも効率的に3次元軟骨を形成することができる。
6.高分子ポリマーなどの足場材料が不要なため、炎症や吸収が生じない。
本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2013‐58534の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
ゲルのような支持体ではなく、底面に細胞が集まるような形状(例えば、U底形状、V底形状など)のプレート上で軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することによっても、三次元組織を形成することができる。このようなプレート上では、小型(すなわち、数百μm程度又はそれ以下の大きさ)の三次元組織を形成することができる。このような小型の三次元組織は関節軟骨欠損部への移植に適している。(後述の実施例5、図14)
軟骨形成細胞と血管細胞との共培養開始から1日程度で三次元組織の形成が観察され、さらに培養を続けると(共培養開始から2日程度)、三次元組織に血管構造の形成が認められ、その後(共培養開始から10日程度)、血管構造の消失が起こることが確認されている。
本発明の方法により形成される三次元組織は、ピンセット等で用手圧迫を行っても、組織が破壊されない程度の高い力学的強度を有しうる。
〔実施例1〕ヒト軟骨前駆細胞を用いた弾性軟骨創出
1. 要約
成体軟骨組織は血管や神経を欠く単純な臓器であり、複雑な高次構造を有する固形臓器などと比較して、再生医療の早期実現化が期待される。これまでに様々な組織由来間葉系前駆細胞を用いて、成熟軟骨細胞の分化誘導を試みる研究が多数報告されている。しかし、成長因子を用いる従来の分化誘導法では、軟骨細胞への終末分化誘導効率が低いことが重大な未解決課題となっている。
頭蓋・顎・顔面領域の先天奇形や外傷に起因する変形は、全世界で100万人以上の患者が抱えている極めて重要な解決課題であり、これらの疾患に対する新しい治療法の開発が待ち望まれている1。現在、形成外科領域では顔面の変形や先天性奇形に対して、患者自身の軟骨組織を移植する手術が広く行われている2。組織移植に広く用いられている軟骨組織として肋軟骨が挙げられるが、採取に伴う術後の疼痛や胸部の瘢痕が問題となるばかりでなく、前胸部の変形をきたす症例もある。先天性の変形に対する手術は小児期に行われることが多いため、患者へ対する侵襲は相対的に大きく、その負担は計り知れない。また、軟骨組織移植に伴う経年的な組織変形と吸収や、骨組織移植に伴う経月的な組織吸収も極めて大きな問題となっており臨床的に満足のいく長期成績が得られていない3-7。合成高分子化合物などの医用材料を移植する方法もあるが8-13、それらが人体にとって異物であることから、感染や炎症、皮膚穿孔などが生じることが知られており、これらの問題が未解決である12,13。このような問題点を克服することの可能な新しい治療法として、組織再生工学を用いたヒト弾性軟骨の臨床的再構築法の開発が切望されている。
3-1. クラニアルウインドウの作製
6週齢で雌のNOD/SCIDマウスを、三協ラボサービス株式会社より購入した。購入したマウスは、横浜市立大学 先端医科学研究センター 共同研究支援部門動物実験センター内において飼育・維持され、これらを用いた動物実験に関しては、横浜市立大学福浦キャンパス動物実験指針に則って行った。
クラニアルウインドウ作製は主にYuanらの方法に従い行った39。麻酔はケタラール(Sankyo Yell Yakuhin Co.)90 mg/kg, キシラジン(Sigma Chemical CO.)9 mg/kgを滅菌処理したPBSで1個体200 μlの投与量になるように調製し、大腿部筋肉内注射により実施した(ケタラール・キシラジン混合麻酔)。ケタラールは麻薬管理法に従い使用した。70 %エタノールでNOD/SCIDマウス頭部を消毒し、頭部皮膚を切開し、頭蓋骨表面の骨膜を綿棒により除去したのち、歯科用マイクロドリル(Fine Science Tools)を用いて頭蓋骨を円形に薄削し、慎重に取り除いた。続いてピンセットを用いて硬膜を剥離した。出血した際には、スポンゼル(Astellas Co.)を用いて止血を行った。出血が見られないことを確認した後、生理食塩水(Otuka Pharmaceutical Co.)で脳表面を満たして、直径7 mmの特注円形スライドガラス(MATSUNAMI)を表面に乗せ、コートレープラスチックパウダー(Yoshida)とアロンアルファ(Toagosei CO.)をセメント状になるように混合した接着剤により強固に封入した。
作成されたクラニアルウインドウマウスにケタラール・キシラジン混合麻酔を腹腔投与後、頭部ガラスが水平になるよう仰向けにしたマウスをカバーガラス上にセロハンテープで固定し、GFP-mouse(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP))(日本SLC)の未成熟な軟骨組織や細胞の観察を行った40,41。観察には、共焦点顕微鏡(Leica)を用いた。また、マウスの血流を可視化するため、尾静脈から29 Gの注射器(Termo)でfluorescein isothiocyanate-conjugated dextran(MW 2,000,000)、tetramethylrhodamine-conjugated dextran (MW 2,000,000)を100μl、マウスの血管構造を可視化するために、尾静脈からAlexaR647-conjugated mouse-specific CD31 antibody(BD Biosciences Pharmingen) 100μl投与した。
摘出した組織、および各発生段階の野生型C57BL/6Jマウス(日本SLC)耳介を、4 %パラホルムアルデヒド(PFA)(Wako)/リン酸緩衝食塩液(PBS)(pH7.4)で4 ℃、2時間固定した。次に、100 mM塩化アンモニウム(Wako)/PBSで4 ℃、10分間、3回洗浄した.そして、15 %スクロース(Wako)/PBSに4 ℃、1 時間浸した後,30%スクロース/PBSで4 ℃、over nightで静置した。O.C.T. Compound(SAKURA Japan)(30 ml)に組織を包埋した。4 ℃、1 時間静置した後、液体窒素で急速凍結し、凍結ブロックを作製した。凍結ブロックをクリオスタットHM 500 O(ZEISS)で5 μmの厚さに薄切し、凍結組織切片を作製した。作成した組織切片は、Alcian Blue染色(武藤化学薬品)、Elastica Van Gieson染色(武藤化学薬品)を行った。
摘出した組織、および各発生段階の野生型C57BL/6Jマウス(日本SLC)耳介を、4 %パラホルムアルデヒド(PFA)(Wako)/リン酸緩衝食塩液(PBS)(pH7.4)で4 ℃、2時間固定した。次に、100 mM塩化アンモニウム(Wako)/PBSで4 ℃、10分間、3回洗浄した。そして、30%スクロース/PBSで4 ℃、over nightで静置し、O.C.T. Compound(SAKURA Japan)(30 ml)に組織を包埋した。30分静置した後、液体窒素で急速凍結し、凍結ブロックを作製した。凍結ブロックをクリオスタットHM 500 O(ZEISS)で5 μmの厚さに薄切し、凍結組織切片を作製した。作成した組織切片を0.1%tween-TBSで洗浄してOCT Compoundを除去後、凍結切片周囲のTBS-Tを拭き取り、染色対象を撥水ペン(DAKO)で囲むように書き、撥水処理を施した。次に、protein block Serum-Free Ready-to-use(Dako)を用い、4 ℃で24時間ブロッキングを行った。一次抗体には、一次抗体は4℃で一晩反応させた。処理後、TBS-Tで5分間3回洗浄し、二次抗体を滴下し、室温で2時間反応させた。TBS-Tで5分間3回洗浄し、DAPIを添加したFA Mounting Fluid(Becton Dickinson)にて核染色および封入を行った。一次抗体および二次抗体の希釈には、protein block Serum-Free Ready-to-use(Dako)を用いた。
また、二次抗体は、
Alexa488 Goat Anti-mouse IgG1(Molecular Probe)(1:500)、
Alexa555 Goat Anti-rabbit IgG(Molecular Probe)(1:500)、
Alexa555 Goat Anti-mouse IgG2b(Molecular Probe)(1:500)、
Alexa555 rabbit Anti-rat IgG2b(Molecular Probe)(1:500)、
Alexa546 Goat Anti-rabbit IgG(Molecular Probe)(1:500)、
を使用した。観察には、蛍光顕微鏡(Zeiss)を用いた。
横浜市立大学附属病院倫理委員会より承認を得て(approval #03-074)、小耳症患者より手術の際に余剰となる残存耳介弾性軟骨を供与頂き、研究を遂行した。
実体顕微鏡下で軟骨膜部、軟骨実質部の2層に分離し、組織を細切にした。その後0.2 %Collagenase TypeII(Worthington)に懸濁・振蕩し、基質を分解し細胞を分離した。その際、軟骨膜組織と軟骨膜は2時間、軟骨組織は10〜15時間振蕩した。各組織の細胞懸濁液は100 μmのCell Strainer (BD Falcon)で濾過し、遠心分離 (1500 rpm、4 ℃、5 min)した。上清を除去後、Standard medium( 10 %Fetal Bovine Serum(FBS;GIBCO)、1 %Antibiotic Antimycotic Solution(SIGMA)を添加したDULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM(D-MEM/F-12;SIGMA))で洗浄し、遠心分離(1500 rpm、4 ℃、5 min)を行った。回収した各細胞は、35 mmイージーグリップ細胞培養ディッシュ(FALCON)あるいは60 mm細胞培養ディッシュ(FALCON)に播種した。細胞は気相条件を37 ℃、CO2濃度5 %に設定したインキュベーター内で培養を行った。
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞(Normal Human Umbilical Vein Endothelial Cells: HUVEC) (Lonza)の継代は、1×PBSで3回洗浄後、0.05 % Tripysin-EDTA(Gibco)を1 ml注入し、インキュベーター内で1分間静置し、Endothelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors(EGM)(Lonza)を加えてピペッティングし細胞を回収した。回収した細胞は遠心分離(950 rpm、4 ℃、5 min)を行い、洗浄を行った後、ディッシュに播種し再び培養した。ディッシュがコンフルエントに達した際に同様の継代操作を施行し、その操作を繰り返した。
全ての遺伝子組み換え実験は、横浜市立大学DNA組み換え委員会の了承を得たうえで、P2レベル安全キャビネット内にて施行した。
軟骨膜細胞を4.0×104 cells/cm2の密度で播種し,増殖培地で培養を行った。24時間後に、軟骨膜細胞、HUVECそれぞれを4.0×104 cells/mlの密度で播種したCell Culture Inserts(BD Falcon)を挿入した。12日間培養後、培地にNuc Blue Live Cell Stain(Molecular Probes)一滴添加した。インキュベーター内で10分静置後、IN Cell analyzer2000(GE)で細胞数を測定した。なお、本検討においては、増殖培地としてStandard medium ( 10 %Fetal Bovine Serum(FBS;GIBCO)、1 %Antibiotic Antimycotic Solution(SIGMA)を添加したDULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM(D-MEM/F-12;SIGMA))を用いて培養を行った。
軟骨膜細胞を1.0×105 cells/mlの密度で播種し,増殖培地で培養を行った。24時間後に、軟骨膜細胞、血管内皮細胞それぞれを7.5×104 cells/mlの密度で播種したCell Culture Insert(BD)を挿入した。3日間培養後、培地を除去したディッシュに上記の0.2 %Collagenase溶液を注入し、インキュベーター内で20分静置し、Standard mediumを加え、ピペッティングし細胞を回収した。
耳介軟骨膜細胞を用いて積層化培養によって軟骨細胞へ分化誘導を行った。軟骨膜細胞を2.5×104 cells/cm2に調整し細胞培養ディッシュ(FALCON)に播種した。播種後2日間、Standard mediumで培養し、細胞の接着を促した後、軟骨分化誘導培地を用いて5日間培養した。軟骨分化誘導培地は10 %FBS(GIBCO)、1 % Antibiotic Antimycotic Solution、L-ascorbic acid 2-phosphate(WAKO)、Dexamethasone(SIGMA)、Insulin Growth Factor-I(SIGMA)、basic Fibroblast Growth Factor(科研製薬)を含有するD-MEM/F-12 medium(SIGMA)である。軟骨分化誘導培地を用い7日間培養を行った後、別に用意した細胞を5×104 cells/cm2に調整し、上から播種し積層化した。2層目を播種後、1層目と同様に2日間はStandard mediumで培養を行い、その後軟骨分化誘導培地を用いて5日間培養を行った。この操作をもう一度繰り返し、計3層に重層化した。なお、細胞の培養はすべて、気相条件を37℃、CO2濃度5%に設定したインキュベーター内で行った。分化させた各細胞は、セルスクレイパー(IWAKI)を用いて剥離した。クラニアルウインドウ内に移植し、共焦点顕微鏡を用い観察を行った。
24-well plateに150 μmのEGMとMatrigelをそれぞれ添加し、インキュベーター内で30分静置した。1.0×105 cells/mlの軟骨膜細胞、HUVECの各細胞懸濁液を混合し、遠心分離(950 rpm、4 ℃、5 min)を行い、回収した細胞を少量の増殖培地でウェルに播種した。5〜20分静置後、Endothelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors(EGM)よりEGF添加を行わない培地(EGM-ΔEGF)(lonza)を1 ml添加し、1日毎にEGMを交換し、3日間培養した。なお、10 %Fetal Bovine Serum(FBS;GIBCO)、1 %Antibiotic Antimycotic Solution(SIGMA)を添加したDULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM(D-MEM/F-12;SIGMA))を用いて培養を行った。
誘導した三次元組織をクラニアルウインドウ内に移植し、肉眼および共焦点顕微鏡によるライブイメージングを実施するとともに、移植15、30、60日後に摘出し、組織化学染色を行った。
Alcian Blue染色した組織切片を、HSオールインワン蛍光顕微鏡(KEYENCE)により組織全体像の画像を取得し、Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/)により、陽性領域を定量した42。
データは、少なくとも3人以上の独立した検体による実験から得たmean±s.d.を表記した。統計学的解析には、まず3あるいは4群のデータに対しKruskal Wallis-H testを行い、P<0.01と判定された場合に、 Mann-Whitney’s U test with Bonferroni correctionによる多重比較検定を行った。有意確率P値がP<0.001またはP<0.01を満たす場合を統計学的有意差ありと判定した。
4-1. 軟骨形成プロセスの追尾定点観察
E17.5のEGFP遺伝子改変マウスの耳介軟骨をクラニアルウインドウ内に移植し、共焦点顕微鏡を用いたライブイメージングを行うことで、軟骨前駆細胞が成熟軟骨細胞に分化するまでの追尾観察を行った。肉眼観察で、移植後1、2目に、移植片の血管とホストマウスの血管の吻合が起き始めていることを確認できた。しかし、移植後5日目以降は、完全に血管が吻合していることが確認された。移植後5日目から血管が徐々に退行していき、移植後11日目には、ほぼ完全に血管が移植片から退行していた(図2A)。tetramethylrhodamine-conjugated dextranとAlexa647-conjugated mouse specific CD31 (mCD31) antibody を血管内に投与することでマウスの血管内皮細胞と血流を可視化したところ、移植後3日に、血流を有した血管が移植した耳介軟骨に侵入していることが確認できた。移植後7日には、一部の血管内皮細胞だけ残し、血管網は退行していた (図2B)。 同時に、円形の形態をしている軟骨前駆細胞が、軟骨細胞と同様な敷石状の形態へと変化していた。移植後10日には、移植した耳介軟骨からは血管が完全に退行していた(図2B)。移植後20日に、軟骨組織を包むように血管を有した軟骨膜組織を形成し、軟骨組織を構成する細胞は敷石状の形態を示した(図2B)。先行研究により、成体のヒトとマウス両方の耳介の軟骨膜組織に、高い軟骨分化能を有している軟骨前駆細胞が存在していることを明らかになっている。移植後20日経過した移植した耳介軟骨は弾性軟骨を形成しているかを組織学的解析により確認したところ、Alcian Blue染色によってプロテオグリカンを産生する軟骨組織が形成され、弾性繊維を染色するElastica Van Gieson染色により、弾性軟骨が形成したことが示された(図2C)。肉眼で、血管退行が起き始めている移植後5日目以降から、移植した発生初期の耳介軟骨が成長していくことが確認できた(図2A)。
血管内皮細胞を支持している基底膜の構成タンパク質であるラミニン、血管内皮細胞マーカーであるmCD31により、E18.5、P0、P2、P10、P30の発達段階の耳介軟骨をクリオスタットで凍結組織切片を作製し、免疫組織化学染色を行った。E18.5の段階で、ラミニン、mCD31を発現する細胞が軟骨形成予定部位に存在していた。P0では、E18.5と比較して血管が多く存在し、P2で最も多くの血管を確認できた。一方で、P10では、血管をわずかに観察することができたが、P30では全く観察することは出来なかった(図3A)。P0、P2、P10、P30の段階での、ラミニン、mCD31を発現する血管と軟骨前駆細胞との距離を測定したところ、P2で最も短い距離(17.8 μm)を計測した (図3B)。
軟骨再構築過程においても血管の侵入が起きているかを検証した。成長因子を添加した分化培地を用い、重層化させることにより、軟骨前駆細胞に軟骨分化誘導を行った。培養上清が粘性を帯びたときに、セルスクレイパーを用いて細胞を回収し、ペレット化することで、クラニアルウインドウに移植した(図4A)。fluorescent-conjugated dextranを血管内に投与することで血流を可視化したところ、10日後に移植したペレットに血管が侵入していき、移植30日後まで血管は侵入したままであった。60日後になると、移植したペレットから血管は完全に退行した(図4B) 。軟骨前駆細胞が成熟軟骨細胞へ分化したかを、組織学的解析により確認したところ、血管が侵入していた移植後10日ではAlcian Blue染色で染色されることはなかったが、移植後30日ではわずかに青色を呈していた。血管の完全に退行している移植後60日後には、濃い青色に染色されており、プロテオグリカンを産生する成熟軟骨細胞へと分化していることが確認できた。
血管が侵入する発生初期の耳介軟骨において、細胞が増殖しているかを検討した。血管が侵入していたP0、P2と、完全に血管が退行していたP30の耳介軟骨を用いて、Ki67とCD44により免疫組織化学染色を行った。増殖中の軟骨前駆細胞を、軟骨前駆細胞の特異的マーカーとして我々が報告しているCD4443と細胞増殖マーカーであるki67により観察した。血管が侵入していた段階であるP0、P2において、Ki67陽性細胞を観察することができ、最も血管の侵入していたP2の段階で最もKi67陽性細胞を確認できた。血管の退行しているP30では、Ki67陽性細胞は観察できなかった(図5)。次に、軟骨前駆細胞を低密度で播種し、Transwell assayによりヒト臍帯静脈内皮細胞(Normal Human Umbilical Vascular Endothelial Cells: HUVEC)と共培養することで、血管内皮細胞による軟骨前駆細胞の増殖能への影響を評価した。コントロールとして、間葉系幹細胞、繊維芽細胞や軟骨細胞と共培養を行った。共培養を始めて12日後、HUVECと共培養したものは細胞が密な状態に成り、ほぼコンフルエントになった。In cell analyzerにより細胞数を定量したところ、軟骨前駆細胞のみでは約2500 cells/cm2であったのに対して、HUVECと共培養を行った軟骨前駆細胞では約4000 cells/cm2であった。また、間葉系幹細胞、繊維芽細胞や軟骨細胞と共培養を行ったが、軟骨前駆細胞の増殖能への影響は見られなかった(図6A)。次に、フローサイトメトリーを用いて、共培養することによる細胞の表面抗原の変化を解析した。先行研究により、CD44+ CD90+細胞がヒト軟骨前駆細胞であると同定している。内皮細胞と共培養して12日後、コントロールである軟骨前駆細胞のみでは、CD44+ CD90+細胞は全体の0.79 %であったのに対して、HUVECと共培養することでCD44+ CD90+細胞は、12.44 %へと増加した (図6B)。
軟骨前駆細胞と内皮細胞との相互作用を再現することによる、足場材料や成長因子を使わない三次元培養系を開発した。ヒト軟骨前駆細胞とHUVECをマトリゲル上で共培養すると、播種後12時間で細胞が少しずつ凝集していき、48時間後には直径約3 mmの三次元構造を自律的に形成した(図7A)。この三次元組織は、一定の力学強度を有しており、形状を崩すことなく、薬さじで掬い上げることでマウスのクラニアルウインドウ内に移植することが出来た。肉眼で、E17.5のマウスの未成熟な耳介軟骨を移植した時と同様に、移植後3日に、移植片への血流が再開し始めた。移植後10日後には、完全にHUVECとマウスの血管が吻合することで、移植片内に血管網が構築されていることが確認でき、一過性血管侵入を再現することが出来た(図7B)。血管侵入している部位を追尾観察していくと、移植後30日では、血管網が完全に無くなり、軟骨前駆細胞は、軟骨細胞と同様な敷石状の形態に変化したことから、軟骨前駆細胞は、成熟軟骨細胞へ分化したと考えられる。ライブイメージング解析でも同様に、移植後3日にはHUVECが血管網を構築し、移植後30日には完全に退行することが確認できた。移植した三次元組織が軟骨組織を形成したかを、組織学的解析により確認したところ、血管が侵入していた移植後3日ではAlcian Blue染色により染色されることはなかったが、移植後15日では一部分が青く染色された。血管の完全に退行した移植後30日後には、一部が濃い青色に染色されており、移植後60日後には、移植した三次元組織の大部分がAlcian Blueにより濃青色に染色された(図7C)。このことから、軟骨前駆細胞とHUVECを共培養することで構築した三次元組織が、プロテオグリカンを産生する軟骨組織を形成したことが確認できた。また、移植後30日の段階で、サフラニンO染色でも軟骨が再構築していること確認でき、Elastica Van Gieson染色により形成した軟骨は弾性軟骨であることが確認できた。免疫組織化学染色により、再構築した軟骨は、アグリカン陽性である軟骨組織を包み込むように、I型コラーゲン陽性である軟骨膜組織を有していることが示された 。また、hCD31の免疫組織化学染色により、再構築した軟骨膜組織に血管内皮細胞が存在していることが示された(図7D)。
軟骨が成熟することに、マウス由来の血管と血液灌流が必須であるか明らかにするために、0.45 μmのポアサイズのナノメッシュを軟骨前駆細胞とHUVECを共培養することで構築した三次元組織と脳の間に挟み、マウスの血流が移植片に作用しない、血流阻害移植モデルを確立した(図8A)。移植後15日においても、移植した三次元組織の周囲に血流がないことが確認できた(図8B)。ライブイメージングにより、移植後3日には多くのHUVECが存在しているが、移植後7日目にはHUVECは減衰していき、移植後10日目にはほとんどのHUVECが死滅していた。また、HUVECの減衰に伴い、移植後11日には軟骨前駆細胞自体も死滅していた(図8C)。血液灌流を阻害することで、軟骨前駆細胞は、生着しないことが示された。また、免疫組織化学染色により、移植15日後の血液灌流を阻害した移植した三次元組織では、軟骨の基質であるII型コラーゲンが陰性であり、アポトーシス過程における中心的酵素であるcaspase3が陽性であることが確認できた(図8D)。一方で、血液灌流を阻害していない場合は、caspase3陽性の細胞は検出されず、II型コラーゲン陽性である軟骨組織を形成した。
従来法であるペレット移植法44と、軟骨前駆細胞とHUVECを共培養することで構築した三次元組織との軟骨再構築の効率を比較するために、同一のクラニアルウインドウマウスの左脳に軟骨前駆細胞とHUVECを共培養することで構築した三次元組織、右脳にペレットを移植した(図9A)。アルシアンブルー染色により、移植後10日で、ペレットは青色に染色されなかったが、共培養することで形成した三次元組織は青色に染色された。このことから、HUVECと共培養することで、プロテオグリカンを産生する成熟軟骨細胞へと軟骨前駆細胞を高効率に分化させることが示唆された。移植後30日になると、共培養することで構築した三次元組織は、プロテオグリカンを多く産生している軟骨組織を形成していることがわかった。移植後60日には、共培養することで構築した三次元組織の大部分がAlcian Blue染色により濃く青色に染色されたため、終末分化した成熟軟骨組織を形成したことが確認できた。対照的に、従来法では移植したペレットに対して一部分でしか、プロテオグリカンを産生する軟骨組織を形成しなかった(図9A)。このことは、HUVECと共培養した軟骨前駆細胞の方がより効率的に軟骨を再構築していることを示している。 アルシアンブルー陽性領域を定量化するために、青色に染色されている部位をimage Jより抽出して、面積を測定した(図9B) 。軟骨前駆細胞とHUVECを共培養することで構築した三次元組織では、アルシアンブルー陽性領域は、移植後10日で約100,000 μm2、移植後30日で約130,000 μm2、移植後60日では約250,000 μm2であった。一方で、従来法であるペレット移植法では、移植後10日で約35,000 μm2、移植後30日で約20,000 μm2、移植後60日では約80,000 μm2の面積の軟骨組織を形成した。比較すると、共培養することで構築した三次元組織では、移植後10日で2.85倍、移植後30日で6.5倍、移植後60日では3.27倍の面積の軟骨組織を形成したことが示された(図9C)。
軟骨組織は、軟骨細胞とそれを取り囲む細胞外基質からなる支持器官である。結合組織や骨組織といった他の支持組織と異なり、軟骨組織の細胞間質内には血管、リンパ管、神経などが存在しない45,46。そのため、複雑な高次構造を有する固形臓器などと比較して、再生医療の早期実現化が期待される領域である47,48。本研究では、軟骨形成プロセスをライブイメージングにより追尾観察することで、軟骨前駆細胞の分化段階において、従来不要と考えられていた血管が一過性に侵入することを見出した。移植した発生初期の耳介軟骨が、血管が侵入した直後に膨化したことから、軟骨前駆細胞が急激に増殖していると考えられる。血管が侵入する時期の耳介軟骨において、間葉系幹細胞の特異的マーカーとして報告されているCD44を発現している細胞を観察でき、その中の一部の細胞がKi67陽性を示した。そこで、軟骨前駆細胞と血管内皮細胞を共培養したところ、軟骨前駆細胞であるCD44+ CD90+細胞が増殖亢進していることが明らかになった。
1. Chang, S.C., Tobias, G., Roy, A.K., Vacanti, C.A. & Bonassar, L.J. Tissue engineering of autologous cartilage for craniofacial reconstruction by injection molding. Plast Reconstr Surg 112, 793-799; discussion 800-791 (2003).
2. Beahm, E.K. & Walton, R.L. Auricular reconstruction for microtia: part I. Anatomy, embryology, and clinical evaluation. Plast Reconstr Surg 109, 2473-2482; quiz following 2482 (2002).
3. Firmin, F., Sanger, C. & O'Toole, G. Ear reconstruction following severe complications of otoplasty. J Plast Reconstr Aesthet Surg (2008).
4. Kline, R.M., Jr. & Wolfe, S.A. Complications associated with the harvesting of cranial bone grafts. Plast Reconstr Surg 95, 5-13; discussion 14-20 (1995).
5. Laurie, S.W., Kaban, L.B., Mulliken, J.B. & Murray, J.E. Donor-site morbidity after harvesting rib and iliac bone. Plast Reconstr Surg 73, 933-938 (1984)
6. Skouteris, C.A. & Sotereanos, G.C. Donor site morbidity following harvesting of autogenous rib grafts. J Oral Maxillofac Surg 47, 808-812 (1989).
7. Whitaker, L.A., et al. Combined report of problems and complications in 793 craniofacial operations. Plast Reconstr Surg 64, 198-203 (1979).
8. Eppley, B.L. & Dadvand, B. Injectable soft-tissue fillers: clinical overview. Plast Reconstr Surg 118, 98e-106e (2006).
9. Matton, G., Anseeuw, A. & De Keyser, F. The history of injectable biomaterials and the biology of collagen. Aesthetic Plast Surg 9, 133-140 (1985).
10. Nagata, S. Modification of the stages in total reconstruction of the auricle: Part I. Grafting the three-dimensional costal cartilage framework for lobule-type microtia. Plast Reconstr Surg 93, 221-230; discussion 267-228 (1994).
11. Maas, C.S., Monhian, N. & Shah, S.B. Implants in rhinoplasty. Facial Plast Surg 13, 279-290 (1997).
12. Matarasso, A., Elias, A.C. & Elias, R.L. Labial incompetence: a marker for progressive bone resorption in silastic chin augmentation. Plast Reconstr Surg 98, 1007-1014; discussion 1015 (1996).
13. Zeng, Y., Wu, W., Yu, H., Yang, J. & Chen, G. Silicone implants in augmentation rhinoplasty. Aesthetic Plast Surg 26, 85-88 (2002).
14. Berry, L., Grant, M.E., McClure, J. & Rooney, P. Bone-marrow-derived chondrogenesis in vitro. J Cell Sci 101 ( Pt 2), 333-342 (1992).
15. Ma, H.L., Hung, S.C., Lin, S.Y., Chen, Y.L. & Lo, W.H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells encapsulated in alginate beads. J Biomed Mater Res A 64, 273-281 (2003).
16. Terada, S., Fuchs, J.R., Yoshimoto, H., Fauza, D.O. & Vacanti, J.P. In vitro cartilage regeneration from proliferated adult elastic chondrocytes. Ann Plast Surg 55, 196-201 (2005).
17. Goessler, U. R. et al. Tissue engineering in head and neck reconstructive surgery: what type of tissue do we need? Eur Arch Otorhinolaryngol 264, 1343-1356, (2007).
18. Caplan, A. I. Review: mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive therapy in orthopedics. Tissue Eng 11, 1198-1211, (2005).
19. Shieh, S.J., Terada, S. & Vacanti, J.P. Tissue engineering auricular reconstruction: in vitro and in vivo studies. Biomaterials 25, 1545-1557 (2004).
20. Togo, T., et al. Identification of cartilage progenitor cells in the adult ear perichondrium: utilization for cartilage reconstruction. Lab Invest 86, 445-457 (2006).
21. Dickhut, A., et al. Calcification or dedifferentiation: requirement to lock mesenchymal stem cells in a desired differentiation stage. J Cell Physiol 219, 219-226 (2009).
22. Afizah, H., Yang, Z., Hui, J.H., Ouyang, H.W. & Lee, E.H. A comparison between the chondrogenic potential of human bone marrow stem cells (BMSCs) and adipose-derived stem cells (ADSCs) taken from the same donors. Tissue Eng 13, 659-666 (2007).
23. Koga, H., et al. Comparison of mesenchymal tissues-derived stem cells for in vivo chondrogenesis: suitable conditions for cell therapy of cartilage defects in rabbit. Cell Tissue Res 333, 207-215 (2008).
24. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K. & Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum 52, 2521-2529 (2005).
25. Kobayashi, S. et al. Presence of cartilage stem/progenitor cells in adult mice auricular perichondrium. PLoS One 6, e26393, (2011).
26. Kobayashi, S. et al. Reconstruction of human elastic cartilage by a CD44+ CD90+ stem cell in the ear perichondrium. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 14479-14484, (2011).
27. Gospodarowicz D, Weseman J, Moran J. Presence in brain of a mitogenic agent promoting proliferation of myoblasts in low density culture. Nature 256,216-219, (1975)
28. Klagsbrun M, Langer R, Levenson R, Smith S, Lillehei C. The stimulation of DNA synthesis and cell division in chondrocytes and 3T3 cells by a growth factor isolated from cartilage. Exp Cell Res 105, 99-108, (1977)
29. Shiang R, Thompson LM, Zhu YZ, Church DM, Fielder TJ, Bocian M, Winokur ST, Wasmuth JJ. Mutations in the transmembrane domain of FGFR3 cause the most common genetic form of dwarfism, achondroplasia. Cell 29, 335-342, (1994)
30. Deng C, Wynshaw-Boris A, Zhou F, Kuo A, Leder P. Fibroblast growth factor receptor 3 is a negative regulator of bone growth. Cell 22, 911-921, (1996)
31. Serra R, Johnson M, Filvaroff EH, LaBorde J, Sheehan DM, Derynck R, Moses HL. Expression of a truncated, kinase-defective TGF-beta type II receptor in mouse skeletal tissue promotes terminal chondrocyte differentiation and osteoarthritis. J Cell Biol 20,541-552, (1997)
32. Furumatsu, T. et al. Smad3 induces chondrogenesis through the activation of SOX9 via CREB-binding protein/p300 recruitment. J. Biol. Chem 280, 8343-8350, (2005)
33. Garcia-Ramirez, M., Toran, N., Andaluz, P., Carrascosa, A. & Audi, L. Vascular endothelial growth factor is expressed in human fetal growth cartilage. J Bone Miner Res 15, 534-540, (2000).
34. Gerber, H. P. et al. VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral bone formation. Nature medicine 5, 623-628, (1999).
35. Furukawa, T., Eyre, D. R., Koide, S. & Glimcher, M. J. Biochemical studies on repair cartilage resurfacing experimental defects in the rabbit knee. J Bone Joint Surg Am 62, 79-89, (1980).
36. L. Danisovic, P. Lesny, V. Havlas, P. Teyssler, Z. Syrova, M. Kopani, G. Fujerikova, T. Trc, E. Sykova, P. Jendelova. Chondrogenic differentiation of human bone marrow and adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. J. Appl. Biomed 5, 139-150, (2007)
37. Havlas V, Kos P, Jendelova P, Lesny P, Trc T, Sykova E. Comparison of chondrogenic differentiation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells with cultured chondrocytes and bone marrow mesenchymal stem cells. Acta Chir. Orthop. Traumatol. Cech 78, 138-144, (2011)
38. K.H. Park, K. Na. Effect of growth factors on chondrogenic differentiation of rabbit mesenchymal cells embedded in injectable hydrogels. J. Biosci. Bioeng 106, 74-79, (2008)
39. Yuan F. Jain RK et al. Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows. Cancer Res 54, 4564-8, (1994)
40. Koike, N. et al. Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels. Nature 428, 138-139, (2004).
41. Takebe, T. et al. Generation of functional human vascular network.
Transplant Proc 44, 1130-1133, (2012).
42. Horvatic, I. et al. Prognostic significance of glomerular and tubulointerstitial morphometry in idiopathic membranous nephropathy. Pathol Res Pract 208, 662-667, (2012).
43. Aruffo, A., Stamenkovic, I., Melnick, M., Underhill, C. B. & Seed, B. CD44 is the principal cell surface receptor for hyaluronate. Cell 61, 1303-1313, (1990).
44. Wang, Y., Kim, U. J., Blasioli, D. J., Kim, H. J. & Kaplan, D. L. In vitro cartilage tissue engineering with 3D porous aqueous-derived silk scaffolds and mesenchymal stem cells. Biomaterials 26, 7082-7094, (2005).
45. NewmanAP. Articular cartilage repair. Am J Sports Med 26, 309-324(1998)
46. Hollander, A. P., Dickinson, S. C. & Kafienah, W. Stem cells and cartilage development: complexities of a simple tissue. Stem Cells 28, 1992-1996, (2010).
47. Langer, R. & Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science 260, 920-926, (1993).
48. Khademhosseini, A., Vacanti, J. P. & Langer, R. Progress in tissue engineering. Sci Am 300, 64-71, (2009).
49. Ding, B. S. et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature 468, 310-315, (2010).
50. Ding, B. S. et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell 147, 539-553, (2011).
51. Lammert, E., Cleaver, O. & Melton, D. Role of endothelial cells in early pancreas and liver development. Mech Dev 120, 59-64, (2003).
52. Matsumoto, K., Yoshitomi, H., Rossant, J. & Zaret, K. S. Liver organogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function. Science 294, 559-563, (2001).
53. Takebe, T. et al. Human elastic cartilage engineering from cartilage progenitor cells using rotating wall vessel bioreactor. Transplant Proc44, 1158-1161, (2012).
実施例1で採取、継代した軟骨膜細胞 3x106 cellsと血管内皮細胞 1x106 cellsを、実施例1と同じ培養条件で、硬さ条件:0.5kPaのゲル(細胞培養用ハイドロゲル 評価用サンプルプレート(VERITAS))上で培養した。初日、培養1日目、2日目の三次元組織形成の状態を図10に示す。
軟骨膜細胞 3x104 cellsと血管内皮細胞 1x104 cellsを、U底形状を有するPrimeSurface 96well細胞培養用培養基材(住友ベークライト)で培養した(図12A)。三次元組織の培養には、軟骨分化誘導培地を用いた。(10 %FBS(GIBCO)、1 % Antibiotic Antimycotic Solution、L-ascorbic acid 2-phosphate(WAKO)、Dexamethasone(SIGMA)、Insulin Growth Factor-I(SIGMA)、basic Fibroblast Growth Factor(科研製薬)を含有するD-MEM/F-12 medium(SIGMA))初日、培養2日目の三次元組織形成の状態を図12Bに示す。播種された軟骨膜細胞は自律的に凝集を開始し、翌日には400μm程度の球状の三次元組織を形成した。これらはピペット操作などで容易に、形状を保ったまま回収が可能であった。
実施例1と同様の方法で、軟骨膜細胞 3x106 cellsと血管内皮細胞 1x106 cellsを、Matrigel(BD)上で共培養することにより形成された4mm大の三次元組織100個を薬匙により回収し、NOD SCIDマウス(三協ラボ)の皮下へ移植を行った。その状態を図13に示す。図13のAは皮下に大量に三次元組織を配置した状態を示し、図13のBは薬匙によって回収を行っている30個程度の三次元組織を示す。
実施例3と同様の方法で、軟骨膜細胞 3x104 cellsと血管内皮細胞 1x104 cellsから形成された400μm大の三次元組織600個を、免疫不全ラット(日本クレア)の関節軟骨表面に作成した3mm大の軟骨欠損部位に移植を行った。その状態を図14に示す。図14のAは関節欠損部位に大量に回収した400μm程度の三次元組織をピペットにより移植操作を行っている状態を示す。図14のBは移植直後の関節欠損部位を示す。移植後20分程度静置し、三次元組織が流れ出ない状態になった後、閉創を行った。
10cmイージーグリップ細胞培養ディッシュ(FALCON)で培養を行った軟骨形成細胞と、ゲル上で血管内皮細胞と共培養を行った軟骨形成細胞の遺伝子発現を、Realtime PCRにより解析を行った。血管内皮細胞との共培養により、未(脱)分化マーカーであるCollagen I遺伝子の発現が減弱し(図15、左)、軟骨分化マーカーであるSOX9とAggrecanの発現が増強した(図15、右)。
軟骨膜細胞 3x106 cellsと血管内皮細胞 1x106 cellsを、Matrigel(BD)上でEndothelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors(EGM)(lonza)で2日間共培養を行うことにより4mm大の三次元組織が形成され、血管構造の形成を認めた。さらにその後、増殖培地( 10 %Fetal Bovine Serum(FBS;GIBCO)、1 %Antibiotic Antimycotic Solution(SIGMA)を添加したDULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM(D-MEM/F-12;SIGMA))、または、軟骨分化誘導培地(10 %FBS(GIBCO)、1 % Antibiotic Antimycotic Solution、L-ascorbic acid 2-phosphate(WAKO)、Dexamethasone(SIGMA)、Insulin Growth Factor-I(SIGMA)、basic Fibroblast Growth Factor(科研製薬)を含有するD-MEM/F-12 medium(SIGMA))で10日程度培養を行うことで、血管構造が消失することが確認された。これらは30日以上の長期にわたって培養を行うことが可能であった。
10%DMSO、5% ethylene glycol、10% sucrose含有増殖培地によるガラス化法による急速凍結法、および、TCプロテクター(大日本住友製薬株式会社)を用いることによる緩慢凍結法、による3次元組織の凍結実験を実施した。
方法
24-well plateに次の複数種類の支持体をゲル化し、固着した。
1.Matrigel原液〜希釈率(16倍希釈まで)。
2.4〜0.5%アガロースゲル。
3.I型コラーゲンゲル(BD Bioscience)。
上記に示す様々な支持体上に、2.0×106cellsの軟骨膜細胞,0.6×106cellsのHUVECの各細胞懸濁液を混合し,遠心分離(950 rpm、4 ℃、5 min)ののちに,回収した細胞をウェルに播種した。30分静置後,EGMを1 ml添加し,3日間培養した。
血管化軟骨作製に用いる支持体条件の検討結果を図16に示す。
A) マトリゲルの希釈率を検討した結果、8倍希釈まで血管化軟骨を作製することが可能であった。
B) アガロースゲルを用いた条件ではいずれの場合においても血管化軟骨の形成を認めなかった。
C) I型コラーゲンを用いた場合においても血管化軟骨の形成を認めなかった。
方法
・血管化軟骨の凍結(図17A)
TC protectorを凍結用tubeに分注(200〜1000ul/tube)した。その後、24-well plateで誘導した三次元組織を浸漬し、4℃にて数時間からover nightしたのちに、-80℃にて緩慢凍結を行った。
なお、急速凍結(ガラス化)法を用いる場合には、10% DMSO, 5% ethylene glycol, 及び 10% sucrose 添加した組織をEGM培地に15〜20分浸したのちに、2M DMSO, 1 M acetamide, 3M propylene glycol添加を行ったDMEM/F12(bFGF, IGF, Dex, Ascorbic Acid, ITS-X, 10%FBS, 1%ABAM)培地(200 ul/tube)に移した。その後直ちに液体窒素に浸し、液体窒素タンクにて保存を行った。
・血管化軟骨の融解(図17B)
・融解を行ったヒト血管化軟骨の皮下移植(図17C)
摘出した組織を、4 %パラホルムアルデヒド(PFA)(Wako)/リン酸緩衝食塩液(PBS)(pH7.4)で4 ℃、2時間固定した。次に、100 mM塩化アンモニウム(Wako)/PBSで4 ℃、10分間、3回洗浄した。そして、15 %スクロース(Wako)/PBSに4 ℃、1 時間浸した後,30%スクロース/PBSで4 ℃、over nightで静置した。O.C.T. Compound(SAKURA Japan)(30 ml)に組織を包埋した。4 ℃、1 時間静置した後、液体窒素で急速凍結し、凍結ブロックを作製した。凍結ブロックをクリオスタットHM 500 O(ZEISS)で5 μmの厚さに薄切し、凍結組織切片を作製した。作製した組織切片は、Alcian Blue染色(武藤化学薬品)、Elastica Van Gieson染色(武藤化学薬品)を行った。
血管化軟骨の凍結工程の様子を図17Aに示す。左;培養皿内で形成された組織、中;薬さじにて回収した様子、右;凍結用溶媒(TC Protector)に回収した組織を浸漬した凍結直前の様子。図17Bは、凍結後、1か月後に融解を行ったヒト血管化軟骨の肉眼観察を示す。図17Cは、融解を行ったヒト血管化軟骨の皮下移植サンプルの組織学的解析を示す。免疫不全マウス背部の皮下へ移植を行ったサンプルの組織学的解析の結果、移植を行ったヒト血管化軟骨は、アルシアンブルーおよびII型コラーゲン抗体によって染色される軟骨基質を含有する軟骨組織を再構築することが明らかとなった。
方法
24-well plateに150 μmのEGMとMatrigelをそれぞれ添加し, インキュベーター内で30分静置した。2.0×106cellsの軟骨膜細胞, 0.6×106cellsのHUVECの各細胞懸濁液を混合し,遠心分離(950 rpm、4 ℃、5 min)を行い,回収した細胞をウェルに播種した。30分静置後, EGMを1 ml添加し, 3日間培養した。誘導した三次元組織を培養ベッセルに播種し,三次元培養用軟骨分化培地(DMEM/F12, Dexamethasone, ascorbic acid 2-phosphate, bFGF, IGF-1, ITS-X, 1% Antibiotic Antimycotic Solution)により,気相条件を37 ℃,CO2濃度5 %に設定したインキュベーター内でRWV bioreactor(Synthecon)により回転培養を行った。回転速度は 7〜12rpmに調整した。60日間の軟骨分化培養の後,5mm〜1cm大の大きさを有する細胞塊を回収し,ピンセット等で用手圧迫を行うことで力学的強度の確認を行った。強度が充分であることを確認のうえ,免疫不全マウスの頭部へと移植した。
図18は、長期培養血管化軟骨の組織学的解析を示す。作製した血管化軟骨を60日間にわたり長期培養することにより、血管を含む軟骨膜組織と血管が排除された軟骨組織の形成を認めた。左上;形成された組織の肉眼像、右上;免疫染色により中心部は軟骨マーカーであるAggrecanを発現し、周囲にはLamininが存在することを示す。下段左;免疫染色拡大図、下段中;HE染色、下段右;アルシアンブルー染色。誘導を行った三次元組織はピンセットで用手圧迫を行っても、組織が破壊されない高い力学的強度を有していた。
Claims (21)
- 0.5〜25 kPaの硬度を有する基材上又はU底形状若しくはV底形状のプレート上で、軟骨細胞、未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞を血管内皮細胞と共培養して、三次元組織の自律的な形成を誘導することを含む、軟骨細胞の調製方法。
- 軟骨細胞、未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞を血管内皮細胞と共培養することで、軟骨細胞、未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞が増幅する請求項1記載の方法。
- 線維芽細胞増殖因子2(bFGF(FGF2))、線維芽細胞増殖因子4(FGF4)、線維芽細胞増殖因子5(FGF5)、骨形成因子2(BMP2)、骨形成因子3(BMP3)、骨形成因子4(BMP4)、骨形成因子6(BMP6)、結合組織増殖因子(CTGF)、トランスフォーミング増殖因子β1(TGF-β1)、トランスフォーミング増殖因子β2(TGF-β2)、トランスフォーミング増殖因子β3(TGF-β3)、インスリン様成長因子1(IGF-1)、肝細胞増殖因子(HGF)、アグリカン(Aggrecan)、ヒアルロン酸(Hyaluronic Acid)、内皮細胞成長因子(ECGF)、内皮細胞増殖因子(ECGS)、内皮細胞由来成長因子(ECDGF)、上皮成長因子(EGF)、酸性繊維芽細胞成長因子(acidic FGF)、マクロファージ由来成長因子(MDGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、腫瘍血管新生因子(TAF)、血管内皮増殖因子(VEGF)ウシ脳抽出液(BBE)、ウシ脳下垂体抽出液(BPE)、糖質コルチコイド、コレステロール、各種ビタミンからなる群より選択される少なくとも1つの成分の存在下で、軟骨細胞、未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞を血管内皮細胞と共培養する請求項1又は2に記載の方法。
- 軟骨細胞、未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞と血管内皮細胞を1:0.3〜1の混合比で共培養する請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 軟骨細胞が、肋骨軟骨、鼻軟骨、耳軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨、環状軟骨、腱、靭帯、関節間軟骨及び椎間板からなる群より選択される組織から得られたものである請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞が、軟骨、軟骨膜、骨髄、胎盤、臍帯、皮膚、筋肉、脂肪及び骨膜からなる群より選択される組織から得られたものである請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- 軟骨細胞、未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞と血管内皮細胞が同じ個体に由来する請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 軟骨細胞、未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞と血管内皮細胞が異なる個体に由来する請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 三次元組織に血管構造が認められる請求項1〜8のいずれかに記載の方法。
- 0.5〜25 kPaの硬度を有する基材上又はU底形状若しくはV底形状のプレート上で、軟骨細胞、未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞を血管内皮細胞と共培養して、自律的に形成された三次元組織を含む、軟骨再生医療用組成物。
- 三次元組織に血管構造が認められる請求項10記載の組成物。
- 生体内に移植し、軟骨組織を形成させるために用いられる請求項10又は11に記載の組成物。
- 生体内に移植した後、血管網が構築される請求項12記載の組成物。
- 血管網に血管潅流が生じる請求項13記載の組成物。
- 血管網が構築された後、消失し、血管構造を欠く軟骨組織が形成される請求項14記載の組成物。
- 0.5〜25 kPaの硬度を有する基材上又はU底形状若しくはV底形状のプレート上で、軟骨細胞、未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞を血管内皮細胞と共培養して、自律的に形成された三次元組織、該三次元組織をヒト以外の動物の生体内に移植して形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、医薬品として有効な薬剤をスクリーニングする方法。
- 三次元組織に血管構造が認められる請求項16記載の方法。
- 0.5〜25 kPaの硬度を有する基材上又はU底形状若しくはV底形状のプレート上で、軟骨細胞、未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞を血管内皮細胞と共培養して、自律的に形成された三次元組織、該三次元組織をヒト以外の動物の生体内に移植して形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、軟骨細胞が産生する基質を調製する方法。
- 三次元組織に血管構造が認められる請求項18記載の方法。
- 0.5〜25 kPaの硬度を有する基材上又はU底形状若しくはV底形状のプレート上で、軟骨細胞、未熟軟骨細胞又は軟骨前駆細胞を血管内皮細胞と共培養して、自律的に形成された三次元組織をヒト以外の動物の生体内に移植し、軟骨組織を形成させることを含む、軟骨再生方法。
- 三次元組織に血管構造が認められる請求項20記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013058534 | 2013-03-21 | ||
JP2013058534 | 2013-03-21 | ||
PCT/JP2014/057673 WO2014148592A1 (ja) | 2013-03-21 | 2014-03-20 | 軟骨細胞の調製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2014148592A1 JPWO2014148592A1 (ja) | 2017-02-16 |
JP6341574B2 true JP6341574B2 (ja) | 2018-06-13 |
Family
ID=51580262
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015506846A Active JP6341574B2 (ja) | 2013-03-21 | 2014-03-20 | 軟骨細胞の調製方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10100274B2 (ja) |
EP (1) | EP2977448B1 (ja) |
JP (1) | JP6341574B2 (ja) |
WO (1) | WO2014148592A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102307115B1 (ko) * | 2021-05-12 | 2021-10-01 | 주식회사 스마트셀랩 | 시프로플록사신에 의한 줄기세포의 연골전구세포로의 유도 및 연골세포로의 분화 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019010003A (ja) * | 2015-11-13 | 2019-01-24 | 協和発酵キリン株式会社 | 軟骨組織塊及びその製造方法、並びに幹細胞から軟骨組織塊を誘導するための培地 |
JP2019010002A (ja) * | 2015-11-13 | 2019-01-24 | 協和発酵キリン株式会社 | 軟骨組織塊及びその製造方法、並びに幹細胞から軟骨組織塊を誘導するための培地 |
US10767164B2 (en) | 2017-03-30 | 2020-09-08 | The Research Foundation For The State University Of New York | Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation |
JP6989828B2 (ja) * | 2017-11-30 | 2022-01-12 | 公立大学法人横浜市立大学 | 細胞塊を集合させる方法及び細胞塊を集合させる装置 |
CN112430564B (zh) * | 2019-08-26 | 2023-09-08 | 上海交通大学医学院附属第九人民医院 | 一种磁控三维细胞培养物调控方法 |
JPWO2021054449A1 (ja) * | 2019-09-18 | 2021-03-25 | ||
US20230167409A1 (en) * | 2020-04-27 | 2023-06-01 | Tokai University Educational System | METHOD FOR CULTURING CELL POPULATION CONTAINING CARTILAGE-DERIVED Tie2-POSITIVE CELLS AND USE OF SAID METHOD |
CN117716021A (zh) * | 2021-08-31 | 2024-03-15 | 公立大学法人横滨市立大学 | 可成型且无需支架的软骨组织的制作方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE414141T1 (de) | 2000-08-09 | 2008-11-15 | Hiroko Yanaga | Verfahren zur kultivierung humaner chondrozyten |
US6852331B2 (en) | 2002-02-11 | 2005-02-08 | Taipei Biotechnology Ltd., Inc. | Fabrication of a cartilage implant |
US20060140914A1 (en) | 2002-10-31 | 2006-06-29 | The General Hospital Corporation | Repairing or replacing tissues or organs |
JP4748222B2 (ja) | 2007-01-23 | 2011-08-17 | 公立大学法人横浜市立大学 | 軟骨細胞調製方法 |
JP5495486B2 (ja) | 2007-10-31 | 2014-05-21 | 恒夫 高橋 | 培養軟骨製造方法および培養軟骨 |
US20090317448A1 (en) | 2008-06-18 | 2009-12-24 | University Of Massachusetts | Tympanic membrane patch |
JP5545563B2 (ja) | 2009-09-08 | 2014-07-09 | 利江 土屋 | 軟骨用移植材 |
JP2012000262A (ja) | 2010-06-17 | 2012-01-05 | Yokohama City Univ | ヒト軟骨細胞と新規足場材料を用いた軟骨組織の製法 |
JP2012031127A (ja) | 2010-08-03 | 2012-02-16 | Nagoya Univ | 臍帯由来間葉系幹細胞を含む組成物 |
-
2014
- 2014-03-20 JP JP2015506846A patent/JP6341574B2/ja active Active
- 2014-03-20 WO PCT/JP2014/057673 patent/WO2014148592A1/ja active Application Filing
- 2014-03-20 EP EP14769212.3A patent/EP2977448B1/en active Active
- 2014-03-20 US US14/778,700 patent/US10100274B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102307115B1 (ko) * | 2021-05-12 | 2021-10-01 | 주식회사 스마트셀랩 | 시프로플록사신에 의한 줄기세포의 연골전구세포로의 유도 및 연골세포로의 분화 |
WO2022239909A1 (ko) * | 2021-05-12 | 2022-11-17 | 주식회사 스마트셀랩 | 시프로플록사신에 의한 줄기세포의 연골전구세포로의 유도 및 연골세포로의 분화 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2977448A1 (en) | 2016-01-27 |
JPWO2014148592A1 (ja) | 2017-02-16 |
US10100274B2 (en) | 2018-10-16 |
US20160046903A1 (en) | 2016-02-18 |
EP2977448A4 (en) | 2016-11-09 |
WO2014148592A1 (ja) | 2014-09-25 |
EP2977448B1 (en) | 2019-07-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6341574B2 (ja) | 軟骨細胞の調製方法 | |
Moshaverinia et al. | Bone regeneration potential of stem cells derived from periodontal ligament or gingival tissue sources encapsulated in RGD-modified alginate scaffold | |
US8192987B2 (en) | Human dental follicle stem cells and methods for obtaining | |
JP4745386B2 (ja) | 組織増加のための分化した未成熟脂肪細胞および生分解性骨格の移植 | |
Wise et al. | Comparison of uncultured marrow mononuclear cells and culture-expanded mesenchymal stem cells in 3D collagen-chitosan microbeads for orthopedic tissue engineering | |
Tavakol et al. | Injectable, scalable 3D tissue-engineered model of marrow hematopoiesis | |
EP3026110A1 (en) | Method for providing vascular system in biological tissue | |
Yeasmin et al. | Stem cells derived from tooth periodontal ligament enhance functional angiogenesis by endothelial cells | |
JP6193214B2 (ja) | 歯髄由来の多能性幹細胞の製造方法 | |
WO2015126528A1 (en) | Biophysically sorted osteoprogenitors from culture expanded bone marrow derived mesenchymal stromal cells (mscs) | |
Black et al. | Characterisation and evaluation of the regenerative capacity of Stro-4+ enriched bone marrow mesenchymal stromal cells using bovine extracellular matrix hydrogel and a novel biocompatible melt electro-written medical-grade polycaprolactone scaffold | |
JP6434014B2 (ja) | 球状軟骨細胞治療剤の製造方法 | |
JP2019505346A (ja) | 3d軟骨オルガノイドブロックを調製するための方法 | |
KR20230125089A (ko) | 단리된 추간판 세포, 사용 방법, 및 포유류 조직으로부터이를 제조하는 방법 | |
Gao et al. | Adipose-derived stem cells embedded in platelet-rich plasma scaffolds improve the texture of skin grafts in a rat full-thickness wound model | |
JP5893562B2 (ja) | 乳動脈由来細胞並びに組織修復及び再生における使用方法 | |
JP7350344B2 (ja) | ヒト誘導万能幹細胞から軟骨細胞のペレットを製造する方法およびその用途 | |
WO2017094879A1 (ja) | 間葉系幹細胞の製造方法 | |
Ghiasi et al. | Use of mesenchymal adult stem cell for cartilage regeneration by hydrogel | |
JP2017079704A (ja) | 血管網被包細胞包埋ビーズ及びその製造方法、並びに前記血管網被包細胞包埋ビーズを用いた集積体及びその製造方法 | |
CN106659560A (zh) | 生殖腺来源的侧群干细胞 | |
CN115305233A (zh) | 大豆苷元与芹菜素复合琼脂糖-胶原蛋白水凝胶三维培养干细胞及细胞外囊泡的制备与用途 | |
JP7228269B2 (ja) | 細胞塊融合法 | |
RU2800991C9 (ru) | Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта | |
RU2800991C2 (ru) | Способ биофабрикации трансплантата в виде клеточных сфероидов для регенеративных технологий восстановления хряща субъекта на основе надхрящницы собственного реберного хряща субъекта и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга этого же субъекта |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20161104 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170912 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20171030 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20171222 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20171222 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180508 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180511 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6341574 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |