CN116018150A - 用于筛选干细胞衍生的β样细胞的体外群体的方法及其新型标志物 - Google Patents

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CN116018150A CN202180053244.4A CN202180053244A CN116018150A CN 116018150 A CN116018150 A CN 116018150A CN 202180053244 A CN202180053244 A CN 202180053244A CN 116018150 A CN116018150 A CN 116018150A
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Abstract

本发明涉及在多能干细胞衍生细胞的体外细胞群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达特异性标志物或其组合的β样细胞的步骤，以在移植前预测所述细胞的体内功能性。本发明还涉及多能干细胞衍生的β样细胞的体外群体，其中所述β样细胞包含一种或多种在天然人β细胞中不存在的标志物，或者所述标志物的表达水平与天然人β细胞中不同。

Description

用于筛选干细胞衍生的β样细胞的体外群体的方法及其新型标志物
技术领域
本发明涉及通过鉴定表达一种或多种特异性标志物的β样细胞而在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法。本发明还涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其包含表达特异性标志物的β样细胞，一种或多种标志物在天然人β细胞中不存在或具有与天然人β细胞中不同的表达水平。
背景技术
1型糖尿病患者可以通过移植来自人类供体的胰岛进行治疗，一些患者实现了胰岛素非依赖性。然而，供体胰岛稀缺且质量参差不齐，因此，多能干细胞衍生的β样细胞提供了有吸引力的胰岛替代物。
在体外分化过程中，使用多种化学和生物因素使人多能干细胞进行分化，以产生包含不同内分泌细胞类型的异质胰岛样细胞簇。
经典的β细胞标志物包括胰岛素(INS)和典型的转录因子，如PDX1和NKX6.1。传统上，这些标志物用于鉴定干细胞衍生的β样细胞。尽管所有干细胞衍生的β样细胞可能通过体外经典β细胞标志物的表达而在表型上看起来与天然人β细胞相似，但它们是不同的，因为并非所有干细胞衍生的β样细胞在移植后都表达和分泌胰岛素。经典的β细胞标志物不足以在体外鉴定移植后维持胰岛素表达和分泌的干细胞衍生的β样细胞。一些经典的β细胞标志物如PDX1甚至与体内功能呈负相关，导致干细胞向β样细胞的体外分化方案朝不希望的细胞群体优化，或选择出在移植前可能类似于天然人β细胞的表型但在移植后改变其表型的细胞群体。
鉴定在移植后维持胰岛素表达和分泌的干细胞衍生β样细胞的体外群体对于分化的β样细胞产品性能、评估和生产至关重要。因此，需要鉴定新的标志物，所述标志物定义在移植后维持胰岛素表达和分泌的干细胞衍生的β样细胞的体外群体。
发明内容
在一方面，本发明涉及在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中所述方法包括鉴定β样细胞的步骤，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少55％的所述β样细胞包含一种或多种选自SOX11、FREM2、DCC、BASP1、CHRNA3和ELALV2的标志物，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的所述β样细胞包含一种或多种选自ACVR1C、MARCKSL1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5和HMGCS1的标志物，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约1个平均对数倍数变化。
在一方面，本发明涉及包含β样细胞的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其用于治疗1型糖尿病。
在一方面，本发明涉及细胞组合物，其包含多能干细胞衍生细胞的体外群体和细胞培养基，所述体外群体包含通过本发明获得的β样细胞。
在一方面，本发明涉及可植入装置，其包含多能干细胞衍生细胞的体外群体，所述体外群体包含通过本发明获得的β样细胞。
在一方面，本发明涉及治疗1型糖尿病的方法，其包括向有需要的人施用包含通过本发明获得的β样细胞的多能干细胞衍生细胞的体外群体。
在一方面，本发明涉及冷冻保存的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其包含通过本发明获得的β样细胞。
在一方面，本发明提供了移植前的多能干细胞的体外群体，其包含β样细胞或胰岛素产生细胞。
本发明还可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
附图说明
图1A的图形显示了从八种不同的(修改的)用于获得干细胞衍生细胞的方案以及从尸体人胰岛细胞采样的所有细胞的T分布随机近邻嵌入(tSNE)投影。
图1B的图形显示了26个细胞簇的tSNE投影，其中每个簇由具有相似基因表达谱的细胞组成。
图2的图形在X轴上显示了干细胞衍生簇编号，并在Y轴上显示了β细胞评分。其表明，基于所有细胞的人β细胞基因模块评分，编号为14、15和26的干细胞衍生的β样细胞簇与编号为16的天然人β细胞簇非常相似。
图3的图形在X轴上显示了天然胰岛亚型，并在Y轴上显示了β细胞评分。所有在β细胞基因集上评分高的细胞都被归类为天然人β细胞。
图4的图形显示了干细胞衍生的β样细胞的体外群体所特有的基因表达谱。将天然人β细胞(簇16)与干细胞衍生的β样细胞(簇14、15和26)进行比较。天然人β细胞的UPT中值(衡量RNA质量的指标)等于0。干细胞衍生的β样细胞的UPT中值大于天然人β细胞。这些图使用箱形图显示了原代或天然人β细胞与干细胞衍生的β样细胞之间的平均表达差异，并使用单点显示了在各个细胞中的表达。每列下方给出了显示不表达的细胞的百分比。
图5的图片显示了体内移植前后的干细胞衍生细胞。其表明一些干细胞衍生细胞在体内暴露后不会保持胰岛素阳性。移植前后干细胞衍生细胞的NKX6.1、胰岛素和胰高血糖素染色表明，尽管这些细胞在移植前看起来与天然人β细胞相似，但移植后在胰岛素表达和分泌上存在显著差异。
图6的图形在X轴上显示了簇14、15和26中的细胞百分比，并在Y轴上显示了移植后8周的平均人C-肽。其显示干细胞衍生的β样细胞与体内暴露后8周分泌的人C-肽之间呈正相关。在移植了使用不同(修改的)分化方案生成的细胞的SCID-beige动物中测得的C-肽水平显示与簇14、15和26的累积大小呈正相关。
图7的图形显示，经典β细胞标志物NKX6.1、SYT13、NKX2.2、PDX1、PDX1+/NKX6.1+、PAX4与SCID小鼠中移植后8周的平均人C-肽呈负相关。
图8a)的上图是显示SLC30A8在干细胞衍生的β样细胞群体中富集的图形。
图8a)的下图是显示PDX1的广泛表达的图形。
图8b)的上图是显示SLC30A8与SCID小鼠中移植后8周的平均人C-肽呈正相关的图形。
图8b)的下图是显示PDX1与SCID小鼠中移植后8周的平均人C-肽呈负相关的图形。
图9a)显示ACVR1C在天然人β细胞中不表达。
图9b)显示ACVR1C标记干细胞衍生细胞培养物中的细胞子集。
图9c)是显示ACVR1C表达与体内功能呈正相关的图形。
图10a)的上图是显示PCDH7在簇14、15和26中高表达的tSNE图。
图10a)的下图是显示PCP4在簇14、15和26中高表达的tSNE图。
图10b)的上图是显示PCDH7与SCID-beige小鼠体内暴露8周后的平均人C-肽呈正相关的图形。
图10b)的下图是显示PCP4与SCID-beige小鼠体内暴露8周后的平均人C-肽呈正相关的图形。
图11a)是显示G6PC2表达的tSNE图。
图11b)的图形显示，通过纳米串(nanostring)测得的G6PC2 mRNA的大量表达(bulk expression)与SCID小鼠中移植8周后循环平均人C-肽形式的体内胰岛素分泌相关。
图11c)的图形显示，通过纳米串测得的G6PC2 mRNA的大量表达(bulkexpression)与葡萄糖毒蜥外泌肽4和IBMX/毛喉素(forskolin)攻击期间分泌的人C-肽形式的体外胰岛素分泌相关。
具体实施方式
本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其包括鉴定表达一种或多种特异性标志物的β样细胞。本发明的标志物和方法允许在移植前鉴定将在移植后维持胰岛素表达和分泌的β样细胞。这是可能的，因为根据本发明鉴定的干细胞衍生的β样细胞在移植后不改变其表型，这与基于经典β细胞标志物的表达鉴定的干细胞衍生的β样细胞不同。
此外，本发明还提供了特异性的新型标志物，或经典β细胞标志物在鉴定移植后维持胰岛素表达和分泌的干细胞衍生的β样细胞中的应用。
此外，本发明还允许通过检测标志物来鉴定在移植后维持胰岛素表达和分泌的β样细胞，所述标志物在天然人β细胞中不存在或在干细胞衍生的β样细胞的体外群体中具有比在天然人β细胞中更高的表达水平。
根据本发明的一方面，标志物基因及其组合用于基于蛋白质的测定，例如但不限于蛋白质组学、流式细胞术、免疫组织化学，或基于RNA的测定，例如但不限于RNA测序、基于qPCR探针的检测，和其他分析或筛选方法，以鉴定或纯化在移植后维持胰岛素表达和分泌的干细胞衍生的β细胞，以用于评估分化效率、质量和性能。
在一方面，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定β样细胞的步骤，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定β样细胞的步骤，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、DLK1和MAFB的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定β样细胞的步骤，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自CHRNA3、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、DLK1和MAFB的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定β样细胞的步骤，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自CHRNA3、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、LBH和DLK1的标志物的组合。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与ACVR1C的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与FREM2的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与CHRNA3的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与DCC的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与SOX11的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与MARCKSL1的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与BASP1的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与STARD10的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与AMBP的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与ST6GALNAC5的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与HMGCS1的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与ELAVL2的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与PCP4的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与PCDH7的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与NEFL的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与PLAGL1的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与EGFL7的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与RAD21的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与RTN1的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与PLXNA2的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与LBH的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与NEFM的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与SLC30A8的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与DLK1的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与MAFB的组合的β样细胞的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及一种在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定表达NKX6.1与ISL1的组合的β样细胞的步骤。
用于评估体外细胞群体中蛋白质和核酸标志物的表达的方法包括定性逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、Northern印迹法、原位杂交(参见，例如Current Protocols inMolecular Biology(Asubel等人编.2001增补)和免疫测定，如切片材料的免疫组织化学分析、Western印迹分析，以及对于完整细胞中可及的标志物，流式细胞分析(FACS)(参见，例如，Harlow和Lane,Using Antibodies:A Laboratory Manual,New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press(1998))。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合，并且其中所述β样细胞在移植后维持胰岛素表达和分泌。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合，并且其中所述β样细胞在移植后维持胰岛素表达和分泌。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、DLK1和MAFB的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、DLK1和MAFB的标志物的组合，并且其中所述β样细胞在移植后维持胰岛素表达和分泌。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自CHRNA3、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、DLK1和MAFB的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自CHRNA3、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、DLK1和MAFB的标志物的组合，并且其中所述β样细胞在移植后维持胰岛素表达和分泌。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自CHRNA3、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、LBH和DLK1的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自CHRNA3、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、LBH和DLK1的标志物的组合，并且其中所述β样细胞在移植后维持胰岛素表达和分泌。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与ACVR1C的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与FREM2的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与CHRNA3的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与DCC的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与SOX11的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与MARCKSL1的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与BASP1的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与STARD10的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与AMBP的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与ST6GALNAC5的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与HMGCS1的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与ELAVL2的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与PCP4的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与PCDH7的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与NEFL的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与PLAGL1的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与EGFL7的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与RAD21的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与RTN1的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与PLXNA2的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与LBH的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与NEFM的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与SLC30A8的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与DLK1的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与MAFB的组合的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的表达NKX6.1与ISL1的组合的β样细胞。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少55％的所述β样细胞包含一种或多种选自SOX11、FREM2、DCC、BASP1、CHRNA3和ELALV2的标志物，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少85％的所述β样细胞包含SOX11，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少75％的所述β样细胞包含FREM2，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少85％的所述β样细胞包含DCC，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少75％的所述β样细胞包含BASP1，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的所述β样细胞包含CHRNA3，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少55％的所述β样细胞包含ELALV2，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的所述β样细胞包含一种或多种选自ACVR1C、MARCKSL1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5和HMGCS1的标志物，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约1个平均对数倍数变化。
在一个实施方案中，平均对数倍数变化等于感兴趣的细胞簇与所有其他细胞簇之间的平均对数倍数变化。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少95％的所述β样细胞包含ACVR1C，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高2个平均对数倍数变化。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少95％的所述β样细胞包含MARCKSL1，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约2个平均对数倍数变化。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少95％的所述β样细胞包含STARD10，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高1个平均对数倍数变化。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少90％的所述β样细胞包含AMBP，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高2个平均对数倍数变化。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少85％的所述β样细胞包含ST6GALNAC5，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约1个平均对数倍数变化。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的所述β样细胞包含HMGCS1，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约1个平均对数倍数变化。
在一方面，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的所述β样细胞包含一种或多种选自ACVR1C、MARCKSL1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5和HMGCS1的标志物，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
在一个实施方案中，本发明涉及多能干细胞衍生细胞的体外群体，其包含在移植后维持胰岛素表达和分泌的β样细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及包含β样细胞的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该细胞群体在移植后表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)反应。
在一个实施方案中，所述反应是体外GSIS反应。在一个实施方案中，所述反应是体内GSIS反应。在一个实施方案中，所述GSIS反应类似于天然人β细胞的反应。
在一个实施方案中，本发明涉及包含β样细胞的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中一种或多种标志物表现出与移植后的平均血浆C-肽水平呈正相关。
在一个实施方案中，本发明涉及包含β样细胞的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述β样细胞在移植后表现出血糖降低。
在一个实施方案中，本发明涉及包含β样细胞的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述β样细胞是葡萄糖响应性的。
在一个实施方案中，本发明涉及包含β样细胞的干细胞衍生细胞的体外群体，其中β样细胞在移植后是葡萄糖响应性的。
在一个实施方案中，本发明涉及包含β样细胞的干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述β样细胞在移植后表现出增强的C-肽水平。
在一个实施方案中，本发明涉及包含β样细胞的干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述β样细胞在移植后表现出改善的胰岛素水平。
在根据本发明的一个实施方案中，干细胞衍生细胞的体外群体包含β样细胞，其中所述β样细胞在移植后表现出血糖降低。
在一方面，本发明涉及体外细胞培养物或组合物，其包含多能干细胞衍生细胞的细胞群体和细胞培养基，其中至少15％的β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及体外细胞培养物或组合物，其包含多能干细胞衍生细胞的细胞群体和细胞培养基，其中至少55％的β样细胞包含一种或多种选自SOX11、FREM2、DCC、BASP1、CHRNA3和ELALV2的标志物，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一方面，本发明涉及体外细胞培养物或组合物，其包含多能干细胞衍生细胞的细胞群体和细胞培养基，其中至少80％的β样细胞包含一种或多种选自ACVR1C、MARCKSL1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5和HMGCS1的标志物，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高1个平均对数倍数变化。
在一个实施方案中，本发明的细胞、干细胞、干细胞衍生细胞和/或干细胞β样细胞是人细胞。
在一个实施方案中，所述干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
在一方面，本发明涉及包含干细胞衍生细胞的体外群体的可植入装置，其中至少15％的β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及包含干细胞衍生细胞的体外群体的可植入装置，其中至少55％的所述β样细胞包含一种或多种选自SOX11、FREM2、DCC、BASP1、CHRNA3和ELALV2的标志物，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一方面，本发明涉及包含干细胞衍生细胞的体外群体的可植入装置，其中至少80％的所述β样细胞包含一种或多种选自ACVR1C、MARCKSL1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5和HMGCS1的标志物，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高1个平均对数倍数变化。
在一方面，本发明涉及一种治疗1型糖尿病的方法，其中该方法包括向有需要的人施用干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少15％的β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及一种治疗1型糖尿病的方法，其中该方法包括向有需要的人施用干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少55％的β样细胞包含一种或多种选自SOX11、FREM2、DCC、BASP1、CHRNA3和ELALV2的标志物，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一方面，本发明涉及一种治疗1型糖尿病的方法，其中该方法包括向有需要的人施用干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的β样细胞包含一种或多种选自ACVR1C、MARCKSL1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5和HMGCS1的标志物，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高1个平均对数倍数变化。
在一方面，本发明涉及冷冻保存的干细胞衍生细胞群体，其中至少15％的β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
在一方面，本发明涉及冷冻保存的干细胞衍生细胞群体，其中至少55％的β样细胞包含一种或多种选自SOX11、FREM2、DCC、BASP1、CHRNA3和ELALV2的标志物，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
在一方面，本发明涉及冷冻保存的干细胞衍生细胞群体，其中至少80％的β样细胞包含一种或多种选自ACVR1C、MARCKSL1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5和HMGCS1的标志物，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高1个平均对数倍数变化。
定义：
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。除非另有说明，否则本发明的实践中采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、生物物理学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的常规方法。
需要注意的是，本文中使用的所有标题和小标题仅仅是为了方便起见，而不应解释为以任何方式限制本发明。
除非另有声明，否则任何和全部实例或本文提供的示例性措辞(例如，“如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并不造成对本发明范围的限制。说明书中的任何用语均不应被解释为表示任何未请求保护的要素对本发明的实践是必不可少的。
在整个本申请中，当涉及细胞分化过程时，术语“方法”和“方案”可互换使用。
如本文所用的，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以选择方式(“或”)解释时，指缺少组合。此外，本发明还设想在本发明的一些实施方案中，可以排除或省略本文阐述的任何特征或特征组合。
如本文所用的，“一个(种)”表示“一个(种)或多个(种)”。
如本文所用的，术语“约”是指加或减10％，例如加或减5％，除非另有说明。
如本文所用的，术语“细胞群体”是指定义的一组细胞，其可以是体外的或体内的。在优选的实施方案中，根据本发明的细胞群体是体外细胞群体。
干细胞
干细胞是由其在单细胞水平上自我更新和分化以产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞以及终末分化的细胞。干细胞的特征还在于其由多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)体外分化成各种细胞谱系的功能性细胞的能力，以及其在移植后产生多个胚层的组织并且在注射到胚泡中后对大多数(如果不是全部的话)组织有显著贡献的能力。
干细胞按其发育潜力分类为：(1)全能的，意思是能够产生所有胚胎细胞类型和胚胎外细胞类型；(2)多能的(pluripotent)，意思是能够产生所有胚胎细胞类型；(3)专能的(multi-potent)，意思是能够产生细胞谱系的子集，但是全部都在特定组织、器官或生理系统内(例如，造血干细胞(HSC)可以产生包括HSC(自我更新)、血细胞限制性寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和元素(例如血小板)在内的子代)；(4)寡能的，意思是能够产生比专能干细胞更受限制的细胞谱系子集；以及(5)单能的，意思是能够产生单细胞谱系(例如生精干细胞)。
人多能干细胞
如本文所用的，“人多能干细胞”(hPSC)是指可来自任何人源的并且在适当条件下能够产生不同细胞类型的子代的细胞，所述细胞类型是所有3个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物。hPSC可具有在8-12周龄的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养中形成所有三个胚层的可识别细胞的能力。在人多能干细胞的定义中包括人胚胎干细胞(hESC)(参见，例如，Thomson等人(1998)，Heins等人(2004))以及诱导多能干细胞(iPSC)(参见，例如，Yu等人(2007)；Takahashi等人(2007))。本文描述的各种方法和其他实施方案可能需要或利用来自多种来源的hPSC。例如，适合使用的hPSC可以从发育中的胚胎获得。另外地或备选地，合适的hPSC可以从已建立的细胞系和/或人诱导多能干(hiPS)细胞获得。
ES细胞系还可以源自单个分裂球，而无需破坏子宫外胚胎，也不会影响临床结果(Chung等人(2006)和Klimanskaya等人(2006))。
胚泡衍生的干细胞
如本文所用的，术语“胚泡衍生的干细胞”被表示为BS细胞，而人形式被称为“hBS细胞”。在文献中，该细胞通常被称为胚胎干细胞，更具体地称为人胚胎干细胞(hESC)。因此，本发明中使用的多能干细胞可以是由胚泡制备的胚胎干细胞，如在例如WO 03/055992和WO2007/042225中所述，或者是可商购获得的hBS细胞或细胞系。然而，进一步想到任何人多能干细胞均可用于本发明，包括如Yu等人(2007)、Takahashi等人(2007)和Yu等人(2009)所公开的，通过例如用某些转录因子如OCT4、SOX2、NANOG和LIN28处理成体细胞而重新编程为多能细胞的分化成体细胞。
人胚胎干细胞
如本文所用的，术语“人胚胎干细胞”或“hESC”是指源自人胚胎的内细胞团的干细胞。人胚胎干细胞能够在未分化状态下无限期地自我更新。此外，人胚胎干细胞是多能性的，这意味着它们能够分化为外胚层、内胚层和中胚层这三个主要胚层的所有衍生物。
人诱导多能干细胞
如本文所用的，术语“人诱导多能干细胞”或“hIPSC”细胞是指通过将体细胞重新编程回胚胎样多能状态而产生的干细胞。诱导多能干细胞能够在未分化状态下无限期地自我更新。诱导多能干细胞也能够分化为外胚层、内胚层和中胚层这三个主要胚层的所有衍生物。
分化
如本文所用的，“分化”是指细胞从未分化状态进展至分化状态，或从分化状态进展至更为分化的状态的过程。细胞可以是分化状态，但没有完全分化成具体细胞类型。
术语“分化因子”是指添加到胰腺细胞中以增强其向内分泌细胞分化的化合物，其中内分泌细胞也包含产生胰岛素的β细胞。
在一个实施方案中，细胞的分化包括在包含一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。
定形内胚层细胞(DE细胞)
定形内胚层细胞的特征在于标志物SOX17的表达。DE的其他标志物是FOXA2和CXCR4。
如本文所用的“SOX17”(SRY-框17)是参与调节胚胎发育和决定细胞命运的转录因子SOX(SRY相关HMG-框)家族的成员。
如本文所用的“FOXA2”(叉头框A2)是叉头类别的DNA结合蛋白的成员。
如本文所用的“CXCR4”(C-X-C基序趋化因子受体4)是对基质细胞衍生因子-1具有特异性的CXC趋化因子受体。
DE诱导方案的非限制性实例是常规D'Amour方案(Novocell,Nature Biotec2006,2008)和WO2012/175633(通过引用将其整体并入本文)中描述的方案。
胰腺内胚层细胞(PE细胞)
胰腺内胚层细胞的特征在于至少5％ NKX6.1+/PDX1+双阳性的标志物的表达。PE的其他标志物是PTF1A和CPA1。
如本文所用的“PDX1”是指参与胰腺发育的同源域转录因子。
如本文所用的“NKX6.1”是NKX转录因子家族的成员。
如本文所用的“PTF1A”是作为胰腺转录因子1复合物(PTF1)的组分并且已知在哺乳动物胰腺发育中起作用的蛋白质。
如本文所用的“CPA1”是锌金属蛋白酶的羧肽酶A家族的成员。这种酶在胰腺中产生。
WO2014/033322中描述的方案通过引用整体并入本文。
内分泌祖细胞(EP细胞)
内分泌祖细胞的特征在于标志物NGN3、NeuroD和NKX2.2的表达，这些标志物是定向于内分泌细胞命运的EP细胞的标志。
如本文所用的“NGN3”是碱性环-螺旋-环转录因子的神经原素(neurogenin)家族的成员。
如本文所用的“NKX2.2”和“NKX6.1”是NKX转录因子家族的成员。
如本文所用的“NeuroD”是碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子的NeuroD家族的成员。
WO2015/028614中描述的方案通过引用整体并入本文。
天然人β细胞
如本文所用的，术语“天然人β细胞”或“原代β细胞”是指在人体内响应于葡萄糖或促分泌素而产生胰岛素的细胞。
干细胞衍生细胞
如本文所用的，术语“干细胞衍生细胞”或“多能干细胞衍生细胞”是指通过多能干细胞的分化而获得的细胞，这些细胞或者具有进一步分化的潜力，或者是终末分化的细胞，但在移植后可能不一定表现出胰岛素分泌。
干细胞衍生的β细胞
如本文所用的，术语“β样细胞”或“干细胞衍生的β细胞”或“SC-β细胞”或“干细胞衍生的β样细胞”或“体外干细胞衍生的β细胞”是指这样的细胞：其衍生自干细胞并且表达天然人β细胞的至少一种标志物，如PDX1、NKX6.1、INS，显示出响应于葡萄糖的体外和/或体内胰岛素分泌，类似于天然人β细胞的反应。WO2017/144695中描述的方案通过引用整体并入本文。
筛选
如本文所用的，术语“筛选”是指基于具有某种表型或基因型的一种或多种细胞的存在来检测、鉴定、纯化、选择或表征细胞或细胞群体。表型或基因型可以基于标志物的表达来确定。在一个实施方案中，鉴定是指根据表征细胞的标志物的表达水平对细胞进行分类。在优选的实施方案中，根据本发明的筛选在体外进行。
表达水平
如本文所用的，术语“表达水平”是指细胞中基因表达和/或基因产物活性的程度。可以以任意绝对单位或归一化的单位(相对于对照参考的已知表达水平)来确定表达水平。
标志物
如本文所用的，术语“标志物”是指由细胞进行的天然发生的可鉴定的表达，其可以与该细胞的某些特性相关并且用来鉴定、预测或表征细胞或细胞群体。标志物可以用基因来指代。标志物可以是mRNA或蛋白质的形式，例如对于细胞表面上的蛋白质而言。
如本文所用的，关于标志物的术语“表达”是指在细胞中缺乏或存在可被检测到的分子。在实施方案中，表达的分子是mRNA或蛋白质。可以在任何合适的水平上，例如在mRNA或蛋白质水平上检测标志物的表达。本领域技术人员将容易理解，可以通过标志物的阳性或阴性表达来定义细胞，即细胞的特性和状态可以基于某种标志物的表达及其缺乏而同样地关联。当提及具体标志物时，表达的存在或缺乏可以分别用+(加号)或-(减号)符号来表示。
如本文所用的“ACVR1C”是1C型激活蛋白A受体。
如本文所用的“AMBP”是α-1-微球蛋白/尿抑胰酶素(bikunin)前体。
如本文所用的“BASP1”是脑富含膜附着信号蛋白1。
如本文所用的“CHRNA3”是胆碱能受体烟碱α3亚基。
如本文所用的“DCC”是编码导蛋白(netrin)1受体的基因。
如本文所用的“DLK1”是δ样非典型notch配体。
如本文所用的“EGFL7”是EGF样域蛋白多样7(EGF like domain multiple 7)。
如本文所用的“ELAVL2”是胚胎致死、异常视力、果蝇样2。
如本文所用的“FREM2”是FRAS1相关细胞外基质2。
如本文所用的“G6PC2”是葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基2。
如本文所用的“HMGCST”是3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶1。
如本文所用的“ISL1”是ISL LIM同源框1。
如本文所用的“LBH”是WNT信号通路的LBH调节物。
如本文所用的“MAFB”是MAF bZIP转录因子B。
如本文所用的“MARCKSL1”是MARCKS样1。
如本文所用的“NEFL”是轻肽神经丝蛋白。
如本文所用的“NEFM”是中肽神经丝蛋白。
如本文所用的“PCDH7”是原钙粘蛋白7。
如本文所用的“PCP4”是浦肯野细胞蛋白4。
如本文所用的“PLAGL1”是PLAG1样锌指1。
如本文所用的“PLXNA2”是丛蛋白A2。
如本文所用的“RAD21”是RAD21黏结蛋白复合物组分。
如本文所用的“RTN1”是网状内皮素(reticulon)1。
如本文所用的“SLC30A8”是溶质载体家族30成员8。
如本文所用的“SOX11”是SRY-框转录因子11。
如本文所用的“STARD10”是含StAR相关脂质转移域蛋白10(StAR related lipidtransfer domain containing 10)。
如本文所用的“ST6GALNAC5”是ST6 N-乙酰半乳糖胺α-2,6-唾液酰基转移酶5。
胰岛素表达或产生
胰岛素表达或产生是细胞合成胰岛素蛋白和/或胰岛素RNA的能力。在优选的实施方案中，本发明的β样细胞在移植后维持胰岛素表达。
胰岛素分泌
胰岛素分泌是细胞释放胰岛素的能力。在优选的实施方案中，本发明的β样细胞在移植后维持胰岛素分泌。
培养基/组合物
旨在支持细胞生长的固体、液体或半固体。不同类型的商业培养基用于培养不同类型的细胞。在优选的实施方案中，根据本发明的细胞培养物或组合物是体外细胞培养物或组合物。
除非在本说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。
通过以下非限制性实施方案进一步描述本发明：
1.在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中该方法包括鉴定β样细胞的步骤，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述β样细胞通过RNAseq进行筛选。
3.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述β样细胞使用qPCR、巢式PCR、ddPCR或其组合进行筛选。
4.多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
5.根据实施方案4所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中该群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合，并且其中所述β样细胞在移植后维持胰岛素表达和分泌。
6.根据实施方案4或5所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少55％的所述β样细胞包含一种或多种选自SOX11、FREM2、DCC、BASP1、CHRNA3和ELALV2的标志物，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
7.根据实施方案4至6中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少85％的所述β样细胞包含SOX11，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
8.根据实施方案4至6中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少75％的所述β样细胞包含FREM2，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
9.根据实施方案4至6中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少85％的所述β样细胞包含DCC，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
10.根据实施方案4至6中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少75％的所述β样细胞包含BASP1，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
11.根据实施方案4至6中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的所述β样细胞包含CHRNA3，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
12.根据实施方案4至6所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少55％的所述β样细胞包含ELALV2，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
13.根据实施方案4至9中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少75％的所述β样细胞包含SOX11、FREM2、DCC，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
14.根据实施方案10至12中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少55％的所述β样细胞包含BASP1、CHRNA3、ELAVL2。
15.根据实施方案4或5中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的所述β样细胞包含一种或多种选自ACVR1C、MARCKSL1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5和HMGCS1的标志物，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约1个平均对数倍数变化。
16.根据实施方案15所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少90％的所述β样细胞包含一种或多种选自ACVR1C、MARCKSL1、STARD10、AMBP的标志物，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约1个平均对数倍数变化。
17.根据实施方案15或16中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少95％的所述β样细胞包含ACVR1C，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高2个平均对数倍数变化。
18.根据实施方案15或16中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少95％的所述β样细胞包含MARCKSL1，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约2个平均对数倍数变化。
19.根据实施方案15或16中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少95％的所述β样细胞包含STARD10，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高1个平均对数倍数变化。
20.根据实施方案15或16中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少90％的所述β样细胞包含AMBP，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高2个平均对数倍数变化。
21.根据实施方案15所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少85％的所述β样细胞包含ST6GALNAC5，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约1个平均对数倍数变化。
22.根据实施方案15中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的所述β样细胞包含HMGCS1，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约1个平均对数倍数变化。
23.根据前述实施方案4至22中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述细胞还表达G6PC2。
24.根据前述实施方案中任一项所述的体外群体，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
25.根据前述实施方案4至24中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述包含β样细胞的群体在移植后维持胰岛素表达和分泌。
26.根据前述实施方案4至25中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述包含β样细胞的群体在移植后表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)反应。
27.根据前述实施方案4至26中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中一种或多种标志物表现出与移植后的平均血浆C-肽水平呈正相关
28.根据前述实施方案4至27中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述包含β样细胞的群体在移植后表现出血糖降低。
29.根据前述实施方案4至28中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其用作药物。
30.根据前述实施方案4至28中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其用于治疗糖尿病。
31.根据前述实施方案4至28中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其用于治疗1型糖尿病。
32.细胞培养物或组合物，其包含根据前述实施方案4至28中任一项所述的多能干细胞衍生细胞和细胞培养基。
33.可植入装置，其包含根据前述实施方案4至28中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体。
34.治疗1型糖尿病的方法，其中该方法包括向有需要的人施用根据前述实施方案4至28中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体。
35.冷冻保存的细胞培养物，其包含根据前述实施方案4至28中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体。
36.根据实施方案35所述的冷冻保存的多能干细胞衍生细胞群体，其中该细胞群体的至少50％、60％、70％、80％或90％是有活力的。
缩写列表
+ve：阳性
AGN：AGN 193109
ALK5：激活蛋白受体样激酶；
BC：β细胞
DE：定形内胚层
EP：内分泌祖细胞
GCG：胰高血糖素
hBS：人胚泡衍生干
hBSC：人胚泡衍生干细胞
hES：人胚胎干
hESC：人胚胎干细胞
hiPSC：人诱导多能干细胞
hPSC：人多能干细胞
LDN：LDN193189
PAX4：配对框4
PE：胰腺内胚层
RT：室温
SCID：重度联合免疫缺陷
SYT13：突触结合蛋白13
T3：三碘甲腺原氨酸
实施例1
干细胞衍生的β样细胞的亚群在移植后有助于胰岛素分泌
基于基因表达、分子特性、葡萄糖感测和胰岛素分泌，干细胞衍生细胞是异质的。该实验的目的是鉴定在移植后有助于产生胰岛素的干细胞衍生细胞或β样细胞的亚群。为了增加方案相关的细胞异质性，如以下表1所示，使用逐步分化方案的8种不同修改使人胚胎干细胞(hESC)分化为内分泌细胞簇。hESC被定向至定形内胚层(DE)，随后是胰腺内胚层(PE)，然后是内分泌祖细胞(EP)，最后生成产生胰岛素的β样细胞，分别如专利公布WO/2012/175633、WO2014/033322、WO2015/028614、WO2017/144695所述(通过引用整体并入本文)。
表1：八种(修改的)分化方案
Figure BDA0004097762230000311
为了鉴定在移植后有助于胰岛素表达和分泌的干细胞衍生细胞或β样细胞的亚群，在移植前使用单细胞RNA测序来分析从8种(修改的)分化方案中的每一种获得的细胞簇。使用accutase(Stem Cell Technologies)将细胞解离成单细胞，并使用RNA测序对每个方案2000-3000个细胞获得单细胞的基因表达谱。也包括人胰岛作为天然人β细胞的参考。在所有样品中整合所有细胞的基因表达数据，以使数据在不同条件之间具有可比性，并应用降维和聚类，使得具有相似基因表达谱的细胞独立于用来生成细胞的方案而分组在一起。总共鉴定了26个不同的细胞群体(图1b)，并显示所有方案都产生了相似的细胞群体，但比例非常不同(图1a)。为了鉴定那些最类似于天然人β细胞(簇16)的群体，将26个已鉴定的簇中的每一个与天然β细胞基因集进行比较，簇14、15和26获得与人β细胞簇(簇16)相似的评分，因此被鉴定为最类似于天然人β细胞的β样细胞群体(图2)。
为了确定动物移植后的胰岛素表达，将采用8种(修改的)分化方案中的每一种获得的许多分化细胞簇(对应于3000pIEQ)移植到免疫受损的SCID-beige小鼠的肾包膜下，每个方案每组有10只动物。作为植入人细胞的胰岛素分泌的测量，在移植后8周使用人C-肽ELISA(酶联免疫测定)测定血清样品中的人C-肽水平。通过将移植动物的平均循环人C-肽水平相对于簇14、15和26中的细胞百分比(相对于总细胞数)作图，发现这些簇中的细胞百分比与体内胰岛素分泌之间呈正相关(图6)。
总之，发现只有干细胞衍生细胞的亚群，即β样细胞，类似于天然人β细胞，并在移植后促进胰岛素分泌。表1、表2和表3中提供了描述和鉴定该亚群或β样细胞(簇14、15和26)的基因列表，参见下文提供的实施例2-4。该群体的鉴定和表征对于干细胞向β细胞分化方案的优化以及最终获得高效(即细胞使血糖正常化的能力)的β细胞疗法至关重要。
实施例2传统β细胞标志物无法预测移植后的胰岛素分泌
为了表明传统β细胞标志物本身不能预测体内功效，我们使用用于检测mRNA的纳米串(nanostring)或用于检测蛋白质的流式细胞术，测量了从8种修改方案获得的细胞群体中诸如NKX6.1、PDX1、PAX4、NKX2.2、SYT13等公知β细胞标志物的表达以及PDX1+/NKX6.1+的共表达。我们发现，这些标志物中没有一种与移植后8周动物的平均C-肽水平呈正相关(图7和图8b下图)。
通过单细胞序列分析，鉴定了数种以前已与β细胞相关联的标志物，包括SLC30A8。这些标志物列于以下的表2中。
表2-在最类似于β的细胞子集中富集的基因的列表
Figure BDA0004097762230000331
为了显示SLC30A8如何与另一种公知的β细胞标志物PDX1在干细胞衍生细胞中区分开来，我们展示了它们在所有已鉴定的簇中的表达(图8a)。我们发现SLC30A8在最类似于β的细胞(簇14、15和26)以及天然β细胞中高表达，并且在也表达GCG的簇24和25中有一定的表达。相反，尽管PDX1也在β细胞和最类似于β的细胞(簇14、15和26)中表达，但它也在几乎所有其他簇中表达。为了显示SLC30A8和PDX1与移植后胰岛素分泌的相关性，我们对于8种修改的方案在纳米串上测量了SLC30A8和PDX1 mRNA转录物的水平，并将其与移植后8周的体内平均C-肽水平进行了关联。我们发现，SLC30A8与移植后的循环人C-肽水平呈正相关(图8b，上图)，而PDX1与移植后的循环人C-肽水平呈负相关(图8b，下图)。PDX1在几乎所有细胞簇中的表达解释了为什么该标志物与体内胰岛素分泌呈负相关；尽管PDX1在天然β细胞和来自于干细胞培养物的最类似于β的细胞(簇14、15和26中的细胞)中表达，但在其他簇中的表达表明该标志物无法鉴定在移植后将成熟为完全功能性β细胞的细胞。由于我们表明某些经典β细胞标志物本身不能预测移植后的胰岛素分泌，因此我们认为前面提到的表2中列出的标志物的应用是新颖的。
为了进一步评估移植前后的细胞组成，我们对移植前的簇和移植后具有植入的人细胞的肾切片进行了免疫组织化学(IHC)。为了鉴定α和β细胞，我们使用了传统标志物，并针对C-肽、NKX6.1和胰高血糖素进行染色。我们发现，在所有8种方案中，有很高比例的细胞在移植前共表达C-肽/NKX6.1(图5，左图)，但只有一部分细胞在移植后维持C-肽/NKX6.1的这种共表达(图5，右图)。
总之，我们表明，大多数传统β细胞标志物不能预测移植后从体外干细胞衍生的内分泌细胞培养物分泌胰岛素。使用这些传统标志物进行细胞筛选或细胞选择可能会导致朝不希望的细胞亚群优化，这些细胞亚群在移植前可能看起来类似于β细胞，但在暴露于体内环境后会改变其表型。
实施例3
干细胞衍生的β样细胞类似于但不同于天然β细胞
为了鉴定在干细胞衍生的β样细胞中表达但在天然人β细胞中不表达的基因，通过单细胞RNAseq测量这些干细胞衍生的β样细胞的基因表达，并与天然人β细胞的基因表达进行比较。
为了获得天然人β细胞的基因表达，我们将来自两个不同人类供体的两个人胰岛样品的单细胞基因表达数据汇集在一起。为了鉴定胰岛内那些作为天然人β细胞的细胞，来自这些样品的每个细胞都针对天然胰岛亚型的基因集进行评分：α、β、δ、ε、γ、胰管、腺泡、内皮、星状细胞、导管细胞、巨噬细胞、肥大细胞和施旺细胞(图3)。将β细胞评分最高的细胞聚集在一起，以便与簇14、15和26进行比较。这两组的比较导致鉴定出干细胞衍生的β样细胞所特有的一组基因(表3)。
表3-干细胞衍生的β样细胞所特有的基因。
Figure BDA0004097762230000341
Figure BDA0004097762230000351
总之，我们鉴定了区分干细胞衍生的β样细胞与人天然β细胞的基因，表明这些细胞尽管相似，但与其天然对应物并不相同。
实施例4
ACVR1C是胰腺内分泌细胞的标志物，对于干细胞衍生的β细胞是新颖的，并且其表达与体内成熟后的胰岛素分泌相关
ACVR1C处于在簇14、15和26中表达的新基因的列表(表4)中，簇14、15和26在所有簇中被鉴定为最类似于天然人β细胞。
表4-簇14、15和26中富集的新基因的列表
Figure BDA0004097762230000352
Figure BDA0004097762230000361
通过使用实施例3中描述的方法，ACVR1C被鉴定为干细胞衍生的β样细胞所特有的，因为它在簇14、15和26中超过99％的细胞中表达，而在80％的天然人β细胞中不表达。其余20％的细胞显示出低ACVR1C表达(图9a)。ACVR1C在簇14、15和16中高表达，但在定位于其他胰腺内分泌亚型如胰腺α细胞和胰腺生长抑素细胞的其他簇中也显示一定的表达(图9b)。为了表明ACVR1C表达与体内胰岛素分泌呈正相关，我们在纳米串上测量了ACVR1CmRNA转录物的水平，并将其与移植后8周的体内平均C-肽水平进行了关联(图9c)。
总之，我们将ACVR1C鉴定为干细胞衍生的β样细胞的新颖且独特的标志物，它与移植后8周的体内C-肽水平相关。C-肽等同于胰岛素。测量人C-肽是因为它只能来自于移植的细胞，而不能来自于可能外部给予的胰岛素治疗。因此，ACVR1C可用于确立和优化干细胞衍生的β样细胞的方案。
实施例5
PCDH7是一种细胞外标志物，而PCP4是一种细胞内标志物，对最类似于β的细胞群体具有特异性
PCDH7和PCP4均在细胞簇14、15和26中表达(表4)，在我们的单细胞RNA测序数据集中，簇14、15和26在所有簇中被鉴定为最类似于天然人β细胞。与ACVR1C相比，PCDH7和PCP4显示出对簇14、15和26具有特异性的表达。在任何其他已鉴定的簇中没有发现或只发现极少的PCDH7和PCP4表达(图10a)。这些标志物的特异性使其适用于预测移植后的胰岛素分泌，并发挥它们用于鉴定和量化干细胞衍生的β样细胞以用作质量标志物的潜力。至于ACVR1C，我们在纳米串上测量了PCDH7和PCP4 mRNA转录物的水平，并将其与移植后8周小鼠体内的平均循环人C-肽水平进行了关联(图10b)。我们发现，这两种标志物与8周后的体内胰岛素分泌呈正相关。
由于PCDH7被鉴定为几乎仅在干细胞衍生的β样细胞中表达的细胞外标志物，因此它还可以用来从异质细胞群体中纯化干细胞衍生的β细胞。这可用于进一步表征或提高最终细胞治疗产品的功效和安全性。总之，我们将PCDH7和PCP4鉴定为对干细胞衍生的β细胞具有特异性。
实施例6
G6PC2是与体内胰岛素产生和体外胰岛素释放相关的标志物
为了鉴定可用于干细胞衍生的β样细胞的额外效力评价的标志物，我们针对所有8种方案修改测量了细胞在体外分泌胰岛素的能力。使用灌注系统测量胰岛素分泌，其中首先用10mM葡萄糖攻击细胞，随后用10mM葡萄糖+1000nM毒蜥外泌肽4进行第二次攻击，然后用IBMX和毛喉素进行第三次攻击。攻击期间分泌的胰岛素总量被定义为灌注曲线下面积，并相对于与体内胰岛素产生呈正相关的标志物进行作图。发现G6PC2在天然人β和α细胞(分别为单细胞RNA测序数据集中的簇16和22)和最类似于β的细胞簇14、15和26内的细胞子集中表达(图11a)。为了表明G6PC2表达与体内胰岛素产生呈正相关，我们在纳米串上测量了G6PC2 mRNA转录物的水平，并将其与移植后8周的体内平均C-肽水平进行了关联(图11b)。最后，为了验证其作为胰岛素分泌的潜在效力标志物的应用，我们将G6PC2表达与体外胰岛素分泌试验获得的曲线下面积进行了比较(图11c)。
总之，我们将GCPC2鉴定为在干细胞衍生的β样细胞中表达的标志物，其与体外胰岛素分泌相关，因此可用于测量干细胞的体外效力或向β细胞的体外分化。
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和改变。

Claims (15)

1.在多能干细胞衍生细胞的体外群体中筛选β样细胞的方法，其中所述方法包括鉴定β样细胞的步骤，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述β样细胞通过RNAseq进行筛选。
3.多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述群体包含至少15％的如下β样细胞，所述β样细胞表达NKX6.1与一种或多种选自ACVR1C、FREM2、CHRNA3、DCC、SOX11、MARCKSL1、BASP1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5、HMGCS1、ELAVL2、PCP4、PCDH7、NEFL、PLAGL1、EGFL7、RAD21、RTN1、PLXNA2、LBH、NEFM、SLC30A8、DLK1、MAFB和ISL1的标志物的组合，并且其中所述β样细胞在移植后维持胰岛素表达和分泌。
4.根据权利要求3所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少55％的所述β样细胞表达一种或多种选自SOX11、FREM2、DCC、BASP1、CHRNA3和ELALV2的标志物，其中所述标志物在天然人β细胞中不存在。
5.根据权利要求3所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中至少80％的所述β样细胞表达一种或多种选自ACVR1C、MARCKSL1、STARD10、AMBP、ST6GALNAC5和HMGCS1的标志物，其中所述标志物的表达水平比所述标志物在天然人β细胞中的表达至少高约1个平均对数倍数变化。
6.根据权利要求3所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述β样细胞还表达G6PC2。
7.根据前述权利要求中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
8.根据前述权利要求3至7中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述β样细胞在移植后表现出葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)反应。
9.根据前述权利要求3至8中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中一种或多种标志物表现出与移植后的平均血浆C-肽水平呈正相关。
10.根据前述权利要求3至9中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其中所述β样细胞在移植后表现出血糖降低。
11.根据前述权利要求3至10中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体，其用于治疗1型糖尿病。
12.细胞组合物，其包含根据前述权利要求3至10中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外细胞群体和细胞培养基。
13.可植入装置，其包含根据前述权利要求3至10中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外细胞群体。
14.冷冻保存的细胞培养物，其包含根据前述权利要求3至10中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体。
15.治疗1型糖尿病的方法，其中所述方法包括向有需要的人施用根据前述权利要求3至10中任一项所述的多能干细胞衍生细胞的体外群体。
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