CN115997007A

CN115997007A - 软骨组织体的制造方法

Info

Publication number: CN115997007A
Application number: CN202180046853.7A
Authority: CN
Inventors: 宝田刚志; 岩井良辅; 铃木康平; 深泽菜月
Original assignee: Nissan Chemical Corp; Okayama University NUC; Kake Educational Institution
Current assignee: Nissan Chemical Corp; Okayama University NUC; Kake Educational Institution
Priority date: 2020-07-03
Filing date: 2021-07-01
Publication date: 2023-04-21
Also published as: EP4177339A1; WO2022004846A1; US20230257686A1; EP4177339A4; JPWO2022004846A1; TW202216987A

Abstract

本发明提供软骨组织体的制造方法，其特征在于，包括下述工序：提供细胞凝集块制造用基板的工序，所述细胞凝集块制造用基板在具有抑制细胞附着的能力的基板上具备由包含由下述式(I)及(II)表示的单体衍生的重复单元的共聚物形成的多个点部；在该基板上接种来自多能干细胞的PRRX1蛋白阳性的人软骨祖细胞的工序；对该细胞进行培养从而制成细胞凝集块的工序；对该凝集块进行培养从而制成软骨组织体的工序。式中，U^a1、U^a、R^a1、R^a2及R^b如说明书及权利要求书中记载的那样。

Description

软骨组织体的制造方法

技术领域

本发明涉及软骨组织体的制造方法。

背景技术

在作为关节软骨损伤的治疗之一的移植自行培养软骨组织的方法中，需要软骨采集和培养软骨移植这2次手术，因此患者的负担大。从减轻该患者负担等的观点考虑，提出了并非自行培养而是经由各种干细胞的分化诱导·培养来制作用于移植的软骨组织的各种再生医疗技术。例如，报道了下述技术：将人工多能干细胞(iPS细胞)诱导成中胚层，在抗坏血酸、BMP2、TGFβ、GDF5的存在下进行培养，由此使皿上的一部分细胞形成软骨细胞凝集物，将其剥离，进行悬浮培养，由此制作出透明软骨组织(例如，参见非专利文献1)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：A.Yamashita,M.Morioka,Y.Yahara,M.Okada,T.Kobayashi,S.Kuriyama,S.Matsuda,N.Tsumaki,人iPSCs无支架透明软骨组织的制备(Generation ofscaffoldless hyaline cartilaginous tissue from human iPSCs),干细胞报告(Stemcell reports)4(2015)404-418

发明内容

发明所要解决的课题

通过上述技术，能够由人多能干细胞制作出作为最终产物的透明软骨组织，但并未规定中间阶段的细胞(＝人软骨祖细胞)。因此，存在难以以高效率大量生产组织形状/性状均匀化的软骨再生材料这样的课题。

用于解决课题的手段

本申请的发明人对此前由干细胞制作软骨组织时的中间阶段的细胞及其制造方法、和由该细胞制造软骨组织的方法进行深入研究，对其中的一部分也进行了专利申请(例如，参见PCT/JP2020/035517)。通过该方法，可以对中间阶段的具有分化指向性的细胞(即，软骨祖细胞)进行扩大培养并进行原种(stock)化，可以通过对经品质管理的同批次的细胞进行软骨分化诱导处理从而制成软骨组织，另外，所制作的软骨组织中不包含软骨细胞以外的细胞，因此，从将软骨组织体用于再生医疗的方面来看是有利的。本发明发现通过在规定的培养条件下实施这样的源自软骨祖细胞的软骨组织的制作，能够进行高效的细胞增殖、并且由少数的细胞制作大的软骨组织片，从而完成了本发明。

本发明包括以下方案。

[1]软骨组织体的制造方法，其特征在于，包括下述工序：

提供细胞凝集块制造用基板的工序，所述细胞凝集块制造用基板在具有抑制细胞附着的能力的基板上具备由包含由下述式(I)表示的单体衍生的重复单元、及由下述式(II)表示的单体衍生的重复单元的共聚物形成的多个点部；在该基板上接种来自多能干细胞的PRRX1蛋白阳性的人软骨祖细胞的工序；对该细胞进行培养从而制成细胞凝集块的工序；对该凝集块进行培养从而制成软骨组织体的工序。

[化学式1]

[式中，

U^a1及U^a2各自独立地表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基，R^a1表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基，R^a2表示碳原子数为1至5的直链或支链亚烷基]

[化学式2]

[式中，

R^b表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基]

[2]如上述[1]所述的制造方法，其中，由式(I)表示的单体衍生的重复单元相对于由上述式(I)表示的单体衍生的重复单元及由上述式(II)表示的单体衍生的重复单元的合计而言的摩尔比率为99摩尔％～51摩尔％。

[3]如上述[1]或[2]所述的制造方法，其中，上述共聚物还包含由下述式(III)表示的单体衍生的结构单元。

[化学式3]

[式中，

R^c及R^d各自独立地表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基，R^e表示碳原子数为1至5的直链或支链亚烷基，n表示1～50的数]

[4]如上述[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其中，上述具有抑制细胞附着的能力的基板在其表面的至少一部分包含含有共聚物(P)的涂覆膜，所述共聚物(P)包含含有下述式(a)表示的基团的重复单元、和含有下述式(b)表示的基团的重复单元。

[化学式4]

[式中，

U^a11、U^a12、U^b11、U^b12及U^b13各自独立地表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基，An^-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子]

[5]如上述[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，制成软骨组织体的工序中的培养是利用含有琼脂的培养基实施的。

[6]如上述[5]所述的制造方法，其中，琼脂的重均分子量为10,000～60,000，琼脂的含量相对于培养基的总量而言为0.005(w/v)％以上且小于2(w/v)％。

发明效果

本发明的制造方法可以通过将经品质管理的软骨祖细胞作为原料进行软骨分化诱导处理从而制成软骨组织，另外，所制作的软骨组织中不包含软骨细胞以外的细胞，因此，从将软骨组织体安全地用于再生医疗的方面来看是有利的。此外，通过在规定的培养条件下实施源自软骨祖细胞的软骨组织的制作，能够进行高效的细胞增殖、并且由少数的细胞制作大的软骨组织片，在成本方面也是有利的。

附图说明

[图1]为在实施例1中得到的细胞凝集块制造用基板上形成的细胞凝集块的整体图像(左上)和放大图像(左下)、及利用其红色荧光蛋白(tdTomato)表达进行可视化而得到的细胞凝集块的整体图像(右上)和放大图像(右下)。

[图2]为实施例1中得到的软骨组织体的实体显微镜照片。

[图3]为实施例1中得到的软骨组织体的倒置显微镜照片(明视野)。

[图4]为进行了苏木精(HE)染色(左)、阿尔新蓝及染色(中央)、或番红O染色(右)的、实施例1中得到的软骨组织体的组织切片的图像。

[图5]为评价例1中对在实施例1中得到的软骨组织体的移植4周后采集的组织片进行HE染色(左)、番红O染色(中央)、或甲苯胺蓝染色(右)而得到的组织片的图像。

具体实施方式

<软骨组织体的制造方法>

本发明的软骨组织体的制造方法的特征在于包括下述工序：

(1)提供细胞凝集块制造用基板的工序，所述细胞凝集块制造用基板在具有抑制细胞附着的能力的基板上具备由包含由式(I)及(II)表示的单体衍生的重复单元的共聚物形成的多个点部；

(2)在该基板上接种来自多能干细胞的PRRX1蛋白阳性的人软骨祖细胞的工序；

(3)对该细胞进行培养从而制成细胞凝集块的工序；以及

(4)对该凝集块进行培养从而制成软骨组织体的工序。

工序(1)

工序(1)中，提供细胞凝集块制造用基板。本发明涉及的细胞凝集块制造用基板在具有抑制细胞附着的能力的基板上具备由包含由式(I)及(II)表示的单体衍生的重复单元的共聚物形成的多个点部。

(共聚物)

前述共聚物包含由下述式(I)表示的单体衍生的重复单元、及由下述式(II)表示的单体衍生的重复单元。

[化学式5]

[式中，

[化学式6]

[式中，

R^b表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基]

本说明书中，只要没有另外定义，则作为“碳原子数为1至5的直链或支链烷基”，例如可举出甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基或1-乙基丙基。

R^a1及R^b各自独立地优选选自氢原子及甲基。

U^a1及U^a2各自独立地优选选自氢原子、甲基、乙基、正丙基、异丙基及正丁基，优选为甲基或乙基，最优选为甲基。

本说明书中，只要没有另外定义，则作为“碳原子数为1至5的直链或支链亚烷基”，例如可举出亚甲基、亚乙基、1,2-亚丙基(propylene)、1,3-亚丙基、1,4-亚丁基、1-甲基-1,2-亚丙基、2-甲基-1,2-亚丙基、二甲基亚乙基、乙基亚乙基、1,5-亚戊基、1-甲基-1,4-亚丁基、2-甲基-1,4-亚丁基、1,1-二甲基-1,3-亚丙基、1,2-二甲基-1,3-亚丙基、2,2-二甲基-1,3-亚丙基、1-乙基-1,3-亚丙基等。它们之中，作为R^a2，优选选自亚乙基及1,2-亚丙基。

因此，作为上述式(I)表示的单体，可举出甲基丙烯酸2-N,N-二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酸N,N-二甲基氨基甲酯等，优选为甲基丙烯酸2-N,N-二甲基氨基乙酯。作为上述式(II)表示的单体，可举出丙烯酸、甲基丙烯酸等，优选为甲基丙烯酸。

前述共聚物中的由式(I)表示的单体衍生的重复单元相对于由式(I)表示的单体衍生的重复单元及由式(II)表示的单体衍生的重复单元的合计而言的摩尔比率优选为99摩尔％～51摩尔％，更优选为98摩尔％～60摩尔％，进一步优选为95摩尔％～70摩尔％，进一步更优选为93摩尔％～70摩尔％。若由式(II)表示的单体衍生的重复单元的摩尔比率为50摩尔％以上，则共聚物的阴离子性变得过剩，存在细胞的粘附力降低的倾向。需要说明的是，本说明书中，只要没有另外说明，则由各单体衍生的重复单元的摩尔比率可以替换为由单体的投入量(摩尔量)算出的比率。

前述共聚物也可以与由式(I)/式(II)表示的单体衍生的重复单元一起还包含由具有2个以上的碳-碳不饱和键的单体衍生的结构单元。所谓具有2个以上的碳-碳不饱和键的单体，具体而言为具有2个以上的碳-碳双键的单体，例如可举出多官能丙烯酸酯化合物、多官能丙烯酰胺化合物、多官能聚酯、或异戊二烯化合物等。

作为优选的具体例，可举出下述式(III)～(V)表示的单体。

[化学式7]

[化学式8]

[化学式9]

式中，R^c及R^d各自独立地表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基，R^e表示碳原子数为1至5的直链或支链亚烷基，n表示1～50的数。它们之中，优选为式(III)表示的单体。

R^c及R^d各自独立地优选选自氢原子及甲基。

R^e优选选自亚甲基、亚乙基及1,2-亚丙基，更优选为亚乙基。

n为1～50的数，但n优选为1～30的数，n更优选为1～10的数。

前述共聚物中的由具有2个以上的碳-碳不饱和键的单体(典型而言为式(III)～(V)表示的单体)衍生的重复单元的摩尔比率优选为0摩尔％～5摩尔％，更优选为0摩尔％～3摩尔％。若由具有2个以上的碳-碳不饱和键的单体衍生的重复单元的摩尔比率大于5摩尔％，则存在下述担忧：由于因过度交联而造成的高分子量化，使得在制造中发生凝胶化，使制造变得困难。

前述共聚物可以进一步包含由作为任意的追加单体成分的烯键式不饱和单体、或者多糖类或其衍生物衍生的重复单元。作为烯键式不饱和单体的例子，可以举出选自由(甲基)丙烯酸酯；乙酸乙烯酯；乙烯基吡咯烷酮；乙烯；乙烯醇；以及它们的亲水性的官能性衍生物组成的组中的1种或2种以上的烯键式不饱和单体。作为多糖类或其衍生物的例子，可以举出羟基烷基纤维素(例如，羟乙基纤维素或羟丙基纤维素)等纤维素系高分子、淀粉、葡聚糖、凝胶多糖。

所谓亲水性的官能性衍生物，是指具有亲水性的官能团或结构的烯键式不饱和单体。作为亲水性的官能性基团或结构的例子，可举出甜菜碱结构；酰胺结构；亚烷基二醇残基；氨基；以及亚磺酰基等。

甜菜碱结构是指具有季铵型的阳离子结构、和酸性的阴离子结构的两性中心的化合物的一价或二价的基团，例如，可以举出磷酰胆碱基：

[化学式10]

作为具有这样的结构的烯键式不饱和单体的例子，可以举出2-甲基丙烯酰基氧基乙基磷酰胆碱(MPC)等。

酰胺结构是指下述式表示的基团。

[化学式11]

[其中，R¹⁶、R¹⁷及R¹⁸彼此独立地为氢原子或有机基团(例如，可经取代的碳原子数为1至5的直链或支链烷基等，具体而言为甲基、异丙基、羟基甲基或羟基乙基等)]

作为具有这样的结构的烯键式不饱和单体的例子，可以举出(甲基)丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-(羟基甲基)(甲基)丙烯酰胺等。此外，具有这样的结构的单体例如已在日本特开2010-169604号公报等中公开。

亚烷基二醇残基是指亚烷基二醇(HO-Alk-OH；其中，Alk是碳原子数为1至10的亚烷基)的单侧末端或两个末端的羟基与其他化合物进行缩合反应之后所残留的亚烷基氧基(-Alk-O-)，也包括亚烷基氧基单元重复存在的聚(亚烷基氧基)基团。作为具有这样的结构的烯键式不饱和单体的例子，可以举出(甲基)丙烯酸2-羟基乙酯、甲氧基聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯等。此外，具有这样的结构的单体例如已在日本特开2008-533489号公报等中公开。

氨基是指式：-NH₂、-NHR¹⁹或-NR²⁰R²¹[其中，R¹⁹、R²⁰及R²¹彼此独立地为有机基团(例如，碳原子数为1至5的直链或支链烷基等)]表示的基团。本发明中的氨基包括已被季铵化或盐化的氨基。作为具有这样的结构的烯键式不饱和单体的例子，可以举出(甲基)丙烯酸二甲基氨基乙酯、(甲基)丙烯酸2-(叔丁基氨基)乙酯、甲基丙烯酰基胆碱氯化物等。

亚磺酰基是指下述式表示的基团。

[化学式12]

[其中，R²²为有机基团(例如，碳原子数为1至10的有机基团，优选为具有1个以上的羟基的碳原子数为1至10的烷基等)]

作为亚磺酰基的导入方法，可以举出日本特开2014-48278号公报等中公开的方法。

本申请的共聚物可以利用本身已知的方法(例如日本特开2014-162865号公报、国际公开第2020/040247号中记载的方法)来制造。

前述共聚物的数均分子量(Mn)为20,000～1,000,000，进一步优选为50,000～800,000。

前述共聚物的重均分子量(Mw)与前述数均分子量(Mn)之比(Mw/Mn)为1.01～10.00，优选为1.2～8.0，优选为1.4～6.0，优选为1.5～5.0，优选为1.6～4.5。

前述数均分子量(Mn)和数均分子量(Mn)例如可以利用凝胶过滤色谱法(GelFiltration Chromatography)求出。

通过利用前述共聚物，能在使细胞粘附后将其剥离而形成细胞凝集块(球状体)。需要说明的是，所谓细胞凝集块，表示细胞发生了凝集的结果所形成的结构体，像球状、环状等那样，形状没有限定。

(基板)

本发明中使用的细胞凝集块制造用基板可以通过将前述共聚物以点状涂布于基板的表面并进行干燥从而制造。此处，所谓“表面”，是指与细胞或细胞培养液等内容物相接的面，特别是在基板为细胞培养容器的一部分的情况下，是指与内容物相接的面中的底面。

基板表面的形状可以为平面，也可以为凹凸，但优选为平面形状。另外，基板也可以是所谓的细胞培养容器或其一部分。作为细胞培养容器，可举出在细胞的培养中通常使用的陪替氏培养皿、组织培养用皿、多用途培养皿(multi-dish)等平皿或皿、细胞培养烧瓶、旋转瓶等烧瓶、塑料袋、Teflon(注册商标)袋、培养袋等袋、微量培养板、微孔板、多用途板(multiplate)、多孔板等板、腔室载玻片、管、托盘、滚瓶等瓶等。

基板的材质例如可以举出玻璃、金属、含有金属的化合物或含有准金属的化合物、活性炭或树脂。金属可举出：典型金属：(铝族元素：Al、Ga、In；铁族元素：Fe、Co、Ni；铬族元素：Cr、Mo、W、U；锰族元素：Mn、Re；贵金属：Cu、Ag、Au等。含有金属的化合物或含有准金属的化合物例如可举出作为基本成分为金属氧化物并且通过高温下的热处理来烧固而得到的烧结体的陶瓷、硅这样的半导体、金属氧化物或准金属氧化物(硅氧化物、氧化铝等)、金属碳化物或准金属碳化物、金属氮化物或准金属氮化物(硅氮化物等)、金属硼化物或准金属硼化物等无机化合物的成型体等无机固体材料、铝、镍钛、不锈钢(SUS304、SUS316、SUS316L等)。

作为树脂，可以为天然树脂或其衍生物、或者合成树脂中的任意树脂，作为天然树脂或其衍生物，优选使用纤维素、三乙酸纤维素(CTA)、硝化纤维素(NC)、固定有硫酸葡聚糖的纤维素等，作为合成树脂，优选使用聚丙烯腈(PAN)、聚酰亚胺(PI)、聚酯系聚合物合金(PEPA)、聚苯乙烯(PS)、聚砜(PSF)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯(PU)、乙烯乙烯醇(EVAL)、聚乙烯(PE)、聚酯、聚丙烯(PP)、聚偏氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)、聚碳酸酯(PC)、环烯烃聚合物(COP)、聚氯乙烯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE)、超高分子量聚乙烯(UHPE)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯树脂(ABS)或Teflon(注册商标)。

在本发明中使用的细胞凝集块制造用基板的制造中，将前述共聚物以点状涂布于基板的表面并进行干燥时，不需要高温下的处理，因此也可应用耐热性低的树脂等。基板的材质可以为1种，也可以为2种以上的组合。

(点部)

本发明中使用的细胞凝集块制造用基板具备由前述共聚物形成的多个点部。点部的总面积相对于基板的表面积而言的比例没有特别限定，例如为30％以上，并且各点部的直径例如为50～5000μm，点部间的间隔例如为30～1000μm。点部的形状没有特别限定，例如为大致圆形、四边形形状，但优选为大致圆形的点部。

点部的总面积相对于基板的表面积而言的比例、各点部的直径、点部间的间隔可以根据使用的细胞、基板的种类、细胞凝集块的所期望的尺寸等而从规定的范围中适宜地选择，点部的总面积相对于基板的表面积而言的比例优选为30％以上、40％以上、50％以上，并且优选为99％以下，各点部的直径为50～5000μm，优选为300～3000μm，点部间的间隔为30～1000μm，优选为100～500μm。

通过在具有抑制细胞附着的能力的基板上以这样高的密度、优选规则地配置细胞可粘附的独立的微小尺寸的区域(点部)，能够在一个基板(容器)上一次形成多个均匀的尺寸的球状体。与以往的通过细胞低粘附板上的非粘附培养而制作的细胞凝集块相比，在通过规定粘附面积来进行的细胞凝集块的尺寸调整(能够制造任意大小的细胞凝集块)等方面具有优点。

由前述共聚物形成的点部可以通过涂布共聚物、优选为包含前述共聚物的基底剂而形成。基底剂可以通过利用本身已知的方法使含水溶液混合于前述共聚物中而制备。这样的基底剂作为促进细胞凝集块形成的用途是有用的。

所谓含水溶液，可举出水、生理盐水或磷酸缓冲溶液等含有盐的水溶液、或者将水或含有盐的水溶液与醇组合而得到的混合溶剂。作为醇，可举出碳原子数为2至6的醇、例如乙醇、丙醇、异丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、叔丁醇、1-戊醇、2-戊醇、3-戊醇、1-庚醇、2-庚醇、2,2-二甲基-1-丙醇(＝新戊醇)、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、2-甲基-2-丁醇(＝叔戊醇)、3-甲基-1-丁醇、3-甲基-3-戊醇、环戊醇、1-己醇、2-己醇、3-己醇、2,3-二甲基-2-丁醇、3,3-二甲基-1-丁醇、3,3-二甲基-2-丁醇、2-乙基-1-丁醇、2-甲基-1-戊醇、2-甲基-2-戊醇、2-甲基-3-戊醇、3-甲基-1-戊醇、3-甲基-2-戊醇、3-甲基-3-戊醇、4-甲基-1-戊醇、4-甲基-2-戊醇、4-甲基-3-戊醇及环己醇，可以单独使用或者使用它们的组合的混合溶剂。

此外，基底剂中，除了前述共聚物和溶剂以外，还可以根据需要在不损害得到的基底膜的性能的范围内添加其他物质。作为其他物质，可举出pH调节剂、交联剂、防腐剂、表面活性剂、提高与容器或基板的密合性的底漆、防霉剂及糖类等。

作为基底剂的涂布的方式，可以使用例如喷墨法、丝网印刷法、狭缝涂布法、辊对辊法等，优选通过喷墨法或丝网印刷等印刷技术来进行。

作为其他涂布方法，例如可使用根据情况将对点部的非形成部位进行了保护的基板浸渍于上述基底剂中、将基底剂根据情况而添加至对点部的非形成部位进行了保护的基板(容器)并静置规定时间等方法，在基板、作为一个方式的细胞培养容器的情况下，通过将基底剂根据情况而添加至对点部的非形成部位进行了保护的容器中并静置规定时间的方法来进行。添加可以通过例如使用注射器等添加容器的总容积的0.5至1倍量的基底剂来进行。对于静置而言，根据容器或基板的材质、细胞培养的基底剂的种类，适宜地选择时间、温度来实施，例如，于10至80℃实施1分钟至24小时、优选为5分钟至3小时。由此，能够制造细胞凝集块制造用基板。

另外，通过上述的方法得到的基板的表面的点部可以在不经过干燥工序的情况下直接、或者在使用水或被供于细胞培养的试样的介质(例如，水、缓冲液、培养基等)进行清洗之后用作细胞凝集块制造用基板。

即，在基板的表面的点部形成后，可以在48小时以内、优选24小时以内、进一步优选12小时以内、进一步优选6小时以内、进一步优选3小时以内、进一步优选1小时以内在不经过干燥工序的情况下直接、或者在使用水或被供于细胞培养的试样的介质(例如，水、缓冲液、培养基等，特别优选为培养基(例如，DMEM培养基(Dulbecco改良Eagle培养基))进行清洗之后用作细胞凝集块制造用基板。

细胞凝集块制造用基板也可以供于干燥工序。对于干燥工序而言，在大气下或真空下，优选于温度-200℃至200℃的范围内进行。通过干燥工序将上述基底剂中的溶剂除去，由此完全固着于基体。

点部也可以通过例如室温(10℃至35℃，优选为20℃至30℃，例如25℃)的干燥来形成，但为了更迅速地形成点部，例如可以于40℃至50℃进行干燥。若干燥温度低于-200℃，则必须使用不一般的制冷剂而缺乏通用性，以及，为了使溶剂升华，干燥需要长时间而效率差。若干燥温度高于200℃，则发生共聚物的热分解。更优选的干燥温度为10℃至180℃，更优选的干燥温度为20℃至150℃。

本发明中使用的细胞凝集块制造用基板可经由以上的简便的工序来制造。

另外，为了将残存于点部(涂布膜)的杂质、未反应单体等除去，可以实施利用选自水及包含电解质的水溶液中的至少1种溶剂进行清洗的工序。清洗优选为流水清洗或超声波清洗等。上述水及包含电解质的水溶液可以是例如于40℃至95℃的范围内进行了加热的溶液。包含电解质的水溶液优选为PBS、生理盐水(仅包含氯化钠的生理盐水)、Dulbecco磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲生理盐水、HEPES缓冲生理盐水及弗洛拿(Veronal)缓冲生理盐水，特别优选为PBS。在固着后，即使利用水、PBS及醇等进行清洗，涂覆膜也不会溶出而保持牢固地固着于基体的状态。

对于点部(涂布膜)的膜厚而言，最大膜厚和最小膜厚在1～1000nm的范围内，优选在5～500nm的范围内。

本发明中使用的细胞凝集块制造用基板是使用具有抑制细胞附着的能力的基板制造的。作为这样的基板，可以使用市售的经过细胞低粘附处理的细胞培养皿、具有抑制细胞附着的能力的细胞培养器等，例如可以使用日本特开2008-61609号公报中记载的细胞培养容器，但并不限定于此。或者，可以为在形成前述点部(涂布膜)之前对基板实施了抑制细胞附着的处理而得到的基板。具有抑制细胞附着的能力的基板可以经由例如涂布已知的具有抑制细胞附着的能力的涂覆膜形成用组合物的工序来制造。优选包括下述工序：将作为具有抑制细胞附着的能力的涂覆膜形成组合物的、包含共聚物(P)和溶剂的涂覆膜形成用组合物涂布于容器或基板的表面并进行干燥，所述共聚物(P)包含含有下述式(a)表示的有机基团的重复单元、和含有下述式(b)表示的有机基团的重复单元。

[化学式13]

[式中，

前述涂覆膜包含于基板表面的至少一部分即可，但优选遍及制造细胞凝集块的表面(即存在本申请的点部的表面)整体、或者遍及基板表面整体地涂布。

碳原子数为1至5的直链或支链烷基与上述的基团相同。

前述涂覆膜形成用组合物例如可以使用国际公开第2014/196650中记载的涂覆膜形成用组合物。

作为前述涂覆膜形成用组合物的涂布方法，没有特别限制，可使用通常的旋涂、浸涂、溶剂流延法等涂布法。

对于前述涂覆膜的干燥工序而言，在大气下或真空下，在温度为-200℃至180℃的范围内进行。通过干燥工序，从而将上述涂覆膜形成用组合物中的溶剂除去，并且上述共聚物的式(a)及式(b)彼此形成离子键而完全固着于基体。

前述涂覆膜也可以通过例如室温(10℃至35℃、例如25℃)的干燥来形成，但为了更迅速地形成涂覆膜，例如可以于40℃至50℃进行干燥。另外，也可以使用基于冻干法的极低温～低温(-200℃至-30℃左右)的干燥工序。冻干被称为真空冷冻干燥，通常为利用制冷剂将想要干燥的物质冷却、在真空状态下通过升华将溶剂除去的方法。冻干中使用的一般的制冷剂可举出干冰与甲醇的混合介质(-78℃)、液氮(-196℃)等。

若干燥温度为-200℃以下，则必须使用不一般的制冷剂而缺乏通用性，以及，为了使溶剂升华，干燥需要长时间而效率差。若干燥温度为200℃以上，则涂覆膜表面的离子键合反应过度进行，该表面失去亲水性，不能发挥抑制生物物质附着的能力。更优选的干燥温度为10℃至180℃，更优选的干燥温度为25℃至150℃。

在干燥后，为了消除残存于前述涂覆膜上的杂质、未反应单体等，此外，为了调节膜中的共聚物的离子平衡，期望利用选自水及包含电解质的水溶液中的1种以上的溶剂、通过流水清洗或超声波清洗等来进行清洗。上述水及包含电解质的水溶液可以是例如于40℃至95℃的范围内进行了加热的溶液。包含电解质的水溶液优选为PBS、生理盐水(仅包含氯化钠的生理盐水)、Dulbecco磷酸缓冲生理盐水、Tris缓冲生理盐水、HEPES缓冲生理盐水及弗洛拿缓冲生理盐水，特别优选为PBS。在固着后，即使利用水、PBS及醇等进行清洗，涂覆膜也不会溶出而保持牢固地固着于基体的状态。对于所形成的涂覆膜而言，即使附着有生物物质，其后也可以通过水洗等而容易地除去，形成有前述涂覆膜的基体表面具有抑制生物物质附着的能力。

前述涂覆膜的膜厚优选为5～1000nm，进一步优选为5～500nm。

所谓具有抑制细胞附着的能力，是指：通过例如WO2016/093293的实施例中记载的方法实施且由荧光显微镜得到的、与无涂覆膜的情况或未经细胞低吸附处理的情况相比较时的相对吸光度(WST O.D.450nm)(％)((实施例的吸光度(WST O.D.450nm))/(比较例的吸光度(WST O.D.450nm)))为50％以下，优选为30％以下，进一步优选为20％以下。

工序(2)

工序(2)中，在前述细胞凝集块制造用基板上接种来自多能干细胞的PRRX1蛋白阳性的人软骨祖细胞。

所谓“多能干细胞”，是指兼具自复制能力和分化为其他多个系统的细胞的能力(多分化能力)的细胞，另外，所谓“祖细胞”，是指处于从干细胞向作为最终的分化目标的功能细胞分化的中途的细胞。因此，所谓来自多能干细胞的人软骨祖细胞，是指将多能干细胞作为原料细胞进行分化诱导、并且处于向作为最终的分化目标的软骨细胞分化的中途的细胞。此处，作为多能干细胞，例如，可举出胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等万能细胞(具有分化成所有的体细胞及生殖系细胞的能力的细胞)。

此外，本发明中，“人软骨祖细胞”是PRRX1蛋白阳性的。所谓PRRX1(Pairedrelated homeobox 1，配对相关同源框1)蛋白，是具有同源异型结构域的转录因子之一，已知其在产生过程中、在来自侧板中胚层的肢芽、来自轴旁中胚层的头部中胚层中特异性地表达。

人(Homo sapiens)的PRRX1基因的cDNA的碱基排列及PRRX1蛋白的氨基酸序列在美国生物技术信息中心(NCBI；National Center for Biotechnology Information)所提供的GenBank中以下述的登记号进行了登记。需要说明的是，在登记有多个修订版本(revision)的情况下，可理解其是指最新的修订版本。

-人PRRX1基因：NM_006902(NM_006902.5)、NM_022716(NM_022716.4)

-人PRRX1蛋白：NP_008833(NP_008833.1)、NP_073207(NP_073207.1)

关于细胞为PRRX1蛋白阳性这一点，可以利用已知的方法进行检测。例如，可举出基于利用PRRX1基因的转录启动子序列来控制表达的报道基因的检测、基于使用了针对PRRX1蛋白的特异性抗体的免疫染色的检测等。

PRRX1蛋白阳性的软骨祖细胞可以通过例如包括以下的工序的方法来制造：

-从多能干细胞分化诱导侧板中胚层细胞的工序；

-将通过前述工序分化诱导出的细胞在使Wnt信号活化的环境下培养，制备肢芽间充质细胞的工序；

-将通过前述工序制备的肢芽间充质细胞在使Wnt信号活化的环境下培养，制备软骨祖细胞的工序。

前述方法中，作为用作原料细胞的多能干细胞，例如，可以使用胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)等。ES细胞及iPS细胞可以使用新制作的细胞、或者已经确立的细胞。

前述方法中，首先从多能干细胞分化诱导侧板中胚层细胞。作为从多能干细胞分化诱导侧板中胚层细胞的手段，可以使用已知的手段。例如，可以采用以文献：Loh等人,2016,细胞(Cell),451-467中记载的方法为基准的方法。具体而言，从多能干细胞，首先向原条(Mid-primitive streak)进行分化诱导，接着从原条进行向侧板中胚层细胞的分化诱导。

关于分化诱导出侧板中胚层细胞这一点，可以通过对例如作为侧板中胚层细胞的特异性标志物的HAND1蛋白的表达进行检测来确认。

接着，将分化诱导出的侧板中胚层细胞在使Wnt信号活化的环境下培养，向PRRX1蛋白阳性的、来自侧板中胚层的PRRX1阳性细胞进行分化诱导。需要说明的是，为了降低之前的培养环境的影响，优选在适宜地进行了利用PBS缓冲液等的清洗的基础上进行使Wnt信号活化的环境下的培养。

另外，从侧板中胚层细胞向肢芽间充质细胞的分化诱导优选在不存在FGF2等FGF信号活化剂的条件下进行，更优选在使Wnt信号活化的环境下进行、并且在选自由TGFβ信号抑制剂、BMP信号抑制剂及Hedgehog信号抑制剂组成的组中的1种、2种或3种抑制剂的存在下进行，进一步更优选在TGFβ信号抑制剂、BMP信号抑制剂、TGFβ信号抑制剂、及Hedgehog信号抑制剂的存在下进行。

使Wnt信号活化的环境下的培养可以通过在例如有效量的Wnt信号活化剂的存在下进行培养来实施。Wnt信号活化剂是增强由Wnt介导的信号传导(尤其是经典Wnt途径)的物质。作为Wnt信号活化剂，可举出GSK3β抑制剂、Wnt家族蛋白质等。例如，作为GSK3β抑制剂，可举出CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈)、XAV939(3,5,7,8-四氢-2-[4-(三氟甲基)苯基]-4H-噻喃并[4,3-d]嘧啶-4-酮)、LiC1等。使用CHIR99021作为Wnt信号活化剂的情况下，其添加量例如可以设定为0.1～20μM左右、优选为1～10μM。

BMP信号抑制剂是抑制(阻碍)由BMP介导的信号传导的物质。作为BMP信号抑制剂，可举出LDN193189(4-[6-[4-(1-哌嗪基)苯基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基]喹啉)或其盐(例如盐酸盐)、DMH-1等，其添加量例如可以设定为0.1～10μM左右、优选为0.2～5μM。

TGFβ信号抑制剂是抑制(阻碍)由TGFβ介导的信号传导的物质。作为TGFβ信号活化剂，可举出A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)、SB431542等，其添加量例如可以设定为0.1～10μM左右、优选为0.2～5μM。

Hedgehog信号抑制剂是抑制(阻碍)由Hedgehog介导的信号传导的物质。作为Hedgehog信号活化剂，可举出维莫德吉(Vismordegib)、环巴胺、索尼德吉(Sonidegib)等，其添加量例如可以设定为10nM～1μM左右、优选为50nM～500nM左右。

培养可例示在约37℃左右及二氧化碳浓度约5％左右的条件下进行培养的方法，但并不限定于此。上述条件下的培养例如可以在使用已知的CO₂恒温箱控制温度及CO₂浓度的同时进行。

培养可以通过二维细胞培养(平面培养)来进行。对于二维细胞培养而言，可以根据需要对培养器具实施促进细胞粘附的涂覆处理而进行。

进行使Wnt信号活化的环境下的培养的期间没有特别限定，例如可以设定为6小时～4天左右、优选为1天～3天左右、更优选为2天左右(48小时左右)。根据需要，可以进行培养基更换。培养条件优选以常规方法为基准。

在培养中，可以根据需要进行传代。在进行传代的情况下，在达到汇合状态之前或刚刚达到汇合状态之后回收细胞，将细胞接种至新的培养基。另外，也可以适宜地更换培养基。

作为培养基，优选使用IMDM培养基、F12培养基、或其混合培养基等无血清培养基。可在不含来自动物的成分的状态下进行分化诱导以及维持培养。另外，可以在前述无血清培养基中添加链霉素、青霉素等抗菌药、非必需氨基酸(NEAA)、ROCK抑制剂(例如，Y-27632((R)-(+)-反式-N-(4-吡啶基)-4-(1-氨基乙基)-环己甲酰胺·2HCl))、胰岛素等激素、转铁蛋白、白蛋白等蛋白质、脂质、聚乙烯醇、单硫代甘油等各种培养基添加物。

接着，将所制备的肢芽间充质干细胞在使Wnt信号活化的环境下培养，向PRRX1蛋白阳性的软骨祖细胞进行分化诱导。需要说明的是，所谓使Wnt信号活化的环境下，与上文同义。另外，从肢芽间充质细胞向软骨祖细胞的分化诱导进一步优选在FGF2等FGF信号活化剂的存在下进行。

如上所述地操作而制造了PRRX1蛋白阳性的软骨祖细胞。具体实施方式如后述的实施例中记载的那样。另外，也可以参照国际公开第2021/054449号的记载。另外，这样得到的软骨祖细胞可在同一批次中进行扩大培养，可在一定的品质管理条件下储存。

人软骨祖细胞向前述细胞凝集块制造用基板的接种可利用本身已知的方法来实施：将细胞悬浮于培养基、例如在后续的工序(3)中的培养中使用的培养基中而制成细胞悬浮液，将其添加至前述细胞凝集块制造用基板；等等。

工序(3)

工序(3)中，对来自多能干细胞的PRRX1蛋白阳性的人软骨祖细胞进行培养从而制成细胞凝集块。

对于培养而言，只要是能由前述人软骨祖细胞制成细胞凝集块的方法即可，没有特别限定，可根据人软骨祖细胞的性质等而适宜选择。

例如，来自多能干细胞的PRRX1蛋白阳性的人软骨祖细胞的培养优选在使Wnt信号活化的环境下、及/或抑制TGFβ信号的环境下进行。

抑制TGFβ信号的环境下的培养可以通过在例如有效量的TGFβ信号抑制剂的存在下进行培养来实施。TGFβ信号抑制剂是抑制(阻碍)由TGFβ介导的信号传导的物质。作为TGFβ信号抑制剂，可举出A-83-01(3-(6-甲基-2-吡啶基)-N-苯基-4-(4-喹啉基)-1H-吡唑-1-硫代甲酰胺)、SB431542(4-[4-(1,3-苯并二氧代-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺)等。使用A-83-01作为TGFβ信号抑制剂的情况下，其添加量例如可以设定为0.1～10μM左右、优选为0.2～5μM。

进行培养的期间没有特别限定，例如可以设定为6小时～4天左右、优选为1天～3天左右、更优选为2天左右(48小时左右)。根据需要，可以进行培养基更换。培养条件优选以常规方法为基准。

作为培养基，优选使用IMDM培养基、F12培养基、或其混合培养基等无血清培养基。可以在不含来自动物的成分的状态下进行分化诱导以及维持培养。另外，可以在前述无血清培养基中添加链霉素、青霉素等抗菌药、非必需氨基酸(NEAA)、ROCK抑制剂(例如，Y-27632)、EGF、FGF等细胞生长因子、胰岛素等激素、转铁蛋白、白蛋白等蛋白质、脂质、聚乙烯醇、单硫代甘油等各种培养基添加物。

如上所述地操作而由人软骨祖细胞制造了细胞凝集块。具体实施方式如后述的实施例中记载的那样。

通过利用工序(1)所提供的、具备由特定的共聚物形成的多个点部的细胞凝集块制造用基板，能在使细胞粘附于点部后将其剥离而形成细胞凝集块。需要说明的是，所谓细胞凝集块，表示细胞发生了凝集的结果所形成的结构体，像球状、环状等那样，形状没有限定。与以往的通过细胞低粘附板上的非粘附培养而制作的细胞凝集块相比，在通过规定粘附面积来进行的细胞凝集块的尺寸调整(能够制造任意大小的细胞凝集块)等方面具有优点。

工序(4)

工序(4)中，对通过前述工序得到的细胞凝集块进行培养从而制成软骨组织体。

对于培养而言，只要是能由前述细胞凝集块制成软骨组织体的方法即可，没有特别限定，可根据由前述人软骨祖细胞得到的细胞凝集块的性质等而适宜选择。

例如，由来自多能干细胞的PRRX1蛋白阳性的人软骨祖细胞得到的细胞凝集块的培养优选通过包括在使Wnt信号活化的环境下进行培养的工序的方法来实施。

另外，培养优选以多个阶段进行。具体而言，优选以下述3个阶段进行：

(i)在Wnt信号活化剂的存在下并且在FGF信号活化剂的存在下进行培养的工序，接着

(ii)在FGF信号活化剂的存在下(并且优选在不存在Wnt信号活化剂的条件下)进行培养的工序，接着

(iii)优选在不存在Wnt信号活化剂的条件下并且在不存在FGF信号活化剂的条件下进行培养的工序。

使FGF信号活化的环境下的培养可以通过在例如有效量的FGF信号活化剂的存在下进行培养来实施。FGF信号活化剂是增强成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导的物质。作为FGF信号活化剂，可举出FGF1/aFGF、FGF2/bFGF等。使用FGF2作为FGF信号活化剂的情况下，其添加量例如可以设定为0.1～100ng/mL左右、优选为1～50ng/mL。

在进行前述3个阶段的培养的情况下，工序(i)及工序(ii)可以通过二维细胞培养(平面培养)或三维培养来进行。对于二维细胞培养而言，可以根据需要对培养器具实施促进细胞粘附的涂覆处理而进行。工序(iii)优选通过三维培养来进行。需要说明的是，在各阶段的培养期间，为了降低之前的培养环境的影响，优选在适宜地进行了利用PBS缓冲液等的清洗的基础上进行培养。

培养可以在用于储存细胞及培养基的适当的容器中进行。作为优选的进行培养的方法，可例示在约37℃左右及二氧化碳浓度约5％左右的条件下进行培养的方法，但并不限定于此。上述条件下的培养例如可以在使用已知的CO₂恒温箱控制温度及CO₂浓度的同时进行。

在不损害本发明的效果的范围内，进行使Wnt信号活化的环境下的培养的期间没有特别限定。例如，可以设定为2小时～12天左右、4天～8天左右。另外，在以多个阶段进行培养的情况下，例如在进行前述3个阶段的培养的情况下，工序(i)及工序(ii)各自可以设定为2小时～12天左右、4天～8天左右，工序(iii)可以设定为2小时～60天左右、8天～54天左右。根据需要，可以在培养期间内进行培养基更换。培养条件优选以常规方法为基准。

在培养中，必要时可以进行传代。在进行传代的情况下，在达到汇合状态之前或刚刚达到汇合状态之后回收细胞，将细胞接种至新的培养基。

工序(4)的培养中使用的培养基没有特别限定。作为培养基，可以使用IMDM培养基、F12培养基、或其混合培养基等无血清培养基，可以使用进一步向它们中添加L-抗坏血酸、ITS(胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠培养基补充剂)、GDF5、及/或BMP4等而得到的已知的软骨诱导培养基。另外，根据需要，也可以添加链霉素、青霉素等抗菌药、非必需氨基酸(NEAA)、ROCK抑制剂(例如，Y-27632)、EGF、TGFβ等细胞生长因子、胰岛素等激素、转铁蛋白、白蛋白等蛋白质、脂质、聚乙烯醇、单硫代甘油等已知的各种培养基添加物。

进而，工序(4)的培养中使用的培养基优选包含琼脂或含有琼脂的培养基组合物。

琼脂由琼脂糖、和琼脂糖部分地被硫酸酯化或被甲氧基、丙酮酸基、羧基取代而得到的琼脂胶构成，关于这些构成成分的比率，没有限制，也可以仅由琼脂糖构成。另外，本发明中的“琼脂”也包括：琼脂糖被羟乙基化而得到的低熔点琼脂糖；通过原料海藻的选择或通过实施羟乙基化等而制备成的低熔点琼脂；以及对热水也显示出高溶解性的即溶性琼脂；等等。

本发明中，工业上制造的粉末状、片状或固体状的琼脂为高纯度且品质也均匀，因此可优选使用。另外，可以使用在医药品、食品等领域中通常使用的具有各种性状、物性的琼脂，可以使用重均分子量为10,000～60,000的低分子量的琼脂、重均分子量大于60,000且为100,000以下左右、并且凝胶强度低的低强度琼脂、重均分子量为290,000左右的高分子量的琼脂等。作为所述琼脂，可以利用市售的制品，例如，可以使用由伊那食品工业株式会社销售的“Ultra Kanten Ina”、“Ultra Kanten AX-30”、“Ultra Kanten AX-100”、“S-6”、“S-7”等。

本发明中，优选使用重均分子量为10,000～60,000、分子量比一般的琼脂低的琼脂(以下，本说明书中，有时称为“低分子琼脂”)。低分子琼脂的重均分子量如上所述为10,000～60,000，更优选为20,000～60,000，进一步优选为30,000～60,000，进一步更优选为40,000～60,000，更进一步优选为43,000～60,000，特别优选为43,000～50,000。使用重均分子量小于10,000的琼脂的情况下，有时难以获得使细胞分散的效果。另一方面，使用重均分子量大于60,000的琼脂的情况下，有时细胞或组织在培养基中的分散变得不均匀，不能获得充分的增殖促进效果。

此外，作为本发明中使用的低分子琼脂，优选为分子量分布窄的琼脂，以将琼脂的重均分子量(Mw)除以数均分子量(Mn)而得的值的形式得到的分子量分布(Mw/Mn)优选为1.1～8.0，更优选为1.5～7.0，进一步优选为2.0～6.0，更进一步优选为2.5～5.5，特别优选为3.5～5.0。

需要说明的是，琼脂的上述重均分子量及数均分子量可以通过基于高效液相色谱法(HPLC)的凝胶渗透色谱法来测定。

前述低分子琼脂可以通过已知的方法(基于通常的琼脂的酸处理的低分子化、或者在从石花菜、龙须菜、拟鸡毛菜等海藻的提取工序时或针对经过前述提取工序或过滤工序中的任一者后的琼脂进行酸处理等)来制造，也可以使用作为低分子琼脂而被市售的制品、例如上述的“Ultra Kanten Ina”(伊那食品工业株式会社制)等。

可以将前述琼脂直接作为培养基添加物而添加至前述工序(4)所使用的培养基中，或者利用前述工序(4)所使用的培养基对包含前述琼脂的培养基组合物进行稀释，并实施培养。作为这样的含有琼脂的培养基组合物，例如可以使用“SphereMAX(商标)”(日产化学株式会社制)等。另外，琼脂及含有琼脂的培养基组合物的更具体的方式记载于国际公开第2016/167373号中。

琼脂的含量相对于工序(4)所使用的培养基的总量而言优选为0.005(w/v)％以上且小于2(w/v)％，更优选为0.03(w/v)％以上且小于2(w/v)％，进一步优选为0.03(w/v)％～1(w/v)％，进一步更优选为0.03(w/v)％～0.1(w/v)％。若培养基中的琼脂的含量为0.005(w/v)％以上，则在不形成过剩的大小的细胞凝集块的情况下进行增殖，可观察到细胞的增殖促进效果。另外，若培养基中的琼脂的含量为0.03(w/v)％以上，则可获得细胞或组织的均匀分散，因此是更优选的。另一方面，若培养基组合物中的琼脂的含量为2(w/v)％以上，则有于室温发生凝胶化的情况，因此有时操作变得困难。

如上所述地操作而制造了软骨组织体。关于得到了软骨组织体这一点，可以通过例如番红O染色、阿尔新蓝染色、番红O染色、或甲苯胺蓝染色呈阳性等来确认。

<软骨组织体的使用>

本发明还涉及人的关节软骨损伤的治疗方法，所述方法的特征在于，将利用本发明的制造方法得到的软骨组织体移植到关节软骨的损伤或缺损部位。此处，软骨组织体的制造方法的具体方式、优选方式如上所述。另外，移植可以通过向关节软骨的损伤或缺损部位引入1个或多个利用本发明的制造方法得到的软骨组织体来实施。

实施例

[制备例1]

(细胞凝集块制造用基板的制备)

在具有抑制细胞附着的能力的培养皿(直径：35mm)(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.，MS9035X)的培养表面的中央部的1.5cm见方的范围内，使用液滴喷出装置(MICROJETcorporation，BioSpot BT600)，每次适量地按格子状向上下左右以隔开300μm的间隔的方式滴加甲基丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基)乙酯与甲基丙烯酸的共聚物(相对于全部单体而言的甲基丙烯酸2-(N,N-二甲基氨基乙基)酯的摩尔比率为90％)的水溶液，然后，于室温使液滴进行15分钟干燥从而使其固着化，由此制备具有350个细胞可粘附的独立的直径为100～1000μm的圆形点部区域的细胞凝集块制造用基板。

[制备例2]

(PRRX1蛋白阳性的人软骨祖细胞的制备)

将人iPS细胞(3×10⁴：由京都大学iPS细胞研究所提供的414C2细胞株)悬浮于含有10μM CultureSure(注册商标)Y-27632(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)及4μL的iMatrix-511(NIPPI株式会社)的1mL的StemFit(注册商标)(Ajinomoto HealthySupply Co.,Inc.)中，加入至35mm的培养皿中。翌日，将培养基更换为不含Y-27632的新的StemFit(注册商标)。培养2天后，利用PBS对细胞进行清洗，在各个阶段更换为具有以下的组成的培养基，由此依次诱导分化为原条(mid-primitive streak)、侧板中胚层细胞(LPM)、肢芽间充质细胞(LBM)。

·原条分化诱导培养基组成：

无血清培养基：50％IMDM培养基(Gibco)+50％F12培养基(Gibco)+1mg/mL聚乙烯醇(Sigma-Aldrich)+1％(v/v)脂质浓缩物(Gibco)+450μM单硫代甘油(Sigma-Aldrich)+0.7μg/mL胰岛素(Sigma-Aldrich)+15μg/mL转铁蛋白(Sigma-Aldrich)+1％(v/v)青霉素/链霉素(Gibco)(以下，称为“CDM2基础培养基(basal medium)”)

30ng/mL活化素A

40ng/mL BMP4

6μM CHIR99021

100nM PIK90(Funakoshi(株))

10μM Y-27632

·侧板中胚层(LPM)分化诱导培养基组成：

CDM2基础培养基

1μM A-83-01

30ng/mL BMP4

1μM C59

10μM Y-27632

·肢芽间充质细胞(LBM)分化诱导培养基组成：

CDM2基础培养基

1μM A-83-01

0.5μM LDN-193189

3μM CHIR99021

150nM维莫德吉

10μM Y-27632

接着，使用Accutase(Thermo Fisher Scientific)将所得到的LBM细胞剥离，将2×10⁵个细胞悬浮于含有16μL的iMatrix-511(NIPPI株式会社)的、下述的人软骨祖细胞分化诱导培养基中，加入至60mm的培养皿中。每隔2天将培养基更换为新的人软骨祖细胞分化诱导培养基，分化诱导为人软骨祖细胞。细胞在达到亚汇合之前同样地进行了传代。

·人软骨祖细胞分化诱导培养基组成：

CDM2基础培养基

1μM A-83-01

3μM CHIR99021

20ng/mL FGF2

20ng/mL EGF

10μM Y-27632

[实施例1]

(细胞凝集块的制作)

在制备例1所得到的培养皿中，接种利用1mL的培养基(CDM2基础培养基+3μMCHIR99021+1μM A-83-01+20ng/mL EGF+20ng/mL FGF)进行了悬浮的、制备例2所得到的1×10⁶个人软骨祖细胞(以下，也称为“ExpLBM细胞”)，于37℃进行培养。在4小时后进行培养基更换。在培养基更换2天后确认到形成了细胞凝集块。将结果示于图1。

(软骨组织体的制作)

将所得到的细胞凝集块剥离，转移至超低吸附板(ultra low attachment plate)(6孔)(Corning公司制#3471)中。对于转移后的细胞凝集块，利用培养基1处理6天(第0天～第6天：培养基组成记载于下文中)，在第6天的时间点替换为培养基2并处理6天(第6天～第12天：培养基组成记载于下文中)，然后，替换为培养基3并进行42天(第12天～第54天：培养基组成记载于下文中)培养，得到软骨组织体。将结果示于图2及图3。图2为实体显微镜照片，图3为利用倒置显微镜以明视野进行拍摄而得到的照片。

培养基组成

培养基1：CDM2基础培养基+3μM CHIR99021+10ng/mL FGF2+50μg/mL抗坏血酸+1×ITS+4％含有低分子琼脂的培养基组合物

培养基2：CDM2基础培养基+10ng/mL FGF2+50μg/mL抗坏血酸+30ng/mL BMP4+10ng/mL TGFβ₁+10ng/mL GDF5+1×ITS+0.04％含有低分子琼脂的培养基组合物

培养基3：CDM2基础培养基+50μg/mL抗坏血酸+30ng/mL BMP4+10ng/mL TGFβ₁+10ng/mL GDF5+1×ITS+0.04％含有低分子琼脂的培养基组合物

前述含有低分子琼脂的培养基组合物是依照国际公开第2016/167373的试验例10制备的含有低分子琼脂的培养基组合物。

(软骨组织体的观察)

将所形成的软骨组织体用4％PFA固定，制成组织切片，利用苏木精(HE)、阿尔新蓝及番红O进行染色并将结果分别示于图4。染色条件如下所述。

·HE染色条件

在脱石蜡后利用Eosin进行1分钟的染色，接着利用苏木精对标本进行20分钟处理，由此进行核染色。

·阿尔新蓝染色条件

在脱石蜡后利用1％阿尔新蓝/3％乙酸对标本进行20分钟处理，利用3％乙酸进行清洗后，利用苏木精对标本进行20分钟处理，由此进行核染色。

·番红O染色条件

在脱石蜡后利用魏格特氏铁苏木精(Weigert’s iron hematoxylin)溶液进行10分钟染色。接着利用坚牢绿溶液进行5分钟染色，然后利用1％乙酸进行清洗。接着利用0.1％番红O溶液进行5分钟染色。

[评价例1]

利用活检环钻在SCID大鼠(由国家生物资源项目-大鼠(National BioResourceProject-Rat)提供，东京大学(日本东京))的膝关节软骨上开孔(长径为1.5mm，深度为约1mm)，塞入实施例1中制作的软骨组织体(3个)从而进行移植。在移植4周后采集组织片，进行各种组织染色(HE染色、番红O、甲苯胺蓝染色)。将结果示于图5。如图5所示，观察到移植物在缺损部的成活，可知在该部位形成了透明软骨。

产业上的可利用性

本发明的制造方法可以通过将经品质管理的软骨祖细胞作为原料进行分化诱导处理从而制成软骨组织，另外，所制作的软骨组织中不包含软骨细胞以外的细胞，因此，从将软骨组织体安全地用于再生医疗的方面来看是有利的。此外，通过在规定的培养条件下实施源自软骨祖细胞的软骨组织的制作，能够进行高效的细胞增殖、并且由少数的细胞制作大的软骨组织片，在成本方面也是有利的。

Claims

1.软骨组织体的制造方法，其特征在于，包括下述工序：

提供细胞凝集块制造用基板的工序，所述细胞凝集块制造用基板在具有抑制细胞附着的能力的基板上具备由包含由下述式(I)表示的单体衍生的重复单元、及由下述式(II)表示的单体衍生的重复单元的共聚物形成的多个点部；在该基板上接种来自多能干细胞的PRRX1蛋白阳性的人软骨祖细胞的工序；对该细胞进行培养从而制成细胞凝集块的工序；对该凝集块进行培养从而制成软骨组织体的工序，

[化学式1]

式(I)中，

U^a1及U^a2各自独立地表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基，R^a1表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基，R^a2表示碳原子数为1至5的直链或支链亚烷基；

[化学式2]

式(II)中，

R^b表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基。

2.如权利要求1所述的制造方法，其中，由式(I)表示的单体衍生的重复单元相对于由所述式(I)表示的单体衍生的重复单元及由所述式(II)表示的单体衍生的重复单元的合计而言的摩尔比率为99摩尔％～51摩尔％。

3.如权利要求1或2所述的制造方法，其中，所述共聚物还包含由下述式(III)表示的单体衍生的结构单元，

[化学式3]

式(III)中，

R^c及R^d各自独立地表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基，R^e表示碳原子数为1至5的直链或支链亚烷基，n表示1～50的数。

4.如权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，所述具有抑制细胞附着的能力的基板在其表面的至少一部分包含含有共聚物(P)的涂覆膜，所述共聚物(P)包含含有下述式(a)表示的基团的重复单元、和含有下述式(b)表示的基团的重复单元，

[化学式4]

式中，

U^a11、U^a12、U^b11、U^b12及U^b13各自独立地表示氢原子或碳原子数为1至5的直链或支链烷基，An^-表示选自由卤化物离子、无机酸根离子、氢氧化物离子及异硫氰酸根离子组成的组中的阴离子。

5.如权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，制成软骨组织体的工序中的培养是利用含有琼脂的培养基实施的。

6.如权利要求5所述的制造方法，其中，琼脂的重均分子量为10,000～60,000，琼脂的含量相对于培养基的总量而言为0.005(w/v)％以上且小于2(w/v)％。