WO2014148592A1 - 軟骨細胞の調製方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing chondrocytes.
  • the method of inducing differentiation into chondrocytes under planar culture using an inducer such as cytokine has the following problems. 1. The cost of the reagent required for differentiation induction is high, and enormous costs are generated for differentiation induction. 2. Since a long culture period (2 to 4 months) is required to induce differentiation into chondrocytes, the risk of medical applications such as tumor formation increases. 3. Differentiated chondrocytes are gel-like and it is extremely difficult to control their morphology during transplantation.
  • the method for reconstructing a three-dimensional cartilage tissue using a carrier has the following problems. 1. Since the carrier is a foreign substance in the living body, infection, inflammation, and scar tissue formation resulting from them occur. 2. Since chondrogenic cells are filled or attached to the carrier, an appropriate differentiation process into chondrocytes is not reproduced. 3. Since differentiation induction efficiency into terminally differentiated chondrocytes is low, it is difficult to obtain a uniform and sufficient amount of three-dimensional cartilage tissue.
  • An object of the present invention is to provide a chondrocyte preparation method that enables construction of a cartilage tissue that can solve the above problems.
  • a three-dimensional culture system was established by reproducing the interaction between chondrogenic cells and vascular endothelial cells, which had not been focused on heretofore.
  • the three-dimensional tissue induced in this culture system was able to construct elastic cartilage with higher efficiency than the conventional method (pellet transplantation method) by transplanting to a living body. Focusing on the cell-cell interaction between chondrogenic cells and vascular cells (for example, vascular endothelial cells), there has never been a method for attempting three-dimensional reconstruction of cartilage tissue, and it is a highly novel method. .
  • the gist of the present invention is as follows. (1) A method for preparing chondrocytes, comprising co-culturing chondrogenic cells with vascular cells. (2) The method according to (1), wherein the chondrogenic cells are amplified by co-culturing the chondrogenic cells with vascular cells. (3) The method according to (1) or (2), wherein a three-dimensional tissue is formed by co-culturing chondrogenic cells with vascular cells on a support. (4) The method according to (3), wherein the support is a substrate having a hardness of 0.5 to 25 kPa.
  • chondrogenic cells are any of chondrocytes, immature chondrocytes, cartilage progenitor cells, or cartilage stem cells.
  • Chondrocytes are obtained from a tissue selected from the group consisting of radial cartilage, nasal cartilage, ear cartilage, tracheal cartilage, laryngeal cartilage, thyroid cartilage, arytenoid cartilage, circular cartilage, tendon, ligament, interarticular cartilage and intervertebral disc.
  • the immature chondrocyte, cartilage progenitor cell or cartilage stem cell is obtained from a tissue selected from the group consisting of cartilage, perichondrium, bone marrow, placenta, umbilical cord, skin, muscle, fat and periosteum (8 ) The method described. (11) The method according to any one of (1) to (10), wherein the chondrogenic cells and vascular cells are derived from the same individual. (12) The method according to any one of (1) to (10), wherein the chondrogenic cells and vascular cells are derived from different individuals. (13) A composition for cartilage regenerative medicine comprising chondrocytes prepared by the method according to any one of (1) to (12).
  • a vascular network is constructed after implantation in a living body.
  • vascular perfusion occurs in the vascular network.
  • Chondrocytes are produced using chondrocytes prepared by the method according to any one of (1) to (12), cartilage tissue formed from the chondrocytes and / or cells derived from the cartilage tissue.
  • cartilage progenitor cells were seeded at low density and co-cultured with human umbilical vein endothelial cells by Transwell assay, cartilage progenitor cells proliferated specifically in vascular endothelial cells. The number of cells per unit area after 11 days of co-culture was quantified.
  • Human cartilage progenitor cells were three-dimensionally organized in vitro without the use of scaffold materials or growth factors.
  • Green Human umbilical vein endothelial cells (Normal-Human-Umbilical-Vascular-Endothelial-Cells: HUVEC), Red: Human cartilage progenitor cells (human-cartilage-from-progenitor-cells: hCPCs)
  • B Time course in cartilage progenitor cells co-cultured with HUVEC in in vivo Observation. Macro observation (top), live imaging (bottom) (scale bar; 100 ⁇ m). Vascular invasion occurs early after transplantation, followed by vascular regression.
  • a chondral progenitor cell co-cultured with HUVEC was pelleted on the left brain of the same cranial window mouse, and a chondrogenic progenitor cell was pellet-grafted on the right brain. 15 days after transplantation, it was found that chondrocyte precursor cells co-cultured with HUVEC began to produce proteoglycans earlier. At 30 and 60 days after transplantation, cartilage progenitor cells co-cultured with HUVEC differentiated into mature chondrocytes.
  • Peritoneal membrane cells 3x10 6 cells and vascular endothelial cells 1x10 6 cells, hardness condition First day when cultured on 0.5 kPa gel (hydrogel for cell culture evaluation sample plate (VERITAS)), first day of culture, 2 The state of the three-dimensional tissue formation on the day is shown.
  • the state of three-dimensional tissue formation on the first day and the second day of culture when perichondrial cells 3x10 4 cells and vascular endothelial cells 1x10 4 cells are cultured on a culture substrate having a U-bottom shape is shown.
  • the present invention provides a method for preparing chondrocytes, comprising co-culturing chondrogenic cells with vascular cells.
  • ⁇ chondrogenic cells '' refers to cells that can form cartilage, such as BRACHYURY, KDR, CXCR4, PDGFRA, PDGFRB, CD44, SOX5, SOX6, SOX9, RUNX2, CDH1, Aggrecan, Collagen II, Those expressing markers such as Versican, Elsatin, and CSP are preferred.
  • Chondrogenic cells can be obtained from a variety of sources and are generally isolated from, but not limited to, auricular cartilage or auricular perichondrium. Furthermore, chondrogenic cells can be distinguished into chondrocytes, immature chondrocytes, cartilage progenitor cells or cartilage stem cells. Chondrocytes may be obtained from any cartilage of hyaline cartilage, elastic cartilage, and fibrocartilage. Specifically, radial cartilage, nasal cartilage, auricular cartilage, tracheal cartilage, laryngeal cartilage, thyroid cartilage It is obtained from arytenoid cartilage, circular cartilage, tendon, ligament, interarticular cartilage, intervertebral disc, and the like.
  • chondrocytes in such a dedifferentiated state may be used.
  • Immature chondrocytes, cartilage progenitor cells or cartilage stem cells are obtained from tissues such as cartilage, perichondrium, bone marrow, placenta, umbilical cord, skin, muscle, fat, and periosteum.
  • Chondrogenic cells are preferably derived from humans, but animals other than humans (for example, animals used for laboratory animals, pets, working animals, racehorses, dogs, etc., specifically mice, Rat, rabbit, pig, dog, monkey, cow, horse, sheep, chicken, shark, ray, shark, salmon, shrimp, crab, etc.) may be used.
  • Vascular cells can be isolated from vascular tissue, but are not limited to cells isolated from vascular tissue, and are induced to differentiate from totipotent or pluripotent cells such as iPS cells and ES cells. It may be a thing.
  • vascular cells vascular endothelial cells are preferable.
  • “vascular endothelial cells” are cells that constitute vascular endothelium, or cells that can differentiate into such cells (for example, vascular endothelial progenitor cells, blood vessels). Endothelial stem cells).
  • a cell is a vascular endothelial cell can be confirmed by examining whether a marker protein, for example, TIE2, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, or CD31 is expressed (any of the above-mentioned marker proteins). If one or more are expressed, it can be judged as a vascular endothelial cell). Further, c-kit, Sca-1 and the like have been reported as markers for vascular endothelial progenitor cells, and expression of these markers can be confirmed as vascular endothelial progenitor cells (S Fang, et al. PLOS Biology. 2012; 10 (10): e1001407.).
  • a marker protein for example, TIE2, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, or CD31 is expressed (any of the above-mentioned marker proteins). If one or more are expressed, it can be judged as a vascular endothelial cell). Further, c-kit, Sca-1 and the like have been reported as
  • endothelial cells endothelial cells, umbilical vein endothelial cells, endothelial progenitor cells, endothelial precursor cells, vasculogenic progenitors, hemangioblast (HJ. Joo, et al. Blood. -104. (2011)) is included in the vascular endothelial cells in the present invention.
  • the blood vessel cells are mainly derived from humans, but animals other than humans (for example, animals used for laboratory animals, pet animals, working animals, racehorses, dogs, etc., specifically mice, rats, rabbits).
  • Chondrogenic cells and vascular cells include cells collected from living organisms, cells obtained by primary or subculture of cells collected from living organisms, and established cells, totipotent or pluripotent cells (for example, immature cells) Any cell such as a cell induced to differentiate from a progenitor cell, a stem cell, an iPS cell, an ES cell, etc.) may be used.
  • the chondrogenic cells and the vascular cells may be derived from the same individual or may be derived from different individuals.
  • chondrogenic cells and vascular cells are preferably HLA types that are not immune rejected.
  • chondrogenic cells By co-culturing chondrogenic cells with vascular cells, the interaction between chondrogenic cells and vascular cells leads to a state of pre-chondrocyte (immature chondrocyte) in which chondrogenic cells are destined to cartilage As it changes, cell proliferation is activated.
  • pre-chondrocyte implant chondrocyte
  • chondrocytes prepared by the method of the present invention includes not only fully differentiated chondrocytes, but also immature chondrocytes (Pre-chondrocyte (immature chondrocyte)), cartilage progenitor cells, cartilage stem cells, and mixtures thereof. Etc. are also included. Differentiation into cartilage includes Alcian Blue staining, markers of undifferentiated differentiation (eg, Collagen 1, CD44) expression, cartilage differentiation markers (eg, Sox9, RUNX2, Aggrecan, Collagen II, Versican, Elsatin, This can be confirmed by enhancing expression of CSPG).
  • markers of undifferentiated differentiation eg, Collagen 1, CD44
  • cartilage differentiation markers eg, Sox9, RUNX2, Aggrecan, Collagen II, Versican, Elsatin
  • Chondrogenic cells are amplified by co-culturing chondrogenic cells with vascular cells. (Example 1 described later, FIG. 6) Amplification of cells means that cells self-replicate and proliferate.
  • a three-dimensional tissue can be formed by co-culturing chondrogenic cells with vascular cells.
  • a three-dimensional tissue can be formed by co-culturing chondrogenic cells with vascular cells on a support.
  • the support is preferably a substrate having a hardness of 0.5 to 25 kPa, and examples of such a substrate include gels (for example, stock solutions to 4-fold diluted Matrigel (registered trademark), agarose gels, acrylamide gels, hydrogels). , Collagen gel, urethane gel, etc.), but is not limited thereto.
  • a large three-dimensional structure (that is, a size of about 2 to 3 mm or more) can be formed.
  • a large three-dimensional tissue is suitable for subcutaneous mass implantation.
  • a three-dimensional tissue can also be obtained by co-culturing chondrogenic cells with vascular cells on a plate (eg, U-bottom shape, V-bottom shape, etc.) in which cells are collected on the bottom surface instead of a support such as a gel. Can be formed.
  • a small three-dimensional structure (that is, a size of about several hundred ⁇ m or less) can be formed.
  • Such a small three-dimensional tissue is suitable for transplantation into an articular cartilage defect.
  • FIG. 14 The formation of a three-dimensional tissue was observed in about one day from the start of co-culture of chondrogenic cells and vascular cells. When the culture was further continued (about two days from the start of co-culture), formation of vascular structures was observed in the three-dimensional tissue Thereafter (after about 10 days from the start of co-culture), it has been confirmed that the vascular structure disappears.
  • the medium used for co-culture may be any medium that can maintain chondrogenic cells and vascular cells, but fibroblast growth factor 2 (bFGF (FGF2)), fibroblast growth factor 5 (FGF5 ), Bone morphogenetic factor 2 (BMP2), bone morphogenetic factor 4 (BMP4), bone morphogenetic factor 6 (BMP6), connective tissue growth factor (CTGF), transforming growth factor ⁇ 1 (TGF- ⁇ 1), transforming growth factor ⁇ 2 (TGF- ⁇ 2), transforming growth factor ⁇ 3 (TGF- ⁇ 3), insulin-like growth factor 1 (IGF-1), hepatocyte growth factor (HGF), fibroblast growth factor 4 (FGF4), osteogenic factor 3 (BMP3), aggrecan, hyaluronic acid (Acid), endothelial cell growth factor (ECGF), endothelial cell growth factor (ECGS), endothelial cell growth factor (ECDGF), epidermal growth factor (EGF), acidic fiber Blast growth factor (acidic FGF
  • glucocorticoids include hydrocortisone, cortisone, corticosterone, dexamethasone, triamcinolone, prednisolone and the like.
  • vitamins include vitamin C and the like.
  • Endothelial cell growth factor ECGF
  • endothelial cell growth factor ECGS
  • endothelial cell derived growth factor EGF
  • epidermal growth factor EGF
  • acidic fibroblast growth factor acidic FGF
  • basic fibroblast growth factor BFGF
  • insulin-like growth factor-1 IGF-1
  • macrophage-derived growth factor MDGF
  • platelet-derived growth factor PDGF
  • tumor angiogenesis factor TAF
  • vascular endothelial growth factor VEGF
  • bovine brain extraction Fluid BBE
  • bovine pituitary extract BPE
  • glucocorticoids hydrocortisone, cortisone, corticosterone, dexamethasone, triamcinolone, prednisolone, etc.
  • cholesterol various vitamins, etc. support the survival of vascular cells be able to.
  • the three-dimensional organization does not necessarily require the presence of the protein preparation as described above, and any medium may be used as long as it maintains vascular cells.
  • the differentiation stage of the three-dimensional tissue may be any state such as Pre-chondrocyte (immature chondrocyte) or Mature Chondrocyte.
  • the shape of the three-dimensional structure is usually spherical, but a complicated shape such as an ear may be produced depending on the setting of the substrate, and is not particularly limited.
  • the three-dimensional tissue formed by the method of the present invention can have a high mechanical strength such that the tissue is not destroyed even if manual compression is performed with tweezers or the like.
  • the temperature during the cultivation is not particularly limited, but is preferably 30 to 40 ° C, more preferably 37 ° C.
  • the culture period is not particularly limited, but is preferably 1 to 20 days, more preferably 2 to 3 days.
  • Chondrocytes prepared by the above method (fully differentiated chondrocytes, immature chondrocytes (Pre-chondrocyte (immature chondrocyte)), cartilage progenitor cells, cartilage stem cells, mixtures thereof, etc. may be used. , Which may or may not form a three-dimensional tissue) can be frozen and stored. It can also be used after being frozen and thawed. Therefore, the method for preparing chondrocytes of the present invention may include a step of freezing chondrocytes, and may further include a step of thawing after the step of freezing chondrocytes.
  • the chondrocytes prepared by the method of the present invention can be used for cartilage regenerative medicine. Accordingly, the present invention provides a composition for cartilage regenerative medicine comprising chondrocytes obtained by co-culturing chondrogenic cells with vascular cells.
  • a three-dimensional tissue is formed by co-culture of chondrogenic cells and vascular cells are preferable because they can be transplanted easily. However, even if a three-dimensional tissue is not formed, the cells remain undispersed after transplantation. If it can be stored, it is considered that cartilage can be regenerated. For example, it is considered that transplantation is possible even in a pellet state (a state in which all cells have been sunk by centrifugation).
  • the composition of the present invention can be used for transplanting into a living body to form a cartilage tissue. Therefore, the present invention also provides a cartilage regeneration method including transplanting chondrocytes prepared by the above method into a living body to form a cartilage tissue.
  • animals other than humans for example, animals used for laboratory animals, pets, working animals, racehorses, dogs, etc., specifically, mice, rats, rabbits, pigs, dogs, Monkey, cow, horse, sheep, chicken, shark, ray, shark, salmon, shrimp, crab, etc.).
  • a vascular network can be constructed.
  • Vascular perfusion may occur in the vascular network.
  • chondrogenic cells can be efficiently engrafted.
  • the vascular network After the vascular network is constructed, it can disappear and cartilage tissue lacking vascular structures can be formed.
  • FIGS. 2C, 3 and 4 By starting differentiation induction into chondrocytes, vascular structures are gradually eliminated and terminal differentiation of chondrogenic cells occurs. (Example 1 described later, FIGS. 2C, 3 and 4)
  • the present invention manufactures a therapeutic three-dimensional cartilage device for realizing cartilage regenerative medicine for patients with facial deformation, patients with arthropathy caused by trauma due to aging or sports, etc. Provide technology to do. Compared with current surgical treatments and conventional regenerative medicine techniques, cartilage regenerative medicine having a dramatic clinical therapeutic effect can be implemented.
  • the chondrocytes prepared by the method of the present invention can also be used for screening for drugs effective as pharmaceuticals. According to the present invention, it is possible to reconstruct a disease model three-dimensional cartilage tissue from chondrogenic cells collected from a patient having a cartilage degenerative disease.
  • the reconstructed disease model 3D cartilage tissue is expected to be a drug discovery screening system useful for developing new drugs. Accordingly, the present invention provides a drug effective as a pharmaceutical agent using chondrocytes obtained by co-culturing chondrogenic cells with vascular cells, cartilage tissue formed from the chondrocytes and / or cells derived from the cartilage tissue.
  • a method for screening is provided.
  • an effective drug can be selected by adding a candidate substance to a three-dimensional tissue culture system and examining the presence or absence of promotion of cartilage formation.
  • screening for compounds that suppress the inflammatory response leads to the development of pharmaceuticals effective in the treatment of diseases such as rheumatic diseases and osteoarthritis.
  • an effective drug can be selected by examining whether the production of collagenase and protease (enzyme that dissolves tissue) involved in other joint diseases is suppressed.
  • the test substance to be used in the screening method of the present invention may be any known compound and / or novel compound, a high molecular compound (eg, nucleic acid, sugar, lipid, protein, peptide, etc.) and / or low Either or both of the molecular compounds may be used, and these substances may be naturally derived (for example, natural components derived from microorganisms, animals and plants, marine organisms, etc.), or synthesized (for example, Existing compound libraries, compound libraries prepared using combinatorial chemistry techniques, peptide libraries, virtual libraries, etc.).
  • a high molecular compound eg, nucleic acid, sugar, lipid, protein, peptide, etc.
  • synthetic methods for example, Existing compound libraries, compound libraries prepared using combinatorial chemistry techniques, peptide libraries, virtual libraries, etc.
  • the chondrocytes prepared by the method of the present invention can also be used for production of a matrix produced by chondrocytes.
  • Chondroitin sulfate extracted from animal-derived cartilage tissues such as sharks is widely used as a health functional food.
  • the cartilage tissue artificially reconstructed according to the present invention is a very useful source of cartilage tissue for the efficient production of chondroitin sulfate in the food-related industry. Therefore, the present invention produces chondrocytes using chondrocytes obtained by co-culturing chondrogenic cells with vascular cells, cartilage tissue formed from the chondrocytes and / or cells derived from the cartilage tissue.
  • a method for preparing a substrate is provided.
  • Examples of substrates produced by chondrocytes include chondroitin sulfate, hyaluronic acid, proteoglycan, collagen, elastin, and the like.
  • chondrocytes obtained by co-culturing chondrogenic cells with vascular cells
  • cartilage tissue formed from the chondrocytes and / or cells derived from the cartilage tissue A known method for extracting a substrate from a culture of cells or tissues may be used.
  • Example 1 Creation of elastic cartilage using human cartilage progenitor cells 1. Summary Adult cartilage tissue is a simple organ that lacks blood vessels and nerves, and it is expected that regenerative medicine will be realized earlier than solid organs with complex higher-order structures. Many studies have been reported so far that attempt to induce differentiation of mature chondrocytes using various tissue-derived mesenchymal progenitor cells. However, in the conventional differentiation induction method using a growth factor, the low efficiency of terminal differentiation induction into chondrocytes is a serious unsolved problem.
  • cartilage progenitor cells autonomously construct a three-dimensional tissue in vitro. Furthermore, it has been shown that by using this three-dimensional tissue for transplantation, elastic cartilage can be reconstructed with high efficiency as compared with the conventional pellet transplantation method.
  • This technology is expected to be an elastic cartilage reconstruction technology that is extremely useful in terms of safety and cost because it is not necessary to use growth factors or scaffold materials.
  • congenital malformations of the skull, jaw, and face area will be co-cultured with vascular endothelial cells consistent with the patient's HLA type and cartilage progenitor cells collected and cultured in a minimally invasive manner to induce and transplant 3D organization. It is considered that a new treatment method for tissue deformation caused by injury or trauma can be provided.
  • Human auricular chondrocytes have superiority such as cartilage differentiation ability, but in addition to invasion of the harvested site, there is no self-replicating stem cell, so long-term tissue maintenance due to cell life Is difficult.
  • BrdU Labeling Retaining assay was confirmed by the presence of Label Retaining Cells (LRCs) for one year after only BrdU administered to mice auricular cartilage membrane portion 25, suggested the presence of cartilage precursor cells in perichondrium It was done. Therefore, the human perichondrium, high proliferative capacity, which is a feature of the progenitor cells, revealed that the cell population exists pluripotent, have developed a technique for separating and culturing progenitor cells 26.
  • LRCs Label Retaining Cells
  • FGFs Fibroblast Growth Factors
  • FGFs are by Gospodarowicz et al. In 1974, have been successfully purified from bovine brain extract was discovered as a growth factor that promotes proliferation of fibroblasts during 27, 1977 in the calf cartilage 28. Mutations in the FGFR gene reveal that hereditary osteogenic diseases such as early fusion of the cranial sutures, achondroplasia with shortened limbs, and hypochondral dysplasia 29,30 occur.
  • TGF- ⁇ -mediated Smad2 / 3-mediated signal promotes Sox9 transcriptional activity and regulates complex formation between Sox9 and CBP / p300 in the enhancer region of Co12a1 gene.
  • 32 has been shown to promote early differentiation of the Therefore, the cartilage precursor cells or mesenchymal stem cells to induce cartilage differentiation is believed to be necessary to add a growth factor, such as TGFs and FGFs 33 and 34.
  • the standard method is to induce cartilage differentiation in cartilage progenitor cells by adding two growth factors, insulin-like growth factor-I and basic-FGF.
  • the problem is that the efficiency of cartilage reconstruction is low due to the low survival rate.
  • many studies have been made to induce cartilage differentiation from mesenchymal stem cells 35-38 , but the problem is that the efficiency of cartilage reconstruction is low in any method.
  • cartilage progenitor cells differentiated from undifferentiated mesenchymal cells appear, and after undergoing mesenchymal aggregation, differentiate and mature into chondrocytes to form cartilage tissue.
  • cartilage progenitor cells there are still many unclear points in the physiological differentiation process of cartilage progenitor cells. Therefore, we have clarified physiological differentiation processes that have not been clarified so far, and aimed to establish a highly efficient elastic cartilage creation method by reproducing their interactions.
  • Ketaral was used according to the Drug Management Act. Disinfect the NOD / SCID mouse head with 70% ethanol, cut the skin of the head, remove the periosteum on the surface of the skull with a cotton swab, and then use a dental microdrill (Fine Science Tools) to thin the skull into a circle. And carefully removed. Subsequently, the dura was peeled off using tweezers. When bleeding occurred, hemostasis was performed using Sponzel (Astellas Co.).
  • mice in which no bleeding or inflammation was seen in the surgical site were used for future experiments.
  • mice In order to visualize blood flow in mice, 100 ⁇ l of fluorescein isothiocyanate-conjugated dextran (MW 2,000,000) and tetramethylrhodamine-conjugated dextran (MW 2,000,000) are visualized from the tail vein with a 29 G syringe (Termo). Therefore, 100 ⁇ l of AlexaR647-conjugated mouse-specific CD31 antibody (BD Biosciences Pharmingen) was administered from the tail vein.
  • the tissue was embedded in OCT Compound (SAKURA Japan) (30 ml). After standing at 4 ° C for 1 hour, it was snap frozen with liquid nitrogen to prepare a frozen block. The frozen block was sliced into 5 ⁇ m thickness with cryostat HM 500 O (ZEISS) to prepare frozen tissue sections. The prepared tissue sections were subjected to Alcian Blue staining (Muto Chemical) and Elastica Van Gieson staining (Muto Chemical).
  • OCT® Compound was removed by washing with 1 ⁇ PBS (phosphate-buffered saline), pre-treated with 3% aqueous acetic acid for 3 minutes, and stained with Alcian® blue staining solution for 60 minutes. The staining solution was dropped with 3% aqueous acetic acid, washed with pure water, and then stained with Cologne Echrotroth for 5 minutes. Excess Cologne Echlot funnel was removed with pure water, then dehydrated with an ascending ethanol series and treated with xylene.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • OCT® Compound was removed, pretreated with 1% hydrochloric acid 70% ethanol for 3 minutes, and immersed in Weigert-resorcin fuchsin solution for 60 minutes.
  • the staining solution was dropped with 70% ethanol by 1% hydrochloric acid, and nuclear staining was performed with Weigert's iron hematoxylin solution for 5 minutes.
  • the color was developed with mild hot water, immersed in Wangy-Son solution for 15 minutes, dehydrated in ascending ethanol series, and then transparentized with xylene.
  • the frozen block was sliced into 5 ⁇ m thickness with cryostat HM 500 O (ZEISS) to prepare frozen tissue sections. Wash the prepared tissue section with 0.1% tween-TBS to remove OCT Compound, wipe off the TBS-T around the frozen section, write the object to be stained with a water repellent pen (DAKO), and apply water repellent treatment. did.
  • protein block Serum-Free Ready-to-use (Dako) was used for blocking at 4 ° C. for 24 hours.
  • the primary antibody was reacted overnight at 4 ° C.
  • Primary antibodies include Alexa Fluor647 anti-mouse CD31 (Biolegend) (1: 200), rabbit anti-polyclonal laminin (Dako) (1: 200), mouse anti-mouse / human CD44 (Biolegend) (1: 200), Rabbit Anti-polyclonal Ki67 (Abcam) (1: 200), rabbit anti-human Collagen type I (MONOSAN) (1: 200), mouse anti-chicken Collagen type II (CHEMICON) (1: 200) were used.
  • the provided human auricular elastic cartilage was separated into two layers of perichondrial tissue and cartilage tissue under a stereomicroscope.
  • Standard medium DULBECCO'S MODIFIED EAGLE'S MEDIUM NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM (D-MEM / F-12; added with 10% Fetal Bovine Serum (FBS; GIBCO), 1% Antibiotic Antimycotic Solution (SIGMA)) SIGMA)
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • SIGMA Antibiotic Antimycotic Solution
  • centrifugation (1500 rpm, 4 ° C., 5 min) was performed.
  • Each collected cell was seeded in a 35 mm easy grip cell culture dish (FALCON) or a 60 mm cell culture dish (FALCON). The cells were cultured in an incubator in which the gas phase conditions were set at 37 ° C. and the CO 2 concentration was 5%.
  • the cells were subcultured using Dulbecco's modified Eagle medium and Ham's F-12 medium (D-MEM / F-12; SIGMA) containing 0.2% Collagenase type II (Worthington).
  • D-MEM / F-12 Ham's F-12 medium
  • SIGMA Standard TM medium
  • the collected cells were centrifuged (1500 rpm, 4 ° C., 5 ° min), washed, seeded in a dish, and cultured again. When the dish reached confluence, the same passage operation was performed and the operation was repeated.
  • Viral vectors pGCD ⁇ NsamEGFP and pGCD ⁇ NsamKO were produced by the following method. 293GPG / pGCD ⁇ NsamEGFP cells and 293GPG / pGCD ⁇ NsamKO cells were seeded on a dish coated with poly-L-lysine and cultured using a specially prepared medium (referred to as 293GPG medium).
  • the medium was replaced with a medium (denoted as 293GP medium) from which 293GPG medium was removed Tetracycline hydrochloride, Puromycin, and G418 (referred to as Day 0).
  • Day 0 Tetracycline hydrochloride, Puromycin, and G418
  • the virus was recovered together with the medium from Day 4, and again filled with 293GP medium.
  • the collected medium was filtered through a 0.45 ⁇ m filter and temporarily stored at 4 ° C.
  • the material collected until Day 7 in the above procedure was centrifuged at 6000xg, 4 ° C, 16 hours, 400 ⁇ L of Stempro (invitrogen) was added to the pellet, shaken at 4 ° C for 72 hours, and then collected and stored at -80 ° C . (Indicated as 100-fold concentrated virus solution).
  • Perichondrial cells were seeded at a density of 4.0 ⁇ 10 4 cells / cm 2 and cultured in a growth medium. 24 hours later, Cell Culture Inserts (BD Falcon) in which perichondrial cells and HUVEC were seeded at a density of 4.0 ⁇ 10 4 cells / ml were inserted. After culturing for 12 days, a drop of Nuc Blue Live Cell Stain (Molecular Probes) was added to the medium. After standing for 10 minutes in the incubator, the number of cells was measured by IN Cell analyzer 2000 (GE).
  • GE IN Cell analyzer 2000
  • the standard medium (10% Fetal Bovine Serum (FBS; GIBCO), 1% Antibiotic Antimycotic Solution (SIGMA) added to DULBECCO'S MODIFIED EAGLE'S MEDIUM NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM (D-MEM / F-12; SIGMA)).
  • FBS Fetal Bovine Serum
  • SIGMA Antibiotic Antimycotic Solution
  • Cartilage differentiation induction medium is 10% FBS (GIBCO), 1% Antibiotic Antimycotic Solution, L-ascorbic acid 2-phosphate (WAKO), Dexamethasone (SIGMA), Insulin Growth Factor-I (SIGMA), basic Fibroblast Growth Factor (KAKEN PHARMACEUTICAL) D-MEM / F-12 medium (SIGMA).
  • FBS GAA
  • WAW L-ascorbic acid 2-phosphate
  • SIGMA Dexamethasone
  • SIGMA Insulin Growth Factor-I
  • KAKEN PHARMACEUTICAL D-MEM / F-12 medium
  • EGM and Matrigel were added to a 24-well plate, respectively, and left in an incubator for 30 minutes. Mix each cell suspension of 1.0 ⁇ 10 5 cells / ml perichondrial cells and HUVEC, centrifuge (950 rpm, 4 ° C, 5 min), and seed the collected cells in a well with a small amount of growth medium did. After standing for 5 to 20 minutes, 1 ml of medium without addition of EGF (EGM- ⁇ EGF) (lonza) is added from Endothelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors (EGM), and EGM is changed every day. Cultured for days.
  • EGF- ⁇ EGF EGF- ⁇ EGF
  • EGM Endothelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors
  • chondrocyte progenitor cells differentiated into mature chondrocytes revealed that they were not stained with Alcian Blue staining 10 days after transplantation when blood vessels had invaded, but 30 days after transplantation. Then it was slightly blue. 60 days after transplantation, in which the blood vessels were completely regressed, the cells were stained in dark blue, and it was confirmed that they had differentiated into mature chondrocytes producing proteoglycans.
  • HUVEC built a vascular network 3 days after transplantation and completely regressed 30 days after transplantation. It was confirmed by histological analysis whether the transplanted three-dimensional tissue formed a cartilage tissue, but it was not stained with Alcian Blue staining 3 days after transplantation when blood vessels had invaded, but after transplantation, 15 In the day, a part was stained blue. Thirty days after transplantation after complete regression of blood vessels, a part was stained in dark blue, and 60 days after transplantation, most of the transplanted three-dimensional tissue was stained in dark blue with Alcian Blue ( FIG. 7C).
  • the three-dimensional tissue constructed by co-culturing cartilage progenitor cells and HUVEC formed a cartilage tissue producing proteoglycan.
  • the cartilage was reconstructed by Safranin O staining, and the cartilage formed by Elastica Van Gieson staining was confirmed to be elastic cartilage.
  • Immunohistochemical staining showed that the reconstructed cartilage had perichondrial tissue positive for type I collagen so as to wrap around the aggrecan positive cartilage tissue.
  • immunohistochemical staining of hCD31 showed that vascular endothelial cells were present in the reconstructed perichondrial tissue (FIG. 7D).
  • Comparison with pellet implantation method 44 compares a conventional method of elastic cartilage reconstruction capability, the efficiency of cartilage reconstruction of the three-dimensional tissue constructed by co-culturing cartilage precursor cells and HUVEC with the Conventional Method
  • a pellet was transplanted to the right brain, a three-dimensional tissue constructed by co-culturing cartilage progenitor cells and HUVEC in the left brain of the same cranial window mouse (FIG. 9A).
  • the pellet was not stained blue by Alcian blue staining 10 days after transplantation, but the three-dimensional tissue formed by co-culture was stained blue.
  • cartilage progenitor cells can be efficiently differentiated into mature chondrocytes producing proteoglycans.
  • 30 days after transplantation it was found that the three-dimensional tissue constructed by co-culture formed cartilage tissue producing a large amount of proteoglycan.
  • most of the three-dimensional tissue constructed by co-culture was stained dark blue by Alcian Blue staining, confirming the formation of terminally differentiated mature cartilage tissue.
  • cartilage tissue producing proteoglycan was formed only in a part of the transplanted pellet (FIG. 9A). This indicates that cartilage progenitor cells co-cultured with HUVEC reconstructed cartilage more efficiently.
  • the site stained in blue was extracted from image J, and the area was measured (FIG. 9B).
  • the Alcian blue positive area is approximately 100,000 ⁇ m 2 at 10 days after transplantation, approximately 130,000 ⁇ m 2 at 30 days after transplantation, and 60 days after transplantation. It was about 250,000 ⁇ m 2 .
  • cartilage tissue having an area of about 35,000 ⁇ m 2 on the 10th day after transplantation, about 20,000 ⁇ m 2 on the 30th day after transplantation, and about 80,000 ⁇ m 2 on the 60th day after transplantation was formed.
  • the comparison shows that the three-dimensional tissue constructed by co-culture formed cartilage tissue of 2.85 times 10 days after transplantation, 6.5 times 30 days after transplantation, and 3.27 times area 60 days after transplantation. (FIG. 9C).
  • Cartilage tissue is a supporting organ consisting of chondrocytes and the extracellular matrix that surrounds them. Unlike other supporting tissues such as connective tissue and bone tissue, there are no blood vessels, lymph vessels, nerves, etc. in the interstitium of cartilage tissue 45,46 . Therefore, compared such a solid organ having a complex higher-order structure, an area where early realization of regenerative medicine are expected 47,48. In this study, we found that blood vessels that had previously been considered unnecessary were temporarily invaded during the differentiation stage of cartilage progenitor cells by tracking the cartilage formation process using live imaging. Since the transplanted early auricular cartilage swelled immediately after the invasion of blood vessels, it is considered that the cartilage progenitor cells proliferated rapidly.
  • this technology which can construct cartilage tissue from cartilage progenitor cells without using growth factors by co-culturing with vascular endothelial cells, has the potential to be a useful technology for clinical application. .
  • cartilage progenitor cells can autonomously induce three-dimensional tissues in vitro without using scaffold materials. Since this three-dimensional tissue has mechanical strength and can be transplanted without breaking the shape, it is considered that the shape can be easily controlled at the time of transplantation.
  • HLA-compatible vascular endothelial cells in addition to self-cartilage.
  • HLA works as an important molecule involved in human immunity. If you receive a cell or organ transplant from a person with an HLA type different from your own, immune rejection occurs, so it is necessary to match the HLA type as much as possible. Therefore, it is necessary to establish a vascular endothelial cell bank that collects, cultures and stores vascular endothelial cells from the umbilical cord.
  • the umbilical cord is a biological resource that has been discarded so far, but it is considered that the vascular endothelial cells can be stably supplied by realizing the preservation like the umbilical cord blood.
  • vascular endothelial cells can be stably supplied by realizing the preservation like the umbilical cord blood.
  • causes congenital malformations or trauma in the skull, jaw, or face area by co-cultured with vascular endothelial cells consistent with the patient's HLA type and cartilage progenitor cells collected and cultured in a minimally invasive manner. It is considered that a new treatment method for tissue deformation can be provided.
  • a three-dimensional culture method that has been attracting attention includes a culture method that simulates a microgravity environment by using a rotating incubator called a Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor.
  • RWV Rotating Wall Vessel
  • the results remained problematic with respect to the strength aspect of the cartilage-like tissue. Therefore, by combining RWV with a unique approach to reproduce the vascularization that occurs in the cartilage formation process, in vitro induction of terminal cartilage differentiation, which was difficult to achieve with conventional culture techniques, is expected.
  • cartilage progenitor cells present in the auricular perichondrium have the ability to differentiate into hyaline cartilage, a heterologous cartilage tissue, and that they can be used to reconstruct articular cartilage tissue (unpublished data) . Since this technique efficiently creates cartilage by reproducing transient blood vessel invasion, it is possible to solve the problem of poor efficiency of cartilage reconstruction after transplantation in regenerative treatment of articular cartilage defects .
  • the cartilage tissue does not have a healing ability and thus progresses to secondary degenerative diseases such as arthritis and knee osteoarthritis.
  • Japan alone there are estimates that there are 25.3 million knee osteoarthritis patients, and the number of patients to be treated is considerable.
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  • Example 2 Cultivation on gels with different hardness
  • the perichondrial cells 3x10 6 cells and the vascular endothelial cells 1x10 6 cells collected and passaged in Example 1 were used under the same culture conditions as in Example 1 : Cultured on 0.5 kPa gel (sample plate for hydrogel evaluation for cell culture (VERITAS)).
  • FIG. 10 shows the state of three-dimensional tissue formation on the first day, the first day of culture, and the second day of culture.
  • FIG. 1 An evaluation sample plate (VERITAS) was used to seed cells under various hardness conditions from 0.2 kPa to 50 kPa. The result is shown in FIG. As a normal culture dish, a 10 cm easy grip cell culture dish (FALCON) was used.
  • FALCON 10 cm easy grip cell culture dish
  • the perichondrial cells formed a good three-dimensional tissue that could withstand the transplantation operation.
  • a normal culture dish was used, a three-dimensional tissue was not formed.
  • FIG. 12B shows the state of three-dimensional tissue formation on the first day of D-MEM / F-12 medium (SIGMA) and the second day of culture.
  • the seeded perichondrial cells started to aggregate autonomously and formed a spherical three-dimensional tissue of about 400 ⁇ m on the next day. These could be easily recovered while maintaining the shape by pipetting.
  • Example 4 Subcutaneous mass transplantation In the same manner as in Example 1, 4 mm size formed by co-culturing perichondrial cells 3x10 6 cells and vascular endothelial cells 1x10 6 cells on Matrigel (BD) 100 three-dimensional tissues were collected with a drug cage and transplanted subcutaneously into NOD SCID mice (Sankyo Lab). The state is shown in FIG. A in FIG. 13 shows a state in which a large amount of three-dimensional tissue is placed under the skin, and B in FIG. 13 shows about 30 three-dimensional tissues that are being collected by a cartridge case.
  • BD vascular endothelial cells
  • Example 5 the same method as transplant Example 3 to articular cartilage defect, the 600 three-dimensional tissue of 400 ⁇ m size which are formed from the perichondrium cells 3x10 4 cells and vascular endothelial cells 1x10 4 cells, immunodeficiency Transplantation was performed on a 3 mm-sized cartilage defect site created on the articular cartilage surface of a rat (CLEA Japan).
  • the state is shown in FIG.
  • FIG. 14A shows a state where a three-dimensional tissue of about 400 ⁇ m collected in large quantities at a joint defect site is being transplanted with a pipette.
  • FIG. 14B shows the joint defect site immediately after transplantation. After leaving the implant for about 20 minutes, the wound was closed after the three-dimensional tissue did not flow out.
  • Chondrogenic cells enhance the expression of differentiation markers by co-culture with vascular endothelial cells Chondrogenic cells cultured in 10 cm Easy Grip Cell Culture Dish (FALCON), and vascular endothelial cells on gel The gene expression of the chondrogenic cells co-cultured with was analyzed by Realtime PCR. Co-culture with vascular endothelial cells attenuated the expression of the collagen I gene, an un (de) differentiated marker (FIG. 15, left), and enhanced the expression of the cartilage differentiation markers SOX9 and Aggrecan (FIG. 15, right) ).
  • Example 7 Long-term culture in vitro Perichondrial cells 3x10 6 cells and vascular endothelial cells 1x10 6 cells were co-cultured on Matrigel (BD) for 2 days in Endothelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors (EGM) (lonza) As a result, a 4 mm large three-dimensional tissue was formed, and the formation of vascular structures was observed.
  • EMM Endothelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors
  • Further growth medium (DULBECCO'S MODIFIED EAGLE'S MEDIUM NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM (D-MEM / F-12; SIGMA)) supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS; GIBCO) and 1% Antibiotic Antimycotic Solution (SIGMA) Or cartilage differentiation induction medium (10% FBS (GIBCO), 1% Antibiotic Antimycotic Solution, L-ascorbic acid 2-phosphate (WAKO), Dexamethasone (SIGMA), Insulin Growth Factor-I (SIGMA), basic Fibroblast Growth Factor It was confirmed that the blood vessel structure disappeared by culturing in D-MEM / F-12 medium (SIGMA) containing (KAKEN PHARMACEUTICAL) for about 10 days. These could be cultured for a long period of 30 days or longer.
  • Example 8 Freezing of three-dimensional tissues by rapid freezing method by vitrification method using growth medium containing 10% DMSO, 5% ethylene glycol and 10% sucrose, and slow freezing method by using TC protector (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) Experiments were performed.
  • FIG. 16 shows the results of examination of the support conditions used for producing vascularized cartilage.
  • FIG. 17 Creation of human mature cartilage by vascularized cartilage transplantation that was cryopreserved
  • FIG. 17A Method -Freezing vascularized cartilage
  • the TC protector was dispensed into a freezing tube (200-1000 ul / tube). Thereafter, the three-dimensional structure induced by the 24-well plate was immersed and over night at 4 ° C. for several hours, and then slowly frozen at ⁇ 80 ° C.
  • the tissue added with 10% DMSO, 5% ethylene glycol, and 10% sucrose is immersed in EGM medium for 15 to 20 minutes, and then 2M DMSO, 1 M acetate.
  • the frozen tissue was transferred from ⁇ 80 ° C. to 37 ° C. water bath, thawed, and transferred to a 15 ml centrifuge tube. 4 ° C., 750 rpm, 3 min. After centrifugation, the supernatant was removed with a pipetman or the like. (The aspirator sucked the tissue and was not used.) After PBS washes (5 ml / tube), centrifuge again at 4 ° C., 1500 rpm, 5 min, and remove the supernatant (by pipetteman etc.) After that, it was used for transplantation or culture experiments. -Subcutaneous transplantation of thawed human vascularized cartilage (Figure 17C)
  • mice Six-week-old female NOD / SCID (immune deficient) mice were purchased from Sankyo Lab Service Co., Ltd. The purchased mice were bred and maintained in the Animal Experiment Center, Joint Research Support Department, Advanced Research Center for Medical Science, Yokohama City University. Animal experiments using these mice were conducted in accordance with the guidelines for animal experiments at Yokohama City University Fukuura Campus. After shaving the immunodeficient mouse, the subcutaneous part of the back or the subcutaneous part of the face was incised and removed, and the collected tissue was implanted and transplanted.
  • the excised tissue was fixed with 4% paraformaldehyde (PFA) (Wako) / phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.4) at 4 ° C. for 2 hours. Next, it was washed with 100 mM ammonium chloride (Wako) / PBS three times at 4 ° C. for 10 minutes. Then, the sample was immersed in 15% sucrose (Wako) / PBS at 4 ° C. for 1 hour and then allowed to stand still at 30 ° C. in 4% at 30 ° C./PBS. The tissue was embedded in OCT Compound (SAKURA Japan) (30 ml).
  • PFA paraformaldehyde
  • PBS phosphate buffered saline
  • the frozen block was sliced into 5 ⁇ m thickness with cryostat HM 500 O (ZEISS) to prepare frozen tissue sections.
  • the prepared tissue sections were subjected to Alcian Blue staining (Muto Chemical) and Elastica Van Gieson staining (Muto Chemical).
  • frozen blocks were sliced into 5 ⁇ m thick with cryostat HM 500 O (ZEISS) to prepare frozen tissue sections. Wash the prepared tissue section with 0.1% tween-TBS to remove OCT Compound, wipe off the TBS-T around the frozen section, write the object to be stained with a water repellent pen (DAKO), and apply water repellent treatment. did. Next, blocking was performed at 4 ° C. for 24 hours using protein block serum-free ready-to-use (Dako). The primary antibody was reacted overnight at 4 ° C. After the treatment, it was washed with TBS-T three times for 5 minutes, a secondary antibody was added dropwise, and the mixture was reacted at room temperature for 2 hours.
  • DAKO water repellent pen
  • FIG. 17A The state of the freezing step of vascularized cartilage is shown in FIG. 17A. Left: Tissue formed in the culture dish, middle: Recovered with a spoon, right: Immediately before freezing the tissue recovered in the freezing solvent (TC Protector).
  • FIG. 17B shows a macroscopic observation of human vascularized cartilage that has been thawed one month after freezing.
  • FIG. 17C shows histological analysis of a subcutaneously transplanted sample of human vascularized cartilage that has been thawed.
  • the transplanted human vascularized cartilage is a cartilage tissue containing a cartilage matrix stained with Alcian blue and type II collagen antibody. It became clear to rebuild.
  • Example 11 Long-term culture of vascularized cartilage (FIGS. 18 and 19) Method 150 ⁇ m EGM and Matrigel were added to each 24-well plate, and left in an incubator for 30 minutes. Each cell suspension of 2.0 ⁇ 10 6 cells perichondrocytes and 0.6 ⁇ 10 6 cells HUVEC is mixed, centrifuged (950 rpm, 4 ° C., 5 min), and the recovered cells are collected. Wells were seeded. After standing for 30 minutes, 1 ml of EGM was added and cultured for 3 days.
  • the induced three-dimensional tissue was seeded in a culture vessel, and a three-dimensional culture cartilage differentiation medium (DMEM / F12, Dexamethasone, ascorbic acid 2-phosphate, bFGF, IGF-1, ITS-X, 1% Antibiotic Solution)
  • Rotational culture was performed by RWV bioreactor (Synthecon) in an incubator where the gas phase conditions were 37 ° C. and the CO 2 concentration was 5%. The rotation speed was adjusted to 7-12 rpm.
  • the cell mass having a size of 5 mm to 1 cm was collected, and mechanical strength was confirmed by manual compression with tweezers. After confirming that the strength was sufficient, it was transplanted to the head of an immunodeficient mouse.
  • FIG. 18 shows histological analysis of long-term cultured vascularized cartilage.
  • FIG. 19 shows transplantation of matured cartilage derived from vascularized cartilage subjected to long-term culture.
  • Long-term cultured vascularized cartilage (shown in the lower left small window in the upper left figure) was a cartilage tissue having mechanical strength capable of withstanding subcutaneous tension by transplantation of the face.
  • the upper and lower photos show how the swelled parts look at different angles.
  • the present invention can be used for regenerative medicine, drug screening, production of a matrix produced by chondrocytes, and the like.

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Abstract

　従来法が抱えている問題を解決できる、軟骨組織の構築を可能とする軟骨細胞の調製方法を提供する。　軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することを含む、軟骨細胞の調製方法。前記方法により調製された軟骨細胞を含む、軟骨再生医療用組成物。前記方法により調製された軟骨細胞、該軟骨細胞から形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、医薬品として有効な薬剤をスクリーニングする方法。前記方法により調製された軟骨細胞、該軟骨細胞から形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、軟骨細胞が産生する基質を調製する方法。前記方法により調製された軟骨細胞を生体内に移植し、軟骨組織を形成させることを含む、軟骨再生方法。

Description

軟骨細胞の調製方法
　本発明は、軟骨細胞の調製方法に関する。
　ヒト軟骨組織は、先天的に欠損していたり、後天的に損傷あるいは欠損すると、通常は再生されない。このようなヒト軟骨疾患に対する従来の治療としては、自己の他部位から軟骨組織を採取し欠損部位に移植する方法があるが、採取部位や量が限定されてしまうことが問題であった。そこで、本発明者らは過去に、自己の軟骨膜に由来する軟骨形成細胞を一部採取して生体外で拡大培養した後、サイトカインなどの誘導因子を添加することにより平面培養下で軟骨細胞へと分化誘導を行う方法を開発した（特許文献１、非特許文献１）。
　一方、軟骨組織の修復を目的とした３次元軟骨組織を作成する手段としては、培養軟骨形成細胞を多数の孔を有する生体適合性足場材等の担体に充填・付着させ、移植材を形成する方法が知られている（特許文献２～５）。
特許第４７４８２２２号 特開2012-000262公報 特開2011-078710公報 特開2009-226221公報 特開2009-106214公報
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　１０８：１４４７９-１４４８４，２０１１
　サイトカインなどの誘導因子により平面培養下で軟骨細胞へ分化誘導を行う方法には、以下のような問題点があった。
１．分化誘導に必要な試薬のコストが高額で、分化誘導に莫大な費用が生じる。
２．軟骨細胞への分化誘導までに長期間（２～４ヶ月の）の培養期間を要するために、腫瘍形成など医療応用上のリスクが高まる。
３．分化誘導された軟骨細胞はゲル状であり、移植時に形態を制御することが著しく困難である。
　担体を用いて３次元軟骨組織再構築を行う方法には、以下のような問題点があった。
１．担体が生体にとり異物であることから、感染や炎症、それらに起因する瘢痕組織形成などが生じる。
２．軟骨形成細胞を担体に充填ないし付着させるため、軟骨細胞への適切な分化プロセスが再現されない。
３．終末分化した軟骨細胞への分化誘導効率が低いために、均一で、充分な量の３次元軟骨組織を得ることが困難である。
　本発明は、以上の問題を解決できる軟骨組織の構築を可能とする、軟骨細胞の調製方法を提供することを目的とする。
　成体軟骨組織には血管が存在しないため、従来の軟骨再生医療の開発概念において、血管は不要と考えられてきた。しかし、軟骨発生の初期段階においては、一過性に血管化が生じ、軟骨形成細胞が血管系細胞と秩序だった空間的配置をとることが重要であり、これにより血管内皮細胞との協調的な相互作用が生じ、軟骨形成細胞の増殖と分化が誘導され、最終的に血管構造を欠く軟骨組織が形成されることを本発明者らは見出した。
　そこで、従来全く着目されなかった軟骨形成細胞と血管内皮細胞との相互作用を再現化することによる３次元培養系を確立した。この培養系で誘導された三次元組織は生体への移植により、従来法（ペレット移植法）より、高効率に弾性軟骨を構築することができた。軟骨形成細胞と血管細胞（例えば、血管内皮細胞）の細胞間相互作用に注目し、軟骨組織の３次元的な再構築を試みる手法は過去には存在せず、新規性の極めて高い方法である。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することを含む、軟骨細胞の調製方法。
（２）軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することで、軟骨形成細胞が増幅する（１）記載の方法。
（３）支持体上で軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより、三次元組織が形成される（１）又は（２）記載の方法。
（４）支持体が0.5～25 kPaの硬度を有する基材である（３）記載の方法。
（５）底面に細胞が集まるような形状のプレート上で軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより、三次元組織が形成される（１）又は（２）記載の方法。
（６）線維芽細胞増殖因子2（bFGF（FGF2））、線維芽細胞増殖因子4（FGF4）、線維芽細胞増殖因子5（FGF5）、骨形成因子2（BMP2）、骨形成因子3（BMP3）、骨形成因子4（BMP4）、骨形成因子6（BMP6）、結合組織増殖因子（CTGF）、トランスフォーミング増殖因子β1（TGF-β1）、トランスフォーミング増殖因子β2（TGF-β2）、トランスフォーミング増殖因子β3（TGF-β3）、インスリン様成長因子1（IGF-1）、肝細胞増殖因子（HGF）、アグリカン（Aggrecan）、ヒアルロン酸（Hyaluronic Acid）、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＳ）、内皮細胞由来成長因子（ＥＣＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞成長因子（acidic ＦＧＦ）、マクロファージ由来成長因子（ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（ＴＡＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ウシ脳抽出液（ＢＢＥ）、ウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）、糖質コルチコイド、コレステロール、各種ビタミンからなる群より選択される少なくとも１つの成分の存在下で、軟骨形成細胞を血管細胞と共培養する（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）軟骨形成細胞と血管細胞を１：０．３～１の混合比で共培養する（１）～（６）のいずれかに記載の方法。
（８）軟骨形成細胞が、軟骨細胞、未熟軟骨細胞、軟骨前駆細胞又は軟骨幹細胞のいずれかである（１）～（７）のいずれかに記載の方法。
（９）軟骨細胞が、肋骨軟骨、鼻軟骨、耳軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨、環状軟骨、腱、靭帯、関節間軟骨及び椎間板からなる群より選択される組織から得られたものである（８）記載の方法。
（１０）未熟軟骨細胞、軟骨前駆細胞又は軟骨幹細胞が、軟骨、軟骨膜、骨髄、胎盤、臍帯、皮膚、筋肉、脂肪及び骨膜からなる群より選択される組織から得られたものである（８）記載の方法。
（１１）軟骨形成細胞と血管細胞が同じ個体に由来する（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）軟骨形成細胞と血管細胞が異なる個体に由来する（１）～（１０）のいずれかに記載の方法。
（１３）（１）～（１２）のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞を含む、軟骨再生医療用組成物。
（１４）生体内に移植し、軟骨組織を形成させるために用いられる（１３）記載の組成物。
（１５）生体内に移植した後、血管網が構築される（１４）記載の組成物。
（１６）血管網に血管潅流が生じる（１５）記載の組成物。
（１７）血管網が構築された後、消失し、血管構造を欠く軟骨組織が形成される（１６）記載の組成物。
（１８）（１）～（１２）のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞、該軟骨細胞から形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、医薬品として有効な薬剤をスクリーニングする方法。
（１９）（１）～（１２）のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞、該軟骨細胞から形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、軟骨細胞が産生する基質を調製する方法。
（２０）（１）～（１２）のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞を生体内に移植し、軟骨組織を形成させることを含む、軟骨再生方法。
１．既に開発されている軟骨膜に由来する幹細胞の操作技術（例えば、特許第４７４８２２２号）と連動することで、高品質な３次元軟骨を大量創出する上で有用な技術となる。
２．サイトカインなど分化誘導に必要な誘導因子を低減することができ、莫大なコスト削減につながる。
３．軟骨形成細胞の分化誘導に必要な培養期間を短縮することができる。
４．培養時に一定の強度を有した３次元組織が形成されるため、移植直後も形状を保ったまま移植することが可能となる。したがって、移植後に得られる３次元組織の形状予測が一定程度可能となる。
５．軟骨形成細胞の移植生着効率・終末分化誘導効率が高いために、少ない細胞数でも効率的に３次元軟骨を形成することができる。
６．高分子ポリマーなどの足場材料が不要なため、炎症や吸収が生じない。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2013‐58534の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
ヒト耳介軟骨膜中に存在する軟骨前駆細胞の同定。A)小耳症患者から摘出した残存耳介軟骨を軟骨膜層、軟骨層に分離した。B)ヒト軟骨前駆細胞はCD44+,CD90+のマーカーを発現しており、前駆細胞の特徴である高い増殖能、多分化能を有し、さらに移植することで、ヒト弾性軟骨組織を長期的に再構築した。 クラニアルウインドウ法を用いた軟骨形成プロセスの追尾定点観察。A)ヒト耳介軟骨の軟骨膜層に血管内皮細胞が存在した。B)E17.5のEGFP遺伝子改変マウスの耳介軟骨をクラニアルウインドウ内に移植した時の肉眼観察。C)共焦点顕微鏡による追尾定点観察。マウスの尾静脈にtetramethylrhodamine-conjugated dextranとAlexa647-conjugated mouse specific CD31 (mCD31) antibody を注入することでマウスの血管内皮細胞と血流を可視化したところ、移植後3日に、血流を有した血管が移植片に侵入していることが確認できた。これらの血管は移植後10日には、退行した。(スケールバー; 75 μm)D)移植後20日に、軟骨組織を包むように血管を有している軟骨膜組織が形成され、軟骨組織を構成する細胞は敷石状の形態を示した。E)P10、P30の発生段階の耳介軟骨組織と同様に、E17.5のEGFP遺伝子改変マウスの耳介軟骨組織は、成熟した弾性軟骨を形成したことが確認された(スケールバー; 100 μm)。 発生初期のマウス耳介軟骨における一過性血管侵入。A)E18.5からP30の発生段階の耳介軟骨でmCD31（緑）とlaminins（赤）により免疫組織化学染色を行った。（両矢印は軟骨層を示す。スケールバー； 50μm）P2の段階で最も多くの内皮細胞を確認できた。一方で、P30の段階では全く観察することは出来なかった。B)軟骨前駆細胞と最も近い血管の平均距離を定量したところ、生後2日で最も短い距離（17.8 μm）を計測した。データは、少なくとも独立した3検体以上から得たmean±s.d.を表記した（200個以上の細胞を計測した。）。 ヒト軟骨再構築過程での一過性血管侵入。A)従来の軟骨分化誘導法を施した軟骨前駆細胞をクラニアルウインドウ内に移植した。B)ライブイメージングより、移植後10日と30日に血液灌流が確認された。移植後60日には、血管が退行した。成熟軟骨層は、Alcian Blue染色により確認した(スケールバー; 100 μm)。 発生初期の耳介軟骨における軟骨前駆細胞の著しい増殖。A)P0、P2、P10とP30の発生段階の耳介軟骨で、CD44陽性である軟骨前駆細胞の増殖をKi67により確認した。P0、P2において、軟骨前駆細胞がより増殖していた。一方で、P30では、Ki67陽性細胞は観察出来なかった(スケールバー; 100 μm, N.D: Not Detected) B)軟骨層におけるKi67陽性である増殖中の細胞数を定量した。 データは、少なくとも独立した5検体以上から得たmean±s.d.を表記した。 血管内皮細胞と共培養することによる、in vitroでの軟骨前駆細胞の増殖亢進。A)軟骨前駆細胞を低密度で播種し、Transwell assayによりヒト臍帯静脈内皮細胞と共培養を行ったところ、血管内皮細胞特異的に軟骨前駆細胞が増殖した。共培養11日後の単位面積当たりの細胞数を定量した。データは、少なくとも独立した検体から得たmean±s.d.を表記した(N=5, **: P < 0.01、Ctrl: Control, HUVEC: Normal Human Umbilical Vascular Endothelial Cells , MSC: mesenchymal stem cells, Fibro: dermal　fibroblasts, Chon: chondrocytes)B)ヒト軟骨前駆細胞が有する細胞表面マーカーであるCD44+ CD90+の発現をフローサイトメトリーにより解析した。 血管内皮細胞との共培養によるヒト軟骨前駆細胞の自律的な三次元組織化。A)軟骨発生初期過程を再現することによる新規三次元培養系の開発。ヒト軟骨前駆細胞が、in vitroにおいて、足場材料や成長因子を使うことなく三次元組織化した。（緑：ヒト臍帯静脈内皮細胞(Normal Human Umbilical Vascular Endothelial Cells: HUVEC)、赤：ヒト軟骨前駆細胞（ human cartilage from progenitor cells：hCPCs））B)HUVECと共培養した軟骨前駆細胞のin vivoにおける経時的観察。マクロ観察（上）、ライブイメージング（下）(スケールバー; 100 μm)。移植後早期に血管侵入が起き、続いて血管退行が起きている。C)HUVECと共培養した軟骨前駆細胞を移植して3、15、30、60日後でのAlcian Blue染色 (スケールバー; 200 μm)D)Safranin O(左)、Elastica Van Gieson（左から二番目）より、HUVECと共培養した軟骨前駆細胞は、移植することで弾性軟骨組織を形成したことが示された。また、Aggrecan（緑）とＩ型コラーゲン（赤）による免疫組織化学染色（右から二番目）を行ったところ、軟骨膜層と軟骨層の両方を形成したことが示された。hCD31の免疫組織化学染色（右）により、軟骨膜層に内皮細胞が存在していることが示された。(スケールバー; 100 μm)E)同様の三次元培養系を用いて、脱分化している軟骨細胞とHUVECを共培養した。Alcian Blue染色(左から二番目)、Elastica Van Gieson染色（右）により弾性軟骨組織が形成したことが確認できた。(スケールバー; 100 μm) 血流阻害移植モデルを用いたヒト弾性軟骨形成の阻害。A)血流阻害移植モデル作製のスキーム。HUVECと共培養した軟骨前駆細胞をクラニアルウインドウに移植し、0.45 μmのポアサイズのナノメッシュ間に挟みこむことで、マウスの血流が移植片に作用しないようにした。B)移植0日から15日までをマクロ観察したところ、移植片への血液灌流を完全に阻害した。C)ライブイメージングにより観察したところ、軟骨前駆細胞は生着しなかったことが確認された。下の画像は、上の画像の強倍率を示している。D)血流阻害移植モデル（上）と通常に移植したモデル（下）で、Caspase 3とII型コラーゲンにより免疫組織化学染色を行った。 (スケールバー; 200 μm) 血管内皮細胞との共培養により構築した三次元組織の高効率な弾性軟骨創出。A)同一のクラニアルウインドウマウスの左脳にHUVECと共培養した軟骨前駆細胞、右脳に軟骨前駆細胞をペレット移植した。移植後15日で、HUVECと共培養した軟骨前駆細胞の方がより早くプロテオグリカンを産生し始めていることがわかった。移植後30、60日で、HUVECと共培養した軟骨前駆細胞では、成熟した軟骨細胞に分化した。(スケールバー; 200 μm)B)移植60日後の、HUVECと共培養した軟骨前駆細胞とペレット移植のアルシアンブルー陽性である最大割面領域の比較と、青色に染色されている部位の抽出画像。Image Jにより、色の抽出を行った。C)アルシアンブルー陽性領域を定量した。データは、少なくとも独立した検体から得たmean±s.d.を表記した(N=4, *: P < 0.05) 。 軟骨膜細胞 3x106 cellsと血管内皮細胞 1x106 cellsを硬さ条件：0.5kPaのゲル（細胞培養用ハイドロゲル　評価用サンプルプレート（VERITAS））上で培養したときの初日、培養1日目、2日目の三次元組織形成の状態を示す。 軟骨膜細胞 3x106 cellsと血管内皮細胞 1x106 cellsを硬さ条件：0.2-50kPaのゲル（細胞培養用ハイドロゲル　評価用サンプルプレート（VERITAS））上で培養したときの培養2日目の三次元組織形成の状態を示す。下段の右は通常の培養皿上で同様の培養条件で培養を行ったときの状態（三次元組織は形成されなかった）を示す。 軟骨膜細胞 3x104 cellsと血管内皮細胞 1x104 cellsを、U底形状を有する培養基材で培養したときの初日、培養2日目の三次元組織形成の状態を示す。A) U底形状を有する96well細胞培養用培養基材（住友ベークライト）の外観。右上のパネルは１つのwellの拡大像を示す。B) 播種された軟骨膜細胞は自律的に凝集を開始し、翌日には400μm程度の球状の三次元組織を形成した。 軟骨膜細胞 3x106 cellsと血管内皮細胞 1x106 cellsを共培養することにより形成された4mm大の三次元組織100個を、皮下へ移植を行った状態を示す。A）皮下に大量に三次元組織を配置した状態。B) 薬匙によって回収を行っている３０個程度の三次元組織を示す。 軟骨膜細胞 3x104 cellsと血管内皮細胞 1x104 cellsから形成された400μm大の三次元組織600個を、関節軟骨の欠損部位に移植を行った状態を示す。A) 関節欠損部位に大量に回収した400μm程度の三次元組織をピペットにより移植操作を行っている状態。 B) 三次元組織を移植した直後の関節欠損部位の様子。 軟骨形成細胞のみの培養と、血管内皮細胞との共培養を行った軟骨形成細胞の遺伝子発現解析を示す。（左）未（脱）分化マーカーの発現。（右）軟骨分化マーカーの発現。 血管化軟骨作成に用いる支持体条件の検討。A) マトリゲルの希釈率を検討した結果、８倍希釈まで血管化軟骨を作製することが可能であった。B) アガロースゲルを用いた条件ではいずれの場合においても血管化軟骨の形成を認めなかった。C) Ｉ型コラーゲンを用いた場合においても血管化軟骨の形成を認めなかった。 凍結保存を行った血管化軟骨移植によるヒト成熟軟骨の創出。A) 血管化軟骨の凍結工程。左；培養皿内で形成された組織、中；薬さじにて回収した様子、右；凍結用溶媒（TC Protector）に回収した組織を浸漬した凍結直前の様子。B) 凍結後、１か月後に融解を行ったヒト血管化軟骨の肉眼観察。C) 融解を行ったヒト血管化軟骨の皮下移植サンプルの組織学的解析。免疫不全マウス背部皮下移植により２ヶ月後に摘出し、アルシアンブルーおよびII型コラーゲンの産生を認める軟骨組織の再構築を認めた。 長期培養を行った血管化軟骨由来成熟軟骨の創出。長期培養血管化軟骨の組織学的解析。作製した血管化軟骨を６０日間にわたり長期培養することにより、血管を含む軟骨膜組織と血管が排除された軟骨組織の形成を認めた。左上；形成された組織の肉眼像、右上；免疫染色により中心部は軟骨マーカーであるAggrecanを発現し、周囲にはLamininが存在することを示す。下段左；免疫染色拡大図、下段中；HE染色、下段右；アルシアンブルー染色。誘導を行った三次元組織はピンセットで用手圧迫を行っても、組織が破壊されない高い力学的強度を有していた。 長期培養を行った血管化軟骨由来成熟軟骨の移植。長期培養血管化軟骨（上段左図の左下の小窓に示す）は顔面部の移植により、皮下の緊張に耐えうる力学的強度を有した軟骨組織であった。上段と下段の写真は、角度を変えて盛り上がっている部分の見え方を確認したものである。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は、軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することを含む、軟骨細胞の調製方法を提供する。
　本発明において、「軟骨形成細胞」とは、軟骨を形成しうる細胞をいい、例えば、BRACHYURY、KDR、CXCR4、PDGFRA、PDGFRB、CD44、SOX5、SOX6、SOX9、RUNX2、CDH1、Aggrecan、Collagen II、Versican、Elsatin、CSPなどのマーカーを発現しているものが好ましい。
　軟骨形成細胞は、様々な供給源から得ることができ、一般に耳介軟骨又は耳介軟骨膜から分離されるが、これらに限定されることはない。さらに、軟骨形成細胞は、軟骨細胞、未熟軟骨細胞、軟骨前駆細胞又は軟骨幹細胞等に区別することができる。軟骨細胞は、硝子軟骨、弾性軟骨、線維軟骨のいずれの軟骨から得られたものであってもよく、具体的には、肋骨軟骨、鼻軟骨、耳介軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨、環状軟骨、腱、靭帯、関節間軟骨、及び椎間板などから得られる。一般的に、培養を経た軟骨細胞は、脱分化しているだろうと考えられているが、このような脱分化した状態の軟骨細胞を用いてもよい。未熟軟骨細胞、軟骨前駆細胞又は軟骨幹細胞は、軟骨、軟骨膜、骨髄、胎盤、臍帯、皮膚、筋肉、脂肪、及び骨膜のような組織から得られる。軟骨形成細胞は、主としてヒト由来のものを用いるとよいが、ヒト以外の動物（例えば、実験動物、愛玩動物、使役動物、競走馬、闘犬などに利用される動物、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、サメ、エイ、ギンザメ、サケ、エビ、カニなど）由来の軟骨形成細胞を用いてもよい。
　血管細胞は、血管組織から分離することができるが、血管組織から分離された細胞に限定されることはなく、iPS細胞やES細胞などの全能性あるいは多能性を有する細胞から分化誘導されたものであってもよい。血管細胞としては、血管内皮細胞が好ましく、本発明において「血管内皮細胞」とは、血管内皮を構成する細胞、又はそのような細胞に分化することのできる細胞（例えば、血管内皮前駆細胞、血管内皮幹細胞など）をいう。ある細胞が血管内皮細胞であるかどうかは、マーカータンパク質、例えば、TIE2、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、CD31が発現しているかどうかを調べることにより確認できる（前記マーカータンパク質のいずれか一つあるいは複数が発現していれば血管内皮細胞であると判断できる）。また、血管内皮前駆細胞のマーカーとしては、c-kit、Sca-1などが報告されており、これらのマーカーの発現により、血管内皮前駆細胞であることを確認しうる(S Fang,et al. PLOS Biology. 2012;10(10):e1001407.)。当業者間で使用されている用語のうち、endothelial cells、umbilical vein endothelial cells、endothelial progenitor cells、endothelial precursor cells、vasculogenic progenitors、hemangioblast（HJ. Joo, et al. Blood. 25;118(8):2094-104.(2011)）などは本発明における血管内皮細胞に含まれる。血管細胞は、主としてヒト由来のものを用いるが、ヒト以外の動物（例えば、実験動物、愛玩動物、使役動物、競走馬、闘犬などに利用される動物、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、サメ、エイ、ギンザメ、サケ、エビ、カニなど）などの動物由来の血管細胞を用いてもよい。血管細胞は、臍帯血、臍帯血管、新生児組織、肝臓、大動脈、脳、骨髄、脂肪組織などから得られる。
　軟骨形成細胞と血管細胞は、生体から採取した細胞、生体から採取した細胞を初代あるいは継代培養した細胞、さらには株化された細胞、全能性あるいは多能性を有する細胞（例えば、未熟細胞、前駆細胞、幹細胞、iPS細胞、ES細胞等）から分化誘導した細胞など、いずれの細胞であってもよい。また、軟骨形成細胞と血管細胞は、同じ個体に由来するものであっても、異なる個体に由来するものであってもよい。再生医療に応用される場合には、軟骨形成細胞と血管細胞（特に、血管細胞）は、免疫拒絶されないHLA型であることが好ましい。
　共培養における二種類の細胞の培養比は軟骨が形成できる範囲内であれば特に限定されないが、好適な細胞の数比は、軟骨形成細胞：血管細胞＝１：０．４～１である。
　軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することで、軟骨形成細胞と血管細胞との相互作用により、軟骨形成細胞が軟骨に運命づけされたPre-chondrocyte（immature chondrocyte、未熟軟骨細胞）という状態へと変化するとともに、細胞増殖が活性化される。
　本発明の方法により調製される「軟骨細胞」の概念には、完全に分化した軟骨細胞だけではなく、未熟軟骨細胞（Pre-chondrocyte（immature chondrocyte））、軟骨前駆細胞、軟骨幹細胞、それらの混合物なども包含される。軟骨への分化は、Alcian Blue染色、未（脱）分化状態を示すマーカー（例えば、Collagen 1、CD44）発現の減弱、軟骨分化マーカー（例えば、Sox9、RUNX2、Aggrecan、Collagen II、Versican、Elsatin、CSPG）発現の増強などによって、確認することができる。
　軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することで、軟骨形成細胞が増幅する。（後述の実施例１、図6）細胞の増幅とは、細胞が自己複製して、増殖することをいう。
　また、軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより、三次元組織が形成されうる。三次元組織は、支持体上で軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより、形成することができる。支持体は、0.5～25 kPaの硬度を有する基材であるとよく、そのような基材としては、ゲル（例えば、原液～4倍希釈マトリゲル（登録商標）、アガロースゲル、アクリルアミドゲル、ハイドロゲル、コラーゲンゲル、ウレタンゲルなど）を例示することができるが、それに限定されることはない。0.5～25 kPaの硬度を有する基材上では、大型（すなわち、2～3 mm程度又はそれ以上の大きさ）の三次元組織を形成することができる。このような大型の三次元組織は皮下への大量移植に適している。（後述の実施例４、図13）
　ゲルのような支持体ではなく、底面に細胞が集まるような形状（例えば、Ｕ底形状、Ｖ底形状など）のプレート上で軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することによっても、三次元組織を形成することができる。このようなプレート上では、小型（すなわち、数百μm程度又はそれ以下の大きさ）の三次元組織を形成することができる。このような小型の三次元組織は関節軟骨欠損部への移植に適している。（後述の実施例５、図14）
　軟骨形成細胞と血管細胞との共培養開始から1日程度で三次元組織の形成が観察され、さらに培養を続けると（共培養開始から2日程度）、三次元組織に血管構造の形成が認められ、その後（共培養開始から１０日程度）、血管構造の消失が起こることが確認されている。
　共培養の際に使用する培地は、軟骨形成細胞と血管細胞を維持することができる培地であればよいが、線維芽細胞増殖因子2（bFGF（FGF2））、線維芽細胞増殖因子5（FGF5）、骨形成因子2（BMP2）、骨形成因子4（BMP4）、骨形成因子6（BMP6）、結合組織増殖因子（CTGF）、トランスフォーミング増殖因子β1（TGF-β1）、トランスフォーミング増殖因子β2（TGF-β2）、トランスフォーミング増殖因子β3（TGF-β3）、インスリン様成長因子1（IGF-1）、肝細胞増殖因子（HGF）、線維芽細胞増殖因子4（FGF4）、骨形成因子3（BMP3）、アグリカン（Aggrecan）、ヒアルロン酸（Hyaluronic Acid）、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＳ）、内皮細胞由来成長因子（ＥＣＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（acidic ＦＧＦ）、マクロファージ由来成長因子（ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（ＴＡＦ）、血管内皮増殖因子（VEGF）ウシ脳抽出液（ＢＢＥ）、ウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）、糖質コルチコイド、コレステロール、各種ビタミンからなる群より選択される少なくとも１つの成分を含むとよい。これらの成長因子またはホルモン類は単独で、あるいは適宜混合して、培地に添加するとよい。糖質コルチコイドとしては、ハイドロコーチゾン、コーチゾン、コーチコステロン、デキサメサゾン、トリアムシノロン、プレドニゾロン等が例示される。各種ビタミンとしては、ビタミンC等が例示される。bFGF（FGF2）、FGF5、FGF5、BMP2、BMP4、BMP6、CTGF 、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、IGF-1、HGF、EGF、FGF4、BMP3、Aggrecan及びHyaluronic Acidは、軟骨への分化をサポートすることができる。内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＳ）、内皮細胞由来成長因子（ＥＣＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（acidic ＦＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（bＦＧＦ）、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、マクロファージ由来成長因子（ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（ＴＡＦ）、血管内皮増殖因子（VEGF）ウシ脳抽出液（ＢＢＥ）、ウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）、糖質コルチコイド（ハイドロコーチゾン、コーチゾン、コーチコステロン、デキサメサゾン、トリアムシノロン、プレドニゾロン等）、コレステロール、各種ビタミン等は、血管細胞の生存をサポートすることができる。なお、三次元組織化には、上記のようなタンパク質製剤の存在を必須とするわけではなく、培地はどのようなものであってもよく、血管細胞を維持する培地であればよい。
　三次元組織の分化段階は、Pre-chondrocyte（immature chondrocyte）、Mature Chondrocyteなど、いずれの状態であってもよい。
　三次元組織の形状は、通常、球状であるが、基材の設定により、耳などの複雑な形状を作製してもよく、特に限定されるものではない。
　本発明の方法により形成される三次元組織は、ピンセット等で用手圧迫を行っても、組織が破壊されない程度の高い力学的強度を有しうる。
　培養時の温度は特に限定されないが、３０～４０℃とするのが好ましく、３７℃とするのが更に好ましい。
　培養期間は特に限定されないが、1～20日とするのが好ましく、2～3日とするのが更に好ましい。
　上記の方法により調製された軟骨細胞（完全に分化した軟骨細胞、未熟軟骨細胞（Pre-chondrocyte（immature chondrocyte））、軟骨前駆細胞、軟骨幹細胞、それらの混合物などのいずれであってもよく、また、三次元組織を形成していても、形成していなくてもよい）は、凍結して、保存することができる。また、凍結後に、融解して、利用することもできる。従って、本発明の軟骨細胞の調製方法は、軟骨細胞を凍結する工程を含んでもよく、さらには、軟骨細胞を凍結する工程の後、融解する工程を含んでもよい。
　本発明の方法により調製された軟骨細胞は、軟骨再生医療に用いることができる。従って、本発明は、軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより得られた軟骨細胞を含む、軟骨再生医療用組成物を提供する。
　軟骨形成細胞と血管細胞との共培養により、三次元組織を形成したものは、移植が容易であるので好ましいが、三次元組織を形成していなくとも、移植後に細胞が分散せずに留めておくことができるのであれば、軟骨の再生が可能であると考えられる。例えば、ペレット（遠心分離によりすべての細胞を沈ませた状態）状態でも移植が可能と考えられる。
　本発明の組成物は、生体内に移植し、軟骨組織を形成させるために用いることができる。従って、本発明は、上記の方法により調製された軟骨細胞を生体内に移植し、軟骨組織を形成させることを含む、軟骨再生方法も提供する。
　生体としては、ヒトの他、ヒト以外の動物（例えば、実験動物、愛玩動物、使役動物、競走馬、闘犬などに利用される動物、具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ニワトリ、サメ、エイ、ギンザメ、サケ、エビ、カニなど）を挙げることができる。
　本発明の組成物は、生体内に移植した後、血管網が構築されうる。（後述の実施例１、図2C、3、4）その血管網には血管潅流が生じうる。血管網に血管潅流が生じることにより、軟骨形成細胞が効率的に生着しうる。血管網は構築された後、消失し、血管構造を欠く軟骨組織が形成されうる。（後述の実施例１、図2C、3、4）軟骨細胞への分化誘導が開始することによって、次第に血管構造が排除されるとともに、軟骨形成細胞の終末分化が生じる。（後述の実施例１、図2C、3、4）
　生体への移植には、共培養開始から３日目程度のもの（三次元組織）が適しているようである。大型の軟骨を形成させるためには、皮下へ3mm程度のもの（三次元組織）を大量に（複数個～数十個：後述の実施例４、図13）移植を行うとよく、関節の欠損部位への移植には200μm-400μm程度のもの（三次元組織）を数百個移植するとよい（後述の実施例５、図14）。また、血管構造に関しては、認めたものの方が結果が良いことが多いが、必須ではない。物理的に（肉眼的に）３次元組織形成が良く、ある程度硬いものということが大切なようである。
　本発明は、顔面に変形を有する患者や、加齢・スポーツなどによる外傷で生じた関節症を有する患者等を対象とした軟骨再生医療を実現化するための、治療用３次元軟骨デバイスを製造する技術を提供する。現在の外科的治療や従来の再生医療技術と比べ、飛躍的な臨床的治療効果を有する軟骨再生医療が実施可能となる。
　本発明の方法により調製した軟骨細胞は、医薬品として有効な薬剤のスクリーニングにも利用可能である。本発明により、軟骨変性疾患を有する患者より採取した軟骨形成細胞より疾患モデル３次元軟骨組織を再構築することが可能となる。再構築された疾患モデル３次元軟骨組織は、新薬を開発する上で有益な創薬スクリーニング系となることが期待される。従って、本発明は、軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより得られる軟骨細胞、該軟骨細胞から形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、医薬品として有効な薬剤をスクリーニングする方法を提供する。
　例えば、形成された3次元軟骨組織を対象として、軟骨形成を促進する化合物をスクリーニングすることにより、軟骨が損傷を受けた際に有効な医薬品の開発につながる。このスクリーニングでは、例えば、三次元組織の培養系に候補物質を添加し、軟骨形成の促進の有無を調べることにより、有効な薬剤を選択することができる。
　他の例としては、炎症反応を抑制する化合物をスクリーニングすることにより、リウマチ性疾患や変形性関節症などの疾患治療に有効な医薬品の開発につながる。このスクリーニングでは、例えば、自己炎症性の関節疾患を有する患者より採取した滑膜細胞や軟骨細胞を用いて作成した三次元組織に対して、培養系で、薬剤を添加した際に、自己炎症性の関節疾患に関与するコラゲナーゼやプロテアーゼ（組織を溶かしてしまう酵素）の産生が抑制されるか否かを調べることにより、有効な薬剤を選択することができる。
　本発明のスクリーニング方法に供される被験物質は、いかなる公知化合物及び／又は新規化合物であってもよく、また、高分子化合物（例えば、核酸、糖、脂質、蛋白質、ペプチドなど）及び／又は低分子化合物のいずれか又は両方であってもよく、これらの物質は、天然由来のもの（例えば、微生物、動植物、海洋生物等に由来する天然成分など）であっても、合成されたもの（例えば、既存の化合物ライブラリー、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、バーチャルライブラリーなど）であってもよい。
　また、本発明の方法により調製した軟骨細胞は、軟骨細胞が産生する基質の生産にも利用可能である。サメなどの動物由来軟骨組織より抽出されたコンドロイチン硫酸は広く保健機能食品として利用されている。本発明により人為的に再構築した軟骨組織は、食品関連産業においてコンドロイチン硫酸を効率的に製造する上で極めて有益な軟骨組織の供給源となる。従って、本発明は、軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより得られる軟骨細胞、該軟骨細胞から形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、軟骨細胞が産生する基質を調製する方法を提供する。軟骨細胞が産生する基質としては、コンドロイチン硫酸の他、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、コラーゲン、エラスチンなどを例示することができる。軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより得られる軟骨細胞、該軟骨細胞から形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、軟骨細胞が産生する基質を調製するには、細胞や組織の培養物から基質を抽出する公知の方法を用いればよい。
　以下、実施例により本発明を更に詳細に説明する。
〔実施例１〕ヒト軟骨前駆細胞を用いた弾性軟骨創出
1. 要約
　成体軟骨組織は血管や神経を欠く単純な臓器であり、複雑な高次構造を有する固形臓器などと比較して、再生医療の早期実現化が期待される。これまでに様々な組織由来間葉系前駆細胞を用いて、成熟軟骨細胞の分化誘導を試みる研究が多数報告されている。しかし、成長因子を用いる従来の分化誘導法では、軟骨細胞への終末分化誘導効率が低いことが重大な未解決課題となっている。
　本研究では高効率な弾性軟骨創出法の開発を目指し、軟骨の生理分化プロセスの解明を試みた。軟骨前駆細胞を含む発生初期の耳介軟骨を独自のライブ観察系に導入しin vivoにおいて追尾定点観察を行ったところ、一過性に血液灌流が生じ血管内皮細胞が侵入することを見出した。これにより軟骨前駆細胞の増殖活性が一時的に亢進し、続く血管の退行に伴って終末分化誘導が生じることが明らかとなった。そこで、近年我々が同定したヒト軟骨前駆細胞を用いて、このような発生過程における一過性血管侵入を再現する新規培養系の構築を試みた。驚くべきことに、血管内皮細胞との共培養により、軟骨前駆細胞はin vitroで自律的に三次元組織を構築することが明らかとなった。さらに、この三次元組織を移植に用いることで、従来のペレット移植法と比較して、高効率に弾性軟骨を再構築することが示された。
　本技術によれば、成長因子や足場材料を用いる必要がないことから、安全性やコストの面で極めて有益な弾性軟骨再構築技術になるものと期待される。将来的に、患者のHLA型と一致した血管内皮細胞と低侵襲で採取培養した軟骨前駆細胞と共培養させ、三次元組織化を誘導し移植することで、頭蓋・顎・顔面領域の先天奇形や外傷に起因する組織変形の新たな治療法を提供できると考えられる。
2. 緒言
　頭蓋・顎・顔面領域の先天奇形や外傷に起因する変形は、全世界で100万人以上の患者が抱えている極めて重要な解決課題であり、これらの疾患に対する新しい治療法の開発が待ち望まれている1。現在、形成外科領域では顔面の変形や先天性奇形に対して、患者自身の軟骨組織を移植する手術が広く行われている2。組織移植に広く用いられている軟骨組織として肋軟骨が挙げられるが、採取に伴う術後の疼痛や胸部の瘢痕が問題となるばかりでなく、前胸部の変形をきたす症例もある。先天性の変形に対する手術は小児期に行われることが多いため、患者へ対する侵襲は相対的に大きく、その負担は計り知れない。また、軟骨組織移植に伴う経年的な組織変形と吸収や、骨組織移植に伴う経月的な組織吸収も極めて大きな問題となっており臨床的に満足のいく長期成績が得られていない3-7。合成高分子化合物などの医用材料を移植する方法もあるが8-13、それらが人体にとって異物であることから、感染や炎症、皮膚穿孔などが生じることが知られており、これらの問題が未解決である12,13。このような問題点を克服することの可能な新しい治療法として、組織再生工学を用いたヒト弾性軟骨の臨床的再構築法の開発が切望されている。
　ヒト弾性軟骨の再構築に適応可能な細胞源として、幾つかの可能性が示唆されている14-16。ヒト耳介軟骨細胞は軟骨分化能などの優位性を有しているが、採取部位への侵襲に加え、自己複製能を有する幹細胞が存在しないために、細胞寿命に起因する長期的な組織維持が困難であることが問題となっている。骨髄由来のヒト間葉系幹細胞は、これらの諸問題を解決できる可能性を持つ細胞の一つであるが17,18、骨髄穿刺の侵襲が大きいこと、成熟軟骨細胞への分化能が極めて低いこと、血管侵入や石灰沈着をきたすことなどの様々な問題を抱えているため実用化の可能性は低い19-21。他にも脂肪組織由来のヒト間葉系幹細胞など候補となる細胞は存在するものの、いずれも成熟軟骨細胞への分化能力が低く、弾性軟骨における細胞外基質の産生能は全く確認されていないことから、ヒト弾性軟骨の再構築に応用可能な優れた細胞源は見いだされていないのが現状である22-24。
　ヒト弾性軟骨による再生治療を実現するためには、低侵襲操作で採取が可能であり、高い増殖活性、成熟軟骨細胞への高い分化能、自己複製能を持つヒト軟骨前駆細胞を同定し、これらの分離・培養法、分化誘導法などに関する様々な細胞操作技術を開発することが必要である。
　先行研究において、BrdU Labeling retaining assayによりマウス耳介軟骨膜部にのみBrdU投与後1年にわたりLabel Retaining Cells ( LRCs )が存在することを確認し25、軟骨膜に軟骨前駆細胞が存在することが示唆された。そこで、ヒト軟骨膜に、前駆細胞の特徴である高い増殖能、多分化能を有する細胞集団が存在することを明らかにし、前駆細胞を分離・培養する技術を開発した26。
　一方で、軟骨細胞への分化誘導因子の探索を目的として、分子生物学的解析が実施され、軟骨分化の進行には、増殖、分化を制御する多様な成長因子が介在していることが明らかとなってきている。その一つの例としてFGFs(Fibroblast Growth Factors)が挙げられる。FGFsは、1974年にGospodarowiczらにより、ウシ脳抽出液中に線維芽細胞の増殖を促進する増殖因子として発見され27、1977年に仔ウシの軟骨から精製することに成功している28。FGFR遺伝子に変異が起こることで、頭蓋縫合早期癒合症や四肢の短縮が起こる軟骨無形成症、軟骨低形成症29,30などの遺伝性骨形成疾患が発生することが明らかになり、FGFシグナルの骨・軟骨形成における役割が注目されている。またその他にも、TGF-βレセプターのキナーゼ領域を欠失させたドミナントネガティブ型レセプターを発現するトランスジェニックマウスが、変形性膝関節症様症状を呈した31。分子生物学的解析により、TGF-β によるSmad2/3を介したシグナルがSox9の転写活性を促進し、Co12a1遺伝子のエンハンサー領域においてSox9とCBP/p300との複合体形成を調節することで、軟骨の初期分化を促進していることを明らかになっている32。このことから、軟骨前駆細胞や間葉系幹細胞を軟骨分化誘導するには、TGFsやFGFsなどの成長因子を添加することが必要であると考えられる33,34。実際に、Insulin-like Growth Factor-Ｉ、basic-FGFの二つの成長因子を添加することで、軟骨前駆細胞に軟骨分化誘導を行う方法が標準的である。しかし、生着率が低いなどの理由から軟骨再構築をする効率が低いことが課題となっている。同様に、間葉系幹細胞から軟骨分化誘導を行う研究が多く成されているが35-38、どの方法においても軟骨再構築をする効率が低いことが課題となっている。
　発生の初期において、未分化な間葉系細胞から分化した軟骨前駆細胞が出現し、間充織凝集を経て、軟骨細胞へ分化・成熟することで、軟骨組織が形成される。しかし、軟骨前駆細胞の生理分化プロセスには未だに不明な点が多い。そこで、これまで全く未解明であった生理分化プロセスを明らかにし、それらの相互作用を再現化することによる高効率な弾性軟骨創出法の確立を目指した。
3. 材料と方法
3-1. クラニアルウインドウの作製
　6週齢で雌のNOD/SCIDマウスを、三協ラボサービス株式会社より購入した。購入したマウスは、横浜市立大学 先端医科学研究センター 共同研究支援部門動物実験センター内において飼育・維持され、これらを用いた動物実験に関しては、横浜市立大学福浦キャンパス動物実験指針に則って行った。
　クラニアルウインドウ作製は主にYuanらの方法に従い行った39。麻酔はケタラール(Sankyo Yell Yakuhin Co.)90 mg/kg, キシラジン(Sigma Chemical CO.)9 mg/kgを滅菌処理したPBSで1個体200 μlの投与量になるように調製し、大腿部筋肉内注射により実施した（ケタラール・キシラジン混合麻酔）。ケタラールは麻薬管理法に従い使用した。70 %エタノールでNOD/SCIDマウス頭部を消毒し、頭部皮膚を切開し、頭蓋骨表面の骨膜を綿棒により除去したのち、歯科用マイクロドリル(Fine Science Tools)を用いて頭蓋骨を円形に薄削し、慎重に取り除いた。続いてピンセットを用いて硬膜を剥離した。出血した際には、スポンゼル(Astellas Co.)を用いて止血を行った。出血が見られないことを確認した後、生理食塩水(Otuka Pharmaceutical Co.)で脳表面を満たして、直径7 mmの特注円形スライドガラス(MATSUNAMI)を表面に乗せ、コートレープラスチックパウダー(Yoshida)とアロンアルファ(Toagosei CO.)をセメント状になるように混合した接着剤により強固に封入した。
　クラニアルウインドウ作製から1週間経過後、手術部に出血や炎症が見られないマウスを今後の実験に用いた。
3-2. 共焦点顕微鏡による観察
　作成されたクラニアルウインドウマウスにケタラール・キシラジン混合麻酔を腹腔投与後、頭部ガラスが水平になるよう仰向けにしたマウスをカバーガラス上にセロハンテープで固定し、GFP-mouse(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP))(日本SLC)の未成熟な軟骨組織や細胞の観察を行った40,41。観察には、共焦点顕微鏡(Leica)を用いた。また、マウスの血流を可視化するため、尾静脈から29 Gの注射器(Termo)でfluorescein isothiocyanate-conjugated dextran(MW 2,000,000)、tetramethylrhodamine-conjugated dextran (MW 2,000,000)を100μl、マウスの血管構造を可視化するために、尾静脈からAlexaR647-conjugated mouse-specific CD31 antibody(BD Biosciences Pharmingen) 100μl投与した。
3-3. 組織化学染色
　摘出した組織、および各発生段階の野生型C57BL/6Jマウス(日本SLC)耳介を、4 %パラホルムアルデヒド（PFA）（Wako）/リン酸緩衝食塩液（PBS）（pH7.4）で4 ℃、2時間固定した。次に、100 mM塩化アンモニウム（Wako）/PBSで4 ℃、10分間、3回洗浄した．そして、15 %スクロース（Wako）/PBSに4 ℃、1 時間浸した後，30%スクロース/PBSで4 ℃、over nightで静置した。O.C.T. Compound（SAKURA Japan）（30 ml）に組織を包埋した。4 ℃、1 時間静置した後、液体窒素で急速凍結し、凍結ブロックを作製した。凍結ブロックをクリオスタットHM 500 O（ZEISS）で5 μmの厚さに薄切し、凍結組織切片を作製した。作成した組織切片は、Alcian Blue染色(武藤化学薬品)、Elastica Van Gieson染色(武藤化学薬品)を行った。
　Alcian Blue染色は、1×PBS（phosphate-buffered saline）で洗浄してOCT Compoundを除去後、3％酢酸水で3分間前処理をし、Alcian blue染色液で60分間染色した。3 ％酢酸水で染色液を落とし純水で洗浄後、ケルンエヒトロートで5分間核染色した。余分なケルンエヒトロートを純水で落とした後、上昇エタノール系列にて脱水し、キシレンで透徹処理した。
　Elastica Van Gieson染色は、OCT Compoundを除去後、1 ％塩酸70 ％エタノールで3分間前処理をし、ワイゲルト・レゾルシンフクシン液で60分間浸漬した。1 ％塩酸70 ％エタノールで染色液を落とし、ワイゲルト鉄ヘマトキシリン液で5分間核染色した。微温湯で色出しを行い、ワンギーソン液で15分間浸漬し、上昇エタノール系列にて脱水し、キシレンで透徹処理した。
3-4. 免疫組織化学染色
　摘出した組織、および各発生段階の野生型C57BL/6Jマウス(日本SLC)耳介を、4 %パラホルムアルデヒド（PFA）（Wako）/リン酸緩衝食塩液（PBS）（pH7.4）で4 ℃、2時間固定した。次に、100 mM塩化アンモニウム（Wako）/PBSで4 ℃、10分間、3回洗浄した。そして、30%スクロース/PBSで4 ℃、over nightで静置し、O.C.T. Compound（SAKURA Japan）（30 ml）に組織を包埋した。30分静置した後、液体窒素で急速凍結し、凍結ブロックを作製した。凍結ブロックをクリオスタットHM 500 O（ZEISS）で5 μmの厚さに薄切し、凍結組織切片を作製した。作成した組織切片を0.1%tween-TBSで洗浄してOCT Compoundを除去後、凍結切片周囲のTBS-Tを拭き取り、染色対象を撥水ペン(DAKO)で囲むように書き、撥水処理を施した。次に、protein block Serum-Free Ready-to-use(Dako)を用い、4 ℃で24時間ブロッキングを行った。一次抗体には、一次抗体は4℃で一晩反応させた。処理後、TBS-Tで5分間3回洗浄し、二次抗体を滴下し、室温で2時間反応させた。TBS-Tで5分間3回洗浄し、DAPIを添加したFA Mounting Fluid(Becton Dickinson)にて核染色および封入を行った。一次抗体および二次抗体の希釈には、protein block Serum-Free Ready-to-use(Dako)を用いた。
　一次抗体は、Alexa Fluor647 anti-mouse CD31(Biolegend)(1:200)、rabbit anti-polyclonal laminin(Dako)(1:200)、mouse anti-mouse/human CD44(Biolegend)(1:200)、Rabbit anti-polyclonal Ki67(Abcam)(1:200)、rabbit anti-human Collagen type Ｉ（MONOSAN）(1:200)、mouse anti-chicken Collagen type II(CHEMICON)（1:200）を使用した。
また、二次抗体は、
Alexa488 Goat Anti-mouse IgG1(Molecular Probe)(1:500)、
Alexa555 Goat Anti-rabbit IgG(Molecular Probe)(1:500)、
Alexa555 Goat Anti-mouse IgG2b(Molecular Probe)(1:500)、
Alexa555 rabbit Anti-rat IgG2b(Molecular Probe)(1:500)、
Alexa546 Goat Anti-rabbit IgG(Molecular Probe)(1:500)、
を使用した。観察には、蛍光顕微鏡(Zeiss)を用いた。
3-5. ヒト耳介軟骨からの軟骨膜組織、軟骨組織の分離
　横浜市立大学附属病院倫理委員会より承認を得て(approval #03-074)、小耳症患者より手術の際に余剰となる残存耳介弾性軟骨を供与頂き、研究を遂行した。
　提供されたヒト耳介弾性軟骨は、実体顕微鏡下で軟骨膜組織、軟骨組織の2層に分離した。
3-6. ヒト耳介軟骨膜細胞、軟骨細胞の培養
　実体顕微鏡下で軟骨膜部、軟骨実質部の2層に分離し、組織を細切にした。その後0.2 %Collagenase TypeII(Worthington)に懸濁・振蕩し、基質を分解し細胞を分離した。その際、軟骨膜組織と軟骨膜は2時間、軟骨組織は10～15時間振蕩した。各組織の細胞懸濁液は100 μmのCell Strainer (BD Falcon)で濾過し、遠心分離 (1500 rpm、4 ℃、5 min)した。上清を除去後、Standard medium( 10 ％Fetal Bovine Serum(FBS；GIBCO)、1 ％Antibiotic Antimycotic Solution(SIGMA)を添加したDULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM(D-MEM/F-12；SIGMA))で洗浄し、遠心分離(1500 rpm、4 ℃、5 min)を行った。回収した各細胞は、35 mmイージーグリップ細胞培養ディッシュ(FALCON)あるいは60 mm細胞培養ディッシュ(FALCON)に播種した。細胞は気相条件を37 ℃、CO2濃度5 ％に設定したインキュベーター内で培養を行った。
　細胞の継代は、0.2 ％Collagenase typeII(Worthington)を含有するDulbecco’s modified Eagle medium and Ham’s F-12 medium(D-MEM/F-12；SIGMA)を用いて行った。培地を除去したディッシュに上記の0.2 ％Collagenase溶液を注入し、インキュベーター内で20分静置し、Standard mediumを加え、ピペッティングし細胞を回収した。回収した細胞は遠心分離(1500 rpm、4 ℃、5 min)を行い、洗浄を行った後、ディッシュに播種し再び培養した。ディッシュがコンフルエントに達した際に同様の継代操作を施行し、その操作を繰り返した。
3-7. ヒト臍帯静脈血管内皮細胞の培養　
　正常ヒト臍帯静脈内皮細胞(Normal Human Umbilical Vein Endothelial Cells: HUVEC) (Lonza)の継代は、1×PBSで３回洗浄後、0.05 % Tripysin-EDTA(Gibco)を1 ml注入し、インキュベーター内で１分間静置し、Endothelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors(EGM)(Lonza)を加えてピペッティングし細胞を回収した。回収した細胞は遠心分離(950 rpm、4 ℃、5 min)を行い、洗浄を行った後、ディッシュに播種し再び培養した。ディッシュがコンフルエントに達した際に同様の継代操作を施行し、その操作を繰り返した。
3-8. レトロウイルスベクターによる蛍光標識
　全ての遺伝子組み換え実験は、横浜市立大学DNA組み換え委員会の了承を得たうえで、P2レベル安全キャビネット内にて施行した。
　ウイルスベクターpGCDΔNsamEGFPおよびpGCDΔNsamKOの産出は以下の方法で行った。293GPG/pGCDΔNsamEGFP細胞および293GPG/pGCDΔNsamKO細胞を、poly-L-lysineでコーティングしたディッシュへ播種し、専用に調整した培地(293GPG mediumと示す)を用いて培養した。すなわち、DMEM (SIGMA)中へ10% fetal bovine serum(GIBCO、USA)、2 mmol/L L-glutamine (Gibco)、1penicillin/streptomycin(Gibco)、1 μg/mL Tetracycline hydrochloride(SIGMA T-7660)、2 μg/mL Puromycin(SIGMA P-7255)、0.3 mg/mL G418(SIGMA A-1720)を含むものを用いた。培養は37℃、10%CO2のインキュベーター内で培養した。約80 %コンフルエント状態まで培養した後、培地を293GPG mediumからTetracycline hydrochloride、Puromycin、G418を抜いた培地(293GP mediumと示す)へ置換した(Day 0とする)。Day 3で培地を交換した後、Day4からウイルスを培地ごと回収し、再び293GP mediumで満たした。回収した培地を0.45μmフィルターでろ過し一時的に4℃で保管した。上記の手順でDay7まで回収したものを6000xg、4℃、16時間遠心し、ペレットへ400μL のStempro (invitrogen)を添加し、4℃、72時間振とう後、この-80℃で回収・保存した。(100倍濃縮ウイルス溶液と示す)。
　ヒト耳介軟骨膜細胞、HUVECの2種類の細胞を30～50%コンフルエント状態になるまで培養し、それぞれの培地にProtamine (Sigma)を終濃度0.4μm/mLになるように加え、HUVECへはpGCDΔNsamEGFPおよびpGCDΔNsamKO、hMSCへはpGCDΔNsamKO、hFLCへはpGCDΔNsamEGFPの100倍濃縮ウイルスを添加した。37℃、5%CO2のインキュベーター内で4時間感染させ、PBSで2回洗浄後、培地を新鮮なものに交換し、再び37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した。この操作を4回繰り返し、FACS CANTOを用いて各細胞へのウイルスベクター導入効率を算出した。
3-9. 増殖能の比較
　　軟骨膜細胞を4.0×104 cells/cm2の密度で播種し，増殖培地で培養を行った。24時間後に、軟骨膜細胞、HUVECそれぞれを4.0×104 cells/mlの密度で播種したCell Culture Inserts(BD Falcon)を挿入した。12日間培養後、培地にNuc Blue Live Cell Stain(Molecular Probes)一滴添加した。インキュベーター内で10分静置後、IN Cell analyzer2000(GE)で細胞数を測定した。なお、本検討においては、増殖培地としてStandard medium ( 10 ％Fetal Bovine Serum(FBS；GIBCO)、1 ％Antibiotic Antimycotic Solution(SIGMA)を添加したDULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM(D-MEM/F-12；SIGMA))を用いて培養を行った。
3-10. FACSを用いた細胞表面抗原の解析
軟骨膜細胞を1.0×105 cells/mlの密度で播種し，増殖培地で培養を行った。24時間後に、軟骨膜細胞、血管内皮細胞それぞれを7.5×104 cells/mlの密度で播種したCell Culture Insert(BD)を挿入した。3日間培養後、培地を除去したディッシュに上記の0.2 ％Collagenase溶液を注入し、インキュベーター内で20分静置し、Standard mediumを加え、ピペッティングし細胞を回収した。
　各細胞毎にFluorescein isothiocyanate (FITC)、 Phycoerythrin(PE) 、 Allophycocyanin(APC)抱合モノクローナル抗体を用い、氷上で30分間染色した。3度の洗浄後、 1 μg/mlのpropidium iodide(PI) を含むPBSに懸濁し、 FACSによる解析を行った。解析にはMoFlo cell sorter (DakoCytomation)を用いた。軟骨膜細胞に対し、fluorescent-conjugated mouse anti-human CD44(BD science)、CD90(BD science)を用いてソーティングを行った。ソーティングに際し、細胞の残骸、死細胞やダブレットは前方散乱光、側方散乱光、PIによって除去した。　
3-11. 従来法による軟骨再構築
　耳介軟骨膜細胞を用いて積層化培養によって軟骨細胞へ分化誘導を行った。軟骨膜細胞を2.5×104 cells/cm2に調整し細胞培養ディッシュ（FALCON）に播種した。播種後2日間、Standard mediumで培養し、細胞の接着を促した後、軟骨分化誘導培地を用いて5日間培養した。軟骨分化誘導培地は10 %FBS（GIBCO）、1 % Antibiotic Antimycotic Solution、L-ascorbic acid 2-phosphate（WAKO）、Dexamethasone（SIGMA）、Insulin Growth Factor-Ｉ（SIGMA）、basic Fibroblast Growth Factor（科研製薬）を含有するD-MEM/F-12 medium（SIGMA）である。軟骨分化誘導培地を用い7日間培養を行った後、別に用意した細胞を5×104 cells/cm2に調整し、上から播種し積層化した。2層目を播種後、1層目と同様に2日間はStandard mediumで培養を行い、その後軟骨分化誘導培地を用いて5日間培養を行った。この操作をもう一度繰り返し、計3層に重層化した。なお、細胞の培養はすべて、気相条件を37℃、CO2濃度5％に設定したインキュベーター内で行った。分化させた各細胞は、セルスクレイパー（IWAKI）を用いて剥離した。クラニアルウインドウ内に移植し、共焦点顕微鏡を用い観察を行った。
3-12. 三次元組織化の誘導
　24-well plateに150 μmのEGMとMatrigelをそれぞれ添加し、インキュベーター内で30分静置した。1.0×105 cells/mlの軟骨膜細胞、HUVECの各細胞懸濁液を混合し、遠心分離(950 rpm、4 ℃、5 min)を行い、回収した細胞を少量の増殖培地でウェルに播種した。5～20分静置後、Endothelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors(EGM)よりEGF添加を行わない培地（EGM-ΔEGF）(lonza)を1 ml添加し、１日毎にEGMを交換し、３日間培養した。なお、10 ％Fetal Bovine Serum(FBS；GIBCO)、1 ％Antibiotic Antimycotic Solution(SIGMA)を添加したDULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM(D-MEM/F-12；SIGMA))を用いて培養を行った。
誘導した三次元組織をクラニアルウインドウ内に移植し、肉眼および共焦点顕微鏡によるライブイメージングを実施するとともに、移植15、30、60日後に摘出し、組織化学染色を行った。
　移植片への血液灌流を阻害するために、作成されたクラニアルウインドウマウスの脳の上にナノメッシュ(pore size = 0.45 μm)を敷き、細胞を移植した。
3-14. アルシアンブルー陽性領域の定量
　Alcian Blue染色した組織切片を、HSオールインワン蛍光顕微鏡(KEYENCE)により組織全体像の画像を取得し、Image J (http://rsb.info.nih.gov/ij/)により、陽性領域を定量した42。
3-15. 統計解析について
　データは、少なくとも3人以上の独立した検体による実験から得たmean±s.d.を表記した。統計学的解析には、まず3あるいは4群のデータに対しKruskal Wallis-H testを行い、P＜0.01と判定された場合に、 Mann-Whitney’s U test with Bonferroni correctionによる多重比較検定を行った。有意確率P値がP＜0.001またはP＜0.01を満たす場合を統計学的有意差ありと判定した。
4. 結果
4-1. 軟骨形成プロセスの追尾定点観察
　E17.5のEGFP遺伝子改変マウスの耳介軟骨をクラニアルウインドウ内に移植し、共焦点顕微鏡を用いたライブイメージングを行うことで、軟骨前駆細胞が成熟軟骨細胞に分化するまでの追尾観察を行った。肉眼観察で、移植後1、2目に、移植片の血管とホストマウスの血管の吻合が起き始めていることを確認できた。しかし、移植後5日目以降は、完全に血管が吻合していることが確認された。移植後5日目から血管が徐々に退行していき、移植後11日目には、ほぼ完全に血管が移植片から退行していた(図2A)。tetramethylrhodamine-conjugated dextranとAlexa647-conjugated mouse specific CD31 (mCD31) antibody を血管内に投与することでマウスの血管内皮細胞と血流を可視化したところ、移植後3日に、血流を有した血管が移植した耳介軟骨に侵入していることが確認できた。移植後7日には、一部の血管内皮細胞だけ残し、血管網は退行していた (図2B)。 同時に、円形の形態をしている軟骨前駆細胞が、軟骨細胞と同様な敷石状の形態へと変化していた。移植後10日には、移植した耳介軟骨からは血管が完全に退行していた(図2B)。移植後20日に、軟骨組織を包むように血管を有した軟骨膜組織を形成し、軟骨組織を構成する細胞は敷石状の形態を示した(図2B)。先行研究により、成体のヒトとマウス両方の耳介の軟骨膜組織に、高い軟骨分化能を有している軟骨前駆細胞が存在していることを明らかになっている。移植後20日経過した移植した耳介軟骨は弾性軟骨を形成しているかを組織学的解析により確認したところ、Alcian Blue染色によってプロテオグリカンを産生する軟骨組織が形成され、弾性繊維を染色するElastica Van Gieson染色により、弾性軟骨が形成したことが示された(図2C)。肉眼で、血管退行が起き始めている移植後5日目以降から、移植した発生初期の耳介軟骨が成長していくことが確認できた(図2A)。
4-2. 発生初期のマウス耳介軟骨における一過性血管侵入
　血管内皮細胞を支持している基底膜の構成タンパク質であるラミニン、血管内皮細胞マーカーであるmCD31により、E18.5、P0、P2、P10、P30の発達段階の耳介軟骨をクリオスタットで凍結組織切片を作製し、免疫組織化学染色を行った。E18.5の段階で、ラミニン、mCD31を発現する細胞が軟骨形成予定部位に存在していた。P0では、E18.5と比較して血管が多く存在し、P2で最も多くの血管を確認できた。一方で、P10では、血管をわずかに観察することができたが、P30では全く観察することは出来なかった(図3A)。P0、P2、P10、P30の段階での、ラミニン、mCD31を発現する血管と軟骨前駆細胞との距離を測定したところ、P2で最も短い距離（17.8 μm）を計測した (図3B)。
4-3. 従来の軟骨再構築法における一過性血管侵入
　軟骨再構築過程においても血管の侵入が起きているかを検証した。成長因子を添加した分化培地を用い、重層化させることにより、軟骨前駆細胞に軟骨分化誘導を行った。培養上清が粘性を帯びたときに、セルスクレイパーを用いて細胞を回収し、ペレット化することで、クラニアルウインドウに移植した(図4A)。fluorescent-conjugated dextranを血管内に投与することで血流を可視化したところ、10日後に移植したペレットに血管が侵入していき、移植30日後まで血管は侵入したままであった。60日後になると、移植したペレットから血管は完全に退行した(図4B) 。軟骨前駆細胞が成熟軟骨細胞へ分化したかを、組織学的解析により確認したところ、血管が侵入していた移植後10日ではAlcian Blue染色で染色されることはなかったが、移植後30日ではわずかに青色を呈していた。血管の完全に退行している移植後60日後には、濃い青色に染色されており、プロテオグリカンを産生する成熟軟骨細胞へと分化していることが確認できた。
4-4. 血管内皮細胞による軟骨前駆細胞の増殖能への影響
　血管が侵入する発生初期の耳介軟骨において、細胞が増殖しているかを検討した。血管が侵入していたP0、P2と、完全に血管が退行していたP30の耳介軟骨を用いて、Ki67とCD44により免疫組織化学染色を行った。増殖中の軟骨前駆細胞を、軟骨前駆細胞の特異的マーカーとして我々が報告しているCD4443と細胞増殖マーカーであるki67により観察した。血管が侵入していた段階であるP0、P2において、Ki67陽性細胞を観察することができ、最も血管の侵入していたP2の段階で最もKi67陽性細胞を確認できた。血管の退行しているP30では、Ki67陽性細胞は観察できなかった(図5)。次に、軟骨前駆細胞を低密度で播種し、Transwell assayによりヒト臍帯静脈内皮細胞(Normal Human Umbilical Vascular Endothelial Cells: HUVEC)と共培養することで、血管内皮細胞による軟骨前駆細胞の増殖能への影響を評価した。コントロールとして、間葉系幹細胞、繊維芽細胞や軟骨細胞と共培養を行った。共培養を始めて12日後、HUVECと共培養したものは細胞が密な状態に成り、ほぼコンフルエントになった。In cell analyzerにより細胞数を定量したところ、軟骨前駆細胞のみでは約2500 cells/cm2であったのに対して、HUVECと共培養を行った軟骨前駆細胞では約4000 cells/cm2であった。また、間葉系幹細胞、繊維芽細胞や軟骨細胞と共培養を行ったが、軟骨前駆細胞の増殖能への影響は見られなかった(図6A)。次に、フローサイトメトリーを用いて、共培養することによる細胞の表面抗原の変化を解析した。先行研究により、CD44+ CD90+細胞がヒト軟骨前駆細胞であると同定している。内皮細胞と共培養して12日後、コントロールである軟骨前駆細胞のみでは、CD44+ CD90+細胞は全体の0.79 %であったのに対して、HUVECと共培養することでCD44+ CD90+細胞は、12.44 %へと増加した (図6B)。
4-5. 血管内皮細胞との共培養による軟骨前駆細胞の三次元組織化
　軟骨前駆細胞と内皮細胞との相互作用を再現することによる、足場材料や成長因子を使わない三次元培養系を開発した。ヒト軟骨前駆細胞とHUVECをマトリゲル上で共培養すると、播種後12時間で細胞が少しずつ凝集していき、48時間後には直径約3 mmの三次元構造を自律的に形成した(図7A)。この三次元組織は、一定の力学強度を有しており、形状を崩すことなく、薬さじで掬い上げることでマウスのクラニアルウインドウ内に移植することが出来た。肉眼で、E17.5のマウスの未成熟な耳介軟骨を移植した時と同様に、移植後3日に、移植片への血流が再開し始めた。移植後10日後には、完全にHUVECとマウスの血管が吻合することで、移植片内に血管網が構築されていることが確認でき、一過性血管侵入を再現することが出来た(図7B)。血管侵入している部位を追尾観察していくと、移植後30日では、血管網が完全に無くなり、軟骨前駆細胞は、軟骨細胞と同様な敷石状の形態に変化したことから、軟骨前駆細胞は、成熟軟骨細胞へ分化したと考えられる。ライブイメージング解析でも同様に、移植後3日にはHUVECが血管網を構築し、移植後30日には完全に退行することが確認できた。移植した三次元組織が軟骨組織を形成したかを、組織学的解析により確認したところ、血管が侵入していた移植後3日ではAlcian Blue染色により染色されることはなかったが、移植後15日では一部分が青く染色された。血管の完全に退行した移植後30日後には、一部が濃い青色に染色されており、移植後60日後には、移植した三次元組織の大部分がAlcian Blueにより濃青色に染色された(図7C)。このことから、軟骨前駆細胞とHUVECを共培養することで構築した三次元組織が、プロテオグリカンを産生する軟骨組織を形成したことが確認できた。また、移植後30日の段階で、サフラニンO染色でも軟骨が再構築していること確認でき、Elastica Van Gieson染色により形成した軟骨は弾性軟骨であることが確認できた。免疫組織化学染色により、再構築した軟骨は、アグリカン陽性である軟骨組織を包み込むように、Ｉ型コラーゲン陽性である軟骨膜組織を有していることが示された 。また、hCD31の免疫組織化学染色により、再構築した軟骨膜組織に血管内皮細胞が存在していることが示された(図7D)。
　同様の三次元培養系を用いて、脱分化している軟骨細胞とヒト臍帯静脈内皮細胞を共培養した。軟骨前駆細胞を用いたときと同様に、Alcian Blue染色とElastica Van Gieson染色により、弾性軟骨を再構築したことが確認できた (図7E)。
4-6. 血流阻害移植モデルを用いた軟骨形成の阻害
　軟骨が成熟することに、マウス由来の血管と血液灌流が必須であるか明らかにするために、0.45 μmのポアサイズのナノメッシュを軟骨前駆細胞とHUVECを共培養することで構築した三次元組織と脳の間に挟み、マウスの血流が移植片に作用しない、血流阻害移植モデルを確立した(図8A)。移植後15日においても、移植した三次元組織の周囲に血流がないことが確認できた(図8B)。ライブイメージングにより、移植後３日には多くのHUVECが存在しているが、移植後７日目にはHUVECは減衰していき、移植後10日目にはほとんどのHUVECが死滅していた。また、HUVECの減衰に伴い、移植後11日には軟骨前駆細胞自体も死滅していた(図8C)。血液灌流を阻害することで、軟骨前駆細胞は、生着しないことが示された。また、免疫組織化学染色により、移植15日後の血液灌流を阻害した移植した三次元組織では、軟骨の基質であるII型コラーゲンが陰性であり、アポトーシス過程における中心的酵素であるcaspase3が陽性であることが確認できた(図8D)。一方で、血液灌流を阻害していない場合は、caspase3陽性の細胞は検出されず、II型コラーゲン陽性である軟骨組織を形成した。
4-7. 従来法との弾性軟骨再構築能の比較
　従来法であるペレット移植法44と、軟骨前駆細胞とHUVECを共培養することで構築した三次元組織との軟骨再構築の効率を比較するために、同一のクラニアルウインドウマウスの左脳に軟骨前駆細胞とHUVECを共培養することで構築した三次元組織、右脳にペレットを移植した(図9A)。アルシアンブルー染色により、移植後10日で、ペレットは青色に染色されなかったが、共培養することで形成した三次元組織は青色に染色された。このことから、HUVECと共培養することで、プロテオグリカンを産生する成熟軟骨細胞へと軟骨前駆細胞を高効率に分化させることが示唆された。移植後30日になると、共培養することで構築した三次元組織は、プロテオグリカンを多く産生している軟骨組織を形成していることがわかった。移植後60日には、共培養することで構築した三次元組織の大部分がAlcian Blue染色により濃く青色に染色されたため、終末分化した成熟軟骨組織を形成したことが確認できた。対照的に、従来法では移植したペレットに対して一部分でしか、プロテオグリカンを産生する軟骨組織を形成しなかった(図9A)。このことは、HUVECと共培養した軟骨前駆細胞の方がより効率的に軟骨を再構築していることを示している。 アルシアンブルー陽性領域を定量化するために、青色に染色されている部位をimage Jより抽出して、面積を測定した(図9B) 。軟骨前駆細胞とHUVECを共培養することで構築した三次元組織では、アルシアンブルー陽性領域は、移植後10日で約100,000 μm2、移植後30日で約130,000 μm2、移植後60日では約250,000 μm2であった。一方で、従来法であるペレット移植法では、移植後10日で約35,000 μm2、移植後30日で約20,000 μm2、移植後60日では約80,000 μm2の面積の軟骨組織を形成した。比較すると、共培養することで構築した三次元組織では、移植後10日で2.85倍、移植後30日で6.5倍、移植後60日では3.27倍の面積の軟骨組織を形成したことが示された(図9C)。
5. 考察
　軟骨組織は、軟骨細胞とそれを取り囲む細胞外基質からなる支持器官である。結合組織や骨組織といった他の支持組織と異なり、軟骨組織の細胞間質内には血管、リンパ管、神経などが存在しない45,46。そのため、複雑な高次構造を有する固形臓器などと比較して、再生医療の早期実現化が期待される領域である47,48。本研究では、軟骨形成プロセスをライブイメージングにより追尾観察することで、軟骨前駆細胞の分化段階において、従来不要と考えられていた血管が一過性に侵入することを見出した。移植した発生初期の耳介軟骨が、血管が侵入した直後に膨化したことから、軟骨前駆細胞が急激に増殖していると考えられる。血管が侵入する時期の耳介軟骨において、間葉系幹細胞の特異的マーカーとして報告されているCD44を発現している細胞を観察でき、その中の一部の細胞がKi67陽性を示した。そこで、軟骨前駆細胞と血管内皮細胞を共培養したところ、軟骨前駆細胞であるCD44+ CD90+細胞が増殖亢進していることが明らかになった。
　血管は酸素や栄養を供給し、老廃物を取り除くだけではなく、高次構造の構築に重要な役割を担っていることが明らかにされてきた49-52。例えば、肝臓における血管内皮細胞と肝細胞の相互作用についてはこれまでに、VEGFR2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2）ノックアウトマウスでは、血管新生の未形成により肝臓の形態形成が阻害されることがわかっている。しかし、軟骨組織のような血管の存在しない組織が発達するときの血管内皮細胞との相互作用については、全く未解明である。血管内皮細胞は発生が進むにつれて退行していくが、成長因子を用いずに軟骨前駆細胞に備わっている軟骨分化能を活性化させることが示唆された。成長因子は、臨床で使用する際には、高コストであることや安全性の面で問題が残っている。そのため、血管内皮細胞と共培養させることで、成長因子を使わずに軟骨前駆細胞から軟骨組織を構築することが出来る本技術は、臨床応用に向けた有益な技術になる可能性を示している。
　臨床応用に際して移植/再構築組織の形態の制御に関しても問題となっている。従来の組織工学的な手法によりヒト軟骨組織を作製するためには、スキャフォールドが必要と考えられてきた。スキャフォールドの多くは生物材料、合成高分子などで構成されている。しかし、臨床応用に耐え得るヒト軟骨組織の作製のためのスキャフォールドはまだ開発されていない。また、軟骨分化誘導した軟骨細胞をゲル状の基質を含めて直接皮下に注入する方法や、それらを一旦腹部皮下に移植し再構築された軟骨様組織を二期的に移植する方法などが開発されているが、いずれも再生軟骨を安定的に得られることは出来ない。本研究において、血管内皮細胞と共培養することで、足場材料を用いることなく、軟骨前駆細胞はin vitroで自律的に三次元組織を誘導が可能であることを示した。この三次元組織は、力学的強度を有しており、形状を崩すことなく移植できるため、移植時に形状の制御が容易になると考えられる。
　間葉系前駆細胞から軟骨分化誘導を行う従来研究の多くは、生着率が低いなどの理由から、極めて効率が悪く、移植細胞数に対し終末分化した軟骨細胞は10-20 %程度しか得られない。本研究で確立した弾性軟骨創出法は、終末分化誘導効率が大幅に上昇することから、従来法と比較して大型の弾性軟骨を効率的に再構築することが可能となるものと期待される。耳介軟骨のような複雑な形態を有する大型の弾性軟骨を再構築することが必要であり、現在、ヒト軟骨前駆細胞と血管内皮細胞を相互作用させることで構築した三次元組織を、マウスの皮下に大量に移植することで大型の弾性軟骨を創出できないか検証している。
　本研究で開発したヒト弾性軟骨創出法を臨床応用するためには、自己の軟骨に加えて、Human Leukocyte Antigen：HLAの適合する血管内皮細胞を安定して供給できるシステムを構築する必要がある。HLAとは、ヒトの免疫に関わる重要な分子として働いている。自分と異なるHLA型の人から細胞や臓器の移植を受けた場合、免疫拒絶反応が起こるため、HLA型をできるだけ合わせる必要がある。そのために、臍帯から血管内皮細胞を採取培養し保存する血管内皮細胞バンクを設立することが必要となる。臍帯はこれまで破棄されてきた生物資源であるが、臍帯血と同様に保存することが実現することで、血管内皮細胞を安定して供給すること出来ると考えられる。患者のHLA型と一致した血管内皮細胞と低侵襲で採取培養した軟骨前駆細胞と共培養させ、三次元組織化を誘導し移植することで、頭蓋・顎・顔面領域の先天奇形や外傷に起因する組織変形の新たな治療法を提供できると考えられる。　
　将来的には、in vitroで三次元的に軟骨組織を再構築することが望まれている。近年、注目されている三次元培養法としてはRotating Wall Vessel ( RWV ) bioreactorという回転する培養器を用いることで微小重力環境を摸倣する培養法が挙げられる。先行研究において、RWVを用い、ヒト耳介軟骨膜細胞と小型の新規スキャフォールドを組み合わせ、軟骨様組織を再構築した53。しかし、軟骨様組織の強度の面に関して問題の残る結果となった。そこで、軟骨形成プロセスで生じる血管化を再現するという独自のアプローチとRWVを組み合わせることにより、従来の培養技術では達成が困難であったin vitroでの終末軟骨分化誘導が期待される。
　耳介軟骨膜に存在する軟骨前駆細胞は、異種軟骨組織である硝子軟骨への分化能を有し、それらを移植することで関節軟骨組織を再構築できることを明らかにしている（未発表データ）。本技術は、一過性血管侵入を再現することで軟骨を効率的に創出するため、関節軟骨欠損の再生治療における移植後の軟骨再構築する効率が悪いという問題を解決することが可能である。関節軟骨は損傷を受けると、軟骨組織は治癒能を有さないことから関節炎や変形性膝関節症などの二次変性疾患へと進行する。日本だけでも膝変形性関節症の患者数は2530万人いると試算もあり、治療対象となる患者数は相当数に及ぶ。低侵襲で採取できる軟骨膜に存在する軟骨前駆細胞を血管内皮細胞と共培養させ、三次元組織化を誘導し移植することで、莫大なニーズのある関節軟骨欠損に対する新たな治療法になると期待される。
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〔実施例２〕固さの異なるゲル上での培養
　実施例１で採取、継代した軟骨膜細胞 3x106 cellsと血管内皮細胞 1x106 cellsを、実施例１と同じ培養条件で、硬さ条件：0.5kPaのゲル（細胞培養用ハイドロゲル　評価用サンプルプレート（VERITAS））上で培養した。初日、培養1日目、2日目の三次元組織形成の状態を図１０に示す。
　細胞培養用ハイドロゲル　評価用サンプルプレート（VERITAS）を用いて、0.2kPaから50kPaまでの様々な硬さ条件において、細胞を播種した。その結果を図１１に示す。なお、通常の培養皿としては、10cmイージーグリップ細胞培養ディッシュ(FALCON)を用いた。
　硬さ条件0.5～25kPaのプレートを用いた場合において、軟骨膜細胞は移植操作に耐え得る三次元組織を良好に形成した。通常の培養皿を用いた場合は、三次元組織を形成しなかった。
〔実施例３〕底面に細胞が集まるような形状のプレート上での培養
　軟骨膜細胞 3x104 cellsと血管内皮細胞 1x104 cellsを、U底形状を有するPrimeSurface 96well細胞培養用培養基材（住友ベークライト）で培養した（図12A）。三次元組織の培養には、軟骨分化誘導培地を用いた。（10 %FBS（GIBCO）、1 % Antibiotic Antimycotic Solution、L-ascorbic acid 2-phosphate（WAKO）、Dexamethasone（SIGMA）、Insulin Growth Factor-Ｉ（SIGMA）、basic Fibroblast Growth Factor（科研製薬）を含有するD-MEM/F-12 medium（SIGMA））初日、培養2日目の三次元組織形成の状態を図１２Bに示す。播種された軟骨膜細胞は自律的に凝集を開始し、翌日には400μm程度の球状の三次元組織を形成した。これらはピペット操作などで容易に、形状を保ったまま回収が可能であった。
〔実施例４〕皮下への大量移植
　実施例１と同様の方法で、軟骨膜細胞 3x106 cellsと血管内皮細胞 1x106 cellsを、Matrigel（BD）上で共培養することにより形成された4mm大の三次元組織100個を薬匙により回収し、NOD SCIDマウス（三協ラボ）の皮下へ移植を行った。その状態を図１３に示す。図１３のAは皮下に大量に三次元組織を配置した状態を示し、図１３のBは薬匙によって回収を行っている３０個程度の三次元組織を示す。
〔実施例５〕関節軟骨欠損部への移植
　実施例３と同様の方法で、軟骨膜細胞 3x104 cellsと血管内皮細胞 1x104 cellsから形成された400μm大の三次元組織600個を、免疫不全ラット（日本クレア）の関節軟骨表面に作成した3mm大の軟骨欠損部位に移植を行った。その状態を図１４に示す。図１４のAは関節欠損部位に大量に回収した400μm程度の三次元組織をピペットにより移植操作を行っている状態を示す。図１４のBは移植直後の関節欠損部位を示す。移植後２０分程度静置し、三次元組織が流れ出ない状態になった後、閉創を行った。
〔実施例６〕血管内皮細胞との共培養により、軟骨形成細胞は分化マーカーの発現を増強する
　10cmイージーグリップ細胞培養ディッシュ(FALCON)で培養を行った軟骨形成細胞と、ゲル上で血管内皮細胞と共培養を行った軟骨形成細胞の遺伝子発現を、Realtime PCRにより解析を行った。血管内皮細胞との共培養により、未（脱）分化マーカーであるCollagen I遺伝子の発現が減弱し（図１５、左）、軟骨分化マーカーであるSOX9とAggrecanの発現が増強した（図１５、右）。
〔実施例７〕in vitro長期培養
　軟骨膜細胞 3x106 cellsと血管内皮細胞 1x106 cellsを、Matrigel（BD）上でEndothelial Cell Growth Medium SingleQuots Supplements and Growth Factors(EGM)(lonza)で２日間共培養を行うことにより4mm大の三次元組織が形成され、血管構造の形成を認めた。さらにその後、増殖培地( 10 ％Fetal Bovine Serum(FBS；GIBCO)、1 ％Antibiotic Antimycotic Solution(SIGMA)を添加したDULBECCO’S MODIFIED EAGLE’S MEDIUM NUTRIENT MIXTURE F-12 HAM(D-MEM/F-12；SIGMA))、または、軟骨分化誘導培地（10 %FBS（GIBCO）、1 % Antibiotic Antimycotic Solution、L-ascorbic acid 2-phosphate（WAKO）、Dexamethasone（SIGMA）、Insulin Growth Factor-Ｉ（SIGMA）、basic Fibroblast Growth Factor（科研製薬）を含有するD-MEM/F-12 medium（SIGMA））で１０日程度培養を行うことで、血管構造が消失することが確認された。これらは３０日以上の長期にわたって培養を行うことが可能であった。
〔実施例８〕
　10%DMSO、５％ ethylene glycol、10% sucrose含有増殖培地によるガラス化法による急速凍結法、および、TCプロテクター(大日本住友製薬株式会社)を用いることによる緩慢凍結法、による３次元組織の凍結実験を実施した。
　凍結１週間後に増殖培地により融解を行ったのち、0.2 ％Collagenase typeII(Worthington)を含有するDulbecco’s modified Eagle medium and Ham’s F-12 medium(D-MEM/F-12；SIGMA)溶液に懸濁し、インキュベーター内で20分静置し、ピペッティングにより細胞の単細胞化を行った。単離された細胞懸濁液をトリパンブルー染色により染色を行った。自動セルカウンター「CountessTM」（InvitrogenTM）により、トリパンブルー染色陰性の生存細胞の数を計測したところ、DMSOを用いる方法では、74%の細胞が生存していたのに対し、TCプロテクターを用いる方法では、88%の細胞が生存していた。細胞は再度培養皿へと播種することにより、良好な増殖性を保っていた。さらに、融解された組織は形状を維持したまま、NOD SCIDマウス（三協ラボ）背部皮下への移植実験に用いることが可能であった。
〔実施例９〕支持体の検討（図１６）
方法
　２４-ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに次の複数種類の支持体をゲル化し、固着した。
１．Ｍａｔｒｉｇｅｌ原液～希釈率（１６倍希釈まで）。
２．４～０．５％アガロースゲル。
３．Ｉ型コラーゲンゲル（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
　上記に示す様々な支持体上に、２．０×１０６ｃｅｌｌｓの軟骨膜細胞，０．６×１０６ｃｅｌｌｓのＨＵＶＥＣの各細胞懸濁液を混合し，遠心分離（９５０　ｒｐｍ、４　℃、５　ｍｉｎ）ののちに，回収した細胞をウェルに播種した。３０分静置後，ＥＧＭを１　ｍｌ添加し，３日間培養した。
結果
　血管化軟骨作製に用いる支持体条件の検討結果を図１６に示す。
A) マトリゲルの希釈率を検討した結果、８倍希釈まで血管化軟骨を作製することが可能であった。
B) アガロースゲルを用いた条件ではいずれの場合においても血管化軟骨の形成を認めなかった。
C) Ｉ型コラーゲンを用いた場合においても血管化軟骨の形成を認めなかった。
〔実施例１０〕凍結保存を行った血管化軟骨移植によるヒト成熟軟骨の創出（図１７）
方法
・血管化軟骨の凍結（図１７Ａ）
　ＴＣ　ｐｒｏｔｅｃｔｏｒを凍結用ｔｕｂｅに分注（２００～１０００ｕｌ／ｔｕｂｅ）した。その後、２４-ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅで誘導した三次元組織を浸漬し、４℃にて数時間からｏｖｅｒ　ｎｉｇｈｔしたのちに、-８０℃にて緩慢凍結を行った。
　なお、急速凍結（ガラス化）法を用いる場合には、１０％　ＤＭＳＯ，　５％　ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ，　及び　１０％　ｓｕｃｒｏｓｅ　添加した組織をＥＧＭ培地に１５～２０分浸したのちに、２Ｍ ＤＭＳＯ，　１　Ｍ　ａｃｅｔａｍｉｄｅ，　３Ｍ　ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ添加を行ったＤＭＥＭ／Ｆ１２（ｂＦＧＦ，　ＩＧＦ，　Ｄｅｘ，　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　Ａｃｉｄ，　ＩＴＳ-Ｘ，　１０％ＦＢＳ，　１％ＡＢＡＭ）培地（２００　ｕｌ／ｔｕｂｅ）に移した。その後直ちに液体窒素に浸し、液体窒素タンクにて保存を行った。
・血管化軟骨の融解（図１７Ｂ）
　凍結された組織を、-８０℃から３７℃　ｗａｔｅｒ　ｂａｔｈに移し、融解したのち、１５　ｍｌ遠心管に移した。４℃，　７５０ｒｐｍ，　３ｍｉｎ．　で遠心ののち、上清をピペットマンなどで除去した。（アスピレーターは組織を吸ってしまうので、使用しなかった。）ＰＢＳ　ｗａｓｈ（５　ｍｌ／ｔｕｂｅ）ののち、４℃，１５００ｒｐｍ，５　ｍｉｎで再度遠心を行い、上清の除去（ピペットマンなどで）を行い、その後、移植、ないし培養実験に用いた。
・融解を行ったヒト血管化軟骨の皮下移植（図１７Ｃ）
　6週齢で雌のNOD/SCID（免疫不全）マウスを、三協ラボサービス株式会社より購入した。購入したマウスは、横浜市立大学 先端医科学研究センター 共同研究支援部門動物実験センター内において飼育・維持され、これらを用いた動物実験に関しては、横浜市立大学福浦キャンパス動物実験指針に則って行った。免疫不全マウスを剃毛の後に、背部皮下ないし、顔面部皮下を切開・剥離し，回収した組織を埋入し，移植を実施した。
　摘出した組織を、4 %パラホルムアルデヒド（PFA）（Wako）/リン酸緩衝食塩液（PBS）（pH7.4）で4 ℃、2時間固定した。次に、100 mM塩化アンモニウム（Wako）/PBSで4 ℃、10分間、3回洗浄した。そして、15 %スクロース（Wako）/PBSに4 ℃、1 時間浸した後，30%スクロース/PBSで4 ℃、over nightで静置した。O.C.T. Compound（SAKURA Japan）（30 ml）に組織を包埋した。4 ℃、1 時間静置した後、液体窒素で急速凍結し、凍結ブロックを作製した。凍結ブロックをクリオスタットHM 500 O（ZEISS）で5 μmの厚さに薄切し、凍結組織切片を作製した。作製した組織切片は、Alcian Blue染色(武藤化学薬品)、Elastica Van Gieson染色(武藤化学薬品)を行った。
　蛍光免疫染色に関しては、凍結ブロックをクリオスタットHM 500 O（ZEISS）で5 μmの厚さに薄切し、凍結組織切片を作製した。作製した組織切片を0.1%tween-TBSで洗浄してOCT Compoundを除去後、凍結切片周囲のTBS-Tを拭き取り、染色対象を撥水ペン(DAKO)で囲むように書き、撥水処理を施した。次に、protein block Serum-Free Ready-to-use(Dako)を用い、4 ℃で24時間ブロッキングを行った。一次抗体は4℃で一晩反応させた。処理後、TBS-Tで5分間3回洗浄し、二次抗体を滴下し、室温で2時間反応させた。TBS-Tで5分間3回洗浄し、DAPIを添加したFA Mounting Fluid(Becton Dickinson)にて核染色および封入を行った。一次抗体および二次抗体の希釈には、protein block Serum-Free Ready-to-use(Dako)を用いた。
結果
　血管化軟骨の凍結工程の様子を図１７Ａに示す。左；培養皿内で形成された組織、中；薬さじにて回収した様子、右；凍結用溶媒（TC Protector）に回収した組織を浸漬した凍結直前の様子。図１７Ｂは、凍結後、１か月後に融解を行ったヒト血管化軟骨の肉眼観察を示す。図１７Ｃは、融解を行ったヒト血管化軟骨の皮下移植サンプルの組織学的解析を示す。免疫不全マウス背部の皮下へ移植を行ったサンプルの組織学的解析の結果、移植を行ったヒト血管化軟骨は、アルシアンブルーおよびII型コラーゲン抗体によって染色される軟骨基質を含有する軟骨組織を再構築することが明らかとなった。
〔実施例１１〕血管化軟骨の長期培養（図１８、１９）
方法
　２４-ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに１５０　μｍのＥＧＭとＭａｔｒｉｇｅｌをそれぞれ添加し，　インキュベーター内で３０分静置した。２．０×１０６ｃｅｌｌｓの軟骨膜細胞，　０．６×１０６ｃｅｌｌｓのＨＵＶＥＣの各細胞懸濁液を混合し，遠心分離（９５０　ｒｐｍ、４　℃、５　ｍｉｎ）を行い，回収した細胞をウェルに播種した。３０分静置後，　ＥＧＭを１　ｍｌ添加し，　３日間培養した。誘導した三次元組織を培養ベッセルに播種し，三次元培養用軟骨分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２，　Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，　ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ　２-ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，　ｂＦＧＦ，　ＩＧＦ-１，　ＩＴＳ-Ｘ，　１％　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）により，気相条件を３７　℃，ＣＯ２濃度５　％に設定したインキュベーター内でＲＷＶ　ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ）により回転培養を行った。回転速度は　７～１２ｒｐｍに調整した。６０日間の軟骨分化培養の後，5mm～1cm大の大きさを有する細胞塊を回収し，ピンセット等で用手圧迫を行うことで力学的強度の確認を行った。強度が充分であることを確認のうえ，免疫不全マウスの頭部へと移植した。 
結果
　図１８は、長期培養血管化軟骨の組織学的解析を示す。作製した血管化軟骨を６０日間にわたり長期培養することにより、血管を含む軟骨膜組織と血管が排除された軟骨組織の形成を認めた。左上；形成された組織の肉眼像、右上；免疫染色により中心部は軟骨マーカーであるAggrecanを発現し、周囲にはLamininが存在することを示す。下段左；免疫染色拡大図、下段中；HE染色、下段右；アルシアンブルー染色。誘導を行った三次元組織はピンセットで用手圧迫を行っても、組織が破壊されない高い力学的強度を有していた。
　図１９は、長期培養を行った血管化軟骨由来成熟軟骨の移植を示す。長期培養血管化軟骨（上段左図の左下の小窓に示す）は顔面部の移植により、皮下の緊張に耐えうる力学的強度を有した軟骨組織であった。上段と下段の写真は、角度を変えて盛り上がっている部分の見え方を確認したものである。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明は、再生医療、医薬品のスクリーニング、軟骨細胞が産生する基質の生産などに利用することができる。

Claims (20)

  1. 軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することを含む、軟骨細胞の調製方法。
  2. 軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することで、軟骨形成細胞が増幅する請求項１記載の方法。
  3. 支持体上で軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより、三次元組織が形成される請求項１又は２記載の方法。
  4. 支持体が0.5～25 kPaの硬度を有する基材である請求項３記載の方法。
  5. 底面に細胞が集まるような形状のプレート上で軟骨形成細胞を血管細胞と共培養することにより、三次元組織が形成される請求項１又は２記載の方法。
  6. 線維芽細胞増殖因子2（bFGF（FGF2））、線維芽細胞増殖因子4（FGF4）、線維芽細胞増殖因子5（FGF5）、骨形成因子2（BMP2）、骨形成因子3（BMP3）、骨形成因子4（BMP4）、骨形成因子6（BMP6）、結合組織増殖因子（CTGF）、トランスフォーミング増殖因子β1（TGF-β1）、トランスフォーミング増殖因子β2（TGF-β2）、トランスフォーミング増殖因子β3（TGF-β3）、インスリン様成長因子1（IGF-1）、肝細胞増殖因子（HGF）、アグリカン（Aggrecan）、ヒアルロン酸（Hyaluronic Acid）、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＳ）、内皮細胞由来成長因子（ＥＣＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（acidic ＦＧＦ）、マクロファージ由来成長因子（ＭＤＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍血管新生因子（ＴＡＦ）、血管内皮増殖因子（VEGF）ウシ脳抽出液（ＢＢＥ）、ウシ脳下垂体抽出液（ＢＰＥ）、糖質コルチコイド、コレステロール、各種ビタミンからなる群より選択される少なくとも１つの成分の存在下で、軟骨形成細胞を血管細胞と共培養する請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 軟骨形成細胞と血管細胞を１：０．３～１の混合比で共培養する請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 軟骨形成細胞が、軟骨細胞、未熟軟骨細胞、軟骨前駆細胞又は軟骨幹細胞である請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 軟骨細胞が、肋骨軟骨、鼻軟骨、耳軟骨、気管軟骨、喉頭軟骨、甲状軟骨、披裂軟骨、環状軟骨、腱、靭帯、関節間軟骨及び椎間板からなる群より選択される組織から得られたものである請求項８記載の方法。
  10. 未熟軟骨細胞、軟骨前駆細胞又は軟骨幹細胞が、軟骨、軟骨膜、骨髄、胎盤、臍帯、皮膚、筋肉、脂肪及び骨膜からなる群より選択される組織から得られたものである請求項８記載の方法。
  11. 軟骨形成細胞と血管細胞が同じ個体に由来する請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 軟骨形成細胞と血管細胞が異なる個体に由来する請求項１～１０のいずれかに記載の方法。
  13. 請求項１～１２のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞を含む、軟骨再生医療用組成物。
  14. 生体内に移植し、軟骨組織を形成させるために用いられる請求項１３記載の組成物。
  15. 生体内に移植した後、血管網が構築される請求項１４記載の組成物。
  16. 血管網に血管潅流が生じる請求項１５記載の組成物。
  17. 血管網が構築された後、消失し、血管構造を欠く軟骨組織が形成される請求項１６記載の組成物。
  18. 請求項１～１２のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞、該軟骨細胞から形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、医薬品として有効な薬剤をスクリーニングする方法。
  19. 請求項１～１２のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞、該軟骨細胞から形成された軟骨組織及び/又は該軟骨組織由来の細胞を用いて、軟骨細胞が産生する基質を調製する方法。
  20. 請求項１～１２のいずれかに記載の方法により調製された軟骨細胞を生体内に移植し、軟骨組織を形成させることを含む、軟骨再生方法。
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