CN111727240A - 用于制备bap或ba细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于制备BAP或BA细胞的方法，所获得的BAP或BA细胞群体和它们作为药剂的应用。

Description

用于制备BAP或BA细胞的方法

技术领域

本发明涉及用于制备BAP(褐色脂肪细胞祖细胞)或BA(褐色脂肪细胞)细胞的方法、BAP或BA细胞群体以及它们作为药剂的应用。

背景技术

在哺乳动物中，两种主要类型的脂肪细胞共存，即褐色脂肪细胞(BA)和白色脂肪细胞(WA)，两种细胞类型均参与能量平衡控制，同时具有相反的功能。白色脂肪组织(WAT)分布于整个身体并且主要参与能量储存。与WAT相反，棕色脂肪组织(BAT)专门进行能量消耗。激活的BAT消耗代谢底物并使脂肪燃烧以通过解偶连环蛋白(UCP)-1产生热。据发现这种组织在新生儿和冬眠物种中具有较大的量。在人中，BAT的量随时间降低，并且在成年人中仅可以存在少量沉积。

BA具有显著的治疗潜力；在燃烧脂肪以产生热和调节身体的恒温性方面，它们已显示出促进体重降低和调节代谢参数，如糖血。因此，临床急需BAP和/或BA的细胞来源。

发明内容

本发明涉及用于制备BAP细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在包含Wnt信号通路的激活剂的培养基中培养多潜能细胞以获得诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)，

b)在肌原性培养基中培养所述iPAM细胞，

c)可选地，在包含血清或其等价物，可选地还包含FGF2或其等价物的培养基中，进一步培养在步骤b)结束时所获得的细胞，

d)通过将在步骤b)或c)结束时所获得的细胞传代并将它们接种到培养皿中来选择BAP细胞。

本发明还涉及用于制备BA细胞的方法，所述方法优选地包括如用于获得BAP细胞的方法中所定义的步骤a)，b)，可选地步骤c)，步骤d)，并且随后包括以下步骤：

e)将所选择的BAP细胞，优选地在步骤d)结束时可获得的那些细胞在包含血清或其等价物的成脂培养基中培养，从而获得BA细胞。

在一个实施方式中，可以在进一步包含骨形态发生通路(BMP)信号通路的抑制剂和可选地DMSO的培养基中实施步骤a)。

在优选的实施方式中：

a)Wnt信号通路是典型的Wnt/β连环蛋白信号通路和/或Wnt/PCP信号通路，

b)BMP信号通路的抑制剂选自：Noggin、腱蛋白、腱蛋白样蛋白1-3、卵泡抑素、卵泡抑素样蛋白1-5、Dan家族成员及其变体和片段。

在其他实施方式中，步骤b)中使用的肌原性培养基包含培养基、血清或其等价物、BMP受体抑制剂、c-MET受体激活剂和IGF或胰岛素受体激活剂或者由其组成或基本由其组成。

在一个实施方式中，实施方法，其中步骤e)的成脂培养基包含培养基、TGFβ/活化素/NODAL通路抑制剂(优选地，SB431542)、EGF受体激活剂(优选地，EGF(表皮生长因子))、抗坏血酸和类皮质激素受体激活剂(优选地，氢化可的松)或基本由其组成。

在其他实施方式中，BA细胞或BA细胞群体的特征在于UCP1的表达。

本发明还涉及通过如本文所定义的方法可获得的BA细胞群体，所述细胞群体包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的表达UCP1的细胞。

本发明还涉及通过如本文所定义的方法可获得的BAP细胞群体，所述BAP细胞群体的特征在于所述群体转化为如本文所定义的BA群体的能力。

优选地，所述BAP或BA细胞群体用作药剂。更优选地，所述药剂用于治疗与BA或BAP细胞活性有关的疾病或病况，并且所述疾病或病况优选地为代谢疾病或病况，如肥胖症相关病变、代谢综合征、糖尿病、高脂血症、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、能量平衡(摄入相对于消耗)。

本发明还涉及如本文所定义的BAP或BA细胞群体用于筛选目的的应用。

具体实施方式

用于制备BAP细胞的方法

在第一方面，提供了用于制备BAP细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在包含Wnt信号通路的激活剂的培养基中培养多潜能细胞以获得诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)，

b)在肌原性培养基中培养所述iPAM细胞，

c)可选地，在包含血清或其等价物，还可选地包含FGF2或其等价物的培养基中，进一步培养在步骤b)结束时所获得的细胞，

d)通过将在步骤b)或c)结束时所获得的细胞传代并将它们接种到培养皿中来选择BAP细胞。

在第二方面，提供了用于制备BA细胞的方法，其中在优选的实施方式中，使用以上定义的方法制备BAP细胞(即步骤a)，步骤b)，可选的步骤c)和步骤d))，所述方法还包括以下步骤：

e)将在步骤d)结束时可获得的所选择的BAP细胞在包含血清或其等价物的成脂培养基中培养，从而获得BA细胞。

在两种方法的背景中，一种方法是指BAP或BA细胞的制备。BAP或BA细胞的表示形式可以替换为包含BAP或BA细胞的群体或者由其组成或基本由其组成的群体。随后，在本文中鉴别了BAP和BA细胞。

除非另外说明，否则当一种方法表示本发明的一种方法或所述方法时，一种方法是指用于制备BAP或者用于制备BA细胞的一种方法或所述方法。

步骤a

在本发明的方法的步骤a)中培养的细胞优选地为多潜能细胞。

如本文所使用的术语“多潜能细胞”是指哺乳动物未分化细胞，其可以产生多种不同的细胞谱系。通常，多潜能细胞可以表达以下标志物：Oct4、SOX2、Nanog、SSEA 3和4、TRA1/81，参见International Stem Cell Initiative recommendations,2007。可以如标题为“在本发明申请的上下文中适用的定义”的一般部分中所公开的评价细胞中给定标志物的表达或存在。

在一个实施方式中，多潜能细胞是哺乳动物多潜能细胞。优选地，所述多潜能细胞是人多潜能细胞。在另一个实施方式中，所述多潜能细胞是非人哺乳动物多潜能细胞。

在一个实施方式中，多潜能细胞是干细胞。优选地，所述干细胞是胚胎干细胞。作为另外一种选择，所述干细胞是成熟干细胞。在使用成熟干细胞的情况下，它表示可以从器官限制性干细胞或间质干细胞(MSC)产生BAP或BA细胞。

在另一个实施方式中，多潜能细胞是人胚胎干细胞(hES细胞)。在另一个实施方式中，所述多潜能细胞是非人哺乳动物胚胎干细胞。通常，hES细胞系(Loser等人,2010)，如下表中所述的细胞系可以用于本发明的方法：

在一个实施方式中，多潜能细胞是非人胚胎干细胞，如小鼠干细胞、啮齿类动物干细胞或灵长类动物干细胞。

在一个实施方式中，所述多潜能细胞是诱导的多潜能干细胞(iPSC)。诱导的多潜能干细胞(iPSC)是一类通过诱导某些基因的“强制”表达人工来源于非多潜能，通常成人体细胞的多潜能干细胞。iPSC于2006年首次从小鼠细胞(Takahashi and Yamanaka,2006)并且于2007年从人细胞中(Takahashi等人,2007；Yu等人,2007)中产生。

如本文所使用的，术语“Wnt信号通路”表示可以分成两种通路的信号通路：“典型的Wnt/β连环蛋白信号通路”和“Wnt/PCP信号通路”。如本文所使用的，术语“典型的Wnt/β连环蛋白信号通路”或者“Wnt/PCP信号通路”以其一般含义表示对于其在胚胎发生和癌症中的作用而熟知且参与成人动物中正常生理学过程的蛋白及其他生物活性分子(脂质、离子、糖……)的网络。“典型的Wnt/β连环蛋白信号通路”的特征在于糖原合酶激酶3β(GSK-3β)的Wnt依赖性抑制，从而导致β-连环蛋白的后续稳定，其然后移位至核以作为转录因子起作用。“Wnt/PCP信号通路”不涉及GSK-3β或者β-连环蛋白，并且包括几种信号转导分支，包括钙依赖性信号转导、平面细胞极性(PCP)分子、小GTP酶和C-Jun N末端激酶(JNK)信号转导。在诸多综述中很好地描述了这些通路，如(Clevers,2006；Montcouquiol等人,2006；Schlessinger等人,2009)。

在一个实施方式中，所述Wnt信号通路是典型的Wnt/β-连环蛋白信号通路。在另一个优选的实施方式中，所述Wnt信号通路是Wnt/PCP信号通路。在另一个优选的实施方式中，所述Wnt信号通路是典型的wnt/β-连环蛋白信号通路和Wnt/PCP信号通路。

如本文所使用的，术语“激活剂”或“Wnt信号通路的激活剂”(除非另外说明)表示提高或促进或激活Wnt信号转导活性的物质。例如，对于典型的Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路，可以使用已建立的LEF/TCF结合位点报道子的多聚体，通过Wnt报道子活性，和/或通过GSK-3β的抑制，和/或典型的Wnt靶标基因，如T、Tbx6、Msgn1或Axin2的激活来测量这种活性。因此，可以作为如以上所鉴别的Msgn1报道子活性(Chal J等人2015)的Wnt的升高来评价Wnt信号转导活性的激活。所述升高可以为至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或以上。

在一个实施方式中，根据本发明的典型的Wnt/β-连环蛋白信号通路或Wnt/PCP信号通路的激活剂是来源于脊椎动物种或改良种的R-脊椎蛋白家族成员。

在一个实施方式中，R-脊椎蛋白家族成员是哺乳动物R-脊椎蛋白家族成员。在具体的实施方式中，根据本发明的R-脊椎蛋白家族成员选自R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3和R-脊椎蛋白4。在具体的实施方式中，根据本发明的R-脊椎蛋白家族成员是R-脊椎蛋白3。在具体的实施方式中，根据本发明的R-脊椎蛋白家族成员是R-脊椎蛋白2。

脊椎动物重组R-脊椎蛋白可以是商购的，或者作为条件培养基产生的。这包括含有R-脊椎蛋白的编码序列的构建体向感受态细胞，如COS细胞的表达。在培养基中分泌R-脊椎蛋白。条件培养基可以直接应用于多潜能细胞或在基础培养基中预先稀释。

如本文所使用的，术语“R-脊椎蛋白3”或“R-脊椎蛋白2”是指脊椎动物中所分泌的激活Wnt信号通路的蛋白家族成员。人R-脊椎蛋白3蛋白的示例性序列以登录号NP_116173.2(SEQ ID NO:1)保存在数据库中。小鼠R-脊椎蛋白3蛋白的示例性序列以登录号NP_082627.3(SEQ ID NO:2)保存在数据库中。人R-脊椎蛋白2蛋白的示例性序列以登录号NP_848660.3(SEQ ID NO:3)保存在数据库中。小鼠R-脊椎蛋白2蛋白的示例性序列以登录号NP_766403.1(SEQ ID NO:4)保存在数据库中。

如本文所使用的，术语“R-脊椎蛋白3”还涵盖了R-脊椎蛋白3野生型(天然存在的)蛋白的任何功能变体，只要这些功能变体保留了出于本发明的目的的有利的分化因子性质。在一个实施方式中，所述功能变体是与最密切相关的已知的天然R-脊椎蛋白3多肽序列，例如，对SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2分别所示的人或小鼠多肽R-脊椎蛋白3具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性并且保留了与相关野生型蛋白基本相同的Wnt激活活性的R-脊椎蛋白3的功能同源物。在另一个实施方式中，所述功能变体是(例如)包含了野生型R-脊椎蛋白3蛋白的至少50、100或200个连续氨基酸并且保留了基本相同的Wnt激活活性的R-脊椎蛋白3片段。在另一个实施方式中，这种功能变体可以作为R-脊椎蛋白3基因产物同工型，如以ref.Q9BXY4-2和CAI20142.1(SEQ ID NO:5)所述的人R-脊椎蛋白3的同工型2存在。在上下文中，“基本地”优选地表示这种功能变体的活性是它所来源的野生型或天然存在的分子的活性的至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在上下文中，它所来源的野生型或天然存在的分子的活性优选地是指激活Wnt信号通路的活性。

如本文所使用的，术语“R-脊椎蛋白2”还涵盖了R-脊椎蛋白2野生型(天然存在的)蛋白的任何功能变体，只要这些功能变体保留了出于本发明的目的的有利的分化因子性质。在一个实施方式中，所述功能变体是与最密切相关的已知的天然R-脊椎蛋白2多肽序列，例如，对SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4分别所示的人或小鼠多肽R-脊椎蛋白2具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性并且保留了与相关野生型蛋白基本相同的Wnt激活活性的R-脊椎蛋白2的功能同源物。在另一个实施方式中，所述功能变体是(例如)包含了野生型R-脊椎蛋白2蛋白的至少50、100或200个连续氨基酸并且保留了基本相同的Wnt激活活性的R-脊椎蛋白2片段。在另一个实施方式中，所述功能变体可以作为R-脊椎蛋白2基因产物同工型，如人R-脊椎蛋白2的同工型2或同工型3，如分别以ref.Q6UXX9-2(SEQ ID NO:6)或者以ref.Q6UXX9-3(SEQ ID NO:7)所述的存在。

在一个实施方式中，在本发明的方法的步骤a)中使用的激活剂是R-脊椎蛋白3和R-脊椎蛋白2的组合。在一个实施方式中，在本发明的方法的步骤a)中使用的激活剂可以是序列SEQ ID NO:5所示的人R-脊椎蛋白-3同工型2。在一个实施方式中，在本发明的方法的步骤a)中使用的激活剂可以是序列SEQ ID NO:6所示的人R-脊椎蛋白-2同工型2，或者序列SEQ ID NO:7所示的人R-脊椎蛋白-2同工型3。

在另一个实施方式中，将单独或与R-脊椎蛋白组合向细胞环境中直接引入适当的量的药理学GSK-3β抑制剂，例如，化合物CHIR99021或其等价物用作提高系统中Wnt信号通路的活性的替代。CHIR99201的等价物是Huang等人2017中所述的CHIR98014。

如本文所使用的，用于“糖原合酶激酶3β”的术语“GSK-3β”表示介导磷酸酯分子在特定细胞底物上的某些丝氨酸和苏氨酸氨基酸上的添加的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在本领域中熟知GSK-3β的抑制剂可以激活Wnt信号通路，参见，例如(Cohen and Goedert,2004；Sato等人,2004；Taelman等人,2010；Wu and Pan,2010)。

在优选的实施方式中，GSK-3β的抑制剂是CHIR99021或其等价物。

如本文所使用的术语“诱导的轴旁中胚层祖细胞”或“iPAM”是指来源于任何细胞类型，但是显示出轴旁中胚层祖细胞的特征的细胞。在一个实施方式中，iPAM细胞的特征在于以下性质：

a)它们表达轴旁中胚层祖细胞的生物标志物特征，如Tbx6、肝配蛋白A1、肝配蛋白B2、EPHA4、PDGFRα、Sall1、Sall4、Dll1、Dll3、Papc(Pcdh8)、Lfng、Hes7、Ripply1、Ripply2、Brachyury(T)、Cdx2、Cdx4、Evx1、Cxcr4、Ill7rd、Fgf8、Fgf17、Gbx2、Wnt3a、Wnt5b、Rspo3、SP5、SP8、Has2、Dkk1、Dact1、Pax3、Pax7、Mesp1、Mesp2或者Msgn1基因。优先地，例如，用包含Msgn1启动子的基因报道子测定测量Msgn1基因(Chal J等人2015)，和；

b)它们是多能细胞，能够分化成至少骨胳、皮肤或肌细胞谱系；

c)可选地，它们可以具有长期的自更新性质，例如，它们可以保持培养超过6个月。

可以(例如)通过使用(例如)WO 2013/030243中所定义的规程，体外分化为骨胳、皮肤或肌细胞谱系，体外测试所述诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的多潜能性。在本发明中，我们证明这些iPAM细胞可以分化为BAP和BA细胞。

如本文所使用的，术语“多能”是指基于环境和培养条件，可以分化为不止一种细胞谱系的细胞。与多潜能且可以分化为所有类型的体细胞谱系的诱导和胚胎干细胞相反，本发明的诱导的轴旁中胚层祖细胞具有有限的分化能力。

在一个实施方式中，在步骤a)中用于多潜能细胞的培养的R-脊椎蛋白3的浓度为0.1ng/mL至500ng/mL，优选地1ng/mL至500ng/mL并且更优选地5ng/mL至30ng/mL。

在一个实施方式中，在步骤a)中用于多潜能细胞的培养的R-脊椎蛋白3的浓度为1ng/mL至500ng/mL，优选地5ng/mL至30ng/mL。在一个实施方式中，R-脊椎蛋白3或R-脊椎蛋白2的浓度为约10ng/ml或者为10ng/ml。使用10ng/ml的浓度时，诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)中超过50％多至70％的多潜能细胞分化。

在一个实施方式中，将多潜能细胞与R-脊椎蛋白3或R-脊椎蛋白2在1至15天期间内培养，或者培养较短的时间。在具体的实施方式中，将多潜能细胞以10ng/ml的浓度与R-脊椎蛋白3或/和R-脊椎蛋白2培养至少10天。

在一个实施方式中，CHIR99021的浓度为1至5mM，或者2至4mM或者3mM。

在优选的实施方式中，步骤a)的培养基还包含骨形态发生蛋白(BMP)信号通路的抑制剂和可选地DMSO。

如本文所使用的，术语“BMP信号通路的抑制剂”(除非另外说明，否则也称为“抑制剂”)表示任何天然或合成化合物，其导致BMP(骨形态发生蛋白)信号通路的激活作用降低，其的特征在于二聚体BMP蛋白与由BMP I型和II型受体所组成的杂合物的结合，其导致磷酸化作用级联，从而导致Smad1/5/8的磷酸化并且导致靶标基因，如Id基因的激活。通常，BMP信号通路的抑制剂引起蛋白Smad 1、5和8的磷酸化水平降低(Gazzero and Minetti,2007)。

本领域的技术人员知道如何评价给定化合物是否是BMP信号通路的抑制剂。通常，如果在存在所述化合物的情况下培养细胞之后，与在不存在所述化合物的情况下培养的细胞相比，磷酸化Smad 1、5或8的水平降低，则认为该化合物是BMP信号通路的抑制剂。可以使用对所述Smad蛋白的磷酸化形式特异的抗体，通过免疫印迹测量磷酸化Smad蛋白的水平。所述降低可以是至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或者100％或以上。

通常，可以通过实时定量PCR(qRT-PCR)，通过直接Id1/2/3转录本(mRNA)的产生来测量靶标基因，如Id基因的激活，并且表达水平可以与在不存在所述化合物的情况下的对照情况相比较。

BMP信号通路的抑制剂可以是BMP拮抗剂(它是阻断BMP I型和/或II型受体活性的化合物(BMP I/II型受体抑制剂))、BMP I型和/或II型基因表达的抑制剂或者抑制BMP信号通路任何下游步骤的分子。BMP信号转导的抑制剂可以是天然或合成化合物。当BMP信号通路的抑制剂是蛋白时，它可以是纯化的蛋白或者重组蛋白或者合成蛋白。

在一个实施方式中，BMP信号通路的抑制剂是BMP I型受体抑制剂。

用于产生重组蛋白的多种方法在本领域中是已知的。技术人员可以容易地根据对给定蛋白序列或者编码所述蛋白的核苷酸序列的认识，使用标准分子生物学和生物化学技术产生所述蛋白。

在本发明的一个实施方式中，BMP信号通路的抑制剂选自Noggin、腱蛋白和相关蛋白质(腱蛋白样蛋白1/2/3)、卵泡抑素和相关蛋白质(卵泡抑素样蛋白1/2/3/4/5)、Dan家族蛋白(包括Cerberus1、Gremlin 1和2、Cerl-2(Coco)、SOST(骨硬化蛋白)、SOSTDC1(Wise)及其抑制BMP信号通路的变体和片段。

在本发明的另一个实施方式中，BMP信号通路的抑制剂选自BMP-1/Tolloid样蛋白、TWSG1(扭转原肠胚形成)、TMEFF(脑肿瘤抑癌蛋白)、双糖链蛋白聚糖(Biglycan)、TSK(Tsukushi)、BMPER(Crossveinless 2)、Ogon(Sizzled)、AMN(无羊膜蛋白)、CTGF(结缔组织生长因子)和HSPG(包括磷脂酰肌醇聚糖3和多配体聚糖4)。

在另一个实施方式中，所述BMP信号通路的抑制剂是Noggin。Noggin可以是哺乳动物Noggin，优选地鼠科Noggin(通过GenPept登录号NP_032737，SEQ ID NO:10举例说明的小鼠Noggin)或者人Noggin(通过GenPept登录号EAW94528，SEQ ID NO:11举例说明的人Noggin)。它可以是纯化的或重组的。它可以处于单体或二聚体形式。

在一个实施方式中，BMP信号通路的抑制剂是抑制BMP信号转导级联的化合物。在一个实施方式中，抑制BMP信号转导级联的化合物是合成或化学化合物。

在另一个实施方式中，BMP信号通路的抑制剂是BMP I型受体抑制剂。如本文所使用的，用于“骨形态发生蛋白”的术语“BMP I型受体”表示具有介导磷酸酯分子在特定细胞底物上的某些丝氨酸和苏氨酸氨基酸上的添加的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白。在本领域中熟知BMP I型受体抑制剂可以阻断BMP信号通路，参见，例如，Yu BP等人,2008。在优选的实施方式中，BMP I型受体抑制剂是Dorsomorphin，它是通过结构-活性研究所产生的化合物或任何衍生物[Cuny GD等人,2008]。Dorsomorphin(6-[4-(2-哌啶-1-基-乙氧基)苯基]-3-吡啶-4-基-吡唑并[1,5-a]嘧啶，也称为化合物C)特异性抑制BMP I型受体(ALK2、3和6)[Yu PB等人,2008]。优选的抑制剂或BMP受体是LDN193189。LDN193189是BMPI型受体Alk2和Alk3的抑制剂。

重组Noggin可以购自R&D Systems或者Peprotech或者可以使用如上所述的标准技术产生。

通常，将BMP信号通路的抑制剂以1至10000ng/mL，优选地5至1000ng/mL，优选地5至500ng/mL，优选地10至200ng/mL的范围内的浓度，更优选地约200ng/mL的浓度加入本发明的方法的步骤a)的培养基中。

通常，将Noggin以1至1000ng/mL，优选地10至200ng/mL的范围内的浓度，更优选地以约200ng/mL或200ng/mL的浓度加入本发明的方法的步骤a)的培养基中。

通常，将Dorsomorphin以0.1至2μM的范围内的浓度，优选地以1μM的浓度加入本发明的方法的步骤a)的培养基中。

LDN193189的浓度可以为300至600nM或者400至500nM或者约500nM，或者500nM。

在一个实施方式中，将多潜能细胞与BMP信号通路的抑制剂培养1至4天。

在一个实施方式中，步骤a)的培养基包含根据本发明的Wnt激活剂和BMP信号通路的抑制剂以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在一个实施方式中，所述方法使得：

a)Wnt信号通路是典型的Wnt/β连环蛋白信号通路和/或Wnt/PCP信号通路，

b)BMP信号通路的抑制剂选自：Noggin、腱蛋白、腱蛋白样蛋白1-3、卵泡抑素、卵泡抑素样蛋白1-5、Dan家族成员及其变体和片段。

在一个实施方式中，Wnt激活剂是R-脊椎蛋白3并且BMP信号通路的抑制剂是Noggin。

在另一个实施方式中，在步骤a)中使用的培养基还可以包含DMSO(二甲基亚砜)或者DMSO的等价物以进一步改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。如本文所使用的，术语“等价物”是指显示出与作为溶解极性和非极性化合物两者的溶剂的DMSO相同的性质的物质。

在一个实施方式中，步骤a)中使用的培养基包含R-脊椎蛋白3、Noggin和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个实施方式中，步骤a)中使用的培养基包含R-脊椎蛋白3和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个实施方式中，步骤a)中使用的培养基包含R-脊椎蛋白2、Noggin和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个实施方式中，步骤a)中使用的培养基包含R-脊椎蛋白2和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个实施方式中，步骤a)中使用的培养基包含R-脊椎蛋白3、Dorsomorphin和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个实施方式中，步骤a)中使用的培养基包含R-脊椎蛋白2、Dorsomorphin和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个实施方式中，步骤a)中使用的培养基包含R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白2、Noggin和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个实施方式中，步骤a)中使用的培养基包含R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白2和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个实施方式中，步骤a)中使用的培养基包含R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白2、Dorsomorphin和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个优选的实施方式中，可以将以下替代用于提高所述系统中R-脊椎蛋白因子的活性：

1.提高编码所述R-脊椎蛋白因子或者R-脊椎蛋白的修饰形式的基因的内源表达，

2.通过将包含可操作性地连接至控制序列的R-脊椎蛋白因子的编码序列的表达载体引入待分化的多潜能细胞，或者通过在所述细胞中引入R-脊椎蛋白因子的编码RNA，使所述R-脊椎蛋白因子异位表达

3.在培养基或条件培养基中，或者作为底物涂层，将适当的量的R-脊椎蛋白因子，例如，作为重组R-脊椎蛋白因子(R-脊椎蛋白1、2、3和4家族)直接引入细胞环境。

4.激活或抑制参与所述靶细胞中R-脊椎蛋白因子信号转导的基因的内源表达；或者，

5.在所述靶细胞中，使参与控制R-脊椎蛋白因子表达水平、成熟和整体控制的蛋白过表达。

在一个实施方式中，步骤a)的培养基包含CHIR99021和根据本发明的BMP信号通路的抑制剂(所述抑制剂是Dorsomorphin)以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在一个实施方式中，步骤a)的培养基包含CHIR99021、Dorsomorphin和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在一个实施方式中，步骤a)的培养基包含Wnt激活剂(所述激活剂是R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3和CHIR99021的组合)；和BMP信号转导的抑制剂(所述抑制剂是Noggin和Dorsomorphin的组合)以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个实施方式中，步骤a)的培养基包含R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白2、CHIR99021、Dorsomorphin和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个实施方式中，步骤a)的培养基包含R-脊椎蛋白3、R-脊椎蛋白2、CHIR99021、Noggin和DMSO以改善多潜能细胞向诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)的分化。

在另一个实施方式中，步骤a)的培养基包含CHIR99021和LDN-193189或者由其组成或基本由其组成。甚至在另一个实施方式中，步骤a)的培养基包含CHIR99021(3μM)和LDN-193189(500nM)或者由其组成或者基本由其组成。

在优选的实施方式中，所述激活剂是R-脊椎蛋白家族成员。

在另一个实施方式中，所述激活剂选自R-脊椎蛋白1、R-脊椎蛋白2、R-脊椎蛋白3和R-脊椎蛋白4。

在另一个优选的实施方式中，所述激活剂是R-脊椎蛋白2或者R-脊椎蛋白3。

在另一个优选的实施方式中，所述激活剂是GSK-3β的抑制剂，如CHIR99021。

在另一个实施方式中，根据本发明的抑制剂是分泌的BMP/TGFβ家族的拮抗剂。

在另一个实施方式中，所述BMP信号通路的抑制剂选自Noggin、腱蛋白、腱蛋白样蛋白1/2/3、卵泡抑素、卵泡抑素样蛋白1/2/3/4/5、Dan家族成员，包括Cerberus 1、Gremlin1/2。

在另一个优选的实施方式中，所述抑制剂是Noggin或卵泡抑素。

在另一个优选的实施方式中，所述抑制剂是BMP信号转导的化学抑制剂，如Dorsomorphin。

步骤a)的持续时间不是至关重要的，只要已获得了适当的量的iPAM细胞或iPAM细胞群体。基于BMP抑制剂的存在和DMSO的存在，所述持续时间也可以是不同的。通常，步骤a)的持续时间可以在3至12天或者4至11天或者5至10天或者6至9天的范围内，或者可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天。

在一个实施方式中，使用胰蛋白酶将多潜能细胞，优选地iPS，更优选地hiPS细胞解离为单细胞，并以3.10⁴至9.10⁴个细胞/cm²的范围内的密度接种。优选的密度为5.5.10⁴个细胞/cm²。可以在基质胶涂覆的培养皿中，在补充有Rock-1抑制剂(10μM)的mTESR-1培养基中进行培养。一天后，将培养基更换为无Rock-1抑制剂的新鲜mTESR-1。从第3天开始，培养基(优选地补充有ITS(1％)的DMEM)可以补充FGF-2(20ng/mL)。所述培养基可以每天更新直至第6天。

轴旁中胚层祖细胞的唯一特异性标志物是Msgn1(Yoon JK等人2015)。可以如标题为在本发明申请的上下文中适用的定义的部分中所解释的，评价Msgn1的表达。

如本文所使用的，Msgn1基因是指编码间生蛋白1的基因。在本发明的背景内，Msgn1基因是指编码Msgn1的哺乳动物基因，优选地鼠科或人基因。分别以SEQ ID NO:8(NM_019544.1)和SEQ ID NO:9(NM_001105569.1)提供小鼠和人中编码间生蛋白1的基因的核苷酸序列的实例。

在一个实施方式中，当表达在基因表达的定量测定中是可检测的时，认为Msgn1是表达的。在另一个实施方式中，当表达水平显著高于原始多潜能细胞中或者非特异性条件，如对于小鼠多潜能细胞无LIF(白血病抑制因子)或者对于人多潜能细胞无FGF(成纤维细胞生长因子)的基础培养基下的分化细胞中所观察到的表达水平时，认为Msgn1是表达的。可以使用组成型表达基因，如GAPDH或β肌动蛋白归一化对照和测试细胞之间的表达水平。

轴旁中胚层祖细胞的其他生物标志物特征无限制地包括以下蛋白中的一种或多种：Tbx6、肝配蛋白A1、肝配蛋白B2、EPHA4、PDGFRα、Sall1、Sall4、Dll1、Dll3、Papc(Pcdh8)、Lfng、Hes7、Ripply1、Ripply2、Brachyury(T)、Cdx2、Cdx4、Evx1、Cxcr4、Ill7rd、Fgf8、Fgf17、Gbx2、Wnt3a、Wnt5b、Rspo3、SP5、SP8、Has2、Dkk1、Dact1、Pax3、Pax7、Mesp1、Mesp2。

这些iPAM群体通常可以包含除iPAM细胞之外的其他细胞类型。在一个实施方式中，在步骤a)结束时所获得的群体的特征在于它们包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％并且优选地至少90％的表达iPAM细胞的至少一种生物标志物特征(例如，Msgn1)的细胞。优选地，如标题为在本发明申请的背景中适用的定义的部分中所解释的，实施所述标志物的存在或表达的评价。

可以在适当的生长条件下无限培养包含iPAM细胞的群体。

可以纯化所述iPAM细胞，或者可以通过选择表达对iPAM细胞特异的标志物的细胞来富集iPAM细胞群体。在一个实施方式中，用于iPAM细胞群体纯化或富集的对iPAM细胞特异的标志物可以是Msgn1。

可以使用细胞分选技术，如荧光激活细胞分选术(FACS)或者包含所述iPAM细胞的细胞表面标志物的特异性结合剂的磁珠，或者iPAM标志物的荧光报道子来实现iPAM细胞的纯化或富集。

在纯化或富集后，所述群体因此可以包含大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或者大于95％的表达iPAM细胞的生物标志物特征，例如，Msgn1的细胞。

步骤b

随后，在肌原性培养基中培养在步骤a)结束时获得的iPAM细胞或者包含iPAM细胞的群体。如上所指出的，在步骤a)结束时获得的细胞可以首先对iPAM细胞的存在进行进一步富集或纯化。

如本文所使用的肌原性培养基是有利于、刺激、诱导肌细胞祖细胞和/或肌细胞的产生的培养基。肌细胞的祖细胞的标志物可以是Pax7(Zammit,等人2006)。早期肌细胞的标志物可以是肌间线蛋白或肌细胞生成素(Paulin等人2004，Buckingham等人2014)。成熟肌细胞的标志物可以是α辅肌动蛋白(Beggs等人,1992)。可以如标题为在本发明申请的上下文中适用的定义的部分中所解释的，评价这些标志物中的每一个的表达。

肌原性培养基可以包含培养基、血清或其等价物(优选地，KSR)、BMP受体抑制剂、c-MET受体激活剂和IGF或胰岛素受体激活剂或者由其组成或基本由其组成。

在本发明申请的上下文中的培养基是适合于培养哺乳动物细胞的培养基。适合的培养基是技术人员已知的，并且包括DMEM、RPMI 1640、MEM、Ham's F12、IMDM、Leibovitz培养基Medium 199。优选的培养基是DMEM。

血清可以是牛血清。优选的牛血清是胎牛血清。在另一个优选的实施方式中，血清的等价物是如Chal等人,2015中所述的KSR(Knockout血清替代物)。优选的抑制剂或BMP受体是LDN193189。LDN193189是BMPI型受体Alk2和Alk3的抑制剂。优选的c-MET受体的激活剂是HGF(肝细胞生长因子)。优选的IGF或胰岛素受体的激活剂是IGF-1(胰岛素生长因子-1)。

在第一实施方式中，肌原性培养基包含培养基、血清或其等价物(优选地KSR)、BMP受体抑制剂(优选地LDN193189)、c-MET受体激活剂(优选地HGF)和IGF或胰岛素受体激活剂(优选地IGF1)或者由其组成或基本由其组成。该第一实施方式中的优选的肌原性培养基包含培养基、KSR、LDN193189HGF和IGF-1或者由其组成或基本由其组成。

在第二实施方式中，肌原性培养基包含培养基、血清或其等价物(优选地KSR)、c-MET受体激活剂(优选地HGF)和IGF或胰岛素受体激活剂(优选地IGF1)或者由其组成或基本由其组成。该第二实施方式中的优选的肌原性培养基包含培养基、KSR、HGF和IGF-1。

在第三实施方式中，肌原性培养基包含培养基、血清或其等价物(优选地KSR)和IGF或胰岛素受体激活剂(优选地IGF1)或者由其组成或基本由其组成。该第三实施方式中的优选的肌原性培养基包含培养基、KSR和IGF-1。

在优选的步骤b)中，首先使用第一实施方式的肌原性培养基，随后是第三实施方式的肌原性培养基，然后是第二实施方式的肌原性培养基。第一实施方式的肌原性培养基中的培养可以具有1至3天或者2天的持续时间。第三实施方式的肌原性培养基中的培养可以具有3至6天或者4至5天或者4天的持续时间。第二实施方式的肌原性培养基中的培养可以具有8至12天或者9至11天或者10天的持续时间。

在优选的方法中，使用包含培养基、KSR、LDN193189、HGF和IGF-1或者由其组成或基本由其组成的肌原性培养基进行步骤b)。

优选以下浓度：5至10％的牛血清或者胎牛血清，8至20％或10至18％或12至16％或13至16％或14至16％或15％的KSR。LDN193189的优选浓度为300至600nM或者400至500nM或者约500nM，或者500nM。HGF的浓度可以为8至12ng/mL或者9至11ng/mL或者约10ng/mL或者10ng/mL。IGF-1的浓度可以为0.8至4ng/ml或者1至3ng/mL或者1.5至2.5ng/ml或者约2ng/ml或者2ng/mL。

该第一实施方式中优选的肌原性培养基包含培养基、KSR(15％)、LDN193189(500nM)、HGF(10ng/ml)和IGF-1(2ng/mL)或者由其组成或基本由其组成。

步骤b)的持续时间不是至关重要的。所述持续时间还可以基于步骤b)开始时所使用的iPAM细胞的数目和/或存在于肌原性培养基中的组分的成分而不同。通常，步骤b)的持续时间可以在2至18天，3至18天或者4至17天或者5至16天或者6至16天的范围内。

步骤c)

该步骤是可选的。该步骤包括在包含血清或其等价物并且进一步可选地包含FGF2(成纤维细胞生长因子2)或其等价物的培养基中培养在步骤b)结束时所获得的细胞或细胞群体。FGF2(成纤维细胞生长因子2)与bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)相同。该步骤旨在提高所存在的BAP细胞的数目或者富集BAP细胞的数目，因为不再存在引发细胞向肌肉通路分化的肌原性培养基。

血清可以是牛血清，优选地胎牛血清。血清可以以5至10％，优选地10％存在。血清等价物是KSR。

可选地，在步骤中c)中，可以存在FGF2或其等价物。这意味着可以在不存在FGF2的情况下实施步骤c)。

FGF2的浓度可以为3至7ng/mL或者4至6ng/mL或者约5ng/mL或者5ng/mL。KSR的浓度可以如步骤b)中。

步骤c)的持续时间不是至关重要的。所述持续时间还可以基于步骤c)开始时所使用的肌原性细胞的数目和/或存在于步骤b)的肌原性培养基中的组分的成分和/或步骤b)的持续时间而不同。通常，步骤c)的持续时间可以在3至15天，或者4至15天，或者5至15天，或者6至15天，或者3至12天，或者4至11天，或者5至10天，或者3至9天，或者4至8天，或者5至7天或者6天的范围内。

可以每2天更新培养基。

步骤d)

在步骤d)中，通过将所述细胞或所述细胞群体传代并将其接种至培养皿中，将在步骤b)或c)结束时获得的细胞或细胞群体进一步培养。用于在组织培养级板上接种所述细胞的密度可以在3.10⁴至9.10⁴个细胞/cm²的范围内，优选地所述细胞密度为5.10⁴个细胞/cm²。

在步骤b)或c)结束时获得的细胞或细胞群体可以已包含一些BAP细胞。步骤d)旨在进一步富集和扩增它们。步骤d)的培养基可以不包含任何特异性分化的驱动剂。步骤d)的培养基可以包含培养基，如已在本文中所列的那些或者由其组成或基本由其组成。DMEM是优选的，因为它促进或有利于细胞增殖。例如，在步骤d)的培养基中可以不存在诱导肌原性或成脂分化的化合物。通常，该培养基可以包含DMEM、葡萄糖、血清或其等价物和FGF2或其等价物。在一个实施方式中，牛血清存在于所述培养基中。在一个实施方式中，胎牛血清存在于所述培养基中。在一个实施方式中，KSR用作血清的等价物。在一个实施方式中，5至10％的牛血清或胎牛血清存在于所述培养基中。KSR的浓度可以是如对于步骤b)所定义的那些。在一个实施方式中，3至8ng/mL或者4至7或者4至6或者5ng/mL FGF2存在于所述培养基中。在一个实施方式中，葡萄糖以0.5至6g/L或者0.8至5g/L或者1至4.5g/l存在。优选地，葡萄糖以1g/L存在。

可以通过评价所得细胞群体的均一性来监测步骤d)中BAP细胞的富集和扩增。可以结合细胞形态、细胞增殖能力和/或给定标志物的表达来评价均一性。均一的细胞群体的优选形态是显示为纺锤形的成纤维细胞样形态。可以在显微镜下观察形态。

另外，在优选的实施方式中，均一的细胞群体在24至72小时内高度增殖，直至达到90-100％汇合。通常，汇合的细胞或者将要汇合的细胞(90-100％汇合)以50000个细胞/cm²的密度接种到培养皿中。在优选的实施方式中，当在24至72小时内达到汇合时，据称细胞群体是均一且高度增殖的。

步骤d)的持续时间不是至关重要的。所述持续时间还可以基于步骤c)开始时所使用的细胞的数目和/或存在于肌原性培养基中的组分的成分而不同。步骤d)期间的代数可以在2至10，3至9或者至少2、3、4、5、6、7、8、9、10代或者至多3、4、5、6、7、8、9、10代的范围内。在优选的实施方式中，代数为4至9，更优选地至少4或4代。通常，每代具有2至3天的持续时间。通常，步骤d)的持续时间可以在3至27天或者4至26天或者5至25天或者8至12天的范围内。基于所接种的初始细胞的数目，持续时间可以是正确的。

步骤d)旨在通过将在步骤b)或c)结束时所获得的细胞传代并将它们接种到培养皿中来扩增和富集BAP细胞。在本文中，随后定义了BAP细胞或BAP细胞群体。

在另一方面，本发明还涉及制备BA细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

优选地，如上定义的步骤a)，步骤b)，可选的步骤c)和步骤d)，并且进一步包括以下步骤：

e)将所选择的BAP细胞，优选地在步骤d)结束时可获得的那些细胞在包含血清或其等价物的成脂培养基中培养，从而获得BA细胞。

步骤e)

将优选地在步骤d)结束时获得或可获得的细胞，或者优选地在步骤d)结束时获得或可获得的细胞群体进一步在成脂培养基中培养以获得BA或BA细胞群体

如本文所使用的成脂培养基是有利于、刺激、诱导BA细胞产生的培养基。BA细胞代表专一的脂肪细胞亚群。不是BA细胞的一些脂肪细胞还可以存在于步骤e)结束时。BA细胞的特征在于UCP1的表达。脂肪细胞的特征在于FABP4的表达。可以如标题为在本发明申请的背景中适用的定义的描述部分中所定义的评价UCP1和FABP4的表达。

在一个实施方式中，实施方法，其中步骤e)的成脂培养基包含培养基、TGFβ/活化素/NODAL通路抑制剂(优选地，SB431542)、EGF(表皮生长因子)受体激活剂(优选地，EGF)、抗坏血酸和类皮质激素受体激活剂(优选地，氢化可的松)或基本由其组成。可以将吲哚美辛加入本文中所定义的任何成脂培养基。这是在该培养基中常用的分子。在优选的实施方式中，实施方法，其中步骤e)的成脂培养基包含培养基、SB431542、EGF、抗坏血酸和氢化可的松或基本由其组成。

在第一实施方式中，成脂培养基(adipogenic culture medium)可以包含培养基、TGF-β/活化素/NODAL通路抑制剂(优选地SB431542)、EGF(表皮生长因子)受体激活剂(优选地EGF)、PPARγ激活剂(优选地罗格列酮)、胰岛素、T3激素、抗坏血酸、类皮质激素受体激活剂(即，优选地氢化可的松和地塞米松)以及环AMP和环AMP磷酸二酯酶的非特异性抑制剂(优选地IBMX)，可以由其组成或者可以基本由其组成。在第一优选实施方式中，所述成脂培养基包含培养基、SB431542、EGF、罗格列酮、胰岛素、T3激素、抗坏血酸、氢化可的松、地塞米松和IBMX或者由其组成或基本由其组成。

在第二实施方式中，成脂培养基可以包含培养基、TGF-β/活化素/NODAL通路抑制剂(优选地SB431542)、EGF(表皮生长因子)受体激活剂(优选地EGF)、PPARγ激活剂(优选地罗格列酮)、胰岛素、T3激素、抗坏血酸和类皮质激素受体激活剂(优选地糖皮质激素，更优选地氢化可的松)，可以由其组成或者可以基本由其组成。在第二优选实施方式中，第二实施方式所述的成脂培养基包含培养基、SB431542、EGF、罗格列酮、胰岛素、T3激素、抗坏血酸和氢化可的松或者由其组成或基本由其组成。

在本发明的上下文中，TGF-β/活化素/NODAL通路抑制剂优选地为抑制ALK5、ALK4和ALK7，但是优选地不抑制BMP I型受体ALK2、ALK3和ALK6的化合物。这种优选的化合物是来自生产商：Stemcell technologies的SB431542。

在本发明的上下文中，PPARγ激活剂可以是来自噻唑烷二酮类的抗-糖尿病药物并且优选地为罗格列酮(生产商Prestwick)。如技术人员已知的，噻唑烷二酮类化合物通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)类胞内受体，具体地PPARγ起作用。

在本发明的上下文内，类皮质激素受体包括糖皮质激素受体和盐皮质激素受体。优选的类皮质激素受体的激活剂包括糖皮质激素，更优选地氢化可的松。

优选的EGF受体激活剂是EGF，更优选地人EGF。通过SEQ ID NO:12表示人EGF。在一个实施方式中，可以使用hEGR的功能变体。功能变体是与人EGF SEQ ID NO:12具有至少60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性并且保留了与相关野生型人EGF基本相同的EGF受体激活活性的人EGF的功能同源物。在上下文中，基本相同的激活活性可以表示至少50％、60％、70％、80％、90％或100％。

在本发明的上下文内，第一和第二实施方式的成脂培养基包含培养基，如DMEM(达尔伯克氏改良伊格尔培养基，Gibco)和血清或血清等价物。优选地，所存在的血清是牛血清，更优选地胎牛血清。更优选地，5至10％的牛血清，并且最优选地10％。更优选地，5至10％的胎牛血清，并且最优选地10％的胎牛血清。在一个实施方式中，如果不存在血清，则可以使用KSR替换它。已在本文中定义了优选的KSR浓度。

在步骤e)的优选实施方式中，首先将细胞在第一实施方式的成脂培养基中培养，然后在第二实施方式的成脂培养基中培养。通常，第一成脂培养基中的培养可以具有2至15天或者3至14天或者4至13天或者2至10天或者2至8天或者3天的持续时间。在一个实施方式中，所述持续时间是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天。

优选以下浓度：2至8μM或者3至7μM或者4至6μM或者约5μM或者5μM的SB431542。优选的抗坏血酸浓度为10至50μg/ml或者12.5至40μg/ml或者15至30μg/ml或者约25.5μg/ml或者25.5μg/ml。EGF的浓度可以为8至12ng/mL或者9至11ng/mL或者约10ng/mL或者10ng/mL。氢化可的松的浓度可以为1至7μg/ml或者2至6μg/ml或者3至5μg/ml或者约4μg/ml或者4μg/ml。罗格列酮的浓度可以为0.5μM至2μM，或者0.75至1.5μM或者0.9至1.2μM或者1μM。胰岛素的浓度可以为2至15μg/ml或者5至12.5μg/ml或者8至11μg/ml或者10μg/ml。T3激素的浓度可以在100至300pM或者150至250pM或者200pM的范围内。地塞米松的浓度可以在0.5μM至2μM，或者0.75至1.5μM或者0.9至1.2μM或者1μM的范围内。IBMX的浓度可以在300至700μM或者400至600μM或者500μM的范围内。

优选地，第一优选实施方式的成脂培养基包含培养基、SB431542(5mM)、EGF(10ng/ml)、罗格列酮(1mM)、胰岛素(10mg/ml)、T3激素(0.2nM)、抗坏血酸(25.5mg/ml)、氢化可的松(4mg/ml)、地塞米松(1mM)和IBMX(500mM)或者由其组成或基本由其组成。

优选地，第二优选实施方式的成脂培养基包含培养基、SB431542(5mM)、EGF(10ng/ml)、罗格列酮(1mM)、胰岛素(10mg/ml)、T3激素(0.2nM)、抗坏血酸(25.5mg/ml)和氢化可的松(4mg/ml)或者由其组成或基本由其组成。

这些优选的成脂培养基中的每一个中的培养基优选地为DMEM。另外，这些优选的成脂培养基中的每一个中的培养基补充了10％FBS和低葡萄糖。在本领域中，技术人员已知“低葡萄糖”或“DMEM低葡萄糖”是1g/l，与4g/l的“高葡萄糖”或“DMEM高葡萄糖”相反。可以在步骤e)开始时以3.10⁴至9.10⁴个细胞/cm²的范围内的密度，优选地使用5.10⁴个细胞/cm²接种细胞。在一个实施方式中，将细胞维持在衍生培养基(derivationmedium)，即由DMEM组成的培养基中。在一个实施方式中，所述培养基补充了FBS(10％)和FGF-2(5ng/mL)。

步骤e)的持续时间不是至关重要的。所述持续时间还可以基于步骤b)开始时所使用的iPAM细胞的数目和/或肌原性培养基中存在的组分的成分和/或是否已进行步骤c)，进行步骤d)的方式，例如，步骤d)期间的代数而不同。通常，步骤e)的持续时间可以在3至18天，或者4至17天或者5至16天或者6至16天的范围内。

在一个实施方式中，本发明的方法使得所获得的BA细胞的特征在于UCP1的表达。在描述部分的下一节中进一步描述了BA细胞和UCP1的表达。在本文中作为SEQ ID NO:13鉴别了优选的人UCP1氨基酸序列。

如将对于技术人员显而易见的，本文所述的方法是离体或体外方法。

还对技术人员显而易见的是获得BA细胞的方法本身不需要包括所述获得BAP细胞的方法的步骤a)，b)，可选的步骤c)和步骤d)。只要技术人员能够获得BAP细胞，则他可以应用如上定义的步骤e)并将获得BA细胞。

从本发明的方法可获得的BAP、BA细胞或者BAP、BA细胞群体

本发明还涉及优选地从如上所述的方法中可获得的BAP、BA细胞本身或者BAP、BA细胞群体本身。技术人员清楚本发明还涉及包含BAP或BA细胞的BAT(褐色脂肪细胞组织)。在整个发明申请中，当提及包含BAP或BA细胞的组合物或者包含BAP或BA细胞的群体时，该组合物或该群体可以认为是包含这些细胞的组织。BAT是包含BA和BAP细胞的组织。

在一个实施方式中，BAP细胞是哺乳动物，更优选地人BAP细胞。在一个实施方式中，BAP细胞群体是人BAP细胞群体。在一个实施方式中，BA细胞是哺乳动物，更优选地人BA细胞。在一个实施方式中，BA细胞群体是人BA细胞群体。

BA细胞或BA细胞群体通常可以包括除BA细胞之外的其他细胞类型。在一个实施方式中，本发明的BA细胞群体的特征在于它们包含至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％并且优选地至少90％的表达至少一种BA细胞的生物标志物特征，例如UCP1(解偶连环蛋白1)的细胞。优选地，所述标志物是UCP1。UCP1被认为是不包括成熟BA阶段的唯一标志物(Nedergaard等人2001，Canon等人2004)。可以表达的其他标志物是PGC1α、FABP4、CIDEA、PLIN1、PPARγ、EBF2、ZIC2、DIO2和伴生存在的脂滴(即至少一个脂滴)。可以如标题为在本发明申请的上下文中适用的定义的部分中所述，进行UCP1和/或PGC1α和/或本文所列的任何其他标志物的表达的评价。可以使用中性脂染色来进行脂滴的检测。

可以纯化BA细胞，或者可以通过选择表达对BA细胞特异的标志物的细胞来富集BA细胞群体。在一个实施方式中，用于BA细胞群体的纯化或富集的对BA细胞特异的标志物可以选自以下标志物中的一种或多种：UCP1，可选地与PGC1α、FABP4、CIDEA、PLIN1、PPARγ、EBF2、ZIC2和/或DIO2中的任一项组合。还可以如本文之前所解释的，对于至少一种脂滴的存在选择BA细胞。

可以使用细胞分选技术，如荧光激活细胞分选术(FACS)或者包含所述BA细胞的细胞表面标志物的特异性结合剂的磁珠，或者BA标志物的荧光报道子来实现BA细胞的纯化或富集。

在纯化或富集后，群体因此可以包含大于10％、20％、30％、40％、50％、60％；70％、80％、90％或大于95％的表达BA细胞的生物标志物特征，例如，可选地与PGC1α、FABP4、CIDEA、PLIN1、PPARγ、EBF2、ZIC2和/或DIO2中的任一项组合的UCP1的细胞。BA细胞还可以包含如本文之前所解释的至少一种脂滴。

鉴定所获得的BA细胞的功能性的另一种方法是评价通过脂解激活剂，如毛喉素或异丙肾上腺素处理后，它们释放游离甘油的能力。优选地，处理使用毛喉素。更优选地，处理以10mM使用毛喉素24小时。与未处理的细胞相比，对于处理的细胞，所释放的游离甘油的增加为至少20％、30％、40％、50％或甚至至少60％。这种游离甘油的释放是脂解增加的指示。本发明的方法使得能够获得高得率(至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％或甚至85％)的脂肪细胞，优选地功能性褐色脂肪细胞。

在另一个优选的实施方式中，本发明涉及包含从如上所述的方法可获得的BA细胞群体的组合物。在一个实施方式中，BA细胞群体可以由BA细胞组成或者可以基本由其组成。

在另一方面，本发明还涉及通常可以包含BAP细胞以外的其他细胞类型的BAP细胞或BAP细胞群体。在一个实施方式中，本发明的BAP细胞群体的特征在于所述BAP细胞群体是通过本发明的方法可获得的并且包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的具有转化为如本文所定义的BA细胞群体的能力的细胞。在一个实施方式中，在根据步骤e)的包含血清或其等价物的成脂培养基中培养BAP细胞或BAP细胞群体之后评价所述转化。所述BA细胞表达UCP1。可以表达的其他标志物是PGC1α、FABP4、CIDEA、PLIN1、PPARγ、EBF2、ZIC2、DIO2。这些BA细胞的特征还可以在于伴生存在的脂滴(即至少一个脂滴)。可以如标题为在本发明申请的上下文中适用的定义的部分中所述，进行UCP1和/或本文所列的任何其他标志物的表达的评价。可以使用中性脂染色来进行脂滴的检测。

可以将BAP细胞群体或者包含BAP细胞的群体在技术人员已知的适当生长条件下培养1至2个月(Wdziekonski等人2010)

可以通过应用本发明的方法纯化BAP细胞或者可以富集BAP细胞群体。

在另一个优选的实施方式中，本发明涉及包含从如上所述的方法可获得的BAP细胞群体的组合物。在一个实施方式中，BAP细胞群体可以由BAP细胞组成或者可以基本由其组成。

BAP或BA细胞或者BAP或BA细胞群体的应用

如本文之前所定义的，可以有利地在分化条件下离体培养BAP细胞以产生褐色脂肪细胞(BA)。

在另一个实施方式中，本发明涉及包含通过根据本发明的方法可获得的BAP或BA细胞的组合物。在一个实施方式中，该组合物是药物组合物。BAP或BA细胞或者包含BAP或BA细胞的群体或者包含这些细胞或细胞群体的组合物可以用作药剂。药剂可以用于治疗或预防与BAP或BA细胞活性有关的任何疾病或病况。这种疾病或病况的实例包括代谢疾病，如肥胖症相关病变、代谢综合征、糖尿病、高脂血症、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、能量平衡(摄入相对于消耗)。因此，本发明还涉及BAP细胞或者包含BAP细胞的群体或者包含这些细胞或细胞群体的组合物用于生产抗如本文所提及的疾病的药剂的应用。本发明的另一方面涉及包含BAP或BA细胞的群体作为本发明的群体的应用。

可以在多种应用，具体地，在研究或治疗领域中使用本发明的群体。一个主要治疗应用领域是细胞疗法或再生医学。再生医学可以用于通过如本文所解释的，包含所获得的BAP或BA细胞的群体的植入使受损组织或细胞体内或体外或离体再生来潜在地治愈由机能性障碍、受损或破坏的组织或细胞(即BA或BAP或与之相关的细胞)所造成的任何疾病。

因此，在一方面，本发明涉及本发明的群体作为植入哺乳动物，例如，人患者中的细胞疗法产物的应用。

在一个具体实施方式中，本发明涉及包含根据本发明获得的BA细胞群体的药物组合物。在另一个优选的实施方式中，本发明涉及包含含有(例如)至少10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸或至少10⁹个表达UCP1的细胞的BA细胞群体的药物组合物。在另一个实施方式中，该组合物包含药物可用的媒介物。

在一个实施方式中，进一步培养BAP细胞或者与多种细胞类型进一步共培养BAP细胞以诱导它们向BA谱系分化。在另一个实施方式中，将BAP细胞直接移植到受体宿主中。

在另一个优选的实施方式中，本发明涉及包含本发明的群体的组合物。可以在细胞疗法或再生医学中使用包含本发明的群体的组合物。

在另一方面，BAP或BA细胞或BAP或BA细胞群体可以用于筛选目的。实例为使用BAP细胞或BAP细胞群体筛选化合物诱导BAP细胞的增殖、存活和/或向BA细胞进一步分化的能力。另一个实例是研究成熟BA细胞的激活以诱导它们的能量消耗。

在该文档中并且在其权利要求中，以其非限制性意义使用动词“包含”及其动词变化以表示包括该单词之后的项目，但是不排除未具体提及的项目。另外，可以用“基本由……组成”来代替动词“由……组成”，从而表示如本文所定义的方法或细胞群体或组合物可以包括具体提及的那些以外的其他步骤，各自的其他组分，所述其他步骤，各自的组分不改变本发明的独特性质。另外，可以用“基本由……组成”来代替动词“由……组成”，从而表示如本文所定义的方法可以包括具体提及的那些以外的其他步骤，所述其他步骤不改变本发明的独特性质。另外，通过不定冠词“一个”对元素的提及不排除存在不止一个元素的可能性，除非上下文明显要求存在一个且仅存在一个元素。因此，不定冠词“一个”通常表示“至少一个”。当结合数值使用时(例如，约10)，单词“约”或“大约”优选地表示所述值可以是比所述值大或小0.1％的给定值(10)。在本发明的说明书中引用的所有专利和参考文献以其全部内容作为参考并入本文。

仅出于说明性目的提供了以下实施例，并且它们不意欲以任何方式限制本发明的范围。

在本发明申请的上下文中适用的定义

标志物

几次在本发明申请中出现，细胞或细胞群体的特征在于标志物的表达。这种标志物的实例为Oct4、SOX2、Nanog、SSEA 3和4、TRA 1/81、Tbx6、肝配蛋白A1、肝配蛋白B2、EPHA4、PDGFRα、Sall1、Sall4、Dll1、Dll3、Papc(Pcdh8)、Lfng、Hes7、Ripply1、Ripply2、Brachyury(T)、Cdx2、Cdx4、Evx1、Cxcr4、Ill7rd、Fgf8、Fgf17、Gbx2、Wnt3a、Wnt5b、Rspo3、SP5、SP8、Has2、Dkk1、Dact1、Pax3、Pax7、Mesp1、Mesp2 Msgn1、pax7、肌间线蛋白、肌细胞生成素、α辅肌动蛋白、UCP1、PGC1α、FABP4、CIDEA、PLIN1、PPARγ、EBF2、ZIC2、DIO2。

据称当可以检测所述标志物的表达时，细胞或细胞群体将表达给定标志物。可以使用本领域中已知的用于测量基因表达的任何方法，具体地，定量方法，如实时定量PCR或微阵列，或者使用基因报道子表达的方法(所述基因报道子包含WO 2013/030243的实验部分中所述的Msgn1启动子)或者定性方法，如鉴别显示出特定生物标志物，包含细胞表面标志物的细胞的免疫染色或细胞分选方法来进行所述标志物的所述表达的检测。

序列同一性

在本文中，将“序列同一性”定义为两种或更多种核酸(核苷酸、多核苷酸、RNA、DNA)序列之间的关系，如通过序列比较所确定的。在本领域中，视情况而定，“同一性”还表示核酸序列之间的序列关联程度，如通过这些序列串之间的匹配所确定的。可以容易地通过已知方法计算“同一性”和“相似性”，所述方法包括(但不限于)ComputationalMolecular Biology,Lesk,,A.M.主编,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.主编,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,andGriffin,H.G.主编,Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in MolecularBiology,von Heine,G.,Academic Press,1987；和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.主编,M Stockton Press,New York,1991；和Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)中所述的那些。

确定同一性的方法旨在提供所测试序列之间最大的匹配。在公开可用的计算机程序中编码了确定同一性和相似性的方法。确定两条序列之间的同一性和相似性的优选的计算机程序方法包含(例如)GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BestFit、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。BLAST X程序公开可得自NCBI及其他来源(BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894；Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。熟知的Smith Waterman算法也可以用于确定同一性。

用于核酸比较的参数包含以下：算法：Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)；比较矩阵：匹配＝+10，错配＝0；空位罚分：50；空位长度罚分：3，作为Gap程序得自位于Madison,Wis.的Genetics Computer Group。以上提供了用于核酸比较的缺省参数。

如本文所使用的，两条氨基酸序列之间的同一性百分比是考虑需要引入以用于两条序列的最优比对的缺口数目和每个缺口的长度，序列共有的相同位置数的函数(即同一性％＝相同位置#/位置总#×100)。可以如下所述，使用数学算法完成序列比较和两条序列之间的同一性百分比的确定。

可以使用已引入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17,1988)算法，使用PAM120权重残基表(weight residuetable)、12的空位长度罚分和4的空位罚分来确定两条氨基酸序列之间的同一性百分比。

可选地，在确定氨基酸相似性程度中，技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸替换，如将对于技术人员清楚的。保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的可互换性。例如，具有脂肪族侧链的氨基酸组是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪-羟基侧链是氨基酸组是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的氨基酸组是天门冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸组是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸组是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的氨基酸组是半胱氨酸和蛋氨酸。优选的保守氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天门冬酰胺-谷氨酰胺。本文所公开的氨基酸序列的替换变体是其中已除去所公开的序列中的至少一个残基并在其位置插入不同残基的那些。优选地，所述氨基酸变化是保守的。对于每个天然存在的氨基酸，优选的保守替换如下所示：Ala替换为ser；Arg替换为lys；Asn替换为gln或his；Asp替换为glu；Cys替换为ser或ala；Gln替换为asn；Glu替换为asp；Gly替换为pro；His替换为asn或gln；Ile替换为leu或val；Leu替换为ile或val；Lys替换为arg；gln或glu；Met替换为leu或ile；Phe替换为met、leu或tyr；Ser替换为thr；Thr替换为ser；Trp替换为tyr；Tyr替换为trp或phe；和Val替换为ile或leu。

在一个实施方式中，基于两个给定SEQ ID NO的全长或其部分计算序列同一性。其部分优选地表示两个SEQ ID NO的至少50％、60％、70％、80％、90％或者100％。

激活剂

如本文所使用的术语“特定通路或分子的激活剂”，如“Wnt信号转导通路的激活剂”(除非另外说明)表示提高或促进或激活或上调或升高与所述通路或分子相联系或有关的活性的物质。Wnt信号转导活性。例如，对于典型的wnt/β-连环蛋白信号通路，可以使用已建立的LEF/TCF结合位点报道子的多聚体，通过Wnt报道子活性，和/或通过GSK-3β的抑制，和/或典型的Wnt靶标基因，如T、Tbx6、Msgn1或Axin2的激活来测量这种活性。因此，可以作为如以上所鉴别的Msgn1报道子活性(Chal J等人2015)的Wnt的升高来评价Wnt信号转导活性的激活。基于所述通路或分子，技术人员已知对于所述通路或分子的活性特异且可以用于评价激活剂的测定。所述提高可以是与没有激活剂的对照情况相比，至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或以上。

抑制剂

如本文所使用的术语特定通路或分子的“抑制剂”表示抑制、下调或降低与所述通路或分子相联系或有关的活性的物质。基于所述通路或分子，技术人员已知对于所述通路或分子的活性特异且可以用于评价抑制剂的测定。所述降低可以是与没有抑制剂的对照情况相比，至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或以上。

附图和附表

图1.从hiPS细胞衍生人褐色脂肪细胞祖细胞(hBAP)和产生人褐色脂肪细胞(hBA)的方法。在诱导的轴旁中胚层(iPAM)产生后，细胞经历肌原性分化。然后，BAP来源于这些细胞并诱导以分化为褐色脂肪细胞。

图2.从hiPSC衍生人褐色脂肪细胞祖细胞的实验方案。从第0天至第22天，一系列分化培养基使得能够在基质胶涂覆的培养平板上从hiPS细胞依次诱导iPAM和肌原性谱系。从第12天至第22天，使用胰蛋白酶使细胞解离并将其接种至未涂覆的培养平板。在几次传代后，对BAP富集细胞群体。

图3.从hiPS细胞的BAP衍生。BAP衍生期间细胞群体的相差光学照片。在整个连续传代期间，细胞获得均一形态(比例尺＝1,000μm)。

图4.BAP的成脂潜力。在不同代数(P5、P6、P7、P8和P9)，从未分化的BAP(Und.)或者从经历分化17天的BAP制备mRNA。通过qPCR分析6个成脂标志物。

图5.褐色脂肪细胞的表征。在不同代数(P5、P6、P7、P8和P9)，BAP分化已诱导17天。通过免疫染色使UCP1、脂滴和核显象(比例尺＝50μm)。

图6.从hiPS细胞衍生人褐色脂肪细胞祖细胞(hBAP)和产生人褐色脂肪细胞(hBA)的方法。在诱导的轴旁中胚层(iPAM)产生后，细胞经历肌原性分化。然后，BAP来源于这些细胞并诱导以分化为褐色脂肪细胞。

图7.从hiPSC衍生人褐色脂肪细胞祖细胞的实验方案。从第0天至第22天，一系列分化培养基使得能够在基质胶涂覆的培养平板上从hiPS细胞依次诱导iPAM和肌原性谱系。从第12天至第22天，使用胰蛋白酶使细胞解离并将其接种至未涂覆的培养平板。在几次传代后，对BAP富集细胞群体。

图8.从hiPS细胞的BAP衍生。在BAP衍生期间，在第16天，细胞群体的相差光学照片。在整个连续传代期间，细胞获得均一形态(比例尺＝1,000μm)。

图9.在早期代数，BAP的成脂潜力。在不同代数(P1、P2、P3、P4和P5)，从未分化的BAP(Und.)或者从经历分化17天的BAP制备mRNA。通过qPCR分析6个成脂标志物。

图10.在早期代数，褐色脂肪细胞的表征。在不同代数(P1、P2、P3、P4和P5)，对于在第16天衍生的BAP，已诱导分化17天。通过免疫染色使UCP1、脂滴和核显象。(B)表达UCP1且显示出脂滴的细胞群体的定量。

图11.在晚期代数，BAP的成脂潜力。在不同代数(P5、P6、P7、P8和P9)，从未分化的BAP(Und.)或者从经历分化17天的BAP制备mRNA。通过qPCR分析6个成脂标志物。

图12.在晚期代数，褐色脂肪细胞的表征。在不同代数(P5、P6、P7、P8和P9)，BAP分化已诱导17天。(A)通过免疫染色使UCP1、脂滴和核显象。(B)表达UCP1且显示出脂滴的细胞群体的定量。

图13.来自在不同终点衍生的BAP的褐色脂肪细胞的表征。在含有血清的培养基中的培养步骤之后，使BAP从第12天至第22天衍生，传代5次并经历脂肪细胞分化17天。(A)通过免疫染色使UCP1、脂滴和核显象。(B)表达UCP1且显示出脂滴的细胞群体的定量。(C)从未分化的BAP(Und.)或者从经历分化17天的BAP(分化的)制备mRNA并通过qPCR分析成脂标志物。(D)将从第12天或第16天衍生的BAP诱导分化17天，然后用10μM毛喉素刺激脂解。

图14.含有血清的培养基中的培养步骤的影响。(A)使用(1)或不使用(2)在含有血清的培养基中的培养步骤使BAP从第20天衍生(即可选的步骤c))并经历脂肪细胞分化17天。通过免疫染色使UCP1、脂滴和核显象。

图15.与方法2的比较。根据方法2，将hiPS细胞诱导为轴旁中胚层谱系。在第8天，将细胞维持在肌原性培养基(a)或者两种成脂培养基(b和c)中。从第20天和第30天制备mRNA。根据方法1，还从hiPS细胞产生了BAP和BA。如方法1所述，从未分化的BAP(Und.)或者从经历分化17天的BAP(Diff.)制备mRNA。通过qPCR分析2种成脂标志物。

图16.与方法3.1的比较。在轴旁中胚层诱导后，使用方法3.1使细胞分化。从第20天和第30天制备mRNA。根据方法1，还从hiPS细胞产生了BAP和BA。如方法1所述，从未分化的BAP(Und.)或者从经历分化17天的BAP(Diff.)制备mRNA。通过qPCR分析2种成脂标志物。

图17.与方法3.2的比较。在轴旁中胚层诱导后，使用方法3.2使细胞分化。在第8天，将细胞维持在两种不同的成脂培养基(3.2.a和b)中。根据方法1，还从hiPS细胞产生了BAP和BA。如方法1所述，从未分化的BAP(Und.)或者从经历分化17天的BAP(Diff.)制备mRNA。通过qPCR分析2种成脂标志物。

图18.与方法4的比较。如方法4或方法1中所述，从hiPS细胞产生了BAP。(A)在P5，BAP分化已诱导17天。通过免疫染色使UCP1、脂滴和核显象。(B)在P5，从未分化的BAP(Und.)或者从经历分化17天的BAP(Diff.)制备mRNA。通过qPCR分析2种成脂标志物。

图19.与方法5的比较。(A)如方法5中所述，在hiPS细胞分化期间，细胞群体的相差光学照片。根据方法1，还从hiPS细胞产生了BAP和BA。(B)如方法1所述，从未分化的BAP(Und.)或者从经历分化17天的BAP(Diff.)制备mRNA。通过qPCR分析2种成脂标志物。(C)在分化17天后，对BA培养物，通过免疫荧光使UCP1、脂滴和核显象。

图20.比较实验的总结。使用方法2、方法3.1、3.2和方法4，使hiPS细胞分化。对于所测试的每种方法，根据方法1，还从hiPS细胞产生了BAP(Und.)和BA(Diff.)。从不同条件制备mRNA，并通过qPCR分析褐色成脂UCP1的表达。

表1：本发明的序列

实施例：

实施例1

方法

在附录中详细说明了本文所使用的所有化合物的全称和生产商。

来自hiPS细胞的人褐色脂肪细胞祖细胞(hBAP)的原代分化和衍生：

使用胰蛋白酶将未分化的hiPS细胞解离成单细胞，并将它们以5.5.10⁴个细胞/cm²的密度接种至基质胶涂覆的皿中的补充有Rock-1抑制剂(10μM)的mTESR-1培养基中。一天后，将培养基更换为无Rock-1抑制剂的新鲜mTESR-1。当细胞形成小团块(在分化第0天确定)时，将它们更换为一系列分化培养基。

在第0天，将培养基更换为由补充有ITS(1％)、CHIR99021(3μM)和LDN-193189(500nM)的DMEM所组成的培养基。将该培养基每天更新直至第6天。

在第6天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)、LDN-193189(500nM)、HGF(10ng/mL)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每天更换该培养基直至第8天。

在第8天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每天更换该培养基直至第12天。

从第12天至第22天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)、HGF(10ng/mL)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每2天更换培养基(图1和图2)。

在衍生出hBAP的所选天数(第12天至第22天之间)，将培养基更换为由补充有FBS(10％)的DMEM所组成的培养基。每2天更新培养基。一周后，使用胰蛋白酶使细胞传代并将其接种到组织培养级板上。将其固定为代数0。将细胞维持在补充有FGF-2(5ng/mL)的上述培养基中。

当细胞达到汇合时，将其传代并以5.10⁴个细胞/cm²的密度接种。

重复传代(通常4至9次)直至获得具有均一形态的细胞群体(图2)。

人褐色脂肪细胞祖细胞(hBAP)的分化：

将hBAP以高密度(即5.10⁵个细胞/cm²)铺板并维持在衍生培养基中。当细胞达到汇合(在分化第0天确定)时，将培养基更换为由补充有FBS(10％)、罗格列酮(1μM)、胰岛素(10μg/ml)、T3(0.2nM)、SB431542(5μM)、抗坏血酸(25.5μg/ml)、EGF(10ng/mL)、氢化可的松(4μg/ml)、地塞米松(1μM)和IBMX(500μM)的具有低葡萄糖的DMEM所组成的分化培养基。在第3天之后，弃去地塞米松和IBMX(图3)。然后，每周更换两次分化培养基。

结果

实验结果

获得BA的工作流程。

该规程由顺序分化期(differentiation session)组成以从hiPS细胞的初始批次获得BA(图1)。在iPAM细胞的诱导之后，通过从第5代至第9代的顺序重新铺板富集推定的BAP亚群。在开始所述规程的第二部分之前，在第12天至第22天，在一些端点挑取BAP。然后，在含有关键成脂因子的培养基中，使富集的BAP群体分化2周(图1和图2)。

BAP可以在不同代之间富集。

在分化12至22天后(显示了第16天)，我们将细胞传代并将它们在含有血清+FGF2的培养基中铺板以富集BAP群体。将细胞从P0传代至P4使得能够消除团块和污染细胞(图3)。如通过相差显微镜所示，细胞达到均一且100％汇合的成纤维细胞样BAP群体。在第4代后，BAP的细胞形状直至P9不再变化(数据未显示)，从而使得从P5至P9的分化过程无差别。

BAP衍生的BA表达分化的褐色脂肪细胞的相关标志物

将BAP或BAP衍生的BA(从P5至P9)在含有10％胎牛血清+罗格列酮(1μM)+胰岛素(10μg/ml)+T3激素(200pM)+SB431542(5μm)+抗坏血酸(25.5μg/ml)+EGF(10ng/mL)+氢化可的松(4μg/ml)+地塞米松(1μM)+IBMX(500μM)的DMEM中分化。3天后，用缺少后两种化合物的新鲜培养基取代该培养基。通过RT-qPCR对BA和BAP细胞评价转录本的表达水平(图4)。与BAP相比，BA细胞中全脂肪细胞(pan-adipocyte)标志物FABP4(脂肪酸结合蛋白4)、PLIN1(脂滴包被蛋白1)、PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)升高，从而反映了向脂肪细胞通路的定型(commitment)。另一方面，褐色脂肪细胞标志物：UCP1(解偶连环蛋白1)、CIDE-A(细胞死亡-诱导的DFFA样效应因子A)和PGC1-α(过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂α)在BA中的表达比在BAP中更多。从第5至9代观察到这种效果(图4)。

在成熟17天后，然后使用抗UCP1抗体和鉴别胞内脂滴的中性脂探针，通过免疫荧光鉴别BA培养物。如所示的，BA对于UCP1具有强且均一的染色(图6)。表达UCP1+脂滴的细胞数目的定量显示出39,5％(对于P9细胞)至79％(对于P6细胞)的范围内的阳性细胞。

实施例1.a

方法

在附录中详细说明了本文所使用的所有化合物的全称和生产商。

来自hiPS细胞的人褐色脂肪细胞祖细胞(hBAP)的原代分化和衍生(图6和图7)：

步骤a)使用胰蛋白酶将未分化的hiPS细胞解离成单细胞，并将它们以3.10⁴至9.10⁴个细胞/cm²的范围内的密度接种。本实施例是以5.5.10⁴个细胞/cm²在基质胶涂覆的皿中的补充有Rock-1抑制剂(10μM)的mTESR-1培养基中进行的。一天后，将培养基更换为无Rock-1抑制剂的新鲜mTESR-1。当细胞形成小团块(在分化第0天确定)时，将它们更换为一系列原代分化培养基。

在第0天，将培养基更换为由补充有ITS(1％)、CHIR99021(3μM)和LDN-193189(500nM)的DMEM所组成的培养基，并且从第3天开始，补充或不补充FGF-2(20ng/mL)。每天更换培养基直至第6天。这对应于轴旁中胚层谱系的诱导。

步骤b)在第6天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)、LDN-193189(500nM)、HGF(10ng/mL)和IGF-1(2ng/ml)，且补充或不补充FGF-2(20ng/mL)的DMEM所组成的培养基。每天更换该培养基直至第8天。

在第8天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每天更换该培养基直至第12天。

从第12天开始并且直至达到所选时间点(最迟第22天)，将培养基更换为由补充有KSR(15％)、HGF(10ng/mL)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每2天更换培养基。该步骤对应于细胞向hBAP的衍生的开始。

步骤c)在选择进行衍生hBAP的当天(原代分化的第12天至第22天之间或者步骤c)开始后的第6至15天之后)，将培养基更换为由补充或不补充FBS(10％)，添加或不添加FGF-2(5ng/mL)的DMEM所组成的培养基。通过补充有10％FBS但未添加FGF-2的DMEM来实施该实施例。每2天更新培养基。

步骤d)7天后，使用胰蛋白酶使细胞传代并将其接种到组织培养级板上。这是第0代(P0)。将细胞维持在由补充有FGF-2(5ng/mL)的DMEM和FBS(10％)所组成的培养基中。

当细胞达到汇合时，将它们传代并以3.10⁴至9.10⁴个细胞/cm²的范围内的密度在组织培养级板上接种。已使用5.10⁴个细胞/cm²进行该实验。

重复传代(通常4至9次)，直至获得如本领域技术人员所确定的具有均一形态的细胞群体(图8)，因此产生了hBAP群体。

人褐色脂肪细胞祖细胞(hBAP)向人褐色脂肪细胞(hBA)的二次分化：

步骤e)将hBAP以3.10⁴至9.10⁴个细胞/cm²的范围内的密度铺板，并维持在衍生培养基，即由补充有FBS(10％)和FGF-2(5ng/mL)的DMEM所组成的培养基中。已使用5.10⁴个细胞/cm²进行该实验。当细胞达到汇合(在二次分化第0天确定)时，将培养基更换为由补充有FBS(10％)、罗格列酮(1μM)、胰岛素(10μg/ml)、T3(0.2nM)、SB431542(5μM)、抗坏血酸(25.5μg/ml)、EGF(10ng/mL)、氢化可的松(4μg/ml)、地塞米松(1μM)和IBMX(500μM)的具有低葡萄糖(1g/l)的DMEM所组成的分化培养基。在第3天之后，弃去地塞米松和IBMX。然后，在第8至30天期间，每周更换两次分化培养基(通常约2周)。

定量RT-PCR：

使用nucleo spin RNA plus试剂盒(Macherey-Nagel)，从细胞培养物提取总RNA。使用iScript gDNA clear cDNA合成试剂盒(Biorad)，适当的引物并在LightCycler 480II(Roche)上运行，对500ng总RNA进行RT-PCR。将TBP用作内部对照。

免疫细胞化学：

用PFA 4％固定细胞培养物。将细胞与由5％NGS、1％胎牛血清和0.2％Triton在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液所组成的封闭溶液一起培育30分钟。在室温下，在1h30期间进行原代抗体培育，并且抗体工作稀释液如下所示：抗-UCP1抗体(R&D)为1:250，抗-肌间线蛋白抗体(Santa Cruz)为1:800。在PBS清洗后，将细胞与AlexaFluor488-缀合的第二抗体(Invitrogen)以1:1000培育30分钟，并通过Dapi复染。根据标准规程进行HCS lipidtox中性脂染色。

脂解：

使BAP分化17天。然后，将细胞在补充有BSA 0,2％的DMEM 1g/l葡萄糖中维持24小时。用毛喉素(10μM)刺激脂解24小时。

实验结果

如本发明中所述获得BA的工作流程

该规程由顺序分化期(differentiation session)组成以从hiPS细胞的初始批次获得BA(图6)。在iPAM细胞诱导(步骤a))和后续对肌原性培养基的暴露(步骤b))之后，在第12天至第22天的范围内的不同时间点，使推定的BAP亚群衍生以通过顺序重新铺板(通常4至9代)(步骤c)和d))富集。然后，在含有关键成脂因子的培养基中，使该富集的BAP群体分化约2周(步骤e))(图6和图7)。

BAP的表型表征

在根据该实施例中所述的方法分化12至22天后(显示了第16天)，将细胞在含有FBS+FGF2的培养基中铺板以富集BAP群体。将细胞传代几次(通常4次)以使得能够除去团块和污染细胞(图8)。如相差显微镜所示，细胞群体达到对本领域技术人员来说均一的100％汇合状态的成纤维细胞样BAP。一旦获得均一的群体，另外的传代不会改变BAP的细胞形状(数据未显示)。

不同代的BAP衍生的BA的表征。

将BAP(P1至P9)在含有FBS(10％)+罗格列酮(1μM)+胰岛素(10μg/ml)+T3激素(200pM)+SB431542(5μm)+抗坏血酸(25.5μg/ml)+EGF(10ng/mL)+氢化可的松(4μg/ml)+地塞米松(1μM)+IBMX(500μM)的DMEM中分化为BA。在第3天之后，弃去地塞米松和IBMX。通过RT-qPCR对BAP和BA两者评价某些典型的脂肪细胞谱系的转录本的表达水平(图9和11)。与BAP相比，BA细胞中全脂肪细胞(pan-adipocyte)标志物FABP4(脂肪酸结合蛋白4)、PLIN1(脂滴包被蛋白1)、PPARγ(过氧化物酶体增殖物激活受体γ)显著升高(分别多表达1.10⁵；3,5.10⁴和8倍)，从而反映了向脂肪细胞通路的定型。另外，褐色脂肪细胞标志物：UCP1(解偶连环蛋白1)、CIDE-A(细胞死亡-诱导的DFFA样效应因子A)和PGC1-α(过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂α)在BA中的表达比在BAP中显著更多(分别多表达1,2.10⁵；300和150倍)。

在分化的第17天，然后使用抗UCP1抗体和鉴别胞内脂滴的中性脂探针，通过免疫荧光鉴别BA培养物。BA对于UCP1具有强且均一的染色(图10和12)。对于该实验，表达UCP1+脂滴的细胞数目的定量显示出40％(对于P2细胞)至79％(对于P6细胞)的范围内的阳性细胞。使用本发明所获得的分化得率达到85％的细胞表达UCP1并且出现脂滴(图19)。

重要地，为了完成表征，将在第12天或第16天且在第5代之后衍生的BAP分化17天，然后用毛喉素(10μM)处理。24小时后，我们观察到与未处理的细胞相比，对于处理的细胞所释放的游离甘油增加(约60％)(图13.D)。BA能够对毛喉素起反应以提高脂解，因此显示出这些细胞的功能性。

这些结果无疑显示本发明的方法不仅产生脂肪细胞，而且还以前所未有的极高得率(高达85％的纯度)特异地产生了褐色脂肪祖细胞和功能性的脂肪细胞(参见实施例2)，从而使得能够获得具有符合工业应用的高纯度的BA群体。

衍生BAP的时间间隔

如上所述，在通过连续传代富集BAP之前，将细胞在肌原性培养基中从第6天培养至第22天，然后维持在含有血清的培养基中。

将在不同时间点衍生的BAP分化(如实施例1所述)17天(显示了第5代的数据)。BA培养物均强烈表达UCP1蛋白且具有多个脂滴(图13，A)。表达UCP1并且出现脂滴的细胞数目的定量显示出43％(对于在第14天衍生的BAP)至69％(对于在第12天衍生的BAP)的范围。通过qPCR分析确认了UCP1的表达(图13，B)。如所期望的，FABP4和UCP1两者在BA中的表达比在BAP中的更多。这些数据显示可以使BAP在第12天至第22天的任何时间点衍生，并以满意的效率导致BA的产生。此外，在用毛喉素刺激之后，我们观察到对于在第12和16天衍生的BAP的分化之后所获得的BA，脂解增加，从而确认了上述结果(图13.D)。

在图14中，在不进行步骤c)的情况下实施本发明的方法以评价该步骤的重要性。在第20天，使用(1)或不使用(2)在含有血清的培养基中的培养步骤使BAP衍生。在分化后，对于使用该额外步骤所衍生的BAP，UCP1-阳性细胞率为60％，而对于不使用它衍生的那些为23％。这些结果表明尽管步骤c)显著提高了BA产生的得率，但是其不存在也不阻碍BA群体的获得，并因此它是可选的。

这些结果显示在iPAM细胞诱导后，可以以高得率产生BAP和BA而无论对于BAP衍生所选择的时间点如何，只要该时间点包含在2至9次连续传代之后，且在原代分化的第12和22天之间。在这些可能性中，优选的条件是在第16天衍生BAP并在分化前将其传代5次。

实施例2

在本实施例中，将本发明的方法与现有技术中所鉴别的主张能够产生BAP和/或BA的其他方法相比较以确定本发明申请中所述的方法的优势。对于每种方法(2至5)，还使用如下所述的本发明的方法(方法1)，同时使用相同批次的未分化的hiPS细胞来平行产生BAP和BA。

方法

在附录中详细说明了本文所使用的所有化合物的全称和生产商。

方法1：从hiPS细胞的hBAP的原代分化和衍生以及hBAP向hBA的分化：

步骤a)使用胰蛋白酶将未分化的hiPS细胞解离成单细胞，并将它们以5.5.10⁴个细胞/cm²的密度接种至基质胶涂覆的皿中的补充有Rock-1抑制剂(10μM)的mTESR-1培养基中。一天后，将培养基更换为无Rock-1抑制剂的新鲜mTESR-1。当细胞形成小团块(在原代分化第0天确定)时，将它们更换为一系列分化培养基。

在第0天，将培养基更换为由补充有ITS(1％)、CHIR99021(3μM)和LDN-193189(500nM)的DMEM所组成的培养基。将该培养基每天更新直至第6天。

步骤b)在第6天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)、LDN-193189(500nM)、HGF(10ng/mL)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每天更换该培养基直至第8天。

在第8天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每天更换该培养基直至第12天。

从第12天至第16天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)、HGF(10ng/mL)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每2天更换培养基(图6和图7)。

步骤c)在第16天，将培养基更换为由补充有FBS(10％)的DMEM所组成的培养基。每2天更新培养基。

步骤d)7天后，使用胰蛋白酶使细胞传代并将其接种到组织培养级板上。(代数0)。将细胞维持在由补充有FBS(10％)和FGF-2(5ng/mL)的DMEM所组成的上述培养基中。

当细胞达到汇合时，将其传代并以5.10⁴个细胞/cm²的密度接种。

重复传代5次直至获得具有均一形态的细胞群体。

步骤e)将hBAP以5.10⁴个细胞/cm²的密度铺板并维持在衍生培养基，即补充有FBS(10％)和FGF-2(5ng/mL)的DMEM中。当细胞达到汇合(在二次分化第0天确定)时，将培养基更换为由补充有FBS(10％)、罗格列酮(1μM)、胰岛素(10μg/ml)、T3(0.2nM)、SB431542(5μM)、抗坏血酸(25.5μg/ml)、EGF(10ng/mL)、氢化可的松(4μg/ml)、地塞米松(1μM)和IBMX(500μM)的具有低葡萄糖(1g/l)的DMEM所组成的分化培养基。在第3天之后，弃去地塞米松和IBMX。然后，每周更换两次分化培养基直至二次分化的第17天。

方法2：WO2013/030243中所述的规程

WO2013/030243主张了在适合于它们分化为脂肪细胞的条件下，即在存在有效量的至少一种或以上已知诱导脂肪细胞分化的化合物的情况下，通过培养iPAM细胞群体来制备包含脂肪细胞的群体的方法。为了确定使用WO2013/030243所述的方法是否可以获得与方法1相当的BAP和BA，产生了iPAM细胞并随后将其暴露于肌原性培养基(2.a.)或者成脂培养基(2.b.和2.c.)，所述成脂培养基被认为是产生脂肪细胞的潜在“适合条件”。

iPAM细胞的产生

使用胰蛋白酶将未分化的hiPS细胞解离成单细胞，并将它们接种至基质胶涂覆的皿中的补充有Rock-1抑制剂(10μM)的mTESR-1培养基中。一天后，将培养基更换为无Rock-1抑制剂的新鲜mTESR-1。当细胞形成小团块(在原代分化第0天确定)时，将它们更换为一系列分化培养基。

在第0天，将培养基更换为由补充有ITS(1％)、CHIR99021(3μM)和LDN-193189(500nM)的DMEM所组成的培养基。

3天后，对上述培养基补充FGF-2(20ng/ml)。将该培养基每天更新直至第6天。

方法2.a：iPAM细胞的产生和在肌原性培养基中的培养步骤：

在第6天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)、LDN-193189(500nM)、HGF(10ng/mL)、FGF-2(20ng/mL)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每天更换该培养基直至第8天。

在第8天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。

在第12天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)、HGF(10ng/mL)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每2-3天更新培养基。

方法2.b和c：iPAM细胞的产生和在成脂培养基中的培养步骤

如上所述产生iPAM细胞。

在第6天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)、LDN-193189(500nM)、HGF(10ng/mL)、FGF-2(20ng/mL)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每天更换该培养基直至第8天。在第8天，然后将培养基更换为两种脂肪细胞分化培养基之一：

b.由含有15％KSR且补充有地塞米松(1μM)、IBMX(500μM)、胰岛素(10μg/ml)、T3(0,2nM)和罗格列酮(1μM)的DMEM-基培养基所组成的脂肪细胞分化培养基。本领域技术人员将认为该培养基是标准成脂培养基。

c.本发明申请的步骤e)中描述了脂肪细胞分化培养基。该培养基由含有15％KSR、地塞米松(1μM)、IBMX(500μM)、胰岛素(10μg/ml)、T3(0,2nM)、SB431542(5μM)、抗坏血酸(25,5μg/ml)、EGF(10ng/mL)和氢化可的松(4μg/ml)的DMEM-基培养基组成。

在第11天，对于两种成脂培养基除去地塞米松和IBMX。每2-3天更新培养基。

方法3：WO17223457中所描述的规程

WO17223457主张通过提供iPAM细胞群体，然后将该群体在两组不同条件：“HIFL”或者“PRA-Adipomix”下培养来产生表达UCP1的诱导的棕色脂肪组织(iBAT)的体外方法。为了确定是否可以使用方法3获得与方法1相当的BAP和BA，产生iPAM细胞并随后将其暴露于WO17223457中所描述的每种方法。

方法3.1.方法《HIFL》：

第0天至第6天：参见先前方法2中所述，《iPAM细胞的产生》

在第6天，将培养基更换为由补充有KSR(15％)、LDN-193189(100nM)、HGF(10ng/mL)、FGF-2(20ng/mL)和IGF-1(2ng/ml)的DMEM所组成的培养基。每天更换该培养基直至第8天。

在第8天，培养基仅补充有HGF(10ng/ml)和IGF-1(2ng/ml)。每2-3天更换培养基。

方法3.2.方法《PRA-Adipomix》

第0天至第6天：参见先前方法2中所述，《iPAM细胞的产生》

在第6天，将培养基更换为含有PD173074(250nM)和视黄酸(100nM)的DMEM-基培养基。

在第8天，将培养更换为两种脂肪细胞分化培养基：

a.在WO17223457中描述了Adipomix培养基。所述培养基由含有15％KSR、1×胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)、500μM IBMX、125nM吲哚美辛、1nM T3、5μM地塞米松和1μM罗格列酮的DMEM基培养基组成。每2-3天更新培养基。

b.在本发明申请中描述了脂肪细胞分化培养基。所述培养基由含有15％KSR、地塞米松(1μM)、IBMX(500μM)、胰岛素(10μg/ml)、T3(0,2nM)、罗格列酮(1μM)、SB431542(5μM)、抗坏血酸(25,5μg/ml)、EGF(10ng/ml)和氢化可的松(4μg/ml)的DMEM基培养基组成。在第11天，除去地塞米松和IBMX。每2-3天更新培养基。

方法4：《Hafner等人,2016》中所描述的规程

Hafner等人公开了通过形成胚状体(EB)，将它们在含有DMEM、血清和FGF-2的培养基中培养，随后连续传代并在步骤e)的成脂培养基中培养来从hiPS细胞产生BAP和BA细胞的方法。方法1和4具有使BAP衍生并将它们分化为BA的共同步骤，但是多潜能细胞分化的第一步有差别，其中对于方法4形成了胚状体，而对于方法1，产生iPAM细胞并随后暴露于肌原性培养基。

为了确定使用方法4是否可以以与方法1相当的得率获得BAP和BA，同时实施两种方法。

通过在补充有20％敲除血清替代物的DMEM/F12培养基中悬浮培养来形成EB。在EB形成后10天，将EB在明胶涂覆的培养平板上铺板并在补充有20％KSR的DMEM/F12培养基中维持8天。在第18天，将培养基更换为由补充有10％FBS的DMEM所组成的培养基。一周后，将细胞传代并将其接种到组织培养级板上。在第4或5代后，重复传代直至获得具有均一形态的细胞群体。

将细胞以5.10⁴个细胞/cm²的密度铺板并维持在衍生培养基，即补充有FBS(10％)和FGF-2(5ng/mL)的DMEM中。当细胞达到汇合(在分化第0天确定)时，将培养基更换为由补充有FBS(10％)、罗格列酮(1μM)、胰岛素(10μg/ml)、T3(0.2nM)、SB431542(5μM)、抗坏血酸(25.5μg/ml)、EGF(10ng/mL)、氢化可的松(4μg/ml)、地塞米松(1μM)和IBMX(500μM)的具有低葡萄糖(1g/l)的DMEM所组成的分化培养基。在第3天之后，弃去地塞米松和IBMX。然后，每周更换两次分化培养基直至分化的第17天。

方法5：WO2012/147853中所描述的规程

WO2012/147853主张了通过2-步法从hiPS细胞高效(>90％)产生褐色脂肪细胞的方法：首先，在无血清环境中，在存在造血细胞因子的情况下，通过从多潜能干细胞悬浮培养产生细胞团块。然后，在存在造血细胞因子的情况下，通过细胞团块的细胞粘附产生BA。同时实施方法1和5以比较通过每种方法可获得的BA的分化得率。

根据WO2012/147853，通过在IMDM/F12培养基(含有5mg/mL BSA，按体积计1％的合成脂溶液、按体积计1％的100×ITS、450mM MTG、2mM L-谷氨酰胺、按体积计5％的PFHII、50mg/mL抗坏血酸、20ng/mL BMP4、5ng/mL VEGF、20ng/mL SCF、2.5ng/mL Flt3L、2.5ng/mLIL6和5ng/mL IGF2)悬浮培养，通过胚状体(EB)的形成起始hiPS细胞的分化。每3天更换培养基。

8天后，将EB在明胶涂覆的培养平板上在IMDM/F12培养基(含有5mg/mL BSA，按体积计1％的合成脂溶液、按体积计1％的100×ITS、450mM MTG、2mM L-谷氨酰胺、按体积计5％的PFHII、50mg/mL抗坏血酸、10ng/mL BMP7、5ng/mL VEGF、20ng/mL SCF、2.5ng/mLFlt3L、2.5ng/mL IL6和5ng/mL IGF2)中铺板1周。每3天更换培养基。

定量RT-PCR：

使用nucleo spin RNA plus试剂盒(Macherey-Nagel)，从细胞培养物提取总RNA。使用iScript gDNA clear cDNA合成试剂盒(Biorad)，适当的引物并在LightCycler 480II(Roche)上运行，对500ng总RNA进行RT-PCR。将TBP用作内部对照。

免疫细胞化学：

用PFA 4％固定细胞培养物。将细胞与由5％NGS、1％胎牛血清和0.2％Triton在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液所组成的封闭溶液一起培育30分钟。在室温下，在1h30期间进行原代抗体培育，并且抗体工作稀释液如下所示：抗-UCP1抗体(R&D)为1:250，抗-肌间线蛋白抗体(Santa Cruz)为1:800。在PBS清洗后，将细胞与AlexaFluor488-缀合的第二抗体(Invitrogen)以1:1000培育30分钟，并通过Dapi复染。根据标准规程进行HCS lipidtox中性脂染色。

实验结果

方法1与方法2的比较：

评价了在使用或不使用本发明的方法中所描述的培养步骤的情况下iPAM细胞产生褐色脂肪细胞的能力(图15)。同时从单一批次hiPS细胞开始产生iPAM细胞。然后，将细胞维持在肌原性培养基(方法2.a)中，在成脂培养基中培养(方法2.b和c)或者根据方法1分化。

通过qPCR分析脂肪细胞标志物的表达：对于该比较，将第20天、第30天和对于方法1所述的BAP和BA的基因表达对在第8天所采集的样品进行归一化(即在向脂肪细胞谱系的任何定型之前)。在分化20或30天后，方法2.a.所述的细胞微弱表达FABP4(全成脂标志物)，但是不表达UCP1(褐色脂肪细胞特异性标志物)。然而，在第20或30天，在方法2.b.和2.c.的细胞中以低水平检测到UCP1的表达。UCP1的表达比从方法1产生的对照细胞高900倍。

这些数据显示通过使用成脂培养基的适当诱导，iPAM细胞可以分化为褐色脂肪细胞。然而，在通过方法2.b.或2.c所产生的细胞中，UCP1的表达显著低于使用方法1所产生的细胞，从而表明了本发明的额外步骤的重要性。与现有技术所示的那些步骤的任何其他组合相比，构成本发明的培养步骤的组合获得了意外的高得率的BA产生。

方法1与方法3的比较：

评价了根据WO17223457产生BA细胞的能力。同时从单一批次hiPS细胞开始产生iPAM细胞。然后，将细胞暴露于方法1，3.1.，3.2.a和3.2.b.的培养步骤(在方法部分中详细描述)。

通过qPCR分析脂肪细胞标志物的表达

对于该比较，将第20天、第30天和对于方法1)所述的BAP和BA的基因表达对在第8天所采集的样品进行归一化(即在向脂肪细胞谱系的任何定型之前)。

在20或30天分化后，名称为“HIFL”的方法3.1.所述的细胞未表达任何脂肪细胞标志物(图16)，这表明细胞未分化为褐色脂肪细胞。在20或30天后，方法3.2.的细胞表达低水平的FABP4和UCP1标志物(图17)。UCP1的表达比从方法1产生的对照细胞高至少1000倍。

这些数据再次显示通过适当诱导，iPAM细胞可以分化为褐色脂肪细胞。然而，与方法1相比，在通过方法3所产生的细胞中UCP1的表达显著较低。尽管WO17223457中所描述的方法可以以低得率产生BA细胞，但是这些结果清楚地显示了本发明的方法的优势。

方法1与方法4的比较：

评价了根据Hafner等人产生BA细胞的能力。根据方法1或方法4，将hiPS细胞分化以产生褐色脂肪细胞。通过qPCR和免疫荧光，在第4代(数据未显示)和第5代，分析了二次分化之前的BAP培养和在成脂培养基中成熟17天之后的BA培养(图18)。

通过qPCR分析的脂肪细胞标志物的表达：对于该比较，通过未分化细胞中的表达对分化细胞中基因的表达进行归一化。通过两种方法所获得的BA细胞显示出FABP4和UCP1的表达(图18.B.)，但是来自方法1的细胞表达UCP1的水平高100倍。

通过IF分析的脂肪细胞标志物的表达：与方法4相比，通过方法1的表达UCP1并且显示出脂滴的细胞群体显著更高(对于方法1为约47％，对于方法4为25％)(图18.A.)。

因此，这些结果教导意外地，通过如方法1中所描述的传代，轴旁中胚层谱系的诱导和BAP的富集的组合显著改善了分化得率。

方法1与方法5的比较：

我们不可以复制方法5的结果。尽管进行了一些尝试，但是在细胞团块形成的第一步之后，在第2或3天观察到了高细胞死亡率(图19)。在第8天后，细胞培养物完全丧失。

然而，使用相同批次的未分化的hiPS细胞，无论是通过qPCR(BA中FABP4和UCP1标志物的表达多于BAP)还是通过免疫荧光(分化17天之后，表达UCP1并且显示出脂滴的细胞群体达到85％)，根据方法1分化的对照细胞显示出预期结果，这表明在方法5的重复期间所观察到的细胞死亡率不是由于所使用的未分化的hiPS细胞。

这些结果表明WO2012/147853的方法是不可重复的或者高度依赖于外部因素，这使得该方法不适合于工业应用，从而确认了方法1的优势并且表明理论上可以得自方法5的细胞比不上通过本发明的方法获得的细胞。

比较的总结：

为了表明本发明优于现有规程的技术优势，我们将其与主张以下细胞中任一种的产生的现有技术中所公开的其他规程相比较：

—从iPAM细胞产生脂肪细胞或褐色脂肪细胞，或者

—从hiPS细胞产生褐色脂肪细胞。

通过qPCR的分析(图20)显示通过方法1所产生的BA以高于其他规程中任一种的水平表达褐色脂肪细胞特异性标志物UCP1(例如，比方法4大100倍至比方法3大高达1000倍)，从而证明了显著更高的分化得率。这些结果明显地表明就得率和/或持续时间以及不存在EB的情况下的稳健性而言，对于BAP和BA的产生，本发明的方法优于现有的规程。因此，本发明申请公开了产生BAP和BA的意外的新型方式。

参考文献

在整个本发明申请中，多种参考文献描述了本发明所属领域的现有技术水平。这些参考文献的公开内容作为参考并入本发明公开。

Altschul,S.F.et al.,1990,“Basic local alignment search tool”,J.Mol.Biol.215:403-410.

Beggs et al.1992J Biological chemistry.PMID:1339456.

Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,New York,1993；

BLAST Manual,Altschul,S.,et al.,NCBI NLM NIH Bethesda,MD 20894.

Buckingham et al.,Dev Cell.,2014.DOI:http://dx.doi.org/10.1016/j.devcel.2013.12.020

Cannon and Nedergaard.Brown adipose tissue:function and physiologicalsignificance.2004,Physiol Rev.,84,277-35910.1152/physrev.00015.2003.

Carillo,H.,and Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:973-1073(1988).

Chal J.et al.,(2015),Nature Biotechnology,Differentiation ofpluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy2015,doi:10.1038/nbt.3297.

Clevers,H.(2006).Wnt/β-catenin signaling in development anddisease.Cell 127,469-80.

Cohen,P.and Goedert,M.(2004).GSK3 inhibitors:development andtherapeutic potential.Nat Rev Drug Discov 3,479-87.

Computational Molecular Biology,Lesk,A.Miller.,ed.,Oxford UniversityPress,New York,1988；

Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994；

Cuny GD,Yu PB,Laha JK,Xing X,Liu JF,Lai CS,Deng DY,Sachidanandan C,Bloch KD,Peterson RT.Structure-activity relationship study of bonemorphogenetic protein(BMP)signaling inhibitors.Bioorg Med Chem Lett.2008 Aug1；18(15):4388-92.Epub 2008 Jun 27.

Devereux,J.,et al.,1984,“A comprehensive set of sequence analysisprograms for the VAX”,Nucleic Acids Research 12(1):387-395.

Gazerro E.and Minetti C.(2007)Potential drug targets within bonemorphogenetic protein signaling pathways.Curr Opin Pharmacol.:325-33

Huang et al.,Scientific reports,2017.doi:10.1038/srep40716

Loser,P.,Schirm,J.,Guhr,A.,Wobus,A.M.and Kurtz,A.(2010).Humanembryonic stem cell lines and their use in international research.Stem Cells28,240-6.

Meyers E.X.and Miller W.,Optimal alignments in linear space,(1988)Comput.Appl.Biosci.,4:11-17.

Montcouquiol,M.,Crenshaw,E.B.,3rd and Kelley,M.W.(2006).NoncanonicalWnt signaling and neural polarity.Annu Rev Neurosci 29,363-86.

Needleman and Wunsch,1970,“A general method applicable to the searchfor similarities in the amino acid sequence of two proteins”,J.Mol.Biol.48:443-453.

Nedergaard et al 2001,Biochim Biophys Acta.UCP1:the only protein ableto mediate adaptive non-shivering thermogenesis and metabolic inefficiency

Paulin et al.,Exp cell research,2004.DOI:10.1016/j.yexcr.2004.08.004

Sato,N.,Meijer,L.,Skaltsounis,L.,Greengard,P.and Brivanlou,A.H.(2004).Maintenance of pluripotency in human and mouse embryonic stem cellsthrough activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK-3-specificinhibitor.Nat Med 10,55-63.

Schlessinger,K.,Hall,A.and Tolwinski,N.(2009).Wnt signaling pathwaysmeet Rho GTPases.Genes Dev 23,265-77.

Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heine,G.,Academic Press,1987

Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M StocktonPress,New York,1991

Taelman,V.F.,Dobrowolski,R.,Plouhinec,J.L.,Fuentealba,L.C.,Vorwald,P.P.,Gumper,I.,Sabatini,D.D.and De Robertis,E.M.(2010).Wnt signaling requiressequestration of glycogen synthase kinase 3 inside multivesicularendosomes.Cell 143,1136-48.

Takahashi,K.,Tanabe,K.,Ohnuki,M.,Narita,M.,Ichisaka,T.,Tomoda,K.andYamanaka,S.(2007).Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defined factors.Cell 131,861-72.

Takahashi,K.and Yamanaka,S.(2006).Induction of pluripotent stem cellsfrom mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.Cell126,663-76.

Wu,D.and Pan,W.(2010).GSK3:a multifaceted kinase in Wntsignaling.Trends Biochem Sci 35,161-8.

Yoon JK et al,(2015),The bHLH regulator pMesogenin1 is required formaturation and segmentation of paraxial mesoderm.Genes.Dev.,14:3204-3214.

Yu,J.,Vodyanik,M.A.,Smuga-Otto,K.,Antosiewicz-Bourget,J.,Frane,J.L.,Tian,S.,Nie,J.,Jonsdottir,G.A.,Ruotti,V.,Stewart,R.et al.(2007).Inducedpluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.Science 318,1917-20.

Yu PB,Hong CC,Sachidanandan C,Babitt JL,Deng DY,Hoyng SA,Lin HY,BlochKD,Peterson RT.Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesisand iron metabolism.Nat Chem Biol.2008 Jan；4(1):33-41.Epub 2007 Nov 18.

Zammit et al.,J.Cell Science,2006.doi:10.1242/jcs.02908。

缩写/分子列表

抗坏血酸：(也称为维生素C)是人膳食中的必需营养素。抗坏血酸是有效的还原剂和抗氧化剂。除抗-氧化活性外，抗坏血酸(ASC)作为原胶原中的脯氨酸和赖氨酸残基的羟基化酶的辅因子起作用。生产商：SigmaAldrich

CHIR99021：是氨基嘧啶衍生物，它是GSK3极有效的抑制剂并且作为WNT激活剂起作用。生产商：axon medchem

地塞米松：是合成糖皮质激素。生产商：Sigma Aldrich

DMEM：达尔伯克改良伊格尔培养基(基础培养基)。生产商：GibcoEGF：表皮生长因子(EGF)通过结合至其受体EGFR刺激细胞生长和分化。生产商：Miltenyi biotech

FBS：胎牛血清。生产商：PanSera；Dutscher

FGF-2(也称为bFGF)：成纤维细胞生长因子-2。生产商：Miltenyibiotech

HGF：肝细胞生长因子。生产商：R&D systems

氢化可的松：是通过肾上腺皮质分泌的糖皮质激素。生产商：SigmaAldrich

IBMX：(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)是环AMP和环GMP磷酸二酯酶(PDE)的非特异性抑制剂。通过抑制PDE，IBMX提高细胞cAMP和cGMP水平，激活环-核苷酸-介导的蛋白激酶。生产商：Stemcell technologies

IGF-1：1型胰岛素生长因子。生产商：Miltenyi biotech

ITS：胰岛素-转铁蛋白-硒。它是细胞补充剂。胰岛素促进葡萄糖和氨基酸吸收、脂肪形成、胞内运输以及蛋白和核酸合成。转铁蛋白是铁-结合糖蛋白，其控制游离铁水平(也可以帮助降低含氧量和过氧化物自由基)。硒是谷胱甘肽过氧化物酶及其他蛋白的辅因子并且在培养基中用作抗氧化剂。生产商：Gibco

KSR：敲除血清替代物。它是成分更确定的无FBS培养基补充剂，其支持多潜能干细胞(PSCs)的生长。生产商：Gibco

LDN-193489：LDN-193189是骨形态发生蛋白(BMP)I型受体ALK2和ALK3的细胞可透过小分子抑制剂。LDN-193189来源于Dorsomorphin的构效关系研究并且主要通过Smad1、Smad5和Smad8磷酸化的预防来起作用。生产商：Miltenyi biotech

mTESR-1：用于hESCs&hiPSCs的不依赖于饲养物的维持的标准化培养基。生产商：Stemcell technologies

Y-27632(通常称为：Rock-1抑制剂)：含有ρ相关的卷曲螺旋的蛋白激酶(ROCK)的抑制剂。生产商：Tocris bioscience。

罗格列酮：罗格列酮是来自噻唑烷二酮类的抗-糖尿病药物。与其他噻唑烷二酮类似，其作用机制是通过胞内受体类的过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)，具体地PPAR-γ的激活。生产商：Prestwick

SB431542：是TGF-β/活化素/NODAL通路的小分子抑制剂，其抑制ALK5、ALK4和ALK7，但不抑制BMP I型受体ALK2、ALK3和ALK6。生产商：Stemcell technologies。

T3：三碘甲腺原氨酸。T3是甲状腺素脱碘所获得的甲状腺激素。生产商：SigmaAldrich。

序列表

<110> 阿纳格讷斯生物技术公司（Anagenesis Biotechnologies S.A.S.）

<120> 用于制备BAP或BA细胞的方法

<130> P6071446PCT

<150> EP17211081.9

<151> 2017-12-29

<160> 13

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 272

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met His Leu Arg Leu Ile Ser Trp Leu Phe Ile Ile Leu Asn Phe Met

1 5 10 15

Glu Tyr Ile Gly Ser Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg

20 25 30

Met His Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys

35 40 45

Ser Asp Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala

50 55 60

Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys

65 70 75 80

Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Asn Lys Cys Thr

85 90 95

Lys Cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr Cys Phe Asn Lys Asn Phe Cys Thr

100 105 110

Lys Cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Asn

115 120 125

Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser

130 135 140

Ile Val His Cys Glu Val Ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr

145 150 155 160

Lys Lys Gly Lys Thr Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val

165 170 175

Arg Glu Ile Ile Gln His Pro Ser Ala Lys Gly Asn Leu Cys Pro Pro

180 185 190

Thr Asn Glu Thr Arg Lys Cys Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Gln Lys

195 200 205

Gly Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Pro Asn

210 215 220

Lys Gly Glu Ser Lys Glu Ala Ile Pro Asp Ser Lys Ser Leu Glu Ser

225 230 235 240

Ser Lys Glu Ile Pro Glu Gln Arg Glu Asn Lys Gln Gln Gln Lys Lys

245 250 255

Arg Lys Val Gln Asp Lys Gln Lys Ser Val Ser Val Ser Thr Val His

260 265 270

<210> 2

<211> 277

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 2

Met His Leu Arg Leu Ile Ser Cys Phe Phe Ile Ile Leu Asn Phe Met

1 5 10 15

Glu Tyr Ile Gly Ser Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg

20 25 30

Met His Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys

35 40 45

Ser Asp Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Val

50 55 60

Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys

65 70 75 80

Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Asn Lys Cys Thr

85 90 95

Lys Cys Lys Val Asp Cys Asp Thr Cys Phe Asn Lys Asn Phe Cys Thr

100 105 110

Lys Cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Ser

115 120 125

Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser

130 135 140

Ile Val His Cys Glu Ala Ser Glu Trp Ser Pro Trp Ser Pro Cys Met

145 150 155 160

Lys Lys Gly Lys Thr Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val

165 170 175

Arg Asp Ile Leu Gln His Pro Ser Ala Lys Gly Asn Leu Cys Pro Pro

180 185 190

Thr Ser Glu Thr Arg Thr Cys Ile Val Gln Arg Lys Lys Cys Ser Lys

195 200 205

Gly Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Leu Asn

210 215 220

Lys Glu Glu Arg Lys Glu Thr Ser Ser Ser Ser Asp Ser Lys Gly Leu

225 230 235 240

Glu Ser Ser Ile Glu Thr Pro Asp Gln Gln Glu Asn Lys Glu Arg Gln

245 250 255

Gln Gln Gln Lys Arg Arg Ala Arg Asp Lys Gln Gln Lys Ser Val Ser

260 265 270

Val Ser Thr Val His

275

<210> 3

<211> 243

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

Met Gln Phe Arg Leu Phe Ser Phe Ala Leu Ile Ile Leu Asn Cys Met

1 5 10 15

Asp Tyr Ser His Cys Gln Gly Asn Arg Trp Arg Arg Ser Lys Arg Ala

20 25 30

Ser Tyr Val Ser Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys

35 40 45

Asp Asn Gly Cys Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg

50 55 60

Arg Glu Gly Met Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser

65 70 75 80

Gly Tyr Tyr Gly His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys

85 90 95

Arg Ile Glu Asn Cys Asp Ser Cys Phe Ser Lys Asp Phe Cys Thr Lys

100 105 110

Cys Lys Val Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys

115 120 125

Pro Asp Gly Phe Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly

130 135 140

Cys Glu Val Gly His Trp Ser Glu Trp Gly Thr Cys Ser Arg Asn Asn

145 150 155 160

Arg Thr Cys Gly Phe Lys Trp Gly Leu Glu Thr Arg Thr Arg Gln Ile

165 170 175

Val Lys Lys Pro Val Lys Asp Thr Ile Leu Cys Pro Thr Ile Ala Glu

180 185 190

Ser Arg Arg Cys Lys Met Thr Met Arg His Cys Pro Gly Gly Lys Arg

195 200 205

Thr Pro Lys Ala Lys Glu Lys Arg Asn Lys Lys Lys Lys Arg Lys Leu

210 215 220

Ile Glu Arg Ala Gln Glu Gln His Ser Val Phe Leu Ala Thr Asp Arg

225 230 235 240

Ala Asn Gln

<210> 4

<211> 243

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 4

Met Arg Phe Cys Leu Phe Ser Phe Ala Leu Ile Ile Leu Asn Cys Met

1 5 10 15

Asp Tyr Ser Gln Cys Gln Gly Asn Arg Trp Arg Arg Asn Lys Arg Ala

20 25 30

Ser Tyr Val Ser Asn Pro Ile Cys Lys Gly Cys Leu Ser Cys Ser Lys

35 40 45

Asp Asn Gly Cys Ser Arg Cys Gln Gln Lys Leu Phe Phe Phe Leu Arg

50 55 60

Arg Glu Gly Met Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser

65 70 75 80

Gly Tyr Tyr Gly His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys

85 90 95

Arg Ile Glu Asn Cys Asp Ser Cys Phe Ser Lys Asp Phe Cys Thr Lys

100 105 110

Cys Lys Val Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys

115 120 125

Pro Asp Gly Phe Ala Pro Leu Asp Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly

130 135 140

Cys Glu Val Gly His Trp Ser Glu Trp Gly Thr Cys Ser Arg Asn Asn

145 150 155 160

Arg Thr Cys Gly Phe Lys Trp Gly Leu Glu Thr Arg Thr Arg Gln Ile

165 170 175

Val Lys Lys Pro Ala Lys Asp Thr Ile Pro Cys Pro Thr Ile Ala Glu

180 185 190

Ser Arg Arg Cys Lys Met Ala Met Arg His Cys Pro Gly Gly Lys Arg

195 200 205

Thr Pro Lys Ala Lys Glu Lys Arg Asn Lys Lys Lys Arg Arg Lys Leu

210 215 220

Ile Glu Arg Ala Gln Glu Gln His Ser Val Phe Leu Ala Thr Asp Arg

225 230 235 240

Val Asn Gln

<210> 5

<211> 292

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 5

Met His Leu Arg Leu Ile Ser Trp Leu Phe Ile Ile Leu Asn Phe Met

1 5 10 15

Glu Tyr Ile Gly Ser Gln Asn Ala Ser Arg Gly Arg Arg Gln Arg Arg

20 25 30

Met His Pro Asn Val Ser Gln Gly Cys Gln Gly Gly Cys Ala Thr Cys

35 40 45

Ser Asp Tyr Asn Gly Cys Leu Ser Cys Lys Pro Arg Leu Phe Phe Ala

50 55 60

Leu Glu Arg Ile Gly Met Lys Gln Ile Gly Val Cys Leu Ser Ser Cys

65 70 75 80

Pro Ser Gly Tyr Tyr Gly Thr Arg Tyr Pro Asp Ile Asn Lys Cys Thr

85 90 95

Lys Cys Lys Ala Asp Cys Asp Thr Cys Phe Asn Lys Asn Phe Cys Thr

100 105 110

Lys Cys Lys Ser Gly Phe Tyr Leu His Leu Gly Lys Cys Leu Asp Asn

115 120 125

Cys Pro Glu Gly Leu Glu Ala Asn Asn His Thr Met Glu Cys Val Ser

130 135 140

Ile Val His Cys Glu Val Ser Glu Trp Asn Pro Trp Ser Pro Cys Thr

145 150 155 160

Lys Lys Gly Lys Thr Cys Gly Phe Lys Arg Gly Thr Glu Thr Arg Val

165 170 175

Arg Glu Ile Ile Gln His Pro Ser Ala Lys Gly Asn Leu Cys Pro Pro

180 185 190

Thr Asn Glu Thr Arg Lys Cys Thr Val Gln Arg Lys Lys Cys Gln Lys

195 200 205

Gly Glu Arg Gly Lys Lys Gly Arg Glu Arg Lys Arg Lys Lys Pro Asn

210 215 220

Lys Gly Glu Ser Lys Glu Ala Ile Pro Asp Ser Lys Ser Leu Glu Ser

225 230 235 240

Ser Lys Glu Ile Pro Glu Gln Arg Glu Asn Lys Gln Gln Gln Lys Lys

245 250 255

Arg Lys Val Gln Asp Lys Gln Lys Ser Gly Ile Glu Val Thr Leu Ala

260 265 270

Glu Gly Leu Thr Ser Val Ser Gln Arg Thr Gln Pro Thr Pro Cys Arg

275 280 285

Arg Arg Tyr Leu

290

<210> 6

<211> 176

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 6

Met Arg Gln Tyr Gly Glu Cys Leu His Ser Cys Pro Ser Gly Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly His Arg Ala Pro Asp Met Asn Arg Cys Ala Arg Cys Arg Ile Glu

20 25 30

Asn Cys Asp Ser Cys Phe Ser Lys Asp Phe Cys Thr Lys Cys Lys Val

35 40 45

Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro Asp Gly

50 55 60

Phe Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Glu Gly Cys Glu Val

65 70 75 80

Gly His Trp Ser Glu Trp Gly Thr Cys Ser Arg Asn Asn Arg Thr Cys

85 90 95

Gly Phe Lys Trp Gly Leu Glu Thr Arg Thr Arg Gln Ile Val Lys Lys

100 105 110

Pro Val Lys Asp Thr Ile Leu Cys Pro Thr Ile Ala Glu Ser Arg Arg

115 120 125

Cys Lys Met Thr Met Arg His Cys Pro Gly Gly Lys Arg Thr Pro Lys

130 135 140

Ala Lys Glu Lys Arg Asn Lys Lys Lys Lys Arg Lys Leu Ile Glu Arg

145 150 155 160

Ala Gln Glu Gln His Ser Val Phe Leu Ala Thr Asp Arg Ala Asn Gln

165 170 175

<210> 7

<211> 177

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

Phe Arg Leu Phe Ser Phe Ala Leu Ile Ile Leu Asn Cys Met Asp Tyr

1 5 10 15

Ser His Cys Gln Gly Asn Arg Trp Arg Arg Ser Lys Arg Gly Cys Arg

20 25 30

Ile Glu Asn Cys Asp Ser Cys Phe Ser Lys Asp Phe Cys Thr Lys Cys

35 40 45

Lys Val Gly Phe Tyr Leu His Arg Gly Arg Cys Phe Asp Glu Cys Pro

50 55 60

Asp Gly Phe Ala Pro Leu Glu Glu Thr Met Glu Cys Val Gly Cys Glu

65 70 75 80

Val Gly His Trp Ser Glu Trp Gly Thr Cys Ser Arg Asn Asn Arg Thr

85 90 95

Cys Gly Phe Lys Trp Gly Leu Glu Thr Arg Thr Arg Gln Ile Val Lys

100 105 110

Lys Pro Val Lys Asp Thr Ile Leu Cys Pro Thr Ile Ala Glu Ser Arg

115 120 125

Arg Cys Lys Met Thr Met Arg His Cys Pro Gly Gly Lys Arg Thr Pro

130 135 140

Lys Ala Lys Glu Lys Arg Asn Lys Lys Lys Lys Arg Lys Leu Ile Glu

145 150 155 160

Arg Ala Gln Glu Gln His Ser Val Phe Leu Ala Thr Asp Arg Ala Asn

165 170 175

Gln

<210> 8

<211> 567

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 8

atggacaacc tgggtgagac cttcctcagc ctggaggatg gcctggactc ttctgacacc 60

gctggtctgc tggcctcctg ggactggaaa agcagagcca ggcccttgga gctggtccag 120

gagtccccca ctcaaagcct ctccccagct ccttctctgg agtcctactc tgaggtcgca 180

ctgccctgcg ggcacagtgg ggccagcaca ggaggcagcg atggctacgg cagtcacgag 240

gctgccggct tagtcgagct ggattacagc atgttggctt ttcaacctcc ctatctacac 300

actgctggtg gcctcaaagg ccagaaaggc agcaaagtca agatgtctgt ccagcggaga 360

cggaaggcca gcgagagaga gaaactcagg atgcggacct tagccgatgc cctccacacg 420

ctccggaatt acctgccgcc tgtctacagc cagagaggcc aaccgctcac caagatccag 480

acactcaagt acaccatcaa gtacatcggg gaactcacag acctcctcaa cagcagcggg 540

agagagccca ggccacagag tgtgtga 567

<210> 9

<211> 582

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 9

atggacaacc tgcgcgagac tttcctcagc ctcgaggatg gcttgggctc ctctgacagc 60

cctggcctgc tgtcttcctg ggactggaag gacagggcag ggccctttga gctgaatcag 120

gcctccccct ctcagagcct ttccccggct ccatcgctgg aatcctattc ttcttctccc 180

tgtccagctg tggctgggct gccctgtgag cacggcgggg ccagcagtgg gggcagcgaa 240

ggctgcagtg tcggtggggc cagtggcctg gtagaggtgg actacaatat gttagctttc 300

cagcccaccc accttcaggg cggtggtggc cccaaggccc agaagggcac caaagtcagg 360

atgtctgtcc agcggaggcg gaaagccagc gagagggaga agctcaggat gaggaccttg 420

gcagatgccc tgcacaccct ccggaattac ctgccacctg tctacagcca gagaggccag 480

cctctcacca agatccagac actcaagtac accatcaagt acatcgggga actcacagac 540

ctccttaacc gcggcagaga gcccagagcc cagagcgcgt ga 582

<210> 10

<211> 232

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 10

Met Glu Arg Cys Pro Ser Leu Gly Val Thr Leu Tyr Ala Leu Val Val

1 5 10 15

Val Leu Gly Leu Arg Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gln His Tyr Leu His

20 25 30

Ile Arg Pro Ala Pro Ser Asp Asn Leu Pro Leu Val Asp Leu Ile Glu

35 40 45

His Pro Asp Pro Ile Phe Asp Pro Lys Glu Lys Asp Leu Asn Glu Thr

50 55 60

Leu Leu Arg Ser Leu Leu Gly Gly His Tyr Asp Pro Gly Phe Met Ala

65 70 75 80

Thr Ser Pro Pro Glu Asp Arg Pro Gly Gly Gly Gly Gly Pro Ala Gly

85 90 95

Gly Ala Glu Asp Leu Ala Glu Leu Asp Gln Leu Leu Arg Gln Arg Pro

100 105 110

Ser Gly Ala Met Pro Ser Glu Ile Lys Gly Leu Glu Phe Ser Glu Gly

115 120 125

Leu Ala Gln Gly Lys Lys Gln Arg Leu Ser Lys Lys Leu Arg Arg Lys

130 135 140

Leu Gln Met Trp Leu Trp Ser Gln Thr Phe Cys Pro Val Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Trp Asn Asp Leu Gly Ser Arg Phe Trp Pro Arg Tyr Val Lys Val Gly

165 170 175

Ser Cys Phe Ser Lys Arg Ser Cys Ser Val Pro Glu Gly Met Val Cys

180 185 190

Lys Pro Ser Lys Ser Val His Leu Thr Val Leu Arg Trp Arg Cys Gln

195 200 205

Arg Arg Gly Gly Gln Arg Cys Gly Trp Ile Pro Ile Gln Tyr Pro Ile

210 215 220

Ile Ser Glu Cys Lys Cys Ser Cys

225 230

<210> 11

<211> 232

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 11

Met Glu Arg Cys Pro Ser Leu Gly Val Thr Leu Tyr Ala Leu Val Val

1 5 10 15

Val Leu Gly Leu Arg Ala Thr Pro Ala Gly Gly Gln His Tyr Leu His

20 25 30

Ile Arg Pro Ala Pro Ser Asp Asn Leu Pro Leu Val Asp Leu Ile Glu

35 40 45

His Pro Asp Pro Ile Phe Asp Pro Lys Glu Lys Asp Leu Asn Glu Thr

50 55 60

Leu Leu Arg Ser Leu Leu Gly Gly His Tyr Asp Pro Gly Phe Met Ala

65 70 75 80

Thr Ser Pro Pro Glu Asp Arg Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ala Gly

85 90 95

Gly Ala Glu Asp Leu Ala Glu Leu Asp Gln Leu Leu Arg Gln Arg Pro

100 105 110

Ser Gly Ala Met Pro Ser Glu Ile Lys Gly Leu Glu Phe Ser Glu Gly

115 120 125

Leu Ala Gln Gly Lys Lys Gln Arg Leu Ser Lys Lys Leu Arg Arg Lys

130 135 140

Leu Gln Met Trp Leu Trp Ser Gln Thr Phe Cys Pro Val Leu Tyr Ala

145 150 155 160

Trp Asn Asp Leu Gly Ser Arg Phe Trp Pro Arg Tyr Val Lys Val Gly

165 170 175

Ser Cys Phe Ser Lys Arg Ser Cys Ser Val Pro Glu Gly Met Val Cys

180 185 190

Lys Pro Ser Lys Ser Val His Leu Thr Val Leu Arg Trp Arg Cys Gln

195 200 205

Arg Arg Gly Gly Gln Arg Cys Gly Trp Ile Pro Ile Gln Tyr Pro Ile

210 215 220

Ile Ser Glu Cys Lys Cys Ser Cys

225 230

<210> 12

<211> 53

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 12

Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His

1 5 10 15

Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn

20 25 30

Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys

35 40 45

Trp Trp Glu Leu Arg

50

<210> 13

<211> 307

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 13

Met Gly Gly Leu Thr Ala Ser Asp Val His Pro Thr Leu Gly Val Gln

1 5 10 15

Leu Phe Ser Ala Gly Ile Ala Ala Cys Leu Ala Asp Val Ile Thr Phe

20 25 30

Pro Leu Asp Thr Ala Lys Val Arg Leu Gln Val Gln Gly Glu Cys Pro

35 40 45

Thr Ser Ser Val Ile Arg Tyr Lys Gly Val Leu Gly Thr Ile Thr Ala

50 55 60

Val Val Lys Thr Glu Gly Arg Met Lys Leu Tyr Ser Gly Leu Pro Ala

65 70 75 80

Gly Leu Gln Arg Gln Ile Ser Ser Ala Ser Leu Arg Ile Gly Leu Tyr

85 90 95

Asp Thr Val Gln Glu Phe Leu Thr Ala Gly Lys Glu Thr Ala Pro Ser

100 105 110

Leu Gly Ser Lys Ile Leu Ala Gly Leu Thr Thr Gly Gly Val Ala Val

115 120 125

Phe Ile Gly Gln Pro Thr Glu Val Val Lys Val Arg Leu Gln Ala Gln

130 135 140

Ser His Leu His Gly Ile Lys Pro Arg Tyr Thr Gly Thr Tyr Asn Ala

145 150 155 160

Tyr Arg Ile Ile Ala Thr Thr Glu Gly Leu Thr Gly Leu Trp Lys Gly

165 170 175

Thr Thr Pro Asn Leu Met Arg Ser Val Ile Ile Asn Cys Thr Glu Leu

180 185 190

Val Thr Tyr Asp Leu Met Lys Glu Ala Phe Val Lys Asn Asn Ile Leu

195 200 205

Ala Asp Asp Val Pro Cys His Leu Val Ser Ala Leu Ile Ala Gly Phe

210 215 220

Cys Ala Thr Ala Met Ser Ser Pro Val Asp Val Val Lys Thr Arg Phe

225 230 235 240

Ile Asn Ser Pro Pro Gly Gln Tyr Lys Ser Val Pro Asn Cys Ala Met

245 250 255

Lys Val Phe Thr Asn Glu Gly Pro Thr Ala Phe Phe Lys Gly Leu Val

260 265 270

Pro Ser Phe Leu Arg Leu Gly Ser Trp Asn Val Ile Met Phe Val Cys

275 280 285

Phe Glu Gln Leu Lys Arg Glu Leu Ser Lys Ser Arg Gln Thr Met Asp

290 295 300

Cys Ala Thr

305

Claims (14)

1.用于制备BAP细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在包含Wnt信号通路的激活剂的培养基中培养多潜能细胞以获得诱导的轴旁中胚层祖细胞(iPAM)，

b)在肌原性培养基中培养所述iPAM细胞，

c)可选地，在具有血清或其等价物，可选地还包含FGF2或其等价物的培养基中，进一步培养在步骤b)结束时所获得的细胞，

d)通过将在步骤b)或c)结束时所获得的细胞传代并将它们接种到培养皿中来选择BAP细胞。

2.用于制备BA细胞的方法，优选地根据权利要求1所述的方法，所述方法包括以下步骤：

优选地如权利要求1中所定义的步骤a)，步骤b)，可选的步骤c)和步骤d)，并且还包括以下步骤：

e)将所选择的BAP细胞，优选地在步骤d)结束时可获得的那些细胞在包含血清或其等价物的成脂培养基中培养，从而获得BA细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在还包含骨形态发生通路(BMP)信号通路的抑制剂和可选地DMSO的培养基中实施步骤a)。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中：

a)Wnt信号通路是典型的Wnt/β连环蛋白信号通路和/或Wnt/PCP信号通路，

b)BMP信号通路的抑制剂选自：Noggin、腱蛋白、腱蛋白样蛋白1-3、卵泡抑素、卵泡抑素样蛋白1-5、Dan家族成员及其变体和片段。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中使用包含培养基、血清或其等价物、BMP受体抑制剂、c-MET受体激活剂和IGF或胰岛素受体激活剂或者由其组成或基本由其组成的肌原性培养基实施步骤b)。

6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中使用包含培养基、TGFβ/活化素/NODAL通路抑制剂(优选地SB431542)、EGF(表皮生长因子)受体激活剂(优选地，EGF)、抗坏血酸和类皮质激素受体激活剂(优选地氢化可的松)或基本由其组成的成脂培养基实施步骤e)。

7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中BA细胞的特征在于UCP1的表达。

8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中BAP细胞的特征在于它们转化为表达UCP1的BA细胞的能力。

9.通过根据权利要求2至7中任一项所述的方法可获得的BA细胞群体，包含至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的表达UCP1的细胞。

10.通过根据权利要求1、3、4、5、8中任一项所述的方法可获得的BAP细胞群体，其特征在于所述群体转化为如权利要求9中所定义的BA细胞群体的能力。

11.根据权利要求9或10所述的BAP或BA细胞群体，用于作为药剂使用。

12.组合物，其包含根据权利要求9至11中任一项所述的BAP或BA细胞群体，优选地其中所述组合物是药物组合物。

13.根据权利要求11所述的BAP或BA细胞群体，其中所述药剂用于治疗与BA或BAP细胞活性有关的疾病或病况，并且所述疾病或病况优选地为代谢疾病或病况，如肥胖症相关病变、代谢综合征、糖尿病、高脂血症、NASH(非酒精性脂肪性肝炎)、能量平衡(摄入相对于消耗)。

14.如权利要求9或10中所定义的BAP或BA细胞群体用于筛选目的的应用。

Images