CN114729329A - Lbm、cpc、opc、它们的制备和质量控制方法、试剂盒、移植材料和疾病模型 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种肢芽间充质细胞群，其衍生自哺乳动物侧板中胚层细胞，并且是PRRX1蛋白阳性的。

Description

LBM、CPC、OPC、它们的制备和质量控制方法、试剂盒、移植材料 和疾病模型
相关申请
本申请要求于2019年9月18日提交的日本专利申请No.2019-169278，以及于2020年3月31日提交的日本专利申请No.2020-62441的优先权权益，其全部内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本发明涉及一种肢芽间充质细胞群、软骨祖细胞群、成骨祖细胞群、其制备方法和质量控制方法、移植材料和疾病模型。
在本文中，术语“CPC”用于意指软骨祖细胞或软骨祖细胞群，以及术语“LBM”用于意指肢芽间充质细胞或肢芽间充质细胞群。术语“OPC”用于意指成骨祖细胞或成骨祖细胞群。此外，有时将“PRRX1-阳性”描述为PRRX1高，以及有时将“PRRX1-阴性”描述为PRRX1低。
背景技术
间充质干细胞是体干细胞的一种，是具有分化成成骨细胞和软骨细胞等细胞的能力的细胞。正在考虑将它们应用于再生医学，但存在分化诱导效率低和自我生长能力有限的困难。此外，涉及使用多能干细胞的相关技术分化诱导方法集中于直接诱导成目标组织细胞，但其低的诱导效率和低的质量将被视为难题(非专利文献1和2)。
此外，当成骨细胞或软骨细胞的质量差时，所获得的骨组织或软骨组织的质量就会下降，因此无法移植到活体中。
引用列表
非专利文献
NPL 1:Stem Cell Reports.2015年3月10日；4(3):404-18.
NPL 2:Nat Biotechnol.2015年6月；33(6):638-45.
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供一种能够高效且高纯度地产生目标骨组织或软骨组织的肢芽间充质细胞群、成骨祖细胞群或软骨祖细胞群，其制备方法以及其质量控制方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于从哺乳动物多能干细胞中获得肢芽间充质细胞群、成骨祖细胞群、软骨祖细胞群或可由其诱导的软骨细胞或软骨组织的试剂盒。
本发明的再一个目的是提供一种用于治疗骨相关疾病或软骨相关疾病的移植材料。
本发明的又一个目的是提供一种骨相关疾病或软骨相关疾病模型。
解决问题的方案
本发明提供了一种如下所述的肢芽间充质细胞群、软骨祖细胞群、成骨祖细胞群，其制备方法及其质量控制方法、试剂盒、移植材料和疾病模型。
项目1、一种肢芽间充质细胞群，其衍生自哺乳动物侧板中胚层细胞，并且是PRRX1蛋白阳性的。
项目2、根据项目1所述的肢芽间充质细胞群，其中，所述肢芽间充质细胞群满足选自CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性中的至少一种条件。
项目3、一种制备项目1或2所述的肢芽间充质细胞群的方法，其包括以下步骤：
诱导多能干细胞分化为侧板中胚层细胞；和
在Wnt信号激活和非FGF信号激活条件下培养在所述分化诱导步骤中获得的所述侧板中胚层细胞。
项目4、一种制备成骨祖细胞群的方法，其包括在无Wnt信号激活剂的环境下培养根据项目1或2所述的肢芽间充质细胞群的步骤。
项目5、一种制备哺乳动物软骨祖细胞群的方法，其包括在Wnt信号激活环境下培养根据项目1或2所述的肢芽间充质细胞群的步骤。
项目6、根据项目5所述的制备哺乳动物软骨祖细胞群的方法，其中所述方法包括在Wnt信号激活环境下并且在FGF信号激活条件下，培养项目1或2所述的肢芽间充质细胞群的步骤。
项目7、一种哺乳动物肢芽间充质细胞群的质量控制方法，其包括确定哺乳动物肢芽间充质细胞是否满足选自以下中的至少一种条件的步骤：CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性。
项目8、一种哺乳动物软骨祖细胞群的质量控制方法，其包括确定哺乳动物软骨祖细胞是否满足选自以下中的至少一种条件的步骤：CD90阳性和CD140B阳性。
项目9、一种哺乳动物软骨祖细胞群，其满足选自CD90阳性和CD140B阳性中的至少一种条件。
项目10、根据项目9所述的哺乳动物软骨祖细胞群，其中所述哺乳动物软骨祖细胞群是冷冻保存的。
项目11、一种哺乳动物成骨祖细胞群，其具有95％以上的RUNX2阳性率。
项目12、根据项目11所述的哺乳动物成骨祖细胞群，其中所述哺乳动物成骨祖细胞群是冷冻保存的。
项目13、一种用于将哺乳动物多能干细胞诱导成肢芽间充质细胞(LBM)的试剂盒，其包括以下项目(i)至(iii)：
(i)用于将多能干细胞诱导成原始条纹细胞的培养基；
(ii)用于将原始条纹细胞诱导成侧板中胚层细胞的培养基；和
(iii)用于将侧板中胚层细胞诱导成肢芽间充质细胞的培养基。
项目14、一种用于将哺乳动物多能干细胞诱导成软骨祖细胞的试剂盒，其包括以下项目(i)至(iv)：
(i)用于将多能干细胞诱导成原始条纹细胞的培养基；
(ii)用于将原始条纹细胞诱导成侧板中胚层细胞的培养基；
(iii)用于将侧板中胚层细胞诱导成肢芽间充质细胞的培养基；和
(iv)用于将肢芽间充质细胞诱导成软骨祖细胞的培养基。
项目15、一种用于将哺乳动物多能干细胞诱导成软骨细胞的试剂盒，其包括以下项目(i)至(v)：
(i)用于将多能干细胞诱导成原始条纹细胞的培养基；
(ii)用于将原始条纹细胞诱导成侧板中胚层细胞的培养基；
(iii)用于将侧板中胚层细胞诱导成肢芽间充质细胞的培养基；
(iv)用于将肢芽间充质细胞诱导成软骨祖细胞的培养基；和
(v)用于将软骨祖细胞诱导成软骨细胞的培养基。
项目16、一种用于将哺乳动物多能干细胞诱导成RUNX2-阳性成骨祖细胞的试剂盒，其包括以下项目(i)至(iv)：
(i)用于将多能干细胞诱导成原始条纹细胞的培养基；
(ii)用于将原始条纹细胞诱导成侧板中胚层细胞的培养基；
(iii)用于将侧板中胚层细胞诱导成肢芽间充质细胞的培养基；和
(iv)用于将肢芽间充质细胞诱导成RUNX2-阳性成骨祖细胞的培养基。
项目17、一种移植材料，其包含：
根据项目9或10所述的哺乳动物软骨祖细胞群；或
通过从所述软骨祖细胞群分化诱导而获得的软骨细胞或软骨组织。
项目18、一种移植材料，其包括：
根据项目11或12所述的哺乳动物成骨祖细胞群；或
通过从所述成骨祖细胞群分化诱导而获得的成骨细胞或骨组织。
项目19、一种软骨相关疾病模型，其包括：
软骨祖细胞群，所述软骨祖细胞群由软骨相关疾病患者衍生的iPS细胞诱导，并且满足选自CD90阳性和CD140B阳性中的至少一种条件；或
由所述软骨祖细胞群诱导的软骨细胞。
项目20、一种骨相关疾病模型，其包括：
成骨祖细胞群，所述成骨祖细胞群由骨相关疾病患者衍生的iPS细胞诱导，并且具有95％以上的RUNX2-阳性率；或
由所述成骨祖细胞群诱导的成骨细胞。
本发明的有益效果
根据本发明，通过对肢芽间充质细胞群或软骨祖细胞群的质量控制，可以获得用于再生的高质量的软骨组织和软骨的移植材料。
本发明获得的肢芽间充质细胞群和由其诱导的成骨祖细胞群或软骨祖细胞群，或由软骨祖细胞群诱导的软骨细胞或软骨组织可作为移植材料用于治疗骨相关疾病或软骨相关疾病。本发明人已经认识到，本发明的移植材料是一种安全的移植材料，其不会引起良性或恶性肿瘤。
通过使用本发明的成骨祖细胞群或软骨祖细胞群可以获得高质量的骨组织或软骨组织。
通过使用本发明的试剂盒，可以容易地从多能干细胞(比如iPS细胞)中获得肢芽间充质细胞群、成骨祖细胞群、软骨祖细胞群、或可由其诱导的软骨细胞或软骨组织。
当从骨相关疾病或软骨相关疾病患者的iPS细胞诱导本发明的肢芽间充质细胞群、软骨祖细胞群或成骨祖细胞群时，该细胞群可用于产生骨疾病模型或软骨疾病模型，并且进一步地用于生成骨相关疾病或软骨相关疾病模型。
通过使用本发明的疾病模型，可以研究骨相关疾病或软骨相关疾病的病理学，并且可以支持新型治疗药物的开发。
附图说明
图1为本发明的分化诱导方案的概要图。
图2为用于产生PRRX1报告基因的靶向载体的示意图。
图3为通过侧板中胚层谱系分化诱导成PRRX1阳性细胞的方案的图。
图4示出了HAND1(侧板中胚层标志物)的免疫染色结果。
图5示出了CDX2(轴旁中胚层标志物)的免疫染色结果。
图6为通过侧板中胚层谱系分化诱导成PRRX1阳性细胞的方案的图。
图7示出了各种信号所使用的激活剂和/或抑制剂(16种组合)。
图8示出了tdTomato的荧光图像。
图9示出了PRRX1的定量RT-PCR(qPCR)的测量结果。
图10示出了HAND1(侧板中胚层标志物)的定量RT-PCR(qPCR)的测量结果。
图11示出了ISL-1(侧板中胚层标志物)的定量RT-PCR(qPCR)的测量结果。
图12示出了FOXF1(侧板中胚层标志物)的定量RT-PCR(qPCR)的测量结果。
图13为用于从侧板中胚层细胞(第2天)诱导PRRX1阳性细胞的优选方案的图。
图14示出了流式细胞术的结果。
图15示出了使用PRRX1抗体的免疫染色结果。
图16示出了CD抗原等的表达谱(1)。
图17示出了CD抗原等的表达谱(2)。
图18示出了CD抗原等的表达谱(3)。
图19为分化诱导方案的图。
图20示出了不同时间点的相差显微照片。
图21示出了不同时间点的PRRX1 mRNA表达量。
图22示出了不同时间点的侧板中胚层标志物(HAND1、ISL1和FOXF1)的mRNA表达量。
图23示出了使用PRRX1抗体的免疫染色结果。
图24示出了不同时间点的相差显微照片。
图25示出了不同时间点的PRRX1和中胚层标志物(HAND1、ISL1和FOXF1)的mRNA表达量。
图26示出了使用PRRX1抗体的免疫染色结果。
图27为通过轴旁中胚层谱系分化诱导成PRRX1阳性细胞的方案的图。
图28示出了HAND1(侧板中胚层标志物)的免疫染色结果。
图29示出了CDX2(轴旁中胚层标志物)的免疫染色结果。
图30示出了各种信号所使用的的激活剂和/或抑制剂(6种组合)。
图31示出了tdTomato的荧光图像。
图32示出了流式细胞术的结果。
图33示出了PRRX1、轴旁中胚层标志物(CDX2)和体节标志物(MEOX1和PARAXIS)的定量RT-PCR(qPCR)的测量结果。
图34示出了各种信号所使用的激活剂和/或抑制剂(16种组合)。
图35示出了RUNX2的定量RT-PCR(qPCR)的测量结果。
图36为分化诱导方案的图。
图37示出了定量RT-PCR(qPCR)的测量结果。
图38示出了RUNX2的定量RT-PCR(qPCR)的测量结果。
图39示出了RUNX2的免疫染色结果。
图40示出了流式细胞术的结果。
图41示出了用茜素红染色的结果。
图42为分化诱导方案的图。
图43示出了不同条件下的相差图像。
图44示出了包被的研究结果。(A)接种到涂有各种包被剂的培养皿中，该培养皿使用Stem Medium 3。(B)选择与诱导分化时使用的包被剂相同的iMatrix-511(临床级)包被。
图45示出了在传代培养期间不同传代数的相差显微照片。PN：传代数。
图46示出了流式细胞术分析结果和生长曲线。PN：传代数。
图47示出了从各种多能干细胞诱导的hCPCs的生长能力的比较。
图48：LBM细胞的质量控制方法的开发。图48(a)：414C2 iPSC系的染色体核型，图48(b)：从414C2 iPSC系建立的人CPC(PN3)的核型。
图49示出了液氮保存前后细胞的相差图像。图49(a)：液氮保存前，图49(b)：液氮保存后。
图50示出了通过在RUNX2阳性成骨祖细胞分化诱导培养基中诱导hCPCs和人LBM(第4天)获得的细胞(衍生自hCPCs和衍生自LBM)的RUNX2表达。结果表明，在衍生自hCPCs的细胞中未发现RUNX2表达的增加。
图51：相应hCPCs的软骨细胞标志物(SOX5、SOX6、SOX9、COL2A1和ACAN)的表达。图51(a)：衍生自各种iPS细胞的hCPCs的SOX9表达，图51(b)：用步骤1培养基和步骤2培养基处理hCPCs的方案，图51(c)：具有细胞因子(完整)或无细胞因子(w/o细胞因子)的细胞的分析结果，图51(d)：软骨细胞标志物(SOX5、SOX6、SOX9、COL2A1和ACAN)的mRNA表达结果。
图52：透明软骨样组织体的产生和染色。图52(a)：从hCPCs获得透明软骨的方案，图52(b)：步骤3处理的第42天的透明软骨组织体，图52(c)：HE染色、阿尔新蓝染色、番红O染色和软骨细胞标志物(SOX9和COL2)、肥大软骨细胞标志物(COLX)和纤维软骨标志物(COL1)的免疫染色的结果。
图53示出了用番红O对由人LBM(第4天)和hCPCs诱导的软骨组织染色的结果。这表明hCPCs比人LBM具有更高的软骨组织形成能力。
图54：透明软骨样组织体向NOD-SCID小鼠内的皮下移植。图54(a)：从hCPCs诱导软骨组织体的方案，然后是皮下移植，图54(b)：从皮下取出的透明软骨样组织体切片的生成，图54(c)：衍生自相应iPS细胞(414C2和Reporter)或ES细胞(SEES6)的透明软骨样组织体的SafO染色结果。
图55：人源软骨组织块向SCID大鼠的软骨缺损部位移植的实验。图55(a)：软骨组织块的产生及其向软骨缺损部位的移植，图55(b)：移植2周后移植组织的植入识别。
图56：透明软骨样组织体向NOD-SCID小鼠的皮下移植。图56(a)：hCPC向小鼠的肾被膜囊下移植的方案，图56(b)：移植后第8周获得的透明软骨组织体的免疫染色结果，图56(c)：肾被膜囊下移植后立即拍摄的照片。
图57：软骨板的生成，图57(a)：从hCPCs获得软骨板的方案，图57(b)：将hCPC球状体装入模具后、培养15天和培养30天后立即拍摄的照片。
图58示出了在模具中形成的软骨板组织的番红O染色的结果。图58(a)：模具中形成的软骨板组织的番红O染色的结果。图58(b)：模具中形成的软骨板组织向NOD-SCID小鼠中的皮下移植，以及移植3周后的番红O染色的结果。
图59：软骨祖细胞(CPC)质量控制技术概述。开发了一种CPC质量控制(＝软骨细胞/软骨组织形成能力)方法。为了稳定地从CPC提供软骨细胞/软骨组织，重要的是在满足选自CD90阳性和CD140B阳性中的至少一种条件的状态下对hCPC进行扩增培养。
图60为肢芽间充质细胞(LBM)的质量控制技术的概述图。开发了一种LBM质量控制(＝PRRX1阳性CPC形成能力)方法。为了从LBM提供具有高软骨组织形成能力的CPC，重要的是在满足选自CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性中的至少一种条件的状态下从LBM诱导CPC，特别重要的是在满足选自CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性中的至少一种条件的状态下从LBM诱导CPC。
图61(a)和图61(b)：PRRX1阳性人软骨祖细胞(hCPCs)的PRRX1表达模式。图61(c)：由此产生的软骨组织的染色结果。将处于每种PRRX1表达状态的hCPCs自它们的培养皿中收集并进行分化诱导。将软骨分化诱导后形成的组织固定，进行HE染色、阿尔新蓝染色和番红O染色，结果发现维持在具有高PRRX1表达量状态的hCPCs具有高软骨细胞/软骨组织形成能力，而维持在具有低PRRX1表达量状态的hCPCs具有低软骨细胞/软骨组织形成能力。换言之，发现了PRRX1的表达量与其最终的软骨组织形成能力呈正相关。
图62：由于PRRX1表达量的差异，在平面软骨分化诱导时采用阿尔新蓝的可染色的差异。
将具有高PRRX1表达量的hCPCs(PRRX1阳性)或具有低PRRX1表达量的hCPCs(PRRX1阴性)接种到培养皿中，并按照图示的程序进行分化诱导。软骨分化诱导后，将细胞固定并进行阿尔新蓝染色，结果只有具有高PRRX1表达量的hCPCs形成了阿尔新蓝阳性结节(nodule)。
图63：在以下2种组合的每一种中进行RNAseq，提取具有高PRRX1表达的样品中上调的基因。从组合(1)中提取了901个基因，从组合(2)中提取了317个基因。
能够鉴定出两种组合共有的189个基因(＝优质细胞标志物分子)。
组合(1)：hCPCs(PRRX1-阳性峰)vs hCPCs(PRRX1-阴性峰)，
组合(2)：hCPCs中PRRX1阳性级分vs PRRX1阴性级分(双峰)。
图64：在以下2种组合的每一种中进行RNAseq，提取具有低PRRX1表达的样品中上调的基因。从组合(3)中提取了728个基因，从组合(4)中提取了479个基因。
能够鉴定出两种组合共有的220个基因(＝劣质细胞标志物分子)。
组合(3)：hCPCs(PRRX1-阳性峰)vs hCPCs PRRX1-阴性峰)，
组合(4)：hCPCs中PRRX1阳性级分vs PRRX1阴性级分(双峰)。
图65：对PRRX1阳性hCPC特异性的基因
用基因分析软件对优质标志物分子(189个基因)和劣质标志物分子(220个基因)进行分析，结果发现优质标志物分子(189个基因)是定义hCPCs的基因。
图66：用Enricher软件对优质标志物分子(189个基因)和劣质标志物分子(220个基因)进行分析，结果发现优质标志物分子(189个基因)与表征hCPCs的转录调节因子的表达模式类似。
图67：选择PRRX1阴性或PRRX1阳性hCPCs的候选基因
RNAseq鉴定的每种表面抗原的流式细胞仪结果与PRRX1的表达量具有相关性。将具有低PRRX1表达量的hCPCs(PRRX1-阴性)或具有高PRRX1表达量的hCPCs(PRRX1-阳性)用针对相应表面抗原的抗体染色，并通过流式细胞术比较表达量。结果，发现在PRRX1阳性细胞中CD90和CD140B有高的表达。
图68(a)和图68(b)：PRRX1阳性人肢芽间充质细胞(LBM)和由产生其的hCPCs的PRRX1表达模式。图68(c)：由相应hCPCs产生的软骨组织。将处于每种PRRX1表达状态的hCPCs自它们的培养皿中收集，并根据图示的程序进行分化诱导。将软骨分化诱导后形成的组织固定，进行HE染色、阿尔新蓝染色和番红O染色，结果发现维持在具有高PRRX1表达量状态的hCPCs具有高软骨细胞/软骨组织形成能力，而维持在具有低PRRX1表达量状态的hCPCs具有低软骨细胞/软骨组织形成能力。换言之，发现PRRX1的表达量与其最终的软骨组织形成能力呈正相关。
图69：用于选择PRRX1阴性或PRRX1阳性LBM的候选基因
RNAseq鉴定的每种表面抗原的流式细胞仪结果与PRRX1的表达量具有相关性。将具有低PRRX1表达量的LBM(PRRX1阴性)或具有高PRRX1表达量的LBM(PRRX1阳性)用针对相应表面抗原的抗体染色，并通过流式细胞术比较表达量。结果，发现在PRRX1阳性细胞中CD44、CD99和CD140B有高的表达，在PRRX1阴性细胞中CD9、CD49f和CD57有高的表达。
图70：II型胶原功能障碍疾病模型1。图70(a)：从每个II型胶原功能障碍相关疾病患者衍生的iPSC系(ACGII-1和HCG-1)产生hCPCs的方案，图70(b)：对相应hCPCs的PRRX1表达进行免疫染色，图70(c)：生长曲线，图70(d)：阿尔新蓝染色的软骨基质染色结果，图70(e)：各种软骨分化标志物基因的表达的测量(qPCR)。
图71：II型胶原功能障碍疾病模型2。在II型胶原功能障碍相关疾病患者来源的CPC(ACGII-1和HCG-1)中观察到，与健康的个体来源细胞(414C2)相比，软骨细胞中的糖原量减少。此外，在患者来源的细胞中，未发现在正常细胞中发现的ER的正常对齐排列。
图72：成骨不全疾病模型。
图73为本发明的概述的图。
具体实施方式
1.肢芽间充质细胞、软骨祖细胞和RUNX2阳性成骨祖细胞
在本发明中，哺乳动物肢芽间充质细胞(LBM)是能够分化成软骨祖细胞和RUNX2阳性成骨祖细胞的多能细胞。同时，软骨祖细胞是不同于LBM细胞，因为软骨祖细胞不会变成成骨细胞。更满意的软骨细胞/软骨组织是通过经受本发明的质量控制的LBM或经受本发明的质量控制的CPC诱导获得的。通过本发明的质量控制方法获得高质量的LBM或CPC，由LBM诱导的成骨祖细胞、由成骨祖细胞诱导的成骨细胞或骨组织，以及由CPC诱导的软骨细胞或软骨组织均是适用于移植的高质量的。
本发明的肢芽间充质细胞(LBM)或软骨祖细胞和RUNX2阳性成骨祖细胞(以下有时简称为“LBM或其分化细胞”)衍生自多能干细胞。LBM和软骨祖细胞是PRRX1蛋白阳性，RUNX2阳性成骨祖细胞是PRRX1蛋白阴性。此外，本发明的LBM具有生长特性，例如，可以在Wnt信号激活环境下可以进行从LBM向软骨祖细胞群的分化诱导，并且该种分化诱导与生长可以同时进行。当CPC在FGF信号激活剂存在下进行传代培养时，其细胞数可以大大增加。发明人已经认识到CPC的传代培养不会引起染色体异常。另外，本发明人已认识到，通过传代培养而细胞数显著增加的CPC在移植到活体时既不会引起良性肿瘤，也不会引起恶性肿瘤。
在本文中，术语“多能干细胞”意指同时具有自我更新能力(自更新能力)和分化成多种其它细胞谱系的能力(多能性)的细胞。可以基于干细胞标志物，比如Oct3/4或Klf-4的表达来识别细胞是多能干细胞，而不是通过识别细胞具有自我更新能力和多能性。术语“祖细胞”意指在从干细胞分化成作为最终分化目的地的功能细胞的过程中的细胞。RUNX2阳性成骨祖细胞是能够被诱导分化成成骨细胞的细胞。通过从LBM向成骨祖细胞群的分化诱导，可以获得RUNX2阳性率为95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上，特别是99.5％以上，最优选地100％的RUNX2阳性成骨祖细胞群。通过使用具有高RUNX2阳性率的成骨祖细胞群，可以产生更高质量的骨组织。此外，与直接从多能干细胞(比如iPS细胞或ES细胞)获得软骨细胞的情况相比，当从本发明的软骨祖细胞制备软骨细胞时，可以产生更高质量的软骨组织。特别地，可以将根据本发明的质量控制方法进行了质量控制的软骨祖细胞用于稳定地再生高质量的软骨组织。
本发明的LBM或其分化细胞所衍生的生物体为哺乳动物，比如人、小鼠、大鼠、牛、马、猪、兔、狗、猫、山羊、猴子或黑猩猩。其中，优选地为人。
“配对相关同源框1(PRRX1)蛋白”是具有同源结构域的转录因子，已知在发育过程中在源自侧板中胚层的肢芽中特异性表达。
人(Homo sapiens，智人)PRRX1基因的cDNA碱基序列及其PRRX1蛋白的氨基酸序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的GenBank中以如下登录号注册(应当理解的是，当注册了多个修订版时，参考最新的修订版。)：
人PRRX1基因：NM_006902(NM_006902.5),NM_022716(NM_022716.4)；
人PRRX1蛋白：NP_008833(NP_008833.1),NP_073207(NP_073207.1)。
可以通过已知技术检测细胞的PRRX1蛋白阳性。其实例包括：采用报告基因的检测，所述报告基因的表达受PRRX1基因的转录启动子序列控制；并通过使用针对PRRX1蛋白的特异性抗体的免疫染色的检测。
本发明的LBM或其分化细胞衍生自多能干细胞。衍生自多能干细胞意指以多能干细胞为原料细胞通过分化诱导获得的细胞。例如，衍生自能干细胞的LBM或其分化细胞是通过至少一部分在活体外进行的分化诱导过程获得的LBM或其分化细胞。
多能干细胞优选是具有完整多能性(分化成所有体细胞和生殖细胞的能力)的细胞，例如，胚胎干细胞(ES细胞)或诱导的多能干细胞(iPS细胞)。
根据本发明优选实施方式的LBM细胞具有选自CD9阴性、CD24阳性、CD29阳性、CD44阳性、CD46阳性、CD49f阴性、CD55阳性、CD57阴性、CD58阳性、CD90阳性、CD99阳性、CD140A阳性、CD140B阳性、SSEA1阴性、SSEA3阴性、SSEA4阳性、TRA-1-60阴性、TRA-1-81阴性、CD73阴性、CD105阴性和CD166阴性中的至少一种抗原标志物表达阳性或阴性的特征。
LBM是PRRX1阳性的，并且在FGF信号激活环境下具有生长特性。在本发明的一个实施方式中，LBM的表面抗原优选满足选自以下条件中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种：CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性(图60)，和特别优选地是满足选自以下条件中的至少一种、至少两种或三种：CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性。在本发明的一个优选实施例中，当满足选自CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性中的至少一种、至少两种或三种条件时，可以进一步满足选自CD99阳性、CD9阴性和CD57阴性中的一种、两种或三种条件。当LBM满足选自CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种条件时，该种LBM优选作为诱导分化成软骨祖细胞或成骨祖细胞的原料。因此，作为软骨祖细胞或成骨祖细胞原料的LBM的质量控制可以通过识别LBM是否满足选自以下的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种条件来进行：CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性。
在本发明的一个优选实施方式中，满足选自CD90阳性和CD140B阳性中的至少一种或两种条件的哺乳动物软骨祖细胞群可以产生或再生高质量的软骨组织。因此，软骨祖细胞群的质量控制可以通过研究软骨祖细胞群是否满足选自CD90阳性和CD140B阳性中的至少一种或两种条件来进行。
在本发明的质量控制方法中，检测LBM中选自CD44、CD99、CD140B、CD9、CD49f和CD57中的至少一种表面抗原的表达的存在或缺失，并且检测CPC中选自CD90和CD140B中的至少一种的表达的存在或缺失。CPC优选对CD90和CD140B呈阳性。在这六种表面抗原中，LBM优选对CD44、CD99和CD140B呈阳性，并且优选对CD9、CD49f和CD57呈阴性。在本文中，CD抗原表达的“阳性”和“阴性”通过设定从对照(无抗体样品)获得的数值(阴性直方图)来判断。
可以通过，例如，使用PRRX1-tdTomato报告细胞的流式细胞术的数值作为标准来判断PRRX1的阳性/阴性。具体而言，可以将tdTomato的测定值的峰值出现在4×104以上的情况判断为PRRX1阳性，将峰值出现在2×104以下的情况判断为PRRX1阴性。tdTomato是一个荧光标记的实例，当使用任何其它标记时，可以用类似的标准来判断PRRX1阳性/阴性。
成骨祖细胞或软骨祖细胞可以大量生产，冷冻保存，并根据需要用于骨或软骨的生产或再生。
可以通过满足选自CD90阳性和CD140B阳性中的至少一种、至少两种或三种条件的软骨祖细胞来识别优选作为移植材料的冷冻保存的软骨祖细胞。因此，软骨祖细胞的质量控制可以通过识别软骨祖细胞是否满足CD90阳性和CD140B阳性的条件来进行。
当通过从软骨相关疾病患者的iPS细胞分化诱导获得软骨祖细胞时，则将患者来源的软骨祖细胞用作软骨相关疾病的疾病模型。该疾病模型可用于筛选软骨相关疾病的治疗药物，并且优选地是冷冻保存的。
类似地，当通过从骨相关疾病患者的iPS细胞分化诱导获得成骨祖细胞时，则将患者来源的成骨祖细胞用作骨相关疾病的疾病模型。该疾病模型可用于筛选骨相关疾病的治疗药物，并且同样优选地是冷冻保存的。
软骨相关疾病的实例包括II型胶原病、复发性多软骨炎、骨关节炎、类风湿性关节炎和软骨发育不全。
骨相关疾病的实例包括骨关节炎、骨质疏松症、骨软化症、类风湿性关节炎、股骨头坏死、剥脱性骨软骨炎和成骨不全。
当通过从多能干细胞(比如iPS细胞或ES细胞)的分化诱导获得LBM的条件不合适时，LBM的质量就会受损。因此，期望在被诱导成软骨祖细胞群或成骨祖细胞群之前，通过识别LBM是否满足选自以下的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或六种条件来进行质量控制：CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性。在所述六中条件中，即CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性，CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性这三种更为重要。只要满足这三种中的至少一种，则可以进一步满足其他三种(CD99阳性、CD9阴性和CD57阴性)中的至少一种。此外，对于软骨祖细胞，优选基于LBM的表面抗原的质量控制和基于软骨祖细胞的表面抗原的质量控制双重进行。
在LBM的制备中，首先，可以将多能干细胞诱导分化成侧板中胚层细胞。
可以将已知的方法用作用于将诱导哺乳动物(特别是人)的多能干细胞分化成侧板中胚层细胞的方法。例如，可以采用与文献Loh等人，2016,Cell,451-467中描述的方法一致的方法。具体而言，首先将哺乳动物(特别是人)的多能干细胞诱导分化成原始条纹细胞(中部原始条纹(mid-primitive streak))，然后将原始条纹细胞诱导分化成侧板中胚层细胞。
可以通过例如，检测作为侧板中胚层细胞的特异性标志物的HAND1蛋白的表达来识别已经进行了向侧板中胚层细胞的分化诱导。
然后，将侧板中胚层细胞在Wnt信号激活环境下培养以诱导分化为LBM，并进一步诱导LBM分化。因此，可以获得CPC。可以将根据本发明进行了质量控制的CPC根据需要冷冻保存以诱导成为软骨细胞或软骨组织。hCPC可以被诱导成为人软骨细胞或人软骨组织，因此是特别优选的作为用于人的移植材料。
本发明的移植材料可用于治疗骨相关疾病或软骨相关疾病，并且还适合用于其他应用，比如整形手术或美容手术。例如，鼻子的形状由鼻翼大软骨、鼻中隔软骨、侧鼻软骨等决定，耳朵的形状由耳壳软骨决定。当鼻子或耳朵有，例如，来自交通事故等的创伤、先天性鼻骨缺损或小耳畸形时，就需要对鼻子或耳朵进行整形或重建。可以通过产生和移植本发明的LBM或CPC，或由其诱导的具有所需形状的软骨细胞或软骨组织来满足这一需求。在鼻子或耳朵的重建或整容手术的情况下，使用硅酮、源自患者的肋软骨等。在这方面，硅酮是异物，因此可能引起异物反应，比如炎症或免疫反应，并且使用患者的肋软骨是侵入性的。然而，根据本发明获得的软骨可以抑制这种异物反应并且是非侵入性的。具有所需形状的软骨在植入到除了鼻子或耳朵之外的原本没有软骨的部位时也可以预期具有美容效果。例如，可以制备软骨板或软骨块并将其切割成期望的形状，从而生成具有期望形状的软骨移植材料。
下面的描述，例如，以人为例来进行，其为特别优选的哺乳动物。
当在如下所述的不适当条件下将hLBM诱导为hCPC时，将获得具有不满足所有CD90阳性和CD140B阳性条件的细胞峰和满足所有条件的细胞峰的CPC群(双峰)，或获得由不满足CD90阳性和CD140B阳性的所有条件的单峰细胞形成的CPC群体(图61)。当将这种CPC群诱导分化成软骨细胞或软骨组织时，不能获得可用于移植的高质量软骨细胞或软骨组织。
为了将人肢芽间充质细胞(hLBM)诱导为hCPC，在传代培养过程中即使在汇合条件下进行培养时，也会出现不满足CD90阳性和CD140B阳性所有条件的细胞峰出现，从而得到不适合移植的hCPC。
为了获得满足CD90阳性和CD140B阳性的所有条件的hCPC，优选将细胞在汇合之前进行传代。
如图61所示，由不满足选自CD90阳性和CD140B阳性中全部条件的至少一种的细胞的单峰形成的hCPC群(PRRX1-阴性)不适合被诱导成软骨细胞或软骨组织，但是当获得满足选自CD90阳性和CD140B阳中全部条件的至少一种的细胞(PRRX1-阳性)以及不满足所有条件的细胞(PRRX1-阴性)的双峰时，随着之后传代培养的继续，所有细胞聚集成由不满足CD90阳性和CD140B阳性的所有条件的细胞形成的细胞群，因此可以在不满足选自CD90阳性和CD140B阳性的全部条件中的至少一种的细胞峰变得能够被识别的时间点停止培养。以下hCPC可被诱导成令人满意的软骨细胞或软骨组织以用于移植：在培养结束时，hCPC是这样的，即由不满足CD90阳性和CD140B的所有条件的细胞组成的峰无法被识别；不满足选自CD90阳性和CD140B阳性的全部条件中的至少一种的细胞的比率优选为5％以下、4％以下、3％以下、2％以下，或1％以下；并且特别优选的是hCPC基本上不含这种不合适的细胞。此外，这种令人满意的hCPC本身可用作治疗包括软骨营养不良和骨关节炎的软骨相关疾病的移植材料。
如图68(b)所示，由不满足CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性所有条件的细胞单峰形成的LBMs(PRRX1阴性)不适合被诱导成PRRX1阳性hCPC(＝满足CD90阳性和CD140B阳性所有条件的hCPC)或成骨祖细胞。以下LBM可以诱导足够的可诱导成可用于移植的令人满意的软骨细胞或软骨组织的hCPC，以及成骨祖细胞：在培养结束时，LBM是这样的，即由不满足CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性的，特别是CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性的所有条件的细胞组成的峰无法被识别；不满足CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性的所有条件，特别是CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性的条件的细胞的比率优选为5％以下、4％以下、3％以下、2％以下、或1％以下；并且特别优选的是LBM基本上不含这种不合适的细胞。
根据本发明的一个特别优选的实施方式，提供了一种两阶段质量控制方法，包括：使用通过本发明的质量控制方法证明具有令人满意的质量的LBM制备CPC；和对CPC进行本发明的质量控制方法。当对LBM和CPC实施该种两阶段质量控制方法时，可以进一步提高CPC以及另外的最终获得的软骨细胞或软骨组织的质量。
CPC不仅可以自身作为移植材料，还可以将其诱导成软骨细胞或软骨组织以作为移植材料，因此CPC的单独质量控制或LBM和CPC的两阶段质量控制对于制备移植材料是重要的。
所述CPC可以是二维培养产品或聚集的三维培养产品中的任一种。当将CPC细胞群作为细胞悬液(移植材料)直接注射到患处时，适合使用平面培养产品，并且聚集的CPC可以通过分化诱导提供聚集的软骨组织。CPC的细胞悬液可以例如，与透明质酸注射液一样，注射到具有软骨的患处(诸如疼痛的膝盖或半月板)，与透明质酸不同的是，CPC的细胞悬液可以通过使软骨再生来消除疼痛的原因。
如图67所示，当hCPC在三种表面抗原的预定标准范围内为单一峰的均匀细胞群时，诱导了令人满意的软骨细胞/软骨组织，当软骨细胞/软骨组织是由两个或多个峰(包括满足选自CD90阳性和CD140B阳性中的至少一种的峰和不满足选自CD90阳性和CD140B阳性中的至少一种的峰)的hCPC(双峰)诱导时，所述软骨细胞/软骨组织具有缺陷，因此不适合作为移植材料。此外，在三种表面抗原的预定标准范围之外的单峰hCPC的情况下，基本上不能获得软骨细胞/软骨组织。
如图69所示，当LBM在六种表面抗原的预定标准范围内为单一峰的均匀细胞群时，诱导了令人满意的hCPC，当hCPC是由两个或更多个峰(包括一个满足选自CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性中的至少一种，特别是选自CD44阳、CD140B阳性和CD49f阴性中的至少一种的峰，以及不满足选自CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性中的至少一种，特别是选自CD44阳、CD140B阳性和CD49f阴性中的至少一种的峰)的LBM(双峰)诱导时，由此诱导的软骨细胞/软骨组织具有缺陷，因此不适合作为移植材料。此外，在六种表面抗原的预定标准范围之外的单峰LBM的情况下，基本上不能获得软骨细胞/软骨组织。
在本发明的一个实施方式中，可以将CPC分化成软骨样组织，所述软骨组织将作为移植材料移植到需要软骨移植的患者体内。
在通过本发明的质量控制方法由所选择的CPC向软骨细胞的分化诱导方法中，只要不产生本发明的效果，则在Wnt信号激活环境下进行培养的时间段没有特别限制。可以将所述时间段设置为例如约24小时至约12天，或约4天至约8天。根据需要，可以进行培养基更换。培养条件优选符合常规方法。
在培养中，可以根据需要进行传代。进行传代时，在达到汇合状态之前或之后立即收集细胞，并将细胞接种到新鲜培养基中。另外，在本发明的培养中，可以适当更换培养基。
本发明中使用的介质没有特别限制。在优选的实施方式中，可以使用已知的软骨诱导培养基。作为软骨诱导培养基，在此给出一种已知的含有L-抗坏血酸、ITS、GDF5、BMP4等的组合物。根据需要，培养基可以补充有比如抗生素(诸如链霉素和青霉素)、非必需氨基酸(NEAA)和ROCK抑制剂(如Y-27362)的成分。
因此，产生软骨细胞或软骨组织。
获得的软骨细胞可以基于例如番红O染色的阳性或阿尔新蓝染色的阳性来识别。
本发明的LBM可以用作例如用于分化诱导成活体中由PRRX1阳性细胞(例如肢芽)分化而成的功能细胞和组织的原料。作为分化目的地的此类功能细胞和组织的实例包括骨、成纤维细胞(例如，真皮成纤维细胞)、关节、软骨以及肌腱和韧带。
对于根据本发明优选实施方式的LBM或其分化细胞，可以将LBM或其分化细胞，即软骨祖细胞或RUNX2阳性成骨祖细胞冷冻保存。冷冻保存的LBM，或软骨祖细胞或RUNX2阳性成骨祖细胞解冻后可通过传代培养生长。
2.诱导多能干细胞分化为LBM的方法
上述本发明的LBM可以通过以下的组合来制备：诱导多能干细胞分化成侧板中胚层细胞的步骤；和在Wnt信号激活环境下培养分化诱导步骤中获得的细胞的步骤。
经由侧板中胚层细胞的分化诱导的方法
多能干细胞
在生产本发明的LBM的方法中，所使用的多能干细胞可以是上述的那些。
侧板中胚层细胞
在生产本发明的LBM的方法中，首先，诱导多能干细胞分化为侧板中胚层细胞。
可以如上所述进行从多能干细胞向侧板中胚层细胞的分化诱导(参见图73)。
可以通过例如，检测作为侧板中胚层细胞的特异性标志物的HAND1蛋白的表达来识别向侧板中胚层细胞的分化诱导已经进行。
从侧板中胚层细胞向本发明的PRRX1阳性肢芽间充质细胞群的分化诱导
然后，将分化诱导的侧板中胚层细胞在Wnt信号激活环境下培养以将其诱导分化为本发明的PRRX1阳性LBM。为了减少前次培养的环境的影响，优选在用PBS缓冲液等适当清洗后进行Wnt信号激活环境下的培养。从侧板中胚层细胞向LBM的分化诱导优选在不存在任何FGF信号激活剂(如FGF2)的情况下进行。
当将侧板中胚层细胞在FGF信号激活剂(比如FGF2和BMP)的存在下培养时，细胞分化成心脏中胚层。因此，当将侧板中胚层诱导成LBM时，使用Wnt信号激活条件。然而，需要避免在培养基中加入有效量的FGF信号激活剂，比如FGF2。在不含FGF信号激活剂的培养基中，侧板中胚层细胞被诱导分化成LBM，因此在诱导成LBM时细胞数没有显著增加。
本发明的特征在于将LBM在Wnt信号激活环境下培养，优选进一步在FGF信号激活剂(比如FGF2)的存在下培养，从而在增加细胞数量的同时获得软骨祖细胞。迄今为止，一直认为FGF信号激活剂不能用于LBM，因为当FGF信号激活剂作用于侧板中胚层时，FGF信号激活剂会促进分化为不感兴趣的细胞，比如心脏中胚层。然而，本发明人发现，通过在进行了向LBM的诱导后使Wnt信号激活剂和FGF信号激活剂发挥作用，可以获得高质量的软骨祖细胞。
Wnt信号激活环境下的培养
可以在通过例如有效量的Wnt信号激活剂存在下培养而在Wnt信号激活环境下培养侧板中胚层细胞。如上所述，在该培养时，优选FGF信号激活剂的含量低于用于细胞增殖促进作用的有效量，更优选地是所述环境不含任何FGF2信号激活剂。
Wnt信号激活剂增强Wnt介导的信号转导(特别是典型的Wnt通路)。Wnt信号激活剂的实例包括GSK3β抑制剂和Wnt家族蛋白。
GSK3β抑制剂的实例包括CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈)、XAV939和LiCl。
当将CHIR99021用作Wnt信号激活剂时，其添加量可以设定为例如约0.1μM至约20μM，优选为1μM至10μM。
BMP信号抑制环境下的培养
在本发明的优选实施方式中，在Wnt信号激活环境下培养分化诱导的侧板中胚层细胞的步骤可以在BMP信号抑制环境下进行。
可以通过例如在有效量的BMP信号抑制剂的存在下培养细胞来进行BMP信号抑制环境下的培养。
BMP信号抑制剂抑制(抑制)BMP介导的信号转导。BMP信号抑制剂的实例包括LDN193189(4-[6-[4-(1-哌嗪基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉)或其盐(如盐酸盐)，和DMH-1。
当将LDN193189用作BMP信号抑制剂时，其添加量可以设定为例如约0.1μM至约10μM，优选地为0.2μM至5μM。
TGFβ信号抑制环境下的培养
在本发明的优选实施方式中，在Wnt信号激活环境下培养分化诱导的侧板中胚层细胞的步骤可以进一步在TGFβ信号抑制环境下进行。
可以通过例如在有效量的TGFβ信号抑制剂的存在下培养细胞来进行TGFβ信号抑制环境下的培养。
TGFβ信号抑制剂抑制(抑制)TGFβ介导的信号转导。TGFβ信号抑制剂的实例包括A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代酰胺)和SB431542。
当将A-83-01用作TGFβ信号抑制剂时，其添加量可以设定为例如约0.1μM至约10μM左右，优选为0.2μM至5μM。
Hedgehog信号抑制环境下的培养
在本发明的优选实施方式中，在Wnt信号激活环境下培养分化诱导的侧板中胚层细胞的步骤优选地进一步在hedgehog(HH)信号抑制环境下进行。
可以通过例如在有效量的hedgehog信号抑制剂的存在下培养细胞来进行hedgehog信号抑制环境下的培养。
hedgehog信号抑制剂抑制(抑制)hedgehog介导的信号转导。hedgehog信号抑制剂的实例包括维莫德吉(vismodegib)、环巴胺(cyclopamine)和sonidegib。
当将维莫德吉用作hedgehog信号抑制剂时，其添加量可以设定为，例如，约10nM至约1μM，优选为约50nM至约500nM。
在本发明的方法(A)中，从向本发明的目标LBM或其分化细胞的诱导效率的观点出发，优选在Wnt信号激活环境下和在BMP信号抑制环境下进行培养，更优选在Wnt信号激活环境下和在BMP信号抑制环境下、以及在TGFβ信号抑制环境下和/或在hedgehog信号抑制环境下进行培养，进一步更优选在Wnt信号激活环境下、在BMP信号抑制环境下、在TGFβ信号抑制环境下、以及在hedgehog信号抑制环境下进行培养。
侧板中胚层细胞向LBM的分化诱导在Wnt信号激活环境下进行，并且其可以进一步在选自TGFβ信号抑制剂、BMP信号抑制剂和hedgehog信号抑制剂中的一种、两种或三种的存在下进行，更优选在存在TGFβ信号抑制剂、BMP信号抑制剂和hedgehog信号抑制剂存在下进行。
培养
可以在用于容纳细胞和培养基的适当容器中进行培养。用于进行适当培养的技术的示例是涉及在约37℃和约5％的二氧化碳浓度的条件下进行培养的技术，但不限于此。上述条件下的培养可以例如，在使用已知的CO2培养箱控制温度和CO2浓度的同时进行。
培养可以通过二维细胞培养(平面培养)进行。二维细胞培养可以根据需要使用经过包被处理以促进细胞粘附的容器进行。
在Wnt信号激活环境下进行培养的时间段没有特别限制，只要不损害本发明的效果即可。可以将该时间段设定为例如约6小时至约4天，优选约1天至约3天，更优选约2天(约48小时)。根据需要，可以进行培养基更换。培养条件优选符合常规方法。
在培养中，可以根据需要进行传代。进行传代时，在达到汇合状态之前或之后立即收集细胞，并将细胞接种到新鲜培养基中。另外，在本发明的培养中，可以适当更换培养基。当达到汇合状态后继续培养时，LBM的质量会下降，因此很容易不能满足质量控制的条件。
培养基
优选地将无血清培养基，比如CDM2基础培养基、IMDM培养基或F12培养基用作培养基。可以在不含任何动物来源成分的状态下进行分化诱导和维持培养。此外，培养基中可以补充有比如抗生素(诸如链霉素和青霉素)、非必需氨基酸(NEAA)和ROCK抑制剂(如Y-27632)的成分。
因此，产生了源自多能干细胞并且是PRRX1蛋白阳性的本发明的LBM。
认为根据本发明制备的PRRX1蛋白阳性LBM细胞单独具有与在活体内从侧板中胚层细胞分化的肢芽细胞相当的特性。本发明的LBM是同质的细胞群，但活体内的LBM细胞处于与各种细胞共存的状态，例如，作为包含不满足以下之一或两者的细胞的群而存在：PRRX1蛋白阳性的条件；以及CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性(特别是CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性)的条件，由此产生的本发明的肢芽间充质细胞群(LBM)是新的。
本发明的LBM是均质的且是高质量的，可将其诱导成软骨祖细胞和成骨祖细胞。软骨祖细胞和成骨祖细胞本身，或由其进一步获得的成骨细胞、软骨细胞、骨组织和软骨组织是极好的移植材料。
3.向成骨细胞的分化诱导
本发明的LBM可以用作例如，诱导分化为RUNX2阳性成骨祖细胞(以下有时称为“RUNX2阳性细胞”)的原料细胞。
RUNX2阳性细胞意指能够分化并发育成成骨细胞并进一步分化和发育成骨组织的细胞。RUNX2阳性细胞和由其诱导的成骨细胞的每一种均可以用作移植到需要骨再生的患者体内的移植材料。
RUNX2阳性细胞可以通过包括在非Wnt信号激活环境下培养本发明的LBM的步骤的方法获得。
非Wnt信号激活环境下的培养
具体而言，非Wnt信号激活环境下的培养可以通过使用基本上不含任何Wnt信号激活剂的培养基培养来进行。在即将进行在无Wnt信号激活剂环境下培养的步骤之前使用含有Wnt信号激活剂的培养基时，优选在用PBS缓冲液等的洗涤适当进行以移除Wnt信号激活剂之后进行无Wnt信号激活剂环境下的培养。进行了这样的洗涤等的情况包含在“非Wnt信号激活环境下”，因为即使在培养基中含有微量的Wnt信号激活剂时Wnt信号也不会被激活。
Wnt信号激活剂的实例包括上述那些。
BMP信号抑制环境下的培养
在本发明优选实施方式中的向RUNX2阳性细胞的分化诱导中，在无血清培养基中在BMP信号抑制环境下培养LBM。
BMP信号抑制环境下的培养可以通过例如，在有效量的BMP信号抑制剂的存在下培养细胞来进行。
BMP信号抑制剂的实例包括上述那些。
当将LDN193189用作BMP信号抑制剂时，其添加量可以设定为例如约0.1μM至约1μM，优选地为0.2μM至5μM。
TGFβ信号激活环境下的培养
在本发明优选实施方式中的向RUNX2阳性细胞的分化诱导中，在无血清培养基中进行培养的步骤可以进一步在TGFβ信号激活环境下进行。
TGFβ信号激活环境下的培养可以通过例如，在有效量的TGFβ信号激活剂的存在下培养细胞来进行。
TGFβ信号激活剂增强TGFβ介导的信号转导。TGFβ信号激活剂的实例是TGFβ1蛋白。
当将TGFβ1蛋白用作TGFβ信号激活剂时，其添加量可以设定为例如约0.1μM至约10μM，优选地为0.2μM至5μM。
Hedgehog激活环境下的培养
在本发明优选实施方式中的向RUNX2阳性细胞的分化诱导中，在无血清培养基中进行培养的步骤优选进一步在hedgehog(HH)信号激活环境下进行。
Hedgehog信号激活环境下的培养可以通过例如，在有效量的hedgehog信号激活剂的存在下培养细胞来进行。
Hedgehog信号激活剂增强hedgehog介导的信号转导。hedgehog信号激活剂的实例是诸如21K的hedgehog激动剂。
当将21K用作hedgehog信号激活剂时，其添加量可以设定为例如约0.1nM至约100nM，优选地为约1nM至约10nM。
培养
可以在用于容纳细胞和培养基的适当容器中进行培养。用于进行适当培养的技术的示例是涉及在约37℃和约5％的二氧化碳浓度的条件下进行培养的技术，但不限于此。上述条件下的培养可以例如，在使用已知的CO2培养箱控制温度和CO2浓度的同时进行。
在进行向RUNX2阳性细胞的分化诱导的方法中，培养可以通过二维细胞培养(平面培养)进行。二维细胞培养可以根据需要使用经过包被处理以促进细胞粘附的培养仪器进行。
在进行向RUNX2阳性细胞的分化诱导的方法中，在非Wnt信号激活环境下进行培养的时间段没有特别限制，只要不损害本发明的效果即可。可以将该时间段设定为例如约1天至约20天，优选约3天至约15天，更优选约5天至约10天。根据需要，可以进行培养基更换。培养条件优选符合常规方法。
在培养中，可以根据需要进行传代。进行传代时，在达到汇合状态之前或之后立即收集细胞，并将细胞接种到新鲜培养基中。另外，在本发明的培养中，可以适当更换培养基。
培养基
在本发明中，优选地使用无血清培养基，比如CDM2基础培养基、IMDM培养基或F12培养基。可以在不含任何动物来源成分的状态下进行分化诱导和维持培养。此外，培养基中可以补充有比如抗生素(诸如链霉素和青霉素)、非必需氨基酸(NEAA)和ROCK抑制剂(如Y-27632)的成分。
因此，产生了RUNX2阳性细胞。
获得的RUNX2阳性成骨祖细胞可以例如，根据在成骨分化诱导培养基中处理RUNX2阳性的成骨祖细胞后的茜素红染色呈阳性来识别。
4.LBM向软骨祖细胞的分化诱导
本发明的LBM可以用作例如，诱导分化为软骨祖细胞的原料细胞
软骨祖细胞群和软骨细胞群的每一种均可以用作移植到需要软骨已知的患者体内的移植材料。
软骨祖细胞群可以通过包括在Wnt信号激活环境下，优选地在诸如FGF2的FGF信号激活剂存在下培养本发明的LBM的步骤的方法获得。
Wnt信号激活环境下的培养
可以通过例如在有效量的Wnt信号激活剂存在下培养细胞来进行Wnt信号激活环境下的培养。
Wnt信号激活剂增强Wnt介导的信号转导(特别是典型的Wnt通路)。Wnt信号激活剂的实例包括GSK3β抑制剂和Wnt家族蛋白。
GSK3β抑制剂的实例包括如上所述那些。
当将CHIR99021用作Wnt信号激活剂时，其添加量可以设定为例如约0.1μM至约20μM，优选为1μM至10μM。
FGF信号激活剂存在下的培养
LBM向软骨祖细胞的分化诱导需要FGF信号激活剂。
FGF信号激活剂有助于细胞数量的增加以及向软骨祖细胞的分化诱导，从而能够大量获得软骨祖细胞。
FGF信号激活剂的一个实例是FGF2，FGF2是优选的。
从软骨祖细胞向软骨细胞的分化诱导优选以多个阶段进行。具体地，该种分化诱导优选以以下三个阶段进行：
(i)在Wnt信号激活环境下和在FGF信号激活环境下进行培养的步骤；
(ii)在FGF信号激活剂存在下(优选在不存在任何Wnt信号激活剂的情况下)进行培养的步骤；和
(iii)优选在不存在任何Wnt信号激活剂和不存在任何FGF信号激活剂的情况下进行培养的步骤。
当进行上述三个阶段的分化诱导时，步骤(i)和步骤(ii)中的每一步均可以通过二维细胞培养(平面培养)或三维培养来进行。二维细胞培养可以根据需要使用经过包被处理以促进细胞粘附的培养仪器进行。步骤(iii)优选通过三维培养进行。在各阶段的培养之间，为了降低前次培养的环境的影响，优选在用PBS缓冲液等适当清洗后再进行培养。
培养
可以在用于容纳细胞和培养基的适当容器中进行培养。用于进行适当培养的技术的示例是涉及在约37℃和约5％的二氧化碳浓度的条件下进行培养的技术，但不限于此。上述条件下的培养可以例如，在使用已知的CO2培养箱控制温度和CO2浓度的同时进行。
在本发明的从软骨祖细胞的分化诱导方法中，(i)在Wnt信号激活环境下进行培养的时间段没有特别限制，只要不损害本发明的效果即可。可以将该时间段设定为例如约24小时至约12天，或约4天至约8天。根据需要，可以进行培养基更换。(ii)在FGF信号激活剂存在下进行培养的时间段没有特别限制，只要不损害本发明的效果即可。
(iii)优选在不存在任何Wnt信号激活剂下且不存在任何FGF信号激活剂下进行培养的时间段没有特别限制，只要不损害本发明的效果即可。在步骤(i)至(iii)的每一步的培养中，可以根据需要进行培养基更换。培养条件优选符合常规方法。
在培养中，可以根据需要进行传代。进行传代时，在达到汇合状态之前或之后立即收集细胞，并将细胞接种到新鲜培养基中。另外，在本发明的培养中，可以适当更换培养基。
培养基
本发明的方法中使用的培养基没有特别限制。在优选实施方式中，可以使用已知的软骨诱导培养基。作为软骨诱导培养基，在此给出一种已知的含有L-抗坏血酸、ITS、GDF5、BMP4等的组合物。根据需要，培养基中可以补充有比如抗生素(诸如链霉素和青霉素)、非必需氨基酸(NEAA)和ROCK抑制剂(如Y-27632)的成分。
因此，产生了软骨细胞。
获得的软骨细胞可以基于例如番红O染色的阳性或阿尔新蓝染色的阳性来识别。
本发明的试剂盒中使用的各培养基如下所述。
(i)用于将多能干细胞诱导成原始条纹细胞的培养基
给出了一种已知的培养基，例如，可以使用文献Loh等人，2016,Cell,451-467中描述的培养基。
(ii)用于将原始条纹细胞诱导成侧板中胚层细胞的培养基
给出了一种已知的培养基，例如，可以使用文献Loh等人，2016,Cell,451-467中描述的培养基。
(iii)用于将侧板中胚层细胞诱导成肢芽间充质细胞的培养基
给出了通过向上述无血清培养基中补充Wnt信号激活剂而获得的培养基。该培养基不含任何FGF信号激活剂，比如FGF2。
(iv)用于将肢芽间充质细胞诱导成软骨祖细胞的培养基
可以使用通过将FGF信号激活剂(比如FGF2)和Wnt信号激活剂引入到上述无血清培养基中而获得的培养基。
(v)用于将软骨祖细胞诱导成软骨细胞的培养基
在从软骨祖细胞向软骨细胞的分化诱导中，优选使用以下培养基(a)至(c)中的至少一种。更优选地，试剂盒包括所有培养基(a)至(c)，或包括培养基(a)和(c)。
(a)通过向上述无血清培养基中补充Wnt信号激活剂和FGF信号激活剂而获得的培养基。Wnt信号激活剂的存在允许诱导聚集的软骨祖细胞。在该培养基中培养的阶段，细胞具有软骨祖细胞的特性。
(b)通过向上述无血清培养基中补充FGF信号激活剂而获得的培养基。优选地，该培养基不含任何Wnt信号激活剂。通过在该培养基中培养，可以诱导软骨祖细胞分化为软骨细胞。
(c)可以使用这样一种培养基，其为上述未补充Wnt信号激活剂和FGF信号激活剂的无血清培养基。该培养基优选补充有BMP4。
该试剂盒可以仅包括上述培养基(b)和(c)中的一种或两种。
(vi)用于将肢芽间充质细胞诱导成RUNX2阳性成骨祖细胞的培养基给出了不含任何Wnt信号激活剂的上述无血清培养基。
实施例
现在，通过实施例的方式更详细地描述本发明。
在图1中，示出了根据本发明的分化诱导方案的概要。
可以诱导肢芽间充质细胞群经由软骨祖细胞和RUNX2阳性成骨祖细胞进一步分化成主要的例如成骨细胞、软骨细胞、肌腱和韧带细胞以及形成肢体的骨关节组织的真皮成纤维细胞。
参考例1：PRRX1 Reporter人iPS细胞的产生
使用图2所示的靶向载体和CRISPR/Cas9系统，将作为iPS细胞系的414C2细胞用作亲本系，并将荧光蛋白tdTomato敲入PRRX1基因座。由此，产生了能够用tdTomato荧光蛋白观察iPS细胞中PRRX1表达的PRRX1报告iPS细胞。
实施例1：通过侧板中胚层谱系向PRRX1阳性细胞的分化诱导
(从iPS细胞经由原始条纹诱导侧板中胚层)
根据图3所示的方案，iPS细胞系(414C2和PRRX1报告细胞系)分别被诱导分化为原始条纹(中部原始条纹，第1天)，然后分化为侧板中胚层(第2天)。
首先，将参考例1中获得的未分化的PRRX1报告iPS细胞接种在iPS细胞的通用培养基(iPSC培养基)中并培养72小时(hr)(第0天)。
然后，在用PBS洗涤一次后，将细胞在具有以下组成的培养基中培养24小时以诱导分化成原始条纹细胞。
·用于原始条纹分化诱导的培养基
CDM2基础培养基
30ng/ml激活素A
40ng/ml BMP4
6μM CHIR99021
20ng/ml FGF2
100nM PIK90
10μM Y-27632
然后，在用PBS洗涤一次后，将细胞在具有以下组成的培养基中培养24小时以诱导分化成侧板中胚层。
·用于原始条纹分化诱导的培养基
CDM2基础培养基
1μM A-83-01
30ng/ml BMP4
1μM C59
10μM Y-27632
对诱导的细胞进行HAND1(侧板中胚层标志物)和CDX2(轴旁中胚层标志物)的免疫染色。结果如图4和图5所示。可以看出，诱导的侧板中胚层细胞是HAND1阳性和CDX2阴性的。
(PRRX1阳性细胞分化诱导条件的研究)
将上述具有PRRX1报告基因的诱导的侧板中胚层细胞(第2天)用PBS洗涤一次，然后在含有图7所示的用于各种信号的激活剂和/或抑制剂(16种组合)的CDM2基础培养基中培养48小时(图6)。
使用的试剂如下所述。
CHIR(CHIR99021，GSK3β抑制剂)
C59(Wnt-C59,PORCN抑制剂)
BMP4(骨形态发生蛋白4)
LDN(LDN193189，ALK2/ALK3抑制剂)
TGFβ1(肿瘤生长因子β1)
A8301(A83-01，ALK5抑制剂)
21K(Hedgehog激动剂)
维莫德吉(Hedgehog抑制剂)
基于在荧光显微镜下作为报告基因的tdTomato的表达，通过观察评估培养48小时(第4天)后细胞中PRRX1的表达。
结果如图8所示。在组合1、2、3、4、5、6、7和8中发现了特别高的tdTomato表达。
培养48小时(第4天)后从细胞中收集RNA，并通过定量RT-PCR(qPCR)评估PRRX1的表达。
结果如图9所示。在组合1、2、3、4、5、6、7和8中发现了特别高的PRRX1表达。
此外，在培养48小时后(第4天)从细胞中收集RNA，并通过定量RT-PCR(qPCR)测量作为侧板中胚层标志物的HAND1的表达。
结果如图10所示。与第2天的HAND1表达相比，组合1、2、3和4的每一种组合中的HAND1的表达均增加，而组合5、6、7和8的每一种组合中HAND1的表达降低。
此外，培养48小时后(第4天)从细胞中收集RNA，通过定量RT-PCR(qPCR)测定作为侧板中胚层标志物的ISL-1的表达。
结果如图11所示。与第2天的ISL1表达相比，组合5、6、7和8的每一种组合中ISL1的表达均降低。
此外，在培养48小时后(第4天)从细胞中收集RNA，并通过定量RT-PCR(qPCR)测量作为侧板中胚层标志物的FOXF1的表达。
结果如图12所示。与第2天的FOXF1表达相比，组合5、6、7和8的每一种组合中FOXF1的表达均降低。
基于上述结果，将组合8选作用于从侧板中胚层细胞(第2天)诱导PRRX1阳性肢芽间充质细胞的特别有效的条件(图13)。
(分化诱导效率的评估)
通过流式细胞术评估在上述分化诱导过程中向tdTomato阳性细胞的诱导的效率。结果如图14所示。在第4天，向tdTomato阳性细胞的诱导的效率为98％以上。
此外，使用PRRX1抗体对第4天的细胞进行免疫染色。结果如图15所示。呈PRRX1阳性的所有细胞均为tdTomato阳性。
(CD抗原表达谱)
使用CD抗体阵列(产品名：BD Lyoplate Screening Panels，由BD制造)评估上述分化诱导过程中tdTomato阳性细胞中CD抗原的表达。
结果见图16至图18。第4天的tdTomato阳性细胞为
1)CD24阳性、CD29阳性、CD44阳性、CD46阳性、CD55阳性、CD58阳性、CD90阳性、CD140A阳性、CD140B阳性(图16)，
2)SSEA1-阴性、SSEA3-阴性、SSEA4-阳性、TRA-1-60-阴性和TRA-1-81-阴性(图17)，以及
3)CD73-阴性、CD90-阳性、CD105-阴性和CD166-阴性(图18)。
换言之，第4天的tdTomato阳性细胞如下：1)细胞基本均一；2)在直至第4天的分化诱导过程中，大多数ES细胞标志物的表达均降低；和3)并且人间充质干细胞(MSC)标志物的表达也较低。
(人iPS细胞(1383D2系)的研究)
通过用PRRX1报告细胞系建立的分化诱导方案处理人iPS细胞系(1383D2系)。在图19中示出了该方案。
图20示出了不同时间点的相差显微照片，图21示出了不同时间点的PRRX1 mRNA表达量。同样，在使用1383D2系的分化诱导中，在第4天的时间点发现了PRRX1表达的增加。另外，图22示出了不同的时间点侧板中胚层标志物(HAND1、ISL1和FOXF1)的mRNA表达量。同样，在使用1383D2系的分化诱导中，每个侧板中胚层标志物的mRNA显著降低。图23示出了在第0天和第4天使用PRRX1抗体进行免疫染色的结果。在第4天的时间点诱导的大多数细胞是PRRX1阳性的。
(人ES细胞(SEES4系、SEES5系、SEES6系和SEES7系)的研究)
图24示出了通过用PRRX1报告细胞系建立的分化诱导方案处理人ES细胞系(SEES4系、SEES5系、SEES6系和SEES7系)期间不同时间点的相差显微照片。图25示出了不同时间点PRRX1和中胚层标志物(HAND1、ISL1和FOXF1)的表达量。通过第2天到第4天的分化诱导，PRRX1的表达增加，各个侧板中胚层标志物的mRNA显著降低。图26示出了第4天使用PRRX1抗体进行免疫染色的结果。在第4天的时间点诱导的大多数细胞是PRRX1阳性肢芽间充质细胞。
实施例2：通过轴旁中胚层谱系向PRRX1阳性细胞的分化诱导
(从iPS细胞经由原始条纹诱导侧板中胚层)
根据图27所示的方案，iPS细胞系(414C2和PRRX1报告细胞系)分别被诱导分化为原始条纹(前部原始条纹，第1天)，然后分化为轴旁中胚层(第2天)。
首先，将参考例1中获得的未分化的PRRX1报告iPS细胞接种在iPS细胞的通用培养基(iPSC培养基)中并培养72小时(hr)(第0天)。
然后，在用PBS洗涤一次后，将细胞在具有以下组成的培养基中培养24小时以诱导分化成轴旁中胚层。
·用于原始条纹分化诱导的培养基
CDM2基础培养基
30ng/ml激活素A
4μM CHIR99021
20ng/ml FGF2
100nM PIK90
然后，在用PBS洗涤一次后，将细胞在具有以下组成的培养基中培养24小时以诱导分化成轴旁中胚层。
·用于轴旁中胚层分化诱导的培养基
CDM2基础培养基
1μM A-83-01
3μM CHIR99021
250nM LDN-193189
20ng/ml FGF2
对诱导的细胞进行HAND1(侧板中胚层标志物)和CDX2(轴旁中胚层标志物)的免疫染色。结果如图28和图29所示。可以看出，诱导的轴旁中胚层细胞是HAND1阴性和CDX2阳性的。
(PRRX1阳性细胞分化诱导条件的研究)
将上述具有PRRX1报告基因的诱导的轴旁中胚层细胞(第2天)用PBS洗涤一次，然后在含有图30所示的用于各种信号的激活剂和/或抑制剂(6种组合)的CDM2基础培养基中培养48小时。
使用的试剂如下所述。
CHIR(CHIR99021，GSK3β抑制剂)
BMP4(骨形态发生蛋白4)
DAPT(γ-分泌酶抑制剂)
PD0325901(MEK抑制剂)
基于在荧光显微镜下作为报告基因的tdTomato的表达，通过观察评估培养48小时(第4天)后细胞中PRRX1的表达。
结果如图31所示。在四种组合中发现了特别高的tdTomato表达，所述四种组合即CHIR/BMP4、CHIR/BMP4/DAPT、CHIR/BMP4/PD、CHIR/BMP4/DAPT/PD。
分别用四种组合(即CHIR/BMP4、CHIR/BMP4/DAPT、CHIR/BMP4/PD和CHIR/BMP4/DAPT/PD)处理，并在48小时后(第4天)，通过流式细胞术研究向tdTomato阳性细胞的诱导的效率。结果如图32所示。发现向tdTomato阳性细胞的诱导的效率如下：CHIR/BMP4(61％)、CHIR/BMP4/DAPT(75％)、CHIR/BMP4/PD(91％)、CHIR/BMP4/DAPT/PD(96％)。
分别用四种组合(即CHIR/BMP4、CHIR/BMP4/DAPT、CHIR/BMP4/PD和CHIR/BMP4/DAPT/PD)处理，并在24小时后(第3天)或48小时后(第4天)，收集每种情况下的RNA并进行qPCR，以测量PRRX1、轴旁中胚层标志物(CDX2)和体节标志物(MEOX1和PARAXIS)的表达。结果如图33所示。可以发现，在各组合中PRRX1的表达均增加，但CHIR/BMP4/PD组合具有低的轴旁中胚层标志物和体节标志物表达量。
实施例3：从肢芽间充质细胞向RUNX2阳性成骨祖细胞的分化诱导
按照实施例1中所述的方法获得肢芽间充质细胞。然后，将获得的细胞用图34所示的用于各种信号的激活剂或抑制剂处理，以研究诱导成RUNX2阳性成骨祖细胞的条件(16种组合)。
CHIR(CHIR99021，GSK3β抑制剂)
C59(Wnt-C59,PORCN抑制剂)
BMP4(骨形态发生蛋白4)
LDN(LDN193189，ALK2/ALK3抑制剂)
TGFβ1(肿瘤生长因子β1)
A8301(A83-01，ALK5抑制剂)
21K(Hedgehog激动剂)
维莫德吉(Hedgehog抑制剂)
用16种组合处理肢芽间充质细胞(第4天，肢芽间充质)，48小时后(第6天)，收集每种情况下的RNA并进行qPCR以测量RUNX2(成骨细胞分化中的必需转录调节剂)。
结果如图35所示。在组合9、10、11、12、13、14、15和16的每一种中均发现了RUNX2的高表达。其中，与其他组相比，组合13显示出特别高的RUNX2表达。
基于上述结果，将组合13选作用于从肢芽间充质细胞诱导RUNX2阳性成骨祖细胞的特别有效的条件(图36)。
在从肢芽间充质细胞(第4天)开始直至第12天的阶段期间随时间收集RNA，并进行qPCR以测量各种基因(PRRX1、RUNX2、SP7、COL1A1和骨唾液酸蛋白(BSP))的表达。
结果如图37所示。结果表明，当肢芽间充质细胞被诱导为RUNX2阳性成骨祖细胞时，PRRX1的表达随时间降低，此外，RUNX2的表达和其他成骨细胞分化标志物(SP7、COL1A1和BSP)的表达增加。
将414C2系、PRRX1报告细胞系、1383D2系、SEES4系和SEES7系分别诱导成肢芽间充质细胞(第4天，肢芽间充质)，然后用组合13处理，8天后(第12天)，收集RNA并进行qPCR以测量RUNX2的表达。
结果如图38所示。结果表明，通过组合13的处理，衍生自各细胞系的肢芽间充质细胞的RUNX2表达显著增加。
在第4天和第12天的时间点，使用RUNX2抗体对PRRX1报告细胞系、1383D2系和SEES4系分别进行细胞免疫染色。
结果如图39所示。第4天未观察到RUNX2的表达，但第12天大部分细胞均为RUNX2阳性。
此外，在第12天的时间点，使用RUNX2抗体分别对414C2系、PRRX1报告细胞系、SEES4系和SEES7系进行流式细胞术分析。
结果如图40所示。各系中诱导的95％以上细胞为RUNX2阳性。
将PRRX1报告细胞系诱导为肢芽间充质细胞(第4天，肢芽间充质)，然后将该细胞用组合13处理并培养8天。为了研究在第12天时间点时该细胞是否具有成骨细胞分化能力，在成骨细胞诱导培养基中培养12天，随后进行茜素红染色。
结果如图41所示。诱导的细胞具有显著增加的茜素红可染性。
实施例4：通过使用Stem Medium 3(hCPC培养基)的传代将LBM诱导为hCPC的方法 以及使用Stem Medium 3的hCPC的传代培养方法
根据实施例1的分化诱导条件，使用参考例1中获得的PRRX1报告细胞系制备侧板中胚层衍生的PRRX1阳性细胞(第4天，肢芽间充质)。研究了用于细胞扩增培养的方法的条件。
通过使用Accutase，在第4天收集来衍生自侧板中胚层的PRRX1阳性细胞，并将收集的细胞在具有各种组成的培养基(stem media 1、2和3)中进行传代培养。结果，当stemmedium 3(CDM2基础培养基+CHIR+A8301+EGF+FGF)补充了Y-27632时，获得了令人满意的结果。
该方案示于图42，不同条件下的相差图像示于图43。
另外，研究了用于培养皿的包被剂的类型。比较传代1周后的细胞数，发现如下：未包被＝明胶<iMatrix-511silk＝Geltrex＝纤连蛋白。选择与诱导分化时使用的包被剂相同的iMatrix-511(临床级)包被，并将其用于下列实验(图44)。
图45示出了在上述条件下的传代培养期间不同传代次数的时间点的相差显微照片。传代能够在维持肢芽间充质细胞形态的状态下进行。
图46示出了在传代培养期间不同传代次数的tdTomato的流式细胞仪分析结果和生长曲线。结果表明，传代能够在保持tdTomato(PRRX1)阳性的状态下进行。
实施例5：自肢芽间充质细胞诱导的hCPC的特性(生长特性、核型和在液氮中的保存)
人软骨祖细胞(CPC)由衍生自健康个体的iPSC细胞系(414C2、1383D2、PRRX1报告基因、HPS1042或HPS1043)或人ES细胞系(SEES4、SEES6或SEES7)产生。
由衍生自健康个体的iPSC系(414C2、1383D2、HPS1042或HPS1043)、PRRX1报告iPSC系(Reporter)或人ES细胞系(SEES6)产生人LBM，并且进一步地由人LBM产生人软骨祖细胞(hCPC)。由人LBM产生hCPC时的细胞数如图47所示。结果表明hCPC具有约2天至约3天的倍增时间。
此外，由人iPS细胞(414C2)产生hCPC(PN3)，并研究了人iPS细胞(414C2)(图48(a))和hCPC(PN3)(图48(b))的核型。图48(a)和图48(b)表明，在从iPS细胞到hCPC的诱导过程中核型未改变。
此外，结果表明进行传代培养的肢芽间充质细胞可以通过STEMCELLBANKER在液氮中保存，并且保存的细胞能够在解冻通过重新接种来进行传代培养(图49(a)和图49(b))。
实施例6：当将LBM(第4天)或hCPC培养在RUNX2阳性成骨祖细胞分化诱导培养基中时，RUNX2(成骨祖细胞标志物)表达量的比较。
用组合13(RUNX2阳性成骨祖细胞分化诱导培养基：组成描述于图50)处理肢芽间充质细胞(LBM)(第4天)和hCPC，随时间收集RNA。结果，在LBM中RUNX2的表达随时间增加(第4天)，但在hCPC中没有发现这种变化(图50)。通过对LBM(第4天)进行扩增培养获得的hCPC在分化诱导能力方面与RUNX2阳性成骨祖细胞不同。hCPC没有分化成RUNX2阳性成骨祖细胞的能力，并且朝向软骨分化，这表明hCPC和LBMs(第4天)彼此不同。
·RUNX2测量条件
每天从培养的细胞中收集RNA并转化为cDNA，然后通过实时PCR方法(本例中使用的引物见表1)测量RUNX2和ACTB(内标)的mRNA表达。测定后，用ACTB的表达量校正RUNX2的表达量。
表1
基因 正向引物序列 反向引物序列
RUNX2 TCAACGATCTGAGATTTGTGGG GGGGAGGATTTGTGAAGACGG
ACTB AGAAAATCTGGCACCACACC AGAGGCGTACAGGGATAGCA
实施例7
用图51(b)所示的步骤1培养基和步骤2培养基处理iPS细胞(第0天)、侧板中胚层细胞(第2天)、LBM(第4天)和hCPC。对于每种处理的细胞，收集RNA，并研究软骨细胞标志物(SOX5、SOX6、SOX9、COL2A1和ACAN)的表达。结果表明，在用步骤2培养基处理的细胞中，软骨细胞标志物显著增加(图51(d))。
实施例8：透明软骨样组织体的染色
由PRRX1报告iPSC系(Reporter)或人ES细胞系(SEES5)生成人软骨祖细胞(hCPC)。从其培养皿中收集细胞，并以100,000个细胞/孔接种到超低U型底96孔板中，然后进行离心操作以在孔上产生聚集体。之后，按照图52(a)所示的方案处理细胞，在第3步处理的第42天由透明软骨组织体(图52(b))制备切片，并对切片进行HE染色、阿尔新蓝染色、番红O染色和软骨细胞标志物(SOX9和COL2)、肥大软骨细胞标志物(COLX)和纤维软骨标志物(COL1)的免疫染色(图52(c))。图52(b)和图52(c)的结果表明获得了透明软骨组织。
实施例9：使用LBM或hCPC制备软骨组织
在图53所示的条件下从LBM或hCPC诱导透明软骨组织，并对其进行番红O染色。结果示于图53。结果表明向衍生自LBM的透明软骨体诱导的效率与向衍生自hCPC的透明软骨体诱导的效率彼此不同。
实施例10：透明软骨样组织体向NOD-SCID小鼠的皮下移植由衍生自健康个体的iPSC细胞系(414C2)、PRRX1报告iPSC系(Reporter)或人ES细胞系(SEES6)产生人软骨祖细胞(hCPC)。从其培养皿中收集细胞，并以100,000个细胞/孔接种到超低U型底96孔板中，然后进行离心操作以在孔上产生聚集体。之后，通过图54(a)所示的方案处理细胞，将第3步处理的第21天的聚集体皮下移植到NOD-SCID小鼠中。由移植后第8周获得的透明软骨组织制备切片(前侧，中央部分，最远侧，图54(b))，并进行番红O(SafO)，通过该染色，存在软骨基质的部位将被染成红色。结果发现，形成了均一的透明软骨组织体，而未形成肿瘤(图54(c))。
实施例11：衍生自人的软骨组织块向SCID大鼠的软骨缺损部位的移植实验
由PRRX1报告iPSC系(Reporter)产生人软骨祖细胞(hCPC)。从其培养皿中收集细胞，并以100,000个细胞/孔接种到超低U型底96孔板中，然后进行离心操作以在孔上产生聚集体。之后，通过图55(a)所示的方案处理细胞，并对步骤3处理的第21天的聚集体进行SafO染色以识别番红阳性。用活检环钻(1mm)在SCID大鼠的膝关节软骨上钻孔，移植软骨组织块(上述聚集体)。移植4周后，进行SafO染色、甲苯胺蓝染色和采用人波形蛋白特异性抗体的免疫染色。识别出了衍生自人的软骨组织块向SCID小鼠的软骨缺损部位的植入(图55(b))。
实施例12：hCPC细胞向NOD-SCID小鼠的肾被膜囊下移植
由PRRX1报告iPSC系产生人软骨细胞祖细胞(hCPC)。将1×105hCPC细胞悬浮在10μl I型胶原凝胶中，并将悬浮液移植到NOD-SCID小鼠的肾被膜囊下(图56(a))。将8周后的染色(HE、阿尔新蓝、番红O)、SOX9表达和人核染色(人核仁)的结果示于图56(b)。认识到，仅将hCPC的细胞悬液移植到成人体内就会导致软骨组织在移植部位的形成。
实施例13：软骨板的生成
使用经过质量控制的人软骨祖细胞的凹坑板形成软骨祖细胞的球状体(图57(a))，将所述球状体装载至模具中并培养。因此，成功地形成了比现有技术的软骨组织球更大的板状软骨组织(图57(b))。
所得板状软骨具有可用于人体移植的大小。
此外，将模具中软骨分化诱导后形成的组织固定并进行番红O染色，从结果可以看出，组织体在形态上大多呈透明软骨，并且为番红O-阳性(图58(a))。此外，将板状软骨组织皮下移植到NOD-SCID小鼠中。移植4周后，取出组织体并进行番红O染色。结果如图58(b)所示。结果证实生成的软骨板被皮下地植入，透明软骨组织体被保持在活体中而没有形成肿瘤。
实施例14：自人LBM细胞向hCPC的分化诱导以及hCPC的质量控制方法
在以下条件下培养实施例1中获得的人LBM(第4天)细胞群以提供hCPC。
·用于获得hCPC的培养基和条件
(i)PRRX1阳性单峰hCPC(图61(a)和图61(b))
将iMatrix511用作包被剂，将人LBM细胞悬浮在以下培养基中并接种到培养皿中。当细胞在亚汇合之前传代时，hCPC可以保持在PRRX1阳性状态。
·hCPC培养基
CDM2基础培养基
1μM A-83-01
3μM CHIR99021
20ng/ml FGF2
20ng/ml EGF
10μM Y-27632
(ii)hCPCs的PRRX1阳性和PRRX1阴性双峰(图61(a)和图61(b))
当hCPC细胞在汇合状态下培养1周并传代时，获得双峰hCPC细胞群。双峰hCPC细胞群最终成为下文所述的PRRX1阴性hCPC细胞群，因此无法维持其培养。
(iii)PRRX1阴性单峰hCPC(图61(a)和图61(b))
当将上述双峰hCPC连续传代时，获得PRRX1阴性hCPC单峰细胞群。
(iv)软骨祖细胞(CPC)和肢芽间充质细胞(LBM)的质量控制
图59示出了CPC的质量控制技术的概况。其表明，为了从CPC稳定地提供软骨细胞/软骨组织，使hCPC在满足选自CD90阳性和CD140B阳性中的至少一种条件的状态下进行扩增培养非常重要。
图60示出了LBM的质量控制技术的概况。其表明，为了从LBM提供具有高软骨组织形成能力的CPC，从处于满足选自以下中的至少一种条件的状态的“LBMs”诱导CPC很重要：CD44阳性、CD99阳性、CD140B阳性、CD9阴性、CD49f阴性和CD57阴性，特别地，从处于满足选自CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性中的至少一种条件的状态的“LBMs”诱导CPC很重要。
实施例15：经过一阶段(One-stage)质量控制的hCPC向软骨组织的诱导
此外，在以下条件下从每种类型的hCPC诱导软骨组织并对其进行HE染色、阿尔新蓝染色和番红O染色。结果如图61(c)所示。
·HE染色条件
脱蜡后，用Eosin进行染色1分钟，然后用苏木精处理标本20分钟。由此，进行核染色。
·阿尔新蓝染色条件
脱蜡后，将标本用1％阿尔新蓝/3％乙酸处理20分钟，然后用3％乙酸洗涤，然后将标本用苏木精处理20分钟。由此，进行核染色。
·番红O染色条件
脱蜡后，用Weigert's铁苏木精溶液进行染色10分钟。接下来，用快速绿色溶液进行染色5分钟，然后用1％乙酸洗涤。接着，用0.1％番红O溶液进行染色5分钟。
此外，对于PRRX1阳性单峰hCPC和PRRX1阴性单峰hCPC，通过软骨分化诱导促进结节形成，并进行阿尔新蓝染色。结果如图62所示。
此外，使用RNA序列分析获得的hCPC(PRRX1阳性单峰、PRRX1阴性单峰和PRRX1阳性和PRRX1阴性双峰)，并选择在PRRX1阳性和PRRX1阴性细胞中高表达的mRNA。结果如图63至图66所示。
此外，对于人iPS细胞(414C2)、hCPC(PRRX1-阴性)和hCPC(PRRX1-阳性)，使用针对相应CD抗原的抗体来评估CD抗原的表达。结果如图67所示。
实施例16：人LBM的质量控制方法
将人iPS细胞以3×104个细胞/3.5cm培养皿的密度接种，接种3天(多能性(pluripotent)3天)或7天(多能性7天)后，进行获得LBM细胞的处理(如实施例所述)1)。
当所述处理自接种3天后进行时，得到具有高PRRX1表达(PRRX1阳性、多能性3天)的LBM，而当所述处理自接种7天后进行时，得到具有低PRRX1表达的LBM(PRRX1-阴性，多能性7天)(图68(a)至图68(c))。换言之，这表明诱导开始时的人多能干细胞的状态对于获得LBM(PRRX1阳性)很重要。
在从LBM(PRRX1-阴性，多能性7天)诱导hCPC的第一代中[hCPC(多能性7天PN1)]，获得了具有低PRRX1表达的群体，当传代数增加时(PN1→PN2→PN3→PN4→PN5)，在PN2阶段，获得了包括具有低PRRX1表达的群体和具有高PRRX1表达的群体的非均一细胞群[hCPC，(多能性7天，PN2)]，并且在最后的PN5阶段，获得了具有高PRRX1表达的均一群体[hCPC，(多能性7天，PN5)](图68(b))。
当分别对包括具有低PRRX1表达的群体和具有高PRRX1表达的群体的非均一细胞群[hCPC，(多能性7天，PN2)]以及具有高PRRX1表达的均一细胞群[hCPC，(多能性7天，PN5)]进行软骨分化诱导时，由hCPC(多能性7天，PN5)形成了被阿尔新蓝/番红O均匀染色的软骨组织，但是由hCPC(多能性7天，PN2)形成了被阿尔新蓝/番红O稀疏染色的非均一软骨组织(图68(c))。
此外，对于人iPS细胞(阴性对照)、LBM(PRRX1-阴性，7天)和hCPC(PRRX1-阳性，3天)，使用针对相应CD抗原的抗体评估CD抗原的表达。结果如图69所示。
实施例17：II型胶原功能障碍疾病模型1
从每个衍生自II型胶原功能障碍相关疾病患者的iPSC系(ACGII和HCG)产生hCPC(图70(a))。对于来自每一系的hCPC，检查了PRRX1表达的免疫染色(图70(b))和生长曲线(图70(c))。通过上述处理过程在“平面培养”下对来自各系的hCPC进行软骨分化诱导，然后通过阿尔新蓝染色对软骨基质进行染色，或进行各种软骨分化标志物基因的表达的测量(qPCR)。结果发现，与衍生自健康个体的hCPC(414C2)、衍生自PRRX1报告iPSC系的hCPC(Reporter)和衍生自ES细胞的hCPC(SEES4、SEES5和SEES7)相比，衍生自II型胶原功能障碍相关疾病患者的hCPC(ACG-II-1和HCG-1)形成阿尔新蓝染色阳性软骨基质的能力降低(图70(d))，并且各种软骨分化标志物基因的表达降低(图70(e))。与衍生自健康个体的细胞相比，衍生自II型胶原功能障碍相关疾病患者的细胞软骨细胞分化能力降低。通过使用hCPC，可以重现患者病理。通过使用该病理模型，可以寻找不仅对II型胶原功能障碍而且对广泛的软骨相关疾病有效的药物。
实施例18：II型胶原功能障碍疾病模型2
由衍生自健康个体的iPSC系(414C2)或衍生自II型胶原功能障碍相关疾病患者的iPSC系(ACGII-1或HCG-1)产生hCPC。从其培养皿中收集细胞，并以100,000个细胞/孔接种到超低U型底96孔板中，然后进行离心操作以在孔上产生聚集体。之后，通过上述方案处理细胞，并对最终获得的聚集体进行电子显微镜检查。结果，与衍生自健康个体的细胞相比，在衍生自II型胶原功能障碍相关疾病患者的细胞中观察到软骨细胞中的糖原量的减少。此外，发现在衍生自患者的细胞中，未发现在正常细胞中发现的ER的正常对齐排列(图71)。与衍生自健康个体的细胞相比，在衍生自II型胶原功能障碍相关疾病患者的细胞中观察到软骨细胞中糖原量的减少。此外，在衍生自患者的细胞中，未发现在正常细胞中发现的ER的正常对齐排列。通过使用由衍生自患者的iPS细胞诱导的hCPC，可以重现患者的病理。
实施例19：成骨不全疾病模型
在平面培养下，将衍生自成骨不全患者的iPSC系(OIO2-1和OIO8-12)或通过基因组编辑将其COL1A1突变恢复为正常类型获得的iPSC系(相应的救援(rescue)系；OIO2-1(res1)和OIO8-12(res1))诱导成RUNX2阳性成骨祖细胞，然后进行成骨细胞分化诱导(图72)，随后是通过茜素红染色的骨基质染色，Ca2+累积量及其与总蛋白的比值的测量，以及ALP活性的测量。结果发现，在救援系中茜素红可染性和各种测量值显著更高(图72)。与通过使突变恢复为正常类型获得的细胞相比，衍生自成骨不全症患者的细胞的成骨细胞分化能力降低。通过使用诱导从PRRX1阳性肢芽间充质细胞向RUNX2阳性成骨祖细胞分化的方案，可以在体外重现成骨不全症患者的病理。
工业适用性
经受本发明的质量控制的LBM、CPC或成骨祖细胞，以及由其诱导的软骨细胞或软骨组织和成骨细胞或骨组织可优选用于移植以治疗骨相关疾病或软骨相关疾病(例如，膝关节骨性关节炎、半月板损伤、类风湿性关节炎或骨质疏松症)。
序列表
<110> 国立大学法人冈山大学； 国立大学法人京都大学
<120> LBM、CPC、OPC、它们的制备和质量控制方法、试剂盒、移植材料和疾病模型
<130> FP220504JP
<150> JP 2019-169278
<151> 2019-09-18
<150> JP 2020-062441
<151> 2020-03-31
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RUNX2正向引物
<400> 1
tcaacgatct gagatttgtg gg 28
<210> 2
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RUNX2反向引物
<400> 2
ggggaggatt tgtgaagacg g 28
<210> 3
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACTB正向引物
<400> 3
agaaaatctg gcaccacacc 28
<210> 4
<211> 28
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ACTB反向引物
<400> 4
agaggcgtac agggatagca 28

Claims (20)

1.一种肢芽间充质细胞群，其衍生自哺乳动物侧板中胚层细胞，并且是PRRX1蛋白阳性的。
2.根据权利要求1所述的肢芽间充质细胞群，其中，所述肢芽间充质细胞群满足选自CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性中的至少一种条件。
3.一种制备权利要求1或2所述的肢芽间充质细胞群的方法，其包括以下步骤：
诱导多能干细胞分化为侧板中胚层细胞；和
在Wnt信号激活和非FGF信号激活条件下培养在所述分化诱导步骤中获得的所述侧板中胚层细胞。
4.一种制备成骨祖细胞群的方法，其包括在无Wnt信号激活剂的环境下培养权利要求1或2所述的肢芽间充质细胞群的步骤。
5.一种制备哺乳动物软骨祖细胞群的方法，其包括在Wnt信号激活环境下培养根据权利要求1或2所述的肢芽间充质细胞群的步骤。
6.根据权利要求5所述的制备哺乳动物软骨祖细胞群的方法，其中所述方法包括在Wnt信号激活环境下和在FGF信号激活条件下，培养根据权利要求1或2所述的肢芽间充质细胞群的步骤。
7.一种哺乳动物肢芽间充质细胞群的质量控制方法，其包括确定哺乳动物肢芽间充质细胞是否满足选自以下中的至少一种条件的步骤：CD44阳性、CD140B阳性和CD49f阴性。
8.一种哺乳动物软骨祖细胞群的质量控制方法，其包括确定哺乳动物软骨祖细胞是否满足选自以下中的至少一种条件的步骤：CD90阳性和CD140B阳性。
9.一种哺乳动物软骨祖细胞群，其满足选自CD90阳性和CD140B阳性中的至少一种条件。
10.根据权利要求9所述的哺乳动物软骨祖细胞群，其中所述哺乳动物软骨祖细胞群是冷冻保存的。
11.一种哺乳动物成骨祖细胞群，其具有95％以上的RUNX2阳性率。
12.根据权利要求11所述的哺乳动物成骨祖细胞群，其中所述哺乳动物成骨祖细胞群是冷冻保存的。
13.一种用于将哺乳动物多能干细胞诱导成肢芽间充质细胞(LBM)的试剂盒，其包括以下项目(i)至(iii)：
(i)用于将多能干细胞诱导成原始条纹细胞的培养基；
(ii)用于将原始条纹细胞诱导成侧板中胚层细胞的培养基；和
(iii)用于将侧板中胚层细胞诱导成肢芽间充质细胞的培养基。
14.一种用于将哺乳动物多能干细胞诱导成软骨祖细胞的试剂盒，其包括以下项目(i)至(iv)：
(i)用于将多能干细胞诱导成原始条纹细胞的培养基；
(ii)用于将原始条纹细胞诱导成侧板中胚层细胞的培养基；
(iii)用于将侧板中胚层细胞诱导成肢芽间充质细胞的培养基；和
(iv)用于将肢芽间充质细胞诱导成软骨祖细胞的培养基。
15.一种用于将哺乳动物多能干细胞诱导成软骨细胞的试剂盒，其包括以下项目(i)至(v)：
(i)用于将多能干细胞诱导成原始条纹细胞的培养基；
(ii)用于将原始条纹细胞诱导成侧板中胚层细胞的培养基；
(iii)用于将侧板中胚层细胞诱导成肢芽间充质细胞的培养基；
(iv)用于将肢芽间充质细胞诱导成软骨祖细胞的培养基；和
(v)用于将软骨祖细胞诱导成软骨细胞的培养基。
16.一种用于将哺乳动物多能干细胞诱导成RUNX2-阳性成骨祖细胞的试剂盒，其包括以下项目(i)至(iv)：
(i)用于将多能干细胞诱导成原始条纹细胞的培养基；
(ii)用于将原始条纹细胞诱导成侧板中胚层细胞的培养基；
(iii)用于将侧板中胚层细胞诱导成肢芽间充质细胞的培养基；和
(iv)用于将肢芽间充质细胞诱导成RUNX2-阳性成骨祖细胞的培养基。
17.一种移植材料，其包含：
根据权利要求9或10所述的哺乳动物软骨祖细胞群；或
通过从所述软骨祖细胞群分化诱导而获得的软骨细胞或软骨组织。
18.一种移植材料，其包括：
根据权利要求11或12所述的哺乳动物成骨祖细胞群；或
通过从所述成骨祖细胞群分化诱导而获得的成骨细胞或骨组织。
19.一种软骨相关疾病模型，其包括：
软骨祖细胞群，所述软骨祖细胞群由软骨相关疾病患者衍生的iPS细胞诱导，并且满足选自CD90阳性和CD140B阳性中的至少一种条件；或
由所述软骨祖细胞群诱导的软骨细胞。
20.一种骨相关疾病模型，其包括:
成骨祖细胞群，所述成骨祖细胞群由骨相关疾病患者衍生的iPS细胞诱导，并且具有95％以上的RUNX2-阳性率；或
由所述成骨祖细胞群诱导的成骨细胞。
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