CN102171330B - 多能干细胞的分化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使多能干细胞分化的方法。具体来讲，本发明涉及使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法和组合物。本发明还提供了产生和纯化能使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的试剂的方法。

Description

多能干细胞的分化
本发明要求于2008年6月30日提交的申请系列号61/076,889的优先权。
技术领域
本发明涉及使多能干细胞分化的方法。具体来讲，本发明涉及使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法和组合物。本发明还提供了产生和纯化能使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的试剂的方法。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞表达多种标志物，例如，HNF-3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰-十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
据报道，从小鼠的胚胎细胞衍生了带有胰岛细胞特征的细胞。例如，Lumelsky等人(Science 292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干细胞向类似胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes 49：157，2000)报道，衍生自小鼠 胚胎干细胞的胰岛素分泌细胞使链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠中的血糖变正常。
例如，Hori等人(PNAS 99：16105，2002)揭示，用磷酸肌醇3-激酶(LY294002)的抑制剂处理小鼠胚胎干细胞产生了类似β细胞的细胞。
又如，Blyszczuk等人(PNAS 100：998，2003)报道，从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞产生了胰岛素生成细胞。
Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成Pdx1阳性胰腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第4天的培养物中时视黄酸是诱导Pdx1最有效的(Diabetes 54：301，2005)。
Miyazaki等人报道了过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果显示，外源Pdx1表达在所得的分化细胞中明显增强了胰岛素、生长抑素、葡萄糖激酶、神经元素3、P48、Pax6和HNF6基因的表达(Diabetes 53：1030，2004)。
Skoudy等人报道说，激活素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛素和胰高血糖素)的表达。
使用1nM激活素A时观察到最大的效果。他们还观察到，胰岛素和Pdx1mRNA的表达水平不受视黄酸的影响；然而，3nM FGF7处理导致Pdx1的转录水平升高(Biochem.J.379：749，2004)。
Shiraki等人研究了特别地增强胚胎干细胞分化为Pdx1阳性细胞的生长因子的效应。他们观察到，TGFβ2可再现地产生更高比例的PDX1阳性细胞(Genes Cells.2005年6月；10(6)：503-16)。
Gordon等人阐明了在不存在血清的情况下和在存在激活素连同Wnt信号转导抑制剂的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导brachyury[阳性]/HNF-3β[阳性]内胚层细胞(US 2006/0003446A1)。
Gordon等人(PNAS，第103卷，第16806页，2006年)声称：“Wnt和TGFβ/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产生所必需”。
然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物(例如人)中的发育程序。
Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science 282：114，1998)。同时，Gearhart和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726，1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件下(美国专利No.6,200,806、WO99/20741、WO 01/51616)。
D′Amour等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下生产人胚胎干细胞衍生定形内胚层的富集培养基(D′Amour K A等人，2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官的特性的更成熟细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞可进一步分化成Pdx1阳性细胞(US 2005/0266554A1)。
D′Amour等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401(2006))声称：“我们已开发出使人胚胎干(hES)细胞转化成能够合成胰腺激素胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和生长激素释放肽的内分泌细胞的分化方法。该方法通过引导细胞经过类似于定形内胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素的细胞来模拟体内胰腺器官发生”。
又如，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(US2006/0040387A1)。在该情形中，分化途径分成三个阶段。首先，使用正丁酸盐和激活素A的组合，使人胚胎干细胞分化为内胚层。然后将细胞与TGFβ拮抗剂如Noggin并结合EGF或β细胞素(betacellulin)一起进行培养，以产生Pdx1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
在一个例子中，Benvenistry等人声称：“我们得出如下结论：PDX1的过量表达增强了胰富集基因的表达，胰岛素表达的诱导可能需要仅存在于体内的额外的信号(Benvenistry等人，Stem Cells 2006；24：1923-1930)。
激活素A是表现出广泛生物活性的TGF-β家族成员，所述生物活性包括调控细胞增殖和分化以及促进神经元存活。激活素A是由两个激活素βA亚基组成的同型二聚体，其由抑制素(inhibin)A基因编码。其他激活素已知是由βA、βC、βD和βE的同型二聚体或异型二聚体组成的。例如，激活素B由两个βB亚基的同型二聚体组成。包含βA亚基和βB亚基的肽具有63％的同一性，并且八个半胱氨酸的位置在这两种肽序列中均是保守的。
激活素A通过与受体结合而对细胞施加其影响。所述受体由异聚受体复合物组成，该复合物由两种类型的受体(I型(ActR-I)和II型(ActR-II))组成，每一种含有细胞内的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。这些受体在结构上与小的富半胱氨酸细胞外区域和由激酶结构域构成的细胞内区域相似。ActR-I(但ActR-II不是)在近膜结构域中具有富含甘氨酸和丝氨酸残基的区域(GS结构域)。激活素A首先与ActR-II结合，后者以与组成性活性激酶形成的低聚体形式存在于细胞膜中。在缺乏ActR-II的情况下，ActR-I(其也作为低聚体形式存在)不能结合激活素A。在激活素A结合后，ActR-I被募集与ActR-II形成复合物。ActR-II然后使ActR-I在GS结构域磷酸化并激活其相应的激酶。
激活素A的分离和纯化通常是复杂的，通常会导致产率低。例如，Pangas，S.A.和Woodruff，T.K声称：“抑制素和激活素是具有包括调节垂体FSH分泌在内的各种生理作用的蛋白质激素”。类似于转化生长因子-β基因家族的其他成员，它们经历从较大前体分子加工以及组装成功能性二聚体。从天然来源分离抑制素和激活素仅能生产有限量的生物活性蛋白质(J.Endocrinol.172(2002)199-210)。
又如，Arai，K.Y.等人声称：“激活素是属于转化生长因子-β超家族的多功能生长因子。从天然来源分离激活素需要许多步骤并仅产生有限的量。尽管重组制剂已用于近来的研究，但重组激活素的纯化仍需要多个步骤”(Protein Expression and Purification49(2006)78-82)。
已投入相当大的努力来开发更有效或更便宜的激活素A替代物。例如，US5215893公开了用于在重组细胞培养中制备蛋白质的方法，所述蛋白质含有抑制素的α或β链。具体来讲，其涉及用于获得或使用编码抑制素的DNA，以及用于制备抑制素变体的方法，所述抑制素变体与天然的动物或人的抑制素的氨基酸序列及其天然存在的等位基因有所差别。
又如，US5716810公开了用于在重组细胞培养中制备蛋白质的方法，所述蛋白质含有抑制素的α或β链。具体来讲，其涉及用于获得或使用编码抑制素的DNA，以及用于制备抑制素变体的方法，所述抑制素变体与天然的动物或人的抑制素的氨基酸序列及其天然存在的等位基因有所差别。
又如，US5525488公开了用于在重组细胞培养中制备蛋白质的方法，所述蛋白质含有抑制素的α或β链。具体来讲，其涉及用于获得或使用编码抑制素的DNA，以及用于制备抑制素变体的方法，所述抑制素变体与天然的动物或人的抑制素的氨基酸序列及其天然存在的等位基因有所差别。
又如，US5665568公开了用于在重组细胞培养中制备蛋白质的方法，所述蛋白质含有抑制素的α或β链。具体来讲，其涉及用于获得或使用编码抑制素的DNA，以及用于制备抑制素变体的方法，所述抑制素变体与天然的动物或人的抑制素的氨基酸序列及其天然存在的等位基因有所差别。
又如，US4737578公开了分子量约32,000道尔顿的具有抑制素活性的蛋白质。所述分子由两条分子量分别约18,000和约14,000道尔顿的链构成，这两条链通过二硫键键合而结合在一起。该18K链从人抑制素基因获得并且具有如下分子式：H-Ser-Thr-Pro-Leu-Met-Ser-Trp-Pro-Trp-Ser-Pro-Ser-Ala-Leu-Arg-Leu-Leu-Gln-Arg-Pro-Pro-Glu-Glu-Pro-Ala-Ala-His-Ala-Asn-Cys-His-Arg-Val-Ala-Leu-Asn-Ile-Ser-Phe-Gln-Glu-Leu-Gly-Trp-Glu-Arg-Trp-Ile-Val-Tyr-Pro-Pro-Ser-Phe-R.sub.65-Phe-His-Tyr-Cys-His-Gly-Gly-Cys-Gly-Leu-His-Ile-Pro-Pro-Asn-Leu-Ser-Leu-Pro-Val-Pro-Gly-Ala-Pro-Pro-Thr-Pro-Ala-Gln-Pro-Tyr-Ser-Leu-Leu-Pro-Gly-Ala-Gln-Pro-Cys-Cys-Ala-Ala-Leu-Pro-Gly-Thr-Met-Arg-Pro-Leu-His-Val-Arg-Thr-Thr-Ser-Asp-Gly-Gly-Tyr-Ser-Phe-Lys-Tyr-Glu-Thr-Val-Pro-Asn-Leu-Leu-Thr-Gln-His-Cys-Ala-Cys-Ile-OH，其中R.sub.65是Ile或Arg。该18K链通过与14K链的二硫键键合来连接。
因此，仍存在对更便宜、更有效的激活素A替代物的巨大需要，以便于多能干细胞的分化。
发明内容
本发明提供能够使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物细胞的化合物。在一个实施例中，所述能够使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的化合物是包含含有至少一个点突变的激活素A氨基酸序列的肽。
在一个实施例中，本发明提供了使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括用培养基处理所述多能干细 胞，持续足以使所述多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的一段时间，所述培养基含有肽，所述肽包含含有至少一个点突变的激活素A的氨基酸序列。
附图说明
图1示出了肽ACTN 2至肽ACTN 48的系统树。
图2示出了肽ACTN 49至肽ACTN 94的系统树。
图3示出了克隆进pcDNA3.1(-)中的野生型激活素A的原区(pro-region)的核酸序列。
图4示出了克隆进pcDNA3.1(-)中的ACTN 1的成熟区的核酸序列。
图5示出了克隆进pcDNA3.1(-)中的ACTN 1的全长基因(含有原区和成熟区)的核酸序列。
图6示出了ACTN 1(◆ACTN 1WT)和对照激活素A(■和▲OriGeneWT)使人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的能力。将克隆进它们各自的哺乳动物表达载体的ACTN 1(◆ACTN 1WT)和野生型对照激活素A(■OriGene WT)转染进HEK293-E细胞，将获得的纯上清液(未浓缩)或浓缩的上清液(浓缩)以所示出的测定稀释度添加至人胚胎干细胞。通过测量相对于未处理过的对照细胞的SOX17强度表达来确定分化。
图7示出了用于获得本发明的肽的表达构建体。分图A示出了克隆进pUNDER中的ACTN 1的全长基因(含有原区和成熟区)的核酸序列。分图B示出了该表达载体的图形表示。
图8示出了克隆进它们各自的哺乳动物表达载体的ACTN 1和野生型激活素A对照使人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的能力。分图A示出了上清液对测定细胞数目的作用。将克隆进pUNDER中的ACTN 1和克隆进pCMV6-XL4中的野生型激活素A对照(OriGene)转染进HEK293-F细胞(白色柱条)和CHO-S细胞(黑色柱条)中，并在定形内胚层生物测定法中以所示稀释度测试所获得的纯上清液或10倍浓缩上清液。所示的数据代表相对于未处理过的细胞的变化。分图B示出了上清液对SOX17表达的作用。将克隆进pUNDER中的ACTN 1和克 隆进pCMV6-XL4中的野生型激活素A对照(OriGene)转染进HEK293-F细胞(白色柱条)和CHO-S细胞(黑色柱条)中，并在定形内胚层生物测定法中以所示稀释度测试所获得的纯上清液或10倍浓缩上清液。所示的数据代表相对于未处理过的细胞的变化。
图9示出了本发明的肽在用pUNDER载体转染过的HEK293-F细胞的上清液中的表达，所述载体含有编码所标明的全长肽(ACTN 2、ACTN 4、ACTN 5、ACTN 6、ACTN 7和ACTN 8)的基因。获得上清液，并通过蛋白质印迹，用抗激活素A抗体探测细胞膜进行分析。
图10示出了本发明的肽在用pUNDER载体转染过的HEK293-F细胞的上清液中的表达，所述载体含有编码所标明的全长肽(ACTN 9、ACTN10、ACTN 11、ACTN 12、ACTN 14、ACTN16、ACTN 17、ACTN 18、ACTN 19、ACTN 20、ACTN 21、ACTN 22和ACTN 23)的基因。获得上清液，并通过蛋白质印迹，用抗激活素A抗体探测细胞膜进行分析。
图11示出了本发明的肽的表达，所述肽被进一步修饰而含有组氨酸置换。将HEK293-F细胞用含有编码ACTD 17、ACTD 18、ACTD 19、ACTD20、ACTD 21和ACTD 22的基因的pUNDER载体转染。获得上清液，通过蛋白质印迹，用抗激活素A抗体(Mab 3381-左手边)或抗前体抗体(Mab1203-右手边)探测细胞膜进行分析。
图12示出了ACTD 20的代表性IMAC纯化曲线。上样后，洗涤柱子并用20柱体积用线性梯度的咪唑(0-500mM)洗脱蛋白质。
图13示出了ACTD 17、ACTD 18、ACTD 19、ACTD 20、ACTD 21和ACTD 22的咪唑级分的蛋白质印迹洗脱图。
图14示出了来自用含有卵泡抑素基因ACTA 1、ACTA 2和ACTA 3的载体转染的HEK293-F细胞的上清液的卵泡抑素变体表达的代表性蛋白质印迹。用所标明的抗体对细胞膜进行探测。
图15示出了ACTA 3(分图A)的代表性IMAC纯化曲线。上样后，洗涤柱子并用分级梯度的咪唑(10mM、50mM、150mM、250mM和500mM)洗脱蛋白质。分图B示出了IMAC纯化的洗脱曲线的银染色凝胶。
图16示出了使用ACTA 3亲和柱时肽变体ACTN 1的代表性纯化的蛋白质印迹(分图A和B)。用所标明的抗体对细胞膜进行探测。分图C示出了使用ACTA 3亲和柱时肽变体ACTN1的代表性纯化的银染色凝胶。
图17示出了人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。分化通过使用IN Cell Analyzer 1000(GE Healthcare)测量细胞数目(分图A)和SOX17强度(分图B)来确定。用含有20ng/ml Wnt3a加标明浓度的激活素的培养基(黑色柱条)或缺少Wnt3a但具有指定浓度的激活素的培养基(白色柱条)处理人胚胎干细胞共四天。
图18示出了ACTN 1(白色柱条)和对照激活素A(有阴影线的柱条和实心柱条)使人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的能力。获得来自用克隆进pcDNA3.1(-)中的ACTN 1(白色柱条)和对照激活素A(带阴影线的柱条)转染的HEK293-E细胞的上清液并浓缩，然后以所示稀释度添加至人胚胎干细胞。通过测量SOX17强度确定分化。
图19示出了使用激活素A人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。分图A示出了使用市售重组人激活素A并测量SOX17强度时的人胚胎干细胞分化的标准曲线。将细胞用所标明浓度的激活素A处理四天。所示数据为用IN Cell Analyzer1000(GE Healthcare)检测的SOX17的平均表达水平。分图B示出了ACTN 1使人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的能力。将来自用克隆进pUNDER(pUNDER)中的ACTN 1和克隆进pCMV6-XL4中的野生型激活素A对照(OriGene)转染过的HEK293-F细胞(白色条柱)和CHO-S细胞(黑色条柱)的上清液以所标明的浓度添加至人胚胎干细胞，并测定SOX17表达水平四天。
图20示出了激活素A ELISA的重组人激活素A(由生产商提供)的标准曲线(分图A)。分图B比较了激活素A ELISA中的两种市售重组人激活素A标准品的标准曲线，其中中空方块(□)指示由生产商(R&D Systems)提供的激活素A标准品而实心三角(▲)指示购自Peprotech的激活素A。
图21示出了在分化第一个步骤期间的多种处理后CXCR4表达的流式细胞检测分析。针对用激活素A处理或未用激活A处理或用两种变体组氨 酸肽(ACTD3和ACTD8)处理，示出了CXCR4阳性细胞百分比的直方图，所述百分比以未纯化的上清液母液或IMAC纯化材料进行测试。
图22分图A至I示出了SOX17表达的相对百分比强度对给定肽浓度的剂量滴定，其中肽浓度先前从ELISA结果计算得到。在每个分图中，代表性曲线将野生型激活素A(ACTN1)与变体肽进行了比较。代表性R2值示出了每一曲线的相对拟合度。
图23示出了针对定形内胚层的多种代表性标志物，使用流式细胞检测分析、PCR和高内涵测量在分化的第一个步骤结束时的结果。分图A示出了在分化处理期间使用商业来源的激活素A或野生型ACTN1肽时CXCR4表达的FACS分析。图B示出了两种变体肽(ACTN4和ACTN48)与野生型ACTN1肽相比较的CXCR4表达。分图C至F示出了在用野生型激活素A或各变体肽处理后，在分化的第一个步骤结束时细胞数目和SOX17表达的高内涵分析。分图G和H示出了在用野生型ACTN1或变体肽ACTN4或ACTN48处理后，在分化的第一个步骤结束时SOX17和FOXA2基因表达的RT-PCR结果。插入的表框示出了每一种基因标志物的CT值。
图24示出了在分化的第一个步骤期间用野生型ACTN1或变体肽ACTN4或ACTN48处理后，在分化的第三个步骤结束时的结果。结果图示了细胞数目(分图A和B)、PDX1蛋白表达(分图C和D)、CDX2蛋白表达(分图E和F)的高内涵分析，或PDX1或CDX2(分图G和H)的RT-PCR结果。插入的表框示出了每一种基因标志物的CT值。
图25示出了在分化的第一个步骤期间用野生型ACTN1或变体肽ACTN4或ACTN48处理后，在分化的步骤四结束时的RT-PCR结果。插入的表框示出了每一种基因标志物的CT值。
具体实施方式
将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或举例说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。
干细胞根据其发育潜能分为：(1)全能，指能够产生所有的胚胎和胚胎外细胞类型；(2)多能，指能够产生所有的胚胎细胞类型；(3)专能，指能够产生细胞谱系的亚群，但在特定组织、器官或生理系统内能产生所有的细胞(例如造血干细胞(HSC)可产生的后代细胞包括：HSC(自我更新型)、局限于血细胞的寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能够产生比多能干细胞更有限的细胞谱系亚群；以及(5)单能，指能够产生单一细胞谱系(如生精干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。去分化指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)程度较低的地位的过程。如本文所用，“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物是指与所关注谱系的细胞表型特异性相关并能够用于评价非定向细胞向所关注谱系的分化的特征。
“β-细胞谱系”指对于转录因子PDX1和下列转录因子中的至少一种具有阳性基因表达的细胞：NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF-3β、MAFA、PAX4或PAX6。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞包括β细胞。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”、或“第1阶段细胞”或“第1阶段”指表达至少一种如下标志物的细胞：SOX17、GATA4、HNF-3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒 蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细胞。
如本文所用，“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：PDX1、HNF-1β、PTF-1α、HNF6或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞、原肠管细胞和后前肠细胞。
如本文所用，“表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞”或“第5阶段细胞”或“第5阶段”指表达至少一种下列标志物的细胞：NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4或PTF-1α。表达胰内分泌系特征性标志物的细胞包括胰内分泌细胞、胰激素表达细胞、胰激素分泌细胞和β细胞系的细胞。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列标志物：HNF-3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。
如本文所用，“胚胎外内胚层”指表达至少一种下列标志物的细胞群体：SOX7、AFP或SPARC。
如本文所用，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。关于这一点，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。与其他细胞相比，所关注细胞中的核酸或多肽标志物的可检测水平足够高或足够低，使得可以使用本领域已知的多种方法识别所关注细胞，并将所关注细胞与其他细胞区相区分。
如本文所用，“中内胚层细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、SOX17、DKK4、HNF-3β、GSC、FGF17或GATA6。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”指能够表达至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
如本文所用，“胰腺内胚层细胞”或“第4阶段细胞”或“第4阶段”指能够表达至少一种下列标志物的细胞：NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、PAX4或NKX2.2。
如本文所用，“胰腺激素分泌细胞”指能够分泌至少一种下列激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素或胰多肽。
如本文所用，“胰腺激素分泌细胞”指能够分泌至少一种以下激素的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素或胰多肽。
如本文所用，“后前肠细胞”或“第3阶段细胞”或“阶段3”指能够分泌至少一种下列标志物的细胞：PDX1、HNF1、PTF1α、HNF6、HB9或PROX1。
如本文所用，“前原条细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：Nodal或FGF8。
如本文所用，“原肠管细胞”或“第2阶段细胞”或“第2阶段”指能够分泌至少一种下列标志物的细胞：HNF1或HNF4α。
如本文所用，“原条细胞”指表达至少一种下列标志物的细胞：Brachyury、Mix样同源盒蛋白或FGF4。
本发明的肽
本发明提供能够使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物细胞的肽。在一个实施例中，本发明的肽是包含含有至少一个点突变的激活素A氨基酸序列的肽。所述至少一个点突变可位于激活素A的有助于结合受体的区域内。或者，所述至少一个点突变可位于激活素A的处于同型二聚体界面内的区域内。
本发明的肽可含有一个点突变。或者，本发明的肽可含有多个点突变。在一个实施例中，所述至少一个点突变通过分析激活素A的晶体学结构来确定，其中选择具体的氨基酸残基用于突变。所述至少一个点突变可为至少一个氨基酸残基插入的形式。或者，所述至少一个点突变可为至少一个氨基酸残基缺失的形式。或者，所述至少一个点突变可为至少一个氨基酸残基置换的形式。
至少一个氨基酸的置换可为特定位置处的至少一个随机氨基酸置换的形式。或者，至少一个氨基酸的置换可为特定位置处的至少一个特定氨基酸 置换的形式。在一个实施例中，用于置换的至少一个特定氨基酸用计算机预测来选择，使得所述至少一个具体氨基酸的置换将对所得的同型二聚体的形成没有影响。
在一个实施例中，将至少一个点突变引入激活素A氨基酸序列的至少一个选自如下的氨基酸残基：10I、16F、39Y、41E、43E、74F、75A、76N、77L、78K、79S和82V。
在一个实施例中，将至少一个点突变引入激活素A氨基酸序列的至少一个选自如下的氨基酸残基16F、18V、19S、20F、37A、38N、39Y、41E、74F、82V、107N、109I、110V和116S。
本发明的肽的氨基酸序列可在表1中找到。
在一个实施例中，将本发明的肽的氨基酸序列回译成核酸序列。可合成该核酸序列并将其插入表达载体以使得能在哺乳动物中表达。可将该核酸序列插入表达载体pcDNA3.1(-)中。或者，可将核酸序列插入pcDNA3.1(-)载体的变体中，其中所述载体已被改变以增强该插入的核酸序列在哺乳动物中的表达。在一个实施例中，pcDNA3.1(-)载体的变体称为pUNDER。
本发明的肽的核酸序列可在表2中找到。
可将含有本发明的肽的核酸序列的表达载体瞬时转染进哺乳动物细胞中。或者，可将含有本发明的肽的核酸序列的表达载体稳定转染进哺乳动物细胞中。任何转染方法均适用于本发明。这种转染方法可以是(例如)CaCl2介导的转染或LIPOFECTAMINETM-介导的转染。对于合适的转染方法的例子，请参见实例2。
可将哺乳动物细胞在悬浮液中培养，或者作为另一种选择，作为单层培养。可用于本发明的哺乳动物细胞的例子可在实例2中找到，并且可在实例3中找到可用于本发明的替代哺乳动物细胞。
在一个替代实施例中，本发明的肽可在昆虫细胞表达系统，例如Kron，R等人(Journal of Virological Methods 72(1998)9-14)中描述的系统中表达。
本发明的肽的纯化
可将本发明的肽从它们在其中表达的哺乳动物中分离。在一个实施例中，可对哺乳动物进行分级，并移出含有本发明的肽的上清液。可从上清液中纯化所述肽。或者，可直接使用上清液。在直接使用上清液的情况中，将 上清液直接施用给人多能干细胞。在一个实施例中，在将上清液施用给人胚胎干细胞之前对其浓缩。
在从上清液纯化本发明的肽的情况中，可用任何合适的蛋白质纯化技术，例如尺寸排阻色谱法纯化所述多肽。在一个实施例中，通过亲和色谱纯化本发明的肽。
在一个实施例中，通过包括如下步骤的方法纯化本发明的肽：
a.用编码本发明的肽的载体转染细胞，
b.让所述肽在所述细胞中表达，
c.将细胞进行分级并收集含有所述肽的上清液，
d.使所述上清液通过亲和纯化柱，该柱填充有含有能够特异性结合所述肽的配体的固相基质，以及
e.将结合的肽从固相基质洗脱，洗脱液含有所述肽的纯化制剂。
在一个实施例中，能够特异性结合本发明的肽的配体是卵泡抑素。
在一个实施例中，进一步修饰本发明的肽以含有至少一个能够特异性结合亲和纯化柱中的固相基质上的配体的区域。在一个实施例中，进一步修饰本发明的肽以在它们的氨基酸序列中含有至少一个金属结合位点。所述进一步的修饰可包括删减氨基酸残基以形成能够特异性结合亲和纯化柱中的固相基质上的配体的区域。作为另一种选择，所述进一步的修饰可包括插入氨基酸残基以形成能够特异性结合亲和纯化柱中的固相基质上的配体的区域。作为另一种选择，所述进一步的修饰可包括置换氨基酸残基以形成能够特异性结合亲和纯化柱中的固相基质上的配体的区域。在一个实施例中，所述至少一个金属结合位点由两个组氨酸残基组成。在一个实施例中，将组氨酸残基置换进所述肽的包含含有至少一个点突变的激活素A氨基酸序列的氨基酸序列中。表3列出了已进一步修饰而含有金属结合位点的本发明的肽。在这些实施例中，能够特异性结合所述肽的配体是镍。
在一个替代实施例中，根据Pangas，S.A.和Woodruff(J.Endocrinol.172(2002)199-210)中描述的方法纯化本发明的肽。
在一个替代实施例中，根据Arai，K.Y.等人(Protein ExpressionandPurification 49(2006)78-82)描述的方法纯化根据本发明的肽。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的特性描述
可通过(例如)以下方法来确认多能干细胞的多能性：将细胞注入严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的体内，使用4％的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后用组织学方法检查来自三种胚层的细胞类型的证据。或者，可通过产生拟胚体并评估拟胚体的与三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。
可以使用标准G带技术并比较已公布的相应灵长类物种的核型来分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意指细胞为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。
多能干细胞的来源
可使用的多能干细胞的类型包括确立多能细胞系。非限制性的例子是已建立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCell)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如BG01v(BresaGen，Athens，GA)。
在一个实施例中，人胚胎干细胞是如Thomson等人所述制备(美国专利No.5,843,780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133ff.，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：7844，1995)所描述方法制备人胚胎干细胞。
在一个实施例中，如Takahashi等人(Cell131：1-12，2007)所述制备多能干细胞。
多能干细胞的培养
在一个实施例中，通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可以多种方式支持多能干细胞。或者，在培养系统中培养多能干细胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞包，但同样支持多能干细胞的增殖而不会进行显著的分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持多能干细
可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的培养基质是胞外基质成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受体-配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养基材是 (Becton Dickenson)。是来自于Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下会发生胶化从而形成重构基底膜。
其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。
可在存在可促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基存在的情况下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
合适的培养基可用如下组分制备，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM)，Gibco # 11965-092；Knockout达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KODMEM)，Gibco # 10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基；200mML-谷氨酰胺，Gibco # 15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140-050；β-巯基乙醇，Sigma # M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco# 13256-029。
从多能干细胞形成胰腺激素生成细胞
在一个实施例中，本发明提供一种从多能干细胞产生胰腺激素生成细胞的方法，该方法包括如下步骤：
a.培养多能干细胞，
b.使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c.使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，并且
d.使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是胰腺激素生成细胞。在一个替代方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞可表达PDX1和至少一种下列转录因子：NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF-3β、MAFA、PAX4或PAX6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。
适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9(NIH编码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH编码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH编码：WA07)和人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，瑞典)。同样适用于本发明的是表达至少一种下列多能细胞特征性标志物的细胞：ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、连接蛋白43、连接蛋白45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60或Tral-81。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX17、GATA4、HNF-3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞为原条前体细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞为中内胚层细胞。在一个替代方面，表达定形内胚层谱系特征性标记物的细胞为定形内胚层细胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、HNF-1β、PTF1α、HNF6、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标记物的细胞为胰腺内胚层细胞。
胰腺内分泌谱系特征性标志物选自NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4和PTF-1α。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达以下激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的细胞为表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标记物的细胞为胰腺内分泌细胞。 胰腺内分泌细胞可以是胰激素表达细胞。或者，胰腺内分泌细胞可以是胰激素分泌细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
在本发明的一个方面，可通过用含有本发明的肽的培养基处理所述多能干细胞，持续足以使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的时间，而使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
可用含有本发明的肽的培养基处理所述多能干细胞约一天至约七天。作为另一种选择，可用含有本发明的肽的培养基处理所述多能干细胞约一天至约六天。作为另一种选择，可用含有本发明的肽的培养基处理所述多能干细胞约一天至约五天。作为另一种选择，可用含有本发明的肽的培养基处理所述多能干细胞约一天至约四天。作为另一种选择，可用含有本发明的肽的培养基处理所述多能干细胞约一天至约三天。作为另一种选择，可用含有本发明的肽的培养基处理所述多能干细胞约一天至约两天。在一个实施例中，可用含有本发明的肽的培养基处理所述多能干细胞约四天。
可在饲养细胞层上培养多能干细胞。或者，可在细胞外基质上培养多能干细胞。
在本发明的一个方面中，将多能干细胞在涂覆有细胞外基质的组织培养基质上培养和分化。细胞外基质可以是从小鼠肉瘤细胞提取的可溶性基底膜制剂(其可由BDBiosciences以商品名MATRIGELTM销售)。作为另一种选择，细胞外基质可以是低生长因子MATRIGELTM。作为另一种选择，细胞外基质可以是纤粘蛋白。在一个替代实施例中，将多能干细胞在包被有人血清的组织培养基质上培养和分化。
可在对组织培养基底进行包被前，将细胞外基质进行稀释。适用于稀释细胞外基质以及适用于包被组织培养基材的方法的例子可在如下文献中找到：Kleinman，H.K.等人，Biochemistry 25：312(1986)或Hadley，M.A.等人，J.Cell.Biol.101：1511(1985)。
在一个实施例中，细胞外基质是MATRIGELTM。在一个实施例中，组织培养基材包被有以1∶10稀释的MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶15稀释的MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组 织培养基材包被有以1∶30稀释的MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶60稀释的MATRIGELTM。
在一个实施例中，细胞外基质是低生长因子MATRIGELTM。在一个实施例中，组织培养基材包被有以1∶10稀释的低生长因子MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶15稀释的低生长因子MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶30稀释的低生长因子MATRIGELTM。在一个替代实施例中，组织培养基材包被有以1∶60稀释的低生长因子MATRIGELTM。
可用含有本发明的肽的培养基处理多能干细胞，所述肽已从表达所述肽的细胞的上清液纯化。作为另一种选择，可用含有本发明的肽的培养基处理多能干细胞，所述肽未从表达所述肽的细胞的上清液纯化。
在其中用含有未从表达本发明肽的细胞的上清液纯化的所述肽的培养基处理多能干细胞的情况中，可以约1∶10稀释度至约1∶100的终浓度使用所述上清液。在一个实施例中，上清液以约1∶10稀释度至约1∶50的终浓度使用。在一个实施例中，上清液以约1∶10稀释度至约1∶40的终浓度使用。在一个实施例中，上清液以约1∶20稀释度至约1∶50的终浓度使用。
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在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQHFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANRGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNYCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSKMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNTCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECMGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNYCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCTGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDLGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQLGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCAGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANSCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDRGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNTCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECGGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPHANRGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQLFGRTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQLFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQEFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFAQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCV。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCV。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCV。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFSQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT。
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在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQMFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGKAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQQMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGRAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQMFGKAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT。
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在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCV。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQLFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGRAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGRTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT。
在一个实施例中，用含有如下肽的培养基处理多能干细胞：GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMVAEECGCT。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可通过在进行特定方案之前或之后检测该标志物的存在来确定。多能干细胞通常不表达这类标志物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多潜能细胞的分化。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA印迹法、原位杂交法(参见例如，Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人(编辑)，2001增补版))和免疫测定法(如对切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印迹法，对于在完整细胞中可接近的标志物而言有流式细胞术分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，UsingAntibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring HarborLaboratoryPress(1998))。
例如，多能干细胞的特征是本领域技术人员所熟知的，并且多能干细胞的其他特征不断地被鉴别。多能干细胞标志物包括(例如)一种或多种如下物质的表达：ABCG2、cripto、FOXD3、连结素43、连结素45、OCT4、SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60或Tral-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过将处理过的细胞群体暴露于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物(例如CXCR4)来进行纯化。
表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
可通过用成纤维细胞生长因子和hedgehog信号转导途径抑制剂KAAD-环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，并随后将所述细胞在含有视黄酸、成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/736,908中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请序列号11/779,311中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，根据序列号为60/990,529的美国专利申请中公开的方法，通过处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。
可以将表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用至少一种其他额外的因子进行处理，这些因子可增强表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内胚层谱系特 征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(例如，GDF-5、-6、-8、-10、-11)、胰胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体TM、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂(例如，三亚乙基五胺)、毛喉素、丁酸-Na、激活素、β细胞素、ITS、成头蛋白、神经突生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27添加剂(Gibco，CA)、甾体类生物碱(例如，环巴胺(EMD，CA))、角质细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体提取物、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印第安豪猪蛋白、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内胚层谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内胚层谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内胚层谱系特征性特性。胰腺内胚层谱系的特异性标志物包括一种或多种转录因子，例如Hlxb9、PTF-1a、PDX-1、HNF-6、HNF-1β的表达。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹法、原位杂交法(参见例如，Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人(编辑)，2001增补版))和免疫测定法(如对切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印迹法，对于在完整细胞中可接近的标志物而言有流式细胞术分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring HarborLaboratoryPress(1998))。
表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成
可通过本领域的任何方法或通过本发明公开的任何方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401(2006)中公开的方法，使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培养基中进行培养，然后移除含有DAPT和毒蜥外泌肽-4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。这个方法的一个例子在NatureBiotechnology 24，1392-1401(2006)中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，然后移除该含有毒蜥外泌肽4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和HGF的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有DAPT和毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志 物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，可通过将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽4的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/736,908中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号11/779,311中公开的方法，通过用可抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，根据转让给LifeScan，Inc.的美国专利申请系列号60/953,178中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导途径的因子处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，通过根据序列号为60/990,529的美国专利申请中公开的方法处理表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，本发明提供了用于增加与胰腺内分泌谱系相关的标志物的表达的方法，所述方法包括用包含足量的TGF-β受体激动剂的培养基处理表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞，以引起与胰腺内分泌谱系相关的标志物的表达增加。
所述TGF-β受体激动剂可以是任何能结合并激活TGF-β受体的任何试剂。在一个实施例中，所述TGF-β受体激动剂选自激活素A、激活素B和激活素C。
在一个替代实施例中，所述TGF-β受体激动剂可以是激活素A的肽变体。这种肽变体的例子在转让给Centocor R&D，Inc.的美国专利申请系列号61/076,889中公开。
可以将表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞用至少一种其他额外的因子进行处理，这些因子可增强表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的形成。作为另一种选择，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的增殖。另外，所述至少一种其他额外的因子可增强通过本发明方法形成的表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞形成其他细胞类型的能力，或可改善任意其他额外分化步骤的效率。
所述至少一种额外的因子可以是(例如)烟酰胺、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、血清白蛋白、成纤维细胞生长因子家族的成员、血小板衍生生长因子-AA和-BB、富血小板血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(例如，GDF-5、-6、-8、-10、-11)、胰胰高血糖素样肽-I和II(GLP-I和II)、GLP-1和GLP-2模拟体TM、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、胰岛素、孕酮、抑酶肽、氢化可的松、乙醇胺、β巯基乙醇、表皮生长因子(EGF)、胃泌素I和II、铜螯合剂(例如，三亚乙基五胺)、毛喉素、丁酸-Na、激活素、β细胞素、ITS、成头蛋白、神经突生长因子、nodal、丙戊酸、曲古抑菌素A、丁酸钠、肝细胞生长因子(HGF)、鞘氨醇-1、VEGF、MG132(EMD，CA)、N2和B27添加剂(Gibco，CA)、甾体类生物碱(例如，环巴胺(EMD，CA))、角质细胞生长因子(KGF)、Dickkopf蛋白家族、牛垂体提取物、胰岛新生相关蛋白(INGAP)、印第安豪猪蛋白、音猬蛋白、蛋白酶体抑制剂、notch通路抑制剂、音猬蛋白抑制剂或它们的组合。
所述至少一种其他额外的因子可由从胰腺细胞系(例如PANC-1(ATCC No：CRL-1469)、CAPAN-1(ATCC No：HTB-79)、BxPC-3(ATCC No：CRL-1687)、HPAF-II(ATCC No：CRL-1997))、肝细胞系例如HepG2(ATCC No：HTB-8065)、肠细胞系例如FHs 74(ATCC No：CCL-241)获得的调理培养基提供。
表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞的检测
胰腺内分泌谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他胰腺内分泌谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得胰腺内分泌谱系特征性特性。胰腺内分泌谱系特异性标志物包括一种或多种转录因子例如NGN3、NEUROD或ISL1的表达。
β细胞谱系特征性标志物是本领域技术人员所熟知的，并且其他β细胞谱系特征性标志物不断被鉴别。这些标志物可用于确定根据本发明处理过的细胞是否已分化而获得β细胞谱系特征性特性。β细胞谱系特异性特征包括一种或多种转录因子例如，PDX1(胰十二指肠同源盒基因-1)、NKX2.2、NKX6.1、ISL1、PAX6、PAX4、NEUROD、HNF1β、HNF6、HNT3β或MAFA等的表达。这些转录因子在内分泌细胞鉴别领域中已得到公认。参见(例如)Edlund(NatureReviews Genetics 3：524-632(2002))。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。作为另一种选择，可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(例如抗体)来确定分化效率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达的方法是本领域的标准方法。这些方法包括定量反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、RNA印迹法、原位杂交法(参见例如，Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人(编辑)，2001增补版))和免疫测定法(如对切片材料的免疫组织化学分析)、蛋白质印迹法，对于在完整细胞中可接近的标志物而言有流式细胞术分析(FACS)(参见例如，Harlow和Lane，Using Antibodies：A Laboratory Manual，New York：Cold Spring HarborLaboratoryPress(1998))。
在本发明的一个方面，通过在处理后测定给定细胞培养物中胰岛素阳性细胞的百分比来确定分化的效率。在一个实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约100％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约90％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约80％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施 例中，本发明方法在给定培养物中产生约70％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约60％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约50％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约40％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约30％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约20％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约10％的胰岛素阳性细胞。在一个替代实施例中，本发明方法在给定培养物中产生约5％的胰岛素阳性细胞。
在本发明的一个方面，通过测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌来确定分化的效率，胰岛素分泌可通过测量由细胞释放的C-肽的量测定。在一个实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约1000ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约900ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约800ngC-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约700ng C-肽/pgDNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约600ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约500ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约400ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约500ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约400ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约300ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约200ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约100ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约90ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约80ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约70ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约60ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约50ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约40ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约30ng C-肽/pg DNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约20ngC-肽/pgDNA。在一个替代实施例中，由本发明方法产生的细胞可产生约10ng C-肽/pg DNA。
疗法
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有1型糖尿病，或有发展1型糖尿病风险的患者的方法。本方法涉及对多能干细胞进行培养，使该多能干细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该β-细胞谱系的细胞移植进患者中。
在另一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有2型糖尿病，或有发展2型糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及将多能干细胞进行培养，使该培养的细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该β-细胞谱系的细胞移植进该患者中。
如果合适，可用有利于该植入细胞存活和功能的药剂或生物活性剂对患者进行进一步处理。这些试剂可包括(例如)胰岛素、TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-7、-8、-10、-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白(pleiotrophin)、内皮素等等。其他的药物化合物可包括(例如)烟酰胺、胰高血糖素样肽-I(GLP-1)和II、GLP-1和2模拟体TM、毒蜥外泌肽-4、视黄酸、甲状旁腺激素、MAPK抑制剂，例如已公布的美国专利申请2004/0209901和已公布的美国专利申请2004/0132729中所公开的化合物。
可使多能干细胞在移植进接受者前分化成胰岛素生成细胞。在一个特定的实施例中，在移植进接受者之前，使多能干细胞完全分化成β-细胞。作为另一种选择，可将多能干细胞以未分化状态或部分分化的状态移植进接受者中。可在该接受者中发生进一步分化。
可将定形内胚层细胞或，作为另一选择，胰腺内胚层细胞，或作为另一种选择，β细胞作为分散细胞进行移植，或可将这些细胞形成簇，可将这些细胞簇输注进肝门静脉内。作为另一种选择，可将细胞设置在生物相容性 的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性装置中或可进行封装以保护其免受宿主免疫应答的破坏。可将细胞移植进接受者中的合适位置内。植入位点包括(例如)肝脏、原来的胰腺、肾包膜下空间、网膜、腹膜、浆膜下空间、肠、胃或皮下袋。
为了增强植入细胞的进一步分化、存活率或活性，可在施用细胞之前、与其同时或之后施用额外的因子，例如生长因子、抗氧化剂或抗炎剂。在某些实施例中，将生长因子用于使所施用的细胞在体内分化。这些因子可由内源性细胞分泌并原位暴露于所施用的细胞。可通过本领域已知的内源生长因子或外源施用的生长因子的任意组合来诱导植入细胞进行分化。
移植中所用的量取决于多种因素，包括患者的状况和对该疗法的响应，并且可由本领域技术人员确定。
在一个方面，本发明提供了一种用于治疗患有糖尿病，或有发展糖尿病风险的患者的方法。该方法涉及培养多能干细胞、使该培养的细胞体外分化成β-细胞谱系，并将该细胞掺入三维的支持物中。在移植进患者前，可将该细胞在该支持物上体外维持。作为另一种选择，可将包含该细胞的支持物直接移植进患者中而无需进行额外的体外培养。可任选将至少一种有利于植入细胞的存活和功能的药剂掺入该支持物中。
适用于本发明目的的支持材料包括可用于组织修复的组织模板、导管、屏障物和贮器。具体地讲，已经在体外和体内用于生物组织重建或再生，以及用于递送趋化剂来诱导组织生长的泡沫、海绵、凝胶、水凝胶、纺织物和非织造结构形式的合成材料和天然材料适用于实践本发明的方法。参见，例如在美国专利5,770,417、美国专利6,022,743、美国专利5,567,612、美国专利5,759,830、美国专利6,626,950、美国专利6,534,084、美国专利6,306,424、美国专利6,365,149、美国专利6,599,323、美国专利6,656,488、美国已公布的专利申请2004/0062753A1、美国专利4,557,264和美国专利6,333,029中所公开的材料。
为了形成含有药剂的支承体，可在形成支承体前将药剂与聚合物溶液混合。作为另一种选择，可将药剂涂覆于制好的支持物上，优选在存在药物载体的情况下进行。药物可以液体、细分固体或任何其他合适的物理形式存在。作为另一种选择，可将赋形剂加入支持物中以改变药剂的释放速率。在 一个替代实施例中，将至少一种为抗炎化合物的药物化合物掺入支持物中，例如在美国专利6,509,369中所公开的化合物。
可将至少一种为抗凋亡化合物的药物化合物掺入支持物中，例如在美国专利6,793,945中所公开的化合物。
可将至少一种为纤维变性抑制剂的药物化合物掺入支持物中，例如在美国专利6,331,298中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种能够增强血管生成的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0220393和美国已公布的专利申请2004/0209901中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为免疫抑制化合物的药物化合物，例如美国已公布的专利申请2004/0171623中所公开的化合物。
支持物还可掺有至少一种为生长因子的药物化合物，例如TGF-β家族的成员(包括TGF-β1、2和3)、骨形态发生蛋白(BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-11、-12和-13)、成纤维细胞生长因子-1和-2、血小板衍生生长因子-AA和-BB、血小板富集血浆、胰岛素生长因子(IGF-I、II)、生长分化因子(GDF-5、-6、-8、-10、-15)、血管内皮细胞衍生生长因子(VEGF)、多效蛋白、内皮素等等。其他药物化合物可包括(例如)烟酰胺、缺氧诱导因子1-α、高血糖素样肽-I(GLP-1)、GLP-1和GLP-2模拟体TM和毒蜥外泌肽-4、nodal、成头蛋白、NGF、视黄酸、甲状旁腺激素、腱生蛋白-C、弹性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凯萨林菌素(cathelicidin)、防御素(defensin)、层粘连蛋白、含有粘附性细胞外基质蛋白例如纤粘蛋白和玻璃粘连蛋白的细胞结合结构域和肝素结合结构域的生物肽、MAPK抑制剂(例如在美国已公布的专利申请2004/0209901和美国已公布的专利申请2004/0132729中所公开的化合物)。
可通过将细胞简单地沉积在该支架上来实现将本发明细胞掺入支架中。细胞可通过简单扩散进入支架中(J.Pediatr.Surg.23(1 Pt 2)：3-9(1988))。已经发展了若干其他方法来增强细胞接种的效率。例如，已经将转瓶用于将软骨细胞接种于聚乙醇酸支架上(Biotechnol.Prog.14(2)：193-202(1998)。用于细胞接种另一种方法是利用离心，这种离心产生最小的应力给接种的细胞并增强接种效率。例如，Yang等人发展了一种细胞接种方法 (J.Biomed.Mater.Res.55(3)：379-86(2001))，称为离心细胞固定(CentrifugationalCell Immobilization，CCI)。
本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。
实例
实例1：本发明的肽的设计
该工作的目的是，基于可利用的配体的结构信息和已知的激活素肽及TGF-β家族的其他成员各自的配体-受体相互作用来设计激活素A的变体肽。对激活素A的两种晶体结构(1nyu和1s4Y，可在Protein databank：http://www.rcsb.org找到)的分析鉴定了多个可进行突变的氨基酸残基。选择位于同型二聚体界面的残基进行突变。尽管一部分该二聚体界面残基是共同的，但晶体中单体的相对取向有显著差异。因而，选择了独立的两组残基，每一组基于各自的晶体结构。未对半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸残基进行改变，因为这些残基通常在蛋白质中起着独特的结构性作用，例如就半胱氨酸而言，可形成二硫键，或者就甘氨酸和脯氨酸残基而言，可使得形成其他残基无法触及的主链角度。
利用pdb号为1nyu的激活素A复合物的晶体结构，针对如下位点进行突变：10I、16F、39Y、41E、43E、74F、75A、76N、77L、78K、79S、82V。利用pdb号为1s4y的激活素A复合物的晶体结构，针对如下位点进行突变：16F、18V、19S、20F、37A、38N、39Y、41E、74F、82V、107N、109I、110V、116S。
将程序Rosetta(参见例如Simons等人，Mol Biol，268，209-225，1997和Simons，K.T.等人，Proteins，34，82-95，1999)用于对激活素配体的两条链中的所选残基进行组合突变。该程序对所述20种氨基酸每一者选取侧链构象的旋转异构体，并用Metropolis蒙特卡罗方法搜索在能量上有利的构象。选择了总共93种设计以及野生型激活素A肽序列。根据本发明的方法对这些序列进行测试。表1列出了本发明的肽的氨基酸序列。ACTN1是野生型激活素分子。ACTN 2至ACTN 48是使用晶体结构1nyu计算得到的本发明的肽序列。ACTN 49至ACTN 94是使用晶体结构1s4y计算得到的本发明的肽序列。没有两条肽序列是相同的。所述肽序列中的变化在图1(ACTN 2至ACTN 48)和图2(ACTN 49至ACTN 94)中以系统树示出。
实例2：本发明的肽的克隆和表达
设计了编码表1所列肽的基因用以克隆进表达载体中。基于关于激活素A和TGF-β家族其他成员的前体形式的蛋白酶解加工的科学文献，将表达构建体设计为含有激活素A的完整前体形式(原区加成熟区)。产生了野生型激活素A前体表达构建体以使得能通过将仅含有成熟蛋白区的编码序列克隆进该野生型激活素A构建体而随后构建全部激活素A变体表达构建体。因而，所有表达构建体具有相同的激活素A原区。
根据转让给Centocor R&D Inc.的美国专利中6,670,127和6,521,427中公开的方法，利用人密码子偏好性，将表1中的野生型激活素A和全部93种设计的变体的氨基酸序列回译成DNA序列。表2中列出了DNA序列。使用野生型激活素A的原区的天然氨基酸序列和天然DNA序列(未进行回译)并分别表1和表2中列出。然后通过使用GENEWRITERTM技术(Centocor R&D，US)将序列分解成较小的片段并合成这些寡核苷酸，然后用RP HPLC(Dionex，Germany)进行纯化，来产生由单种原结构域和94种成熟蛋白质结构域组成的每种DNA序列。然后用转让给Centocor R&D Inc.的美国专利6,670,127和6,521,427中公开的方法，将每种DNA序列的纯化的寡核苷酸独立地组装成全长DNA片段。
第一步，在用整个变体库进行处理前，制备含有野生型激活素(ACTN 1)的表达构建体以评价表达系统。利用XbaI和NotI位点(图3中的斜体)，将激活素A原区域DNA片段克隆进pcDNA3.1(-)(Invitrogen，目录号：V795-20)中。然后利用SgrAI(带下划线的粗体)和NotI位点(图4)，将编码激活素A成熟蛋白的DNA片段克隆进该原区构建体并框内融合至该原区，从而产生全长的前体表达构建体(图5)。然后将编码变体ACTN 2至ACTN 8的成熟蛋白质的DNA片段以相似方式克隆进原区构建体以产生这些变体的前体表达构建体。作为阳性对照，从OriGene Technologies，Inc.(目录号：TC118774)商购获得人激活素A表达构建体。该克隆中的激活素A的mRNA的登录号为NM_002192.2，该哺乳动物表达载体为pCMV6-XL4。
基因构建体的转染和表达：比较ACTN 1和OriGene野生型激活素A前体构建体的表达和活性，以确定ACTN 1构建体是否将产生活性分子。
细胞维持：将HEK293-E细胞在293FreeStyle培养基(Invitrogen；目录号：12338)中培养。当细胞浓度在1.5和2.0×106个细胞/ml时，将细胞稀释至2.0×105个细胞/ml。将细胞在37℃和8％CO2下，在以125RPM摇动的增湿培养箱中培养。
激活素A变体的转染：在单独的装有20ml培养基的125ml摇瓶(Corning；目录号：431143)中，将变体转染进HEK293-E细胞中。将细胞稀释至1.0×106个细胞/ml。将总DNA(25μg)稀释进1.0ml的Opti-Pro(Invitrogen；目录号：12309)并将25μl的FreeStyle Max转染试剂(Invitrogen；目录号：16447)稀释进1.0ml的Opti-Pro中。将稀释的DNA添加至稀释的Max试剂并在室温下孵育10分钟。将2ml DNA Max复合物的等分试样添加至细胞摇瓶中并置于37℃和8％CO2条件下的以125RPM摇动的培养箱中96小时。
通过以5,000×g离心10分钟将上清液从细胞分离并滤过0.2μm过滤器(Cotning；目录号：431153)，然后用Amicon Ultra浓缩器10K(目录号：UFC901096)浓缩10倍和50倍，并以3,750×g离心大约10分钟。
在基于细胞的测定法中检查浓缩上清液和未浓缩上清液，测量本发明的肽使人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的能力(参见实例6)，以SOX17强度作为示值读数。来自OriGene野生型构建体的浓缩上清液和未浓缩上清液两者均比来自ACTN 1构建体的浓缩上清液具有高很多的活性(SOX17强度)(图6)。该结果导致决定来将ACTN 1构建体的pcDNA3.1(-)表达载体改成Centocor哺乳动物表达载体pUnder，后者具有一贯较好的表达特性，有可能是由于在核心CMV启动子上游包括了完整的内含子A。
利用EcoRI和HindIII位点(灰色粗体，图7A和7B)将全长的ACTN1前体基因从pcDNA3.1(-)亚克隆进pUnder中。将该新的ACTN 1野生型激活素A构建体连同OriGene构建体两者均独立地转染进CHO-S或HEK293-F细胞中。如上所述制备上清液并检测激活素A活性。在基于细胞的测定法中发现来自ACTN 1pUnder构建体的上清液比来自OriGene野生型构建体具有更高的活性(通过细胞数目和SOX17强度增加来判断)(图8A和8B)。
因为来自pUnder构建体的ACTN 1的表达导致上清液的活性水平比来自相应的pcDNA3.1(-)构建体的要高，所以随后对于整个激活素A变体库，在pUnder中产生全长前体表达构建体。利用SgrAI和NotI克隆位点(带下划线的粗体和斜体，图7A和7B)，将所述变体的仅跨越成熟蛋白区的DNA片段每一者亚克隆进pUnder中，替代ACTN 1成熟蛋白编码序列，而仍然保留原区完整。
激活素A变体的转染：在单独的装有20ml培养基的125ml摇瓶(Corning；目录号：431143)中，将变体转染进HEK293-F细胞中。将细胞稀释至1.0×106个细胞/ml。将总DNA(25μg)稀释进1.0ml的Opti-Pro(Invitrogen；目录号：12309)并将25μl的FreeStyle Max转染试剂(Invitrogen；目录号：16447)稀释进1.0ml的Opti-Pro中。将稀释的DNA添加至稀释的Max试剂并在室温下孵育10分钟。将2ml DNA Max复合物的等分试样添加至细胞摇瓶中并置于37℃和8％CO2条件下的以125RPM摇动的培养箱中96小时。
使用前七种激活素A变体(ACTN 2至ACTN 8)的pUnder表达构建体，对所产生的上清液进行蛋白质印迹分析。包括OriGene和ACTN 1激活素A野生型对照在内。这两种对照蛋白质的表观分子量类似并且与所计算的分子量26kD一致。观察到几种变体有表达，但变体之间的表达水平不一致(图9)。这总体上表明，某些变体中的氨基酸置换没有影响表达，且仍允许前体蛋白的正确加工。
还通过蛋白质印迹分析了来自pUnder表达构建体(总共39种)的第二组上清液。大多数变体的表达未能检测到(数据未示出)。图10中仅示出了具有可检测信号的那些变体的蛋白质印迹。以该方式对其余的变体的表达进行了分析。
实例3和4的背景
本发明的肽的亲和纯化
该部分的目标是发展激活素A变体的亲和纯化的手段。第一种方法称为bis-his，是将金属结合位点引入本发明的肽的氨基酸序列中，这将使得每种变体能选择性地结合至金属亲和基质。如果可鉴定到bis-his变体以高的亲和性结合至该基质并且对所有的激活素A变体均适用，则可在基因组装 时整合进该bis-his位点。然而，因为这些变体将会以比具有多组氨酸标签的蛋白质低的亲和性结合，所以能否与具有类似金属结合位点的其他内源性蛋白质完全分离是不确定的。为了解决这一问题，还采用了卵泡抑素亲和基质，该基质将特异性结合所有激活素A变体。尽管该方法涉及表达和纯化卵泡抑素并随后产生卵泡抑素亲和基质，但其还可以有助于其他TGF-β家族成员的纯化。这些方法在下面实例3和4中描述。
实例3：本发明的肽的金属螯合纯化
第一种方法涉及工程改造分子以选择性地结合金属亲和色谱基质。工程改造过的蛋白质可带有增强该蛋白质纯化的肽序列标签。将一系列组氨酸残基整合进肽序列是一个借此可用固定化金属亲和色谱来纯化所关注的蛋白质的例子。IMAC是基于组氨酸残基与金属(例如钴、镍或锌)的配位共价结合。结合后，可通过pH的改变或通过添加竞争性分子(例如咪唑)来洗脱，从而提供一定程度的纯化。通常，将组氨酸残基引入N或C端。然而，由于激活素A表达为前体肽，在该前体肽中N端要被切除，N端标签将会在细胞内加工过程中丧失。此外，添加C端标签据怀疑可阻止该分子的正确二聚化和加工。参见例如Pangas，S.和Woodruff，T.；J.Endocrinology，第172卷，第199-210页，2002年。因而，选择成熟激活素A序列内的内部位置用于用组氨酸残基置换以产生合成的金属结合位点。该方法引入两个暴露于溶剂的组氨酸残基，这两个组氨酸残基由α螺旋的单个转角分开(His-X3-His)或处于β片层中的两个分开的位置(His-X-His)。参见例如Sub等人，Protein Engineering，第4卷，第3期，第301-305页，1991年。表3示出了其中已进行组氨酸置换的所选肽的氨基酸序列。
含有组氨酸置换的本发明的肽的转染：根据实例2所述方法，产生编码表3中所列肽的基因序列并将其插入pUnder载体。如下对HEK293-F细胞进行瞬时转染：在转染当天，在单独的2L摇瓶(每种载体一个)(Corning目录号：431255)将细胞在750ml的培养基中稀释至1.0×106个细胞/ml。将总DNA(937.5μg)稀释进7.5ml的Opti-Pro(Invitrogen；目录号：12309)并将937.5μl的FreeStyle Max转染试剂(Invitrogen；目录号：16447)稀释进7.5ml的Opti-Pro中。将稀释的DNA添加至稀释的Max试剂并在室温下孵育10分钟。将15ml DNAMax复合物的等分试样添加至细胞 摇瓶中并置于37℃和8％CO2条件下的以125RPM摇动的培养箱中96小时。
含组氨酸置换的本发明的肽的纯化：采用固定化金属螯合亲和色谱(IMAC)的纯化用GE Healthcare的UnicornTM软件在AKTA FPLC色谱系统上进行。
简而言之，在转染后四天收获来自瞬时转染的HEK293-F细胞的细胞上清液，通过离心(30分钟，6000rpm)使之澄清，并过滤(0.2μm PES膜，Corning)。用激活素A ELISA(R&DSystems；目录号：DY338)按照生产商的说明书测定特定蛋白质的相对量。用LV Centramate(Pall)浓缩器将样品浓缩4倍并通过使用用于检测的抗激活素A抗体(R&D Systems；目录号：3381)或抗激活素A前体抗体(R&D Systems；目录号：1203)的蛋白质印迹检验。图11示出了各上清液4倍浓缩后数种肽变体的代表性图。然后将浓缩的样品用10x PBS稀释至1x PBS的终浓度，再次用0.2μm的膜过滤。以大约10mg蛋白质/ml树脂的相对浓度将稀释的上清液上样至平衡(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.4)过的HisTrap柱(GE Healthcare)上。上样后，洗涤柱子并用20柱体积用线性梯度的咪唑(0-500mM)洗脱蛋白质。图12示出了肽变体ACTD20的代表性IMAC纯化曲线。收集峰级分，并在4℃下相对于PBS，pH 7透析过夜。从透析液移出蛋白质，过滤(0.2μm)，通过在NANODROPTM分光光度计(Thermo Fisher Scientific)上测量280nm下的吸光度来确定总蛋白质浓度。如先前所述，用激活素A ELISA确定特定蛋白质的浓度。如有必要，用10K截留分子量(MWCO)离心浓缩器(Millipore)对纯化的蛋白质进行浓缩。通过SDS-PAGE和使用用于检测的抗激活素A抗体(R&D Systems；目录号：3381)或抗激活素A前体(R&D Systems；目录号：1203)的蛋白质印迹评价纯化的蛋白质的质量。图13示出了来自六种代表性肽纯化的咪唑级分的蛋白质印迹洗脱图。将纯化的蛋白质在4℃下保存。
正如所预期的，所检验的所有单bis-his对构建体均被阻留在金属亲和色谱基质上。然而，由于这些点突变导致形成单个金属结合位点，与基质结合是非特异性的，所述变体与含有类似位点的其他蛋白质一同被洗脱。为了增强特异性结合和驻留，将另外的一对组氨酸残基添加至每一K7H/N9H单 对构建体(表4)。再次，每种双bis-his构建体在金属亲和基质上展现出明显的富集以及与非特异性结合的蛋白质清楚地分开。还将第三对组氨酸残基添加至这些构建体中分离最好的构建体(从ACTN 34得到ACTD 23)以图进一步增加与非特异性结合的蛋白质的分离。然而，这些分子没有展现出优于双bis-his构建体的特异性驻留。
实例4：本发明的肽的卵泡抑素纯化
采取了针对纯化一系列激活素A变体的第二种方法，以利用卵泡抑素和激活素A之间的高度亲和相互作用。卵泡抑素是天然的激活素A拮抗剂，从而抑制I型和II型受体相互作用两者。由于本发明中的变体包含二聚体界面中而不是受体结合界面中的改变，所以由于未对受体结合表面进行改变，卵泡抑素是用于亲和基质的合理选择。卵泡抑素288和315(分别是卵泡抑素的残基1-288和1-315)以非常高的亲和力(大约300pM)结合激活素A，而卵泡抑素12和123(分别是卵泡抑素的残基64-212和残基64-288)以适度的亲和力(大约400nM)结合。所测试的卵泡抑素构建体包括卵泡抑素12(FS12)、卵泡抑素288(FS288)和卵泡抑素315(FS315)，参见表5。对这些构建体每一者进行设计以进行哺乳动物表达，其含有多组氨酸标签以用于金属亲和纯化。
卵泡抑素变体的克隆：分别在表6和表7中给出了三种带多组氨酸标签的所设计的卵泡抑素基因变体ACTA 1、ACTA2和ACTA 3的蛋白质序列和基因序列。合成所述基因并如实例2中针对激活素A基因变体所描述的进行组装。使用在每种基因序列的前面和后面的EcoRI和HindIII限制性酶切位点，将组装好的基因利用载体的独特EcoRI和HindIII限制性酶切位点克隆进Centocor pUnder哺乳动物表达载体中(在实例2中有详细描述)。
卵泡抑素变体表达的评价：在单独的装有750ml培养基的2L摇瓶(每种载体一个)(Corning；目录号：431255)中，用HEK293-F细胞转染变体(ACTA1、ACTA2和ACTA3)。将细胞稀释至1.0×106个细胞/ml。将总DNA(937.5μg)稀释进7.5ml的Opti-Pro(Invitrogen；目录号：12309)并将937.5μl的FreeStyle Max转染试剂(Invitrogen；目录号：16447)稀释进7.5ml的Opti-Pro中。将稀释的DNA添加至稀释的Max试剂并在室温下孵育10分钟。将15mlDNA Max复合物的等分试样添加至细胞摇瓶中并置于 37℃和8％CO2条件下的以125RPM摇动的培养箱中96小时。在转染后四天收获细胞上清液，通过离心(30分钟，6000rpm)使之澄清，并过滤(0.2μm PES膜，Corning)。通过使用用于检测的抗卵泡抑素抗体(R&DSystems；目录号：669)或抗五-组氨酸抗体(Qiagen；目录号：34660)的蛋白质印迹检验卵泡抑素变体的表达。图14示出了来自培养物上清液的卵泡抑素变体表达的代表性蛋白质印迹。选择一种变体(ACTA 3)用于放大表达和纯化。
ACTA 3的放大表达：将HEK293-F细胞瞬时转染进Applikon生物反应器中。在转染前当天，以4.0×106个细胞/ml对生物反应器进行接种。控制反应器在顶部空间具有空气，监控O2并通过喷射控制为50％。通过CO2和碳酸氢钠控制pH。用marine搅拌叶轮以115RPM搅拌细胞。在转染前，将pH保持为7.2，然后在转染时降至6.8。
在转染时，细胞浓度为1.0×106个细胞/ml。将总DNA(1.25mg/L)稀释进50ml/L的Opti-Pro中，并将1.25ml/L的FreeStyleMax转染试剂稀释进50ml/L的Opti-Pro中。将稀释的DNA添加至稀释的Max试剂并在室温下孵育10分钟。将100ml/L的DNA Max复合物等分试样添加至生物反应器并培养96小时。
ACTA3的金属螯合纯化：使用GE Healthcare’s UnicornTM软件在AKTAFPLC色谱系统上进行纯化。
在转染后四天收获细胞上清液，通过离心(30分钟，6000rpm)澄清，过滤(0.2μmPES膜，Corning)，并用Centramate(Pall)浓缩器浓缩至少于1L。然后将浓缩的样品用10xPBS稀释至1x PBS的终浓度，再次用0.2μm的膜过滤。以大约10mg蛋白质/ml树脂的相对浓度将稀释的上清液上样至平衡(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.4)过的HisTrap柱(GEHealthcare)上。上样后，洗涤柱子并用分级梯度的咪唑(10mM、50mM、150mM、250mM和500mM)洗脱蛋白质。图15A示出了卵泡抑素变体ACTA3的代表性IMAC纯化曲线。图15B示出了上图中的IMAC纯化洗脱曲线的SDSPAGE。收集用150mM咪唑洗脱的峰级分并用10K MWCO离心式浓缩器(Millipore)浓缩。将浓缩材料上样至平衡(PBS，pH7)过的26/60Superdex200柱(GEHealthcare)上，通过尺寸排阻色谱纯化。收集含有ACTA3的级分 并用10K MWCO离心式浓缩器(Millipore)浓缩。通过在NANODROPTM分光光度计(Thermo Fisher Scientific)上测量280nm下的吸光度来确定纯化的ACTA3的浓度。通过SDS-PAGE评估所纯化的蛋白质的质量。将纯化的蛋白质在4℃下保存。
ACTA 3与NHS-琼脂糖凝胶的偶联：根据随树脂提供的生产商的说明书进行与NHS-琼脂糖凝胶(GE Healthcare)的偶联。
简而言之，将所纯化的卵泡抑素在4℃下透析过夜进偶联缓冲液(0.2MNaHCO3，0.5M NaCl pH8.3)中。根据生产商的说明书制备NHS-琼脂糖凝胶并添加至所透析的蛋白质。在4℃下使偶联反应发生过夜。第二天根据生产商的说明书洗涤卵泡抑素-NHS-琼脂糖凝胶树脂并用PBS，pH7平衡。
使用ACTA 3亲和色谱纯化本发明的肽：简而言之，在转染后4天收获来自瞬时转染的HEK293-F细胞的细胞上清液，通过离心(30分钟，6000rpm)澄清，并过滤(0.2μm PES膜，Corning)。通过激活素A ELISA(R&D Systems；目录号：DY338)按照生产商的说明书测定特定蛋白质的相对量。使用LV Centramate(Pall)浓缩器将样品浓缩至少于或等于100ml。然后将浓缩的样品用10x PBS稀释至1x PBS的终浓度，再次用0.2μm的膜过滤。将平衡过的ACTA 3亲和树脂添加至稀释的上清液，将该浆料在4℃下孵育过夜。在接下来的一天，洗涤柱子并用10柱体积0.1M甘氨酸，pH2.5洗脱蛋白质。立刻通过洗脱进装有10％级分体积的1.0M Tris，pH 9的试管中(即如果收集1ml的洗出液，试管则预先装有0.1ml Tris缓冲液)来中和所洗脱的蛋白质级分。收集峰级分，并在4℃下相对于PBS，pH 7透析过夜。移出所透析的蛋白质，过滤(0.2μm)，通过在NANODROPTM分光光度计(Thermo Fisher Scientific)上测量280nm下的吸光度来确定蛋白质浓度。如有必要，用10K截留分子量(MWCO)离心浓缩器(Millipore)对纯化的蛋白质进行浓缩。通过SDSPAGE和蛋白质印迹评估所纯化的蛋白质的质量。图16示出了肽变体ACTN 1的代表性纯化，该图使用用于检测的抗激活素A抗体(R&DSystems；目录号：3381)(图16A)或抗前体抗体(R&DSystems；目录号：1203)(图16B)通过蛋白质印迹或通过银染色(图16C)产生。将纯化的蛋白质在4℃下保存。
实例5：人配体干细胞培养
从WiCell Research Institute，Inc.(Madison，WI)获得人胚胎干细胞系H1、H7和H9，并根据该来源公司提供的说明进行培养。也可将人胚胎干细胞接种于包被有以1∶30稀释的低生长因子MATRIGELTM(BDBiosciences；目录号：356231)的板上并在补充有8ng/ml的bFGF(R&DSystems；目录号：233-FB)的MEF调理培养基中培养。用胶原酶IV(Invitrogen/GIBCO；目录号：17104-019)、分散酶(Invitrogen；目录号：17105-041)或释放酶CI酶(Roche；目录号：11814435001)将在MATRIGELTM上培养的细胞进行常规传代。
实例6：激活素A生物测定法
激活素A是多种细胞类型分化的重要介体。当用激活素A和Wnt3a的组合处理人胚胎干细胞时，代表定形内胚层的多种基因上调。测量人胚胎干细胞中的这种分化的生物测定法以小型化设计适于用于筛选目的96孔板。利用采用市售激活素A和Wnt3a重组蛋白的处理并测量被视为定形内胚层的代表性标志物的转录因子SOX17的蛋白质表达来完成验证。
活细胞测定法：简而言之，将H1或H9人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(Invitrogen；目录号：356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶(Invitrogen；目录号：17104-019)处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例接种于低生长因子MATRIGELTM包被的96孔板(黑色，96孔，PackardViewPlates；目录号：6005182)上。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&D Systems；目录号：233-FB)的MEF调理培养基饲养。
在测定法的最开始将各板的孔在PBS中洗涤两次，然后将DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号：11330-032)中的测试样品的等分试样(100μl)添加至各孔。测试条件一式三份进行，在总共四天测定期间每隔一天通过从各孔抽吸出培养基并用测试样品替换培养基来进行饲养。在测定法的第一天和第二天，将添加至测定孔的测试样品稀释于具有0.5％FCS(HyClone；目录号：SH30070.03)和20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号：1324-WN)的DMEM:F12中。在测定法的第三天和第四天，将添加至测定孔的测试样品稀释于具有2％FCS但没有任何Wnt3a的DMEM:F12 中。阳性对照样品由如下组成：在整个测定法中以100ng/ml的浓度加入的重组人激活素A(Peprotech；目录号：120-14)和在第1天和第2天加入的Wnt3a(20ng/ml)。阴性对照样品省略了用激活素A和Wnt3a两者进行的处理。
高内涵分析：在四天的培养结束时，用PBS洗涤测定板两次，用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号：16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号：AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/mlHoechst 33342(Invitrogen；目录号：H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
图17示出了对该筛选测定法的验证，检测了市售激活素A(Peprotech)的两倍稀释曲线并同时测量了细胞数(图17A)和SOX17强度(图17B)两者。通常在100-20/ml范围内观察到激活素A对诱导SOX17表达的最佳效果，其中EC50为30-50/ml。在测定法的第1天和第2 天在处理中忽略Wnt3a不能产生可测量的SOX17表达。没有激活素A也不能产生SOX17表达。
检测野生型激活素A标准品：表达了两种野生型激活素A基因构建体并测试功能活性：pCMV6-XL4哺乳动物表达载体(目录号：SC118774)中的OriGene激活素A和pcDNA3.1(-)哺乳动物表达载体中的ACTN1。两种构建体在它们各自的表达载体中均利用CMV启动子，并且两者均在HEK293-E细胞中表达。在96小时后收集培养上清液并测试功能活性。将以1x浓缩(纯的)或4x浓缩母液形式接收到上清液1∶4稀释于DMEM:F12中以产生中间母液，然后进一步进行两倍系列稀释，最后1∶5稀释进装有细胞和测定培养基的每一个孔中(最终测定稀释度范围为1∶20至1∶640)。图18示出了人胚胎干细胞向定形内胚层分化(由SOX17表达水平测量)的结果。在该测定法中，OriGene野生型激活素A表达系统优于ACTN 1表达。浓缩OriGene野生型上清液提高了功能活性大约1.5倍。
为了改善表达系统，随后将ACTN 1构建体移至pUnder哺乳动物表达载体。如实例2所述，利用EcoRI和HindIII位点将全长的ACTN 1前体基因从pcDNA3.1(-)亚克隆进pUnder中。将该新的ACTN 1野生型激活素A构建体连同OriGene构建体两者均独立地转染进CHO-S或HEK293-F细胞中。将在96小时时收获的清液如实例2中所述制备并测试激活素A活性。将以1x浓缩(纯的)或10x浓缩母液形式接收到上清液1∶4或1∶8稀释于DMEM:F12中以产生中间母液，然后进一步1∶5稀释进装有细胞和测定培养基的每一个孔中(最终测定稀释度范围为1∶20至1∶40)。表19A示出了在该测定法中使用市售的重组人激活素A(Peprotech)的人胚胎干细胞分化的标准曲线，其中将SOX17表达水平作为定形内胚层分化的标志物进行测量。比较在该测定法中使用的多种表达系统中的OriGene激活素A和ACTN 1的结果在图19B中示出。使用pUnder表达载体和HEK293F细胞ACTN1表达得以显著改善；甚至是在浓缩上清液后，CHOS细胞中的ACTN 1表达显示出弱的或可忽略不计的结果。
实例7：本发明的肽使人胚胎干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的 细胞的能力
激活素A序列中的特定氨基酸残基的改变对该分子的功能性质具有深远的影响，并因而改变了多种生物学结果。改变可(例如)修改结合亲和力或二聚体稳定性，或者是以积极的方式改变或以负面的方式改变。在生物测定法中测量所表达的变体的功能活性并确定特定残基的修饰模式是否与相对于野生型标准的功能增加或降低相关很重要。
筛选：如上面实例5和实例6所述，将从人胚胎干细胞系H1获得的细胞簇进行接种并进行测定。简而言之，将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例接种于低生长因子MATRIGELTM包被的96孔板上。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&DSystems；目录号：233-FB)的MEF调理培养基饲养。
在测定法的最开始将各板的孔在PBS中洗涤两次，然后将DMEM:F12基础培养基(Invitrogen；目录号：11330-032)中的测试样品的等分试样(100μl)添加至各孔。测试条件一式三份进行，在总共四天测定期间每隔一天通过从各孔抽吸出培养基并用测试样品替换培养基来进行饲养。在测定法的第一天和第二天，将添加至测定孔的测试样品稀释于具有0.5％FCS(HyClone；目录号：SH30070.03)和20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号：1324-WN)的DMEM:F12中。在测定法的第三天和第四天，将添加至测定孔的测试样品稀释于具有2％FCS但没有任何Wnt3a的DMEM:F12中。阳性对照样品由如下组成：在整个测定法中以100ng/ml的浓度加入的重组人激活素A和在第1天和第2天加入的Wnt3a(20ng/ml)。阴性对照样品省略了用激活素A和Wnt3a两者进行的处理。
用纯的、10x或50x浓缩母液的形式接收每种表达的变体肽的上清液。将测试上清液1∶4或1∶8稀释于DMEM:F12中以产生中间稀释液，然后进一步1∶5稀释进装有细胞和测定培养基的每孔中(最终测定稀释度范围为1∶20至1∶40)。来自OriGene或ACTN 1(各对应于激活素A野生型)表达构建体用作这些测定法的阳性对照。
高内涵分析：在四天的培养结束时，用PBS洗涤测定板两次，用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100 在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号：16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号：AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号：H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除从阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
表8示出了人胚胎干细胞向定形内胚层分化(由SOX17表达水平测量)的结果。根据该筛选，对应于一亚组变体肽的上清液可鉴定为在定形内胚层生物测定法中具有显著的功能活性。在一些情况下，某些肽变体的功能活性显示出剂量滴定效果，在其中将上清液相对于纯的未浓缩样品浓缩10x或50x时具有更高活性；例如，当相对于它们各自相应的未浓缩上清液浓缩10x时，ACTN 4的样品上清液显示高2.6倍的效力，而ACTN 16显示出4倍的改善。某些样品未能表现出任何功能活性或相对于阳性对照具有最低限度的功能活性。这可反映蛋白质表达的差别，或者，可反映突变对激活素A变体的正常折叠、二聚体形成或与其各自的受体的亲和力的影响。然而，该筛选结果确实鉴定了一亚组在定形内胚层生物测定法中具有显著功能的变体肽。表9展示了该亚组命中变体肽。如果没有关于这些上清液样品中的蛋白 质表达水平的额外信息，那么该列表可能不是能充分理解的并且不能用于对变体肽的效力相对于彼此或相对于野生型标准进行排序。
实例8：本发明的肽的蛋白质浓度的测定
能够测量细胞培养上清液(纯的或浓缩的)中以及用于多种纯化策略的样品中的激活素A蛋白质的总量很重要。这是向能够将变体肽相互之间以及与野生型对照或商业来源的激活A相比较的必要步骤。为此，将市售的人激活素A的ELISA试剂盒用该试剂盒标准品和上述生物测定法中所用的不同商业来源的激活素A两者进行验证。在一后续步骤中，在ELISA测定法中测试了激活A以及本发明的变体肽的表达并纯化的样品以确定每种样品中总蛋白质的测量值。
使用一种市售的人激活素A的DuoSet试剂盒(R&D Systems，目录号：DY338)根据由生产商提供的说明书(不同的是，在每一推荐步骤洗涤步骤进行四次)，测定了细胞培养上清液(纯样品)、浓缩的上清液和纯化材料的总激活素A蛋白质。未包括在该试剂盒中并从其他商业来源购买的试剂包括BSA级分IV(RIA级；Sigma；目录号：A7888)TMB溶液(Sigma；目录号：T0440)、PBS(Invitrogen；目录号：14190)、Tween-20(JT Baker；目录号：X251-07)、硫酸(JT Baker；目录号：9681-00)和尿素(BioRad；目录号：161-0731)。将该试剂盒中由生产商提供的重组人激活素A用作ELISA验证的参照标准。将该材料进行两倍系列稀释以产生七点标准曲线，最高标准为8ng/ml，如图20A中所示。还将另一商业来源的重组人激活素A(Peprotech目录号：120-14)与所述试剂盒标准品进行了平行测试，并产生了相同的标准曲线，如图20B所示，表明了该测定法的高度可重复性。将细胞培养上清液(纯的或浓缩的)和纯化的材料(来自IMAC或ACTA 3亲和纯化柱)系列稀释，使得浓度可从标准曲线的线性部分计算。所有样品的ELISA结果在表10中示出。
选择一系列来自初步筛选的变体肽用于完成评价。在摇瓶中使用相应的pUnder载体和HEK293-F细胞如上面所述转染变体。简而言之，将细胞稀释至1.0×106个细胞/ml。将总DNA的等分试样稀释进Opti-Pro(Invitrogen；目录号：12309)中，并将FreeStyle Max转染试剂(Invitrogen；目录号：16447)的等分试样稀释进Opti-Pro中。将稀释的 DNA添加至稀释的Max试剂并在室温下孵育10分钟，随后添加该DNAMax复合物至细胞摇瓶中并在37℃和8％CO2下以125RPM摇动孵育96小时。通过以5,000×g离心10分钟将上清液从细胞分离并滤过0.2μm过滤器(Corning；目录号：431153)，然后用Amicon Ultra浓缩器10k(目录号：UFC901096)浓缩10倍，并以3,750×g离心大约10分钟。将样品在4℃下保存。
将细胞培养上清液系列稀释，使得浓度可从标准曲线的线性部分计算。所有样品的ELISA结果在表10和表11中示出。表10示出了首次尝试将样品稀释跨越大的范围以找到每种样品处于标准曲线线性部分的适当稀释度。这是重要的以便能够精确地计算样品浓度。表11示出了使用适当稀释系列的第二次实验以及各样品最终的计算浓度。
实例9：本发明的肽的蛋白质浓度与功能活性的相关性
显示已用组氨酸残基进行改变以易于纯化的本发明的变体肽也在定形内胚层分化测定法中具有活性并且该活性与特定蛋白质的相对量相关很重要。选择一亚组从上面实例5中的初步筛选鉴定的变体肽用于另外的bis-his突变。在相应培养物表达和浓缩后，对样品的总激活素A蛋白质和功能作用进行测定。
含组氨酸插入的本发明的肽的转染：根据实例2中所述的方法，产生表2中所列的编码bis-his肽ACTD 2至ACTD 16及它们各自的亲本构建体(ACTN 1、ACTN 16和ACTN 34)的基因序列并将其插入pUnder载体。如下对HEK293-F细胞进行瞬时转染：在转染当天，在摇瓶中将细胞在培养基中稀释至1.0×106个细胞/ml。将总DNA稀释进Opti-Pro中，并将FreeStyle Max转染试剂稀释进Opti-Pro中。将稀释的DNA添加至稀释的Max试剂并在室温下孵育10分钟。将DNA Max复合物的等分试样添加至细胞摇瓶中并置于37℃和8％CO2条件下的以125RPM摇动的培养箱中96小时。
在转染后四天收获来自瞬时转染的HEK293-F细胞的细胞上清液，通过离心(30分钟，6000rpm)使之澄清，并过滤(0.2μm PES膜，Corning)。用LV Centramate(Pall)浓缩器将样品浓缩4倍或10倍，并在4℃下保存。
ELISA蛋白质定量：使用市售的人激活素A的DuoSet试剂盒(R&DSystems，目录号：DY338)根据由生产商提供的说明书(不同的是，在每一推荐步骤将洗涤步骤进行四次)，测定了浓缩细胞培养上清液的总激活素A蛋白。将由该试剂盒的生产商提供的重组人激活素A用作ELISA验证的参照标准。在表12中示出了计算得到的每种样品的ELISA激活素A蛋白质浓度。
活细胞测定法：简而言之，根据实例5中所述的方法将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(BD Biosciences目录号：356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例接种于低生长因子MATRIGELTM包被的96孔板上。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&D Systems；目录号：233-FB)的MEF调理培养基饲养。
在测定法的最开始将各板的孔在PBS中洗涤两次，然后将DMEM:F12基础培养基中的测试样品的等分试样(100μl)添加至各孔。测试条件一式三份进行，在总共四天测定期间每隔一天通过从各孔抽吸出培养基并用测试样品替换培养基来进行饲养。在测定法的第一天和第二天，将添加至测定孔的测试样品稀释于具有0.5％FCS(HyClone；目录号：SH30070.03)和20ng/mlWnt3a(R&D Systems；目录号：1324-WN)的DMEM:F12中。在测定法的第三天和第四天，将添加至测定孔的测试样品稀释于具有2％FCS但没有任何Wnt3a的DMEM:F12中。阳性对照样品由如下组成：在整个测定法中以100ng/ml的浓度加入的重组人激活素A(Peprotech；目录号：120-14)和在第1天和第2天加入的Wnt3a(20ng/ml)。阴性对照样品省略了用激活素A和Wnt3a两者进行的处理。
高内涵分析：在四天的培养结束时，用PBS洗涤测定板两次，用4％多聚甲醛在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号：16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号：AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持一小时。将Alexa Fluor 488缀合的二 抗(鸡抗山羊IgG；Molecular Probes)在PBS中以1∶200稀释，并在用PBS洗涤三次后加至每个样品孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入4μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号：H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。根据阳性对照孔并根据单独用二抗染色的无处理阴性对照孔来优化曝光时间。每孔获取15个视野的图像，以补偿生物鉴定和后续染色程序中的任何细胞损失。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总细胞数目和总SOX17强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总SOX17蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。对于每个重复组，对归一化的数据计算平均值和标准偏差。
表12示出了多种激活素A肽变体的活性结果，其中在该测定法中定形内胚层形成后细胞数目和SOX17表达两者均与从ELISA结果估计的激活素A浓度相关。显然就肽变体的野生型家族(ACTN1和bis-his变体ACTD2-6)而言，额外的组氨酸取代对关于定形内胚层形成的功能活性具有极小或没有影响。对于其他肽变体家族(ACTN16和ACTN34)及它们各自的bis-his变体(分别是ACTD7-11和ACTD12-16)这也是如此，其中足量的蛋白质被添加至功能测定法中。
实例10：通过用本发明的肽处理人胚胎干细胞而形成的表达定形内胚层谱系特征 性标志物的细胞的FACS分析
显示本发明的变体肽可支持定形内胚层分化(通过其他生物标志物指示)是很重要的。CXCR4是常常与定形内胚层相关的表面蛋白。显示具有为了易于纯化而插入的额外组氨酸置换的变体肽不会影响激活素A分子的功能性质也是很重要的。在该实例中，使人胚胎干细胞经历使用一系列天然野生型和两种变体分子的bis-his原型的定形内胚层分化方案。
含组氨酸插入的本发明的肽的转染：根据实例2所述方法，产生编码表3中所列的bis-his肽ACTD3和ACTD8的基因序列并将其插入pUnder载体。如下对HEK293-F细胞进行瞬时转染：在转染当天，在独立的摇瓶中将细胞在培养基中稀释至1.0×106个细胞/ml。将总DNA稀释进Opti-Pro中，并将FreeStyle Max转染试剂稀释进Opti-Pro中。将稀释的DNA添加至稀释的Max试剂并在室温下孵育10分钟。将DNA Max复合物的等分试样添加至细胞摇瓶中并置于37℃和8％CO2条件下的以125RPM摇动的培养箱中96小时。
含组氨酸插入的本发明的肽的纯化：采用固定化金属螯合亲和色谱(IMAC)的纯化用GE Healthcare’s UNICORNTM软件在AKTA FPLC色谱系统上进行。
在转染后四天收获来自瞬时转染的HEK293-F细胞的细胞上清液，通过离心(30分钟，6000rpm)使之澄清，并过滤(0.2μm PES膜，Corning)。使用实例6所述的方法通过ELISA测定特定蛋白质的相对量。用LVCentramate(Pall)浓缩器将样品浓缩4倍或10倍并通过使用用于检测的抗激活素A抗体(R&D Systems；目录号：3381)或抗激活素A前体抗体(R&DSystems；目录号：1203)的蛋白质印迹检验。在这时保存ACTD3和ACTD8浓缩样品的等分试样而无需进一步纯化以用于活细胞测定法。然后将该浓缩样品用10x PBS稀释至1x PBS的终浓度，再次用0.2μm的膜过滤。以大约10mg蛋白质/ml树脂的相对浓度将稀释的上清液上样至平衡(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.4)过的HisTrap柱(GE Healthcare)上。上样后，洗涤柱子并用20柱体积用线性梯度的咪唑(0-500mM)洗脱蛋白质。收集峰级分，并在4℃下相对于PBS，pH 7透析过夜。从透析液移出透析过的蛋白质，过滤(0.2μm)，通过在NANODROPTM分光光度计(ThermoFisher Scientific)上测量280nm下的吸光度来确定总蛋白质浓度。通过SDS-PAGE和使用用于检测的抗激活素A抗体(R&D Systems；目录号：3381)或抗激活素A前体(R&D Systems；目录号：1203)的蛋白质印迹评估纯化的蛋白质的质量。如有必要，用10K截留分子量(MWCO)离心浓缩器(Millipore)对纯化的蛋白质进行浓缩。将样品在4℃下保存。
ELISA测定法：在ELISA中测试ACTD3(4倍浓缩)、ACTD8(10倍浓缩)的培养物上清液和每一者的IMAC纯化材料以测量总蛋白质浓度。使用市售的人激活素A的DuoSet试剂盒(R&D Systems，目录号：DY338)根据由该生产商提供的说明书(不同的是，在每一推荐步骤将洗涤步骤进行四次)，测定了样品的总激活素A蛋白质。将由该试剂盒的生产商提供的重组人激活素A用作ELISA验证的参照标准。ACTD3的浓缩上清液以不足以通过ELISA测量的量存在。所计算的其余样品的蛋白质浓度如下：ACTD8(10x上清液浓缩物)361ng/ml；ACTD8(IMAC纯化过的)1,893ng/ml；ACTD3(IMAC纯化过的)57,956ng/ml。
活细胞测定法：简而言之，根据实例5中所述的方法将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(BD Biosciences目录号：356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：利用胶原酶处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例接种于低生长因子MATRIGELTM包被的96孔板上。让细胞成簇贴附，然后在1至3天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&D Systems；目录号：233-FB)的MEF调理培养基饲养。
在测定法的最开始将各板的孔在PBS中洗涤两次，然后将DMEM:F12基础培养基中的测试样品的等分试样(100μl)添加至各孔。测试条件在九孔重复组中进行，在总共四天测定期间每隔一天通过从各孔抽吸出培养基并用测试样品替换培养基来进行饲养。在测定法的第一天和第二天，将添加至测定孔的测试样品稀释于具有0.5％FCS(HyClone；目录号：SH30070.03)和20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号：1324-WN)的DMEM:F12中。在测定法的第三天和第四天，将添加至测定孔的测试样品稀释于具有2％FCS但没有任何Wnt3a的DMEM:F12中。阳性对照样品由如下组成：在整个测定法中以100ng/ml的浓度加入的重组人激活素A(Peprotech；目录号：120-14)和在第1天和第2天加入的Wnt3a(20ng/ml)。阴性对照样品省略了用激活素A和Wnt3a两者进行的处理。将每种浓缩上清液或IMAC纯化的样品1∶16稀释于DMEM:F12中以产生中间稀释液，然后进一步1∶5稀释进装有细胞和测定培养基的每孔中(最终测定稀释度1∶80)。在四天培养结束时，用PBS洗涤测定孔，对于每种处理条件通过用TrypLETM(Invitrogen；目录 号：12604-013)简单处理3-5分钟而从九个重复孔收集细胞的单细胞悬浮液。在FACS分析前将细胞在PBS中洗涤一次。
FACS分析：将用于FACS分析的细胞于4℃下在PBS(Invitrogen；目录号：14040-133)中的0.5％人γ-球蛋白(Sigma；目录号：G-4386)：BDFACS染色缓冲液-BSA(BD；目录号：554657)的1∶5溶液中封闭15分钟。然后将细胞在4℃下用CD9PE(BD；目录号：555372)、CD99PE(Caltag；目录号：MHCD9904)和CXCR4APC(R&D Systems；目录号：FAB173A)的抗体染色30分钟。在BD FACS染色缓冲液中的一系列洗涤后，将细胞用7-AAD(BD；目录号：559925)针对生活力进行染色并在BD FACSArray上进行。将针对PE和APC两者的小鼠IgG1K同种型对照抗体用于测量阳性细胞百分数。
图21所示的结果表明，来自bis-his构建体每一者的纯化材料均具有功能活性并且可诱导从人胚胎干细胞形成定形内胚层。
实例11：本发明的肽的效力
评价变体肽每一者较于野生型激活素A分子(ACTN1)的相对活性和效力很重要。在该实例中，选择了15种变体肽并使其表达，通过ELISA对来自浓缩的培养上清液的所分泌产物每一者进行定量。然后在使用人胚胎干细胞的定形内胚层分化方案中评价一定剂量的每种肽的功能活性。
本发明的肽的转染：根据实例2所述方法，产生编码表13中所列的bis-his肽的基因序列并将其插入pUnder载体中。用Freestyle Max转染试剂(Invitrogen；目录号：16447)瞬时转染HEK 293F细胞。在20ml转染体积的转染之前，将细胞稀释至1.0×106个细胞/ml。在转染当天，将1.25μg/ml的转染物稀释进1.0ml OPTIPRO(Invitrogen；目录号：12309)中并将1.25ml Max转染试剂稀释进1.0ml OPTIPRO中。将DNA和Max转染试剂添加在一起以形成脂质复合物并在室温下孵育10分钟。然后将该脂质复合物添加至细胞中并置于培养箱中4天，在37℃和8％CO2下以125RPM摇动。在转染后四天收获细胞，通过离心(30分钟，6000rpm)使之澄清，并过滤(0.2μm PES膜，Corning)。使用实例6所述的方法通过ELISA测定特定蛋白质的相对量。如有必要，将该蛋白质上清液用Amicon Ultra浓缩器3K(Millipore；目录号：UFC900396)以，3,500RCF离心大约40分钟而浓缩 20倍，并通过使用用于检测的抗激活素A抗体(R&D Systems；目录号：3381)或抗激活素A前体抗体(R&D Systems；目录号：1203)的蛋白质印迹检验。在这时保存ACTD3和ACTD8浓缩样品的等分试样而无需进一步纯化以用于活细胞测定法。将10x PBS添加至浓缩样品至1x PBS终浓度，然后通过0.2μ过滤器。如有必要，将蛋白质浓缩20倍。将样品在4℃下保存。
在转染当天，在独立的摇瓶中将细胞在培养基中稀释至1.0×106个细胞/ml。将总DNA稀释进Opti-Pro中，并将FreeStyle Max转染试剂稀释进Opti-Pro中。将稀释的DNA添加至稀释的Max试剂并在室温下孵育10分钟。将DNA Max复合物的等分试样添加至细胞摇瓶中并置于37℃和8％CO2条件下的以125RPM摇动的培养箱中96小时。
在转染后四天收获来自瞬时转染的HEK293-F细胞的细胞上清液，通过离心(30分钟，6000rpm)使之澄清，并过滤(0.2μm PES膜，Corning)。使用实例6所述的方法通过ELISA测定特定蛋白质的相对量。用LVCentramate(Pall)浓缩器将样品浓缩4倍或10倍并通过使用用于检测的抗激活素A抗体(R&D Systems；目录号：3381)或抗激活素A前体抗体(R&DSystems；目录号：1203)的蛋白质印迹检验。在这时保存ACTD3和ACTD8浓缩样品的等分试样而无需进一步纯化以用于活细胞测定法。然后将该浓缩样品用10x PBS稀释至1x PBS的终浓度，再次用0.2μm的膜过滤。以大约10mg蛋白质/ml树脂的相对浓度将稀释的上清液上样至平衡(20mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.4)过的HisTrap柱(GE Healthcare)上。上样后，洗涤柱子并用20柱体积用线性梯度的咪唑(0-500mM)洗脱蛋白质。收集峰级分，并在4℃下相对于PBS，pH 7透析过夜。从透析液移出透析过的蛋白质，过滤(0.2μm)，通过在NANODROPTM分光光度计(ThermoFisher Scientific)上测量280nm下的吸光度来确定总蛋白质浓度。通过SDS-PAGE和使用用于检测的抗激活素A抗体(R&D Systems；目录号：3381)或抗激活素A前体(R&D Systems；目录号：1203)的蛋白质印迹评估纯化的蛋白质的质量。如有必要，用10K截留分子量(MWCO)离心浓缩器(Millipore)对纯化的蛋白质进行浓缩。将样品在4℃下保存。
ELISA测定法：在ELISA中测试15种不同的ACTN肽(另外还包括野生型ACTN1分子)的培养上清液以测量总蛋白质浓度。使用市售的人激活素A的DuoSet试剂盒(R&D Systems，目录号：DY338)根据由该生产商提供的说明书(不同的是，在每一推荐步骤将洗涤步骤进行四次)测定样品。将由该试剂盒的生产商提供的重组人激活素A用作ELISA验证的参照标准。ACTN56、ACTN65和ACTN69的浓缩上清液的存在量不足以用ELISA测量。所计算的其余样品的蛋白质浓度在表13中示出。
活细胞测定法：简而言之，根据实例5中所述的方法将H1人胚胎干细胞簇在低生长因子MATRIGELTM(BD Biosciences目录号：356231)包被的组织培养塑料上培养。细胞通过以下方式来传代：用胶原酶处理并小心刮擦、洗涤以除去残余酶，并以1∶1(表面面积)的比例接种于低生长因子MATRIGELTM包被的96孔板(PerkinElmer；目录号：6005182)上，体积为0.1ml/孔。让细胞成簇贴附，然后在一至三天时间内恢复对数期生长，每天用补充有8ng/ml的bFGF(R&D Systems；目录号：233-FB)的MEF调理培养基饲养。在整个测定法期间，将板维持在37℃、5％CO2下。
在测定法的最开始将各板的孔在PBS中洗涤两次，然后将测试样品的等分试样(100μl)添加至各孔。测试条件在总共四天的测定期间重复进行三次，在第1天和第3天通过从各孔抽吸培养基并用新鲜测试培养基替换该培养基来饲养。基于ACTN浓缩上清液每一者的ELISA结果，在适当培养基中产生了两倍稀释系列(范围为3.1ng/ml至400ng/ml)以用于在第1天和第3天添加至测定法中。在测定法的第一天和第二天，将添加至测定孔的测试样品稀释于补充有0.5％FCS(HyClone；目录号：SH30070.03)和20ng/mlWnt3a(R&D Systems；目录号：1324-WN)的DMEM:F12中。在测定法的第三天和第四天，将添加至测定孔的测试样品稀释于补充有2％FCS但没有任何Wnt3a的DMEM:F12中。阳性对照样品由如下组成：在整个测定法中以100ng/ml的浓度加入的重组人激活素A(Peprotech；目录号：120-14)和仅在第1天和第2天加入的Wnt3a(20ng/ml)。阴性对照样品由没有任何生长因子的测定培养基组成。
高内涵分析：在培养结束时，将测定板用PBS(Invitrogen；目录号：14190)洗涤一次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号：ALX-350- 011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号：T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号：16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号：AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持两小时。在用PBS洗涤三次后，将以1∶200稀释于PBS中的Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Invitrogen；目录号：A21467)加至每个孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入5μg/ml Hoechst 33342(Invitrogen；目录号：H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。从每孔的25个视野获得图像。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至4500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。
在图22的分图a至i中，测定法结果图示了SOX17表达百分比对肽浓度。对于变体ACTN肽每一者，示出了相对于野生型ACTN1肽的相似曲线的剂量滴定曲线。还标明了曲线拟合度的值(R2值)。所有的变体ACTN肽的剂量滴定结果与野生型ACTN1肽剂量滴定密切匹配，其中曲线偏移波动处于每一标准曲线的标准误差范围内。这些数据表明，每种变体ACTN肽的效力与野生型ACTN1肽的相似或相当。
实例12：ACTN变体肽可介导下游胰腺分化
证实用本发明的肽处理人胚胎干细胞将不会阻止向内胚层和内分泌谱系进一步分化很重要。将两种ACTN用于使人胚胎干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此后，将分步分化方案应用于处理细胞，以促进向胰腺内胚层和内分泌谱系的分化。在整个分步分化过程中，将用ACTN1野生型肽处理的细胞的平行对照样品用于比较。在分化的每个阶段 取得样品，以确定代表分化的多个阶段的蛋白质和mRNA生物标记的出现。
用于测定法的细胞准备：将人胚胎干细胞(H1hESC系)的母培养物以未分化、多能状态维持在补充有bFGF(PeproTech；目录号：100-18B)的MEF调理培养基中的低生长因子MATRIGELTM包被的平皿上，平均每四天传代。传代通过这样进行：使细胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml胶原酶(Invitrogen，目录号：17104-019)的溶液五至七分钟，然后用MEF调理培养基冲洗该单层并小心刮擦以回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉淀并除去残余的胶原酶。将细胞簇以1∶3或1∶4的比例分传以进行例行维持培养，或者以1∶1比例分传以立即进行测试。将所有人胚胎干细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评价核型表型是否正常和支原体污染是否存在。
将细胞簇均匀地再悬浮于补充有8ng/ml bFGF的MEF调理培养基中，并以0.5ml/孔的体积接种到低生长因子MATRIGELTM包被的24孔黑壁培养板(Arctic White；目录号：AWLS-303012)上。日常饲养是通过从每个孔抽吸掉废培养基并用等体积的新鲜培养基替换来进行。在整个测定法期间，将板维持在37℃、5％CO2下。
测定法：如下开始该测定法：从每个孔抽吸掉培养基，并重新添加测试培养基的等分试样(0.5ml)。在三天的周期内进行分化第一步的测试条件，每天通过从各孔抽吸培养基并用新鲜的测试培养基替换该培养基来饲养。如先前实例11中所述，用人激活素A的DuoSetELISA试剂盒(R&DSystems；目录号：DY338)评价ACTN肽的浓缩上清液的蛋白质浓度。在测定的第一天，将ACTN肽在具有2％牛白蛋白级分V、无脂肪酸BSA(FAF BSA)(MP Biomedicals，Inc；目录号：152401)、8ng/ml bFGF和20ng/ml Wnt3a(R&D Systems；目录号：1324-WN/CF)的RPMI 1640培养基(Invitrogen；目录号：22400)中稀释至终浓度100ng/ml，然后添加至测定孔。在测定法的第二天和第三天，将ACTN肽稀释进补充有2％无脂肪酸BSA和8ng/ml bFGF而无任何Wnt3a的RPMI 1640培养基中，然后添加至测定孔。阳性对照样品包括稀释于具有所标明的生长因子的培养基中的商业来源的激活素A(PeproTech；目录号：120-14)。在三天培养结束时，从 一些孔收获细胞进行流式细胞检测分析，以评价CXCR4(定形内胚层形成的标志物)的水平。从另外的孔收获样品用于RT-PCR分析其他分化标志物。对其他培养孔进行SOX17蛋白质表达水平的高内涵分析。
在该分化方案的第一步结束时，使各处理组的重复平行孔组进行进一步分步分化。重要的是注意在第一个三天后，所有经历连续培养和分化的孔接受相同的处理。这种连续分化的方案在下面描述。
在分化的第二个步骤，将培养物在DMEM:F12培养基(Invitrogen；目录号：11330-032)中培养两天，所述DMEM:F12培养基补充有2％牛血清白蛋白级分V、无脂肪酸BSA(FAFBSA)(MP Biomedicals，Inc；目录号：152401)、50ng/ml FGF7(PeproTech；目录号：100-19)和250nM环巴胺(Calbiochem；目录号：239804)。在这两天每天均抽吸各孔中的培养基并用新鲜等分试样(0.5ml)替换。
用四天进行该分化方案的步骤3。通过从各孔抽吸培养基并用新鲜等分量(0.5ml)的高葡萄糖DMEM(Invitrogen；目录号：10569)替换每天对细胞进行饲养，所述高葡萄糖DMEM补充有1％B27(Invitrogen；目录号：17504-044)、50ng/ml FGF7、100ng/ml成头蛋白(R&D Systems；目录号：3344-NG)、250nM KAAD-环巴胺(Calbiochem；目录号：239804)和2μM全反式视黄酸(RA)(Sigma-Aldrich；目录号：R2625)。在该分化的第三个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。对其他培养孔进行PDX1(一种与胰腺内胚层相关的转录因子)和CDX2(一种与肠内胚层相关的转录因子)的蛋白质表达水平的高内涵图像分析。
用三天进行该分化方案的步骤4。通过从各孔抽吸培养基并用新鲜等分量(0.5ml)的高葡萄糖DMEM替换每天对细胞进行饲养，所述高葡萄糖DMEM补充有1％B27、100ng/ml成头蛋白、100ng/ml轴突导向因子-4(R&D Systems)、1μM DAPT和1μM Alk 5抑制剂(Axxora；目录号：ALX-270-445)。在该分化的第四个步骤结束时，从一些孔收获细胞用于通过RT-PCR分析以测量分化的标志物。
FACS分析：将用于FACS分析的细胞于4℃下在PBS(Invitrogen；目录号：14040-133)中的0.5％人γ-球蛋白(Sigma；目录号：G-4386)：BD FACS染色缓冲液-BSA(BD；目录号：554657)的1∶5溶液中封闭15分钟。然后将细胞用CXCR4APC的抗体(R&D Systems；目录号：FAB173A)在4℃下染色30分钟。在BD FACS染色缓冲液中的一系列洗涤后，将细胞用7-AAD(BD；目录号：559925)针对生活力进行染色并在BD FACSArray上进行。将APC的小鼠IgG1K同种型对照抗体用于测量阳性细胞百分数。
RT-PCR分析：通过在存在含乙醇的高盐缓冲液的情况下与硅胶膜(Rneasy MiniKit，Qiagen，CA)结合，随后通过洗涤来除去污染物来对RNA样品进行纯化。用TURBO DNA-free试剂盒(Ambion，INC)使RNA进一步纯化，并随后将高质量的RNA在水中稀释。通过在分光光度计上读取A260和A280读数来评估产率和纯度。用ABI(ABI，CA)大容量cDNA库试剂盒从纯化的RNA制备cDNA拷贝。
除非另外指明，否则所有试剂均购自Applied Biosystems。实时PCR反应用ABI7900序列检测系统来进行。将 UNIVERSALPCR MASTER (ABI，CA)用于20ng的逆转录RNA，总反应体积为20μl。每种cDNA样品重复运行两次以校正吸量误差。使用浓度为200nM的引物和FAM-标记的 探针。使用此前由AppliedBiosystems开发的人3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)内源性对照对每一个靶标基因的表达水平进行归一化。引物和探针组如下：GAPDH(Applied Biosystems)、FOXA2(Hs00232764_m1，Applied Biosystems)、SOX17(Hs00751752_s1，Applied Biosystems)、CDX2(Hs00230919_m1，Applied Biosystems)、PDX1(Hs00236830_m1，Applied Biosystems)、NGN3(Hs00360700_g1，AppliedBiosystems)、NKX6.1(Hs00232355_m1，Applied Biosystems)和PTF1α(Hs00603586_g1，Applied Biosystems)。在50℃下初始孵育2分钟然后95℃下孵育10分钟后，将样品进行40次的两阶段循环：变性步骤，95℃15秒，然后退火/延伸步骤，60℃1分钟。数据分析用GENEAMP 7000序列检测系统的软件进行。对于每个引物/探针组，Ct值确定为荧光强度达到扩增指数区中部中的特定值时的循环数。用比较性Ct方法来计算相对基因表达水平。简而言之，对于每种cDNA样品，从所关注基因的Ct值减去内源对 照Ct值而得到改变的Ct值(ΔCt)。靶标的归一化量计算为2-ΔCt，假设扩增为100％的效率。最终的数据是相对于校准样品表示的。
高内涵分析：在三天的培养结束时，将测定板用PBS(Invitrogen；目录号：14190)洗涤一次，用4％多聚甲醛(Alexis Biochemical；目录号：ALX-350-011)在室温下固定20分钟，然后用PBS洗涤三次并用0.5％Triton X-100(Sigma；目录号：T8760-2)在室温下透化处理20分钟。将细胞再用PBS洗涤三次，然后用4％鸡血清(Invitrogen；目录号：16110082)在PBS中于室温下封闭30分钟。将一抗(山羊抗人SOX17；R&D Systems；目录号：AF1924)在4％鸡血清中以1∶100稀释，在室温下加至每个孔保持两小时。在用PBS洗涤三次后，将以1∶200稀释于PBS中的Alexa Fluor 488缀合的二抗(鸡抗山羊IgG；Invitrogen；目录号：A21467)加至每个孔。为了对细胞核进行复染，在室温下加入5μg/mlHoechst 33342(Invitrogen；目录号：H3570)保持十分钟。将板用PBS洗涤一次，并保留在100μl/孔PBS中以进行成像。用于分析的其他一抗包括1∶100稀释的小鼠抗人CDX2(Invitrogen；目录号：397800)、1∶100稀释的山羊抗人PDX1(Santa Cruz Biotechnology；目录号：SC-14664)、1∶200稀释的兔抗人胰岛素(Cell Signaling；目录号：C27C9)和1∶1500稀释的小鼠抗人胰高血糖素(Sigma-Aldrich；目录号：G2654)。用于分析的二抗包括1∶400稀释的Alexa Fluor 647鸡抗小鼠IgG(Invitrogen；目录号：A-21463)、1∶200稀释的Alexa Fluor 488驴抗山羊IgG(Invitrogen；目录号：A11055)、1∶1000稀释的Alexa Fluor 647鸡抗兔IgG(Invitrogen；目录号：A21443)和1∶1000稀释的Alexa Fluor 488鸡抗小鼠(Invitrogen；目录号：A21200)。
用IN Cell Analyzer 1000细胞分析仪(GE Healthcare)进行成像，对于用Hoechst 33342和Alexa Fluor 488染色的细胞采用51008bs二向分色镜。从每孔的25个视野获得图像。用IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE Healthcare)软件从每个孔获得总强度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。计算每个重复数据集的平均值和标准偏差。总蛋白表达记录为总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面 积。基于灰阶范围在200至4500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。
结果：图23示出了针对定形内胚层的多种代表性标志物，使用流式细胞检测分析、PCR和高内涵测量在分化的第一个步骤结束时的结果。图23A图示了CXCR4水平的FACS分析，将用商业来源的激活素A处理与野生型ACTN1处理相比较；对于两种处理结果证实具有相当的和强的CXCR4表达。图23B示出了两种变体肽(ACTN4和ACTN48)与野生型ACTN1肽相比较的CXCR4表达；对于所有处理结果均是等价的或相当的。图23C至图23F示出了在分化的第一个步骤结束时细胞数目和SOX17表达的高内涵分析，同样证实对于用市售激活素A和ACNT1野生型肽处理结果等价，还显示出与两种变体肽每一者具有相当的结果。图23G和23H示出了在分化的第一个步骤结束时的RT-PCR结果。相对于ACTN1和市售激活素A处理，用ACTN4和ACTN48变体肽处理的样品具有类似的SOX17和FOXA2(与定形内胚层分化相关的标志物)表达水平。
图24示出了针对胰腺内胚层的多种代表性标志物，使用PCR和高内涵测量在分化的第三个步骤结束时的结果。用ACTN4和ACTN48变体肽处理得到等价的细胞数目和等价的PDX1和CDX2的蛋白质表达，与使用市售激活素A或ACTN1野生型肽处理时所观察到的结果相当。RT-PCR结果一致。
图25示出了在分化的步骤四结束时的RT-PCR结果。与前面一样，相对于用市售激活素A或ACTN1野生型肽处理用ACTN4和ACTN48变体肽处理得到相当的下游胰腺分化标志物表达。
这些综合结果证明，ACTN4和ACTN48变体肽可在定形内胚层分化以及后续的胰腺内胚层和内分泌分化期间替代激活素A。
藉此将整篇文档中引用的出版物全文以引用方式并入本文。尽管上文已结合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围不受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下正确解释的权利要求书的限定。
表1
本发明的肽的原区和成熟蛋白区的氨基酸序列
原区
>野生型激活素A原区(SwissProt/UniProt：P08476)：SEQ ID 1
MPLLWLRGFLLASCWIIVRSSPTPGSEGHSAAPDCPSCALAALPKDVPNSQPEMVEAVKKHILNMLHLKKRPDVTQPVPKAALLNAIRKLHVGKVGENGYVEIEDDIGRRAEMNELMEQTSEIITFAESGTARKTLHFEISKEGSDLSVVERAEVWLFLKVPKANRTRTKVTIRLFQQQKHPQGSLDTGEEAEEVGLKGERSELLLSEKVVDARKSTWHVFPVSSSIQRLLDQGKSSLDVRIACEQCQESGASLVLLGKKKKKEEEGEGKKKGGGEGGAGADEEKEQSHRPFLMLQARQSEDHPHRRRRR
成熟蛋白区：
>ACTN1(野生型激活素A)(SwissProt/UniProt：P08476)：SEQ ID 2
GLECDGKVNICCKKQFFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANYCEGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN2：SEQ ID 3
GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECTGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDLGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN3：SEQ ID 4
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN4：SEQ ID 5
GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN5：SEQ ID 6
GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNLGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN6：SEQ ID 7
GLECDGKVNLCCKKQWFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVTNHYRMRGHSPFADMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN7：SEQ ID 8
GLECDGKVNYCCKKQHFVSFKIDIGWNDWIIAPSGYHANSCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN8：SEQ ID 9
GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN9：SEQ ID 10
GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCTGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFADLGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN10：SEQ ID 11
GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFAQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN11：SEQ ID 12
GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHAHHCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFAQMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN12：SEQ ID 13
GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN13：SEQ ID 14
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN14：SEQ ID 15
GLECDGKVNLCCKKQHFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFAQMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN15：SEQ ID 16
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN16：SEQ ID 17
GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN17：SEQ ID 18
GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN18：SEQ ID 19
GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN19：SEQ ID 20
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN20：SEQ ID 21
GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFAQMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN21：SEQ ID 22
GLECDGKVNYCCKKQWFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN22：SEQ ID 23
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFALMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN23：SEQ ID 24
GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN24：SEQ ID 25
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGRCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN25：SEQ ID 26
GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN26：SEQ ID 27
GLECDGKVNLCCKKQHFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN27：SEQ ID 28
GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANRGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN28：SEQ ID 29
GLECDGKVNYCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN29：SEQ ID 30
GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN30：SEQ ID 31
GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSKMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN31：SEQ ID 32
GLECDGKVNTCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN32：SEQ ID 33
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCIPTKRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN33：SEQ ID 34
GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECMGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN34：SEQ ID 35
GLECDGKVNYCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCTGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDLGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN35：SEQ ID 36
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN36：SEQ ID 37
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN37：SEQ ID 38
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN38：SEQ ID 39
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCGGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSQLGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN39：SEQ ID 40
GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN40：SEQ ID 41
GLECDGKVNLCCKKQLFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANHCAGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSNMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN41：SEQ ID 42
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANSCSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDRGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN42：SEQ ID 43
GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANKCSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN43：SEQ ID 44
GLECDGKVNYCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN44：SEQ ID 45
GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN45：SEQ ID 46
GLECDGKVNTCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN46：SEQ ID 47
GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECGGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPHANRGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN47：SEQ ID 48
GLECDGKVNYCCKKQNFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGKCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN48：SEQ ID 49
GLECDGKVNLCCKKQNFVSFKKDIGWNDWIIAPSGYHANECSGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANMGACCIPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN49：SEQ ID 50
GLECDGKVNLCCKKQDFVSFKDIGWNDWIIAPSGYHANRCDGLCPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFSDMGSCCVPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMIVEECGCS
>ACTN50：SEQ ID 51
GLECDGKVNICCKKQLFGRTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT
>ACTN51：SEQ ID 52
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMVVEECGCT
>ACTN52：SEQ ID 53
GLECDGKVNICCKKQLFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT
>ACTN53：SEQ ID 54
GLECDGKVNICCKKQEFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT
>ACTN54：SEQ ID 55
GLECDGKVNICCKKQSFAQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT
>ACTN55：SEQ ID 56
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT
>ACTN56：SEQ ID 57
GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCV
>ACTN57：SEQ ID 58
GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT
>ACTN58：SEQ ID 59
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT
>ACTN59：SEQ ID 60
GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCV
>ACTN60：SEQ ID 61
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCV
>ACTN61：SEQ ID 62
GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT
>ACTN62：SEQ ID 63
GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT
>ACTN63：SEQ ID 64
GLECDGKVNICCKKQSFSQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT
>ACTN64：SEQ ID 65
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT
>ACTN65：SEQ ID 66
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT
>ACTN66：SEQ ID 67
GLECDGKVNICCKKQMFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT
>ACTN67：SEQ ID 68
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT
>ACTN68：SEQ ID 69
GLECDGKVNICCKKQSFGKAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT
>ACTN69：SEQ ID 70
GLECDGKVNICCKKQSFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQQMVVEECGCT
>ACTN70：SEQ ID 71
GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT
>ACTN71：SEQ ID 72
GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT
>ACTN72：SEQ ID 73
GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT
>ACTN73：SEQ ID 74
GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT
>ACTN74：SEQ ID 75
GLECDGKVNICCKKQSFGRAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMVVEECGCT
>ACTN75：SEQ ID 76
GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMKVEECGCT
>ACTN76：SEQ ID 77
GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT
>ACTN77：SEQ ID 78
GLECDGKVNICCKKQMFGKAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT
>ACTN78：SEQ ID 79
GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT
>ACTN79：SEQ ID 80
GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMVVEECGCT
>ACTN80：SEQ ID 81
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCAPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCV
>ACTN81：SEQ ID 82
GLECDGKVNICCKKQLFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMVVEECGCT
>ACTN82：SEQ ID 83
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT
>ACTN83：SEQ ID 84
GLECDGKVNICCKKQSFGRAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT
>ACTN84：SEQ ID 85
GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT
>ACTN85：SEQ ID 86
GLECDGKVNICCKKQLFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPVANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT
>ACTN86：SEQ ID 87
GLECDGKVNICCKKQSFGKTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT
>ACTN87：SEQ ID 88
GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT
>ACTN88：SEQ ID 89
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT
>ACTN89：SEQ ID 90
GLECDGKVNICCKKQLFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPNANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT
>ACTN90：SEQ ID 91
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGSCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT
>ACTN91：SEQ ID 92
GLECDGKVNICCKKQSFGRTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMVVEECGCT
>ACTN92：SEQ ID 93
GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCSGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQGMKVEECGCT
>ACTN93：SEQ ID 94
GLECDGKVNICCKKQSFGQTKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPFANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQNMKVEECGCT
>ACTN94：SEQ ID 95
GLECDGKVNICCKKQSFGQAKDIGWNDWIIAPSGYHGGGCTGECPSHIAGTSGSSLSFHSTVINHYRMRGHSPWANLKSCCSPTKLRPMSMLYYDDGQNIIKKDIQRMVAEECGCT
表2
编码本发明的肽的DNA序列
原区：
>野生型激活素A原区：SEQ ID 96
ATGCCCTTGCTTTGGCTGAGAGGATTTCTGTTGGCAAGTTGCTGGATTATAGTGAGGAGTTCCCCCACCCCAGGATCCGAGGGGCACAGCGCGGCCCCCGACTGTCCGTCCTGTGCGCTGGCCGCCCTCCCAAAGGATGTACCCAACTCTCAGCCAGAGATGGTGGAGGCCGTCAAGAAGCACATTTTAAACATGCTGCACTTGAAGAAGAGACCCGATGTCACCCAGCCGGTACCCAAGGCGGCGCTTCTGAACGCGATCAGAAAGCTTCATGTGGGCAAAGTCGGGGAGAACGGGTATGTGGAGATAGAGGATGACATTGGAAGGAGGGCAGAAATGAATGAACTTATGGAGCAGACCTCGGAGATCATCACGTTTGCCGAGTCAGGAACAGCCAGGAAGACGCTGCACTTCGAGATTTCCAAGGAAGGCAGTGACCTGTCAGTGGTGGAGCGTGCAGAAGTCTGGCTCTTCCTAAAAGTCCCCAAGGCCAACAGGACCAGGACCAAAGTCACCATCCGCCTCTTCCAGCAGCAGAAGCACCCGCAGGGCAGCTTGGACACAGGGGAAGAGGCCGAGGAAGTGGGCTTAAAGGGGGAGAGGAGTGAACTGTTGCTCTCTGAAAAAGTAGTAGACGCTCGGAAGAGCACCTGGCATGTCTTCCCTGTCTCCAGCAGCATCCAGCGGTTGCTGGACCAGGGCAAGAGCTCCCTGGACGTTCGGATTGCCTGTGAGCAGTGCCAGGAGAGTGGCGCCAGCTTGGTTCTCCTGGGCAAGAAGAAGAAGAAAGAAGAGGAGGGGGAAGGGAAAAAGAAGGGCGGAGGTGAAGGTGGGGCAGGAGCAGATGAGGAAAAGGAGCAGTCGCACAGACCTTTCCTCATGCTGCAGGCCCGGCAGTCTGAAGACCACCCTCATCGCCGGCGTCGGCGG
成熟蛋白区：
>ACTN1(野生型激活素A)：SEQ ID 97
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGTTCTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACTACTGCGAGGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN2：SEQ ID 98
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCC CCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCACCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCGACCTGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN3：SEQ ID 99
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN4：SEQ ID 100
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN5：SEQ ID 101
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCAACCTGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN6：SEQ ID 102
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGTGGTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCGACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN7：SEQ ID 103
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGCACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGCTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN8：SEQ ID 104
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN9：SEQ ID 105
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCACCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCGACCTGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN10：SEQ ID 106
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN11：SEQ ID 107
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCCAGATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN12：SEQ ID 108
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN13：SEQ ID 109
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN14：SEQ ID 110
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCGACGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCCAGATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN15：SEQ ID 111
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN16：SEQ ID 112
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCCAGATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN17：SEQ ID 113
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCGGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN18：SEQ ID 114
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN19：SEQ ID 115
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCGGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN20：SEQ ID 116
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCGGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCCAGATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN21：SEQ ID 117
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGTGGTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN22：SEQ ID 118
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCGACGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCCTGATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN23：SEQ ID 119
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCGACGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN24：SEQ ID 120
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCAGCGGCAGGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN25：SEQ ID 121
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGC GGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCCAGATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN26：SEQ ID 122
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCGACGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN27：SEQ ID 123
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCGACGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACAGGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN28：SEQ ID 124
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN29：SEQ ID 125
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN30：SEQ ID 126
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACTACTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAAGTGCAGCGGCCTGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCAAGATGGGCGCCTGCTGCGTGCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN31：SEQ ID 127
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACACCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACCACTGCAGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN32：SEQ ID 128
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGGACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACAGGTGCGGCGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCAACATGGGCAGCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
>ACTN33：SEQ ID 129
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACCTGTGCTGCAAGAAGCAGAACTTCGTGAGCTTCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGCCAACGAGTGCATGGGCAAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCAGCGACATGGGCGCCTGCTGCATCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGATCGTGGAGGAGTGCGGCTGCAGCTAA
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>ACTN83：SEQ ID 179
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCAGGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
>ACTN84：SEQ ID 180
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
>ACTN85：SEQ ID 181
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCCAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCGTGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
>ACTN86：SEQ ID 182
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCAAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
>ACTN87：SEQ ID 183
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCAGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
>ACTN88：SEQ ID 184
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
>ACTN89：SEQ ID 185
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGCTGTTCGGCCAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCAACGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
>ACTN90：SEQ ID 186
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCAGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
>ACTN91：SEQ ID 187
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCAGGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGC
GGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGGTGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
>ACTN92：SEQ ID 188
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCAGCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGGGCATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
>ACTN93：SEQ ID 189
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGACCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTTCGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAACATGAAGGTGGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
>ACTN94
GGCCTGGAGTGCGACGGCAAGGTGAACATCTGCTGCAAGAAGCAGAGCTTCGGCCAGGCCAAGGACATCGGCTGGAACGACTGGATCATCGCCCCCAGCGGCTACCACGGCGGCGGCTGCACCGGCGAGTGCCCCAGCCACATCGCCGGCACCAGCGGCAGCAGCCTGAGCTTCCACAGCACCGTGATCAACCACTACAGGATGAGGGGCCACAGCCCCTGGGCCAACCTGAAGAGCTGCTGCAGCCCCACCAAGCTGAGGCCCATGAGCATGCTGTACTACGACGACGGCCAGAACATCATCAAGAAGGACATCCAGAGGATGGTGGCCGAGGAGTGCGGCTGCACCTAA
表3
含组氨酸置换的本发明的肽的氨基酸序列
表4
合组氨酸置换的本发明的肽的氨基酸序列
表5
用于本发明的卵泡抑素变体的描述
肽ID 描述 构建体ID
ACTA1 pUnder中的具有His标签和GS连接序列的卵泡抑素FS315 pDR000001870
ACTA2 pUnder中的具有His标签和GS连接序列的卵泡抑素FS288 pDR000001871
ACTA3 pUnder中的具有His标签和GS连接序列的卵泡抑素FS12 pDR000001872
表6
用于本发明的卵泡抑素变体的氨基酸序列
-信号序列：MAWVWTLLFLMAAAQSIQA
-6XHis标签和GS连接序列：GSHHHHHHGSGSGS
>ACTA1_pDR000001870：SEQ ID 200
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAGSHHHHHHGSGSGSGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCNSISEDTEEEEEDEDQDYSFPISSILEW*
>ACTA2_pDR000001871：SEQ ID 201
MAWVWTLFLMAAAQSIQAGSHHHHHHGSGSGSGNCWLRQAKNGRCQVLYKTELSKEECCSTGRLSTSWTEEDVNDNTLFKWMIFNGGAPNCIPCKETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIKAKSCEDIQCTGGKKCLWDFKVGRGRCSLCDELCPDSKSDEPVCASDNATYASECAMKEAACSSGVLLEVKHSGSCN *
>ACTA3_pDR000001872：SEQ ID 202
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAGSHHHHHHGSGSGSETCENVDCGPGKKCRMNKKNKPRCVCAPDCSNITWKGPVCGLDGKTYRNECALLKARCKEQPELEVQYQGRCKKTCRDVFCPGSSTCVVDQTNNAYCVTCNRICPEPASSEQYLCGNDGVTYSSACHLRKATCLLGRSIGLAYEGKCIK*
表7
用于本发明的卵泡抑素变体的核酸序列
>ACTA1_pDR000001870：SEQ ID 203
ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATCCAAGCAGGCTCCCATCAC CATCACCACCATGGAAGCGGATCCGGGTCAGGGAACTGTTGGCTGAGGCAAGCGAAGAACGGCAGATGTCAGGTGCTGTACAAGACCGAGCTGAGTAAGGAGGAATGCTGCAGTACGGGCAGGTTGAGCACTAGCTGGACTGAAGAGGACGTCAACGACAACACGCTGTTCAAGTGGATGATCTTCAATGGCGGAGCTCCCAATTGCATCCCCTGCAAAGAGACCTGCGAAAACGTCGACTGTGGACCGGGCAAGAAATGCAGGATGAACAAGAAGAACAAGCCCAGATGCGTGTGTGCTCCAGATTGCAGCAACATCACCTGGAAAGGCCCCGTGTGTGGCCTCGATGGGAAGACCTACCGCAATGAGTGCGCCCTTCTGAAGGCACGATGCAAGGAGCAGCCAGAACTGGAGGTGCAGTACCAGGGTAGGTGCAAGAAGACCTGTAGGGACGTCTTCTGCCCTGGATCTTCCACTTGCGTGGTGGATCAGACCAACAACGCTTACTGCGTGACATGCAACCGTATCTGCCCAGAACCCGCCTCTAGCGAACAGTACCTGTGCGGTAATGACGGAGTCACCTACTCTAGTGCCTGCCACTTGAGGAAGGCCACATGTCTGCTCGGTAGGAGCATTGGTCTGGCTTACGAGGGCAAGTGCATCAAGGCCAAGTCTTGCGAGGACATACAGTGTACGGGTGGGAAGAAGTGCCTTTGGGACTTCAAAGTGGGGAGAGGGAGATGCAGTCTCTGTGACGAACTGTGTCCCGATTCCAAGTCCGATGAACCCGTGTGCGCGTCCGATAACGCGACCTATGCCTCAGAATGCGCCATGAAAGAGGCAGCCTGTTCTAGCGGAGTTCTGCTCGAGGTTAAGCACAGCGGTAGCTGCAACTCCATCTCAGAGGACACTGAGGAGGAAGAGGAAGACGAGGATCAGGACTACTCCTTTCCGATCAGCTCCATCCTTGAGTGGTAA
>ACTA2_pDR000001871：SEQ ID 204
ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATCCAAGCAGGCTCCCATCAC CATCACCACCATGGAAGCGGATCCGGGTCAGGGAACTGTTGGCTGAGGCAAGCGAAGAACGGCAGATGTCAGGTGCTGTACAAGACCGAGCTGAGTAAGGAGGAATGCTGCAGTACGGGCAGGTTGAGCACTAGCTGGACTGAAGAGGACGTCAACGACAACACGCTGTTCAAGTGGATGATCTTCAATGGCGGAGCTCCCAATTGCATCCCCTGCAAAGAGACCTGCGAAAACGTCGACTGTGGACCGGGCAAGAAATGCAGGATGAACAAGAAGAACAAGCCCAGATGCGTGTGTGCTCCAGATTGCAGCAACATCACCTGGAAAGGCCCCGTGTGTGGCCTCGATGGGAAGACCTACCGCAATGAGTGCGCCCTTCTGAAGGCACGATGCAAGGAGCAGCCAGAACTGGAGGTGCAGTACCAGGGTAGGTGCAAGAAGACCTGTAGGGACGTCTTCTGCCCTGGATCTTCCACTTGCGTGGTGGATCAGACCAACAACGCTTACTGCGTGACATGCAACCGTATCTGCCCAGAACCCGCCTCTAGCGAACAGTACCTGTGCGGTAATGACGGAGTCACCTACTCTAGTGCCTGCCACTTGAGGAAGGCCACATGTCTGCTCGGTAGGAGCATTGGTCTGGCTTACGAGGGCAAGTGCATCAAGGCCAAGTCTTGCGAGGACATACAGTGTACGGGTGGGAAGAAGTGCCTTTGGGACTTCAAAGTGGGGAGAGGGAGATGCAGTCTCTGTGACGAACTGTGTCCCGATTCCAAGTCCGATGAACCCGTGTGCGCGTCCGATAACGCGACCTATGCCTCAGAATGCGCCATGAAAGAGGCAGCCTGTTCTAGCGGAGTTCTGCTCGAGGTTAAGCACAGCGGTAGCTGCAACTAA
>ACTA3_pDR000001872：SEQ ID 205
ATGGCTTGGGTGTGGACCTTGCTATTCCTGATGGCAGCTGCCCAAAGTATCCAAGCAGGCTCCCATCAC CATCACCACCATGGAAGCGGATCCGGGTCAGAGACCTGCGAAAACGTCGACTGTGGACCGGGCAAGAAATGCAGGATGAACAAGAAGAACAAGCCCAGATGCGTGTGTGCTCCAGATTGCAGCAACATCACCTGGAAAGGCCCCGTGTGTGGCCTCGATGGGAAGACCTACCGCAATGAGTGCGCCCTTCTGAAGGCACGATGCAAGGAGCAGCCAGAACTGGAGGTGCAGTACCAGGGTAGGTGCAAGAAGACCTGTAGGGACGTCTTCTGCCCTGGATCTTCCACTTGCGTGGTGGATCAGACCAACAACGCTTACTGCGTGACATGCAACCGTATCTGCCCAGAACCCGCCTCTAGCGAACAGTACCTGTGCGGTAATGACGGAGTCACCTACTCTAGTGCCTGCCACTTGAGGAAGGCCACATGTCTGCTCGGTAGGAGCATTGGTCTGGCTTACGAGGGCAAGTGCATCAAGTAA
表8
初步筛选数据：本发明的肽对多能干细胞的分化的作用
表9
初步筛选数据子集：本发明的肽对多能干细胞的分化的作用

Claims (5)

1.一种使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的方法，所述方法包括用含有激活素A的培养基处理所述多能干细胞，持续足以使所述多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的一段时间，其中所述多能干细胞为确立的多能干细胞系，以及其中所述激活素A是ACTN4，其序列示于SEQ ID NO：5；ACTN48，其序列示于SEQ ID NO：49；ACTN11，其序列示于SEQ ID NO：12；ACTN34，其序列示于SEQ ID NO：35；ACTN29，其序列示于SEQ ID NO：30；ACTN28，其序列示于SEQ ID NO：29；ACTN31，其序列示于SEQ ID NO：32；ACTN40，其序列示于SEQ ID NO：41或ACTN16，其序列示于SEQ ID NO：17。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多能干细胞是胚胎干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中进一步修饰所述激活素A氨基酸序列，以含有至少一个能特异性结合至亲和纯化柱中的固相基质上的配体的区域。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述至少一个能特异性结合至亲和纯化柱中的固相基质上的配体的区域是金属结合位点。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述金属结合位点包含一对组氨酸残基。
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