KR20210040107A - 간-담도-췌장 조직 및 이를 제조하는 방법 - Google Patents

간-담도-췌장 조직 및 이를 제조하는 방법 Download PDF

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KR20210040107A
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다카노리 다케베
히로유키 고이케
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칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터
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Abstract

간-담도-췌장 오가노이드("HBPO" 또는 "HBP 오가노이드") 조성물, 및 간-담도-췌장 오가노이드 조성물을 제조하고 사용하는 방법이 본원에 개시된다. 개시된 조성물은 간 조직 기능, 담도 조직 기능, 외분비 췌장 기능 및 내분비 췌장 조직 기능으로부터 선택된 둘 이상의 기능을 가질 수 있다. 간-담도-췌장 오가노이드 조성물을 사용하여 개개인을 치료하는 방법이 또한 개시된다.

Description

간-담도-췌장 조직 및 이를 제조하는 방법
관련 출원의 교차 참조
이 출원은 2019년 7월 26일에 출원된 발명의 명칭이 "인간에서 전장-중장 경계로부터의 간-담도-췌장 기관형성 모델링"인 62/703,559의 우선권 및 이익을 주장하며, 이는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
기관형성은 다수의 경계 조직 상호작용에 의해 조정된, 복잡하고 상호-연결된 과정이다1-7. 그러나, 현재까지, 개별의 인접한 구성요소가 통합된 다중-기관 구조를 확립하기 위해 어떻게 조정되는지는 명확하지 않다. 따라서, 줄기 세포 배양에서 다중-기관 통합은 중요한 충족되지 않은 과제였다. 특히, 하나 이상의 조직 유형을 갖는 구조적으로 그리고 기능적으로 통합된 오가노이드를 얻는 것은 당업계에서 충족되지 않은 요구이다. 보다 구체적으로, 간-담도-췌장(HBP) 시스템의 패턴화 및 균형잡힌 기관형성은 기술적 복잡성으로 인해 조직 배양에서 성공적으로 모델링되지 않아, 상세한 기계적 연구를 방해한다16,17. 본 개시내용은 당업계에서 전술한 요구들 중 하나 이상을 다루는 것을 추구한다.
간-담도-췌장 오가노이드("HBPO" 또는 "HBP 오가노이드") 조성물, 및 간-담도-췌장 오가노이드 조성물을 제조하고 사용하는 방법이 본원에 개시된다. 개시된 조성물은 간 조직 기능, 담도 조직 기능, 외분비 췌장 기능 및 내분비 췌장 조직 기능으로부터 선택된 둘 이상의 기능을 가질 수 있다. 간-담도-췌장 오가노이드 조성물을 사용하여 개개인을 치료하는 방법이 또한 개시된다.
당업자는 아래에 설명된 도면은 단지 예시를 위한 것임을 이해할 것이다. 도면은 어떤 식으로든 본 교시의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
도 1a 내지 도 1g. 경계 오가노이드는 다중-내배엽 도메인을 생성한다. 1a. iPSC로부터 간-담도-췌장(HBP) 오가노이드("HBPO")를 확립하기 위한 개략도. 인간 PSC는 전방 또는 후방 장 세포로 분화되었다. 세포는 단일 세포로 해리되고 재응집되어 전방/후방 장 스페로이드를 형성하고, 전방-후방 경계 오가노이드가 매트리겔(Matrigel)에서 생성되었다. 매트리겔 포매는 다중-기관 사양 및 경계 오가노이드로부터 함입을 개시했다. 1b. SOX2+ 전방 및 CDX2+ 후방 장 스페로이드의 융합을 통한 경계 오가노이드의 생성. SOX2 및 CDX2 발현은 레드인 SOX2, 그린인 CDX2 및 화이트인 DAPI에 대한 온조직표본 면역염색, 유입구 번호로 표시된 각 모집단의 백분율에 대한 유동세포분석법, 및 qPCR에 의해 확인되었다. 데이터는 평균 ± s.d.이고; n = 3 독립적인 실험이다. 짝이 없는 양측 스튜던트 t-검정. 1c. 8일차부터 11일차까지 인간 iPSC 유래 전방 및 후방 오가노이드 혼합물의 추적. 상단 열: 명 시야. 중간 역: 레드인 SOX2, 그린인 PDX1, 블루인 CDX2 및 화이트인 DAPI에 대한 온조직표본 면역염색. 하단 열: 블루인 CDX2, 그린인 HHEX, 레드인 PDX1, 화이트인 DAPI에 대한 온조직표본 면역염색. 화살표: PDX1 및 HHEX 양성 영역. 1d. PDX1에 대해 염색된 경계 오가노이드 면역형광의 각 영역에서 검출된 PDX1 양성 세포의 빈도. 1e. 각 경계 오가노이드에서 PDX1 양성 세포의 위치. Y 축은 DAPI 염색된 총 세포 수와 비교하여 각 영역에서 PDX1 양성 세포의 백분율을 나타냈다. f. 11일차에서 전방-후방(AP)(n = 4), 전방-전방(AA)(n = 3) 및 후방-후방(PP)(n = 3)인, 다양한 조합에서 융합된 오가노이드에 대한 HHEX 및 PDX1 양성 세포의 백분율. Y 축은 DAPI 염색된 총 세포 수와 비교하여 양성 세포의 백분율을 나타냈다. 데이터는 평균 ± s.d.이다. *P<0.05, **P<0.01; 일원 ANOVA.g. 8일차(D8)부터 12일차(D12)까지 시간 경과에 따른 경계 오가노이드의 전사학적 특성화. 전방(A), 경계(B) 및 후방(P) 도메인은 왼쪽 대표 이미지에 지시된 대로 RNA 시퀀싱을 위해 해부, 분리 및 적용되었다(전방 장 스페로이드는 GFP에 의해 표지되었고 후방 장 스페로이드는 RFP에 의해 표지되었다). 전방, 경계 및 후방 도메인은 각각 보고된31,32 전방 전장, 간/담도/췌장 원기 및 중간/후장 마커의 유전자-세트의 농후화를 나타냈다. 스케일 바, 50 μm(1b), 100 μm(1c), 50 μm(1g).
도 2a 내지 도 2i. 유도 인자 없이 경계 오가노이드로부터 간-담도-췌장 전구세포의 자가-출현. 2a. CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템에 의한 PROX1-tdTomato 리포터 라인 생성. 2b. 9일차부터 11일차까지 확립된 PROX1 리포터 iPSC에서 PROX1-tdTomato 발현. 2c. 각 오가노이드에서 PROX1-tdTomato 양성 영역. AP, AA 및 PP 조합이 평가되었다. tdTomato 발현은 AP 조합에서 경계 오가노이드의 세포막에서 확인되었다. 2d. 마우스 간 원시 외식편(Prox1::GFP) 및 인간 iPSC-유래 경계 오가노이드(PROX1::m-tdTomato)에서의 간 함입. 2e. 13일차에 E8.75 마우스 배아 및 경계 오가노이드에서 PROX1의 면역염색. 2f. 경계 오가노이드의 전사학적 특성화. 전방, 경계 및 후방 도메인을 RNA 시퀀싱을 위해 해부하고 분리하고 적용했다. 히트맵은 GO 용어 범주 및 KEGG 경로 범주에서 선택된 FGF, BMP, Hedgehog, NOTCH 및 RA 신호 경로와 관련된 하류 유전자 발현을 나타낸다. 히트맵은 편향되지 않은 계층적 클러스터링에 의해 8개 세부 그룹(C1 ― C8)으로 분리되었다. B에서 고도로 발현된 유전자의 고유한 발현 패턴을 보여준 C6은 다른 것들에 비해 RA 하류 유전자-세트의 농후화를 나타낸다. 2g. 레티노산, BMS493, R-75251 또는 WIN18446의 3일 배양으로 11일차에 HHEX, PDX1, SOX2 및 CDX2의 유전자 발현. 2h. 원래의 전방 또는 후방 장 스페로이드로부터 상피 또는 간엽 세포에서 RA 신호 경로 관련 유전자에 대한 유전자 발현 분석. 각 장 스페로이드는 RFP 또는 GFP 표지된 iPSC를 사용하여 분화되었고 경계 형성 후 단일 세포로 해리되었다. 전방/후방 분리는 RFP 또는 GFP 발현에 의해 수행된 반면, 상피/간엽 분리는 EpCAM 발현에 의해 수행되었다. 2i. 이식된 경계 오가노이드의 디폴트 발달 잠재력. 중간 패널은 H&E 염색 및 면역조직화학분석을 보여주는 반면 오른쪽 패널은 면역형광 분석을 보여준다. 스케일 바, 50 μm(2b), 200 μm(2d), 100 μm(2e), 100 μm(2i).
도 3a 내지 도 3o. 인간 간-담도-췌장 기관형성 모델링. 3a. HBP 오가노이드로부터 PROX1 양성 영역의 해부 및 해부 전/후의 이미지의 예시. 3b. 1) 플로팅, 2) 매트리겔 안으로 포매, 3) 매트리겔 안으로 포매 및 D13, 4)에서 트랜스웰(Transwell)과 함께 배양한 배양된 시스템의 최적화. 해부하고 매트리겔 안으로 포매하고 D13부터 트랜스웰과 함께 배양했다. 왼쪽 패널은 함입 또는 분기 오가노이드의 분류를 보여준다. 3c. 13일차부터 2일에 걸쳐 경계 오가노이드의 형태형성. 3d. 30일의 공기-액체 계면 배양 시스템을 통해 경계 오가노이드로부터 PROX1 해부된 조직의 형태형성의 변화. 3e. 37일차 오가노이드의 입체현미경 이미지. 3f. 경계 오가노이드는 배양된 마우스 E10.5 유래 간-담도-췌장에 유사한, 추정 췌장 도메인에 대해 분기된 간담도 조직을 발현하는 tdTomato를 갖는다. 왼쪽: 4일 동안 배양된 마우스 배아 조직, 오른쪽: 90일차에 PROX1-tdTomato 리포터 iPSC. 3g. 오른쪽: 장과 연결된 함입 간, 담관 및 췌장의 예시. 왼쪽: D90 경계 조직에서 H&E. 3h 내지 3i. CK19, PDX1, PROX1, SOX9 및 NGN3, 그리고 알파 -SMA 및 SOX17(3h) 및 AFP, EpCAM 그리고 알파 -SMA(3i)의 조합에 대한 면역염색. 3j, 3ka. PDX1, NKX6.1 및 GATA4, DBA, PDX1 및 PROX1(3ka)의 온조직표본 염색. 3l 내지 3n. NKX6.1 및 HNF1B(3l), 아밀라제 및 GATA4(3m) 및 아밀라제 및 CCKAR(3n)의 면역염색. 3o. 추정 담도 구조에서 CCK 치료 반응. 3p. 외분비 췌장 도메인의 호르몬 유도 분비 기능. 3일 전후의 경계 조직에서 아밀라제의 효소-연결 면역흡착 분석- CCK. 스케일 바, 100 μm(3a), 100 μm(3b), 100 μm(3c), 200 μm(3d), 1 mm(3e), 200 μm(3f), 200 μm(3g), 200 μm(3h), 200 μm(3i), 200 μm(3j), 100 μm(3kb), 200 μm(3l), 100 μm(3m), 500 μm(3n), 50 μm(3o).
도 4a 내지 도 4j. HBP 오가노이드에서 HES1-매개 기관 분리 오류 모델링. 4a. CRISPR-Cas9 시스템에 의한 HES1 녹 아웃(KO) 라인에 대한 유전자 표적화 전략. 4b. WT 및 HES1KO(Del #11)의 변형된 유전자 서열의 확인 4c. HES1-/-iPSC 배양의 사진 4d. 20일차에 HES1 KO iPSC-유래 경계 오가노이드에서 HES1의 유전자 발현. 4e. SOX2, CDX2, PDX1 및 HHES의 온조직표본 면역염색에 의한 HES1-/-iPS 라인으로부터 경계 오가노이드 형성의 확인. 간-담도-췌장 전구체 사양은 HES1 돌연변이의 존재에서도 보존되었다. 4f. D11에서 HES1+/+ 및 HES1-/-에서 생성된 전방 및 후방 경계 스페로이드에서 PROX1-tdTomato 발현. 4g. HES1+/+ 및 HES1-/- HBP 오가노이드의 22일차에 췌장 관련 마커의 RNAseq. 4h. HES1+/+, HES1-/- 오가노이드 및 인간 성인 췌장 조직에서 GCG, NEUROG3, INS 및 NKX2-2의 유전자 발현. 4i. HES1+/+ 및 HES1-/-의 경계 조직의 육안 관찰. 4j. DBA 및 PDX1에 대한 온조직표본 면역염색은 HES1 KO 오가노이드에서 향상된 PDX1 발현 및 감소된 DBA 염색 영역을 나타낸다. 스케일 바, 500 μm(4c), 200 μm(4e), 100 μm(4f), 500 μm(4i), 500 μm(4j).
도 5. 전방 및 후방 장 세포 특성화. TkDA 인간 iPSC 및 72_3 인간 iPSC를 사용하여 7일차 전방 및 후방 장 세포에서 EpCAM의 유세포 분석.
도 6a 내지 도 6b 경계 오가노이드 형성의 재현성. 6a. D11 경계 오가노이드의 이미지. 전방 및 후방 장 스페로이드는 H1 ESC 또는 1383D6 iPSC로부터 분화되고 혼합되고 매트리겔 안으로 이전되었다. 스케일 바는 200 μm이다. 6b. H1ESC로부터 유래된 경계 스페로이드에서 CDX2, 상피 마커 ECAD 및 HHEX의 면역형광 염색. 6c. 72_3 iPS에서 유래된 경계 스페로이드에서 PDX1, CDX2, FOXF1 및 HHEX의 면역형광 염색.
도 7a 내지 도 7b 세포-세포 접촉 의존성 HBP 유전자 유도. 7a. 전방 및 후방 장 스페로이드는 D8에 혼합되고 다음날 D9에 융합되고, 배양되고 정량적 RT-PCR을 위해 D12에서 수집되었다. 융합되지 않은 스페로이드도 비교를 위해 D12에서 수집되었다. 7b. 융합된, 융합되지 않은, 후방 장 스페로이드(8일차) 및 iPS 세포의 조건에서 PDX1 및 HHEX 유전자 발현.
도 8 상이한 전방 및 후방 장 조합의 비교. D12에서 AP, AA 및 PP 스페로이드의 조합에서 CDX2, HHEX 및 PDX1의 면역형광 염색. 스케일 바는 200 μm이다.
도 9a 내지 도 9c. HBP 전구세포는 후방 장 세포로부터 전개한다. 9a. 비 표지 iPS 세포는 전방 장 스페로이드로 분화되는 반면 AAVS1-GFP 표지된 iPS 세포는 후방 장 스페로이드로 분화되었다. 상단 컬럼은 경계 오가노이드 형성 중에 명 시야와 GFP 형광 이미지를 나타냈다. 하단 컬럼은 13일차에 HHEX 및 PDX1에 대한 온조직표본 면역염색을 나타냈다. HHEX 발현은 GFP 발현과 중첩되었다. 스케일 바는 200 μm이다. 9b. H2B-GFP 표지 및 표지되지 않은 PROX1-tdTomato 리포터 iPSC는 각각 전방 및 후방 장 스페로이드로 분화되었다. tdTomato 발현은 표지되지 않은 원래의 후방 장 스페로이드에서만 검출되었다. 스케일 바는 200 μm이다. 9c. 표지되지 않은 iPSC 및 PROX1-tdTomato 리포터 iPSC를 사용하여 전방 및 후방 장 스페로이드가 분화되었다. 2개의 조합, 리포터 세포 유래 전방 및 표지되지 않은 세포 후방(왼쪽 컬럼) 또는 표지되지 않은 세포 유래 전방 및 리포터 세포 유래 후방 장 스페로이드(오른쪽 컬럼)는 tdTomato 발현에 의해 조사되었다. 상단 열: 명 시야 이미지, 하단 열: tdTomato 형광 이미지. 스케일 바는 200 μm이다.
도 10. 후방 장 특이적 BMS493에서 HHEX 및 PDX1 유도의 폐지. BMS493 전처리된 전방 또는 후방 장 스페로이드는 융합되어 HBP anlage 형성을 유도하였다. 처리되지 않은 대조군과 비교하여, BMS493 전처리된 후방 장 스페로이드의 군은 경계에서 HHEX 및 PDX1 발현을 억제하였으며, 이는 후방 측면에서 레티노산 수용체 기능이 HBP 경계 오가노이드를 확립하는 데 중요하였다는 것을 시사한다. 스케일 바: 200 μm
도 11a 및 도 11b. E9.0 PROX1::GFP 리포터 마우스 배아 외식편 배양으로 BMS493 노출에 의한 PROX1 억제. 배아의 9.0일차 Prox1-GFP 전체 배아는 회전자-유형 병 배양 시스템에서 24시간 동안 배양되었다. 레티노산 수용체 길항제 BMS493 처리군은 대조군(DMSO 첨가)과 비교되었다. 11a. 배양 후 배아에 대한 명 시야 이미지 및 GFP 형광 이미지. 11b. GFP 발현 부분의 영역은 (a)에서 GFP 이미지로부터 정량화되었다. 스케일 바: 1 mm
도 12 시험관내 배양 시스템의 최적화. 도 3a 내지 도 3c에서, PROX1 양성 HBP 전구체 영역의 함입 및 분지 형태형성과 같은 형태학적 변화를 향상시키기 위해 다양한 배양 포맷이 비교되었다. D7에서, 전방 및 후방 장 스페로이드가 혼합되고 24시간-배양 후 연결되었다. 연결된 스페로이드는 매트리겔 드롭 또는 낮은 결합 배양 플레이트로 이전되어 HBP 전구체 출현 동안 비-부유 상태와 부유 상태 사이에서 비교되었다. 매트리겔 포매된 군의 오가노이드는 D11에서 tdTomato를 발현하기 시작했다. tdTomato 양성 영역은 형광 발현에 따라 현미경 하에서 수동 절개되고 다시 매트리겔 드롭 또는 트랜스웰로 이전되어 배지에서 다양한 작용제 및 길항제의 효과를 비교했다.
도 13. 오가노이드 크기, PROX1 양성 영역, 분기 및 함입의 비교. 단지 AP 조합만이 오가노이드와 PROX1 발현 영역의 크기를 증가시켰다. 더욱이, AP 조합은 분기와 함입이 있는 스페로이드를 나타낸 반면 다른 두 조합은 그렇지 않았다. 스케일 바: 500 μm
도 14. HBP 오가노이드의 후방 영역으로부터 분지 및 함입 실패. HBP 오가노이드는 Prox1 발현 분지 구조를 형성한 반면, PDX1 발현을 함유하는 HBP의 후방 영역은 그 구조를 형성하지 않았다. 스케일 바는 200 μm이다.
도 15a 내지 도 15c. HBP 오가노이드에서 기관 도메인-특이적 마커의 발현. 15a. 30일차에 AFP, 알부민 및 HHEX의 면역형광 염색. AFP 및 알부민은 HHEX가 아닌 동일한 영역에서 발현되었다. HHEX는 간세포 전구세포 마커였으며 이는 후기 단계에서 발현이 사라지는 결과를 초래한다. 15b. NKX6.1, NKX6.3 및 PDX1의 면역형광 염색. NKx6.3은 췌장 마커 PDX1 및 NKX6.1 발현의 영역에서 발현되었다. 15c. EpCAM, PROX1, SOX9 및 CLF의 면역형광 염색. 스케일 바: 100 μm
도 16. 췌장 관련 유전자는 HES-/- 오가노이드에서 상향조절되었다. HES1+/+ 및 HES1-/- HBP 오가노이드의 22일차에서 췌장 관련 마커의 RNAseq. 이것은 도 4g와 관련된다.
도 17. 장기 배양된 오가노이드의 연결된 구조. HES1-/- 및 HES1+/+ 오가노이드에서 DBA 및 SOX9의 온조직표본 염색. DBA 및 SOX9는 HES1-/- 오가노이드에서 사라졌다. 스케일 바: 200 μm.
정의
달리 언급되지 않는 한, 용어는 관련 기술 분야의 통상인에 의해 통상적인 사용법에 따라 이해되어야 한다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 문서가 우선한다. 바람직한 방법 및 물질이 아래에 설명되지만, 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고로 포함된다. 본원에 개시된 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시이고 제한하려는 의도가 아니다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "and" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 다수의 이러한 방법을 포함하고 "용량"에 대한 언급은 당업자에게 공지된 하나 이상의 용량 및 이의 등가물에 대한 언급 등을 포함한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오류 범위 내를 의미하며, 이는 값이 측정 또는 결정되는 방법, 예를 들어, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계의 실행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 또는 최대 10%, 또는 최대 5%, 또는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 값의 어느 정도의 크기 이내, 바람직하게는 5-배 이내, 더욱 바람직하게는 2-배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기술되어 있는 경우, 달리 언급되지 않는 한 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용 가능한 오류 범위 내를 의미한다고 가정해야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "확정 내배엽(DE) 세포"는 낭배형성의 과정에 의해 생성된 3개의 1차 생식 층 중 하나를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "wnt 신호전달 경로"는 wnt/베타-카테닌 경로를 의미하고 베타-카테닌 단백질을 통해 작용하는 Wnt 리간드 및 주름진 세포 표면 수용체에 의해 매개되는 신호전달 경로이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 경로, 예컨대 "wnt 경로"와 관련하여 용어 "활성제"는 Wnt/베타-카테닌 표적이 증가되도록 Wnt/베타-카테닌 경로를 활성화하는 물질을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "FGF 신호전달 경로 활성화제"는 FGF 표적이 증가되도록 FGF 경로를 활성화하는 물질을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "BMP 신호전달 경로 억제제"는 BMP 경로를 방해하고 BMP 표적을 감소시키는 물질이다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "성장 인자"는 성장, 증식, 형태형성 또는 분화를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포 과정을 자극할 수 있는 물질을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 마커의 "안정적인 발현"이라는 용어는 성장 환경의 변화에 따라 변하지 않는 발현을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "분화전능성 줄기 세포"(전능성 줄기 세포로도 알려짐)는 배아 및 배아-외 세포 유형으로 분화할 수 있는 줄기 세포이다. 이러한 세포는 완전하고 생존가능한 유기체를 구성할 수 있다. 이 세포는 난자와 정자 세포의 융합으로부터 생성된다. 수정란의 처음 몇 부분에 의해 생성된 세포도 분화전능성이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 일반적으로 PS 세포로 알려진 용어 "다능성 줄기 세포(PSC)"는 거의 모든 세포로 분화할 수 있는 임의의 세포, 즉 내배엽(위 내벽, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 뼈, 혈액, 비뇨 생식기) 및 외배엽(표피 조직 및 신경계)을 포함하는 세 가지 생식 층(배아 상피) 중 어느 것에서 유래된 세포를 포괄한다. PSC는 배아(배아 생식 세포 포함)에서 유래되거나 특정 유전자의 발현을 강제함으로써 성인 체세포와 같은 비-다능성 세포의 유도를 통해 얻어진 분화전능성 세포의 후손일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 일반적으로 iPS 세포로도 약칭된, 용어 "유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)"는 정상적으로 특정 유전자의 "강제된" 발현에 의해 비-다능성 세포, 예컨대 성체 체세포로부터 인위적으로 유도된 다능성 줄기 세포의 유형을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "전구체 세포"는 이를 통해 하나 이상의 전구체 세포가 스스로 재생하거나 하나 이상의 특화된 세포 유형으로 분화하는 능력을 획득하는, 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있는 임의의 세포를 포괄한다. 일부 양태에서, 전구체 세포는 다능성이거나 다능성이 되는 능력을 갖는다. 일부 양태에서, 전구체 세포는 다능성을 획득하기 위해 외부 인자(예를 들어, 성장 인자)의 처리를 받는다. 일부 양태에서, 전구체 세포는 분화전능성 줄기 세포; 다능성 줄기 세포(유도 또는 비-유도된 것); 다중능 줄기 세포; 및 단일능 줄기 세포일 수 있다. 일부 양태에서, 전구체 세포는 배아, 유아, 아동 또는 성인으로부터 유래할 수 있다. 일부 양태에서, 전구체 세포는 유전적 조작 또는 단백질/펩타이드 처리를 통해 분화다능성이 부여되도록 처리된 체세포일 수 있다.
발달 생물학에서 세포 분화는 덜 특화된 세포가 보다 특화된 세포 유형이 되는 과정이다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 "지향된 분화"는 덜 특화된 세포가 특정 특화된 표적 세포 유형이 되는 과정을 기술한다. 특화된 표적 세포 유형의 특이성은 초기 세포의 운명을 한정하거나 변경하는 데 사용될 수 있는 모든 적용가능한 방법에 의해 결정될 수 있다. 예시적인 방법은 유전자 조작, 화학적 처리, 단백질 처리 및 핵산 처리를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
간-담도-췌장 오가노이드("HBPO" 또는 "HBP 오가노이드") 조성물이 본원에 개시된다. 개시된 HBPO 조성물은 일부 양태에서 간 조직 기능, 담도 조직 기능, 외분비 췌장 기능 및 내분비 췌장 조직 기능으로부터 선택된 둘 이상의 기능을 가질 수 있다. 일 양태에서, 본원에 개시된 HBPO는 "다중-기관 3-차원 오가노이드"로 상호교환적으로 지칭될 수 있고 전방 영역, 후방 영역 및 경계 영역을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 경계 영역은 췌장 및 십이지장 호메오박스 1(PDX1) 및 혈액생성과 관련하여-발현된 호메오박스 단백질(HHEX)을 발현할 수 있다. 일 양태에서, HBPO는 담관 조직 및 췌장 조직을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 담관 조직과 췌장 조직은 HBPO에서 연결될 수 있다. 일 양태에서, HBPO는 간 세포, 췌장 세포, 담관 세포 및 장 세포를 포함할 수 있다.
일 양태에서, HBPO는 내피 세포, 간엽 세포, 또는 내피 세포와 간엽 세포 둘 모두를 포함할 수 있다. HBPO는 특정 양태에서 내배엽 및 중배엽을 포함할 수 있다.
개시된 HBPO는, 예를 들어, 본원에서 상응하는 도면에 도시된 바와 같이 분지형 구조를 특징으로 할 수 있다.
일 양태에서, 본원에 개시된 HBPO는 기능적 외분비 마커의 발현을 특징으로 할 수 있다. 일 양태에서, 마커는 아밀라아제일 수 있다. 일 양태에서, 마커는 내분비 마커, 예를 들어 인슐린일 수 있다.
특정 양태에서, 본원에 개시된 HBPO는 외인성으로 투여된 제제에 대한 기능적 반응을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 일 양태에서 HBPO는 콜레시스토키닌(CCK)과의 접촉에 반응하여 아밀라제를 분비할 수 있다.
특정 양태에서, 개시된 HBPO는 HBPO가 점막하 선, 전이 구역, 혈관계, 면역 세포 또는 점막하 층 중 하나 이상이 실질적으로 없을 수 있음을 특징으로 할 수 있다. 이러한 특징은 3-차원 오가노이드 구조를 인간 또는 다른 포유류에서 내생적으로 발견되는 천연 조직의 구조와 구별한다.
일 양태에서, HBPO는 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 전구체 세포, 예를 들어 개체로부터 수득된 iPSC의 확장에 의해 수득된다.
또한 간-담도-췌장 오가노이드("HBPO" 또는 "HBP 오가노이드")의 제조 방법이 본원에 개시된다. 이 양태에서, 방법은 제1 확정 내배엽을 Wnt 신호전달 경로 활성화제, FGF 신호전달 경로 활성화제 및 BMP 신호전달 경로 억제제와 접촉시켜 전방 장 스페로이드를 형성하는 단계; 제2 확정 내배엽을 Wnt 신호전달 경로 활성화제 및 FGF 신호전달 경로 활성화제와 접촉시켜 후방 장 스페로이드를 형성하는 단계; 전방 장 스페로이드와 후방 장 스페로이드가 융합되어 전장-중장 경계를 갖는 경계 오가노이드를 형성할 때까지 전방 장 스페로이드를 후방 장 스페로이드와 접촉시키는 단계; 및 전장-중장 경계를 갖는 경계 오가노이드를 배양하여 HBPO를 형성하는 단계를 포함할 수 있으며; 여기서 상기 HBPO는 담도 조직 및 췌장 조직을 포함한다.(예를 들어, 도 12 참조) 일 양태에서, 개시된 방법은 간 조직, 췌장 조직, 담관 조직 및 장 조직을 포함할 수 있는 HBPO의 생산을 허용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 간-담도-췌장 오가노이드("HBPO" 또는 "HBP 오가노이드")는 일반적으로 다수-기관 도메인(간, 담즙 및 췌장 기관 도메인)이 분리되는 단계의 오가노이드를 지칭하며, 일반적으로 D30 경에 발생한다. 용어 "경계 오가노이드"와 관련하여, 이는 아직 조직 사양이 없는 오가노이드 조성물을 포함하는 D7 이후 오가노이드를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 전방 장 스페로이드는 SRY- 박스 2(SOX2)를 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 전방 장 스페로이드는 SRY-box 2(SOX2) 발현을 특징으로 할 수 있다. 일 양태에서, 전방 장 스페로이드에는 췌장 및 십이지장 호메오박스 1(PDX1) 발현 세포가 실질적으로 없을 수 있다. 일 양태에서, 후방 장 스페로이드는 췌장 및 십이지장 호메오박스 1(PDX1)을 발현하는 세포를 포함한다. 일 양태에서, 후방 장 스페로이드는 CDX2를 발현할 수 있다. 일 양태에서, 후방 장 스페로이드는 코달 타입 호메오박스 2(CDX2) 발현을 특징으로 할 수 있다. 일 양태에서, 후방 장 스페로이드는 코달 타입 호메오박스 2(CDX2)를 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 일 양태에서, HBPO는 췌장 및 십이지장 호메오박스 1(PDX1)을 발현하는 세포, 혈액 생성과 관련하여-발현된 호메오박스 단백질(HHEX)을 발현하는 세포, 및 프로스페로-관련된 호메오박스 1(PROX1)을 발현하는 세포를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 융합된 전방 장 스페로이드 및 후방 장 스페로이드는 SOX2, CDX2, HHEX 및 PDX1의 발현을 특징으로 하는 담도-췌장 원기부를 포함할 수 있으며, 여기서 PDX1 발현은 융합된 전방 장 스페로이드 및 후방 장 스페로이드의 경계 영역에 국소화된다.
일 양태에서, HBPO는 형태형성 인자, 바람직하게는 예를 들어 매트리겔과 같은 기저막 매트릭스에 포매될 수 있다. 방법은 HBPO로부터 PROX1 양성 영역을 절제하는 단계 및 절제된 HBPO를 배양하여 함입 상피 및 분지 구조를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 양태에서, HBPO는 예를 들어 본원에 개시된 방법을 사용하여 회전으로 배양될 수 있다.
일 양태에서, 개시된 방법은 본원에 기재된 바와 같은 HBPO, 특히 내배엽 및 중배엽을 포함하는 HBPO를 수득하기 위해 사용될 수 있다.
일 양태에서, 확정 내배엽은 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 유도된 분화다능성 줄기 세포, 중배엽 세포, 확정 내배엽 세포, 후방 내배엽 세포, 후방 내배엽 세포 및 후장 세포, 바람직하게는 분화다능성 줄기 세포로부터 유래된 확정 내배엽, 더욱 바람직하게는 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 유도된 분화다능성 줄기 세포로부터 선택된 분화다능성 줄기 세포로부터 유래된 확정 내배엽으로부터 선택된 전구체 세포로부터 유래될 수 있다.
일 양태에서, 확정 내배엽은 분화다능성 줄기 세포를 성장 인자의 TGF-베타 수퍼패밀리의 BMP 서브그룹인, 액티빈(Activin); 노달(Nodal), 액티빈A, 액티빈B, BMP4, Wnt3a 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 분자와 접촉시킴으로써 유래될 수 있다.
일 양태에서, WNT 신호전달 경로 활성화제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자로부터 선택될 수 있다: Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16, GSKβ 억제제(예를 들어, CHIR99021, 즉 "CHIRON"), BIO, LY2090314, SB-216763, 리튬, 호저 억제제 IWP, LGK974, C59, SFRP 억제제 WAY-316606, 베타-카테닌 활성화제 DCA.
일 양태에서, FGF 신호전달 경로 활성화제는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23 및 이들의 조합, 바람직하게는 FGF4 또는 FGF10, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자로부터 선택될 수 있다.
일 양태에서, BMP 신호전달 경로 억제제는 노긴, 도르소모르핀, LDN189, DMH-1 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 BMP 신호전달 경로 억제제는 노긴이다.
일 양태에서, 개시된 방법은 시험관내에서 수행될 수 있다. 특정 양태에서, 방법의 적어도 하나의 단계는 고체 지지체 상에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 콜라겐, 기저막 매트릭스(매트리겔), 또는 이들의 조합에서 선택될 수 있다.
일 양태에서, 내피를 갖는 HBPO를 제조하는 방법이 개시된다. 이 양태에서, 방법은 유도된 분화다능성 줄기 세포로부터 유래된 내피 세포와 함께 본원에 개시된 방법에 따라 HBPO를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 내피 세포는 HBPO로 배양하기 전에 내피 세포(EC) 스페로이드로 형성될 수 있다. 예를 들어, 내피 세포(EC) 분화를 위해, 인간 iPSC는 Accutase(Thermo Fisher Scientific Inc., 미국 매사추세츠주 월섬 소재)를 사용하여 해리되고 Laminin 511 E8 단편(iMatrix-511™, Nippi, Inc.에서 제공됨) 상에 Rho-연관 키나제 억제제(Y-27632)와 함께 StemFit®(Ajinomoto Co., Inc.)에서 다양한 최적 밀도(세포주에 따라 다름)로 도말될 수 있다. 다음날부터, 이들은 먼저 3일 동안 B27 배지를 갖는 프라이밍 배지(Wnt 활성화제 및 골 형태형성 단백질 4(BMP4)와 함께 1% 글루타맥스 및 1% B27(모든 Life Technologies)과 DMEM:F12(1:1)의 1:1 혼합물)를 사용하여 중배엽으로 분화될 수 있다. 프라이밍 배지는 그 다음 EC 유도 배지인, VEGF 및 포스콜린이 보충된 StemPro-34 SFM 배지(Life Technologies)로 대체될 수 있다. 유도 배지는 매일 갱신될 수 있다. 분화 7일차에, EC는 해리되고 FACS 분석을 받는다. iPSC 파생 EC는 CD144 및 CD31의 접합 국소화와 함께 전형적인 내피 형태를 보여야 한다. EC는 VEGF-A가 보충된 StemPro-34 SFM으로 구성된 EC 확장 배지에서 50,000 세포 cm-2의 밀도로 Fibronectin 코팅된 접시 상에 재-도말될 수 있다. EC 확장 배지는 격일로 대체될 수 있다. 분화된 EC는 단일 세포로 분리되어 본원에 기재된 바와 같은 전방 장 스페로이드 및 후방 장 스페로이드의 스페로이드 형성 프로토콜을 사용하여 스페로이드로 형성될 수 있다. 이어서 EC는 융합된 EC 스페로이드, 전방 장 스페로이드 및 후방 장 스페로이드를 형성하기 위해 24시간 동안 장 성장 배지에서 96 웰 둥근 바닥 초저 부착 플레이트 상에서 융합된 전방 장 스페로이드 및 후방 장 스페로이드와 혼합될 수 있다.
일 양태에서, 간엽을 갖는 HBPO를 제조하는 방법이 개시된다. 이 양태에서, 방법은 유도된 분화다능성 줄기 세포로부터 유래된 간엽 세포와 함께 본원에 개시된 바와 같은 방법에 따라 HBPO를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 간엽 세포는 HBPO로 배양하기 전에 간엽 세포(MC) 스페로이드로 형성될 수 있다. 개시된 다수-기관, 3-차원 오가노이드 및 간엽 세포 또는 간엽 스페로이드는 다수-기관, 3-차원 오가노이드의 성장 및 성숙을 개선하기 위해 함께 배양될 수 있다. 예를 들어, 간엽(MSC) 분화를 위해 인간 iPSC는 중배엽으로 분화될 수 있다. 그 다음 중배엽 세포는 3일의 추가 액티빈 A 및 PDGFBB에 노출될 수 있다. 분화된 MSC는 그 다음 단일 세포로 해리되고 전방 장 스페로이드 및 후방 장 스페로이드의 스페로이드 형성 프로토콜을 사용하여 스페로이드로 형성될 수 있다. 이어서 MSC 스페로이드는 융합된 MSC 스페로이드, 전방 장 스페로이드 및 후방 장 스페로이드를 형성하기 위해 24시간 동안 장 성장 배지에서 96 웰 둥근 바닥 초저 부착 플레이트 상에서 융합된 전방 장 스페로이드 및 후방 장 스페로이드와 혼합될 수 있다.
일 양태에서, 간-담도-췌장 오가노이드("HBPO")를 제조하는 방법이 개시되며, 여기서 상기 방법은 전방 장 세포로부터 전방 장 스페로이드를 유도하고, 후방 장 세포로부터 후방 장 스페로이드를 유도하여 경계 오가노이드를 제조하는 단계; 및 장 성장 배지에서 상기 경계 오가노이드를 배양하여 HBPO를 제조하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, 간-담도-췌장 오가노이드("HBPO")를 제조하는 방법은 전방 장 세포 및 후방 장 세포로부터 전방 장 스페로이드를 유도하고 후방 장 스페로이드를 유도하여 유도 인자의 부재에서 HBPO를 제조하는 단계; 및 장 성장 배지에서 경계 오가노이드를 배양하여 HBPO를 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
"유도 인자"는 분화를 지시하는 데 사용되는 인자, 예를 들어, 간세포 분화를 위한 레티노산(RA; Sigma, 미국 미주리주 소재), 간세포 성장 인자(HGF; PeproTech, 미국 뉴저지주 소재), 0.1 μM 덱사메타존(Dex; Sigma) 및 20 ng/mL 온코스타틴 M(OSM; R & D Systems)을 의미한다. 많은 다른 유도 인자가 췌장 및 담도에 대해서 또한 알려져 있고, 당업자에 의해 쉽게 이해될 것이다.
일 양태에서, 간-담도-췌장 오가노이드("HBPO")를 제조하는 방법이 개시되며, 여기서 상기 방법은 장 성장 배지에서 분화다능성 줄기 세포(PSC)로부터 분화된 확정 내배엽(DE)을 배양하여 전방 장 세포 및 후방 장 세포를 만드는 단계, 전방 장 세포로부터 전방 장 스페로이드를 만들고 후방 장 세포로부터 후방 장 스페로이드를 만들어 유도 인자의 부재에서 경계 오가노이드를 만드는 단계; 및 (iii) 상기 경계 오가노이드를 장 성장 배지에서 배양하여 HBPO를 만드는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 장 성장 배지는 ROCK 억제제를 포함하는 배지일 수 있다. 일 양태에서, ROCK 억제제는 Y-27632일 수 있다. 일 양태에서, 성장 배지는 글루타민, HEPES, N2 및 B27의 추가로, https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12634010에서 입수가능한, 감소된 태아 우 혈청(FBS) 보충제와 함께 포유류 세포를 배양할 수 있는 널리 사용되는 기본 배지인, Advanced DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12)이다. 일 양태에서, 배지는 Advanced DMEM에 다음 사이토카인의 첨가를 포함할 수 있다: 전방 장 세포에 대해 노긴(BMP 억제제), CHIR(WNT 활성화제), FGF4, 후방 장 세포에 대해 CHIR 및 FGF4(노긴 없음).
일 양태에서, HBPO를 생산하기 위한 기계가 본원에 개시된다. 기계는 BMP 신호전달 경로 억제제의 존재 또는 부재에서 Wnt 신호전달 경로 활성화제 및 FGF 신호전달 경로 활성화제를 함유하는 장 성장 배지; 및 ROCK 억제제를 함유하는 장 성장 배지를 포함할 수 있다.
일 양태에서, HBPO의 생산을 위한 복수의 배양 배지의 용도가 개시되며, 여기서 복수의 배양 배지는 Wnt 신호전달 경로 활성화제 및 선택적으로 BMP 신호전달 경로 억제제를 포함하는 FGF 신호전달 경로 활성화제를 함유하는 장 성장 배지; 및 ROCK 억제제를 함유하는 장의 성장 배지를 포함한다.
일 양태에서, HBPO는 HBPO의 성장 및 성숙을 증가시키기 위해 일정 기간 동안 비-인간 포유동물과 같은 포유동물에 이식될 수 있다. 일 양태에서, HBPO는 예를 들어 이를 필요로 하는 개체에서 장기 기능장애를 구제하기 위해 이식될 수 있다. 일 예에서, 시험관내 생성된 HBPO는 수집되고 비-비만 당뇨병/중증 복합 면역결핍(NOD/SCID) 마우스에서 신장의 견갑하 부위 또는 소장의 장간막에 이식될 수 있다. 이식 후 8주에 오가노이드의 성장 증가가 관찰될 수 있다. 인간-Alb, 인간-C- 펩타이드 수준과 같은 혈액 검사를 기반으로 생존력과 성장을 모니터링할 수 있다.
일 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 HBPO를 이식하는 것을 포함하는 개인을 치료하는 방법이 개시된다. 이 양태에서, 본원에 사용된 임의의 방법에 따라 생성된 오가노이드는 당업계에 공지된 표준 수술 절차를 사용하여 이를 필요로 하는 개체에 이식될 수 있다. 일 양태에서, 개체는 간부전 및 선천성 간 질환과 같은 간 질환, 당뇨병과 같은 췌장 질환 또는 담도 질환으로부터 선택된 질환 상태를 가질 수 있다.
일 양태에서, 담도 염증성 질환 및/또는 췌장염과 같은 췌장 염증성 질환으로부터 선택된 하나 이상의 질환 상태에 대한 치료를 확인하는 방법이 개시된다. 이 양태에서, 개시된 오가노이드 조성물은 본원에 개시된 오가노이드 조성물을 갖는 관심있는 잠재적 치료제와 접촉될 수 있다. 그 다음 기관 활성의 척도가 오가노이드에서 검출될 수 있다. 이 검출의 출력을 기반으로, 관심있는 잠재적 치료제가 질환 상태의 측정을 개선하는지 여부를 결정할 수 있으며, 이에 의해 HBPO에 체화된 모든 조직의 오기능을 수반하는 질환 상태를 치료하는 데 유용할 것 같은 치료제를 식별하는 데 사용될 수 있다.
배아 세포에서 유래된 분화다능성 줄기 세포
일부 양태에서, 하나의 단계는 분화다능성이거나 분화다능성이 되도록 유도될 수 있는 줄기 세포를 얻는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 분화다능성 줄기 세포는 배아 줄기 세포로부터 유래되고, 이는 차례로 초기 포유 동물 배아의 전능성 세포로부터 유래되고 시험관내에서 무제한의 미분화된 증식이 가능하다. 배아 줄기 세포는 초기-단계 배아인 배반포의 내부 세포 덩어리에서 유래된 분화다능성 줄기 세포이다. 배반포로부터 배아 줄기 세포를 유도하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 인간 배아 줄기 세포 H9(H9-hESC)은 본 출원에 기술된 예시적인 실시형태에서 사용되지만, 본원에 기술된 방법 및 시스템이 임의의 줄기 세포에 적용될 수 있음을 당업자는 이해할 것이다.
본 발명에 따른 실시형태에서 사용될 수 있는 추가 줄기 세포는 국립 줄기 세포 은행(NSCB), 샌프란시스코 캘리포니아 대학교(UCSF)의 인간 배아 줄기 세포 연구 센터; Wi Cell 연구소의 WISC 세포 은행; 위스콘신 대학 줄기 세포 및 재생 의학 센터(UW-SCRMC); Novocell, Inc.(캘리포니아주 샌디에고 소재); Cellartis AB(스웨덴 예테보리 소재); ES Cell International Pte Ltd(싱가포르 소재); Technion at the Israel Institute of Technology(이스라엘 하이파 소재)가 주최하는 데이터베이스; 및 프린스턴 대학과 펜실베니아 대학이 주최하는 줄기 세포 데이터베이스에 의해 제공되거나 기재된 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않다. 본 발명에 따른 실시형태에서 사용될 수 있는 예시적인 배아 줄기 세포는 SA01 (SA001); SA02 (SA002); ES01 (HES-1); ES02 (HES-2); ES03 (HES-3); ES04 (HES-4); ES05 (HES-5); ES06 (HES-6); BG01 (BGN-01); BG02 (BGN-02); BG03 (BGN-03); TE03 (13); TE04 (14); TE06 (16); UC01 (HSF1); UC06 (HSF6); WA01 (H1); WA07 (H7); WA09 (H9); WA13 (H13); WA14 (H14)를 포함하지만 이에 제한되지는 않다. 배아 줄기 세포에 대한 자세한 내용은 예를 들어 문헌 [Thomson et al., 1998, "Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts," Science 282 (5391):1145-1147]; 문헌 [Andrews et al., 2005, "Embryonic stem (ES) cells and embryonal carcinoma (EC) cells: opposite sides of the same coin," Biochem Soc Trans 33:1526-1530]; 문헌 [Martin 1980, "Teratocarcinomas and mammalian embryogenesis,". Science 209 (4458):768-776]; 문헌 [Evans and Kaufman, 1981, "Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos," Nature 292(5819): 154-156]; 문헌 [Klimanskaya et al., 2005, "Human embryonic stem cells derived without feeder cells," Lancet 365 (9471): 1636-1641]에서 찾아볼 수 있으며; 이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
유도된 분화다능성 줄기 세포(iPSC)
일부 양태에서, iPSC는 특정 줄기 세포-관련 유전자를 성인 섬유아세포와 같은 비-분화다능성 세포로 형질감염에 의해 유도된다. 형질감염은 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터를 통해 달성될 수 있다. 형질감염된 유전자에는 마스터 전사 조절자 Oct-3/4(Pouf51) 및 Sox2가 포함되지만 다른 유전자가 유도의 효율을 향상시킨다는 것이 제안된다. 3 내지 4주 후, 소수의 형질감염된 세포는 분화다능성 줄기 세포와 형태학적 및 생화학적으로 유사해지기 시작하고 전형적으로 형태학적 선택, 배가 시간 또는 리포터 유전자 및 항생제 선택을 통해 분리된다. 본원에서 사용된 바와 같은, iPSC는 마우스 및 인간 유도 분화다능성 줄기 세포에서 1세대 iPSC, 2세대 iPSC를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 양태에서, 레트로바이러스 시스템은 4개의 중추적 유전자인: Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc를 사용하여 인간 섬유아세포를 분화다능성 줄기 세포로 변환하는 데 사용된다. 대안적인 양태에서, 렌티바이러스 시스템은 OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28로 체세포를 형질전환하는 데 사용된다. iPSC에서 발현이 유도되는 유전자는 Oct-3/4(예를 들어, Pou5fl); Sox 유전자 계열의 특정 구성원(예를 들어, Sox1, Sox2, Sox3 및 Sox15); Klf 계열의 특정 구성원(예를 들어, Klf1, Klf2, Klf4 및 Klf5), Myc 계열의 특정 구성원(예를 들어, C-myc, L-myc 및 N-myc), Nanog 및 LIN28을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
일부 양태에서, iPSC를 생성하기 위해 비-바이러스 기반 기술이 사용된다. 일부 양태에서, 아데노바이러스를 사용하여 필요한 4개의 유전자를 마우스의 피부 및 간 세포의 DNA로 전이하여, 배아 줄기 세포와 동일한 세포를 생성할 수 있다. 아데노바이러스는 임의의 그 자신의 유전자를 표적 숙주와 결합하지 않기 때문에 종양 생성 위험이 제거된다. 일부 양태에서, 재프로그램화는 매우 낮은 효율성이지만 임의의 바이러스 형질감염 시스템 없이 플라스미드를 통해 수행될 수 있다. 다른 양태에서, 단백질의 직접 전달은 iPSC를 생성하는 데 사용되고, 따라서 바이러스 또는 유전자 변형의 필요성을 제거한다. 일부 실시형태에서, 마우스 iPSC의 생성은 유사한 방법론을 사용하여 가능하다: 폴리-아르기닌 앵커를 통해 세포로 채널링된 특정 단백질로 세포를 반복적으로 처리하는 것이 분화다능성을 유도하기에 충분하였다. 일부 양태에서, 분화다능성 유도 유전자의 발현은 또한 낮은 산소 조건 하에서 FGF2로 체세포를 처리함으로써 증가될 수 있다.
배아 줄기 세포에 대한 자세한 내용은, 예를 들어, 문헌[Kaji et al., 2009, "Virus free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors," Nature 458:771-775]; 문헌[Woltjen et al., 2009, "piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells," Nature 458:766-770]; 문헌[Okita et al., 2008, "Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors," Science 322(5903):949-953]; 문헌[Stadtfeld et al., 2008, "Induced Pluripotent Stem Cells Generated without Viral Integration," Science 322(5903):945-949]; 및 문헌[Zhou et al., 2009, "Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins," Cell Stem Cell 4(5):381-384]에서 찾아 볼 수 있으며; 이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
일부 양태에서, 예시적인 iPS 세포주는 iPS-DF19-9; iPS-DF19-9; iPS-DF4-3; iPS-DF6-9; iPS(Foreskin); iPS(IMR90); 및 iPS(IMR90)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
DE 개발과 관련된 신호전달 경로의 기능에 대한 자세한 내용은, 예를 들어, 문헌[Zorn and Wells, 2009, "Vertebrate endoderm development and organ formation," Annu Rev Cell Dev Biol 25:221-251]; 문헌[Dessimoz et al., 2006, "FGF signaling is necessary for establishing gut tube domains along the anterior-posterior axis in vivo," Mech Dev 123:42-55]; 문헌[McLin et al., 2007, "Repression of Wnt/β-catenin signaling in the anterior endoderm is essential for liver and pancreas development. Development," 134:2207-2217]; 문헌[Wells and Melton, 2000, Development 127:1563-1572]; 문헌[de Santa Barbara et al., 2003, "Development and differentiation of the intestinal epithelium," Cell Mol Life Sci 60(7): 1322-1332]에서 찾아볼 수 있으며; 이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
분화다능성 세포(예를 들어, iPSC 또는 ESC)로부터 확정 내배엽을 생산하기 위한 임의의 방법이 본원에 기재된 방법에 적용가능하다. 일부 양태에서, 분화다능성 세포는 상실배로부터 유래된다. 일부 양태에서, 분화다능성 줄기 세포는 줄기 세포이다. 이들 방법에 사용되는 줄기 세포는 배아 줄기 세포를 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 배아 줄기 세포는 배아 내부 세포 덩어리 또는 배아 생식선 융기로부터 유래될 수 있다. 배아 줄기 세포 또는 생식 세포는 인간을 포함한 다양한 포유류 종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 동물 종으로부터 유래할 수 있다. 일부 양태에서, 인간 배아 줄기 세포는 확정 내배엽을 생성하는 데 사용된다. 일부 양태에서, 인간 배아 생식 세포는 확정 내배엽을 생산하는 데 사용된다. 일부 양태에서, iPSC는 확정 내배엽을 생성하는 데 사용된다.
일 양태에서, 확정 내배엽은 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 유도된 분화다능성 줄기 세포, 중배엽 세포, 확정 내배엽 세포, 후방 내배엽 세포, 후방 내배엽 세포 및 후장 세포로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 확정 내배엽은 분화다능성 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, 확정 내배엽은 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 유도된 분화다능성 줄기 세포로부터 선택된 분화다능성 줄기 세포로부터 유래될 수 있다. 일 양태에서, DE는 DE 단일층일 수 있으며, 여기서 DE 단일층 내의 세포의 90% 초과가 FOXA2 및 SOX17을 공동 발현한다.
일 양태에서, 확정 내배엽은 분화다능성 줄기 세포를 성장 인자의 TGF-베타 수퍼패밀리의 BMP 서브그룹인, 액티빈(Activin); 노달(Nodal), 액티빈A, 액티빈B, BMP4, Wnt3a 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 분자와 접촉시킴으로써 유래될 수 있다.
일 양태에서, BMP 신호전달 경로 억제제는 노긴, 도르소모르핀, LDN193189, DMH-1 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 일 양태에서, BMP 신호전달 경로 억제제는 노긴이다. BMP 억제제는 약 50 내지 약 1500 ng/ml의 농도로 존재할 수 있다.
일 양태에서, WNT 신호전달 경로 활성화제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자로부터 선택될 수 있다: Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16, GSKβ 억제제(예를 들어, CHIR99021, 즉 "CHIRON"), BIO, LY2090314, SB-216763, 리튬, SFRP 억제제 WAY-316606, 베타-카테닌 활성화제 DCA. Wnt 경로 활성화제의 농도는, 예를 들어, 약 50 내지 약 1500 ng/ml의 농도로 사용될 수 있다. Wnt/베타-카테닌 경로를 활성화하는 많은 방식이 있다(http://web.stanford.edu/group/nusselab/cgi-bin/wnt/ 참조). 적합한 일부 기존 wnt 신호전달 경로 활성화제는 단백질-기반 활성화제를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt8 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 Wnt 리간드; 활성화된 Wnt 프리즐드 수용체, (LRP) 공-수용체, R-스폰딘 단백질, Dkk 단백질, Wnt 리간드 분비 및 트래피킹의 조절제(Wntless, Porcupine), 억제성 베타-카테닌 분해 APC 및 GSK3 베타 억제, 활성화된 베타-카테닌, 구성적으로 활성인 TCF/Lef 단백질 및 화학적 활성화제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 Wnt 리간드의 개질제를 포함할 수 있으며, 이는 Wnt/베타-카테닌 신호전달을 활성화하거나 억제하는 28개 이상의 알려진 화학물질을 포함할 수 있다. 일부 활성화제는 GSK3-베타 억제제 CHIR99021(CHIRON), BIO, LY2090314, SB-216763, 리튬, SFRP 억제제 WAY-316606, 베타-카테닌 활성화제 DCA를 포함하지만 이에 제한되지는 않다.
일 양태에서, FGF 신호전달 경로 활성화제는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23 및 이들의 조합, 바람직하게는 FGF4 또는 FGF10, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자일 수 있다. 일 양태에서, FGF 경로 활성화제의 농도는 약 50 내지 약 1500 ng/ml의 농도로 사용될 수 있지만, 다양한 농도가 사용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. MAPK, MEK, ERK 단백질 및 이의 활성을 조절하는 화학물질을 포함하여 FGF 수용체 및 수용체의 신호전달 구성요소 하류를 자극하는 단백질 및 화학물질. FGF 신호전달은 스프라우티(Sprouty) 단백질 계열 구성원을 포함 하나 이에 제한되지 않는 FGF 신호전달 경로의 억제제를 억제함으로써 활성화될 수 있다.
실시예
다음의 비-제한적 실시예는 본원에 개시된 본 발명의 실시형태를 추가로 예시하기 위해 제공된다. 다음의 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하는 것으로 밝혀진 접근법을 나타내며, 따라서 그 실시를 위한 모드의 예를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당업자는 이해해야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어 볼 때, 개시된 특정 실시형태에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 여전히 같거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
기관형성은 다수의 경계 조직 상호작용에 의해 조정된, 복잡하고 상호-연결된 과정이다1-7. 그러나, 개별의 인접한 구성요소가 통합된 다중-기관 구조를 확립하기 위해 어떻게 조정되는지는 현재로 명확하지 않다. 인간 분화다능성 줄기 세포(PSC)의 3-차원 배양으로부터 함입하는, 간, 담도 및 췌장 구조의 연속적인 패턴화 및 동적 형태형성이 본원에 개시된다.
출원인은 인간 PSC로부터 분화된 전방 및 후방 장 스페로이드 사이의 경계 상호작용이 외인성 인자 공급의 부재에서 전장-중장 경계 오가노이드에 특정화된 간-담도-췌장(HBP) 기관 도메인의 자율적 출현을 가능하게 한다는 것을 발견했다. 이식-유래 조직은 중장 파생물에 의해 지배되는 반면, 미세 해부된 HBP 오가노이드의 장기 배양은 분리된 간-췌장-담도 연골로 발전한 다음, 세 가지 다른 및 상호-연결된 장기 구조의 함입 및 분기, 마우스 외식 전장-중장 배양에서 유래된 조직의 연상을 포함하는 초기 형태형성 사건의 재현이 뒤따른다. HES1에서 유전적 돌연변이에 의해 발생하는 다중-기관 도메인의 오-분리는 생체내에서 볼 수 있듯이 배양에서 담도 사양 잠재력을 폐지한다 8,9 . 출원인은 실험적 다중-기관 통합 모델이 전장과 중장 조직의 병치-위치화에 의해 확립될 수 있으며, 인간에서 복잡한 내배엽 조직생성의 연구를 위한 다루기 쉽고 조작가능하며 쉽게 접근할 수 있는 모델로 사용될 수 있음을 입증했다.
HHEX(혈액 생성과 관련하여-발현된 호메오박스 단백질) 및 PDX1(췌장 및 십이지장 호메오박스 1) 발현에 의해 구분되는 간-담도-췌장(HBP) 분석은 먼저 전장-중장 사이의 경계에서 특화되고10, 원시 장에서 복부로 함입하는 상피 소포를 형성한다11-13. BMPR1A(뼈 형태형성 단백질 수용체, 유형 1A)1, HLX(H2.0-형 호메오박스)2, CDX2(코달 타입 호메오박스 2)3, NKX3-2(NK3 호메오박스 2)4, HHEX 5, PDX1 및 SOX9(SRY-박스 9)6와 같은 이 영역 주변의 경계-한정 유전자의 파괴는 생체내에서 위-HBP-장을 따라 균형잡힌 기관형성을 상당하게 변경한다1-7. HBP 계통의 후속 다양화는 후방 간 새싹 세포에서 SOX9를 간접적으로 억제함으로써 그의 경계에서 인접한 간엽 BMP에 의해 매개될 가능성이 있다14. 따라서, 연속적이고 동적인 기관 발생은 복잡한 환경에서 발생하고 연속적인 이웃 조직 상호작용에 의해 유도될 가능성이 있다5,6,15. 그러나, HBP 시스템의 패턴화 및 균형잡힌 기관형성은 기술적 복잡성으로 인해 조직 배양에서 성공적으로 모델링되지 않아, 상세한 기계적 연구를 방해한다16,17.
여기서, 출원인은 인간 분화다능성 줄기 세포(PSC)를 사용하는 3-차원 분화 접근법을 사용하여 내배엽과 중배엽 둘 모두로 구성된 뚜렷한 구역 정체성을 가진 장 스페로이드를 특화했다. 출원인은 전방-후방 상호작용이 생체외에서 전장(SOX2, SRY-박스 2로 표시됨) 및 중장(CDX2로 표시됨) 경계를 재현하여 인간 간-담도-췌장 시스템의 상호-조정된 사양 및 함입을 모델링함을 입증했다.
전장-중장 경계 모델을 개발하기 위해, 출원인은 먼저 전방 장에 대한 BMP 길항제 노긴의 존재에서 그리고 후방 장 정체성에 대한 노긴의 부재에서 재조합 단백질 FGF4 및 소분자 CHIR99021(WNT 경로를 조절함)에 앞서 설명한18,19 바와 같이 패턴화된 확정 내배엽 세포를 노출시켰다(도 1a 및 도 5). 7일차(D7)에, 전방 또는 후방 장 세포를 개별적으로 응집하여 각각 전장 및 중장/후장 전사 인자 SOX2 및 CDX2의 우선적 발현을 갖는 스페로이드를 형성하였다(도 1b). 그런 다음 출원인은 전방 장 스페로이드에 인접한 후방 장 스페로이드를 옮겼다. D9에서, 2개의 스페로이드는 94.8%의 웰에서 융합되었고, 융합된 스페로이드는 형태발생 인자, 즉 매트리겔 안으로 포매되었다(도 1a 및 1b). 놀랍게도, 어떤 외인성 인자 추가 없이, HBP 원시세포는 마커 SOX2, CDX2, 미성숙 간 마커 HHEX 및 공동, 십이지장 및 췌장 전구 마커 PDX1을 사용하여 D9, D10 및 D11에 걸친 스페로이드의 온조직표본 염색에 의해 입증된 바와 같이 전방 및 후방 장 스페로이드의 경계면에서 나타났다(도 1c). D9에서, 전방 및 후방 장 스페로이드는 HHEX 및 PDX1의 어떠한 발현도 나타내지 않았다. D10에서, HHEX 및 PDX1 발현이 나타났고 HHEX는 전방 및 후방(bAP) 오가노이드의 경계에서만 검출 가능했다. PDX1 및 HHEX 양성 세포 둘 모두는 D11에서 경계 영역에서 뚜렷하게 증가했다(도 1c). 3개의 추가 유도된 분화다능성 줄기 세포(iPSC) 및 배아 줄기 세포(ESC) 주를 사용하여 bAP 오가노이드의 경계에서 HHEX 및 PDX1 발현 세포를 전개하는 재현성을 확인했다(도 6a 내지 도 6c). HBP 전구세포 유도는 전방 및 후방 장 스페로이드 사이의 세포 대 세포 접촉을 필요로 한다(도 3a 및 도 3b). 경계 부위에서 검출된 모든 PDX1 양성 세포(30개의 염색된 오가노이드 중 30개)(도 1d) 중에서, 총 세포 수 당 PDX1 양성 세포의 백분율은 경계 영역에서 5%인 반면 전방 및 후방 영역 각각에서 0%와 1%였다(도 1e). PDX1 발현 세포는 A-P 오가노이드 및 후방-후방(P-P) 장 스페로이드 조합에서 관찰되었다. 대조적으로, HHEX 양성 세포는 A-P 오가노이드에서만 검출되었지만 전방-전방(A-A) 또는 P-P 조합(도 1f 및 도 8)에서는 검출되지 않았으며, 이는 HBP 전구세포의 균형잡힌 유도가 A-P 융합을 포함함을 나타낸다.
HHEX 및 PDX1 발현 세포의 근원을 추적하기 위해, bAP 오가노이드는 비-표지 전방 및 GFP-표지된 후방 장 스페로이드를 사용하여 확립되었다. 출원인은 HHEX 및 PDX1 발현 둘 모두가 GFP와 겹치는 것을 발견했으며, 이는 HBP 전구세포가 후방 장에서 유래함을 시사한다(도 9a). D8, D9, D11 및 D12 미세-해부된 전방, 경계 및 후방 영역의 RNA-시퀀싱은 D11 및 D12에서의 경계 조직이 HBP 사양 마커의 배열을 점진적으로 발현한 반면, 전방 또는 후방 영역은 각각 전장 또는 중장/후장 정체성을 얻었다(도 1g). 주목할 점은, A-P 재조합 실험과 일치하여 후방 조직은 경계 영역에 더 가까운 정체성을 가지고 있다(도 1g). 종합하면 AP 경계 전략은 외인성 유도 인자의 부재에서 HHEX 및 PDX1 양성 HBP 전구세포의 자율 패턴화를 조정한다.
출원인은 또한 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 사용하여 프로스페로-관련 호메오박스 1(PROX1)인, 간, 담관 및 췌장의 공통 전구세포 마커 하에 tdTomato를 시각화하여 이의 운명을 추적하기 위해 리포터 인간 iPSC를 확립했다(도 2a). HHEX 및 PDX1과 유사하게, PROX1 발현은 D10에서의 경계에서 시작되었고 이후에 증가했다(도 2b). PROX1 출현은 A-P 오가노이드에 특이적이었지만 A-A 또는 P-P 조합에는 그렇지 않았다(도 2c). A-P 재조합 분석은 PROX1 양성 세포가 또한 후방 장 세포로부터 유래하였음을 나타냈다(도 9b 및 도 9c). 공기-액체 계면 배양은 E8.75 Prox1::EGFP 마우스 배아 간 조직에서 볼 수 있듯이 PROX1 양성 영역의 추가 성장을 유도했다(도 2d). PROX1 면역염색은 bAP 오가노이드로부터 유도된 형태학적으로 함입하는 조직이 E8.5-8.75에서 마우스의 경계 영역과 유사함을 확인했다(도 2e).
HBP 전구세포 자가-유도 메커니즘을 설명하기 위해, 출원인은 알려진 유도성 신호전달 경로의 경계 특정 발현 프로파일을 평가했다. FGF, BMP, HH(hedgehog), NOTCH 및 RA(레티노산) 신호 중에서, RNAseq는 RA의 하류 신호가 경계 영역에서 두드러지게 활성화되었지만 D11에서 전방 또는 후방 영역에서는 활성화되지 않았음을 확인했다(도 2f 및 표 1).
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지원에서, 출원인은 D9에서 bAP 오가노이드를 다양한 RA 신호전달 작용제 또는 길항제에 노출했다. RA 수용체 길항제 BMS493은 HHEX 및 PDX1 둘 모두의 유전자 발현을 강력하게 억제하였다(도 2g). 동물 연구는 RA 신호전달이 간-담도-췌장 시스템에 대한 계통 사양에서 중요한 역할을 한다고 제안했다20,21. 측면 플레이트 중배엽 모집단은 생체내 사양 동안 RA 신호전달을 위한 활성화제 역할을 한다22-24. 모델 시스템에서 RA에 대한 세포 근원을 연루시키기 위해, 분리된 상피 및 비-상피 세포 모집단에서 RA 신호전달 관련 유전자를 평가했다. FACS 분석은 전방 장 세포에 90.3% 상피 세포 부착 분자(EpCAM) 양성 상피 세포가 있는 반면, 후방 장 세포에 94.8% EpCAM 양성이 있는 것으로 나타났다(도 5). 흥미롭게도, 다른 모집단이 아닌 전방 비-상피 세포는 이전의 생체내 동물 모델 연구에 유사한 RA 합성 유전자 알데히드 탈수소효소 1 계열 구성원 A2(ALDH1A2)를 고도로 발현했다(도 2h). 이를 보완하여, 융합 이전에 BMS493에 전방 장 스페로이드가 아닌 후방 장 스페로이드 만 노출시키면 HHEX 및 PDX1의 단백질-수준 유도가 억제되었다(도 10). BMS493과 함께 전체 배아 배양 시스템에서 배양된 E9.0 PROX1::GFP 리포터 마우스 배아는 또한 2일 후에 PROX1 발현 세포의 현저한 억제를 나타냈다(도 11a 및 도 11b). 종합하면, 경계 오가노이드 모델 시스템의 후방 영역에서 유래된 HBP 전구세포 자가-사양은 RA 신호에 의해 조절되며, 전방 비-상피성, 가장 가능성이 높은 간엽, 계통을 공동-분화함으로써 지원될 수 있다.
줄기 세포-유래 배아 내배엽 세포는 매우 가소성이고 일반적으로 장 조직을 생성한다18,25. 생체내에서 전구세포로부터 HBP 조직을 형성하는 능력이 있는지 여부를 조사하기 위해 인간 PROX1 발현 오가노이드를 면역결핍 마우스 안으로 이식했다. 1개월 이식 유래 조직은 소장 조직 마커인 케라틴(Keratin) 20(CK20), CDX2 및 EpCAM을 보였지만 다른 HBP 마커의 발현은 무시할 수 있었다(도 2i). 또한, 십이지장 마커인 수용체 액세서리 단백질 6(REEP6/DP1L1) 및 SOX9 발현 패턴은 이들 인간 조직이 십이지장 조직과 가장 유사하다는 것을 알렸다(도 2i). 이들 결과는 HBP 전구세포의 존재에도 불구하고, 이소성으로 이식된 오가노이드가 생체내에서 장 조직을 발달시키는 경향이 있음을 나타냈다.
HBP 오가노이드가 생체내에서 주로 십이지장 조직을 생성했기 때문에, 출원인은 다음으로 D13 경계 오가노이드로부터 PROX1 양성 영역을 절제하고 이를 다른 형식으로 배양하여 HBP 조직생성을 효과적으로 모델링했다(도 3a 및 도 3b). 놀랍게도, 다양한 시험된 배양 조건(도 12) 중에서, 절제된 조직을 특정 성장 인자 없이 트랜스웰(Transwell) 상의 매트리겔 드롭에서 2주 동안 배양하였다; 대부분의 PROX1 조직은 공간적으로 조직된 함입성 상피로 발달하고 분지 구조를 형성했다(도 3b). 대조적으로, 부유 상태 또는 비-해부 오가노이드에서 배양된 소수의 PROX1 양성 상피 만이 함입되었다(도 3b). 시간 경과 영상화는 해부된 PROX1 양성 조직이 배양 2일 동안 상피 형태에서보다 복잡한 구조로 변경되었음을 나타냈다(도 3c). D25 즈음에, 오가노이드의 PROX1 상피 부분이 함입하기 시작했다. PROX1 양성 영역은 이후 다수의 방향으로 바깥쪽으로 성장하기 시작하여 점진적 함입을 통해 분기 구조를 형성했다(도 3d 및 d). 분기 구조는 A-A 및 P-P 조합에서 관찰되지 않았다(도 13). 더욱이, PDX1을 처음에 발현했지만 bAP 오가노이드로부터 해부된 후방 장 스페로이드 단독은 함입 구조를 성장시킬 수 없었다(도 14).
장기 배양이 더 성숙한 조직을 생산할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 오가노이드를 D90까지 배양했다. D90 오가노이드는 마우스 E14.5 외식된 장기 배양과 형태학적으로 유사했다(도 3f). H&E 염색은 장기 배양된 오가노이드가 형태학적으로 간, 췌장, 담관 및 장 조직을 함유함을 나타냈다(도 3g). 더욱이, 면역형광 염색은 오가노이드에서 췌장 마커 PDX1 및 NGN3, 간 마커 PROX1 및 담관 마커 CK19 및 SOX9의 발현을 검출하였다(도 3h). 간엽 세포를 발현하는 알파-SMA는 발달하는 담낭 조직26과 유사한 담관 SOX17+ 세포 주위를 감쌌다(도 3h). 간 마커 AFP 및 알부민, 췌장 마커 PDX1, NKX6.1 및 GATA4, 담관 마커 DBA 및 SOX9를 사용한 면역형광 및 온조직표본 염색은 각 조직의 계통이 배양 30일 초과 후 동일한 경계 오가노이드로부터 분리되었음을 확인했다(도 3i 내지 도 3l 및 도 15a 내지 도 15b). NKX6.1, HNF1B 및 GATA4는 PDX1 양성 영역에서 차별적으로 발현되었고, 췌장 간엽 마커 NKX6.3 발현은 생체내 발달 췌장에서 관찰되는 바와 같이 PDX1 발현 세포와 함께 관찰되었다(도 3i 내지 도 3l 및 도 15a 내지 도 15c). 놀랍게도, 담관과 췌장 조직은 DBA, SOX9 및 PDX1의 온조직표본 공동-염색과 플루오레세인-표지 담즙산(CLF)을 통합하는 능력에 의해 입증된 바와 같이, 분지형 오가노이드에서 직접적으로 연결된다(도 3ka 및 3kb 및 도 15c). 더욱이, 90일에서 외분비 마커인 아밀라아제 및 GATA4를 발현하는 췌장 영역이 오가노이드에서 확인되었다(도 3m). 오가노이드에서 콜레시스토키닌 A 수용체(CCKAR) 발현이 주어지면(도 3n), 오가노이드를 CCK에 노출시키고 췌장 분비 기능을 아밀라아제 효소-연결 면역 흡착 분석(ELISA)으로 분석했다. 다음 날 수축된 관 구조 및 CCK 처리된 조직은 처리되지 않은 대조군에 비해 상청액에서 아밀라아제 분비를 증가시켰다(도 3o 및 도 3p). 이들 결과는 경계 오가노이드 전략이 다수의 장기(HBP) 조직을 생성할뿐만 아니라 췌장, 특히 외분비 계통 및 담관의 기능적 연결을 설정함을 나타낸다.
HES1(Hes 계열 bHLH 전사 인자 1)은 후방 전장 계통을 조절하는 전사 인자이다15,27. Hes1 녹-아웃 설치류에서, 췌장-담도 기관 분리 실패로 인해 담도 시스템이 췌장 조직으로 전환된다8,9. HBP 오가노이드가 HES1 매개 발달 과정을 재현하는지 여부를 밝히기 위해, 출원인은 CRISPR/Cas9 시스템에 의해 PROX1 리포터 iPSC 상에 HES1 KO를 설정하고(도 4a 내지 도 4c), D20에서 HES1-/-iPSC 유래 오가노이드 내 HES1 유전자 발현의 부재를 확인했다(도 4d). HES1-/-오가노이드는 D11에서 bAP에서 PROX1 리포터 활성(도 4e) 및 HHEX/PDX1 발현(도 4f)을 유지했다. 22일차에 HES1-/- 및 HES1+/+ 오가노이드의 RNAseq는 보고된 췌장의 유의한 상향 조절은 HES1+/+ 오가노이드와 비교하여 HES1-/- 오가노이드에서 HES1 표적9,28으로 내분비 마커를 포함하여 뮤어라인 유전자와 관련되었음 나타냈다(도 4g 및 도 16). qRT-PCR은 GCG, NEUROG3, INS 및 NKX2-2의 모든 췌장 유전자 발현 수준이 HES1+/+ 오가노이드와 비교하여 HES1-/- 오가노이드에서 상향 조절되었음을 보여주었으나(GCG: 264배; NEUROG3: 29.8배; INS: 212배), GCG, INS의 발현 수준은 HES1+/+ 및 HES1-/- 오가노이드 둘 모두에서 인간 췌장 조직보다 여전히 낮았다(도 4h). 더욱이, 생체내 설치류 연구와 일치하여, HES1-/- 인간 오가노이드는 HES1+/+ 오가노이드와 비교하여 더 적은 DBA 및 SOX9 양성 관 조직 및 더 많은 PDX1 양성 췌장 구조를 생성하여(도 4i 및 도 4j 및 도 17), 동물 모델 연구에 표현형 관련성을 강조한다.
줄기 세포 배양에서 다중-기관 통합은 중요한 충족되지 않은 과제이다. 본 개시내용은 전장-중장 경계에서 개발된 구조적으로 및 기능적으로 통합된 HBP 오가노이드를 유도하는 인간 3-차원 전후 경계 시스템의 생성을 입증한다.
방법
PSC의 유지관리
인간 PSC 주는 이전에 설명한 대로 유지되었다. 미분화 hPSC는 37℃에서 5% CO2/95% 공기가 있는 인큐베이터에서 1/30 희석에서의 Matrigel Growth Factor Reduced(Corning Inc., 미국 뉴욕주 뉴욕 소재) 또는 0.25 ug/cm2에서의 iMatrix-511(Nippi, 일본 소재)로 코팅된 플레이트 상에 mTeSR1 배지(StemCell Technologies, 캐나다 밴쿠버 소재) 또는 Stem Fit 배지(Ajinomoto Co, 일본 소재)에서 피더가 없는 조건에서 유지되었다.
PSC의 전방 및 후방 장 스페로이드로의 분화
hPSC의 확정 내배엽으로의 분화는 이전에 기술된 방법18,19을 변형하여 사용하여 유도되었다. 간단히 말해서, hiPSC의 콜로니가 Accutase(Thermo Fisher Scientific Inc., 미국 매사추세츠주 월섬 소재)에서 분리되고 150,000개 세포/mL가 매트리겔 코팅된 조직 배양 플레이트(VWR Scientific Products, 펜실베이니아주 웨스트 체스터 소재)에 도말되었다. 배지는 1일차에 100 ng/mL 액티빈 A(R & D Systems, 미네소타주 미니애폴리스 소재) 및 50 ng/mL 뼈 형태형성 단백질 4(BMP4; R & D Systems), 2일차에 100 ng/mL 액티빈 A 및 0.2% 우 태아 혈청(FCS; Thermo Fisher Scientific Inc.) 및 3일차에 100 ng/mL 액티빈 A 및 2% FCS를 함유하는 RPMI 1640 배지(Life Technologies, 캘리포니아주 칼스 배드 소재)로 변경되었다. 4 내지 7일차에 대해, 세포는 전방 장 세포 유도를 위해 200 ng/mL 노긴(NOG; R & D Systems), 500 ng/ml 섬유아세포 성장 인자 4(FGF4; R & D Systems) 및 2 μM CHIR99021(Stemgent, 미국 매사추세츠 주 캠브리지 소재)이 보충되고 후방 장 세포 유도를 위해 500 ng/ml FGF 4 및 3 μM CHIR99021이 보충된 15 mM HEPES, 2 mM L-글루타민, 페니실린-스트렙토마이신, B27(Life Technologies) 및 N2(Gibco, 메릴랜드주 록빌 소재)를 갖는 장 성장 배지(Advanced DMEM/F12(Thermo Fisher Scientific Inc.)에서 배양되었다. 세포 분화를 위한 배양물은 5% CO2/95% 공기의 분위기에서 37℃로 유지되었고 배지는 매일 교체되었다.
전방-후방 경계 스페로이드 형성
7일차에, 전방 또는 후방 장 세포는 37℃에서 TrypLE Express(Life Technologies)와 함께 배양함에 의해 단일 세포로 분리되었다. 세포는 1000 rpm에서 3분 동안 원심 분리되고, 상청액을 제거한 후, 펠렛은 10 uM의 Y-27632 디하이드로클로라이드(Tocris Bioscience, 영국 브리스톨 소재)를 함유하는 장 성장 배지에 재-현탁되었다. 전방 또는 후방 장 세포 현탁액은 10,000 세포/웰의 밀도로 96 웰 둥근 바닥 초저 부착 플레이트(Corning Inc) 상에 도말되고 24시간 동안 37℃에서 배양되어 스페로이드를 형성하였다. 8일차에, 생성된 단일 전방 장 스페로이드 및 후방 장 스페로이드는 장 성장 배지에서 96 웰 둥근 바닥 초저 부착 플레이트 상에서 24시간 동안 혼합되어 융합된 경계 스페로이드(A-P 스페로이드)를 형성했다.
간-담도-췌장(HBP) 오가노이드 배양 및 이식
9일차에, A-P 스페로이드는 매트리겔 드롭에 포매되고 장 성장 배지에서 배양되어 다중-기관 HBP 오가노이드를 생성했다. 장기 배양의 경우, HBP 오가노이드는 해부되고/되거나 13일차에 공기-액체 계면 배양을 위해 트랜스웰로 이전되었다. 스페로이드에 대한 배양은 5% CO2/95% 공기의 분위기에서 37℃로 유지되었고 장 성장 배지는 4일마다 교체되었다. 13일차에 단일 HBP 오가노이드는 12주령의 수컷 면역 결핍 NSG(NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ) 마우스에서 신장의 서브캡슐에 이식되었다. 모든 실험은 CCHMC의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인(프로토콜 IACUC2018-0096) 하에서 수행되었다.
H&E 염색 및 면역조직화학
스페로이드와 오가노이드는 매트리겔로부터 수집되고 4% 파라포름알데히드(PFA)에 고정되고 파라핀에 포매되었다. 절편은 H&E 및 면역조직화학 염색을 받았다. 1차 항체는 표 1에 나열되어 있다. 면역조직화학 염색은 ultraView Universal DAB 검출 키트(Roche Diagnostics, 스위스 바젤 소재)를 사용하여 수행되었다. 표본은 현미경으로 관찰되었다.
온조직표본 면역조직화학 염색을 위해, 스페로이드 및 오가노이드는 매트리겔로부터 수집되고 30분 동안 4℃에서 세포 회수 용액으로 처리하여 잔여 매트리겔이 제거되었다. 조직은 PBS로 세척되고 밤새 4℃에서 4% PFA에 고정되었다. 고정된 샘플은 실온에서 15분 동안 0.5% Triton X100으로 4% PFA에 의해 처리되고 실온에서 15분 동안 0.1% Tween 20(Sigma)으로 투과되었다. 샘플은 차단 용액(1% BSA, 0.3% Triton X100)으로 실온에서 1시간 동안 처리되고 차단 용액에 희석된 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션되었다. 세정 후, 형광 염료-결합 2차 항체를 실온에서 2시간 동안 시료에 적용했다. 1차 및 2차 항체는 표 1에 나열되어 있다. 2차 항체 반응 후, 샘플은 3회 세정되었다. 핵은 DAPI 장착 용액으로 염색되었다.
염색된 부분과 온조직표본 샘플은 Nikon A1Rsi 도립 공초점 현미경으로 관찰되었다.
RNA 분리, RT―qPCR
RNA는 RNeasy 미니 키트(Qiagen, 독일 힐덴 소재)를 사용하여 분리되었다. 역전사는 제조업체의 프로토콜에 따라 RT-PCR용 SuperScript IV First-Strand 합성 시스템(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 소재)을 사용하여 수행되었다. qPCR은 QuantStudio 3 실시간 PCR 시스템(Thermo)에서 TaqMan 유전자 발현 마스터 믹스(Applied Biosystems)를 사용하여 수행되었다. 각 표적 유전자에 대한 모든 프라이머 및 프로브 정보는 Universal ProbeLibrary Assay Design Center(https://qpcr.probefinder.com/organism.jsp)에서 얻었으며 표 2에 나열되어 있다.
RNA 시퀀싱
RNA 시퀀싱을 위한 샘플 준비는 제조업체의 사용 설명서에 따라 시퀀싱용 SMART-seq v4 초저 입력 RNA 키트(Clontech Laboratories)를 사용하여 수행되었다.
간단히 말해, First-strand cDNA 합성은 3' SMART-seq CDS Primer II A에 의해 프라이밍되었으며 전사체의 5' 말단에서 템플릿 전환을 위해 SMART-Seq v4 올리고뉴클레오타이드를 사용한다. PCR 프라이머 II A는 PCR에 의해 3' SMART-Seq CDS Primer II A 및 SMART-Seq v4 올리고뉴클레오타이드에 의해 도입된 SMART 서열로부터 cDNA를 증폭했다. PCR 증폭 cDNA는 AMPure XP 비드에 고정화함에 의하여 정제되었다. 그 다음 비드는 80% 에탄올로 세정되고 cDNA는 용리 완충액으로 용리되었다. 증폭된 cDNA는 키트 사용자 설명서에 따라 Agilent 2100 Bioanalyzer 및 Agilent의 고 민감성 DNA 키트(Agilent)를 사용하여 검증되었다. 시퀀싱용 SMART-Seq v4 초저 입력 RNA 키트의 전체 길이 cDNA 출력은 Nextera XT DNA 라이브러리 준비 키트(Illumina)로 처리되었다.
RNA 프로파일은 Kallisto 소프트웨어로 컴파일되고 백만 당 전사체(TPM)로 표현되었다. 적어도 1개 샘플에서 0 초과를 요하는 임계값으로 필터링된 데이터 세트는 먼저 FGF, BMP, Hedgehog, NOTCH 및 RA 신호전달 경로와 관련된 유전자 세트를 기반으로 유전자 기능 분류를 받았다. 유전자 세트의 목록은 Molecular Signatures Database(ver 6.2)로부터 획득되었다. Cluster 3.0 소프트웨어를 사용하여 수행된 필터링된 데이터 세트에 대한 편향되지 않은 클러스터 분석. 각 클러스터에 포함된 유전자 세트의 세부 사항은 표 3에 나열되어 있다.
유세포 분석.
유세포 분석을 위해, 전방 장 세포는 GFP-표지된 iPSC에서 분화되었고 후방 장 세포는 mCherry-표지된 iPSC에서 분화되었다. 13일차에, A-P 스페로이드는 37℃에서 10분 동안 TrypLE Express의 처리에 의하여 단일 세포로 분리되었다. PBS 세정 후, 단일 세포는 BV421-접합 EpCAM 항체(BioLegend)와 함께 실온에서 30분 동안 인큐베이션되었다. PBS 세정 후, 세포 분류는 BD FACS AriaII(BD Biosciences)에 의해 수행되었다. 분석은 BD FACS DIVA 소프트웨어와 FlowJo(FlowJo, LLC)에 의해 수행되었다.
CRISPR 편집
Cas9-2A-GFP를 인코딩하는 플라스미드는 addgene(# 44719, doi: 10.1016/j.stem.2013.03.006)에서 획득되었다. PROX1 또는 HES1의 N-말단을 표적화하는 가이드 RNA는 Integrated DNA Technologies에 의해 합성되었고, pGL3-U6-sgRNA-PGK-퓨로마이신 벡터(addgene # 51133, doi: 10.1038/nmeth.2857)에 클로닝되고 RV3 유니버셜 프라이머를 사용하여 시퀀싱되었다. HDR 템플릿을 구성하기 위해 PROX1 시작 코돈 옆에 있는 상동성 암이 게놈 DNA로부터 독립적으로 증폭되었고 그 다음 고-충실도 taq 중합효소 iProof(Bio-Rad)를 사용하여 중첩 확장 PCR을 통해 tdTomato에 융합되었다. 생성된 PCR 산물은 그 다음 pCR-Blunt II-TOPO 클로닝 벡터(Invitrogen)에 클로닝되었고 생어(Sanger) 시퀀싱으로 확인되었다.
인간 iPSC는 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민 3000을 사용하여 각 플라스미드 2 μg으로 형질감염되었다. 형질감염 24시간 후, 세포는 GFP 발현에 의해 분류되어 양성 형질감염된 세포가 선택되었다. 클론 세포는 2주 동안 팽창되고 삽입된 PROX1-tdTomato 또는 고갈된 HES1 엑손 1 서열에 대해 스크리닝되고 핵형분석되었다.
아밀라제 ELISA.
오가노이드의 아밀라제 분비 수준을 측정하기 위해, 200 μL의 배양 상청액이 매트리겔에 포매된 오가노이드로부터 수집되었다. 배양 상청액은 배양 후 48시간 시점에 수집되었고 사용할 때까지 -80℃에서 보관되었다. 상청액은 1,500 rpm에서 3분 동안 그리고 파편을 펠렛화하기 위해 원심분리되었고 생성된 상청액은 제조업체의 지침에 따라 Human Amylase ELISA 키트로 분석되었다.
통계 및 재현성.
짝을 이루지 않은 양측 Student의 t-테스트, Dunn-Holland-Wolfe 테스트 또는 Welch의 t-테스트를 사용하여 통계 분석이 수행되었다. 결과는 평균 ± s.d.로 표시되었다; P 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. N-값은 달리 명시되지 않는 한 생물학적으로 독립적인 복제를 지칭한다. 짝을 이루지 않은 두 그룹 간의 비교를 위해, 두 샘플이 독립적이고 샘플의 분산이 같지 않을 때 비-모수 Brunner-Munzel 테스트가 수행되었다. 2개 초과의 샘플 간의 비교를 위해, 비-모수 Kruskal-Wallis 및 사후 hoc Dunn-Holland-Wolf 테스트가 수행되었다.
마우스 전체 배아 배양
다중-기관 3-차원 오가노이드의 배양은 성장이 개선된 전체 배아 배양 시스템(Ikemoto Scientific Technology, 일본 도쿄 소재)을 사용하여 수행될 수 있다. 다중-기관 3-차원 오가노이드는 배양 배지를 함유하는 멸균 유리 롤러 병으로 옮겨질 수 있고 플라스크는 실리콘 플러그로 닫혔다. 전달된 오가노이드의 수는 그들이 배양될 기간에 따라 다르다. 배양 병은 회전자 드럼에 부착되어 어두운 곳에서 20 rpm 및 37℃에서 가스 혼합물(주로 20% O2, 5% CO2, 75% N2, 그러나 O2 농도는 N2와 균형을 이루면서 변경될 수 있음)을 지속적으로 공급하면서 회전될 수 있다. 오가노이드는 몇 주 동안 배양될 수 있다(가장 긴 시험은 10주임). 배양 배지는 5 내지 7일마다 교체되고 Alb, Amy, C-펩타이드 수준과 같은 오가노이드 길이 및 배지 구성요소를 기반으로 생존력과 성장이 모니터링될 수 있다.
배아 전체 배양을 위해 회전식 병 배양 시스템(Ikemoto Scientific Technology Co., Ltd)이 사용되었다. E9.0 Prox1-GFP 마우스 배아가 절개되고 Advanced DMEM/F12 보충 B27 및 N2 보충제와 함께 배양 병으로 옮겼다. 전체 배아 배양 시스템 내부의 온도는 37.0℃로 유지되었다.
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모든 백분율 및 비율은 달리 명시되지 않는 한 중량으로 계산된다.
모든 백분율 및 비율은 달리 명시되지 않는 한 전체 조성물을 기준으로 계산된다.
본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 최대 수치 제한은 마치 그러한 더 낮은 수치 제한이 본원에 명시적으로 기재된 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다는 것을 이해해야 한다. 본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 최소 수치 제한은 마치 그러한 더 높은 수치 제한이 본원에 명시적으로 기재된 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함할 것이다. 본 명세서 전반에 걸쳐 주어진 모든 수치 범위는 마치 그러한 더 좁은 수치 범위가 모두 본원에 명시적으로 기재된 것처럼 그러한 더 넓은 수치 범위 내에 속하는 모든 더 좁은 수치 범위를 포함할 것이다.
본원에 개시된 치수 및 값은 인용된 정확한 수치로 엄격하게 제한되는 것으로 이해되어서는 안 된다. 대신, 달리 명시되지 않는 한, 각각의 그러한 차원은 언급된 값과 해당 값을 둘러싼 기능적으로 동등한 범위를 모두 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, "20 mm"로 개시된 차원은 "약 20 mm"를 의미하는 것으로 의도된다.
임의의 상호 참조 또는 관련 특허 또는 출원을 포함하여 본원에 인용된 모든 문헌은 명시적으로 배제되거나 달리 제한되지 않는 한 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 임의의 문헌의 인용은 본원에 공개되거나 청구된 모든 발명과 관련하여 선행 기술이거나 단독으로 또는 다른 참조 또는 참고 문헌과의 조합으로 그러한 발명을 가르치고, 제안하거나 공개한다는 것을 인정하는 것이 아니다. 또한, 이 문서에서 용어의 의미 또는 정의가 참조로 포함된 문헌에서 동일한 용어의 의미 또는 정의와 충돌하는 경우, 이 문서에서 해당 용어에 할당된 의미 또는 정의가 우선한다.
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SEQUENCE LISTING <110> CHILDREN'S HOSPITAL MEDICAL CENTER <120> HEPATO-BILIARY-PANCREATIC TISSUES AND METHODS OF MAKING SAME <130> 0719702 <150> 62/703,559 <151> 2018-07-26 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 5'Primer <400> 1 gggggaatgg accttgtata g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SOX2 3'Primer <400> 2 gcaaagctcc taccgtacca 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDX2 5'Primer <400> 3 atcaccatcc ggaggaaag 19 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDX2 3'Primer <400> 4 tgcggttctg aaaccagatt 20 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDX1 5'Primer <400> 5 aagctcacgc gtggaaag 18 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDX1 3'Primer <400> 6 gccgtgagat gtacttgttg aa 22 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HHEX 5'Primer <400> 7 cggacggtga acgactaca 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HHEX 3'Primer <400> 8 agaaggggct ccagagtaga g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALDH1A2 5'Primer <400> 9 ccacagtgtt ttccaacgtc 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALDH1A2 3'Primer <400> 10 tcctgaacag ggccaaag 18 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP26A1 5'Primer <400> 11 cgagcactcg tgggagag 18 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP26A1 3'Primer <400> 12 ccaaagagga gttcggttga 20 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RARA 5'Primer <400> 13 gccatctgcc tcatctgc 18 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RARA 3'Primer <400> 14 tccgcacgta gacctttagc 20 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RARB 5'Primer <400> 15 ccgaaaagct caccagga 18 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RARB 3'Primer <400> 16 cgatggtcag cactggaat 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RARG 5'Primer <400> 17 cagccctaca tgttcccaag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RARG 3'Primer <400> 18 ggcctggaat ctccatcttc 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HES1 5'Primer <400> 19 tgccagctga tataatggag aa 22 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HES1 3'Primer <400> 20 ctccataata ggctttgatg acttt 25 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INS 5'Primer <400> 21 aggcttcttc tacacaccca ag 22 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> INS 3'Primer <400> 22 cacaatgcca cgcttctg 18 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCG 5'Primer <400> 23 gtacaaggca gctggcaac 19 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GCG 3'Primer <400> 24 tgggaagctg agaatgatct g 21 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX2-2 5'Primer <400> 25 cgagggcctt cagtactcc 19 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NKX2-2 3'Primer <400> 26 ggggacttgg agcttgagt 19 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPA1 5'Primer <400> 27 cagcatcatc aaggcaattt at 22 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CPA1 3'Primer <400> 28 ggagctcgaa ggtgaagga 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEL 5'Primer <400> 29 ggagctcgaa ggtgaagga 19 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEL 3'Primer <400> 30 gatcccgaag gccatagtta c 21 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFTR 5'Primer <400> 31 gaagtagtga tggagaatgt aacagc 26 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFTR 3'Primer <400> 32 gctttctcaa ataattcccc aaa 23 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPN6 5'Primer <400> 33 aggctgctat aacaaccgtg a 21 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAPN6 3'Primer <400> 34 catcctcagg cacagtgaag 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB 5'Primer <400> 35 gtgaggttgc tcatcggttt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB 3'Primer <400> 36 gagcaaaggc aatcaacacc 20 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP3A7 5'Primer <400> 37 caaacttggc cgtggaaa 18 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYP3A7 3'Primer <400> 38 agtccatgtg tacgggttcc 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4A 5'Primer <400> 39 gagatccatg gtgttcaagg a 21 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HNF4A 3'Primer <400> 40 gtgccgaggg acaatgtagt 20 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFP 5'Primer <400> 41 tgtactgcag agataagttt agctgac 27 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AFP 3'Primer <400> 42 tccttgtaag tggcttcttg aac 23 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APOA2 5'Primer <400> 43 gagaaggtca agagcccaga 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> APOA2 3'Primer <400> 44 ccttcttgat caggggtgtc 20 <210> 45 <211> 43 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 45 gctaccccag ccagtgtcaa cacgacaccg gataaaccaa aga 43 <210> 46 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHES1 gRNA1 F <400> 46 caccgatccg gtgtcgtgtt gacac 25 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHES1 gRNA1 R <400> 47 ctaggccaca gcacaactgt gcaaa 25 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHES1 Seq F <400> 48 accctcagca cttgctcagt ag 22 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hHES1 Seq R <400> 49 tcttcgtctt ttctccataa taggc 25 <210> 50 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified gene sequence of WT and HES1KO (Del #11)-A <400> 50 aaaaaaaaaa ggaaaatgcc agctgatata atggagaaaa attcctcgtc 50 <210> 51 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified gene sequence of WT and HES1KO (Del #11)-B <400> 51 cccggtgcta ccccagccag tgtcaacacg acaccggata a 41 <210> 52 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified gene sequence of WT and HES1KO (Del #11)-C <400> 52 cacgacaccg gataa 15

Claims (52)

  1. 간-담도-췌장 오가노이드("HBPO" 또는 "HBP 오가노이드")로서, 상기 HBPO는 간 조직 기능, 담도 조직 기능, 외분비 췌장 기능 및 내분비 췌장 조직 기능으로부터 선택된 둘 이상의 기능을 가지는, 간-담도-췌장 오가노이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 다중-기관 3-차원 오가노이드 조성물은 전방 영역, 후방 영역 및 경계 영역을 포함하고, 상기 경계 영역은 췌장 및 십이지장 호메오박스 1(PDX1) 및 혈액생성과 관련하여-발현된 호메오박스 단백질(HHEX)을 발현하는, HBPO.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 HBPO는 담관 조직 및 췌장 조직을 포함하는, HBPO.
  4. 제3항에 있어서, 상기 담관 조직과 상기 췌장 조직은 연결되는, HBPO.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HBPO는 간 세포, 췌장 세포, 담관 세포 및 장 세포를 포함하는, HBPO.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오가노이드는 내피 세포를 포함하는, HBPO.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오가노이드는 중배엽 세포를 포함하는, HBPO.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HBPO는 내배엽 및 중배엽을 포함하는, HBPO.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HBPO는 분지형 구조를 갖는, HBPO.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오가노이드는 기능적 외분비 마커, 바람직하게는 아밀라제 및 내분비 마커, 바람직하게는 인슐린을 발현하는, HBPO.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 오가노이드는 바람직하게는 콜레시스토키닌(CCK)에 대한 반응으로 호르몬에 반응하여 아밀라아제를 분비하는, HBPO.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 점막하 선, 전이 구역, 혈관계, 면역 세포 또는 점막하 층 중 하나 이상이 실질적으로 없는, HBPO.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HBPO는 하나 이상의 전구체 세포의 확장에 의해 수득되는, HBPO.
  14. 간-담도-췌장 오가노이드("HBPO" 또는 "HBP 오가노이드")의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
    제1 확정 내배엽을 Wnt 신호전달 경로 활성화제, FGF 신호전달 경로 활성화제, 및 BMP 신호전달 경로 억제제와 접촉시켜 전방 장 스페로이드를 형성하는 단계;
    제2 확정 내배엽을 Wnt 신호전달 경로 활성화제 및 FGF 신호전달 경로 활성화제와 접촉시켜 후방 장 스페로이드를 형성하는 단계;
    상기 전방 장 스페로이드와 상기 후방 장 스페로이드가 융합되어 전장-중장 경계를 갖는 경계 오가노이드를 형성할 때까지 상기 전방 장 스페로이드를 상기 후방 장 스페로이드와 접촉시키는 단계; 및
    상기 전장-중장 경계를 갖는 상기 경계 오가노이드를 배양하여 상기 HBPO를 형성하는 단계를 포함하며;
    여기서 상기 HBPO는 담도 조직 및 췌장 조직을 포함하는, 방법.
  15. 제16항에 있어서, 상기 HBPO는 간 조직, 췌장 조직, 담관 조직 및 장 조직을 포함하는, 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 전방 장 스페로이드는 SRY-박스 2(SOX2)를 발현하는 세포를 포함하는, 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전방 장 스페로이드는 췌장 및 십이지장 호메오박스 1(PDX1) 발현 세포가 실질적으로 없는, 방법.
  18. 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후방 장 스페로이드는 췌장 및 십이지장 호메오박스 1(PDX1)을 발현하는 세포를 포함하는, 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후방 장 스페로이드는 코달 타입 호메오박스 2(CDX2)를 발현하는 세포를 포함하는, 방법.
  20. 제14항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경계 오가노이드는 췌장 및 십이지장 호메오박스 1(PDX1)을 발현하는 세포, 혈액 생성과 관련하여-발현된 호메오박스 단백질(HHEX)을 발현하는 세포, 및 프로스페로-관련된 호메오박스 1(PROX1)을 발현하는 세포를 포함하는, 방법.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후방 장 스페로이드는 CDX2를 발현하는, 방법.
  22. 제14항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경계 오가노이드는 형태형성 인자, 바람직하게는 기저막 매트릭스, 더욱 바람직하게는 매트리겔에 포매되는, 방법.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 경계 오가노이드로부터 PROX1 양성 영역을 절제하는 단계 및 상기 절제된 경계 오가노이드를 배양하여 함입 상피 및 분지 구조를 형성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HBPO는 회전 배양되는, 방법.
  25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HBPO는 상기 HBPO의 성장 및 성숙을 증가시키기 위해 일정 기간 동안 비-인간 포유동물과 같은 포유동물에 이식되고, 바람직하게는 상기 HBPO는 기관 장애를 구하기 위해 이식되는, 방법.
  26. 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 전방 장 스페로이드는 SRY-박스 2(SOX2) 발현을 특징으로 하는, 방법.
  27. 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 후방 장 스페로이드는 코달 타입 호메오박스 2(CDX2) 발현을 특징으로 하는, 방법.
  28. 제14항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합된 전방 장 스페로이드 및 상기 후방 장 스페로이드는 SOX2, CDX2, HHEX 및 PDX1의 발현을 특징으로 하는 담도-췌장 원기부를 포함하고, 여기서 PDX1 발현은 상기 융합된 전방 장 스페로이드 및 상기 후방 장 스페로이드의 경계 영역에 국소화되는, 방법.
  29. 제14항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중-기관, 3-차원 오가노이드는 내배엽 및 중배엽을 포함하는, 방법.
  30. 제14항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확정 내배엽은 배아 줄기 세포, 배아 생식 세포, 유도된 분화다능성 줄기 세포, 중배엽 세포, 확정 내배엽 세포, 후방 내배엽 세포, 후방 내배엽 세포 및 후장 세포, 바람직하게는 분화다능성 줄기 세포로부터 유래된 확정 내배엽, 더욱 바람직하게는 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포 또는 유도된 분화다능성 줄기 세포로부터 선택된 분화다능성 줄기 세포로부터 유래된 확정 내배엽으로부터 선택된 전구체 세포로부터 유래되는, 방법.
  31. 제14항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 확정 내배엽은 분화다능성 줄기 세포를 성장 인자의 TGF-베타 수퍼패밀리의 BMP 서브그룹인, 액티빈(Activin); 노달(Nodal), 액티빈A, 액티빈B, BMP4, Wnt3a 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 분자와 접촉시킴으로써 유래되는, 방법.
  32. 제14항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 WNT 신호전달 경로 활성화제는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16, GSKβ 억제제(예를 들어, CHIR99021, 즉 "CHIRON"), BIO, LY2090314, SB-216763, 리튬, 호저 억제제 IWP, LGK974, C59, SFRP 억제제 WAY-316606, 베타-카테닌 활성화제 DCA로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자로부터 선택되는, 방법.
  33. 제14항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FGF 신호전달 경로 활성화제는 FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGF10, FGF11, FGF12, FGF13, FGF14, FGF15, FGF16, FGF17, FGF18, FGF19, FGF20, FGF21, FGF22, FGF23 및 이들의 조합, 바람직하게는 FGF4 또는 FGF10, 또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 분자로부터 선택되는, 방법.
  34. 제14항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 BMP 신호전달 경로 억제제는 노긴, 도르소모르핀, LDN189, DMH-1 및 이들의 조합으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 BMP 신호전달 경로 억제제는 노긴인, 방법.
  35. 제14항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 시험관내에서 수행되는, 방법.
  36. 제14항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법의 적어도 하나의 단계는 고체 지지체 상에서 수행되는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 고체 지지체는 콜라겐, 기저막 매트릭스(매트리겔), 또는 이들의 조합에서 선택되는, 방법.
  38. 제1항에 따른 HBPO를 유도된 분화다능성 줄기 세포로부터 유래된 내피 세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 내피를 갖는 HBPO의 제조 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 내피 세포는 상기 HBPO로 상기 배양하기 전에 내피 세포(EC) 스페로이드로 형성되는, 방법.
  40. 제1항에 따른 HBPO를 유도된 분화다능성 줄기 세포로부터 유래된 중배엽 세포와 함께 배양하는 단계를 포함하는, 중배엽을 갖는 HBPO의 제조 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 중배엽 세포는 상기 HBPO로 상기 배양하기 전에 중배엽 세포(MC) 스페로이드로 형성되는, 방법.
  42. 간-담도-췌장 오가노이드("HBPO")의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
    전방 장 세포로부터 전방 장 스페로이드를 유도하고, 후방 장 세포로부터 후방 장 스페로이드를 유도하여 경계 오가노이드를 제조하는 단계; 및
    장 성장 배지에서 상기 경계 오가노이드를 배양하여 상기 HBPO를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 간-담도-췌장 오가노이드("HBPO")의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
    전방 장 세포 및 후방 장 세포로부터 전방 장 스페로이드를 유도하고 후방 장 스페로이드를 유도하여 유도 인자의 부재에서 상기 HBPO를 제조하는 단계; 및
    장 성장 배지에서 상기 경계 오가노이드를 배양하여 HBPO를 제조하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 간-담도-췌장 오가노이드("HBPO")의 제조 방법으로서, 상기 방법은:
    장 성장 배지에서 분화다능성 줄기 세포(PSC)로부터 분화된 확정 내배엽(DE)을 배양하여 전방 장 세포 및 후방 장 세포를 만드는 단계,
    전방 장 세포로부터 전방 장 스페로이드 및 후방 장 세포로부터 후방 장 스페로이드를 만들어 유도 인자의 부재에서 경계 오가노이드를 만드는 단계; 및
    (iii) 경계 오가노이드를 장 성장 배지에서 배양하여 HBPO를 만드는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장 성장 배지는 ROCK 억제제를 포함하는 배지인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 ROCK 억제제는 Y-27632인, 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 의해 생성된 HBPO 또는 경계 오가노이드.
  48. HBPO 또는 경계 오가노이드를 생산하기 위한 기계로서,
    BMP 신호전달 경로 억제제의 존재 또는 부재에서 Wnt 신호전달 경로 활성화제 및 FGF 신호전달 경로 활성화제를 함유하는 장 성장 배지; 및
    ROCK 억제제를 함유하는 장 성장 배지를 포함하는, 기계.
  49. HBPO 또는 경계 오가노이드의 생산을 위한 복수의 배양 배지의 용도로서,
    상기 복수의 배양 배지는 Wnt 신호전달 경로 활성화제 및 FGF 신호전달 경로 활성화제를 함유하는 장 성장 배지를 포함하며, 선택적으로 BMP 신호전달 경로 억제제를 포함하고; 그리고
    ROCK 억제제를 함유하는 장 성장 배지를 포함하는, 용도.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 HBPO를 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 개체는 간부전 및 선천성 간 질환과 같은 간 질환, 당뇨병과 같은 췌장 질환 또는 담도 질환으로부터 선택된 질환 상태를 갖는, 방법.
  52. 관심 있는 잠재적인 치료제를 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 오가노이드와 접촉시키는 단계, 장기 활성의 척도를 검출하는 단계, 및 상기 관심 있는 잠재적인 치료제가 상기 질환 상태의 상기 척도를 개선시키는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 담즙성 염증성 질환 및 췌장염과 같은 췌장 염증성 질환 중 하나 이상에 대한 치료를 확인하는 방법.
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