CN115011544B - 体外诱导获得胰岛δ细胞的方法及其应用 - Google Patents

体外诱导获得胰岛δ细胞的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了体外诱导获得胰岛δ细胞的方法，培养基及其应用。

Description

体外诱导获得胰岛δ细胞的方法及其应用
技术领域
本发明属于细胞分化和再生医学领域，具体涉及胰岛δ细胞的体外诱导方法，更具体地涉及一种由干细胞分化为胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的方法。
背景技术
人胰岛主要由4种内分泌细胞构成，分别为β细胞(分泌胰岛素-Insulin)、α细胞(分泌胰高血糖素-Glucagon)、δ细胞(分泌生长抑素-SST)和PP细胞(分泌胰多肽-Peptide)。一般认为α和β细胞分泌的胰高血糖素和胰岛素共同调节人体内的血糖平衡。在机体血糖较高时，β细胞会释放胰岛素促进机体糖原物质合成，降低血糖。机体低血糖时，胰岛α细胞分泌胰高血糖素，胰高血糖素增加肝脏中葡萄糖产生(主要通过糖原分解和糖异生)来提高血糖水平。尽管δ细胞在人胰岛内分泌细胞中只占5-10％，但δ细胞可以通过调节β细胞上的特定生长抑素受体(SSTR)有效抑制胰岛素和胰高血糖素的释放。因此δ细胞可以有效抑制胰高血糖素和胰岛素的过度分泌，从而将血糖水平维持在一个狭窄的生理范围内。鉴于生长抑素在抑制胰岛素和胰高血糖素释放方面的功能，胰岛δ细胞的生理功能和胰岛δ细胞分泌的生长抑素的信号传导对攻克糖尿病的治疗都是十分有益的。
1973年Armelin等人在垂体和下丘脑的提取物中发现成纤维细胞生长因子(FGF,Fibroblast Growth Factor)。已发现的FGF家族成员被分为6个亚家族：5个旁分泌家族和1个内分泌家族。旁分泌家族分为：FGF1亚科(FGF1和FGF2)，FGF4亚科(FGF4、FGF5、FGF6)，FGF7亚科(FGF3、FGF7、FGF10、FGF22)，FGF8亚科(FGF8、FGF17、FGF18)，FGF9亚科(FGF9、FGF16、FGF20)，内分泌亚科FGF19(FGF19、FGF21、FGF23)。已有研究表明FGF通过旁分泌或内分泌方式调节多种生理活动，参与机体内的血管生成、组织修复、胚胎发育等过程，维护机体的正常生理结构。在实验室成功将人胚胎干细胞(Human Embryonic stem cell，ES)体外分化为胰岛δ细胞的基础上，研究不同亚科FGF对胰岛δ细胞分化的影响对于如何将人胚胎干细胞分化为胰岛δ细胞具有重大意义。
发明内容
本发明提供了在体外诱导分化得到胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的方法，具体提供了一种将胚胎干细胞在体外诱导分化得到胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的方法。本发明首先将胚胎干细胞分化形成定型内胚层细胞，之后分化形成胰腺前体细胞，再分化形成胰腺内分泌细胞，最后分化形成成熟的胰岛δ细胞。本发明的体外诱导方法简单易行。
第一方面，本发明提供了体外诱导获得胰岛δ细胞的方法，所述方法包括：
(1)获得胰腺前体细胞的步骤，
(2)培养胰腺前体细胞获得胰腺内分泌细胞的步骤，以及
(3)培养胰腺内分泌细胞获得胰岛δ细胞的步骤，
任选地，步骤(2)包括利用添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基培养。
在一些实施方式中，步骤(1)中，胰腺前体细胞通过培养干细胞获得，优选地，所述干细胞选自多能干细胞、胰腺干细胞、成体干细胞或胚胎干细胞；优选地，所述干细胞选自人源干细胞。
在一些实施方案中，步骤(1)包括利用添加成纤维细胞生长因子FGF7的培养基培养。在一些实施方案中，所述成纤维细胞生长因子FGF7的浓度在10-200ng/ml的范围内，例如可以为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、150ng/ml、180ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值。
在一些实施方案中，步骤(2)和/或步骤(3)中，培养胰腺前体细胞获得胰腺内分泌细胞的培养基中不添加成纤维细胞生长因子FGF，优选地，步骤(2)中，在含有选自视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂、Alk5抑制剂、ZnSO4、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ-分泌酶抑制剂、重组人β细胞素(Human RecombinantBetacellulin)、肝素(Heparin)、Axl抑制剂和N-乙酰基-L-半胱氨酸中的至少一种组分的培养基中培养胰腺前体细胞得到胰腺内分泌细胞；步骤(3)中，在含有三碘甲状腺原氨酸(T3)、肝素(Heparin)、ZnSO4、(±)-α-生育酚的培养基中培养胰腺内分泌细胞得到胰岛δ细胞。优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E，所述Axl抑制剂选自R428。
在一些实施方案中，步骤(2)中，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科、FGF4亚科、FGF7亚科、FGF8亚科、FGF9亚科或FGF19亚科中的至少一种FGF，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF7亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF7和/或FGF10，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF和选自FGF7亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2和FGF7，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF4亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF4，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF9亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF9，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF8亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF8，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF19亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF21，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF2的浓度在2-100ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF4的浓度在100-400ng/ml的范围内，例如可以为100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml或它们之间的任意值，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF7的浓度在2-200ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、150ng/ml、180ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值，优选为50ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF10的浓度50-200ng/ml的范围内，例如可以为50ng/ml、70ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、130ng/ml、150ng/ml、170ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF8的浓度在2-100ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF9的浓度在50-200ng/ml的范围内，例如可以为50ng/ml、70ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、130ng/ml、150ng/ml、170ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF21的浓度在50-100ng/ml的范围内，例如可以为50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF2的浓度在2-100ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，并且FGF7的浓度在2-200ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、150ng/ml、180ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值。
在一些实施方案中，步骤(1)通过培养干细胞获得胰腺前体细胞。在一些实施方案中，所述步骤(1)包括培养干细胞获得定型内胚层细胞的步骤，以及依次在S2培养基和S3培养基中培养所述定型内胚层细胞获得胰腺前体细胞的步骤，其中，所述S2培养基和/或S3培养基中含有成纤维细胞生长因子FGF7；
优选地，所述S2培养基为在基础培养基中添加成纤维细胞生长因子FGF7的培养基；
优选地，所述S3培养基为在基础培养基中添加成纤维细胞生长因子FGF7、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂和rho激酶抑制剂的培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632。
在一些实施方案中，所述步骤(2)包括依次在S4培养基、S5培养基和S6培养基中培养所述胰腺前体细胞，获得胰腺内分泌细胞的步骤，其中S4培养基和/或S5培养基中含有所述成纤维细胞生长因子FGF，
优选地，所述S4培养基为在基础培养基中添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂和Alk5抑制剂的培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，
优选地，所述S5培养基为在基础培养基中添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、ZnSO4、Alk5抑制剂、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ-分泌酶抑制剂、重组人β细胞素(Human Recombinant Betacellulin)和肝素(Heparin)的培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E，
优选地，所述S6培养基为在基础培养基中添加BMP 1型受体抑制剂、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ-分泌酶抑制剂、肝素(Heparin)、Axl抑制剂、N-乙酰基-L-半胱氨酸和ZnSO4的培养基，优选地，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E，所述Axl抑制剂选自R428。
在一些实施方案中，所述定型内胚层细胞具有SOX17基因和FOXA2基因的表达；和/或，所述胰腺前体细胞具有PDX1基因的表达；和/或，所述胰腺内分泌细胞具有CHGA基因的表达；和/或，所述胰岛δ细胞具有SST基因的表达。
在一些实施方案中，所述方法包括：
(1)获得胰腺前体细胞的步骤：
(1-1)利用添加重组人激活素-A(Activin A)和WNT激动剂的S1培养基培养干细胞，获得定型内胚层细胞；优选地，利用S1培养基培养3天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5％CO2，36-38℃；优选地，WNT激动剂选自ChiR99021；
(1-2)利用添加成纤维细胞生长因子FGF7的S2培养基培养步骤(1-1)得到的定型内胚层细胞；优选地，利用S2培养基培养2天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5％CO2，36-38℃；
(1-3)利用添加成纤维细胞生长因子FGF7、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂的S3培养基培养步骤(1-2)得到的细胞，获得胰腺前体细胞；优选地，利用S3培养基培养1-2天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5％CO2，36-38℃；优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632；
(2)培养胰腺前体细胞获得胰腺内分泌细胞的步骤：
(2-1)利用添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂和Alk5抑制剂的S4培养基培养步骤(1-3)得到的胰腺前体细胞；优选地，利用S4培养基培养3天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5％CO2，36-38℃；优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ；
(2-2)利用添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、ZnSO4、Alk5抑制剂、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ-分泌酶抑制剂、重组人β细胞素(Human Recombinant Betacellulin)、肝素(Heparin)的S5培养基培养步骤(2-1)得到的细胞；优选地，利用S5培养基培养3天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5％CO2，36-38℃；优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E；
(2-3)利用添加BMP 1型受体抑制剂、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ-分泌酶抑制剂、肝素、Axl抑制剂、N-乙酰基-L-半胱氨酸、ZnSO4的S6培养基中培养步骤(2-2)得到的细胞，获得胰腺内分泌细胞；优选地，利用S6培养基培养5天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5％CO2，36-38℃；优选地，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E，所述Axl抑制剂选自R428；
(3)培养胰腺内分泌细胞获得胰岛δ细胞的步骤：
利用添加三碘甲状腺原氨酸(T3)、肝素(Heparin)、ZnSO4、(±)-α-生育酚的S7培养基中培养步骤(2-3)得到的胰腺内分泌细胞，获得胰岛δ细胞，优选地，利用S7培养基培养14-21天，每24-48小时更换一次培养基，培养条件为5％CO2，36-38℃。
在一些实施方案中，所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞，优选为人胚胎干细胞H1或人胚胎干细胞H9。
第二方面，本发明提供了由第一方面所述的方法获得的胰岛δ细胞。
第三方面，本发明提供了用于胚胎干细胞体外诱导获得胰岛δ细胞的培养基，所述培养基包括添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基。
在一些实施方案中，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科、FGF4亚科、FGF7亚科、FGF8亚科、FGF9亚科或FGF19亚科中的至少一种FGF，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF7亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF7和/或FGF10，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF和选自FGF7亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2和FGF7，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF4亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF4，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF9亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF9，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF8亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF8，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF19亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF21，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF2的浓度在2-100ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF4的浓度在100-400ng/ml的范围内，例如可以为100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml或它们之间的任意值，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF7的浓度在2-200ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、150ng/ml、180ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值，优选为50ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF10的浓度50-200ng/ml的范围内，例如可以为50ng/ml、70ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、130ng/ml、150ng/ml、170ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF8的浓度在2-100ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF9的浓度在50-200ng/ml的范围内，例如可以为50ng/ml、70ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、130ng/ml、150ng/ml、170ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF21的浓度在50-100ng/ml的范围内，例如可以为50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF2的浓度在2-100ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，并且FGF7的浓度在2-200ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、150ng/ml、180ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值。
在一些实施方案中，所述培养基还包括添加成纤维细胞生长因子FGF7的培养基。优选地，所述添加成纤维细胞生长因子FGF7的培养基中，所述成纤维细胞生长因子FGF7的浓度在10-200ng/ml的范围内，例如可以为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、150ng/ml、180ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值。
在一些实施方案中，所述培养基包括：
添加成纤维细胞生长因子FGF7的S2培养基，
添加成纤维细胞生长因子FGF7、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂和rho激酶抑制剂的S3培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，
添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂和Alk5抑制剂的S4培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，和
添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、ZnSO4、Alk5抑制剂、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ-分泌酶抑制剂、重组人β细胞素(HumanRecombinant Betacellulin)和肝素(Heparin)的S5培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E。
在一些实施方案中，所述培养基还包括：
添加重组人激活素-A(Activin A)和WNT激动剂的S1培养基，优选地，WNT激动剂选自ChiR99021，
添加所述成纤维细胞生长因子FGF、BMP 1型受体抑制剂、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ-分泌酶抑制剂、肝素(Heparin)、Axl抑制剂、N-乙酰基-L-半胱氨酸和ZnSO4的S6培养基，优选地，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E，所述Axl抑制剂选自R428，和
添加三碘甲状腺原氨酸(T3)、肝素(Heparin)、ZnSO4和(±)-α-生育酚的S7培养基。
在一些实施方案中，所述S1培养基、S2培养基、S3培养基、S4培养基、S5培养基、S6培养基和S7培养基分别还包括：以IMDM培养基、F12培养基、BLAR培养基、MCDB131培养基中的至少一种作为基础培养基，以及选自牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖(Glucose)、碳酸氢钠(NaHCO3)、维生素C(Vitamin C)、谷氨酰胺(GlutaMAX)、青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)中的至少一种成分。在一些实施方案，所述基础培养基为MCDB131培养基。
优选地，所述牛血清白蛋白(BSA)的浓度范围为5-20mg/ml，葡萄糖(Glucose)的浓度范围为10-20mM，碳酸氢钠(NaHCO3)的浓度范围为1-3mg/ml，维生素C(Vitamin C)的浓度范围为0-0.5mM，谷氨酰胺(GlutaMAX)的浓度范围为(1：100)，青链霉素的浓度范围为0.5-1.5％、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)的浓度范围为(1：200)-(1：50000)。第四方面，本发明提供了用于胚胎干细胞体外诱导获得胰岛δ细胞的试剂盒，所述试剂盒包括添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基。
在一些实施方案中，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科、FGF4亚科、FGF7亚科、FGF8亚科、FGF9亚科或FGF19亚科中的至少一种FGF，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF7亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF7和/或FGF10，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF和选自FGF7亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2和FGF7，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF4亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF4，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF9亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF9，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF8亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF8，
优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF19亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF21，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF2的浓度在2-100ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF4的浓度在100-400ng/ml的范围内，例如可以为100ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml或它们之间的任意值，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF7的浓度在2-200ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、150ng/ml、180ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值，优选为50ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF10的浓度50-200ng/ml的范围内，例如可以为50ng/ml、70ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、130ng/ml、150ng/ml、170ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF8的浓度在2-100ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF9的浓度在50-200ng/ml的范围内，例如可以为50ng/ml、70ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、130ng/ml、150ng/ml、170ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF21的浓度在50-100ng/ml的范围内，例如可以为50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，优选为100ng/ml，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF2的浓度在2-100ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml或它们之间的任意值，并且FGF7的浓度在2-200ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、150ng/ml、180ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值。
在一些实施方案中，所述培养基还包括添加成纤维细胞生长因子FGF7的培养基。优选地，所述添加成纤维细胞生长因子FGF7的培养基中，所述成纤维细胞生长因子FGF7的浓度在10-200ng/ml的范围内，例如可以为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、150ng/ml、180ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值。
在一些实施方案中，所述培养基包括：
添加成纤维细胞生长因子FGF7的S2培养基，
添加成纤维细胞生长因子FGF7、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂和rho激酶抑制剂的S3培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，
添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂和Alk5抑制剂的S4培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，和
添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、ZnSO4、Alk5抑制剂、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ-分泌酶抑制剂、重组人β细胞素(HumanRecombinant Betacellulin)和肝素(Heparin)的S5培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E。
在一些实施方案中，所述培养基还包括：
添加重组人激活素-A(Activin A)和WNT激动剂的S1培养基，优选地，WNT激动剂选自ChiR99021，
添加所述成纤维细胞生长因子FGF、BMP 1型受体抑制剂、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ-分泌酶抑制剂、肝素(Heparin)、Axl抑制剂、N-乙酰基-L-半胱氨酸和ZnSO4的S6培养基，优选地，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E，所述Axl抑制剂选自R428，和
添加三碘甲状腺原氨酸(T3)、肝素(Heparin)、ZnSO4和(±)-α-生育酚的S7培养基。
在一些实施方案中，所述S1培养基、S2培养基、S3培养基、S4培养基、S5培养基、S6培养基和S7培养基分别还包括：以IMDM培养基、F12培养基、BLAR培养基、MCDB131培养基中的至少一种作为基础培养基，以及选自牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖(Glucose)、碳酸氢钠(NaHCO3)、维生素C(Vitamin C)、谷氨酰胺(GlutaMAX)、青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)中的至少一种成分。在一些实施方案，所述基础培养基为MCDB131培养基。
优选地，所述牛血清白蛋白(BSA)的浓度范围为5-20mg/ml，葡萄糖(Glucose)的浓度范围为10-20mM，碳酸氢钠(NaHCO3)的浓度范围为1-3mg/ml，维生素C(Vitamin C)的浓度范围为0-0.5mM，谷氨酰胺(GlutaMAX)的浓度范围为(1：100)-(1:50000)，青链霉素的浓度范围为0.5-1.5％、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)的浓度范围为(1：200)-(1：50000)。
在第五方面，本发明提供了第一方面的方法，第二方面的胰岛δ细胞，第三方面的培养基在将胚胎干细胞体外诱导分化为胰岛δ细胞，或在制备或筛选用于治疗糖尿病、胰腺癌或胰岛相关疾病的药物中的用途。
具体实施方式
本发明的目的是在体外诱导分化得到胰腺前体细胞及胰岛δ细胞，具体地，是将人胚胎干细胞在体外分化为胰腺前体细胞及胰岛δ细胞。本发明首先将人胚胎干细胞分化形成定型内胚层细胞，之后分化形成胰腺前体细胞，再分化形成胰腺内分泌细胞，最后分化形成成熟的胰岛δ细胞。在这一过程中，检测SOX17、FOXA2、PDX1、CHGA、SST以及HHEX的基因表达，从而确定各时期细胞发育状态。
本发明提供的由人胚胎干细胞分化为胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的分化方法的具体实施步骤为：
1)人胚胎干细胞分化为胰腺前体细胞
1.1)人胚胎干细胞分化为定型内胚层细胞
S1培养基将人胚胎干细胞分化为定型内胚层细胞。
S1培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、5mg/ml BSA、10-20mM Glucose、1.5mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1：100)、1％青链霉素、100ng/ml ActivinA、0.1-3μM ChiR99021、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:50000)，S1培养基共培养3天，每24小时更换一次培养基。
1.2)定型内胚层细胞分化为胰腺前体细胞
S2培养基分化2天，S2培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、5mg/ml BSA、10-20mM Glucose、1.5mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1：100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:50000)、10-200ng/ml FGF7，每24小时更换一次培养液。
S3培养基分化2天，S3培养基内容为：
以MCDB131培养基为基础、20mg/ml BSA、10-20mM Glucose、2.5mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1:100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:200)、10-200ng/ml FGF7、0.05-2μM RA(视黄酸)、0.25μM SANT1、100nM LDN193189、100-500nM PDBU、10μM Y27632，每24h更换一次培养液。
S2培养基和S3培养基共分化4天，将定型内胚层细胞分化为胰腺前体细胞。
2)胰腺前体细胞分化为胰岛δ细胞
2.1)胰腺前体细胞分化为胰腺内分泌细胞
S4培养基培养3天，S4培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、20mg/ml BSA、10-20mM Glucose、2.5mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1:100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:200)、0.05-2μM RA(视黄酸)、0.25μM SANT1、100nM LDN193189、100-500nM PDBU、10μM Y27632、10μM ALK5iⅡ，每24h更换一次培养液。
S5培养基培养3天，S5培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、20mg/ml BSA、10-20mM Glucose、1.75mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1:100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:200)、0.05-2μM RA(视黄酸)、0.25μM SANT1、100nM LDN193189、10μM ZnSO4、10μM ALK5iⅡ、1μM T3、0.1-1μM compound E、20ng/mlHuman Recombinant Betacellulin、10μg/ml Heparin，每24h更换一次培养液。
S6培养基培养5天，S6培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、20mg/ml BSA、10-20mM Glucose、1.5mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1:100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:200)、100nM LDN193189、1μM T3、0.1-1μMcompound E、10μg/ml Heparin、2μM R428、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM ZnSO4，每24h更换一次培养液。
S4培养基、S5培养基和S6培养基共培养11天，将胰腺前体细胞分化为胰腺内分泌细胞。
2.2)胰腺内分泌细胞分化为胰岛δ细胞
S7培养基将胰腺内分泌细胞分化为胰岛δ细胞，S7培养基共分化14天。S7培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、20mg/ml BSA、10-20mM Glucose、1.5mg/ml NaHCO3、GlutaMAX(1:100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:200)、1μM T3、10μg/ml Heparin、10μM ZnSO4、10μM(±)-α-生育酚，每24h更换一次培养液。
通过以此上分化方式(参见图1)，可获得9.1％的胰岛δ细胞(参见图4)。
本发明在S1培养基培养结束后检测SOX17基因和FOXA2基因表达，鉴定人胚胎干细胞是否分化形成定型内胚层细胞；在S3培养基培养结束后检测PDX1基因表达，鉴定细胞是否分化形成胰腺前体细胞；胰腺前体细胞经S4培养基、S5培养基和S6培养基培养结束后检测CHGA和SST的mRNA表达，同时收获蛋白样品检测HHEX的表达，鉴定是否分化为胰腺内分泌细胞(包括胰岛δ细胞)；胰腺内分泌细胞经S7培养基培养14天后检测SST蛋白表达，鉴定细胞是否分化形成胰岛δ细胞。
本发明在确定一种胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的分化方法后，在胰腺前体细胞至胰腺内分泌细胞阶段不断尝试FGF家族不同亚科对胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞分化效率的影响。研究发现，在S4培养基和S5培养基中加入一定浓度的FGF1亚科或FGF4亚科或FGF7亚科或FGF9亚科或FGF1亚科和FGF7亚科混合使用可以提高胰腺前体细胞至胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率；在S4培养基和S5培养基中加入一定浓度的FGF8亚科或FGF19亚科小分子可以增加胰腺前体细胞至胰腺内分泌细胞的分化效率，但不能增加胰岛δ细胞的分化效率。
根据上述方法，改变S2培养基和S3培养基中FGF7浓度，影响定型内胚层细胞分化为胰腺前体细胞的分化效率。
根据上述方法，在S4培养基和S5培养基中添加FGF7，FGF7提高胰腺前体细胞分化为胰腺内分泌细胞的分化效率。
根据上述方法，在S4培养基和S5培养基中添加FGF7，FGF7提高胰腺前体细胞分化为胰岛δ细胞的分化效率。
根据上述方法，在S4培养基和S5培养基中添加FGF10，FGF10提高胰腺前体细胞分化为胰腺内分泌细胞的分化效率。
根据上述方法，在S4培养基和S5培养基中添加FGF10，FGF10提高胰腺前体细胞分化为胰岛δ细胞的分化效率。
根据上述方法，在S4培养基和S5培养基中添加FGF2，FGF2提高胰腺前体细胞分化为胰岛δ细胞的分化效率。
根据上述方法，在S4培养基和S5培养基中添加FGF7和FGF2，FGF2+FGF7配合使用提高胰腺前体细胞分化为胰岛δ的分化效率。
根据上述方法，在S4培养基和S5培养基中添加FGF4，FGF4影响胰腺前体细胞分化为胰岛δ细胞的分化效率。
根据上述方法，在S4培养基和S5培养基中添加FGF9，FGF9提高胰腺前体细胞分化为胰岛δ细胞的分化效率。
根据上述方法，在S4培养基和S5培养基中添加FGF8，FGF8影响胰腺前体细胞分化为胰岛δ细胞的分化效率。
根据上述方法，在S4培养基和S5培养基中添加FGF10，FGF10影响胰腺前体细胞分化为胰岛δ细胞的分化效率。
根据上述方法，在S4培养基和S5培养基中添加FGF21，FGF21影响胰腺前体细胞分化为胰岛δ细胞的分化效率。
名词解释：
本文所用的术语“胚胎干细胞”包含分离的胚胎干细胞、原代胚胎干细胞或其群或细胞系建立的细胞系。其包括处于非分化形式或处于分化形式的胚胎干细胞，也含胚胎干细胞的祖先，其细胞系或包含该未分化的或分化的胚胎干细胞的细胞群。任选地，所述胚胎干细胞被遗传修饰，例如被突变。本文所用的胚胎干细胞可以为任何哺乳动物的胚胎干细胞，包括和不限于啮齿目(如小鼠和大鼠)，兔形目(兔子)、食肉目(猫科动物和犬科动物)、偶蹄目(牛科动物和猪科动物)、奇蹄目(马科动物)，或为灵长目和猿猴亚目(人或猴)。所述哺乳动物优选为人或小鼠。本文所用的术语“人胚胎干细胞”为具有较强的自我更新能力并且能分化为不同类型的体细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞表达下列标记物：HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。
胰腺前体细胞是指定形内胚层谱系中表达NGN3并可进一步分化为内分泌系统细胞(例如胰岛素表达细胞)的多能细胞。与较少特异性分化的定形内胚层细胞(如PDX1阳性胰腺内胚层细胞)相比，胰腺前体细胞无法分化成与其一样多的不同细胞、组织和/或器官类型。
胰腺内分泌细胞是指能够表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽等激素中至少一种的细胞，其包括β细胞(分泌胰岛素-Insulin)、α细胞(分泌胰高血糖素-Glucagon)、δ细胞(分泌生长抑素-SST)和PP细胞(分泌胰多肽-Peptide)。一般认为α和β细胞分泌的胰高血糖素和胰岛素共同调节人体内的血糖平衡。在机体血糖较高时，胰岛β细胞会释放胰岛素促进机体糖原物质合成，降低血糖。机体低血糖时，胰岛α细胞分泌胰高血糖素，胰高血糖素增加肝脏中葡萄糖产生(主要通过糖原分解和糖异生)来提高血糖水平。尽管胰岛δ细胞在人胰岛内分泌细胞中只占5-10％，但δ细胞可以通过调节β细胞上的特定生长抑素受体(SSTR)有效抑制胰岛素和胰高血糖素的释放。
通过检测SOX17基因和FOXA2基因表达可以确定是否形成定型内胚层细胞；通过检测PDX1基因表达可以确定是否形成胰腺前体细胞；通过检测CHGA基因表达，可以确定是否形成胰腺内分泌细胞；通过检测HHEX蛋白可以确定胰岛δ细胞的分化、发育情况；通过检测SST基因表达可以确定形成胰岛δ细胞。
SOX17基因，是编码SOX转录因子家族的成员，该家族编码的转录因子参与胚胎发育的调节和细胞命运的确定。除此之外，SOX17是定形内胚层正常发育所必需的。
FOXA2基因，该基因是编码叉头类DNA结合蛋白的成员，参与肝脏、胰腺和肺等多个内胚层衍生器官系统的发育。
PDX1基因，该基因编码的蛋白质是几种基因的转录激活因子，包括胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、胰岛淀粉样多肽和2型葡萄糖转运蛋白。编码的核蛋白参与胰腺的早期发育，并在胰腺的早期发育中起主要作用。该基因的缺陷是胰腺发育不全的一个原因，这可能导致早发性胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，以及年轻的4型糖尿病。
CHGA基因，该基因编码的蛋白质是神经内分泌分泌蛋白嗜铬粒蛋白/分泌粒蛋白家族的成员，它存在于神经元和内分泌细胞的分泌囊泡中。该基因产物是三种生物活性肽的前体：血管抑素、胰抑素和副抑素。这些肽充当神经内分泌系统的自分泌或旁分泌负调节剂。
SST基因，该基因编码的蛋白质是生长抑素，具有14aa和28aa两种活性形式。生长抑素在全身表达，并通过与高亲和力G蛋白偶联的生长抑素受体结合来抑制多种次级激素的释放。这种激素通过与垂体生长激素、促甲状腺激素和大多数胃肠道激素的相互作用而成为内分泌系统的重要调节剂。在胰岛细胞中由胰岛δ细胞特异性表达。已有研究表明SST的表达影响胰岛α、β对胰高血糖素和胰岛素的释放。
HHEX基因，该基因编码的转录因子成员许多被认为参与发育过程。近期有相关文献表明该基因在胰腺分化过程中在胰岛δ细胞中特异性表达。该基因的表达可能与胰岛δ细胞的发育、成熟相关，该基因表达失调可能破坏胰岛素旁分泌机制进而引起糖尿病。
FGF是成纤维细胞生长因子(FGF,Fibroblast Growth Factor)。已发现的FGF家族成员分为6个亚家族：5个旁分泌家族和1个内分泌家族。旁分泌家族分为：FGF1亚科(包括FGF1和FGF2)，FGF4亚科(包括FGF4、FGF5、FGF6)，FGF7亚科(包括FGF3、FGF7、FGF10、FGF22)，FGF8亚科(包括FGF8、FGF17、FGF18)，FGF9亚科(包括FGF9、FGF16、FGF20)，内分泌亚科FGF19(包括FGF19、FGF21、FGF23)。
MCDB131培养基最初是由研究员Knedler和Ham研发而来，用来在低蛋白和无血清的条件下培养人微血管内皮细胞(HMVEC)，后用于此类细胞和其他类型的细胞(例如肝、平滑肌、心肌细胞)。它属于为多种哺乳动物细胞提供明确的最佳营养环境的MCDB培养基的一种。
以下所述的是本发明的优选实施方案，本发明所保护的不限于以下优选实施方案。应当指出，对于本领域的技术人员来说在此发明创造构思的基础上，做出的若干变形和改进，都属于本发明的保护范围。所用试剂未注明生产商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
附图说明
图1显示了根据本申请的人胚胎干细胞分化为胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的分化示意图。
图2显示了根据本申请的人胚胎干细胞分化为胰岛δ细胞过程中的细胞形态，其中A为未分化的人胚胎干细胞，B为定型内胚层细胞，C为胰腺前体细胞，D为胰腺内胚层细胞，E为胰岛δ细胞。
图3显示了根据本申请实施例1的人胚胎干细胞分化过程中的各阶段特征性基因的mRNA表达。
图4显示了根据本申请实施例1的胰岛δ细胞表达SST蛋白结果(9.1％)。
图5显示了根据本申请实施例2的实验组(FGF2)与对照组的SST基因和CHGA基因的mRNA表达。
图6显示了根据本申请实施例2的实验组(FGF2)与对照组的SST的蛋白表达结果(对照组9.1％，实验组18.2％)。
图7显示了根据本申请实施例2的实验组(FGF2)与对照组的SST的HHEX蛋白表达。
图8显示了根据本申请实施例3的实验组(FGF4)与对照组的SST基因和CHGA基因的mRNA表达。
图9显示了根据本申请实施例4的实验组(FGF7)与对照组的SST基因和CHGA基因的mRNA表达。
图10显示了根据本申请实施例4的实验组(FGF7)与对照组的SST蛋白表达结果(对照组9.1％，实验组19.3％)。
图11显示了根据本申请实施例4的实验组(FGF7)与对照组的HHEX蛋白表达。
图12显示了根据本申请实施例5的实验组(FGF8)与对照组的SST基因和CHGA基因的mRNA表达。
图13显示了根据本申请实施例6的实验组(FGF9)与对照组的SST基因和CHGA基因的mRNA表达。
图14显示了根据本申请实施例7的实验组(FGF21)与对照组的SST基因和CHGA基因的mRNA表达。
图15显示了根据本申请实施例8的实验组(FGF2+FGF7)与对照组的SST基因和CHGA基因的mRNA表达。
图16显示了根据本申请实施例8的实验组(FGF2+FGF7)与对照组的SST蛋白表达结果(对照组9.1％，实验组22.6％)。
图17显示了根据本申请实施例8的实验组(FGF2+FGF7)与对照组的HHEX蛋白表达。
图18显示了根据本申请实施例9的实验组(FGF10)与对照组的SST基因和CHGA基因的mRNA表达。
实施例
仪器设备:
生物安全柜(Thermo Fisher，1389)、荧光倒置显微镜(尼康，TS2-FL)、CO2培养箱(Thermo Fisher，HERAcell150i)、离心机(湘仪，L600-A)、冷冻切片机(瑞沃德，FS800)、Zeiss LSM800、QPCR仪(Bio-rad，CFX-96)、PCR仪(Bio-rad，T-100)、流式细胞仪(BDFACSAria Fusion)、摇床(其林贝尔，ZD-2008)、医用低温冰箱(海尔DW-25L262)
试剂：
MCDB131(Thermo Fisher,10372019)、TRYPLE(Thermo Fisher,12605028)、GentleCell Dissociation Reagent(Stemcell，100-0485)、mTeSR1(Stemcell，85850)、Matrigrl(Corning,354277)、DPBS(Thermo Fisher,14190250)、Glucose(Sigma,G7528)、NaHCO3(Sigma,S6014)、ZnSO4(Sigma,1088830500)、BSA(Proliant，68700)、Ascorbic acid(Sigma，A4544)、GlutaMAX(invitrogen，35050079)、青链霉素(Thermo Fisher，15140122)、ITS-X(invitrogen，51500056)、Activin A(stemcell，78001.2)、CHIR99021(Stemgent，04-0004-10)、FGF7(stemcell，78046.2)、SANT-1(Sigma，S4572)、LDN 193189(MCE，HY-12071)、PDBU(Millipore，524390)、Y27632(MCE，HY-10583)、ALK5-InhibitorⅡ(CGS，SM09-50)、T3(Millipore，64245)、RA视黄酸(sigma，R2625)、Compound E(MCE，HY-14176)、HumanRecombinant Betacellulin(Stemcell，78105)、Heparin(Millipore，H3149-500KU-9)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(sigma，A9165)、(±)-α-生育酚(sigma，T3251)、R428(Selleck，S2841)、FGF2(MCE，HY-P70529)、FGF4(MCE，HY-P7014)、FGF8(MCE，HY-P7346)、FGF9(MCE，HY-P7352)、FGF21(MCE，HY-P7012)、TB Green Premix Ex Taq(TAKARA,RR820)、Maxima HMinus Reverse Transcriptase(Thermo Fisher,EP0752)、Random(Thermo Fisher,SO142)、Oligo(Thermo Fisher，SO132)、dNTP(Thermo Fisher，RO192)、RiboLock RNase(Thermo Fisher，EO0381)、RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit(AXGEN，74106)、RNase-FreeDNase Set(AXGEN，79256)、96孔QPCR反应板(Bio-rad，HSP9655)、4％多聚甲醛固定液(BBI，E672002-0500)、OCT冷冻切片包埋剂(Biosharp,BL557A)、Triton X-100(Diamond，A110694-0500)、Donkey serum(abcam,ab63507)、抗淬灭封片剂(ACMEC，AS2100)、Donkeyanti-Rat Secondary Antibody Alexa Fluor 488(Invitrogen，A21208)、Anti-Rat-somatostatin(Abcam，ab30788)、Hoechst 33342(Thermo Fisher，62249)、QuickBlockWestern封闭液(金斯瑞，P0252)、Western一抗稀释液(金斯瑞，P0023A)、Sure-PAGE(金斯瑞，M00660)、Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder(金斯瑞，M00138)、Transfer BufferPowder(金斯瑞，M00139)、Mouse-Monoclonal Antibody-HHEX(R&D,MAB83771)、Goat anti-mouse lgG(H+L)(Proteintech,SA00001-1)、Rabbit-Monoclonal antibody-α-Tubulin(R&D,MAB9344)、Goat-anti-rabbit lgG(H+L)(Proteintech,SA0001-2)、BeyoECL Plus显影液(Beyotime,P0018M)、RIPA(Beyotime，P0013B)。
本发明中细胞培养所处的培养条件均为37℃，5％CO2，此后不再赘述。本发明中使用到的试剂、仪器均为商品化，市场可以购买。
检测方法：
分化过程中每个分化阶段的最后一天收获分化细胞样品，QPCR检测特征基因mRNA表达水平，免疫荧光技术检测特征性基因蛋白表达水平，蛋白免疫印迹实验检测目的蛋白的表达水平。下面将分别描述RNA提取、RNA转录、QPCR实验、免疫荧光染色、蛋白免疫印迹实验在本发明中的操作。本发明中涉及的实验方法均与下述描述相同，下述会多次涉及这些实验，具体过程不再具体描述。
(I)收获RNA并进行QPCR
a.RNA提取：
RNA提取过程使用到的试剂均包含在商品化RNA提取试剂盒中。
弃去培养板中的培养液，DPBS清洗一遍，弃去清洗液。24孔板每孔加入500μlTrypLE消化液，培养箱中孵育7分钟左右。镜下观察到90％左右的细胞呈光亮透明状，加入1ml此阶段培养基终止消化。吹打均匀，1.5ml离心管收集细胞，1450rpm离心5分钟。弃上清，加入1ml DPBS，轻轻混匀。1450rpm离心5分钟，弃上清。加入600μl裂解液(Buffer RLT+β-ME)，上下颠倒混匀4-6次，静置5分钟。
在上述样品中加入等体积(600μl)70％无水乙醇，充分混匀。
将上一步液体转移入RNA提取试剂盒过滤柱中，12000rpm离心1分钟。每次转移600μl，分两次转移。
弃去上一步离心的滤液，在过滤柱中加入350μl洗液RW1，12000rpm离心1分钟。
弃去上一步离心的滤液，在过滤柱中加入80μl DNA消化液(RNA提取试剂盒中的10μl DNaseⅠ+70μl buffer)，室温静置20分钟，消化提取细胞中的DNA。
静置结束后加入350μl RW1洗液，12000rpm离心1分钟，弃滤液。
在过滤柱中加入700μl RW1洗液，12000rpm离心1分钟，弃滤液。
在过滤柱中加入500μl RW2洗液，12000rpm,离心1分钟，弃滤液。
在过滤柱中加入500μl RW2洗液，12000rpm,离心1分钟，弃滤液。
将过滤柱放回试剂盒提供的收集管中，12000rpm离心2分钟。将过滤柱放置到一个新的收集管中。
在收集管中加入60μl RNase Free H2O，静置5分钟。
将过滤柱与新的收集管放置一起，12000rpm离心3分钟。收集管中的液体即为提取的RNA溶液。
b.CDNA转录
将上一步收获的RNA按照下表1依次添加到0.2ml离心管中。
表1
轻轻混匀，瞬时离心后在PCR仪上65℃加热5分钟。加热结束后瞬时离心，放置在冰上静置3分钟。
将下表2引物依次加入到上述0.2ml离心管中(在冰上完成此步操作)。
表2
将混合后的液体在PCR仪上加热反应，反应程序为25℃10分钟，50℃1小时，85℃5分钟。
所得产物即为提取的RNA反转录CDNA产物。
c.QPCR
将得到的CDNA按照如下表3的顺序在冰上完成QPCR反应液配制：
表3
反应液配制完成后在QPCR仪上完成QPCR反应，反应程序为95℃,30s进行预变性，95℃5s，60℃30s，进行40个循环。
QPCR反应体系及流程按照(TAKARA,RR820)试剂说明书执行。
本实验中QPCR的数据处理方式为▲▲CT法，差异性分析标准为：*表示差异显著，p<0.05；**表示差异极显著，p<0.001；***表示差异极极显著，p<0.0001；****表示差异极极极显著，p<0.00001
QPCR反应使用的引物序列如下表4所示：
表4 QPCR引物序列
(II)免疫荧光染色实验
免疫荧光染色主要的目的是通过抗原抗体特异性结合，将特征性蛋白通过荧光显示出来。
荧光染色的具体步骤如下：
1.首先将细胞连同培养板30°倾斜5分钟，使悬浮的细胞沉于培养板底部。随后用200μl枪头吸取悬浮细胞转移至1.5ml离心管中，弃上清。加入1ml DPBS轻轻混匀，静置5分钟，弃上清。加入1ml 4％PFA(多聚甲醛固定液)，静置30分钟固定。静置结束后弃上清，在样品中加入1ml DPBS，放入4℃备用。
2.弃去样品中的DPBS，加入1ml 30％蔗糖(30ml DPBS+9g蔗糖)，4℃静置2小时脱去细胞中的水分。从蔗糖溶液中吸取悬浮细胞，加入OCT，放入-80℃中速冻20分钟，从-80℃中取出样品，放入-20℃保存。将冷冻固定的细胞在冷冻切片机中切片，切下的冷冻切片吸附在载玻片上。4℃保存。
3.从4℃取出切片，用封闭笔在切片周围密封防水，每片加70μl 4％PFA室温静置20分钟将细胞固定在玻片上，DPBS清洗3次，每次70μl，每次静置5分钟。加入0.5％Trixton-100静置20分钟通透细胞膜。弃去上一步液体，加入70μl封闭液(0.1％Trixton-100:Donkeyserum＝9:1)封闭30分钟。一抗室温孵育2小时，封闭液清洗3次，每次5分钟。二抗室温避光孵育1小时。孵育后DPBS清洗3次，每次5分钟，在切片中央加入1滴(约20μl)抗荧光淬灭剂，盖上盖玻片，指甲油密封盖玻片与载玻片之间的空隙。切片染色完成。
本实验中Donkey anti-Rat Secondary Antibody Alexa Fluor 488(Invitrogen，A21208)稀释比例为1：1000、Anti-Rat-somatostatin(Abcam，ab30788)稀释比例为1：200、Hoechst33342(Thermo Fisher，62249)稀释比例1：1000。
(III)蛋白免疫印迹实验(WB)
本发明在S6培养结束后收获细胞，获取蛋白，通过蛋白免疫印迹实验确定不同蛋白的表达情况。
1.裂解细胞收获蛋白。将培养板30°倾斜5分钟，取悬浮细胞(50个悬浮小球左右)，1450rpm离心5分钟。弃上清，加入500μl TrypLE裂解细胞。37℃裂解8分钟左右，加入S6培养基终止裂解，1450rpm离心5分钟。弃上清，加入1ml DPBS(提前预冷)，轻轻混匀，1450rpm离心5分钟，完全弃上清。加入200μl蛋白裂解液(198μlRIPA+2μl蛋白酶抑制剂)，置于冰上裂解30分钟，每10分钟震荡一次。裂解结束后，4℃条件下12000rpm离心20分钟。离心结束后将上清转移入新的1.5ml离心管中，加入1×蛋白上样缓冲液(loading buffer)混匀,95℃金属浴5分钟。获得蛋白样品。
2.蛋白电泳。将5μl蛋白预染Marker及蛋白样品15μl上样在蛋白预制胶Sure-PAGE中。设置恒定电压120V电泳(电泳液Tris-MOPS-SDS Running Buffer Powder)至蛋白完全分离，电泳时间约1小时左右。
3.转膜。电泳结束后将Sure-PAGE胶转移入三层滤纸及PVDF膜中，形成三层夹心结构。将夹心结构浸入转膜液(Transfer Buffer Powde)内，在冰上用恒定电压90V下转膜1小时。
4.封闭。取出PVDF膜，裁剪成合适大小，使用TBST清洗，每次5分钟，清洗三次。
弃去TBST清洗液，加入封闭液(QuickBlock Western)，室温孵育1小时。
5.一抗孵育。弃去封闭液，使用TBST清洗三次，每次5分钟。室温孵育一抗1小时。
6.二抗孵育。弃去一抗，使用TBST清洗六次，每次5分钟。室温避光孵育二抗1小时。
7.显影。弃去二抗，使用TBST清洗六次，每次5分钟。使用BeyoECL Plus显影液进行显影。
本实验中使用到的一抗Mouse-Monoclonal Antibody-HHEX、Rabbit-Monoclonalantibody-α-Tubulin使用时稀释比例为1：1000；二抗Goat-anti-rabbit lgG(H+L)、Goatanti-mouse lgG(H+L)使用时稀释比例为1：10000。
实施例1：由人胚胎干细胞分化为胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的方法
本实施例描述了由人胚胎干细胞(以下简称干细胞)分化为胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的方法，在干细胞进入分化之前首先描述干细胞的传代培养与分化前铺板操作等干细胞培养基本流程，再描述干细胞分化。
本实施例中培养干细胞使用的六孔板、24孔板如无特殊说明均需提前孵育基质胶(matrigel)才能使用。具体操作为：商品化matrigel按照厂家提供的稀释因子与DMEM F12混匀，随后按照六孔板每孔1ml、24孔板每孔300μl混匀液孵育培养板，孵育2小时后使用。
传代：干细胞在六孔板中以mTesR1作为培养基培养，每孔2ml培养基，每24h更换一次培养基。干细胞在六孔板中生长细胞密度至80-90％，弃去培养液，DPBS清洗一遍，弃去清洗液，每孔加入500μl Gentle Cell Dissociation Reagent消化液，37℃培养箱孵育3分钟左右。显微镜下观察细胞80-90％呈光亮状，弃去消化液，mTesR1轻轻冲洗，弃去清洗液。加入2ml mTesR1，轻轻混匀，15ml离心管收集细胞。按照1/40比例均匀接种在下一个六孔板中。完成干细胞传代。4-5天后干细胞密度达80-90％，进行下一次传代或铺板。
铺板：干细胞在六孔板中以mTesR1作为培养基，每孔2ml每孔培养基，每24h更换一次。干细胞在六孔板中生长密度至80-90％左右，弃去培养液，DPBS清洗一遍，弃去清洗液。每孔加入500ul TRYPLE，37℃培养箱孵育3分钟左右。显微镜下观察80-90％的细胞呈光亮状，每孔加入1ml mTesR1终止消化。吹打均匀，15ml离心管收集细胞，1450rpm离心5分钟。弃上清，加入1ml mTesR1将细胞吹打均匀，计数。细胞以2.5×105个细胞每孔均匀的接种到24孔板中，48-72小时细胞长至90％左右进入分化阶段。
由人胚胎干细胞分化为胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的方法，其特征方法步骤为：
1)人胚胎干细胞分化为胰腺前体细胞
1.1)人胚胎干细胞分化为定型内胚层细胞
S1培养基将人胚胎干细胞分化为定型内胚层细胞。S1培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、5mg/ml BSA、10-20mM Glucose、1.5mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1：100)、1％青链霉素、100ng/ml Activin A、0.1-3μM ChiR99021、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:50000)，S1培养基共培养3天，每24小时更换一次培养基。
1.2)定型内胚层细胞分化为胰腺前体细胞
S2培养基分化2天，S2培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、5mg/ml BSA、10-20mM Glucose、1.5mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1：100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:50000)、10-200ng/ml FGF7，每24小时更换一次培养液。
S3培养基分化2天，S3培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、20mg/ml BSA、10-20mM Glucose、2.5mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1：100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:200)、10-200ng/ml FGF7、0.05-2μM RA(视黄酸)、0.25μM SANT1、100nM LDN193189、100-500nM PDBU、10μM Y27632，每24h更换一次培养液。
S2培养基和S3培养基共分化4天，将定型内胚层细胞分化为胰腺前体细胞。
2)胰腺前体细胞分化为胰岛δ细胞
2.1)胰腺前体细胞分化为胰腺内分泌细胞
S4培养基培养3天，S4培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、20mg/ml BSA、10-20mM Glucose、2.5mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1：100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:200)、0.05-2μM RA(视黄酸)、0.25μM SANT1、100nM LDN193189、100-500nM PDBU、10μM Y27632、10μM ALK5iⅡ，每24h更换一次培养液。
S5培养基培养3天，S5培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、20mg/ml BSA、10-20mM Glucose、1.75mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1：100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:200)、0.05-2μM RA(视黄酸)、0.25μM SANT1、100nM LDN193189、10μM ZnSO4、10μM ALK5iⅡ、1μM T3、0.1-1μM compound E、20ng/mlHuman Recombinant Betacellulin、10μg/ml Heparin，每24h更换一次培养液。
S6培养基培养5天，S6培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、20mg/ml BSA、10-20mM Glucose、1.5mg/ml NaHCO3、0.25mM Vitamin C、GlutaMAX(1:100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:200)、100nM LDN193189、1μM T3、0.1-1μMcompound E、10μg/ml Heparin、2μM R428、1mM N-乙酰基-L-半胱氨酸、10μM ZnSO4，每24h更换一次培养液。
其中，在S5培养基培养3天结束后，将分化的细胞悬浮起来进行3D培养。具体操作为：弃去培养板中的培养液，DPBS清洗一次，弃去清洗液。每孔加入500μl TrypLE，放入培养箱中孵育6分钟左右，至轻轻吹打细胞即悬浮起来。加入1ml S6培养液，将细胞吹打均匀并收集入15ml离心管中。1450rpm离心5分钟。弃去离心后的上清，加入S6培养基吹打均匀。按照6个24孔板孔的细胞量悬浮到一个六孔板中(悬浮培养的六孔板不需要使用matrigel孵育)。将悬浮的细胞置于37℃摇床培养箱100rpm悬浮培养。需要注意的是悬浮到六孔板中的细胞在第一天培养液S6中要加入10μM Y27632小分子。悬浮细胞的换液需要倾斜30°静置5分钟，使聚集的团块细胞沉淀到培养板底部，再轻轻弃去上层的培养液2ml，随后添加新的培养液2ml，六孔板培养液总体积为3ml。
S4培养基、S5培养基和S6培养基共培养11天，将胰腺前体细胞分化为胰腺内分泌细胞。
2.2)胰腺内分泌细胞分化为胰岛δ细胞
S7培养基将胰腺内分泌细胞分化为胰岛δ细胞，S7培养基共分化14天。S7培养基内容为：以MCDB131培养基为基础、20mg/ml BSA、10-20mM Glucose、1.5mg/ml NaHCO3、GlutaMAX(1：100)、1％青链霉素、胰岛素-转铁蛋白-硒-氨基乙醇(ITS-X)(1:200)、1μM T3、10μg/ml Heparin、10μM ZnSO4、10μM(±)-α-生育酚，每24h更换一次培养液。
图1显示了本实施例的干细胞分化为胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的过程，图2显示了分化过程中不同阶段的细胞形态。待S1培养基培养结束后收取RNA样品QPCR实验检测SOX17和FOXA2的基因表达，待S3培养基培养结束后收取RNA样品QPCR实验检测PDX1表达，待S6培养基培养结束后收取RNA样品QPCR实验检测CHGA表达，结果如图3所示。S7培养基培养结束收获实验组与对照组细胞进行免疫荧光染色实验检测SST蛋白表达，结果如图4所示，结果表明，本实施例的分化方法可获得9.1％的胰岛δ细胞。
实施例2：FGF家族FGF1亚科对胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率的影响
FGF家族FGF1亚科可以提高胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率。其具体特征为：在S4培养基和S5培养基中加入2-100ng/ml FGF2，CHGA基因和SST基因mRNA表达增加，HHEX和SST蛋白表达增加。
具体实施方案为：人胚胎干细胞(H1)正常培养分化至胰腺前体细胞(即S3培养基2天培养结束)，在S4培养基和S5培养基中加入2-100ng/ml FGF2继续培养作为实验组。同时设置对照组如实施例1所示培养。待S6培养基培养结束后收取实验组与对照组RNA样品与蛋白样品，QPCR实验检测CHGA与SST表达，WB实验检测HHEX蛋白表达。结果如图5、图7所示。S7培养基培养结束收获实验组与对照组细胞蛋白样品进行免疫荧光染色实验检测SST蛋白表达，结果如图6所示。结果表明，本实施例的分化方法可获得18.2％的胰岛δ细胞。本实施例中除实验组S4培养基和S5培养基中另外加入2-100ng/ml FGF2，其余培养方式与分化方法均与实施例1所示方法相同。
实施例3：FGF家族FGF4亚科对胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率的影响
FGF家族FGF4亚科可以提高胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率。其具体特征为：在S4培养基和S5培养基中加入100-400ng/ml FGF4，CHGA基因和SST基因mRNA表达增加。
具体实施方案为：人胚胎干细胞(H1)正常培养分化至胰腺前体细胞(即S3培养基2天培养结束)，在S4培养基和S5培养基中加入100-400ng/ml FGF4继续培养作为实验组。同时设置对照组如实施例1所示培养。待S6培养基培养结束后收取实验组与对照组RNA样品QPCR实验检测CHGA与SST表达，结果如图8所示。本实施例中除实验组S4培养基和S5培养基中另外加入100-400ng/ml FGF4，其余培养方式与分化方法均与实施例1所示方法相同。
实施例4：FGF家族FGF7亚科对胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率的影响
FGF家族FGF7亚科可以提高胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率。其具体特征为：在S4培养基和S5培养基中加入2-200ng/ml FGF7，CHGA基因和SST基因表达增加，HHEX和SST蛋白表达增加。
具体实施方案为：人胚胎干细胞(H1)正常培养分化至胰腺前体细胞(即S3培养基2天培养结束)，在S4培养基和S5培养基中加入2-200ng/ml FGF7继续培养作为实验组。同时设置对照组如实施例1所示培养。待S6培养基培养结束后收取实验组与对照组RNA与蛋白样品，QPCR实验检测CHGA与SST表达mRNA，WB实验检测HHEX蛋白表达。结果如图9、图11所示。S7培养基培养结束收获实验组与对照组细胞蛋白样品，进行免疫荧光染色实验检测SST蛋白表达，结果如图10所示。结果表明，本实施例的分化方法可获得19.3％的胰岛δ细胞。本实施例中除实验组S4培养基和S5培养基中另外加入2-200ng/ml FGF7，其余培养方式与分化方法均与实施例1所示方法相同。
实施例5：FGF家族FGF8亚科对胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率的影响
FGF家族FGF8亚科可以提高胰腺内分泌细胞的分化效率，对胰岛δ细胞的分化效率无影响。其具体特征为：在S4培养基和S5培养基中加入2-100ng/ml FGF8，CHGA基因表达增加，SST基因表达无影响。
具体实施方案为：人胚胎干细胞(H1)正常培养分化至胰腺前体细胞(即S3培养基2天培养结束)，在S4培养基和S5培养基中加入2-100ng/ml FGF8继续培养作为实验组。同时设置对照组如实施例1所示培养。待S6培养基培养结束后收取实验组与对照组RNA样品QPCR实验检测CHGA与SST表达，结果如图12所示。本实施例中除实验组S4培养基和S5培养基中另外加入2-100ng/ml FGF8，其余培养方式与分化方法均与实施例1所示方法相同。
实施例6：FGF家族FGF9亚科对胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率的影响
FGF家族FGF9亚科可以提高胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率。其具体特征为：在S4培养基和S5培养基中加入50-200ng/ml FGF9，CHGA基因和SST基因表达增加。
具体实施方案为：人胚胎干细胞(H1)正常培养分化至胰腺前体细胞(即S3培养基2天培养结束)，在S4培养基和S5培养基中加入50-200ng/ml FGF9继续培养作为实验组。同时设置对照组如实施例1所示培养。待S6培养基培养结束后收取实验组与对照组RNA样品QPCR实验检测CHGA与SST表达，结果如图13所示。本实施例中除实验组S4培养基和S5培养基中另外加入50-200ng/ml FGF9，其余培养方式与分化方法均与实施例1所示方法相同。
实施例7：FGF家族FGF19亚科对胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率的影响
FGF家族FGF19亚科可以提高胰腺内分泌细胞的分化效率，对胰岛δ细胞的分化效率无影响。其具体特征为：在S4培养基和S5培养基中加入50-100ng/ml FGF21，CHGA基因表达增加，SST基因表达无影响。
具体实施方案为：人胚胎干细胞(H1)正常培养分化至胰腺前体细胞(即S3培养基2天培养结束)，在S4培养基和S5培养基中加入50-100ng/ml FGF21继续培养作为实验组。同时设置对照组如实施例1所示培养。待S6培养基培养结束后收取实验组与对照组RNA样品QPCR实验检测CHGA与SST表达，结果如图14所示。本实施例中除实验组S4培养基和S5培养基中另外加入50-100ng/ml FGF21，其余培养方式与分化方法均与实施例1所示方法相同。实施例8：FGF家族FGF1亚科与FGF7亚科配合使用对胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率的影响
FGF家族FGF1亚科与FGF7亚科配合使用可以提高胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率。其具体特征为：在S4培养基和S5培养基中加入2-100ng/ml FGF2与2-200ng/mlFGF7，CHGA基因和SST基因表达增加，HHEX和SST蛋白表达增加。
具体实施方案为：人胚胎干细胞(H1)正常培养分化至胰腺前体细胞(即S3培养基2天培养结束)，在S4培养基和S5培养基中加入2-100ng/ml FGF2与2-200ng/ml FGF7继续培养作为实验组。同时设置对照组如实施例1所示培养。待S6培养基培养结束后收取实验组与对照组RNA及蛋白样品，QPCR实验检测CHGA与SST表达，WB检测HHEX蛋白表达。结果如图15、图17所示。S7培养基培养结束收获实验组与对照组细胞进行免疫荧光染色实验检测SST蛋白表达，结果如图16所示。结果表明，本实施例的分化方法可获得22.6％的胰岛δ细胞。本实施例中除实验组S4培养基和S5培养基中另外加入2-100ng/ml FGF2与2-200ng/ml FGF7，其余培养方式与分化方法均与实施例1所示方法相同。
实施例9：FGF家族FGF7亚科FGF10对胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率的影响
FGF家族FGF7亚科的FGF10可以提高胰腺内分泌细胞及胰岛δ细胞的分化效率。其具体特征为：在S4培养基和S5培养基中加入50-200ng/ml FGF10，CHGA基因和SST基因mRNA表达增加。
具体实施方案为：人胚胎干细胞(H1)正常培养分化至胰腺前体细胞(即S3培养基2天培养结束)，在S4培养基和S5培养基中加入50-200ng/ml FGF10继续培养作为实验组。同时设置对照组如实施例1所示培养。待S6培养基培养结束后收取实验组与对照组RNA样品QPCR实验检测CHGA与SST表达，结果如图18所示。本实施例中除实验组S4培养基和S5培养基中另外加入50-200ng/ml FGF10，其余培养方式与分化方法均与实施例1所示方法相同。
序列表
<110> 广州国家实验室
<120> 体外诱导获得胰岛δ细胞的方法及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcatgactcc ggtgtgaatc t 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcacacgtca ggatagttgc agt 23
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctggtcgtt tgttgtggc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttccatcttc accgctccca 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cggaactttc tatttaggat gtgg 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagatgtgaa ggtcatactg gctc 24
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgctgtccat cgtcctg 17
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gggcatcatt ctccgtctg 19
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgcaaaccgc agaccagagg a 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agctctgctt caatggccga ca 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgcaccacca actgcttagc 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggcatggact gtggtcatga g 21

Claims (22)

1.体外诱导获得胰岛δ细胞的方法，所述方法包括：
（1）获得胰腺前体细胞的步骤，
（2）培养胰腺前体细胞分化为胰腺内分泌细胞的步骤，以及
（3）培养胰腺内分泌细胞获得胰岛δ细胞的步骤，
其中，步骤（2）包括利用添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基培养，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2和FGF7，FGF2的浓度在2-100ng/ml的范围内，并且FGF7的浓度在2-200ng/ml的范围内；
步骤（3）中，培养基中不添加成纤维细胞生长因子FGF；
其中，步骤（2）包括依次在S4培养基、S5培养基和S6培养基中培养所述胰腺前体细胞获得胰腺内分泌细胞的步骤，
所述S4培养基为在基础培养基中添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸（RA）、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂和Alk5抑制剂的培养基，
所述S5培养基为在基础培养基中添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸（RA）、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、ZnSO4、Alk5抑制剂、三碘甲状腺原氨酸（T3）、γ-分泌酶抑制剂、重组人β细胞素（Human Recombinant Betacellulin）和肝素（Heparin）的培养基，
所述S6培养基为在基础培养基中添加BMP 1型受体抑制剂、三碘甲状腺原氨酸（T3）、γ-分泌酶抑制剂、肝素（Heparin）、Axl抑制剂、N-乙酰基-L-半胱氨酸和ZnSO4的培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，步骤（1）中，胰腺前体细胞通过培养干细胞获得。
3.根据权利要求2所述的方法，所述干细胞选自多能干细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，所述干细胞选自成体干细胞。
5.根据权利要求2所述的方法，所述干细胞选自胰腺干细胞或胚胎干细胞。
6.根据权利要求2所述的方法，所述干细胞选自人源干细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，步骤（1）包括利用添加成纤维细胞生长因子FGF7的培养基培养。
8.根据权利要求7所述的方法，所述步骤（1）中添加成纤维细胞生长因子FGF7的浓度在10-200ng/ml的范围内。
9.根据权利要求2所述的方法，步骤（1）通过培养干细胞获得胰腺前体细胞，步骤（1）包括培养干细胞获得定型内胚层细胞的步骤，以及依次在S2培养基和S3培养基中培养所述定型内胚层细胞获得胰腺前体细胞的步骤，其中，所述S2培养基和/或S3培养基中含有成纤维细胞生长因子FGF7。
10.根据权利要求9所述的方法，所述S2培养基为在基础培养基中添加成纤维细胞生长因子FGF7的培养基。
11.根据权利要求10所述的方法，所述S2培养基中添加成纤维细胞生长因子FGF7的浓度在10-200ng/ml的范围内。
12. 根据权利要求9所述的方法，所述S3培养基为在基础培养基中添加成纤维细胞生长因子FGF7、视黄酸（RA）、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂和rho激酶抑制剂的培养基。
13. 根据权利要求12所述的方法，所述S3培养基中，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632。
14. 根据权利要求1所述的方法，所述S4培养基中，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ。
15. 根据权利要求1所述的方法，所述S5培养基中，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E。
16. 根据权利要求1所述的方法，所述S6培养基中，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E，所述Axl抑制剂选自R428。
17.根据权利要求9所述的方法，所述定型内胚层细胞具有SOX17基因和FOXA2基因的表达；和/或，
所述胰腺前体细胞具有PDX1基因的表达；和/或，
所述胰腺内分泌细胞具有CHGA基因的表达；和/或，
所述胰岛δ细胞具有SST和HHEX基因的表达。
18.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：
（1）获得胰腺前体细胞的步骤：
（1-1）利用添加重组人激活素-A（Activin A）和WNT激动剂的S1培养基培养干细胞，获得定型内胚层细胞；
（1-2）利用添加成纤维细胞生长因子FGF7的S2培养基培养步骤（1-1）得到的定型内胚层细胞；
（1-3）利用添加成纤维细胞生长因子FGF7、视黄酸（RA）、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂的S3培养基培养步骤（1-2）得到的细胞，获得胰腺前体细胞；
（2）培养胰腺前体细胞获得胰腺内分泌细胞的步骤：
（2-1）利用添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸（RA）、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂和Alk5抑制剂的S4培养基培养步骤（1-3）得到的胰腺前体细胞；
（2-2）利用添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸（RA）、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、ZnSO4、Alk5抑制剂、三碘甲状腺原氨酸（T3）、γ-分泌酶抑制剂、重组人β细胞素（Human Recombinant Betacellulin）、肝素（Heparin）的S5培养基培养步骤（2-1）得到的细胞；
（2-3）利用添加BMP 1型受体抑制剂、三碘甲状腺原氨酸（T3）、γ-分泌酶抑制剂、肝素、Axl抑制剂、N-乙酰基-L-半胱氨酸、ZnSO4的S6培养基中培养步骤（2-2）得到的细胞，获得胰腺内分泌细胞；
（3）培养胰腺内分泌细胞获得胰岛δ细胞的步骤：
利用添加三碘甲状腺原氨酸（T3）、肝素（Heparin）、ZnSO4、(±)-α-生育酚的S7培养基中培养步骤（2-3）得到的胰腺内分泌细胞，获得胰岛δ细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，
步骤（1-1）中，利用S1培养基培养3天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5% CO2，36-38℃；
步骤（1-2）中，利用S2培养基培养2天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5% CO2，36-38℃；
步骤（1-3）中，利用S3培养基培养1-2天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5% CO2，36-38℃；
步骤（2-1）中，利用S4培养基培养3天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5% CO2，36-38℃；
步骤（2-2）中，利用S5培养基培养3天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5% CO2，36-38℃；
步骤（2-3）中，利用S6培养基培养5天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5% CO2，36-38℃；
步骤（3）中，利用S7培养基培养14-21天，每24-48小时更换一次培养基，培养条件为5%CO2，36-38℃。
20.根据权利要求18所述的方法，
步骤（1-1）中，WNT激动剂选自ChiR99021；
步骤（1-3）中，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632；
步骤（2-1）中，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ；
步骤（2-2）中，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E；
步骤（2-3）中，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述γ-分泌酶抑制剂选自compound E，所述Axl抑制剂选自R428。
21.根据权利要求5所述的方法，所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，所述胚胎干细胞为人胚胎干细胞H1或人胚胎干细胞H9。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1596305A (zh) * 2001-11-09 2005-03-16 阿特塞尔科学公司 脂肪组织来源的基质细胞的内分泌胰腺分化及其应用
CN104726395A (zh) * 2015-03-20 2015-06-24 深圳市人民医院 一种诱导人诱导多能干细胞定向分化为胰腺细胞的方法
CN105008518A (zh) * 2012-12-31 2015-10-28 詹森生物科技公司 在空气-液体界面处培养人胚胎干细胞以用于分化成胰腺内分泌细胞
CN109415689A (zh) * 2016-04-28 2019-03-01 武田药品工业株式会社 源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的纯化法及其扩增法
CN111394298A (zh) * 2012-12-31 2020-07-10 詹森生物科技公司 使用hb9调节子使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞的方法
CN112251396A (zh) * 2020-10-09 2021-01-22 北京呈诺医学科技有限公司 培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法
WO2022026933A2 (en) * 2020-07-31 2022-02-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated In vitro differentiation of pancreatic endocrine cells

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2435826A1 (en) * 2001-01-24 2002-08-01 The Government Of The United States Of America Differentiation of stem cells to pancreatic endocrine cells
JP5288209B6 (ja) * 2006-05-02 2018-06-27 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 幹細胞の内胚葉細胞および膵臓系列細胞への分化方法
WO2014179198A1 (en) * 2013-04-29 2014-11-06 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods for producing insulin-secreting beta cells from human pluripotent stem cells
AU2021319209A1 (en) * 2020-07-31 2023-03-02 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Differentiation of pancreatic endocrine cells

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1596305A (zh) * 2001-11-09 2005-03-16 阿特塞尔科学公司 脂肪组织来源的基质细胞的内分泌胰腺分化及其应用
CN105008518A (zh) * 2012-12-31 2015-10-28 詹森生物科技公司 在空气-液体界面处培养人胚胎干细胞以用于分化成胰腺内分泌细胞
CN111394298A (zh) * 2012-12-31 2020-07-10 詹森生物科技公司 使用hb9调节子使人胚胎干细胞分化为胰腺内分泌细胞的方法
CN104726395A (zh) * 2015-03-20 2015-06-24 深圳市人民医院 一种诱导人诱导多能干细胞定向分化为胰腺细胞的方法
CN109415689A (zh) * 2016-04-28 2019-03-01 武田药品工业株式会社 源自多能性干细胞的胰腺祖细胞的纯化法及其扩增法
WO2022026933A2 (en) * 2020-07-31 2022-02-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated In vitro differentiation of pancreatic endocrine cells
CN112251396A (zh) * 2020-10-09 2021-01-22 北京呈诺医学科技有限公司 培养基及其应用与诱导性多能干细胞向胰岛分化的方法

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