CN116391028A - 促熟剂 - Google Patents

促熟剂 Download PDF

Info

Publication number
CN116391028A
CN116391028A CN202180075398.3A CN202180075398A CN116391028A CN 116391028 A CN116391028 A CN 116391028A CN 202180075398 A CN202180075398 A CN 202180075398A CN 116391028 A CN116391028 A CN 116391028A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
inhibitor
medium
cdk8
cell population
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180075398.3A
Other languages
English (en)
Inventor
佐久间健介
松本宽和
豊田太郎
小长谷周平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qianzhihe Treatment Co
Original Assignee
Qianzhihe Treatment Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qianzhihe Treatment Co filed Critical Qianzhihe Treatment Co
Publication of CN116391028A publication Critical patent/CN116391028A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/405—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclins, cyclin-dependant kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/22—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明的目的在于提供一种用于由多能干细胞分化诱导出胰岛素阳性细胞群的新颖方法，提供了一种制造胰岛素阳性细胞群的方法，所述方法包括：使胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群在包含CDK8/19抑制剂的培养基中分化。

Description

促熟剂
技术领域
本发明涉及一种由多能干细胞制造胰岛素阳性细胞群的方法。更具体地，本发明涉及一种制造胰岛素阳性细胞群的方法，其特征在于，使由多能干细胞分化诱导得到的胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群与对周期蛋白依赖性激酶8和/或周期蛋白依赖性激酶19(以下，有时描述为“CDK8/19”)具有抑制活性的因子作用。
【背景技术】
目前正在推进由iPS细胞或ES细胞等多能干细胞分化诱导出胰岛素阳性细胞或胰岛β细胞，并应用于糖尿病治疗的研究。
迄今为止，已开发并报道了各种用于由多能干细胞分化诱导成胰岛素阳性细胞群的方法(非专利文献1)。然而，在分化诱导得到的胰岛素阳性细胞群中，除了作为目标的胰岛素阳性细胞(特别是胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞等)之外，还包含各种细胞。在想要将胰岛素阳性细胞群应用于糖尿病治疗时，从安全性的观点来看，严格控制细胞群中所含细胞的种类是极为重要的。因此，迫切需要一种能够包含更多目标细胞的新的胰岛素阳性细胞群的分化诱导方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Stem Cell Research(2015)14，185-197
发明内容
本发明所要解决的问题
本发明的目的在于提供一种用于由多能干细胞分化诱导出胰岛素阳性细胞群的新颖方法。
用于解决问题的技术手段
本发明者们为了解决上述问题而锐意研究的结果是发现在由多能干细胞诱导出胰岛素阳性细胞群的过程中，通过使在胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群与具有CDK8/19抑制活性的因子(以下，有时描述为“CDK8/19抑制剂”)作用，能够有效地分化诱导出胰岛素阳性细胞、特别是胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞，与以往的方法相比，能够得到包含更多该细胞的胰岛素阳性细胞群。
本发明是基于这些新认知的发明，包含以下发明。
[1]一种制造胰岛素阳性细胞群的方法，
所述方法包括：使胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群在包含CDK8/19抑制剂的培养基中分化。
[2]根据[1]所述的方法，其中，所述培养基实质上不具有ALK5抑制活性。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述CDK8/19抑制剂对于ALK5的IC50为1μM及以上。
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的方法，其中，CDK8/19抑制剂为选自由二乙基(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯酰胺)苄基)膦酸酯、2-(4-(4-(异喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙酰胺、4-((2-(6-(4-甲基哌嗪-1-羰基)萘-2-基)乙基)氨基)喹唑啉-6-甲腈、4-(4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-6-基)-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇、3-(2-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基硫基)乙基)-4-(萘-1-基磺酰基)-3,4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮、及(E)-3-(4-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-N-(4-(吗啉基甲基)苯基)丙烯酰胺组成的组中的一种或多种。
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群是通过分化诱导多能干细胞而制造的。
[6]一种胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群的分化培养基，所述培养基包含CDK8/19抑制剂。
[7]根据[6]所述的培养基，所述培养基实质上不具有ALK5抑制活性。
[8]根据[6]或[7]所述的培养基，其中，CDK8/19抑制剂对于ALK5的IC50为1μM及以上。
[9]根据[6]至[8]中任一项所述的培养基，其中，CDK8/19抑制剂为选自由二乙基(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯酰胺)苄基)膦酸酯、2-(4-(4-(异喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙酰胺、4-((2-(6-(4-甲基哌嗪-1-羰基)萘-2-基)乙基)氨基)喹唑啉-6-甲腈、4-(4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-6-基)-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇、3-(2-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基硫基)乙基)-4-(萘-1-基磺酰基)-3,4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮、及(E)-3-(4-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-N-(4-(吗啉基甲基)苯基)丙烯酰胺组成的组中的一种或多种。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的2020年11月20日提交的日本专利申请第2020-193454号的说明书和/或附图中记载的内容。
本说明书中引用的所有刊物、专利以及专利申请直接作为参考并入本说明书中。
发明效果
根据本发明，可以提供一种用于由多能干细胞分化诱导出胰岛素阳性细胞群的新颖方法。即，根据本发明，在由多能干细胞诱导出胰岛素阳性细胞群的过程中，能够有效地分化诱导出胰岛素阳性细胞、特别是胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞，与以往的方法相比，能够得到包含更多该细胞的胰岛素阳性细胞群。
附图说明
【图1】图1是示出了在用包含ALK5抑制剂II或CDK8/19抑制剂(化合物1、化合物2或化合物3)的分化诱导培养基对胰腺前体细胞群进行处理得到的胰岛素阳性细胞群中，胰岛素阳性且NKX6.1阳性(表示为“INS+/NKX+”)的细胞率及胰岛素阳性且NKX6.1阴性(表示为“INS+/NKX-”)的细胞率的图。
【图2】图2示出了用包含规定浓度的ALK5抑制剂II或CDK8/19抑制剂(化合物1、化合物2或化合物3)的分化诱导培养基对胰腺前体细胞群进行处理得到的胰岛素阳性细胞群的胰岛素及NKX6.1的利用流式细胞术的表达分析结果。
具体实施方式
1.术语
以下，对本说明书中所记载的术语进行说明。
本说明书中，“约”或“大致”表示相对于基准值分别在正或负25％、20％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％内波动的值。优选地，“约”或“大致”这样的术语表示相对于基准值分别在正或负15％、10％、5％或1％的范围。
本说明书中，“包括/包含(comprise(s)或comprising)～”意指包括/包含与该语句接续的要素，但不限于此。因此，虽然暗示了包括/包含与该语句接续的要素，但并未暗示排除其它任意要素。
本说明书中，“由～组成(consist(s)of或consisting of)”意指包含且限于与该语句接续的所有要素。因此，“由～组成”这一语句表示所列举的要素是必要或必须的，实质上不存在其它要素。
本说明书中，不“使用饲养细胞”意指基本上不包含饲养细胞、不使用通过培养饲养细胞从而进行了预处理的培养基等。因此，培养基中不包含由饲养细胞分泌的生长因子及细胞因子等物质。
另外，“饲养细胞”或“饲养者”意指与其它种类的细胞共同培养、赋予能够支持该细胞并使其生长的环境的细胞。饲养细胞可以是与它们所支持的细胞相同来源，也可以是不同来源。例如，作为人细胞的饲养者，可以使用人皮肤成纤维细胞或人胚胎干细胞，也可以使用小鼠胚胎成纤维细胞的初代培养物及永生小鼠胚胎成纤维细胞。饲养细胞可以通过放射线照射或丝裂霉素C处理等失活。
本说明书中，“粘附”是指细胞附着于容器，例如细胞在适当的培养基的存在下附着于灭菌塑料(或包覆后的塑料)细胞培养皿或烧瓶。细胞之中，也有不粘附于细胞培养容器就无法在培养物中维持或生长的细胞。而非粘附性细胞不粘附于容器仍能在培养物中维持、增殖。
本说明书中，“培养”是指在活体外环境中维持细胞，并使其生长和/或分化。“进行培养”意指在组织或体外，例如在细胞培养皿或烧瓶中使细胞延续、增殖和/或分化。培养包括二维培养(平面培养)、三维培养(悬浮培养)。
本说明书中，“进行富集(enrich)”及“富集(enrichment)”是指使细胞的组合物等组合物中的特定的构成成分的量增加；“富集了的(enriched)”，在用于对细胞的组合物例如细胞群进行说明时，是指与富集前的细胞群中特定的构成成分的比例相比该构成成分的量增加了的细胞群。例如，可以对与靶细胞型相关的细胞群等组合物进行富集，因此，与富集前的细胞群内存在的靶细胞的比例相比靶细胞型的比例增加。也可以通过本技术领域公知的细胞选择及筛选方法对与靶细胞型相关的细胞群进行富集。也可以通过本说明书中记载的特定的筛选或选择流程对细胞群进行富集。在本发明的特定实施方式中，通过对靶细胞群进行富集的方法，使与靶细胞群相关的细胞群富集至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。
本说明书中，“使…耗尽(deplete)”及“耗尽(depletion)”是指使细胞的组合物等组合物中的特定的构成成分的量减少；“耗尽后的(depleted)”，在用于对细胞的组合物例如细胞群进行说明时，是指与耗尽前的细胞群中特定的构成成分的比例相比该构成成分的量减少了的细胞群。例如，可以使与靶细胞型相关的细胞群等组合物耗尽，因此，与耗尽前的细胞群内存在的靶细胞的比例相比靶细胞型的比例减少。也可以通过本技术领域公知的细胞选择及筛选方法使与靶细胞型相关的细胞群耗尽。也可以通过本说明书中记载的特定的筛选或选择流程使细胞群耗尽。在本发明的特定实施方式中，通过使靶细胞群耗尽的方法，与靶细胞群相关的细胞群至少减少(耗尽)了50％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％。
本说明书中，“进行纯化(purify)”及“纯化(purification)”是指去除细胞的组合物等组合物中的杂质，使特定的构成成分变得纯净；“纯化后的(purified)”，在用于对细胞的组合物例如细胞群进行说明时，是指杂质的量与纯化前的细胞群中的该构成成分的比例相比减少，特定的构成成分的纯度提高的细胞群。例如，可以对与靶细胞型相关的细胞群等组合物进行纯化，因此，与纯化前的细胞群内存在的靶细胞的比例相比靶细胞型的比例增加。也可以通过本技术领域公知的细胞选择及筛选方法使与靶细胞型相关的细胞群纯化。也可以通过本说明书中记载的特定的筛选或选择流程对细胞群进行纯化。在本发明的特定实施方式中，通过对靶细胞群进行纯化的方法，使靶细胞群的纯度变成至少70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％，或者是可变成无法检出杂质(包含夹杂细胞)的程度。
本说明书中，“标记”意指“标记蛋白质”、“标记基因”等通过规定的细胞型而特异性地表达的细胞抗原或其基因。优选地，标记为细胞表面标记，此时，可以实施生存细胞的浓缩、分离和/或检出。标记可以是阳性选择标记或阴性选择标记。
标记蛋白质的检出可以利用对该标记蛋白质具有特异性的抗体进行免疫学分析，例如ELISA、免疫染色、流式细胞术来进行。标记基因的检测可以利用所属领域公知的核酸扩增方法和/或核酸检测方法，例如RT-PCR、微阵列、生物芯片等来进行。本说明书中，标记蛋白质为“阳性”意指通过流式细胞术检出为阳性，“阴性”意指通过流式细胞术为检出限界以下。此外，本说明书中，标记基因为“阳性”意指通过RT-PCR被检出，“阴性”意指通过RT-PCR为检出限界以下。
本说明书中，“表达(expression)”定义为由细胞内的启动子所驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
本说明书中，“具有CDK8/19抑制活性的因子”或“CDK8/19抑制剂”意指具有CDK8/19抑制活性的所有物质。相对于同为CDK家族的其它蛋白质，CDK8对于细胞增殖来说是非必需的，CDK8的抑制在通常条件下没有太大的效果。CDK19与CDK8类似，CDK8的抑制通常伴随着CDK19的抑制。
本说明书中，“增殖因子”为促使特定细胞的分化和/或增殖的内源性蛋白质。作为“增殖因子”，可举出例如：表皮生长因子(EGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子2(IGF-2)、角质形成细胞生长因子(KGF)、神经生长因子(NGF)、血小板源生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、运铁蛋白、各种白细胞介素(例如IL-1至IL-18)、各种集落刺激因子(例如粒细胞/巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、各种干扰素(例如IFN-γ等)以及对干细胞有效的其它细胞因子例如干细胞因子(SCF)和促红细胞生成素(Epo)。
本说明书中，“ROCK抑制剂”意指抑制Rho激酶(ROCK：Rho-associated，coiled-coil containing protein kinase)的物质，也可以是抑制ROCK I和ROCK II中任一者的物质。ROCK抑制剂只要具有上述功能就没有特别限定，可举出例如：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-甲酰胺(本说明书中，有时也称为Y-27632)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]六氢-1H-1,4-二氮杂环庚烯(H-1152)、4β-[(1R)-1-氨基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α-甲酰胺(Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-氨基乙基]环己烷-1α-甲酰胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-氨基-1,2,5-噁二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-吗啉基)乙基]-氧基}苯甲酰胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-氧代-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氢-1H-吡啶-5-羧酰胺(GSK429286A)。ROCK抑制剂不限于以上这些，也可以将ROCK的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA、与ROCK结合的抗体、显性负ROCK突变体等用作ROCK抑制剂，其可商购或可根据公知的方法合成。
本说明书中，“GSK3β抑制剂”是指对GSK3β(糖原合酶激酶3β)具有抑制活性的物质。GSK3(糖原合酶激酶3)是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的一种，参与有关糖原的产生或凋亡、干细胞的维持等许多信号传导路径。GSK3存在α和β两种同工型。本发明中使用的“GSK3β抑制剂”只要具有GSK3β抑制活性就没有特别限定，也可以是与GSK3β抑制活性组合并兼具GSK3α抑制活性的物质。
作为GSK3β抑制剂，例示了CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-氨基吡啶-2－基)氨基]乙基]氨基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]-氨基]乙基]氨基]尼古丁腈)、TDZD-8(4-苄基-2-甲基-1,2,4-噻二唑烷-3,5-二酮)，SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)，TWS-119(3-[6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧基]酚)、坎帕罗酮(Kenpaullone)、1-氮杂坎帕罗酮(Azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羟基苯基)氨基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-丙酮肟、吡啶并咔唑-环戊二烯基钌复合体、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、锂等。GSK3β不限于以上这些，也可以将GSK3β的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA、与GSK3β结合的抗体、显性负GSK3β突变体等用作GSK3β抑制剂，其可商购或可根据公知的方法合成。
本说明书中的“血清替代物”可举出例如：KnockOutTM Serum Replacement(KSR:Thermo Fisher Scientific)，StemSure(注册商标)Serum Replacement(Wako)、B-27补充剂、N2补充剂、白蛋白(例如，富脂质白蛋白)、胰岛素、运铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体物、痕量元素(例如锌、硒(例如，亚硒酸钠))、2-巯基乙醇、3'-硫代甘油或它们的混合物(例如，ITS-G)。作为血清替代物，优选B-27补充剂、KSR、StemSure(注册商标)Serum Replacement、ITS-G。将血清替代物添加到培养基中时，其在培养基中的浓度按重量计为0.01％-10％、优选按重量计为0.1％-2％。在本发明中，优选使用“血清替代物”来代替血清。
2.胰岛素阳性细胞群的制造方法
本发明提供一种制造胰岛素阳性细胞群的方法，所述方法包括：在CDK8/19抑制剂的存在下，使胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群分化。
CDK8/19抑制剂作用于胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群，产生使胰岛素阳性细胞、特别是胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞富集了的胰岛素阳性细胞群。
本发明中所使用的“CDK8/19抑制剂”只要具有CDK8/19的抑制活性就没有特别限定，可使用直接或间接抑制CDK8/19功能的所有因子。优选地，在本发明中，“CDK8/19抑制剂”是指抑制50％及以上CDK8/19的因子。作为判断有无CDK8/19抑制活性的方法，可选自公知的方法，可举出例如以下详述的本说明书实施例1的方法。
在本发明中，“CDK8/19抑制剂”也可以使用以往公知的抑制剂，这样的CDK8/19抑制剂可以从专利文献或非专利文献中找到。例如US 2012/0071477、WO 2015/159937、WO2015/159938、WO 2013/116786、WO 2014/0038958、WO 2014/134169、JP 2015/506376、US2015/0274726、US 2016/0000787、WO 2016/009076、WO 2016/0016951、WO 2016/018511、WO2016/100782及WO 2016/182904中记载的化合物中，具有CDK8/19抑制活性的化合物(或其盐)可以用作本发明中的“CDK8/19抑制剂”。特别是，上述化合物中，可以适当地利用对CDK8/19具有选择性抑制活性的化合物(或其盐)。
在“CDK8/19抑制剂”对ALK5(activin receptor-like kinase 5)具有抑制活性时，CDK8/19抑制剂优选对于ALK5显示抑制率50％所需的浓度(IC50值)为1μM及以上的那些。通过利用这样的CDK8/19抑制剂，可以使添加了CDK8/19抑制剂的培养基实质上不具有ALK5抑制活性。“实质上不具有ALK5抑制活性”不只意指培养基完全不具有ALK5抑制活性的情况，还包括对于ALK5的抑制率低于50％、优选为40％及以下、更优选为30％及以下、进一步优选为20％及以下、还进一步优选为10％及以下、特别优选为5％及以下的情况。
更具体地，作为本发明中可利用的CDK8/19抑制剂，没有特别限定，可举出例如下述化合物或其盐。此外，这些化合物只要具有CDK8/19抑制活性，可以具有一个或多个取代基，也可以变换一部分的部分结构(取代基、环等)。
【表1】
Figure BDA0004216823320000061
此外，作为本发明中可利用的CDK8/19抑制剂，没有特别限定，例如可以使用下述记载的化合物7至13或其盐。化合物7至11优选游离化合物，化合物12及13优选三氟乙酸盐。
【表2】
Figure BDA0004216823320000071
本发明中的CDK8/19抑制剂不限于以上所示的化合物，也可以将CDK8/19的mRNA的反义寡核苷酸或siRNA、与CDK8/19结合的抗体、显性负CDK8/19突变体等用作CDK8/19抑制剂。
上述CDK8/19抑制剂可利用商购或根据公知的方法合成的那些。
本发明中的“胰岛素阳性细胞群”意指包含由多能干细胞分化诱导得到的胰岛素阳性细胞的细胞群。“胰岛素阳性细胞”意指通过胰岛素的标记的表达被确认来表征的细胞。“胰岛素阳性细胞”可以是表达NK6同源框1(NKX6.1)的标记的细胞、优选地是表达胰岛素及NKX6.1两者的标记的细胞(即，胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞)。
与根据以往公知的方法(即，包括：在ALK5抑制剂(例如，ALK5抑制剂II)的存在下培养胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群的步骤的方法(NatureBiotechnology 2014；32：1121-1133等))由多能干细胞分化诱导得到的胰岛素阳性细胞群相比，本发明中的“胰岛素阳性细胞群”为使胰岛素阳性细胞、特别是胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞富集了的细胞群。本发明的胰岛素阳性细胞群中，胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞的含有率为33％及以上、优选为34％及以上、更优选为35％及以上、进一步优选为36％及以上、特别优选为37％及以上。该含有率上限没有特别限定，为70％及以下、60％及以下或50％及以下。该含有率可以使用分别从前述上限值和下限值中选择的两个数值来表示，例如，该含有率为33％～50％、优选为34％～50％、更优选为35％～50％、进一步优选为36％～50％、特别优选为37％～50％。
本发明中的“胰岛素阳性细胞群”可以通过用CDK8/19抑制剂对由多能干细胞分化诱导得到的胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群进行处理来得到。通过用CDK8/19抑制剂对胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段这一规定的分化阶段的细胞群进行处理，可以得到胰岛素阳性细胞、优选胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞富集了的胰岛素阳性细胞群。除了胰岛素阳性细胞，胰岛素阳性细胞群还可以包含其他细胞(例如，内分泌前体细胞；表达胰高血糖素、生长抑素及胰多肽中的至少一种标记的其他胰腺激素产生细胞；Ki67阳性细胞；CHGA阴性细胞等)。
在本发明中，“胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群”意指胰腺前体细胞群或内分泌前体细胞群、或者胰腺前体细胞群和内分泌前体细胞群这两个细胞群。
本说明书中，“多能(pluripotency)”意指能够分化为各种具有不同形态或功能的组织或细胞，且能够分化为三胚层的任一层的细胞的能力。“多能(pluripotency)”不能够分化为胚盘，因此从不具有形成个体的能力的角度来看，区别于能够分化为包括胚盘的生物体所有组织的“全能(totipotency)”。
本说明书中，“多潜能(multipotency)”意指能够分化为多个有限数量的层的细胞的能力。例如，间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞为多潜能(multipotent)，而非多能(pluripotent)。
本说明书中，“多能干细胞(pluripotent stem cell)”是指胚胎干细胞(ES细胞)及潜在地具有与其同样的分化多能、即分化为生物体各种组织(内胚层、中胚层、外胚层全部)的能力的细胞。可举出“诱导性多能干细胞”(本说明书中，也被称为“iPS细胞”)作为具有与ES细胞同样的分化多能的细胞。优选地，在本发明中，多能干细胞是人多能干细胞。
如果是小鼠ES细胞作为“ES细胞”，可利用由inGenious公司、理化学研究所(理研)等建立的各种小鼠ES细胞株；如果是人ES细胞作为“ES细胞”，可利用由美国国立卫生研究院(NIH)、理研、京都大学、Cellartis公司建立的各种人ES细胞株。例如，可以利用NIH的CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等；WiCell Research Institute的H1株、H9株；理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等作为ES细胞株。
“诱导性多能干细胞”是指通过将特定的因子(核重编程因子)导入哺乳动物体细胞或未分化干细胞内进行重编程而得到的细胞。目前，有各式各样的“诱导性多能干细胞”，除了山中等人通过将Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四因子导入小鼠成纤维细胞内而建立的iPS细胞(Takahashi K，Yamanaka S.，Cell，(2006)126：663-676)之外，还可以使用：将同样的四因子导入人成纤维细胞内而建立的源自人细胞的iPS细胞(Takahashi K，YamanakaS.，等人，Cell，(2007)131：861-872.)、在导入上述四因子后，以Nanog的表达作为指标进行筛选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita，K.，Ichisaka，T.，以及Yamanaka，S.(2007).Nature448，313-317.)、通过不包含c-Myc的方法制作的iPS细胞(Nakagawa M，Yamanaka S.，等人，Nature Biotechnology，(2008)26，101-106)、通过无病毒法导入六因子而建立的iPS细胞(Okita K等人，Nat.Methods 2011May；8(5)：409-12，Okita K等人，Stem Cells.31(3)：458-66.)。此外，还可以使用：Thomson等人制作的、导入了OCT3/4、SOX2、NANOG及LIN28四因子而建立的诱导性多能干细胞(Yu J.，Thomson JA.等人，Science(2007)318：1917-1920.)、Daley等人制作的诱导性多能干细胞(Park IH，Daley GQ.等人，Nature(2007)451：141-146)、樱田等人制作的诱导性多能干细胞(日本特开第2008-307007号)等。
此外，也可以使用已公开的所有论文(例如，Shi Y.，Ding S.等人，Cell StemCell，(2008)Vol 3，Issue 5，568-574；Kim JB.，Scholer HR.等人，Nature，(2008)454，646-650；Huangfu D.，Melton，DA.等人，Nature Biotechnology，(2008)26，No 7，795-797)、或者专利(例如，日本特开第2008-307007号、日本特开第2008-283972号、US 2008/2336610、US 2009/047263、WO 2007/069666、WO 2008/118220、WO 2008/124133、WO 2008/151058、WO 2009/006930、WO 2009/006997、WO 2009/007852)中记载的所属领域公知的诱导性多能干细胞中的任一种。
可以使用NIH、理化学研究所(理研)、京都大学等建立的各种iPS细胞株作为诱导性多能细胞株。例如，如果是人iPS细胞株，可举出：理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株；京都大学的Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株、253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株；CDI公司的MyCell iPS Cells(21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。
本说明书中的“胰腺前体细胞群”意指包含胰腺前体细胞的细胞群。本说明书中，胰腺前体细胞通过作为标记的NKX6.1的表达来表征(即NKX6.1阳性)。胰腺前体细胞进一步可以表达PDX-1、PTF-1α、GATA4及SOX9中的至少一种标记。优选地，胰腺前体细胞通过NKX6.1及PDX-1的表达来表征(即NKX6.1阳性且PDX-1阳性)。
在一个实施方式中，本发明中的“胰腺前体细胞群”是在以下详述的将多能干细胞分化诱导成胰岛β细胞的步骤中，相当于步骤4)结束后的培养物、或步骤5)中的培养物的细胞群。
本发明中的“胰腺前体细胞群”中，胰腺前体细胞以30％及以上、优选40％及以上、更优选50％及以上、进一步优选60％及以上、更进一步优选70％及以上的比例包含。除了胰腺前体细胞，胰腺前体细胞群还可以包含其他细胞(例如，内分泌前体细胞、胰岛素阳性细胞、Ki67阳性细胞、CHGA阴性细胞等)。
另外，可以基于如流式细胞术这样的能够计算出细胞数量的公知的方法来求出本说明书中记载的细胞群中的特定细胞的比例。
本说明书中的“内分泌前体细胞群”意指包含内分泌前体细胞的细胞群。本说明书中，内分泌前体细胞意指通过CHGA、NeuroD及NGN3中的至少一种的标记的表达及胰腺相关联的激素系(例如，胰岛素等)的标记的未表达来表征的细胞。内分泌前体细胞也可以表达PAX-4、NKX2.2、Islet-1、PDX-1等标记。
在一个实施方式中，本发明中的“内分泌前体细胞群”是在以下详述的将多能干细胞分化诱导成胰岛β细胞的步骤中，相当于步骤5)结束后的培养物、或步骤6)中的培养物的细胞群。
本发明中的“内分泌前体细胞群”中，内分泌前体细胞以30％及以上、优选40％及以上、更优选50％及以上、进一步优选60％及以上、更进一步优选70％及以上的比例包含。除了内分泌前体细胞，内分泌前体细胞群还可以包含其他细胞(例如，胰腺前体细胞、胰岛素阳性细胞、Ki67阳性细胞、CHGA阴性细胞等)。
已知在由多能干细胞分化成胰岛素阳性细胞的过程中，根据分化阶段会出现具有不同特征的细胞(WO 2009/012428、WO 2016/021734)。例如，此分化阶段中，按照相对未分化的顺序可以大致分为多能干细胞、定形内胚层细胞、胃肠道细胞、后前肠细胞、胰腺前体细胞、内分泌前体细胞、胰岛素阳性细胞。
胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群可使用将多能干细胞分化诱导成胰岛素阳性细胞的公知的方法来得到。即，可以利用以下分化诱导步骤得到处于各目标的分化阶段中的细胞群：
步骤1)由多能干细胞分化诱导成定形内胚层细胞；
步骤2)由定形内胚层细胞分化诱导成胃肠道细胞；
步骤3)由胃肠道细胞分化诱导成后前肠细胞；
步骤4)由后前肠细胞分化诱导成胰腺前体细胞；
步骤5)由胰腺前体细胞分化诱导成内分泌前体细胞；以及
步骤6)由内分泌前体细胞分化诱导成胰岛素阳性细胞。
以下，对各步骤进行说明，但各细胞的分化诱导不限于这些方法。
步骤1)分化成定形内胚层细胞
首先，使多能干细胞分化成定形内胚层细胞。由多能干细胞诱导出定形内胚层的方法是公知的，也可以使用这些方法中的任一种。优选地，将多能干细胞在包含激活素A的培养基中进行培养，更优选在包含激活素A、ROCK抑制剂、GSK3β抑制剂的培养基中进行培养，以使其分化成定形内胚层细胞。培养开始时的细胞数量没有特别限定，为22000个细胞/cm2～150000个细胞/cm2、优选为22000个细胞/cm2～100000个细胞/cm2、更优选为22000个细胞/cm2～80000个细胞/cm2。培养时间为1至4天、优选为1至3天、特别优选为3天。
培养温度没有特别限定，在30℃～40℃(例如，37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度例如为5％左右。培养可以通过二维培养或三维培养进行。
作为本步骤中使用的培养基，可以使用：RPMI 1640培养基、MEM培养基、iMEM培养基、DMEM/F12培养基、改良的MEM Zinc Option培养基、改良的MEM/1％B-27/PenisilinStreptomycin培养基、MCDB131/20mM Glucose/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAXTM/抗坏血酸/Penisilin Streptomycin培养基等培养哺乳动物细胞所使用的基础培养基。
培养基中激活素A的浓度通常为30ng/mL～200ng/mL、优选为50ng/mL～150ng/mL、更优选为70ng/mL～120ng/mL、特别优选为约100ng/mL。
在另一方案中，激活素A可以低用量包含在培养基中，例如5ng/mL～100ng/mL、优选5ng/mL～50ng/mL、更优选5ng/mL～10ng/mL。
在又一个方案中，培养基中激活素A的浓度为约0.1ng/mL～100ng/mL、优选为约1ng/mL～50ng/mL、更优选为约3ng/mL～10ng/mL。
培养基中GSK3β抑制剂的浓度根据所使用的GSK3β抑制剂的种类适当设定，例如，在将CHIR99021用作GSK3β抑制剂时的浓度通常为2μM～5μM、优选为2μM～4μM、特别优选为约3μM。
培养基中ROCK抑制剂的浓度根据所使用的ROCK抑制剂的种类适当设定，例如，在将Y27632用作ROCK抑制剂时的浓度通常为5μM～20μM、优选为5μM～15μM、特别优选为约10μM。
可以进一步将胰岛素添加到培养基中。胰岛素可以0.01μM～20μM、优选0.1μM～10μM、更优选0.5μM～5μM的量包含在培养基中。培养基中胰岛素浓度可以是添加的B-27补充剂中所包含的胰岛素的浓度，但不限于此。
在特定的方案中，在包含激活素A、ROCK抑制剂、GSK3β抑制剂的培养基中培养1天后、在以仅包含激活素A的培养基每天交换培养基的同时进一步培养2天。或者，可通过在低用量的激活素A的存在下，将多能干细胞在包含0.01μM～20μM胰岛素的培养基中进行第1培养，然后在不含胰岛素的培养基中进行第2培养而制造。
步骤2)分化成胃肠道细胞
将步骤1)中得到的定形内胚层细胞进一步在包含增殖因子的培养基中进行培养，分化诱导成胃肠道细胞。培养时间为2至8天、优选为约4天。
培养温度没有特别限定，在30℃～40℃(例如，37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度例如为5％左右。培养可以通过二维培养或三维培养进行。
培养基可以与步骤1)同样地使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基。除了増殖因子，血清替代物、维生素、抗生素等也可以适当地添加到培养基中。
作为増殖因子，优选EGF、KGF、FGF10、更优选EGF和/或KGF、进一步优选KGF。
培养基中増殖因子的浓度根据所使用的増殖因子的种类适当设定，但通常为约0.1nM～1000μM、优选为约0.1nM～100μM。在使用EGF时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即，约0.8nM～320nM)、优选为约5ng/mL～1000ng/mL(即，约0.8nM～160nM)、更优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即，约1.6nM～160nM)。在使用FGF10时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即约0.3nM～116nM)、优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即约0.6nM～58nM)。例如使用KGF作为增殖因子时的浓度通常为5ng/mL～150ng/mL、优选为30ng/mL～100ng/mL、特别优选为约50ng/mL。
步骤3)分化成后前肠细胞
将步骤2)中得到的胃肠道细胞进一步在包含增殖因子、环巴胺、头蛋白等的培养基中进行培养，分化诱导成后前肠细胞。培养时间为1至5天、优选为约2天左右。培养可以通过二维培养或三维培养进行。
培养温度没有特别限定，在30℃～40℃(例如，37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度例如为5％左右。
培养基可以与步骤1)同样地使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基。除了増殖因子，血清替代物、维生素、抗生素等也可以适当地添加到培养基中。
作为増殖因子，优选EGF、KGF、FGF10、更优选EGF和/或KGF、进一步优选KGF。
培养基中増殖因子的浓度根据所使用的増殖因子的种类适当设定，但通常为约0.1nM～1000μM、优选为约0.1nM～100μM。在使用EGF时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即，约0.8nM～320nM)、优选为约5ng/mL～1000ng/mL(即，约0.8nM～160nM)、更优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即，约1.6nM～160nM)。在使用FGF10时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即约0.3nM～116nM)、优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即约0.6nM～58nM)。例如使用KGF作为增殖因子时的浓度通常为5ng/mL～150ng/mL、优选为30ng/mL～100ng/mL、特别优选为约50n g/mL。
培养基中环巴胺的浓度没有特别限定，但通常为0.5μM-1.5μM、优选0.3μM-1.0μM，特别优选约0.5μM。
培养基中头蛋白的浓度没有特别限定，但通常为10ng/mL～200ng/mL、优选为50ng/mL～150ng/mL，特别优选为约100ng/mL。
步骤4)分化成胰腺前体细胞
将步骤3)中得到的后前肠细胞进一步在包含具有CDK8/19抑制活性的因子的培养基中进行培养，优选在包含具有CDK8/19抑制活性的因子和增殖因子的培养基中进行培养，分化诱导成胰腺前体细胞。培养时间为2至10天、优选为约5天左右。培养可以通过二维培养或三维培养进行。
在二维培养的情况下，根据先前的报道(Toyoda等人，Stem Cell Research(2015)14，185-197)，将步骤3)中得到的后前肠细胞用0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液进行处理，通过移液使其分散于该液中并得到细胞分散液，将得到的分散液进行离心分离，将回收的细胞再悬浮于少量的新鲜培养基中，将此细胞悬浮液再接种到步骤4)的新的培养基中。
培养基可以与步骤1)同样地使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基。除了増殖因子，血清替代物、维生素、抗生素等也可以适当地添加到培养基中。
可以使用前述各种化合物或其盐作为具有CDK8/19抑制活性的因子，根据所使用的化合物或其盐适当确定添加至培养基的量，通常为约0.00001μM～5μM、优选为0.00001μM～1μM。培养基中具有CDK8/19抑制活性的因子的浓度优选对CDK8/19的抑制活性达到50％及以上的浓度。
作为増殖因子，优选EGF、KGF、FGF10、更优选KGF和/或EGF、进一步优选KGF及EGF。
培养基中増殖因子的浓度根据所使用的増殖因子的种类适当设定，但通常为约0.1nM～1000μM、优选为约0.1nM～100μM。在使用EGF时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即，约0.8nM～320nM)、优选为约5ng/mL～1000ng/mL(即，约0.8nM～160nM)、更优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即，约1.6nM～160nM)。在使用FGF10时，其浓度为约5ng/mL～2000ng/mL(即约0.3nM～116nM)、优选为约10ng/mL～1000ng/mL(即约0.6nM～58nM)。例如使用KGF及EGF作为增殖因子时，EGF的浓度通常为5ng/mL～150ng/mL、优选为30ng/mL～100n g/mL、特别优选为约50ng/mL；KGF的浓度通常为10ng/mL～200ng/mL、优选为50ng/mL～150ng/mL、特别优选为约100ng/mL。
步骤4)中的培养的第一天可以在ROCK抑制剂的存在下进行，此后可以在不含ROCK抑制剂的培养基中进行培养。
此外，培养基中还可以包含蛋白激酶C(PKC)活化剂。可使用PDBu(PKC activatorII)、TPB(PKC activator V)等作为PKC活化剂，但不限于此。PKC活化剂的浓度以约0.1ng/mL～100ng/mL、优选约1ng/mL～50ng/mL、更优选约3ng/mL～10ng/mL进行添加。
此外，可以将二甲亚砜和/或激活素(1ng/mL～50ng/mL)添加到培养基中。
在任一步骤中，除了上述成分外，还可以将血清替代物(例如，B-27补充剂、ITS-G)添加到培养基中。此外，根据需要，也可以添加氨基酸、L-谷氨酰胺、GlutaMAX(产品名称)、非必需氨基酸、维生素、尼古丁酰胺、抗生素(例如，抗生素-抗真菌剂(Antibiotic-Antimycotic)、青霉素、链霉素或它们的混合物)、抗菌剂(例如，两性霉素B)、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等。当将抗生素添加到培养基中时，其在培养基中的浓度按重量计通常为0.01％～20％，优选按重量计为0.1％～10％。培养可以通过二维培养或三维培养进行。
此外，在细胞培养是二维培养的情况下，不使用饲养细胞，通过粘附培养进行。培养时，使用皿、烧瓶、微孔板、OptiCell(产品名称)(Nunc公司)等细胞培养片等培养容器。优选对培养容器进行用于提高与细胞的粘附性(亲水性)的表面处理，或将胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、基质胶(例如，BD基质胶(日本贝克顿迪金森公司)、玻连蛋白等用于细胞粘附的基质涂覆其上。优选将涂覆有I型胶原蛋白、基质胶、纤连蛋白、玻连蛋白或聚-D-赖氨酸等的培养容器作为培养容器、更优选将涂覆有基质胶或聚-D-赖氨酸的培养容器作为培养容器。
培养温度没有特别限定，在30℃～40℃(例如，37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度例如为5％左右。
可以利用作为公知的表面标记的糖蛋白2(GP2)等进一步对步骤4)中得到的胰腺前体细胞进行纯化。可以通过本身已为公知的方法进行上述纯化，例如，使用固定有抗GP2抗体的珠子。
步骤5)分化成内分泌前体细胞
将步骤4)中得到的胰腺前体细胞进一步在包含増殖因子的培养基中进行培养，分化诱导成内分泌前体细胞。培养可以通过二维培养或三维培养进行。在二维培养的情况下，将步骤4)中得到的胰腺前体细胞用0.25％的胰蛋白酶-EDTA溶液进行处理，通过移液使其分散于该液中并得到细胞分散液，将得到的分散液进行离心分离，将回收的细胞再悬浮于少量的新鲜培养基中，将此细胞悬浮液再接种到步骤5)的新的培养基中。培养时间为2至3天、优选为约2天。
培养基可以与步骤1)同样地使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基。根据先前的报道(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，将SANT1、视黄酸、ALK5抑制剂II、T3、LDN添加到培养基中，进一步地，可以将Wnt抑制药、ROCK抑制剂、FGF(优选FGF2)、血清替代物、维生素、抗生素等适量添加到培养基中。另外，在本发明中，在步骤5)中使用CDK8/19抑制剂时，可不使用ALK5抑制剂(ALK5抑制剂II等)，优选不使用ALK5抑制剂(ALK5抑制剂II等)。
培养不使用饲养细胞，通过非粘附培养进行。培养时，使用皿、烧瓶、微孔板、多孔板(Nunc公司)等或生物反应器。优选对培养容器进行用于降低与细胞的粘附性的表面处理。
培养温度没有特别限定，在30℃～40℃(例如，37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度例如为5％左右。
可以利用作为公知的表面标记的糖蛋白2(GP2)等进一步对步骤5)中得到的内分泌前体细胞进行纯化。可以通过本身已为公知的方法进行上述纯化，例如，使用固定有抗GP2抗体的珠子。
步骤6)分化成胰岛素阳性细胞
将步骤5)中得到的内分泌前体细胞进一步在包含増殖因子的培养基中进行培养，分化诱导成胰岛素阳性细胞。培养时间为10至30天，优选为约10至20天。
培养基可以与步骤1)同样地使用用于培养哺乳动物细胞的基础培养基。根据先前的报道(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，将ALK5抑制剂II、T3、LDN、γ-secretase抑制剂XX、γ-secretase抑制剂RO、N-半胱氨酸、AXL抑制剂、抗坏血酸添加到培养基中，进一步，可以将Wnt抑制药、ROCK抑制剂、FGF(优选FGF2)、血清替代物、维生素、抗生素等适量添加到培养基中。例如，可以将ALK5抑制剂II、T3、LDN、γ-secretase抑制剂RO及抗坏血酸添加到培养基中，或者将T3、ALK5抑制剂II、ZnSO4、肝素、N-乙酰半胱氨酸、Trolox及R428添加到培养基中。另外，在本发明中，在步骤6)中使用CDK8/19抑制剂时，可不使用ALK5抑制剂(ALK5抑制剂II等)，优选不使用ALK5抑制剂(ALK5抑制剂II等)。
培养可以通过二维培养或三维培养进行。培养不使用饲养细胞。在三维培养的情况下，通过非粘附培养进行。培养时，使用皿、烧瓶、微孔板、多孔板(Nunc公司)等或生物反应器。优选对培养容器进行用于降低与细胞的粘附性的表面处理。
培养温度没有特别限定，在30℃～40℃(例如，37℃)下进行。此外，培养容器中的二氧化碳浓度例如为5％左右。
通过以CDK8/19抑制剂对由多能干细胞分化诱导得到的胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群的处理，可以通过使CDK8/19抑制剂与该细胞群接触来进行。例如，可以通过在添加了CDK8/19抑制剂的培养基中培养该细胞群来进行。CDK8/19抑制剂可以以能够抑制CDK8/19活性的任意量包含在培养基中，例如，以10μM及以下、5μM及以下、4μM及以下、3μM及以下、2μM及以下、或1μM及以下的量包含。特别是，在CDK8/19抑制剂对ALK5具有抑制活性，对于ALK5显示抑制率50％所需的浓度(IC50值)为1μM及以上时，可以以小于1μM的量包含。CDK8/19抑制剂的添加量的下限没有特别限定，可以为0.1μM及以上、0.2μM及以上、0.3μM及以上、0.4μM及以上、或0.5μM及以上。例如，CDK8/19抑制剂的添加量为10μM及以下且0.1μM及以上、优选为5μM及以下且0.1μM及以上、更别优选为1μM及以下且0.1μM及以上，例如，小于1μM且大于等于0.1μM。
此外，由多能干细胞分化诱导得到的胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群的在CDK8/19抑制剂存在下的培养可以进行至少12小时、优选24小时及以上、2天及以上、4天及以上、8天及以上、10天及以上、或15天及以上。在CDK8/19抑制剂存在下的培养优选进行4天及以上。通过CDK8/19抑制剂进行处理的期间也可以进行培养基的交换，可以根据培养计划与添加了CDK8/19抑制剂的与交换前具有相同组成的培养基或具有不同组成的培养基进行交换。
由多能干细胞分化诱导得到的胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群可以与用CDK8/19抑制剂进行处理一起进行付诸于进一步分化成目标细胞群的步骤。这里，“与用CDK8/19抑制剂进行处理一起”还包括同时进行用CDK8/19抑制剂进行处理的步骤与分化的步骤的情况、用CDK8/19抑制剂进行处理后进行付诸于分化的步骤的情况、以及进行付诸于分化的步骤后付诸于用CDK8/19抑制剂进行处理的步骤的情况。因此，用CDK8/19抑制剂进行处理时使用的培养基与使细胞群分化时使用的培养基可以不同，也可以将CDK8/19抑制剂进一步添加到分化的步骤中使用的培养基中。
在本发明的一个实施方式中，在由多能干细胞分化诱导出胰岛素阳性细胞的步骤中，使CDK8/19抑制剂包含在步骤5之后的培养基(即步骤5的培养基、或步骤6的培养基、或步骤5的培养基及步骤6的培养基)中而作用于细胞。
通过本发明得到的胰岛素阳性细胞群可以分化诱导成包含胰岛β细胞的细胞群(以下，描述为“胰岛β细胞群”)。本说明书中的“胰岛β细胞”意指比“胰岛素阳性细胞”更成熟的细胞，具体地，意指表达作为胰岛β细胞成熟标记的MAFA、UCN3及IAPP中的至少一种标记、或是通过葡萄糖刺激引起的胰岛素分泌上升反应来表征的细胞。除了胰岛β细胞，胰岛β细胞群还可以包含其他细胞(例如，胰岛素阳性细胞、Ki67阳性细胞、CHGA阴性细胞等)。
胰岛β细胞群可以通过使胰岛素阳性细胞群分化/成熟、优选通过在动物生物体内使其分化/成熟而得到的。
“动物”优选哺乳动物，可举出例如：人、非人灵长类、猪、牛、马、绵羊、山羊、美洲驼、狗、猫、兔、小鼠、豚鼠等，但优选人。
移植优选在可将细胞群固定于一定位置的生物体内区域中进行，例如，可以在动物的皮下、腹腔内、腹膜上皮、大网膜、脂肪组织、肌肉组织、或胰脏、肾脏等各脏器的包膜下等进行。被移植的细胞数量可以根据被移植的细胞的分化阶段、移植对象的年龄、体重、移植部位的大小、疾病的严重程度等重要因素而变化，没有特别限定，例如，可以是10×104个细胞～10×1011个细胞左右。被移植的细胞群可在生物体内环境中进行分化诱导而分化成目标细胞群、优选胰岛β细胞群，之后，可以将其回收或直接留置于生物体内。
在移植时，可以将细胞群包埋于包含生物体相容性材料的凝胶中进行移植，例如，可以将包埋于包含生物体相容性材料的凝胶中的细胞群封闭在胶囊、袋或室等装置中再移植到生物体内。
本说明书中的“包埋”意指使内分泌前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群分散并容纳在包含生物体相容性材料的凝胶中。
本说明书中的“生物体相容性材料”意指当移植到生物体内并短期或长期留置时，不会诱导出显著的免疫反应或有害的生物体反应(例如，毒性反应、凝血等)的任何材料。此外，“生物体相容性材料”优选为可生物降解材料。这样的材料可举出：聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚(3-羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物)(PHBV)、聚(乙烯-乙酸乙烯酯共聚物)(PEVA)、聚丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚乙烯亚胺、聚羟基丁酸、聚(N-乙烯吡咯烷酮)、聚乙烯醇、聚富马酸丙烯酯、聚丙烯酸、聚e-己内酯、聚甲基丙烯酸、聚偏二氟乙烯(PVDF)、果胶酸、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、肝素、甲壳素、壳聚糖、黄原胶、羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、海藻酸盐、海藻酸酯、胶原蛋白、纤维素、丝素蛋白、角蛋白、明胶、血纤维蛋白、普鲁兰多糖、层粘连蛋白、结冷胶、矽、氨甲酸乙酯、弹性蛋白等及其变形以及它们的组合。根据需要，“生物体相容性材料”的表面也可以实施通过表面修饰(例如，通过将用于细胞粘附的基质(胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白、基质胶、玻连蛋白等)进行涂覆)、或用已知控制细胞的增殖、分化或功能的官能团(例如氨基、羧基、羟基、甲基丙烯酸基、丙烯酸基等)进行的改变而使细胞粘附成为可能。在特定的方案中，海藻酸盐或海藻酸酯可以适当地用作“生物体相容性材料”。
海藻酸盐只要是水溶性的盐即可，并且可以利用金属盐、铵盐等。例如，可以适当地使用海藻酸钠、海藻酸钙、海藻酸铵等。
海藻酸酯(也被称为海藻酸丙二醇)是一种将丙二醇与海藻酸的羧基经酯键结的衍生物。
海藻酸盐中所包含的甘露糖醛酸与古罗糖醛酸的比例(M/G比)是任意的，一般地说，当M＞G时，可以形成富有柔软性的凝胶，而在M＜G的时，可以形成坚固的凝胶。在本发明中，可以利用以10％～90％、20％～80％、30％～70％或40％～60％的比例包含古罗糖醛酸的海藻酸盐。
使用海藻酸盐或海藻酸酯的凝胶的制作可以依据公知的方法(WO 2010/032242、WO 2011/154941)来制作，可以通过在海藻酸盐或海藻酸酯溶液中添加交联剂并使其凝胶化而得到。
在溶剂中，可以以按重量计为0.05％～10％、优选按重量计为0.1％～5％、更优选按重量计为0.5％～3％的量包含海藻酸盐或海藻酸酯。溶剂只要是可以溶解海藻酸盐或海藻酸酯即可，可以利用水、生理盐水等。
交联剂没有特别限定，只要是可以使海藻酸盐或海藻酸酯的溶液凝胶化即可，可以利用多价金属阳离子。多价金属阳离子优选二价金属阳离子、更优选钙离子、锶离子、钡离子。交联剂可以以盐的形式利用，在本发明中，可利用选自氯化钙、氯化锶、氯化钡中的至少一种作为交联剂。
包含海藻酸盐或海藻酸酯的凝胶中可以包含纳米纤维。纳米纤维是直径在纳米范围内的天然或合成纤维。天然纳米纤维可举出：包含胶原蛋白、纤维素、丝素蛋白、角蛋白、明胶、壳聚糖等多糖类的一种或多种的物质。合成纳米纤维可举出：聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)、聚氨酯(PU)、聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)(PLGA)、聚(3-羟基丁酸酯-羟基戊酸酯共聚物)(PHBV)、聚(乙烯-乙酸乙烯酯共聚物)(PEVA)等。纳米纤维可以以按重量计为少于1％，例如，按重量计为0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％或更少的量包含在包含海藻酸的凝胶中。包含海藻酸盐或海藻酸酯的凝胶中所包含的纳米纤维的量的下限没有特别限定，可以按重量计为0.05％及以上、优选按重量计为0.1％及以上。
包含海藻酸盐或海藻酸酯的凝胶的细胞群的包埋可以通过任何方式进行，没有特别限定，例如，可以通过在海藻酸盐或海藻酸酯的溶液中混合细胞群并使其凝胶化来进行。
细胞群可以以选自1×104个细胞/mL～1×109个细胞/mL、优选1×107个细胞/mL～1×108个细胞/mL的量包含在海藻酸盐或海藻酸酯的溶液中。
包含细胞群的海藻酸盐或海藻酸酯的溶液的凝胶化可以通过在该溶液中添加交联剂来进行。所添加的交联剂的量可以是相对于该溶液选自按重量计为0.1％～5％，例如，按重量计为0.1％～1％的量。凝胶化可以在用于细胞培养或细胞移植的具有规定构造和/或形状的容器内进行，或者在设计成能够得到适合该容器的凝胶的模具内进行。
或者，可以依据公知的方法(WO 2010/010902)通过形成包含海藻酸的凝胶胶囊来进行。即，可以对交联剂的溶液滴加包含细胞群的海藻酸盐或海藻酸酯的溶液来进行。液滴的大小可以根据滴加时的喷嘴形状或滴加方法来调整，进而可以规定包含海藻酸的凝胶胶囊的大小。滴加方法没有特别限定，但可以通过空气喷雾法、无气喷雾法、静电喷雾法等方法进行。包含海藻酸的凝胶胶囊的大小没有特别限定，其直径可以为5mm及以下、1mm及以下、500μm及以下。交联剂溶液中可以包含选自按重量计为0.1％～10％的量，例如，按重量计为0.1％～5％的量的交联剂。
通过本发明得到的胰岛素阳性细胞群可以移植到动物生物体内，在动物生物体内分化时可直接留置用作产生/分泌胰岛素的细胞。
通过本发明得到的胰岛素阳性细胞群，通过直接或胶囊化后移植到患部，可用作治疗糖尿病、特别是I型糖尿病的细胞药物。
此外，通过本发明得到的胰岛素阳性细胞群可以是前药。本说明书中，前药是指移植到生物体内后分化，并变化为具有治疗疾病的功能的细胞的细胞群。
通过本发明得到的胰岛素阳性细胞群的毒性(例如，急性毒性、慢性毒性、遗传毒性、生殖毒性、心脏毒性、致癌性)较低，可以通过直接或与药学上可接受的载体等混合制成药物组合物而安全地施用于哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊、猴、人)。
3.分化培养基
本发明提供一种胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群的分化培养基，所述培养基包含CDK8/19抑制剂。
本发明的分化培养基可用于胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群的分化诱导。本发明的分化培养基可用于上述将多能干细胞分化诱导成胰岛素阳性细胞的方法中的步骤5)、或步骤6)。
本发明的分化培养基是在RPMI 1640培养基、MEM培养基、iMEM培养基、DMEM/F12培养基、改良的MEM Zinc Option培养基、改良的MEM/1％B-27/Penisilin Streptomycin培养基、MCDB131/20mM Glucose/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAXTM/抗坏血酸/PenisilinStreptomycin培养基等培养哺乳动物细胞所使用的基础培养基中以能抑制CDK8/19活性的任意量包含上述CDK8/19抑制剂而成。培养基中所包含的CDK8/19抑制剂的量如以上定义。
除了CDK8/19抑制剂之外，本发明的分化培养基进一步包含步骤5)和步骤6)分别要求的增殖因子、各种抑制剂、血清替代物、抗生素、维生素等其他因子。根据先前的报道(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，例如，可在步骤5)中使用的培养基中，以规定的量添加SANT1、视黄酸、T3、LDN、Wnt抑制药、ROCK抑制剂、FGF(优选FGF2)、血清替代物、维生素、抗生素等。此外，可在步骤6)中使用的培养基中以规定的量添加T3、LDN、γ-secretase抑制剂XX、γ-secretase抑制剂RO、N-半胱氨酸、AXL抑制剂、抗坏血酸、Wnt抑制药、ROCK抑制剂、FGF(优选FGF2)、血清替代物、维生素、抗生素、ZnSO4、肝素、N-乙酰半胱氨酸、Trolox、R428等。
本发明的分化培养基实质上不具有ALK5抑制活性。“实质上不具有ALK5抑制活性”，如上述定义那样，不只意指完全不具有ALK5抑制活性的情况，还包括对于ALK5的抑制率低于50％、优选为40％及以下、更优选为30％及以下、进一步优选为20％及以下、还进一步优选为10％及以下、特别优选为5％及以下的情况，只要满足上述定义，也可以包括具有ALK5抑制活性的化合物(例如，ALK5抑制剂II等)。
本发明的分化培养基可以以将基本培养基、CDK8/19抑制剂及上述其他因子全部合一的形式提供，或者可以以任何组合或各自分别的多个形式提供来准备制备。
以下，通过实施例对本发明进行说明，但是本发明并非仅限于这些实施例。
实施例
实施例1：ALK4抑制活性、ALK5抑制活性、CDK8抑制活性及CDK19抑制活性的评价
通过以下方法，评价作为试验化合物的二乙基(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯酰胺)苄基)膦酸酯(化合物1)、2-(4-(4-(异喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙酰胺(化合物2(BI-1347))、4-((2-(6-(4-甲基哌嗪-1-羰基)萘-2-基)乙基)氨基)喹唑啉-6-甲腈(化合物3(Senexin B)的ALK4抑制活性、ALK5抑制活性、CDK8抑制活性及CDK19抑制活性。
在激酶谱试验中，对ALK4、ALK5、CDK8及CDK19的各激酶，以0.1μM、1μM(即-Log10值7次方、6次方)添加试验化合物，测定其结合抑制活性0～100％。根据得到的2个值计算出预估pIC50，用6至8的值表示。表中的pIC50＝6意指在本测定试验中，在0.1μM、1μM中的任一添加浓度下均未显示结合抑制活性，从而认为该化合物不具有抑制活性，或只具有pIC50≤6的弱结合抑制活性。同样地，pIC50＝8意指根据0.1μM、1μM的结合抑制活性求出的预估pIC50值为8及以上，从而显示pIC50≥8的强结合活性。
对于ALK4、ALK5、CDK8及CDK19显示抑制率50％所需的各试验化合物的浓度(预估pIC50值)示于表3。
【表3】
化合物1 ALK4 ALK5 CDK8 CDK19
预估pIC50值 6 6 7.27 7.76
化合物2 ALK4 ALK5 CDK8 CDK19
预估pIC50值 6 6 8 8
化合物3 ALK4 ALK5 CDK8 CDK19
预估pIC50值 6 6 7.89 8
表中，关于预估pIC50值，“6”表示IC50≥1μM，“8”表示IC50≤10μM。
根据表3，确认了化合物1、化合物2及化合物3强力抑制CDK8及CDK19。
实施例2：用CDK8/19抑制剂对胰腺前体细胞群进行处理得到的细胞群中目标细胞(胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞)的增加
1.方法
由iPS细胞向胰腺前体细胞群的分化诱导根据上述步骤1)-4)、先前的报道(StemCell Research(2015)14，185-197)等实施。向胰岛素阳性细胞的分化诱导，根据上述步骤5)、6)等实施。
将由iPS细胞分化诱导得到的胰腺前体细胞群，与分化因子(SANT1、视黄酸、T3、LDN、Wnt抑制药、ROCK抑制剂、FGF2)一起，在以规定的浓度包含ALK5抑制剂II(10μM)或CDK8/19抑制剂(化合物1、化合物2或化合物3)、或不包含ALK5抑制剂II及CDK8/19抑制剂中任一种的分化诱导培养基(改良的MEM/1％B-27/Penisilin Streptomycin培养基)中培养2天，分化诱导成内分泌前体细胞群。
接着，与分化因子(T3、LDN、γ-secretase抑制剂RO、FGF受体1抑制剂PD-166866)一起，在以规定的浓度包含ALK5抑制剂II(10μM)或CDK8/19抑制剂(化合物1、化合物2或化合物3)、或不包含ALK5抑制剂II及CDK8/19抑制剂中任一种的分化诱导培养基(改良的MEM/1％B-27/Penisilin Streptomycin培养基)中培养7天后，根据先前的报道(NatureBiotechnology 2014；32：1121-1133)，与T3、LDN、γ-secretase抑制剂RO、N-乙酰半胱氨酸、AXL抑制剂R428、抗坏血酸、ROCK抑制剂、ZnSO4、肝素、Trolox一起，在以规定的浓度包含ALK5抑制剂II(10μM)或CDK8/19抑制剂、或不包含ALK5抑制剂II及CDK8/19抑制剂中任一种的分化诱导培养基(MCDB131/20mM Glucose/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/PenisilinStreptomycin培养基)中培养4天，分化诱导成胰岛素阳性细胞群。
通过流式细胞术对通过上述方法得到的胰岛素阳性细胞群中的胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞数量，以及胰岛素阳性且NKX6.1阴性的细胞数量进行计数，求出各细胞群中的目标细胞，即胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞率，以及目标外细胞即胰岛素阳性且NKX6.1阴性的细胞率。
2.结果
用以规定的浓度包含ALK5抑制剂II(10μM)或CDK8/19抑制剂(化合物1、化合物2或化合物3)、或不包含ALK5抑制剂II及CDK8/19抑制剂中任一种的分化诱导培养基处理时得到的胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞率，以及胰岛素阳性且NKX6.1阴性的细胞率的结果示于图1。此外，使用ALK5抑制剂II(10μM)、0.3μM的化合物1、3nM的化合物2及0.1μM的化合物3时得到的细胞群的流式细胞术的结果示于图2。
确认了在分化诱导培养基中包含CDK8/19抑制剂时，可以制造作为目标的胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞的比例大于或等于作为目标外的胰岛素阳性且NKX6.1阴性的细胞的比例的细胞群。
特别是，将0.3μM的化合物1、3nM的化合物2及0.1μM的化合物3用作CDK8/19抑制剂时，与以往使用由胰腺前体细胞群分化诱导出胰岛素阳性细胞群时一般使用的ALK5抑制剂II(10μM)时相比，可以制造作为目标的胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞比例更高的细胞群。
利用ALK5抑制剂II时，得到的细胞群中的作为目标的胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞的比例为33％左右。这意味着即使在将向培养基中加入的ALK5抑制剂II的浓度提高到30μM时，该比例也是相同程度或更低(未示出数据)。
另一方面，确认了通过在由胰腺前体细胞群分化诱导出胰岛素阳性细胞群的制造过程中，进行用CDK8/19抑制剂的处理，细胞群中的目标细胞(胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞)的比例提高到超过33％。
由以上结果可知，通过用CDK8/19抑制剂代替ALK5抑制剂II对处于由胰腺前体细胞群分化诱导出胰岛素阳性细胞群的过程中的细胞群进行处理，可以以比以往的方法更高的比例制造包含目标细胞(胰岛素阳性且NKX6.1阳性的细胞)的胰岛素阳性细胞群。

Claims (9)

1.一种制造胰岛素阳性细胞群的方法，
所述方法包括：使胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群在包含CDK8/19抑制剂的培养基中分化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述培养基实质上不具有ALK5抑制活性。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述CDK8/19抑制剂对于ALK5的IC50为1μM及以上。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，CDK8/19抑制剂为选自由二乙基(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯酰胺)苄基)膦酸酯、2-(4-(4-(异喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙酰胺、4-((2-(6-(4-甲基哌嗪-1-羰基)萘-2-基)乙基)氨基)喹唑啉-6-甲腈、4-(4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-6-基)-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇、3-(2-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基硫基)乙基)-4-(萘-1-基磺酰基)-3,4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮、及(E)-3-(4-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-N-(4-(吗啉基甲基)苯基)丙烯酰胺组成的组中的一种或多种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群是通过分化诱导多能干细胞而制造的。
6.一种胰腺前体细胞群或处于在此之后的分化阶段的细胞群的分化培养基，所述培养基包含CDK8/19抑制剂。
7.根据权利要求6所述的培养基，所述培养基实质上不具有ALK5抑制活性。
8.根据权利要求6或7所述的培养基，其中，CDK8/19抑制剂对于ALK5的IC50为1μM及以上。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的培养基，其中，CDK8/19抑制剂为选自由二乙基(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯酰胺)苄基)膦酸酯、2-(4-(4-(异喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙酰胺、4-((2-(6-(4-甲基哌嗪-1-羰基)萘-2-基)乙基)氨基)喹唑啉-6-甲腈、4-(4-(2,3-二氢苯并[b][1,4]二氧芑-6-基)-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇、3-(2-(咪唑并[1,2-b]哒嗪-6-基硫基)乙基)-4-(萘-1-基磺酰基)-3,4-二氢喹喔啉-2(1H)-酮、及(E)-3-(4-(1-环丙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-N-(4-(吗啉基甲基)苯基)丙烯酰胺组成的组中的一种或多种。
CN202180075398.3A 2020-11-20 2021-11-19 促熟剂 Pending CN116391028A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-193454 2020-11-20
JP2020193454 2020-11-20
PCT/JP2021/042557 WO2022107877A1 (ja) 2020-11-20 2021-11-19 成熟化剤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116391028A true CN116391028A (zh) 2023-07-04

Family

ID=81709097

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180075398.3A Pending CN116391028A (zh) 2020-11-20 2021-11-19 促熟剂

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20230399607A1 (zh)
EP (1) EP4249587A1 (zh)
JP (1) JPWO2022107877A1 (zh)
CN (1) CN116391028A (zh)
TW (1) TW202237818A (zh)
WO (1) WO2022107877A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023210578A1 (ja) * 2022-04-25 2023-11-02 オリヅルセラピューティクス株式会社 Ａｌｋ５阻害活性とｃｄｋ８／１９阻害活性とを有する成熟化剤

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1960657B (zh) 2004-04-10 2010-12-29 汉高两合股份公司 卷发筒
US8278104B2 (en) 2005-12-13 2012-10-02 Kyoto University Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2
MX2008007654A (es) 2005-12-13 2008-09-26 Univ Kyoto Factor de reprogramacion nuclear.
US7661738B2 (en) 2006-11-28 2010-02-16 Veritainer Corporation Radiation detection unit for mounting a radiation sensor to a container crane
WO2008124133A1 (en) 2007-04-07 2008-10-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Reprogramming of somatic cells
CN101802172A (zh) 2007-05-30 2010-08-11 通用医疗公司 由体细胞产生多能细胞的方法
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
EP2185695B1 (en) 2007-07-18 2015-02-25 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
EP2305373A1 (en) 2008-07-24 2011-04-06 Niigata University Microcapsule, process for production thereof, and food or beverage containing microcapsule
US9446168B2 (en) 2010-06-07 2016-09-20 Beta-O2 Technologies Ltd. Multiple-layer immune barrier for donor cells
US9540630B2 (en) 2008-09-17 2017-01-10 Beta O2 Technologies Ltd. Optimization of alginate encapsulation of islets for transplantation
US8598344B2 (en) 2009-11-30 2013-12-03 Senex Biotechnology CDKI pathway inhibitors and uses thereof
SG11201404596UA (en) 2012-02-02 2014-10-30 Senex Biotechnology Inc Cdk8/cdk19 selective inhibitors and their use in anti-metastatic and chemopreventative methods for cancer
NO344593B1 (no) 2012-09-10 2020-02-03 Rodeo Holding AS Balansestol
GB201220157D0 (en) 2012-11-08 2012-12-26 Selvita Sa Substitute tricyclic benzimidazoles as kinase inhibitors
RU2684215C2 (ru) * 2012-12-31 2019-04-04 Янссен Байотек, Инк. Способ получения панкреатических эндокринных клеток (варианты) и способ увеличения выхода бета-клеток
WO2014134169A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Senex Biotechnology, Inc. Inhibitors of cdk8/19 for use in treating estrogen receptor positive breast cancer
WO2015159938A1 (ja) 2014-04-18 2015-10-22 武田薬品工業株式会社 複素環化合物
JP6521387B2 (ja) 2014-04-18 2019-05-29 武田薬品工業株式会社 縮合複素環化合物
AU2015296968A1 (en) 2014-06-10 2017-02-02 University Of South Carolina Methods and compositions for treatment of HER-positive cancers
WO2016009076A1 (en) 2014-07-17 2016-01-21 Merck Patent Gmbh Novel naphthryidines and isoquinolines and their use as cdk8/19 inhibitors
JP5801979B1 (ja) 2014-07-29 2015-10-28 櫻護謨株式会社 安全弁機能を備えた結合金具
CA2957000C (en) 2014-08-04 2023-08-01 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method for proliferation of pancreatic progenitor cells
EP3233086B1 (en) 2014-12-18 2023-02-15 University of South Carolina Suppression of neointimal formation following vascular surgery using cdk8 inhibitors
RU2017142394A (ru) 2015-05-08 2019-06-10 Президент Энд Феллоус Оф Гарвард Колледж Целевой отбор пациентов для лечения производными кортистатина
JPWO2018159805A1 (ja) * 2017-03-03 2020-01-09 国立大学法人京都大学 膵前駆細胞の製造方法
US20210292708A1 (en) * 2018-08-03 2021-09-23 Kyoto University Cell production method
CA3113608A1 (en) * 2018-09-19 2020-03-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Insulin-producing cells
WO2020209389A1 (ja) * 2019-04-10 2020-10-15 国立大学法人京都大学 生体組織様構造体の製造方法
JP6952359B2 (ja) 2019-05-27 2021-10-20 株式会社サンロック 自動ドア駆動装置、自動ドア及び自動ドア監視システム

Also Published As

Publication number Publication date
EP4249587A1 (en) 2023-09-27
TW202237818A (zh) 2022-10-01
WO2022107877A1 (ja) 2022-05-27
US20230399607A1 (en) 2023-12-14
JPWO2022107877A1 (zh) 2022-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI710636B (zh) 源自多能性幹細胞之胰前驅細胞的純化法及其擴增法
CN112912490B (zh) 细胞制造方法
US20220168357A1 (en) Method for producing biological tissue-like structure
EP3081638A1 (en) Method for producing pseudo-islets
CN116391028A (zh) 促熟剂
CN111492052A (zh) 细胞的培养方法
WO2017047797A1 (ja) 膵芽細胞の製造方法
EP4293105A1 (en) Maturation agent
WO2023210578A1 (ja) Ａｌｋ５阻害活性とｃｄｋ８／１９阻害活性とを有する成熟化剤
WO2024014497A1 (ja) 細胞移植用のフィブリンゲルシート
EP3770253A1 (en) Hydrogel capsule
RU2815583C2 (ru) Способ получения биологической тканеподобной структуры
CN114929854A (zh) 增殖抑制剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination