KR102257868B1 - 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 정제 방법 및 이의 증폭 방법 - Google Patents

다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 정제 방법 및 이의 증폭 방법 Download PDF

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Abstract

다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포를 상피 성장 인자 (EGF) 계열에 속하는 인자 및/또는 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 계열에 속하는 인자, 및 (2) Wnt 아고니스트를 함유하는 배지에서 3 차원 배양하는 단계 (A) 를 포함하는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법; 상기 배양 방법에 의해 배양된 췌장 전구 세포를 도세포로 분화 유도하는 단계 (E) 를 포함하는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포로부터의 도세포의 제조 방법; 및 상기 배양 방법에 의해 배양된 췌장 전구 세포를 동결시키는 단계 (F) 를 포함하는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 동결보존 방법을 개시한다.

Description

다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 정제 방법 및 이의 증폭 방법
본 발명은 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포로부터의 도세포 (islet cell) 의 제조 방법, 및 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 동결보존 방법에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포 배양용 배지에 관한 것이다.
췌장 이식 및 췌도 이식은 당뇨병 (특히 인슐린 의존성 당뇨병) 의 치료법으로서 효과적이지만; 장기 기증자의 수의 적음, 면역 거부반응의 억제를 위한 면역억제제 복용의 필요성 등이 주요 문제가 되고 있다. 따라서, 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS 세포) 및 배아 줄기 (ES) 세포와 같은 다능성 줄기 세포, 및 유기체에서 단리된 췌장 전구 세포로부터 도세포를 분화 유도하는 연구가, 마우스 및 인간 유래의 세포를 사용하여 광범위하게 수행되어 왔다 (예를 들어, NPL 1).
도세포를 수득하기 위하여, 다능성 줄기 세포를 중내배엽 세포 및 최종 내배엽을 통해 췌장 전구 세포로 분화시킨 후, 내분비 전구체 세포 및 도세포, 예컨대 α-세포, β-세포 및 δ-세포로 분화시킨다. 다수의 도세포가 췌도 이식에 요구되지만, 분화된 도세포는 낮은 증식 능력을 갖는다. 대조적으로, 미(未)분화된 다능성 줄기 세포는 증식 능력을 갖지만; 이의 분화 유도에는 오랜 기간이 요구된다. 또한, 다능성 줄기 세포가 이식에 사용되는 도세포에 혼합되는 경우에는, 이식 후 종양 형성에 대한 우려가 존재한다. 따라서, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 증식을 시도한 다수의 연구가 존재한다.
이러한 연구에서는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포를 증식시키기 위해, 각종 피더세포 (feeder cell) 를 사용한 공동배양 (co-culture) 이 수행된다 (예를 들어, NPL 2 및 NPL 3). 하지만, 이러한 피더세포의 사용 및 혈청의 사용은, 공지되지 않은 성분을 갖는 재료의 사용을 의미하며, 로트 (lot) 간 성분의 차이로 인해 균일한 특성을 갖는 췌장 전구 세포를 안정적으로 제조하는 것이 곤란하다는 문제가 있다. 나아가, 이종 동물 유래의 피더세포 및 혈청이 사용되는 경우에는, 이종 동물 유래의 공지되지 않은 병원체를 갖는 감염원이 될 수 있는 위험이 있다.
NPL 2 에는, ES 세포 유래의 전구 세포를, 분화 없이, 전구 세포를 간엽 세포와 공동배양함으로써 증식시킨 것이 보고되어 있다.
NPL 3 에는, ES 세포 유래의 췌장 전구 세포를, 분화 없이, 내피 세포와 공동배양하거나 또는 EGFL7 존재 하에서 배양함으로써 증식시킨 것이 보고되어 있으나; 이의 증식 능력은 불충분하다.
또한, 유기체에서 단리된 췌장 전구 세포를 생체외 배양으로 증식시킨 것이 보고되어 있으나; 다능성 줄기 세포 유래가 아닌 췌장 전구 세포의 경우에는 충분한 증식이 달성되지 않았다.
예를 들어, PTL 1 에는, 유기체로부터 단리된 췌장 조직 단편을, 특정 세포 배양 배지를 사용하여 배양한 것이 보고되어 있다. 하지만, PTL 1 에는 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 사용이 개시되어 있지 않으며, 배양에 사용된 세포군 (cell population) 은 균질한 세포군이 아니다. 췌장 조직 유래의 각종 세포군이 배양되었으며, PTL 1 에는 균질한 췌장 전구 세포군의 배양이 개시되어 있지 않다.
PTL 1: JP5722835B
NPL 1: A Rezania et al. Nat Biotechnol. 2014 Nov; 32 (11): 1121-1133 NPL 2: JB Sneddon et al. Nature. 2012 Nov; 491 (7426): 765-768 NPL 3: DI Kao et al. Stem Cell Reports. 2015 Feb; 4 (2): 181-189
본 발명의 목적은, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 분화를 억제하면서, 이를 효율적으로 증식시킬 수 있는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 배양 방법에 의해 수득된 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포로부터의 도세포의 제조 방법, 및 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 동결보존 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 분화를 억제하면서, 이를 효율적으로 증식시킬 수 있는 배양 배지를 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위하여 예의 연구한 결과, 본 발명자들은 상피 성장 인자 (EGF) 및 R-스폰딘 1 (R-spondin 1) 을 함유하는 배지, 또는 FGF-7 및 GSK 저해제 (CHIR99021) 의 다양한 조합을 함유하는 배지에서, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포를 세포 응집체 형태로 배양함으로써, 상기 목적이 달성될 수 있다는 것을 발견하였다.
본 발명은 이러한 발견을 기반으로 추가적인 검토를 통해 완성된 것이다. 본 발명은, 하기 기재되는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포로부터의 도세포의 제조 방법, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 동결보존 방법, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포 배양용 배지 등을 제공한다. 이하에서, "(I-1) 내지 ~" 라는 기재에는, (I-1-A), (I-1-B) 등이 포함되며, 다른 것에 대해서도 동일하게 적용된다.
(I) 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법
(I-1) 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포를, (1) 상피 성장 인자 (EGF) 계열에 속하는 인자 및/또는 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 계열에 속하는 인자, 및 (2) Wnt 아고니스트를 함유하는 배지에서 3 차원 배양하는 단계 (A) 를 포함하는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법.
(I-1-A) Wnt 아고니스트가 Wnt 계열에 속하는 인자, R-스폰딘 계열에 속하는 인자, 노린 (norrin) 및/또는 GSK 저해제인, (I-1) 에 따른 방법.
(I-1-B) Wnt 아고니스트가 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp, Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, CHIR99021, SB216763, SB415286, A1070722, BIO, BIO-아세톡심, 인디루빈-3'-옥심, NSC 693868, TC-G 24, TCS 2002, TWS 119, siRNA, 리튬, 켄파울론 (kenpaullone), R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4 및 노린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 인자를 포함하는, (I-1) 에 따른 방법.
(I-2) Wnt 아고니스트가 R-스폰딘 계열에 속하는 단백질 및/또는 GSK 저해제인, (I-1) 에 따른 방법.
(I-2-A) EGF 계열에 속하는 인자 및/또는 FGF 계열에 속하는 인자 (1) 이 ErbB1 에 결합하는 인자 및/또는 FGFR2IIIb 에 결합하는 인자인, (I-1), (I-1-A), (I-1-B) 또는 (I-2) 에 따른 방법.
(I-2-B) EGF 계열에 속하는 인자 및/또는 FGF 계열에 속하는 인자 (1) 이 EGF, 형질전환 성장 인자 (transforming growth factor) α (TGF-α), 암피레굴린 (amphiregulin), 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자, 신경초종 (schwannoma)-유래 성장 인자, 베타셀룰린 (betacellulin), 폭스바이러스 성장 인자, 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF, FGF-1), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF, FGF-2), FGF-3, 케라티노사이트 성장 인자 (KGF, FGF-7), FGF-10 및 FGF-22 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 인자를 포함하는, (I-1), (I-1-A), (I-1-B) 또는 (I-2) 에 따른 방법.
(I-3) EGF 계열에 속하는 인자 및/또는 FGF 계열에 속하는 인자 (1) 이 EGF 이고, Wnt 아고니스트 (2) 가 R-스폰딘 1 인, (I-1) 에 따른 방법.
(I-4) EGF 계열에 속하는 인자가 EGF 이고, FGF 계열에 속하는 인자가 FGF-7 이고, R-스폰딘 계열에 속하는 단백질이 R-스폰딘 1 이고, GSK 저해제가 CHIR99021 인, (I-2) 에 따른 방법.
(I-5) 배지가 무혈청 배지인, (I-1) 내지 (I-4) 중 어느 하나에 따른 방법.
(I-6) 배양이 피더세포의 부재 하에서의 배양인, (I-1) 내지 (I-5) 중 어느 하나에 따른 방법.
(I-7) 다능성 줄기 세포가 iPS 세포 또는 ES 세포인, (I-1) 내지 (I-6) 중 어느 하나에 따른 방법.
(I-8) 다능성 줄기 세포가 인간 유래인, (I-1) 내지 (I-7) 중 어느 하나에 따른 방법.
(I-9) 3 차원 배양이 췌장 전구 세포의 응집체의 부유 배양인, (I-1) 내지 (I-8) 중 어느 하나에 따른 방법.
(I-10) 단계 (A) 에서 수득된 췌장 전구 세포를 추가로 계대배양하는 단계 (B) 를 추가로 포함하는, (I-1) 내지 (I-9) 중 어느 하나에 따른 방법.
(I-11) 췌장 전구 세포의 정제에 사용하기 위한, (I-1) 내지 (I-10) 중 어느 하나에 따른 방법.
(I-12) iPS 세포를 제조하는 단계 (C) 를 추가로 포함하고, iPS 세포 유래의 췌장 전구 세포가 단계 (A) 에 사용되는, (I-1) 내지 (I-11) 중 어느 하나에 따른 방법.
(I-13) 다능성 줄기 세포를 췌장 전구 세포로 분화 유도하는 단계 (D) 를 추가로 포함하고, 췌장 전구 세포가 단계 (A) 에 사용되는, (I-1) 내지 (I-12) 중 어느 하나에 따른 방법.
(II) 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포로부터의 도세포의 제조 방법
(II-1) (I-1) 내지 (I-13) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 배양된 췌장 전구 세포를, 도세포로 분화 유도하는 단계 (E) 를 포함하는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포로부터의 도세포의 제조 방법.
(III) 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 동결보존 방법
(III-1) (I-1) 내지 (I-13) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 배양된 췌장 전구 세포를 동결시키는 단계 (F) 를 포함하는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 동결보존 방법.
(IV) 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포 배양용 배지
(IV-1) (1) EGF 계열에 속하는 인자 및/또는 FGF 계열에 속하는 인자, 및 (2) Wnt 아고니스트를 함유하는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포 배양용 배지.
(IV-1-A) Wnt 아고니스트가 Wnt 계열에 속하는 인자, R-스폰딘 계열에 속하는 인자, 노린 및/또는 GSK 저해제인, (IV-1) 에 따른 배지.
(IV-1-B) Wnt 아고니스트가 Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp, Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11, Wnt-16, CHIR99021, SB216763, SB415286, A1070722, BIO, BIO-아세톡심, 인디루빈-3'-옥심, NSC 693868, TC-G 24, TCS 2002, TWS 119, siRNA, 리튬, 켄파울론, R-스폰딘 1, R-스폰딘 2, R-스폰딘 3, R-스폰딘 4 및 노린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 인자를 포함하는, (IV-1) 에 따른 배지.
(IV-2) Wnt 아고니스트가 R-스폰딘 계열에 속하는 단백질 및/또는 GSK 저해제인, (IV-1) 에 따른 배지.
(IV-2-A) EGF 계열에 속하는 인자 및/또는 FGF 계열에 속하는 인자 (1) 이 ErbB1 에 결합하는 인자 및/또는 FGFR2IIIb 에 결합하는 인자인, (IV-1), (IV-1-A), (IV-1-B) 또는 (IV-2) 에 따른 배지.
(IV-2-B) EGF 계열에 속하는 인자 및/또는 FGF 계열에 속하는 인자 (1) 이 EGF, 형질전환 성장 인자 α (TGF-α), 암피레굴린, 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자, 신경초종-유래 성장 인자, 베타셀룰린, 폭스바이러스 성장 인자, 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF, FGF-1), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF, FGF-2), FGF-3, 케라티노사이트 성장 인자 (KGF, FGF-7), FGF-10 및 FGF-22 로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 인자를 포함하는, (IV-1), (IV-1-A), (IV-1-B) 또는 (IV-2) 에 따른 배지.
(IV-3) EGF 계열에 속하는 인자 및/또는 FGF 계열에 속하는 인자 (1) 이 EGF 이고, Wnt 아고니스트 (2) 가 R-스폰딘 1 인, (VI-1) 에 따른 배지.
(IV-4) EGF 계열에 속하는 인자가 EGF 이고, FGF 계열에 속하는 인자가 FGF-7 이고, R-스폰딘 계열에 속하는 단백질이 R-스폰딘 1 이고, GSK 저해제가 CHIR99021 인, (IV-2) 에 따른 배지.
(IV-5) 혈청을 함유하지 않는, (IV-1) 내지 (IV-4) 중 어느 하나에 따른 배지.
(IV-6) 피더세포의 부재 하에서의 배양을 위한, (IV-1) 내지 (IV-5) 중 어느 하나에 따른 배지.
(IV-7) 다능성 줄기 세포가 iPS 세포 또는 ES 세포인, (IV-1) 내지 (IV-6) 중 어느 하나에 따른 배지.
(IV-8) 다능성 줄기 세포가 인간 유래인, (IV-1) 내지 (IV-7) 중 어느 하나에 따른 배지.
(IV-9) 소닉 헤지호그 (Sonic Hedgehog) 신호 저해제, TGF-β 수용체 저해제 및 레티노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종을 추가로 함유하는, (IV-1) 내지 (IV-8) 중 어느 하나에 따른 배지.
(IV-10) 췌장 전구 세포의 정제에 사용하기 위한, (IV-1) 내지 (IV-9) 중 어느 하나에 따른 배지.
(V) 배양 배지에서의 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 용도
(V-1) 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포 배양용 배지에서의, (IV-1) 내지 (IV-4) 및 (IV-9) 중 어느 하나에 따른 성분의 용도.
(VI) 약학적 제제
(VI-1) (I-1) 내지 (I-13) 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 배양된 췌장 전구 세포를 포함하는 약학적 제제.
(VII) 배양
(VII-1) (1) EGF 계열에 속하는 인자 및/또는 FGF 계열에 속하는 인자, (2) Wnt 아고니스트, 및 5 질량% 이상, 10 질량% 이상, 15 질량% 이상 또는 20 질량% 이상의 췌장 전구 세포를 포함하는 격리 배양.
본 발명의 배양 방법에 따라, 고도로 균질한 세포군인 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포를, 무혈청 및 무피더세포 조건 하에서, 이의 분화를 억제하면서 효율적으로 증식시킬 수 있다. 배양이 무혈청 및 무피더세포 조건 하에서 수행되기 때문에, 로트 간 배지의 차이를 감소시킬 수 있으며, 안정한 품질을 갖는 췌장 전구 세포를 제조할 수 있다.
나아가, 본 발명의 배양 방법을 계대배양에 사용할 수 있기 때문에, 다량의 췌장 전구 세포를 증식시킬 수 있으며, 췌장 전구 세포를 계대배양 과정에서 정제할 수 있다.
또한, 본 발명의 배양 방법에 의해 증식시킨 췌장 전구 세포를, 인슐린-생산 세포 (β-세포) 를 포함하는 도세포로 분화 유도할 수 있다.
본 발명의 배양 방법에 의해 증식시킨 췌장 전구 세포를 동결보존할 수 있고, 또한 해동 후에도, 동결 전과 같이 증식시킬 수 있다.
다량의 췌장 전구 세포를 본 발명의 배양 방법에 의해 증식시킬 수 있기 때문에, 배양 방법은 췌장 전구 세포의 단계에서 세포를 스크리닝 (예를 들어, 미분화된 세포 또는 종양형성 세포의 제거) 및 안전성 평가할 수 있다는 점에서; 췌장 전구 세포의 제조 시간 및 제조 비용을 절감할 수 있다는 점에서; 및 품질이 보장된 다량의 도세포를 단시간에 공급할 수 있다는 점에서 유리하다.
본 발명의 배양 방법에 의해 증식시킨 췌장 전구 세포, 또는 본 발명의 배양 방법에 의해 증식시킨 췌장 전구 세포를 분화 유도하여 수득한 도세포는, 이를 직접 또는 캡슐화한 후에 환부에 이식하는 방식으로, (1 형 또는 2 형) 당뇨병을 치료하기 위한 세포 약학적 제제 또는 장치로서 유용하다.
도 1 은 췌장 전구 세포로의 분화 유도 후, 유동 세포 계측법 (flow cytometry analysis) 의 결과를 나타낸다.
도 2 는 췌장 전구 세포로의 분화 유도 후, 각각의 인자 또는 이들의 조합의 존재 하에서 6 일 동안 배양된 세포의 위상차 현미경 이미지를 보여주는 사진을 나타낸다.
도 3 은 췌장 전구 세포로의 분화 유도 후, 세포를 각각의 인자 또는 이들의 조합의 존재 하에서 배양했을 때의, 시간에 따른 세포 수의 변화를 나타내는 그래프이다. 수직축은 배양 개시 시간을 1 로 간주했을 때의 세포 수의 상대 값을 나타낸다.
도 4 는 췌장 전구 세포로의 분화 유도 후, 각각의 인자 또는 이들의 조합의 존재 하에서 6 일 동안 배양된 (계대배양되지 않음) 세포의 유동 세포 계측법의 결과를 나타낸다.
도 5 는 췌장 전구 세포로의 분화 유도 후, 세포를 부착 배양했을 때의, 시간에 따른 세포 수의 변화를 나타내는 그래프이다. 수직축은 배양 개시 시간을 1 로 간주했을 때의 세포 수의 상대 값을 나타낸다.
도 6 은 각각의 계대에서의 SOX9- 및 BrdU-양성 세포의 비율 (%) 을 나타내는 그래프이다.
도 7 은 각각의 계대에서의 세포의 유동 세포 계측법의 결과를 나타낸다.
도 8 은 각각의 계대에서의 SOX9- 및 PDX1-양성 세포의 비율 (%) 을 나타내는 그래프이다.
도 9 는 5 회 계대 후 세포 응집체의 위상차 현미경 이미지를 보여주는 사진을 나타낸다.
도 10 은 췌장 전구 세포로의 분화 유도 후, 세포를 6 일 간격으로 계대배양했을 때의, 시간에 따른 세포 수의 변화를 나타내는 그래프이다. 수직축은 배양 개시 시간을 1 로 간주했을 때의 세포 수의 상대 값을 나타낸다.
도 11 은 9 회 계대 후 세포의 면역염색 이미지를 보여주는 사진을 나타낸다.
도 12 는 9 회 계대 후 세포의 유동 세포 계측법의 결과를 나타낸다.
도 13 은 도세포로의 분화 유도 후, 세포의 유동 세포 계측법의 결과를 나타낸다.
도 14 는 도세포로의 분화 유도 후, 세포에 대한 포도당 부하 시험의 결과를 나타내는 그래프이다. 수직축은 분비된 C-펩타이드의 양을 나타낸다 (pM/256 응집체, 0.5 mL, 0.5 h).
도 15 는 도세포로의 분화 유도 후, 세포의 면역염색 이미지를 보여주는 사진을 나타낸다.
도 16 은 췌장 전구 세포를 각종 동결보존액을 사용하여 동결시키고, -196℃ 에서 저장한 후, 해동시켰을 때의, 세포 생존율 (%) 을 나타내는 그래프이다.
도 17 은 동결보존된 세포를 해동하여 수득된 세포 및 동결보존되지 않은 세포를, 췌장 전구 세포의 증식용 배지에서 배양했을 때의, 시간에 따른 세포 수의 변화를 나타내는 그래프이다. 수직축은 배양 개시 시간을 1 로 간주했을 때의 세포 수의 상대 값을 나타낸다.
도 18 은 RPChiPS771-2 주 유래의 췌장 전구 세포에 4 가지 인자 (EGF + RSPD1 + FGF-7 + CHIR99021) 를 첨가하여 배양했을 때의, 시간에 따른 세포 수의 변화를 나타내는 그래프이다. 수직축은 배양 개시 시간을 1 로 간주했을 때의 세포 수의 상대 값을 나타낸다.
도 19 는 각각의 인간 iPS 세포주 유래의 췌장 전구 세포에 4 가지 인자 (EGF + RSPD1 + FGF-7 + CHIR99021) 를 첨가하여 배양했을 때의, 유동 세포 계측법의 결과를 나타낸다.
도 20 은 각각의 인간 iPS 세포주 유래의 췌장 전구 세포에 2 내지 4 가지 인자를 첨가하여 배양했을 때의, 시간에 따른 세포 수의 변화를 나타내는 그래프이다. 수직축은 배양 개시 시간을 1 로 간주했을 때의 세포 수의 상대 값을 나타낸다.
도 21 은 각각의 인간 iPS 세포주 유래의 췌장 전구 세포에 2 내지 4 가지 인자를 첨가하여 배양했을 때의, Ki67- 및 PDX1-양성 세포의 비율 (%) 을 나타내는 그래프이다.
본 명세서는, 본 출원의 우선권의 기초가 되는 일본 특허 출원 제 2016-091116 호 (2016 년 4 월 28 일 출원) 의 명세서에 기재된 내용을 포함한다.
이하, 본 발명이 상세하게 기재된다.
본 명세서에서, 용어 "~ 을 함유하다" 및 "~ 을 포함하다" 에는, "본질적으로 ~ 로 이루어지다" 의 의미 및 "~ 로 이루어지다" 의 의미가 포함된다.
본 명세서에서, 용어 "배양" 은, 생체외 환경에서의 세포의 유지 또는/및 증식을 나타낸다. 용어 "배양하는" 은, 세포를 조직 외부 또는 체 외부에서 (예를 들어, 세포 배양 접시 또는 플라스크에서) 유지 또는/및 증식시키는 것을 나타낸다.
다능성 줄기 세포
다능성 줄기 세포는, 3 개의 배아 층 (내배엽, 중배엽 및 외배엽) 중 임의의 것으로 분화하는 능력인 다능성을 가지며, 자가-복제할 수 있는 줄기 세포이다. 다능성 줄기 세포는 특별히 제한되지 않는다. 이의 예에는, 배아 줄기 (ES) 세포, 핵 이식에 의해 수득된 복제된 배아 유래 배아 줄기 (ntES) 세포, 다능성 생식 줄기 세포 ("mGS 세포"), 배아 생식 세포 ("EG 세포"), 유도된 다능성 줄기 (iPS) 세포 등이 포함된다. 나아가, 다능성 줄기 세포 유래가 유래되는 유기체는 특별히 제한되지 않는다. 이의 예에는, 인간, 원숭이, 마우스, 래트, 기니피크, 토끼, 소, 돼지, 개, 말, 고양이, 염소 및 양과 같은 포유류가 포함된다. 이들 중에서, 인간 유래의 다능성 줄기 세포가 바람직하다. 사용 가능한 다능성 줄기 세포에는, 상업적으로 입수 가능한 다능성 줄기 세포, 소정의 기관에서 분양된 것, 및 공지된 방법에 의해 제조된 것들이 포함된다. ES 세포 및 iPS 세포는 바람직하게는 다능성 줄기 세포로서 사용될 수 있다.
ES 세포는 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 사용 가능한 ES 세포는, 예를 들어 모체에서 수득된 수정란을 재료로서 사용하여 제조된 것이 아닌, 체외 수정에 의해 수득된 수정란을 재료로 사용하여 제조된 것일 수 있다.
iPS 세포는 공지된 방법, 예를 들어 재프로그램화 인자의 임의의 체세포로의 도입에 의해 제조될 수 있다. 재프로그램화 인자의 예에는, Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 베타-카테닌, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 및 Glis1 과 같은 유전자; ?? 유전자 산물이 포함된다. 이러한 재프로그램화 인자는, 단독으로 또는 2 종 이상의 조합으로 사용될 수 있다. 재프로그램화 인자의 조합의 예에는, 하기에 기재된 것들이 포함된다: WO2007/069666, WO2008/118820, WO2009/007852, WO2009/032194, WO2009/058413, WO2009/057831, WO2009/075119, WO2009/079007, WO2009/091659, WO2009/101084, WO2009/101407, WO2009/102983, WO2009/114949, WO2009/117439, WO2009/126250, WO2009/126251, WO2009/126655, WO2009/157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO2010/056831, WO2010/068955, WO2010/098419, WO2010/102267, WO2010/111409, WO2010/111422, WO2010/115050, WO2010/124290, WO2010/147395, WO2010/147612; [Huangfu D et al., Nat. Biotechnol., 26:795-797 (2008)]; [Shi Y et al., Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)]; [Eminli S et al., Stem Cells. 26: 2467-2474 (2008)]; [Huangfu D et al., Nat. Biotechnol. 26: 1269-1275 (2008)]; [Shi Y et al., Cell Stem Cell, 3: 568-574 (2008)]; [Zhao Y et al., Cell Stem Cell, 3:475-479 (2008)]; [Marson A, Cell Stem Cell, 3:132-135 (2008)]; [Feng B et al., Nat. Cell Biol. 11:197-203 (2009)]; [Judson RL et al., Nat. Biotechnol., 27:459-461 (2009)]; [Lyssiotis CA et al., Proc Natl Acad Sci U S A.106: 8912-8917 (2009)]; [Kim JB et al., Nature. 461: 649-643 (2009)]; [Ichida JK et al., Cell Stem Cell. 5: 491-503 (2009)]; [Heng JC et al., Cell Stem Cell. 6: 167-174 (2010)]; [Han J et al., Nature. 463: 1096-1100 (2010)]; [Mali P et al., Stem Cells. 28: 713-720 (2010)]; 및 [Maekawa M et al., Nature. 474: 225-229(2011)].
상기 체세포는 특별히 제한되지 않는다. 이의 예에는, 태아 체세포, 신생아 체세포, 및 성숙한 건강한 및 병적인 체세포가 포함되고; 또한 1차 배양 세포, 계대 세포 및 주화 세포 (established cell) 가 포함된다. 체세포의 특정예에는, (1) 조직 줄기 세포 (체세포 줄기 세포), 예컨대 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 치수 (dental-pulp) 줄기 세포; (2) 조직 전구체 세포; 및 (3) 분화된 세포, 예컨대 혈액 세포 (말초 혈액 세포, 제대혈 세포 등), 림프구, 상피 세포, 내피 세포, 근육 세포, 섬유아세포 (피부 세포 등), 모발 세포, 간 세포, 위 점막 세포, 장 세포, 비장 세포, 췌장 세포 (췌장 외분비 세포 등), 뇌 세포, 폐 세포, 신장 세포 및 지방세포가 포함된다.
췌장 전구 세포
본 발명의 췌장 전구 세포는 후속적으로 도세포로 분화하는 세포를 나타낸다. 췌장 전구 세포는, 예를 들어 세포가 PDX1 (췌장 십이지장 호메오박스 유전자 (pancreas duodenal homeobox gene) 1) 에 대하여 양성인지 (및 SOX9 에 대하여 양성인지) 여부에 기초하여 동정될 수 있다.
나아가, 본 발명의 췌장 전구 세포는 또한, 세포가 NKX6.1, NGN3 (Neurogenin 3) 등에 대하여 음성인지 여부에 기초하여 동정될 수 있으나; 본 발명의 췌장 전구 세포는 NKX6.1 및/또는 NGN3 에 대하여 양성일 수 있다.
또한, HNF6, HLXB9, PAX4 및/또는 NKX2-2 와 같은 마커가, 또한 췌장 전구 세포를 위한 지표로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 췌장 전구 세포에는, PDX1, HNF6 및 HLXB9 와 같은 마커에 대하여 양성인 세포, 또는 NKX6.1, NGN3, PAX4 및 NKX2-2 와 같은 마커에 대하여 양성인 세포가 포함된다.
본 발명의 췌장 전구 세포는 바람직하게는 PDX1-양성이고, 더욱 바람직하게는 PDX1-양성 및 SOX9-양성이다.
본 발명의 췌장 전구 세포는 특히 바람직하게는 PDX1-양성, SOX9-양성이고, NKX6.1-음성 및/또는 NGN3-음성이다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 췌장 전구 세포는 특히 바람직하게는 PDX1-양성, SOX9-양성 및 NKX6.1-양성 및/또는 NGN3-양성이다.
도세포
본 발명의 췌도 (랑게르한스섬 (Langerhans island)) 세포는, 글루카곤-분비성 α-세포, 인슐린-분비성 β-세포 및 소마토스타틴 (somatostatin)-분비성 δ-세포 중 적어도 1 종을 포함하고; 바람직하게는 적어도 β-세포를 포함한다. α-세포, β-세포 및 δ-세포를 포함하는 도세포는, 예를 들어 각각, 글루카곤, 인슐린 또는 C-펩타이드, 및 소마토스타틴에 대한 항체를 사용하여 면역염색함으로써 확인될 수 있다. β-세포는 또한 C-펩타이드에 대한 항체를 사용하여 면역염색함으로써 검출될 수 있다. β-세포는 또한 디티존 염색에 의해 검출될 수 있다. 도세포는 추가로 췌장 폴리펩타이드를 분비하는 F-세포, 및 췌도 전구 세포를 포함할 수 있다.
췌장 전구 세포의 배양 방법 (단계 A)
본 발명에 따른 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법은, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포를, (1) 상피 성장 인자 (EGF) 계열에 속하는 인자 및/또는 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 계열에 속하는 인자 (이하 또한 성분 (1) 로서 언급됨), 및 (2) Wnt 아고니스트 (이하 또한 성분 (2) 로서 언급됨) 를 함유하는 배지에서 3 차원 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 배양 방법에 사용되는 췌장 전구 세포는 다능성 줄기 세포에서 유래된 것이며; 즉, 다능성 줄기 세포로부터 분화된 세포이다.
본 발명의 배양 방법에 사용되는 배지는, 적어도 (1) FGF 계열에 속하는 인자 및/또는 EGF 계열에 속하는 인자, 및 (2) Wnt 아고니스트를 함유하며, 기초 배지로서 사용되는, 동물 세포의 배양에 사용되는 배지이다. 기초 배지는, 동물 세포의 배양에 사용될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 이의 예에는, IMDM 배지, Medium 199 배지, 및 이글의 최소 필수 배지 (Eagle's Minimum Essential Medium) (EMEM) 배지, αMEM 배지, 둘베코의 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's Medium) (DMEM) 배지, 햄 (Ham) F12 배지, RPMI 1640 배지, 피셔 (Fischer) 배지, MCDB 131 배지, 및 이들의 혼합 배지가 포함된다. 따라서, 성분 (1) 및 성분 (2) 의 조합된 사용은 췌장 전구 세포를 효율적으로 증식시키는 것을 가능하게 한다.
EGF 계열에 속하는 인자는, EGF 수용체에 결합하여 이의 활성을 증가시킬 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. EGF 계열에 속하는 인자는 바람직하게는 EGF 수용체인, ErbB1 에 결합하는 인자이다. 이의 예에는, EGF, 형질전환 성장 인자-α (TGF-α), 암피레굴린, 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자, 신경초종-유래 성장 인자, 베타셀룰린 및 폭스바이러스 성장 인자; 더욱 바람직하게는 EGF 가 포함된다.
상피 성장 인자 (EGF) 는 각종 상피 세포 및 섬유아세포의 증식을 촉진하는 53 개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드이며, 3 개의 분자내 디술파이드 결합을 갖는다. 상피 성장 인자는 상피 성장 인자 수용체에 결합한다. 상피 성장 인자는 또한 상피 증식 인자, 상피 세포 성장 인자, 피부 성장 인자 및 표피모양 성장 인자와 같은 몇몇의 일본어 표현으로도 언급된다. 본 발명의 상피 성장 인자에는 광범위하게는, 이들이 본래의 활성을 가지고 있는 한, 자연 발생 상피 성장 인자 변이체가 포함된다. 상피 성장 인자는 시판용 제품일 수 있거나, 또는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
FGF 계열에 속하는 인자로서, 22 가지 유형의 FGF 가 인간 및 마우스에 존재한다. FGF 는 또한 섬유아세포 성장 인자 및 헤파린-결합 성장 인자로서 언급된다. FGF 계열에 속하는 인자의 예에는, 산성 섬유아세포 성장 인자 (aFGF, FGF-1), 염기성 섬유아세포 성장 인자 (bFGF, FGF-2), FGF-3, 케라티노사이트 성장 인자 (KGF, FGF-7), FGF-10 및 FGF-22; 바람직하게는 FGF 수용체인 FGFR2IIIb 에 결합하는 인자; 더욱 바람직하게는 FGF-3, FGF-7, FGF-10 및 FGF-22 가 포함된다.
Wnt 아고니스트는 Wnt 신호 전달을 활성화시키고, 세포 내에서 TCF/LEF-매개 전사를 활성화시키는 물질이다. 이의 예에는, Frizzled 수용체에의 결합 시 활성화를 유도하는 물질, 세포내 β-카테닌 분해 저해제, TCF/LEF 활성화제 등이 포함된다. 특정예에는, Wnt 계열에 속하는 인자 (예를 들어, Wnt 계열에 속하는 단백질, 및 Wnt 계열의 것과 동일한 작용을 갖는 저분자량 화합물), R-스폰딘 계열에 속하는 인자 (예를 들어, R-스폰딘 계열에 속하는 단백질 (R-스폰딘 1 내지 4 등), 및 R-스폰딘 계열의 것과 동일한 작용을 갖는 저분자량 화합물), 노린 및 GSK 저해제; 바람직하게는 R-스폰딘 계열에 속하는 인자 및/또는 GSK 저해제; 더욱 바람직하게는 R-스폰딘 계열에 속하는 단백질 및/또는 GSK 저해제가 포함된다.
Wnt 계열에 속하는 단백질은 특별히 제한되지 않는다. 이의 예에는, Wnt-1/Int-1, Wnt-2/Irp, Wnt-2b/13, Wnt-3/Int-4, Wnt-3a, Wnt-4, Wnt-5a, Wnt-5b, Wnt-6, Wnt-7a, Wnt-7b, Wnt-8a/8d, Wnt-8b, Wnt-9a/14, Wnt-9b/14b/15, Wnt-10a, Wnt-10b/12, Wnt-11 및 Wnt-16; 특히 Wnt-3a 가 포함된다.
GSK 저해제는, GSK-3β (글리코겐 합성효소 키나아제 (Glycogen Synthase Kinase) 3β) 를 저해하는 인자이면, 특별히 제한되지 않는다. 이의 예에는, CHIR99021, SB216763, SB415286, A1070722, BIO, BIO-아세톡심, 인디루빈-3'-옥심, NSC 693868, TC-G 24, TCS 2002, TWS 119, siRNA, 리튬 및 켄파울론; 바람직하게는 CHIR99021 이 포함된다.
R-스폰딘 계열에 속하는 단백질은 바람직하게는 R-스폰딘 1 이다. R-스폰딘 1 은 Wnt 조절인자의 RSPO (RSPO1-4) 계열에 속하며, Wnt/β-카테닌 신호 전달을 조절하는 분비된 단백질이다. 본 발명의 R-스폰딘 1 에는 광범위하게는, 이들이 본래의 활성을 가지고 있는 한, 자연 발생 R-스폰딘 1 변이체가 포함된다. R-스폰딘 1 은 시판용 제품일 수 있거나, 또는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.
배지는 EGF 계열에 속하는 인자, FGF 계열에 속하는 인자, R-스폰딘 계열에 속하는 인자 (예를 들어, 단백질 또는 R-스폰딘 계열의 것과 동일한 작용을 갖는 저분자량 화합물), 및 GSK 저해제 중 적어도 2 종을 함유한다. 배지는 EGF 계열에 속하는 인자, FGF 계열에 속하는 인자, R-스폰딘 계열에 속하는 인자 (예를 들어, 단백질 또는 R-스폰딘 계열의 것과 동일한 작용을 갖는 저분자량 화합물), 및 GSK 저해제 중 3 종 이상, 또는 4 종 이상을 함유할 수 있다.
배지 중 성분 (1) 의 농도는, 췌장 전구 세포가 증식될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 성분 (1) 의 농도는 바람직하게는 1 내지 1000 ng/mL, 더욱 바람직하게는 20 내지 100 ng/mL 이다. 나아가, 배지 중 성분 (2) 의 농도는, 췌장 전구 세포가 증식될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 성분 (2) 의 농도는 바람직하게는 10 내지 2000 ng/mL 또는 0.1 내지 50 μM, 더욱 바람직하게는 200 내지 1000 ng/mL 또는 1 내지 10 μM 이다. 배지가 GSK 저해제로서 CHIR99021 을 함유하는 경우, CHIR99021 의 농도는 바람직하게는 1 내지 20 μM, 더욱 바람직하게는 3 내지 10 μM 이다.
배지 중 상피 성장 인자의 농도는, 췌장 전구 세포가 증식될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 상피 성장 인자의 농도는 바람직하게는 1 내지 1000 ng/mL, 더욱 바람직하게는 20 내지 100 ng/mL 이다. 나아가, 배지 중 R-스폰딘-1 의 농도는, 췌장 전구 세포가 증식될 수 있는 한, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, R-스폰딘-1 의 농도는 바람직하게는 10 내지 2000 ng/mL, 더욱 바람직하게는 200 내지 1000 ng/mL 이다.
본 발명에 사용되는 배지는 바람직하게는 소닉 헤지호그 신호 저해제, TGF-β 수용체 저해제 및 레티노산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1 종을 추가로 함유한다.
소닉 헤지호그 신호 저해제는, 소닉 헤지호그 신호를 저해할 수 있는 인자이면, 특별히 제한되지 않는다. 특정예에는, SANT-1, 제르빈 (Jervine), 시클로파민-KAAD 등이 포함된다.
TGF-β 수용체 저해제는, TGF-β 수용체를 저해할 수 있는 인자이면, 특별히 제한되지 않는다. 특정예에는, LDN193189, D4476, LY2157299, LY364947, SB525334, SB431542, SD208 등이 포함된다. 나아가, 도소모르핀 (dorsomorphin) 및 노긴 (Noggin) 과 같은 BMP 신호 저해제가 또한, TGF-β 수용체 저해제 대신 사용될 수 있다. 장기 배양이 계대의 반복에 의해 수행되는 경우, TGF-β 수용체 저해제 및/또는 BMP 신호 저해제를 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.
전부 트랜스인 레티노산이 레티노산으로서 특히 바람직하게 사용된다.
나아가, 본 발명에 사용되는 배지는 ROCK (Rho-관련 이중나선 형성 키나아제/Rho-결합 키나아제 (Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho-binding kinase)) 저해제를 함유할 수 있다. ROCK 저해제는 계대 후 1 내지 2 일만 배지에 첨가되는 것이 바람직하다.
ROCK 저해제는, ROCK 의 기능을 저해할 수 있는 인자이면, 특별히 제한되지 않는다. 특정예에는, Y-27632, Fasudil (또는 HA1077), H-1152, Wf-536, Y-30141 등이 포함된다.
본 발명에 사용되는 배지는 혈청을 함유할 수 있거나, 무혈청일 수 있으며; 무혈청 배지가 바람직하다.
본 발명에 사용되는 배지는 혈청 대체물 (예를 들어, 알부민, 트랜스페린, 녹아웃 혈청 대체물 (Knockout Serum Replacement) (KSR), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 요소, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤 및 ITS-보충물) 을 추가로 함유할 수 있다. 혈청 대체물은 단독으로 또는 2 종 이상의 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 배지는 B27-보충물, N2-보충물, 지질, 포도당, 아미노산 (비(非)필수 아미노산 등), L-글루타민, Glutamax (Thermo Fisher Scientific), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항생제, 항산화제, 피루브산, 완충제, 무기 염 등 중 하나 이상의 물질을 추가로 함유할 수 있다.
본 발명에 사용되는 배지로서, 혈청과 같은 공지되지 않은 성분을 갖는 재료를 함유하지 않는 화학적으로 한정된 (chemically-defined) 배지를 사용하는 것이, 로트 간 배지의 차이를 감소시킬 수 있고, 안정한 품질을 갖는 췌장 전구 세포를 제조할 수 있기 때문에 바람직하다.
본 발명에 사용되는 배지의 pH 는 일반적으로 7.0 내지 7.8, 바람직하게는 7.2 내지 7.6 이다. 사용 전 오염을 방지하기 위해, 배지는 바람직하게는 여과, UV 조사, 가열 살균 또는 방사선 조사와 같은 방법에 의해 살균된다.
본 발명에 사용되는 배지는 용액 형태, 건조된 형태 또는 농축된 형태 (예를 들어, 2x 내지 1000x) 로 제조될 수 있다. 농축된 형태의 배지는 적절한 농도로 적절하게 희석된 후 사용될 수 있다. 건조된 형태 또는 농축된 형태의 배지를 희석시키는데 사용되는 액체는, 물, 완충액, 식염수 등으로부터 적절하게 선택된다.
본 발명의 췌장 전구 세포는 3 차원 배양된다. 본원에 언급된 3 차원 배양은, 단층 배양을 수행하는 2 차원 배양과 달리, 세로 방향으로 두께를 갖도록 배양을 수행하는 배양 방법이다. 상기와 같은 3 차원 배양을 수행함으로써 췌장 전구 세포를 효율적으로 증식시킬 수 있다. 3 차원 배양 방법으로서, 췌장 전구 세포가 증식될 수 있는 한, 공지된 방법이 비제한적으로 광범위하게 사용될 수 있다. 특히, 췌장 전구 세포의 세포 응집체를 사용하는 부유 배양이 바람직하다.
췌장 전구 세포의 세포 응집체를 형성하는 배양 방법이 하기 설명된다.
먼저, 췌장 전구 세포를 분산된 세포 (단일 세포 또는 수 개의 세포 덩어리) 로 해리시킨다. 분산된 세포로의 해리는 트립신 및 콜라게나아제와 같은 효소, 또는 EDTA 와 같은 킬레이트제를 사용하는 처리에 의해, 또는 피펫팅 (pipetting) 과 같은 기계적 조작에 의해 수행될 수 있다. 분산된 세포로 해리된 췌장 전구 세포를 배지 중에 현탁시키고, 바람직하게는 10 내지 10000 세포/웰, 더욱 바람직하게는 300 내지 3000 세포/웰의 세포 농도로 배양 용기에 씨딩 (seeding) 한다. 이어서, 세포를 일정 기간 (예를 들어, 12 내지 36 시간) 동안 이러한 상태로 정치시켜, 응집체를 형성한다. 응집체의 크기 (직경) 는 일반적으로 약 50 내지 500 ㎛, 바람직하게는 약 100 내지 200 ㎛ 이다. 응집체 당 세포의 수는 일반적으로 약 100 내지 5000 개, 바람직하게는 약 500 내지 2000 개이다.
췌장 전구 세포의 세포 응집체를 형성하는 배양 방법에서, 예를 들어 0.001 내지 10 ㎕/웰, 0.001 내지 1 ㎕/웰, 0.005 내지 0.5 ㎕/웰, 0.01 내지 0.5 ㎕/웰, 또는 0.01 내지 0.1 ㎕/웰 용량의 배양 웰을 갖는 배양 용기가 사용될 수 있다. 나아가, 세포가 바닥에 가라 앉아 응집체를 용이하게 형성할 수 있게 하는 형상을 갖는 배양 웰, 예를 들어 바닥쪽으로 팽창된 바닥 부분을 갖는 반구형 배양 웰, 또는 반구형 바닥 부분을 갖는 실린더형 배양 웰을 갖는 배양 용기를 사용하는 것이 바람직하다. 배양 용기의 배양 웰의 직경은, 예를 들어 200 내지 800 ㎛ 또는 400 내지 800 ㎛ 이다. 나아가, 상기와 같은 배양 웰의 깊이는, 예를 들어 400 내지 1000 ㎛ 또는 400 내지 800 ㎛ 이다. 상기 형상의 다수의 웰을 갖는 다중웰 배양 용기를 사용하여 다수의 췌장 전구 세포를 수득할 수 있다.
췌장 전구 세포의 세포 응집체 형성용 배양 용기로서, 비(非)부착 배양을 수행하기 위해, 배양 용기 표면은 세포 비부착 처리 (예를 들어, 세포 비부착 처리에 적용시킨 플라스틱 (예를 들어, 폴리스티렌) 으로 제조된 배양 용기) 에 적용될 수 있지만, 바람직하게는 비부착 상태로 세포의 배양을 가능하게 하는 재료로 제조된 것이다. 상기와 같은 재료는 바람직하게는 세포 독성이 없는 3 차원 구조를 갖는 친수성 재료, 더욱 바람직하게는 배양 상태의 관찰을 용이하게 하는 투명 재료이다. 나아가, 세포의 비부착 처리에 사용되는 친수성 폴리머를 포함하는 히드로겔이 또한 바람직하다.
히드로겔의 제조에 사용되는 재료의 예에는, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-2-히드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리-2-히드록시에틸 아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴산 및 폴리메타크릴산과 같은 합성 폴리머의 물리적 또는 화학적 가교 생성물; 방사선 조사에 의해 수득된 상기 합성 폴리머의 가교 생성물; 상기 폴리머를 구성하는 모노머의 코폴리머의 가교 생성물; 및 히드로겔을 형성할 수 있는 다른 각종 합성 폴리머 재료가 포함된다. 나아가, 또한 다당류 (예를 들어, 아가로오스, 알긴산, 덱스트란 및 셀룰로오스) 및 이의 유도체를 포함하는 천연 폴리머; 및 젤라틴 및 알부민과 같은 단백질, 및 이의 유도체의 가교 생성물을 사용할 수 있다. 이들 중에서, 아가로오스 겔이 히드로겔의 제조에 사용되는 재료로서 바람직하다.
세포가 비부착 상태로 배양될 수 있도록 처리하는데 사용되는 재료의 예에는, 상기 언급된 히드로겔의 제조에 사용되는 재료, 주 성분으로서 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린 (MPC) 을 포함하는 폴리머 재료 등이 포함된다.
본 발명의 배양 방법의 배양 조건은 일반적인 세포 배양을 위한 조건과 동일할 수 있다. 배양 온도는 바람직하게는 35 내지 39℃, 더욱 바람직하게는 37℃ 이다. O2 농도는 일반적으로 약 5 내지 20% 이다. CO2 농도는 일반적으로 약 1 내지 10%, 바람직하게는 약 5% 이다. 상기와 같은 배양은 공지된 CO2 인큐베이터를 사용하여 수행될 수 있다.
배양 시간은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 배양 시간은 바람직하게는 3 내지 10 일, 더욱 바람직하게는 5 내지 7 일이다. 나아가, 배양 동안 1 내지 3 일의 간격으로 배지를 교환하는 것이 바람직하다.
본 발명의 배양 방법은 바람직하게는 피더세포의 부재 하에서 수행된다. 본 발명의 배양 방법이 피더세포의 부재 하에서의 배양을 가능하게 하기 때문에, 공지되지 않은 성분이 혼합되지 않고, 균일한 특성을 갖는 췌장 전구 세포를 안정적으로 증식시킬 수 있다.
본 발명의 배양 방법은 도세포, 및 간 세포, 신경 세포 및 췌장 외분비 세포와 같은 다른 기능성 세포로 분화된 세포보다 높은 증식 능력으로 췌장 전구 세포를 효율적으로 증식시킬 수 있으며, 따라서 췌장 전구 세포의 정제에 적합하게 사용된다.
계대배양 (단계 B)
본 발명의 배양 방법의 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 단계 A 에서 수득된 췌장 전구 세포를 계대배양하는 단계를 추가로 포함한다.
계대배양은 상기 방법에 의해 배양된 췌장 전구 세포의 응집체를 수집하고, 응집체를 분산된 세포로 해리시키고, 분산된 세포를 새로운 배지에 씨딩하고, 이를 배양함으로써 수행될 수 있다. 분산된 세포로의 해리, 세포 씨딩, 배지, 배양 방법 등은, 상기 기재된 바와 동일하다.
계대 횟수는, 예를 들어 1 내지 10 회, 1 내지 5 회, 또는 2 또는 3 회이며; 바람직하게는 3 회 이상이다. 본 명세서에서, 제 1 배양은 0 번째 계대로 표시된다.
본 발명의 배양 방법에서, 췌장 전구 세포의 증식 능력은 심지어 계대배양될 때에도 유지되기 때문에; 다량의 췌장 전구 세포가 제조될 수 있다. 또한, 계대 횟수가 증가함에 따라, 췌장 전구 세포의 정제 또한 개선된다.
iPS 세포의 제조 단계 (단계 C)
본 발명의 배양 방법은 iPS 세포를 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
iPS 세포의 제조 방법의 예에는, 상기 "다능성 줄기 세포" 섹션에 기재된 방법이 포함된다. 이러한 단계에서 제조된 iPS 세포는 췌장 전구 세포로 분화될 수 있고, 췌장 전구 세포는 단계 A 의 배양에 사용될 수 있다.
본 발명에서, iPS 세포 이외의 다능성 줄기 세포가 사용되는 경우, iPS 세포 대신 다른 다능성 줄기 세포가 이러한 단계에서 제조될 수 있다.
췌장 전구 세포로의 분화 유도 단계 (단계 D)
본 발명의 배양 방법은 다능성 줄기 세포를 췌장 전구 세포로 분화 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이러한 단계에서 분화된 췌장 전구 세포는 단계 A 의 배양에 사용될 수 있다.
다능성 줄기 세포를 췌장 전구 세포로 분화시키는 단계에서, 배양액의 조성은 생체내 췌장 발달 과정을 모방하도록 시간에 따라 변화될 수 있다. 나아가, 분화 유도 단계는 상기 기재된 세포 응집체를 사용하는 부유 배양 또는 부착 배양에 의해 수행될 수 있다.
상기와 같은 방법으로서, 예를 들어 하기 문헌에 개시된 방법, 및 이들 방법의 적절하게 변형된 버전이 사용될 수 있다. 참고 문헌 2 에 개시된 방법에 따라, 단계 1 내지 4 를 수행하여 다능성 줄기 세포를 췌장 전구 세포로 분화시킬 수 있다.
참고 문헌 1: Rezania A, Bruin JE, Riedel MJ, Mojibian M, Asadi A, Xu J, Gauvin R, Narayan K, Karanu F, O'Neil JJ, Ao Z, Warnock GL, Kieffer TJ. Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice. Diabetes 2012; 61: 2016-2029.
참고 문헌 2: Rezania A, Bruin JE, Arora P, Rubin A, Batushansky I, Asadi A, O'Dwyer S, Quiskamp N, Mojibian M, Albrecht T, Yang YH, Johnson JD, Kieffer TJ. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol 2014; 32: 1121-1133.
참고 문헌 3 : Hrvatin S, O'Donnell CW, Deng F, Millman JR, Pagliuca FW, DiIorio P, Rezania A, Gifford DK, Melton DA. Differentiated human stem cells resemble fetal, not adult, β cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014; 111: 3038-3043.
참고 문헌 4: Pagliuca FW, Millman JR, Gurtler M, Segel M, Van Dervort A, Ryu JH, Peterson QP, Greiner D, Melton DA. Generation of functional human pancreatic β cells in vitro. Cell. 2014; 159: 428-439.
예를 들어, 초기 단계에서 액티빈 (Activin) A 및 Wnt3a 를 첨가하는 것이 바람직하고, 또한 후속으로 레티노산 및 헤지호그 신호 저해제 (예를 들어, SANT-1 및 시클로파민-KAAD), 섬유아세포 성장 인자 등을 첨가하는 것이 바람직하다.
나아가, 분화 과정에서, 췌장 전구 세포를 수득하기 위하여 생체내 췌장 발달의 과정을 모방하기 위해, 미분화된 특성을 유지하고 증식을 촉진시키는 물질, 증식을 억제하고 분화를 촉진시키는 물질, 생체내 췌장에서 발현되는 단백질 등이, 적절한 시점에서 첨가될 수 있다. 상기와 같은 물질의 예에는, GSK-3β (글리코겐 합성효소 키나아제 3β) 저해제 (예를 들어, CHIR99021), ALK 저해제 (예를 들어, SB431542), 노치 (Notch) 신호 저해제 (예를 들어, DAPT), TGFβ 저해제 (예를 들어, LDN193189), AMPK 및 BMP 신호 저해제 (예를 들어, 도소모르핀), PKC 활성화제 (예를 들어, Pdbu), 인슐린-유사 성장 인자-1, 상피 성장 인자, 간세포 성장 인자, 글루카곤-유사 펩타이드-1, 상업적으로 입수 가능한 보충물 등이 포함된다.
도세포로의 분화 유도 단계 (단계 E)
본 발명에 따른 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포로부터의 도세포의 제조 방법은, 상기 방법에 의해 배양된 췌장 전구 세포를 도세포로 분화 유도하는 단계를 포함한다.
췌장 전구 세포를 도세포로 분화시키는 단계에서, 배양액의 조성은 생체내 췌장 발달 과정을 모방하도록 시간에 따라 변화될 수 있다. 분화 유도 단계는 상기 기재된 세포 응집체를 사용하는 부유 배양에 의해 수행될 수 있다.
상기와 같은 방법으로서, 예를 들어 상기 언급된 참고 문헌 1 내지 4 에 개시된 방법, 및 이들 방법의 적절하게 변형된 버전이 사용될 수 있다. 참고 문헌 2 에 개시된 방법에 따라, 단계 5 내지 7 을 수행하여 췌장 전구 세포를 도세포로 분화시킬 수 있다.
췌장 전구 세포의 동결 단계 (단계 F)
본 발명에 따른 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 동결보존 방법은, 상기 방법에 의해 배양된 췌장 전구 세포를 동결하는 단계를 포함한다.
췌장 전구 세포로서, 상기 배양 방법에 의해 배양된 세포, 및 추가로 계대배양된 세포 모두 사용될 수 있다. 나아가, 동결보존하고자 하는 췌장 전구 세포를 분산된 세포로 해리시키는 것이 바람직하다. 췌장 전구 세포를 분산된 세포로 해리시키는 방법은 상기 기재된 바와 동일하다.
동결보존액은 특별히 제한되지 않는다. 이의 예에는, 상업적으로 입수 가능한 동결보존액 (예를 들어, CELLBANKER (등록 상표) 2 (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), STEM-CELLBANKER (등록 상표) (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.), 및 StemSure (등록 상표) 동결 배지 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)), 약 5 내지 20 부피% 의 디메틸술폭시드가 첨가된 배양 배지 (예를 들어, 상기 배양 방법에서 사용된 배지) 등이 포함된다.
동결보존은 일반적으로 약 -70 내지 -196℃ 에서, 바람직하게는 -100℃ 이하에서 동결시킴으로써 수행될 수 있다. 장기 저장의 경우, 저장은 액체 질소 세포 저장 용기에서, 액체 질소 중에서 또는 액체 질소 위 증기 상에서 수행될 수 있다.
동결보존된 세포는 일반적으로 약 20 내지 40℃, 바람직하게는 약 35 내지 38℃ 의 수조에서 신속하게 가온시킴으로써 해동될 수 있다.
본 발명의 배양 방법에 의해 증식시킨 췌장 전구 세포는, 동결보존 후, 동결보존 전과 동등한 증식 능력을 유지한다. 따라서, 이러한 기술은 췌장 전구 세포의 세포 은행에 적용될 수 있을 것으로 예상된다.
실시예
본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위해 하기에 실시예가 제공된다. 하지만, 본 발명이 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예에서, iPS 세포주의 명칭이 제시되지 않는 경우, 253G1 주를 사용한 실험 결과가 제시된 것이다.
아가로오스 마이크로웰 (microwell) 의 제조
아가로오스 마이크로웰을 제조업자에 의해 제공된 프로토콜 (http://www.funakoshi.co.jp/contents/5556) 을 참조로, 3D 페트리 디쉬 (Petri Dish) (Microtissues, Inc. 사제) 를 사용하여 제조하였다. 직경 400 ㎛ 의 웰을 갖는 256-웰/겔-플레이트용 몰드를 사용하였다. 특히, 아가로오스 마이크로웰을 하기 절차에 따라 제조하였다.
먼저, 가온시킨 아가로오스 용액 (Lonza 사의 아가로오스, 2.5% 아가로오스/생리 식염수) 를 몰드에 부었다. 다음으로, 몰드를 실온까지 냉각시키고, 아가로오스의 겔화 후, 아가로오스 마이크로웰을 몰드에서 제거하였다. 아가로오스 마이크로웰을 세포 배양용 12-웰 폴리스티렌 플레이트로 옮기고, 배지 (DMEM/F12) 를 아가로오스 마이크로웰의 부근에 첨가하여, 아가로오스 마이크로웰 플레이트를 배지에 침지시켰다. 플레이트를 인큐베이터 (37℃, 5% CO2) 에 1 일 이상 동안 위치시켜, 아가로오스 마이크로웰 플레이트를 그 부근의 배지와 평형화시켰다. 따라서, 각각 실린더 부분 (직경: 400 ㎛) 및 반구형 바닥을 갖는, 256 개의 웰을 갖는 아가로오스 마이크로웰을 수득하였다. 상기 작업을 무균 조건 하 클린 벤치에서 수행하였다.
응집체의 형성, 및 췌장 전구 세포로의 분화 유도
iPS 세포 (253G1, Riken Cell Bank 사에서 입수함) 를 Geltrex (Thermo Fisher Scientific) 로 코팅된 배양 용기를 사용하여, 3 내지 4 일 동안 E8 배지 (Thermo Fisher Scientific) 에서 배양하였다. TrypLE (Thermo Fisher Scientific) 를 70 내지 80% 컨플루언트 (confluent) 조건 하에서 처리한 후, 세포를 단일 세포로 수집하였다. 세포를 10 μM Y-27632 (ROCK 저해제, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 를 함유하는 E8 배지에 현탁시키고, 상기 기재된 바와 같이 제조하고 12-웰 폴리스티렌 플레이트 중 하나의 웰에 배치한, 256-웰 아가로오스 마이크로웰 플레이트에 평균 2500 세포/웰로 씨딩하였다.
아가로오스 마이크로웰 플레이트를 10 분 동안 정치시켜 세포를 바닥에 침전시킨 후, 배지 (E8 배지 + ROCK 저해제) 를 아가로오스 마이크로웰 플레이트 부근에 첨가하여 플레이트를 배지에 침지시켰다. 세포를 37℃ 에서 5% CO2 로 24 시간 동안 (5% CO2, 37℃) 배양하여, 세포를 응집시킨 후, 일정 기간 동안 배양하여 분화를 유도하였다. 특히, 하기 기재되는 바와 같이, 배지를 매일 빼내고 새로운 배지를 첨가하는 방식으로, 배지 교체를 수행하였다. 또한, 배지 조성을 소정의 날에 변화시켰다. 배지 조성 및 각각의 배지에서의 배양 일수를 [A Rezania et al. Reversal of diabetes with insulin producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2014 Nov; 32 (11): 1121-33] 의 설명에 따라 결정하였다.
제 1 단계 (3 일)
MCDB131 (Thermo Fisher Scientific) + 1.5 g/L NaHCO3 (Nacalai Tesque, Inc.) + 0.5% 무지방 BSA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 2 mM GlutaMax (Thermo Fisher Scientific) + 10 mM D-포도당 (Nacalai Tesque, Inc.) + 3 μM CHIR99021 (Tocris Bioscience) + 100 ng/mL 액티빈 A (R&D Systems) (CHIR99021 은 제 1 일차에만 배지에 첨가함).
제 2 단계 (2 일)
MCDB131 + 1.5 g/L NaHCO3 + 0.5% 무지방 BSA + 2 mM GlutaMax + 10 mM D-포도당 + 50 ng/mL 섬유아세포 성장 인자 7 (FGF-7, PeproTech) + 0.25 mM 아스코르브산 (Sigma-Aldrich)
제 3 단계 (2 일)
MCDB131 + 1.5 g/L NaHCO3 + 0.5% 무지방 소 혈청 알부민 (무지방 BSA) + 1/200 ITS 보충물 (Thermo Fisher Scientific) + 2 mM GlutaMax + 20 mM D-포도당 + 50 ng/mL FGF-7 + 0.25 μM SANT-1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 0.1 μM LDN193189 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 1 μM 레티노산 (Sigma-Aldrich) + 0.2 μM TBP (PKC 활성화제; Catalog No. 565740; EMD Chemicals Inc.) + 0.25 mM 아스코르브산
제 4 단계 (2 일)
MCDB131 + 1.5 g/L NaHCO3 + 0.5% 무지방 BSA + 1/200 ITS 보충물 + 2 mM GlutaMax + 20 mM D-포도당 + 50 ng/mL FGF-7 + 0.25 μM SANT-1 + 0.2 μM LDN193189 + 0.1 μM 레티노산 + 0.1 μM TBP + 0.25 mM 아스코르브산
TBP: (2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(트리플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타디에노일아미노)벤조락탐
도 1 은 상기 제 1 내지 제 4 단계의 배양에 의해 수득된, 세포의 유동 세포 계측법의 결과를 나타낸다. 도 1 에서, SOX9 는 췌장 전구 세포 마커이고, BrdU 는 세포 증식 마커 (세포의 핵을 증식 능력으로 표시하기 위한 핵산 유사체) 이고, PDX1 은 췌장 전구 세포 및 도세포 마커이다. BrdU 를 배양액에 첨가하고, 24 시간 동안 배양한 후, 염색 및 유동 세포 계측법을 수행하였다. 염소 항-PDX1 항체 (R&D Systems), 토끼 항-SOX9 항체 (Merck Millipore) 및 마우스 항-BrdU 항체 (Dako) 를 1차 항체로서 사용하였다. FITC-표지된 항-마우스 IgG 항체 (Thermo Fisher Scientific), PE-표지된 항-염소 IgG 항체 (Thermo Fisher Scientific), FITC-표지된 항-토끼 IgG 항체 (BD Biosciences) 및 PE-표지된 항-마우스 IgG 항체 (BD Biosciences) 를 2차 항체로서 사용하였다. 측정을 위해, Guava (등록 상표) easyCyte (Merck Millipore) 를 사용하였다.
도 1 은, PDX1-양성 췌장 세포로 분화된 세포 약 60% 및 증식 중인 SOX9/BrdU-양성 췌장 전구 세포 약 30% 를 함유하고 있음을 나타낸다. 결과적으로, 비(非)균질한 세포군을 수득하였다. 미분화된 세포, 췌장 전구 세포 (SOX9- 및 PDX1-양성, 및 NKX6.1-음성 세포) 및 내분비 세포로 성숙된 세포가 함유되어 있다고 추정되었다.
췌장 전구 세포의 증폭
상기 제 1 내지 제 4 단계의 배양에 의해 수득된 세포 응집체를, 세포 분산 효소 용액 TrypLE (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 단일 세포로 분산시켰다. 세포를 10 μM Y-27632 (ROCK 저해제, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 를 함유하는 하기 배지에 현탁시키고, 12-웰 플레이트 중 하나의 웰에 배치한 256-웰 아가로오스 마이크로웰 플레이트에 1000 세포/웰 (1000 x 256 = 2.56 x 105/플레이트) 로 씨딩하였다. 아가로오스 마이크로웰 플레이트를 10 분 동안 정치시켜 세포를 바닥에 침전시킨 후, 하기 배지를 아가로오스 마이크로웰 플레이트 부근에 첨가하여 플레이트를 배지에 침지시켰다. 그 후, 37℃ 에서 5% CO2 로 6 일 동안 배양하였다. 배지 교체를 격일로 수행하였다.
MCDB131 + 1.5 g/L NaHCO3 + 0.5% 무지방 BSA + 1/200 ITS 보충물 + 2 mM GlutaMax + 20 mM D-포도당 + 50 ng/mL 상피 성장 인자 (EGF, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 200 ng/mL R-스폰딘 1 (RSPD1, R&D Systems) + 0.25 μM SANT-1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 0.2 μM LDN193189 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 0.1 μM 레티노산 (Sigma-Aldrich)
도 2 내지 4 에 결과를 나타낸다. 도 3 에서, 세포를 6 일 후에 한번 계대하였다. 도 4 에서, BrdU 를 배양액에 첨가하고, 24 시간 동안 배양한 후, 염색 및 유동 세포 계측법을 수행하였다. 24-시간 배양 동안 증식시킨 세포를 BrdU 로 표지하였다. 도 4 에서, SOX9 는 췌장 전구 세포 마커이다. 도 2 및 3 은, R-스폰딘 1 및 EGF 가 동시 첨가되는 경우에 세포가 잘 증식되었음을 나타낸다. 나아가, 도 4 는, R-스폰딘 1 및 EGF 가 동시 첨가되는 경우에 SOX9/BrdU-양성 세포의 비가 가장 높았음을 나타낸다. SOX9- 및 PDX1-양성 췌장 전구 세포의 비율은 배양 전 비율과 비교하여 (26.3% 에서 57.5% 로) 증가하였고, 췌장 전구 세포로의 스크리닝이 진행되었다.
상기 제 1 내지 제 4 단계의 배양에 의해 수득된 세포를 Geltrex 로 코팅된 6-웰 플레이트 상에 20000 또는 40000 세포/cm2 의 밀도로 플레이트 기재에 부착시키고, 상기 기재된 "췌장 전구 세포의 증폭" 에서와 동일한 배양 방법으로 부착 배양하였다. 세포를 37℃ 에서 5% CO2 로 12 일 동안 배양하였다. 세포를 배양 6 일 후에 계대하였다. 배지 교체를 격일로 수행하였다. 도 5 에 결과를 나타낸다. 도 5 는, 부착 배양이 수행되었던 경우, 다수의 세포가 외분비 세포로 분화되었고 (데이터는 제시되지 않음), 세포의 증식 능력이 계대를 반복하는 중간에 감소되었으며, 세포의 수가 감소하는 경향을 취하였음을 나타낸다.
췌장 전구 세포의 정제
세포 응집체를 아가로오스 마이크로웰 플레이트로부터 6 일 간격으로 수집하고, 단일 세포로 분산시키고, 새로운 아가로오스 마이크로웰 플레이트에 씨딩하였다. 세포 분산 방법, 배지 조성 및 배양 조건은 상기 "췌장 전구 세포의 증폭" 에서와 동일하였다.
도 6 은, 각각의 계대에서 SOX9- 및 BrdU-양성 세포의 비를 측정한 결과를 나타낸다. 도 6 에서, P 는 계대 횟수를 의미한다. 도 6 은, SOX9/BrdU-양성 세포의 비가 계대가 반복됨에 따라 증가하였으며, 1 회 계대 후 60% 까지 증가하였음을 나타낸다. 도 7 및 8 은, 각각의 계대에서 SOX9- 및 PDX1-양성 세포의 비를 측정한 결과를 나타낸다. SOX9 및 PDX1 에 대하여 양성인 췌장 전구 세포의 비는 계대가 반복됨에 따라 증가하였으며, 3 회 계대 후 90% 까지 증가하였다. 이러한 결과는, 성숙 세포보다 높은 증식 능력을 갖는 전구 세포의 순도가 증가하였다는 것을 시사한다.
췌장 전구 세포의 장기 배양
세포 응집체를 아가로오스 마이크로웰 플레이트로부터 6 일 간격으로 수집하고, SOX9- 및 PDX1-양성 췌장 전구 세포를 포함하는 단일 세포로 분산시킨 후, 새로운 아가로오스 마이크로웰 플레이트에 씨딩하였다. 세포 분산 방법, 배지 조성 및 배양 조건은 상기 "췌장 전구 세포의 증폭" 에서와 동일하였다.
도 9 내지 12 에 결과를 나타낸다. 도 9 의 좌측 도면은 아가로오스 마이크로웰 상에 배양된 세포 응집체의 위상차 현미경 이미지를 나타내며, 우측 도면은 아가로오스 마이크로웰 플레이트에서 취한 세포 응집체의 위상차 현미경 이미지를 나타낸다. 도 11 및 12 에서, BrdU 는 세포 증식 마커이고, PDX1 은 췌장 전구 세포 및 도세포 마커이고, SOX9 는 췌장 전구 세포 마커이고, C-펩타이드는 β-세포 마커이고, NKX6.1 은 내분비 세포 마커이다. 각종 세포를 함유하는 세포군에서, 응집체는 왜곡된 형상을 갖지만; 도 9 는 수득된 세포 응집체가 구형과 유사한 형상을 갖기 때문에, 응집체 중 세포가 균일한 췌장 전구 세포라고 추정된다. 도 10 은, 세포 증식 능력의 감소 없이 장기간 동안 (48 일) 증폭시킬 수 있으며, 각각의 계대 동안, 즉 6 일 배양 동안 세포의 수가 3 배 증가하였음을 나타낸다. 도 11 및 12 는, 장기간 동안 증폭된 세포가 췌장 전구 마커 SOX9 및 PDX1 에 대하여 양성이었음을 나타낸다. 나아가, BrdU 를 배양액에 첨가하고, 24 시간 동안 배양한 후, 염색하였을 때, 증식 중인 다수의 BrdU-양성 세포를 관찰하였다. 하지만, β-세포 마커로서 C-펩타이드에 대하여 양성이고, 내분비 세포 마커로서 NKX6.1 에 대하여 양성인, 점진적인 성숙을 갖는 세포는 단지 몇 개 뿐이었다.
내분비 세포로의 성숙
6 회 계대 동안 증폭 및 배양된 췌장 전구 세포를, 상기 "췌장 전구 세포의 증폭" 에서와 동일한 방식으로 아가로오스 웰 플레이트에 씨딩하였다. 씨딩 밀도는 3000 세포/웰이었다. 세포를 하기 제 1 내지 제 3 단계에 제시된 절차로, 내분비 세포로 성숙시켰다. 특히, 배지 조성을 하기 기재되는 바와 같이 시간에 따라 변화시켰다. 배지를 격일로 빼내고, 새로운 배지로 대체하였다. 또한, 배지 조성을 소정의 날에 변화시켰다. 배지 조성 및 각각의 배지에서의 배양 일수를 [A Rezania et al. Reversal of diabetes with insulin producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 2014 Nov; 32 (11): 1121-33] 의 설명에 따라 결정하였다.
제 1 단계 (3 일)
MCDB131 + 1.5 g/L NaHCO3 + 0.5% 무지방 BSA + 1/200 ITS 보충물 + 2 mM GlutaMax + 20 mM D-포도당 + 0.25 μM SANT-1 + 0.2 μM LDN193189 + 0.05 μM 레티노산 + 1 μM T3 (갑상선 호르몬, 트리요오도티로닌, Sigma-Aldrich) + 10 μM Alk5i II (액티빈 수용체-유사 키나아제 수용체 5 저해제 II, Enzo Life Sciences, Inc.) + 10 ㎍/mL 헤파린 (Nacalai Tesque, Inc.) + 10 μM 황산아연 (Sigma-Aldrich)
제 2 단계 (7 일)
MCDB131 + 1.5 g/L NaHCO3 + 0.5% 무지방 BSA + 1/200 ITS 보충물 + 2 mM GlutaMax + 20 mM D-포도당 + 0.2 μM LDN193189 + 1 μM T3 + 10 μM Alk5i II + 10 ㎍/mL 헤파린 + 10 μM 황산아연 + 0.1 μM GSi XX (감마-세크레타아제 (gamma-secretase) 저해제 XX, Merck Millipore)
제 3 단계 (7 내지 14 일)
MCDB131 + 1.5 g/L NaHCO3 + 0.5% 무지방 BSA + 1/200 ITS 보충물 + 2 mM GlutaMax + 20 mM D-포도당 + 1 μM T3 + 10 μM Alk5i II + 10 ㎍/mL 헤파린 + 10 μM 황산아연 + 1 mM N-Cys (N-아세틸시스테인, Sigma-Aldrich) + 2 μM R428 (Axl 저해제, Selleckchem) + 10 μM Trolox (Merck Millipore)
분화 유도 효율을 조사하기 위하여, 도세포로 분화된 세포 응집체 중 C-펩타이드-양성 췌장 β-세포를 조사하였다. 도 13 에 결과를 나타낸다. 도 13 에서, NKX6.1 은 내분비 세포 마커이고, C-펩타이드는 β-세포 마커이다. 도 13 은, 6 회 계대 동안 증폭 및 배양된 췌장 전구 세포를 사용하였던 경우, 세포가 증폭 없이, 췌장 전구 세포와 동등한 비로 C-펩타이드/NKX6.1-양성 β 세포로 분화되었음을 나타낸다.
포도당 부하 시험을 도세포로 분화된 세포 응집체에 대하여 수행하였다. 특히, 응집체를 2.5 mM, 22.5 mM, 2.5 mM 및 22.5 mM 포도당을 함유하는 크렙스 링거액 (Krebs Ringer's solution) 에 30 분 동안 침지시키고, 크렙스 링거액으로 분비된 C-펩타이드를 ELISA (효소 결합 면역흡착 검정 (enzyme-linked immunosorbent assay)) 방법으로 정량화하였다. 도 14 에 결과를 나타낸다. 도 14 는, 췌장 전구 세포로부터 성숙된 세포에서, C-펩타이드 분비량이 포도당 농도에 따라 가변적이라는 것을 보여준다. 결과적으로, 증폭된 췌장 전구 세포는 β-세포를 포함하는 췌장 내분비 세포로 분화되고, 포도당 농도에 따라 인슐린 분비량을 변화시키는 능력이 있음이 나타났다.
도 15 에 도세포로 분화된 세포 응집체를 면역염색한 결과를 나타낸다. 도 15 에서, 글루카곤은 α-세포 마커이고, 소마토스타틴은 δ-세포 마커이고, 인슐린은 β-세포 마커이다. 도 15 는, 도세포로 분화된 세포 응집체가 또한 글루카곤-양성 α-세포 및 소마토스타틴-양성 δ-세포를 포함하고 있었음을 나타낸다.
췌장 전구 세포의 동결보존
- 동결
상기 "췌장 전구 세포의 증폭" 에서와 동일한 방식으로 5 회 계대 후, 췌장 전구 세포를 단일 세포로 분산시켰다. 세포를 상업적으로 입수 가능한 동결보존액 (CELLBANKER 2 (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.) 또는 STEM-CELLBANKER (Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd.)) 또는 증식에 사용된 배양액에 10% 디메틸술폭시드를 첨가하여 수득한 용액을 사용하여, 완만-동결 방법으로 동결시켰다. 특히, 5 x 105 개의 세포를 500 ㎕ 의 동결보존액에 현탁시키고, 동결용 바이알에 주입하였다. 바이알을 동결 용기 (Bicell, Nihon Freezer Co., Ltd.) 에 위치시키고, -80℃ 에서 밤새 저장하였다. 장기 저장의 경우, 바이알을 액체 질소 탱크로 옮기고, 거기서 저장하였다.
- 해동 방법
-80℃ 에서 1 일 동안 및 액체 질소 저장 탱크에서 6 시간 동안 저장한 동결용 바이알을, 37℃ 의 수조에서 가온시켜 신속하게 해동하였다. 해동된 세포 현탁액을 10 mL 의 배양액 (MCDB131 + 1.5 g/L NaHCO3 + 0.5% 무지방 BSA + 1/200 ITS 보충물 + 2 mM GlutaMax + 20 mM D-포도당) 에 첨가하였다. 상청액을 원심분리에 의해 제거한 후, 세포를 10 μM Y-27632 를 함유하는 배지 (MCDB131 + 1.5 g/L NaHCO3 + 0.5% 무지방 BSA + 1/200 ITS 보충물 + 2 mM GlutaMax + 20 mM D-포도당 + 50 ng/mL EGF + 200 ng/mL R-스폰딘 1 + 0.25 μM SANT-1 + 0.2 μM LDN193189 + 0.1 μM 레티노산 + 10 μM Y-27632) 에 현탁시켰다. 트리판 블루 (trypan blue) 염색약을 첨가하고, 해동 후 세포 생존율을 계산하였다.
도 16 에 결과를 나타낸다. 도 16 에서, CB2 는 동결보존액으로서 CELLBANKER 2 를 사용한 결과를 나타내고, SCB 는 동결보존액으로서 STEM-CELLBANKER 을 사용한 결과를 나타내고, DMSO 는 동결보존액으로서 배지 + 10% DMSO (자체 제작 동결보존액) 을 사용한 결과를 나타낸다. 도 16 은, 어떠한 동결보존액을 사용하였던 경우에도, 생존율이 70 내지 80% 였음을 나타낸다.
나아가, 도 17 은, 해동 후 세포를 상기 "췌장 전구 세포의 증폭" 에서와 동일한 방식으로, 6 일 간격으로 3 차원 배양에 의해 계대했을 때의 세포의 수의 변화를 나타낸다. 도 17 은 CELLBANKER 2 를 사용하여 동결보존된 세포의 결과를 나타낸다. 도 17 에 제시된 결과는, 동결보존된 세포가 동결보존되지 않은 세포와 동등한 증식 능력을 가짐을 명백하게 나타낸다.
다른 iPS 세포주 유래의 췌장 전구 세포로의 분화 유도
454E2 주 (Riken Cell Bank 에서 입수함), RPChiPS771-2 주 (ReproCELL, Inc.) 및 P11025 주 (Takara Bio, Inc.) 를 인간 유래 iPS 세포로서 사용하였다.
454E2 주를 Geltrex (Thermo Fisher Scientific) 로 코팅된 배양 용기를 사용하여 E8 배지 (Thermo Fisher Scientific) 에서 3 내지 4 일 동안 배양하였다. TrypLE (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 70 내지 80% 컨플루언트 조건 하에서 처리한 후, 세포를 단일 세포로 수집하였다. 세포를 10 μM Y-27632 (ROCK 저해제, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 를 함유하는 E8 배지에 현탁시키고, Geltrex (Thermo Fisher Scientific) 로 코팅된 배양 용기에 1.2 내지 1.5 x 105 세포/cm2 로 씨딩하였다. 454E2 주를 부착 배양하여, 췌장 전구 세포로 분화 유도하였다. 제 4 단계의 배양을 3 일 동안 수행한 것을 제외하고는, 상기 기재된 바와 동일한 배양 기간 동안 동일한 배양액을 사용하여 분화 유도를 수행하였다.
771-2 주를 Geltrex (Thermo Fisher Scientific) 로 코팅된 배양 용기를 사용하여 StemFit AK02N 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) 에서 3 내지 4 일 동안 배양하였다. TrypLE (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 처리한 후, 세포를 단일 세포로 수집하였다. 이어서, 세포를 10 μM Y-27632 (ROCK 저해제, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 를 함유하는 StemFit AK02 배지 (Ajinomoto Co., Inc.) 에 현탁시키고, Geltrex (Thermo Fisher Scientific) 로 코팅된 배양 용기에 1.2 내지 1.5 x 105 세포/cm2 로 씨딩하였다. 771-2 주를 부착 배양하여, 췌장 전구 세포로 분화 유도하였다. 제 4 단계의 배양을 3 일 동안 수행한 것을 제외하고는, 상기 기재된 바와 동일한 배양 기간 동안 동일한 배양액을 사용하여 분화 유도를 수행하였다.
P11025 주를 DEF-CS Culture System (Takara Bio, Inc.) 을 사용하여 3 내지 4 일 동안 배양하였다. TrypLE (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 처리한 후, 세포를 단일 세포로 수집하였다. 이어서, 세포를 10 μM Y-27632 (ROCK 저해제, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 를 함유하는 DEF-CS 배지 (Takara Bio, Inc.) 에 현탁시키고, DEF-CS Coat (Takara Bio, Inc.) 로 코팅된 배양 용기에 1.2 내지 1.5 x 105 세포/cm2 로 씨딩하였다. P11025 주를 부착 배양하여, 췌장 전구 세포로 분화 유도하였다. 제 4 단계의 배양을 3 일 동안 수행한 것을 제외하고는, 상기 기재된 바와 동일한 배양 기간 동안 동일한 배양액을 사용하여 분화 유도를 수행하였다.
다른 iPS 세포주 유래의 췌장 전구 세포의 증폭
상기 수득된 췌장 전구 세포를 253G1 주에서와 같이, 세포 분산 효소 용액 TrypLE (Thermo Fisher Scientific) 를 사용하여 단일 세포로 분산시켰다. 세포를 10 μM Y-27632 (ROCK 저해제, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 를 함유하는 하기 배지에 현탁시키고, 12-웰 플레이트 중 하나의 웰에 배치한 256-웰 아가로오스 마이크로웰 플레이트에 1000 세포/웰 (1000 x 256 = 2.56 x 105/플레이트) 로 씨딩하였다. 아가로오스 마이크로웰 플레이트를 10 분 동안 정치시켜 세포를 바닥에 침전시킨 후, 하기 배지를 아가로오스 마이크로웰 플레이트 부근에 첨가하여 플레이트를 배지에 침지시켰다. 그 후, 37℃ 에서 5% CO2 로 4 일 동안 배양하였다. 배지 교체를 격일로 수행하였다. 또한, 4 가지 인자 (EGF + RSPD1 + FGF-7 + CHIR99021) 를 함유하는 배지 대신, 3 가지 인자 (EGF + RSPD1 + CHIR99021 또는 EGF + RSPD1 + FGF-7) 또는 2 가지 인자 (FGF-7 + CHIR99021) 를 함유하는 배지를 사용하여 배양을 수행하였다.
MCDB131 + 1.5 g/L NaHCO3 + 0.5% 무지방 BSA + 1/200 ITS 보충물 + 2 mM GlutaMax + 20 mM D-포도당 + 50 ng/mL 상피 성장 인자 (EGF, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 200 ng/mL R-스폰딘 1 (RSPD1, R&D Systems) + 0.25 μM SANT-1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 0.2 μM LDN193189 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) + 0.1 μM 레티노산 (Sigma-Aldrich) + 4.5 μM CHIR99021 (Tocris Bioscience) + 50 ng/mL 섬유아세포 성장 인자 7 (FGF-7, PeproTech)
도 18 내지 21 에 결과를 나타낸다. 도 18 은, 4 가지 인자 (EGF + RSPD1 + FGF-7 + CHIR99021) 를 첨가하였던 경우 (8 일 동안 배양함), 771-2 주 유래의 췌장 전구 세포 수의 변화를 나타낸다. 4 가지 인자의 첨가로 인해, 771-2 주 유래의 췌장 전구 세포는 4 일 동안의 배양에 의해 약 2 배 증식되었다. 나아가, 도 19 는, 3 개의 세포주에서, 4 가지 인자를 첨가하였던 경우, 약 70% 의 세포가 췌장 세포 마커 PDX1 및 세포 분열 마커 Ki67 에 대하여 양성이었음을 나타낸다. 도 20 및 21 은, 2 내지 4 가지 인자를 첨가한 결과를 나타낸다. 이러한 결과는, 3 가지 인자 (EGF + RSPD1 + CHIR99021 또는 EGF + RSPD1 + FGF-7) 를 첨가하였던 경우, 및 2 가지 인자 (FGF-7 + CHIR99021) 를 첨가하였던 경우에 세포가 약 2 배로 증식되었고; 50% 이상의 세포가 PDX1 및 Ki67 에 대하여 양성이었으며; 췌장 전구 세포를 증식시킬 수 있었음을 입증한다.
P11025 주 유래의 췌장 전구 세포를 4 가지 인자 (EGF + RSPD1 + FGF-7 + CHIR99021) 를 첨가한 성장 배지에서 2 회 계대한 후, 세포를 내분비 세포로 성숙시켰다. 성숙 배양 방법은 253G1 주 유래의 췌장 전구 세포에 대한 것과 동일하였다. 분화된 세포의 면역염색 결과, 도세포로 분화된 세포 응집체는 인슐린-양성 β-세포, 글루카곤-양성 α-세포 및 소마토스타틴-양성 δ-세포를 함유하고 있었다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허 공보, 특허 및 특허 출원은, 본 명세서에 그대로 참조로서 인용된다.

Claims (15)

  1. 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포를, (1) 상피 성장 인자 (EGF) 계열에 속하는 인자, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 계열에 속하는 인자, 또는 양자 모두 및 (2) Wnt 아고니스트를 함유하는 배지에서 3 차원 배양하는 단계 (A) 를 포함하는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법으로서,
    3 차원 배양이 췌장 전구 세포의 응집체의 부유 배양이고,
    Wnt 아고니스트가 R-스폰딘 (R-spondin) 계열에 속하는 단백질 및 GSK 저해제 양자 모두인, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 배지가 무혈청 (serum-free) 배지인, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 배양이 피더세포 (feeder cell) 부재 하에서의 배양인, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 iPS 세포 또는 ES 세포인, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 인간 유래인, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 단계 (A) 에서 수득된 췌장 전구 세포를 계대배양하는 단계 (B) 를 추가로 포함하는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 췌장 전구 세포의 정제에 사용하기 위한, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, iPS 세포를 제조하는 단계 (C) 를 추가로 포함하고, iPS 세포 유래의 췌장 전구 세포가 단계 (A) 에 사용되는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 다능성 줄기 세포를 췌장 전구 세포로 분화 유도하는 단계 (D) 를 추가로 포함하고, 췌장 전구 세포가 단계 (A) 에 사용되는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법.
  12. 제 1 항에 따른 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법에 의해 배양된 췌장 전구 세포를, 도세포 (islet cell) 로 분화 유도하는 단계 (E) 를 포함하는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포로부터의 도세포의 제조 방법.
  13. 제 1 항에 따른 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 배양 방법에 의해 배양된 췌장 전구 세포를 동결시키는 단계 (F) 를 포함하는, 다능성 줄기 세포 유래의 췌장 전구 세포의 동결보존 방법.
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