CN115074388B - 母源因子诱导的2c样全能干细胞及其转化应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种母源因子诱导的2C样全能干细胞及其转化应用，本发明解决了以下问题：1.用四个母源因子诱导产生2C样全能干细胞及相关方法；2.2C样全能干细胞体外分化为囊胚的方法；3.2C样全能干细胞体外分化为透明带壳囊胚的方法；4.一种包含四个母源因子的表达载体。本发明首次证明四个母源因子Hsf1、Zar1、Padi6和Npm2可重编程体细胞为2C样全能干细胞。这些方法和技术的建立与转化在临床医学与生物医学研究及哺乳动物物种保护研究领域具有巨大的应用潜能。

Description

母源因子诱导的2C样全能干细胞及其转化应用

技术领域

本发明一般涉及生物技术与工程领域，尤其涉及一种母源因子诱导的2C样全能干细胞及其转化应用。

背景技术

干细胞领域的三个里程碑式的进展，包括第一个里程碑小鼠胚胎干细胞系和胚胎生殖干细胞系的建立、第二个里程碑人胚胎干细胞系的建立和第三个里程碑小鼠诱导多潜能性干细胞系的建立(iPSC技术)。iPSC技术规避了卵细胞和胚胎的缺陷、免疫排斥反应及伦理的限制，实现了个体化特异的体细胞重编程，使个体化精准细胞替代治疗和再生医学成为可能。iPSC技术的建立将干细胞的研究与转化应用推入一个以全新概念发展的新领域。然而，经过二十多年的广泛研究，其机制的不可阐述性、可诱导体细胞不完全重编程导致肿瘤和生产效力低等缺陷，限制了该技术的潜在应用价值；有50多年研究历史的细胞核转移技术(SCNT技术)是目前公认的成功地诱导全能性干细胞产生的唯一方法。然而，不可克服的卵资源缺乏、异体免疫排斥和伦理上的争议是限制该技术应用的主要障碍。近期报道的联合化学小分子诱导多潜能扩展干细胞技术(EPSC技术)无疑将诱导干细胞技术向临床应用推进了一步，但存在小分子特异性不强，靶点不单一和分子机制不清楚或不可阐述性等问题。因此，揭示重编程全能干细胞的细胞因子及其分子机制仍然是国际上公认的具有战略意义的重大而尚未解决的科学问题之一。

小鼠卵母细胞在发育生长过程中积累大量母源因子(Maternal-effect factor，MF)，对卵及卵泡的发育没有影响，但在早期胚胎发育过程中发挥关键作用。受精后，母源因子以100％效率，将两个终分化的配子卵细胞和精子转化为一个具有全能分化能力的合子，标志着全能干细胞干性的获得，这是一个完全依赖母源因子的过程。随之，合子经历第一次细胞有丝分裂为2-细胞胚胎，获得全能干细胞特性并伴随胚胎基因组激活。在卵细胞-合子转变及发育到2-细胞胚胎期的时间窗内(即早期胚胎细胞获得全能干性的时间窗内)发挥极其关键的调控作用，因此母源因子很可能与早期胚胎细胞重新获得全能干性和转化为全能性干细胞密切相关。迄今为止，对于母源因子的分子作用机制及其在重编程体细胞获得全能干性和诱导全能性干细胞产生的研究仍处于起步阶段。国际上尚无母源因子诱导全能性干细胞的报道。

理论上，候选母源因子诱导体细胞重编程的分子机制具有可阐述性。其所具有的优势将有助于拓展诱导干细胞生物学技术的潜在应用前景，包括：(1)候选母源因子诱导的全能样干细胞系可以用作实验工具进一步研究诱导重编程体细胞为全能干细胞和受精后早期胚胎细胞自然重编程获得全能干性的分子机制以及随后细胞命运决定的分子机制；(2)候选母源因子诱导的全能样干细胞近似从早期胚胎获得的全能干细胞，具有更大的细胞可塑性，更可控而有效地进行后续分化为均一的组织特异的多能和/或单能干细胞。是实现临床个性化细胞替代治疗的理想细胞；(3)揭示候选母源因子的生物学功能及其分子作用机制也将为生殖医学领域中改进试管受精成功的新方法、研发新的避孕措施以及制定新的拯救濒危动物物种新方案提供新的理论基础和实践指导；(4)有助推动和促进一系列新的以卵细胞生物学为基础的干细胞生物学技术和生殖医学技术的研发和应用。

发明内容

针对上述技术中存在的不足之处，本发明提供了一种包含四个母源因子的表达载体或四个母源因子加所述标签蛋白或标签多肽的表达载体，首次证明所述四个母源因子可重编程体细胞为2C样全能干细胞。在此基础上，提供了2C样全能干细胞体外囊胚分化技术和透明带壳囊胚技术。这些方法和技术的建立与转化在临床医学与生物医学研究及哺乳动物物种保护研究领域具有巨大的应用潜能。

为实现上述目的，本发明提供一种母源因子顺式表达盒，所述母源因子顺式表达盒从5’到3’依次包含以下元件：

(1)强启动子；

(2)由具有自我剪接功能的2A多肽碱基序列连接的四个母源因子cDNA序列组合；

(3)终止密码子；

所述母源因子为小鼠(mus musculus)来源，四个母源因子为Heat shock factor1(Hsf1)，NCBI数据库参考序列:NM_008296.2；Zygote arrest 1(Zar1)，NCBI数据库参考序列:NM_174877.3；Peptidyl arginine deiminase,type VI(Padi6)，NCBI数据库参考序列:NM_153106.2和Nucleophosmin/nucleoplasmin 2(Npm2)，NCBI数据库参考序列:NM_181345.3；所述Hsf1的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；所述Zar1的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示；所述Padi6的cDNA序列如SEQ ID NO：3所示；所述Npm2的cDNA序列如SEQ ID NO：4所示；所述强启动子为EF1α。

本发明的一个实施例中，所述母源因子顺式表达盒由以下方式构建：

(1)合成从NCBI数据库获得的每个母源因子的cDNA序列；

(2)去掉前三个母源因子cDNA的终止密码子，保留最后一个母源因子的cDNA的终止密码子，分别用具有自我剪切功能的2A多肽基因碱基序列P2A、T2A、E2A将所述去除终止密码子的母源因子cDNA序列依次连接，形成由一个强启动子调控的四个母源因子cDNA序列组合的读码框，即所述四个母源因子cDNA序列组合；此时，所述母源因子顺式表达盒的终止密码子为最后一个母源因子cDNA的终止密码子。

作为优选，所述母源因子顺式表达盒还包含表达标签蛋白mGFP的cDNA序列或表达标签多肽C-Myc-DDK的DNA序列，设置于所述四个母源因子cDNA序列组合和所述终止密码子之间。

在本发明的另一个实施例中，所述母源因子顺式表达盒由以下方式构建：

(1)合成从NCBI数据库获得的每个母源因子的cDNA序列以及标签蛋白mGFP的cDNA序列或标签多肽C-Myc-DDK的cDNA序列；

(2)去掉每个母源因子cDNA的终止密码子；

(3)分别用具有自我剪切功能的2A多肽基因碱基序列P2A、T2A、E2A将所述去除终止密码子的母源因子cDNA序列依次连接，形成所述四个母源因子cDNA序列组合，第四个母源因子cDNA与标签蛋白mGFP的cDNA序列或标签多肽C-Myc-DDK的cDNA序列相连，终止密码子添加在由一个强启动子调节的开放cDNA读码框的末端。

作为优选，所述P2A的碱基序列为：

GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT；

所述T2A的碱基序列为：

GAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCA；

所述E2A的碱基序列为：

CAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCAGGTCCC。

本发明公开了一种母源因子顺式表达载体，所述母源因子顺式表达载体含有上文所述的母源因子表达盒，并且表达四个母源因子或表达四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C-Myc-DDK；所述表达载体为慢病毒载体pLenti-IRES-Puro。

本发明公开了一种利用上文所述的母源因子顺式表达载体重编程体细胞获得2C样全能干细胞的方法，包括以下步骤：

S1:构建上文所述的母源因子顺式表达载体；

S2:制备包含所述四个母源因子的慢病毒或包含所述四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C-Myc-DDK的慢病毒；

S3：构建2C报告细胞；

S4：利用所述包含所述四个母源因子的慢病毒或包含所述四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C-Myc-DDK的慢病毒感染所述2C报告细胞，获得2C样全能干细胞。

作为优选，在步骤S2中，将编码水疱性口炎病毒糖蛋白G的质粒，编码呼吸道合胞病毒rev的质粒，包含囊膜核基质表达基因Gag的质粒，包含表达蛋白酶、反转录酶和整合酶表达基因Pol的质粒，包含表达Rev应答元件RRE的质粒pMDLg/pRRE以及包含所述四个母源因子的顺式表达载体或包含所述四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C-Myc-DDK的顺式表达载体，分别共同转染293T细胞，转染后收集293T细胞培养上清，过滤去除细胞脆片后，进行低温高速离心收集，得到包含所述四个母源因子的慢病毒或包含所述四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C-Myc-DDK的慢病毒。

作为优选，在步骤S3中，利用限制性内切酶ClaI酶切及线性化Rosa26::2C::dtTomato载体，将所述载体转染至AB2.2胚胎干细胞，转染细胞获得抗潮霉素抗性，添加潮霉素到细胞培养基筛选，获得嵌入Rosa26::2C::dtTomato载体的可表达2C::tdTomato的报告细胞，即2C报告细胞。

作为优选，还包括采用PCR方法对所述2C报告细胞进行鉴定的步骤，PCR引物组序列为：

引物组1：5’-ACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACC-3’和5’-TCTCGAAGACCTGTTGCTGCTCAG-3’；

引物组2：5’-CTAGGTAGGGGATCGGGACT-3’和5’-CCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTC-3’。

作为优选，在步骤S4中，所述四个母源因子在所述2C报告细胞中表达并重编程所述2C报告细胞获得2C样全能干性和诱导产生母源因子诱导的2C样全能干细胞，高表达2C::tdTomato标记蛋白、2C细胞标记基因Mervl及其异构体和Zscan4以及RNA-seq测序结果呈现的转录基因组学特征。

本发明公开了一种利用2C样全能干细胞体外分化形成囊胚的方法，包括以下步骤：

A1：根据上文任一项所述的方法获得2C样全能干细胞；

A2：胰酶消化所述2C样全能干细胞克隆制备单细胞悬液；

A3：去除所述单细胞悬液中的饲养细胞；

A4：离心收集所述单细胞悬液的上清细胞后在基质胶中进行培养形成类胚体；

A5：去除基质胶后继续诱导分化培养所述类胚体至囊胚样结构形成。

本发明还公开了一种利用2C样全能干细胞注射到透明带壳形成透明带壳类胚体并分化形成透明带壳囊胚的方法，包括以下步骤：

B1：根据上文任一项所述的方法获得2C样全能干细胞；

B2：将所述2C样全能干细胞注射到去除了胚胎细胞的8-细胞胚胎期的空卵透明带壳内；

B3：培养所述卵透明带壳内的2C样全能干细胞，形成透明带壳类胚体；

B4：继续培养所述透明带壳类胚体至分化为透明带壳囊胚。

本发明的有益效果是：本发明用所述四个母源因子(简称4MFs)重编程体细胞获得全能样干细胞(定义为母源因子诱导的2C样全能干细胞，4MF-induced 2C-liketotipotent stem cells，MFi2CLTSCs)，这种模拟自然细胞重编程技术产生的2C样全能干细胞可以克服iPSC技术诱导体细胞不完全重编程导致肿瘤和生产效力低的缺陷，可以克服SCNT技术存在的卵资源缺乏、异体免疫排斥和伦理上的争议缺陷以及可以克服EPSC技术存在的小分子特异性不强和靶点不单一的缺陷，能更好地诱导体细胞为全能干细胞，获得的2C样全能干细胞在临床医学与生物医学研究及哺乳动物物种保护研究领域具有巨大的应用潜能。

附图说明

图1为本发明的母源因子顺式表达载体4MF2A示意图；

图2为本发明的母源因子顺式表达载体4MF2A-c-Myc-DDK示意图；

图3为本发明的母源因子顺式表达载体4MF2A-mGFP示意图；

图4为本发明的母源因子顺式表达载体4MF2A-mGFP在293T细胞中的表达结果；

图5为Western blotting检测各母源因子在293T细胞的表达；

图6为本发明构建的2C报告细胞系；

图7为本发明母源因子诱导2C::tdTomato表达的2C报告细胞在显微镜下的观察结果；

图8为本发明母源因子诱导2C::tdTomato表达的2C报告细胞流式细胞仪检测结果；

图9为本发明的母源因子诱导2C::tdTomato表达的2C报告细胞的标记基因Mervl和多潜能性干细胞标记基因Nanog的表达相互排除的免疫荧光检测结果；

图10表示本发明的母源因子诱导2C::tdTomato表达的2C报告细胞的标记基因Mervl蛋白的表达与2C::tdTomato的表达相互重叠的免疫荧光检测结果；

图11为本发明的母源因子诱导的2C样全能干细胞表达2-细胞胚胎期胚胎细胞标记基因Mervl及其异构体Mervl-b、Mervl-c和Mervl-d的mRNA表达水平；

图12为本发明的母源因子诱导的2C样全能干细胞表达2-细胞胚胎期胚胎细胞标记基因Zscan4的mRNA表达水平；

图13为2C::tdTomato分别在MFi2CLTSCs^tdTomato+(2C::tdTomato阳性表达的2C报告细胞)和MFi2CLTSCs^tdTomato-(2C::tdTomato阴性表达的2C报告细胞)第9代分选细胞中的表达；

图14为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞的形态学特征；图中a为MFi2CLTSCs^tdTomato-形成胚胎干细胞样的细胞克隆；图中b表示MFi2CLTSCs^tdTomato+在生长过程中与已报道的2C细胞克隆相同；图中c表示小部分显著高表达2C::tdTomato标记蛋白的MFi2CLTSCs^tdTomato+漂离细胞克隆，悬浮于培养基；图中d表示部分悬浮的MFi2CLTSCs^tdTomato+呈现卵细胞样的细胞不对称分裂表型；

图15为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞的转录组学的Cluster分析结果；

图16为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞的转录组学的PCA分析结果；

图17为MFi2CLTSCs^tdTomato+和MFi2CLTSCs^tdTomato-的差异表达基因分析结果；

图18为MFi2CLTSCs^tdTomato+富集表达基因调控的相关细胞生物学功能分析结果；

图19为MFi2CLTSCs^tdTomato+的特异性基因的表达特征分析结果；

图20为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞体外分化为囊胚的过程；

图21为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞体外分化为囊胚的滋养层细胞系标记蛋白Krt18表达的免疫荧光检测结果；

图22为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞体外分化为囊胚的滋养层细胞系标记蛋白Cdx2表达的免疫荧光检测结果；

图23为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞体外分化为囊胚的滋养层细胞系标记蛋白Tfap2c表达的免疫荧光检测结果；

图24为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞体外分化为囊胚的胚胎外胚层标记蛋白Gata6表达的免疫荧光检测结果；

图25为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞体外分化为透明带壳囊胚的过程；

图26为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞体外分化为透明带壳囊胚的滋养层细胞系标记蛋白Cdx2表达的免疫荧光检测结果；

图27为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞体外嵌合体形成与分化能力鉴定结果；

图28为本发明母源因子诱导的2C样全能干细胞体内嵌合体形成与分化能力鉴定结果。

具体实施方式

为了更清楚地表述本发明，下面结合附图对本发明作进一步地描述。

请参阅图，为了更清楚地表述本发明，下面结合附图对本发明作进一步地描述；除非另外指明或定义，所用的所有术语具有本领域常用的意思，这是研究与技术人员所清楚的，以及其中所引用的公知技术背景。

此处所用的术语“母源因子”是指在卵母细胞特异性表达基因/蛋白，对卵及卵泡的发育没有影响，但在早期胚胎发育过程中发挥关键作用。

此处所用的术语“全能干细胞”严格意义上是指单细胞胚胎期的合子细胞和2-细胞胚胎期的两个胚胎细胞，不仅可分化发育成为一个正常的胚胎，还可分化和发育支持胚胎体发育的胚胎外组织，包括胎盘和胎囊。

此处所用的术语“分化发育”是指从同一来源的细胞逐渐产生出形态结构和功能性特征不同的细胞类群的过程。

此处所用的术语“标记基因/蛋白”是指特异性地在一个特定类型细胞表达的基因/蛋白，也就是标记这类特定细胞存在的标记。

此处所用的术语“2C细胞”是指在小鼠胚胎干细胞(mESCs)中短暂存在的具有全能干性的全能干细胞，表达仅在2-细胞期胚胎细胞表达的标记基因/蛋白Mervl，有分化发育为胚胎与胚胎外胚层的潜能，与2-细胞胚胎期的两个胚胎细胞类似。

此处所用的术语“2C报告细胞”在本发明具体实施中是特指表达单细胞和2-细胞胚胎期胚胎细胞特异性表达基因Mervl的长终末重复启动子驱动的荧光标记蛋白tdTomato表达。参考Macfarlan等报告的方法，利用2C：：tdTomato报告基因标记母源因子诱导的2-细胞样全能性干细胞。

此处所用的术语“转录谱”是指在细胞中表达并且执行功能的基因谱。

此处所用的术语“2C样全能干细胞”在本发明具体实施中是指用所述四个母源因子(Four maternal-effect factors，4MFs)重编程2C报告细胞为一种2C样全能干细胞，具有类似晚期2-细胞胚胎期胚胎细胞的分子特征和全能干细胞分化与发育的潜能，因此，在本发明中特定定义为母源因子诱导的2C样全能干细胞(4MF-induced 2C-like totipotentstem cells，MFi2CLTSCs)，表达2C::tdTomato标记蛋白和RNA-seq测序结果呈现的转录组学特征。

此处所用的术语“细胞重编程”是指分化的体细胞在特定的条件下去分化后逆转再分化发育为全能性、多潜能性、多能性或单能性干细胞的过程。

本发明的遗传构建表达载体通过将本发明的基因核苷酸序列插入到本身已知的适当的表达载体中而获得。本发明的遗传构建表达载体可用于转化宿主细胞。宿主细胞是专业人才所明确的；可以是任何真核细胞或细胞系。

除非另外指明或定义，本发明用M15完全培养基培养AB2.2胚胎干细胞、2C报告细胞和4MFs诱导的2C样全能干细胞。M15完全培养基的组分包括：DMEM containing highglucose(含高糖DMEM培养基)；L-Glutamine(L-谷氨酰胺)200mM；1X Penicillin-Streptomycin(青霉素-链霉素混合液)；1X MEM non-Essential Amino Acids(NEAA)(非必需氨基酸最低基本培养基)；15％FBS(ES-grade)(干细胞培养级的胎牛血清)；0.05mMβ-mercaptoethanol(巯基乙醇)；mLIF(小鼠白血病抑制因子)1000U/ml。

主要实验材料

CD-1(ICR)IGS小鼠：购自维通利华；

Rosa26::2C::dtTomato:中国医学科学院北京协和医学院基础研究所获取；

AB2.2胚胎干细胞和表达EGFP的AB2.2胚胎干细胞：中国医学科学院北京协和医学院基础研究所获取；

293T细胞：西班牙国家癌症研究中心Dr.Manuel Serrano获取；

4MF2A DNA序列：GeneScript公司合成；

pLenti-C-Myc-DDK-IRES-Puro和pLenti-C-mGFP-IRES-Puro:购自OriGene公司(英国)；

ViraPower packaging mix and lipofectamine 2000试剂盒：购自Invitrogen公司；

Ultra-15centrifugal filters：购自Millipore公司；

小鼠白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor from mouse，mLIF)：购自Millipore公司；

DMEM containing high glucose(含高糖DMEM培养基)：购自Invitrogen；

L-Glutamine(L-谷氨酰胺)：购自Invitrogen；

Penicillin-Streptomycin(青霉素-链霉素混合液)：购自Invitrogen；

MEM non-Essential Amino Acids(NEAA，非必需氨基酸最低基本培养基)：购自Invitrogen；

β-mercaptoethanol(巯基乙醇)：购自Gibco；

FBS(ES-grade)(胎牛血清，干细胞培养级)：购自VISTECH；

Matrigel：购自BD公司；

抗Hsf1抗体:购自OriGene公司；

抗Zar1抗体:购自Origene公司；

抗mGFP抗体:购自OriGene公司；

抗Cdx2抗体:购自Biogenex公司；

抗Krt18抗体:购自Affinite公司；

抗Gata6抗体：购自Affinite公司；

抗Tpfa2c抗体：购自Affinite公司；

抗Nanog抗体：购自Abcam公司；

抗Mervl-gag抗体：购自Beyotime公司。

实施例1：构建母源因子顺式表达盒

为了使得母源因子能有效在细胞内进行表达，首先构建包含四个母源因子的顺式表达盒和四个母源因子加标签蛋白或标签多肽的顺式表达盒。四个母源因子为Hsf1、Zar1、PPadi6和Npm2；Hsf1的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；Zar1的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示；Padi6的cDNA序列如SEQ ID NO：3所示；Npm2的cDNA序列如SEQ ID NO：4所示。

一、不含表达标签的母源因子顺式表达盒

从5’到3’依次包含以下元件：

(1)强单启动子EF1α；

(2)由具有自我剪接功能的2A多肽碱基序列连接的四个母源因子cDNA序列组合；

(3)终止密码子；

母源因子顺式表达盒由以下方式构建：

(1)合成从NCBI数据库获得的每个母源因子的cDNA序列；

(2)去掉前三个母源因子cDNA的终止密码子，保留最后一个母源因子cDNA的终止密码子；

(3)分别用具有自我剪切功能的2A多肽基因碱基序列P2A、T2A、E2A将去除终止密码子的母源因子cDNA序列依次连接，形成由一个强启动子调控的四个母源因子cDNA序列组合的读码框，即四个母源因子cDNA序列组合；此时，母源因子顺式表达盒的终止密码子为最后一个母源因子cDNA的终止密码子。

二、带表达标签的母源因子顺式表达盒

从5’到3’依次包含以下元件：

(1)强单启动子EF1α；

(2)由具有自我剪接功能的2A多肽碱基序列连接的四个母源因子cDNA序列组合；

(3)表达标签蛋白mGFP的cDNA序列或表达标签多肽C-Myc-DDK的cDNA序列；

(4)终止密码子；

母源因子顺式表达盒由以下方式构建：

(1)合成从NCBI数据库获得的每个母源因子的cDNA序列以及标签蛋白mGFP的cDNA序列或标签多肽C-Myc-DDK的cDNA序列；

(2)去掉每个母源因子cDNA的终止密码子；

(3)分别用具有自我剪切功能的2A多肽基因碱基序列P2A、T2A、E2A将去除终止密码子的母源因子cDNA序列依次连接，形成四个母源因子cDNA序列组合，第四个母源因子cDNA与标签蛋白mGFP的cDNA序列或标签多肽C-Myc-DDK的cDNA序列相连，终止密码子添加在由一个强启动子调节的开放cDNA读码框的末端。

上述两种母源因子顺式表达盒中，2A多肽基因碱基序列如下：

P2A：

GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT；

T2A：

GAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCA；

E2A：

CAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCAGGTCCC。

实施例2构建母源因子顺式表达载体

分别将实施例1构建好的母源因子顺式表达盒插入慢病毒载体pLenti-IRES-Puro的适合酶切位点，获得强单启动子控制的四个母源因子顺式表达载体，4MF2A、4MF2A-c-Myc-DDK和4MF2A-mGFP，参见图1-图3，图1为母源因子顺式表达载体4MF2A示意图，图2为母源因子顺式表达载体4MF2A-c-Myc-DDK示意图，图3为母源因子顺式表达载体4MF2A-mGFP示意图。

为了证明四个母源因子是否表达，待插入完成后，用化学转染方法，将慢病毒载体导入293T细胞，48小时后，带mGFP标签的4MFs在293T细胞表达，表达结果见图4，表明4MF2A-mGFP在293T细胞中的表达；收集细胞，检测母源因子的表达，如图5所示，Western blotting结果显示母源因子Hsf1、母源因子Zar1和mGFP的表达；参见图3，母源因子Padi6的编码序列位于母源因子Zar1和母源因子Npm2之间，且母源因子Npm2与mGFP融合在一起，mGFP的表达意味着母源因子Padi6和母源因子Npm2也表达了，即各个母源因子在293T细胞均表达。

实施例3：构建2C报告细胞系

首先用限制性内切酶ClaI酶切和线性化Rosa26::2C::dtTomato载体，然后用电转染的方法将其导入预先准备的AB2.2胚胎干细胞，转染细胞获得抗潮霉素(Hygromycin)抗性。加200mg/ml的潮霉素到培养基，筛选6-7天后，用PCR方法鉴定Rosa26::2C::dtTomatoDNA整合到AB2.2胚胎干细胞DNA基因组的细胞克隆。这些细胞称为2C报告细胞，包含0.25％的2C::dtTomato阳性细胞。如图6所示，在10倍显微镜下，每个视野包含2-4个2C::tdTomato表达阳性的细胞。其中，PCR方法鉴定时所用的引物组序列为：

引物组1：5’-ACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACC-3’和5’-TCTCGAAGACCTGTTGCTGCTCAG-3’(5.4kb)；引物组1获得的PCR产物序列长度为5.4kb；

引物组2：5’-CTAGGTAGGGGATCGGGACT-3’和5’-CCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTC-3’(1.9kb)；引物组2获得的PCR产物序列长度为1.9kb。

实施例4：包含4MFs的慢病毒的制备

制备出包含4MFs的慢病毒，更为具体步骤为：用化学转染的方法制备慢病毒颗粒(ViraPower packaging mix and lipofectamine 2000试剂盒)，将编码水疱性口炎病毒糖蛋白G的质粒，编码呼吸道合胞病毒rev的质粒，包含囊膜核基质表达基因Gag的质粒、包含表达蛋白酶、反转录酶和整合酶表达基因Pol的质粒、包含表达Rev应答元件RRE的质粒pMDLg/pRRE以及实施例2制备的母源因子顺式表达载体共同转染293T细胞，过夜培养后，更换新鲜培养基。转染后48小时和72小时收集293T细胞培养上清，用0.45uM滤器过滤去除细胞脆片后，加入到超滤离心管(Ultra-15 centrifugal filters)进行低温高速离心收集病毒颗粒。病毒颗粒收集后立即用于感染2C报告细胞，或者在-80℃下冻存备用。

实施例5：用4MFs诱导2C报告细胞为2C样全能干细胞及鉴定

以2.0×10⁵个六孔板每孔的密度接种实施例3制备的2C报告细胞在小鼠饲养层细胞包被的六孔板，24小时后，按100％感染的病毒感染量将实施例4制成的病毒颗粒感染4次，加入聚凝胺(终浓度8ug/ml)，每次感染间隔12小时(即上午8点，晚上8点和第二天上午8点各一次，下午8点换液)。传代扩增后，用流式细胞仪分选表达2C::tdTomato的2C报告细胞高达50％(4MFs诱导的2C::tdTomato阳性2C报告细胞)，显微镜下观察结果见图7，流式细胞仪检测结果见图8。

本申请发明人用细胞免疫荧光染色方法，具体地，用DAPI即4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole)进行荧光染色初步鉴定4MFs诱导的2C::tdTomato阳性2C报告细胞，如图9所示，在2C::tdTomato阳性表达的2C报告细胞中，Mervl蛋白的表达与多潜能性干细胞标记基因Nanog的表达相互排除；如图10所示，Mervl蛋白的表达与2C::tdTomato的表达相互重叠，提示2C::tdTomato的表达代表细胞Mervl蛋白的表达。进一步，用流式细胞分选仪分选这些2C::tdTomato阳性表达和2C::tdTomato阴性表达的2C报告细胞(分别定义为MFi2CLTSCs^tdTomato+和MFi2CLTSCs^tdTomato-)进行下游实验。

进一步地，本申请发明人用RT-qPCR方法进行对4MFs诱导的2C::tdTomato阳性2C报告细胞进行鉴定，检测结果参见图11-12，2-细胞胚胎期细胞特异性表达基因Mervl及其异构体Mervl-b、Mervl-c、Mervl-d(图11)和Zscan4(图12)在2C::tdTomato阳性的2C报告细胞高表达，表明4MFs诱导的这些2C::tdTomato阳性表达的2C报告细胞(简称MFi2CLTSCs^tdTomato+)是一种全能样干细胞，即母源因子诱导的2C样全能性干细胞(4MF-induced 2C-like totipotent stem cells，MFi2CLTSCs)；参见图13，2C::tdTomato分别在MFi2CLTSCs^tdTomato+(2C::tdTomato阳性表达的2C报告细胞)和MFi2CLTSCs^tdTomato-(2C::tdTomato阴性表达的2C报告细胞)第9代分选细胞中的表达具有显著的差异。

再进一步地，本申请发明人对四个母源因子诱导的2C样全能干细胞(MFi2CLTSCs^tdTomato+)的形态学特征进行了分析，参见图14，与MFi2CLTSCs^tdTomato-比较显微镜下观察和分析结果，MFi2CLTSCs^tdTomato-在培养过程中，形成胚胎干细胞样的细胞克隆(图14a)，而MFi2CLTSCs^tdTomato+在生长过程中，与已报道的2C细胞克隆相同，部分2C::tdTomato阳性细胞变成2C::tdTomato阴性细胞(图14b中短箭头和图14c中的右下框中短箭头所示)。小部分显著高表达2C::tdTomato标记蛋白的MFi2CLTSCs^tdTomato+漂离细胞克隆，悬浮于培养基(图14c)。部分这些悬浮的MFi2CLTSCs^tdTomato+呈现卵细胞样的细胞不对称分裂表型(图14c中的上框中短箭头和图14d中的短箭头所示)。也有小部分悬浮的MFi2CLTSCs^tdTomato+可继续生长和发育为细胞克隆(图14b中的长箭头和图14c中的长箭头所示)。总之，形态学上，MFi2CLTSCs^tdTomato+呈现不同于已报道ESCs、iPSCs和EPSCs。

更进一步地，本申请发明人对MFi2CLTSCs^tdTomato+和MFi2CLTSCs^tdTomato-进行了转录组测序分析比较。测序结果映射后，基因表达水平采用RPKM(RPKM是Reads Per Kilobaseper Million mapped reads的缩写，代表每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数)来表示，通过与现有的细胞转录组测序数据进行比较分析，进一步确定了MFi2CLTSCs^tdTomato+的分子表达特性和性质，结果如图15-19所示：

(1)Cluster分析结果如图15所示，PCA分析结果如图16所示，Cluster和PCA分析结果表明MFi2CLTSCs^tdTomato+与2-细胞胚胎晚期细胞和2C细胞类似；

(2)MFi2CLTSCs^tdTomato+和MFi2CLTSCs^tdTomato-的差异表达基因分析结果如图17所示，MFi2CLTSCs^tdTomato+和MFi2CLTSCs^tdTomato-之间存在663个显著差异表达基因，其中226个基因上调表达，437个基因下调表达；

(3)MFi2CLTSCs^tdTomato+富集表达基因调控的相关细胞生物学功能分析结果如图18所示，MFi2CLTSCs^tdTomato+富集表达基因调控的相关细胞学生物学功能与染色质重塑、DNA甲基化、蛋白质磷酸化与去磷酸化、RNA聚合酶II调节的转录抑制、细胞成分的合成与运输等密切相关，与正常单细胞胚胎与2-细胞胚胎期细胞富集基因及其生物学功能过程类似；

(4)参见图19，MFi2CLTSCs^tdTomato+显著高表达2-细胞胚胎期细胞特异性表达基因，这些基因在功能上有协同促进细胞基因组处于一种转录抑制状态，这种状态与已报导的正常小鼠2-细胞胚胎晚期细胞的基因功能状态类似。

总之，这些结果证明MFi2CLTSCs^tdTomato+的转录功能基因组类似正常小鼠2-细胞胚胎晚期细胞的分子表达特征，支持MFi2CLTSCs^tdTomato+是2C样全能干细胞。目前尚未有报道全能干细胞转录谱特征，本申请发明人首次揭示了2C样全能干细胞的功能基因谱。

实施例6：MFi2CLTSCs^tdTomato+体外分化为囊胚

母源因子诱导的2C样全能干细胞体外分化为囊胚的过程如图20所示。首先，用0.05％胰酶消化MFi2CLTSCs^tdTomato+克隆制备单细胞悬液，加入预先用0.1％明胶的包被的培养皿，在培养箱放置30分钟，以去除饲养细胞。然后，离心收集上清细胞，重悬单细胞在基质胶(Matrigel)培养3-5分钟，待基质胶凝固后，加M15完全培养基培养。48小时后，换液为撤出mLIF的M15培养基，继续培养3-4天，类胚体(EB^MFi2CLTSCs)形成后，通过轻柔吹打，去除基质胶，继续类胚体培养第6-7天，获得高达25％的类胚体囊胚样结构(blastocyst^MFi2CLTSCs)。

其次，本申请发明人用细胞免疫荧光染色方法，具体地，用DAPI即4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole)进行荧光染色检测所述囊胚样结构是否有胚胎外胚层的分化发育，结果参见图21-24，显示blastocyst^MFi2CLTSCs表达滋养层细胞系标记蛋白Krt18(图21)、Cdx2(图22)、Tfap2c(图23)和原始胚外内胚层标记蛋白Gata6(图24)。

实施例7：MFi2CLTSCs^tdTomato+体外分化为透明带壳囊胚

母源因子诱导的2C样全能干细胞体外分化为透明带壳囊胚的过程参见图25。首先，预先吸出8-细胞胚胎内的细胞，用PBS洗两次，然后注射35颗MFi2CLTSCs^tdTomato+细胞到空卵透明带壳(Empty-zona)，转移到50ul的M15完全培养基培养48小时后，换液为添加mLIF的M15培养基继续培养，3-4天后，MFi2CLTSCs^tdTomato+生长为较致密的类胚体样细胞团，简称为透明带壳类胚体(Zona-EB^MFi2CLTSCs)。5-6天后，逐步分化发育为囊胚样的结构，简称为透明带壳囊胚(Zona-blastocyst^MFi2CLTSCs)。

其次，用实施例6采用的细胞免疫荧光染色方法检测，免疫荧光染色结果如图26所示，透明带壳囊胚表达滋养层细胞系的标记蛋白Cdx2，这些细胞分布在透明带壳囊胚的外周。

实施例8：MFi2CLTSCs^{EGFP/tdTomato+}体外嵌合体形成与分化能力鉴定

用0.05％胰酶消化MFi2CLTSCs^{EGFP/tdTomato+}(表达标签蛋白EGFP的2C样全能干细胞)克隆制备单细胞悬液，将单颗MFi2CLTSC^{EGFP/tdTomato+}细胞注射到预先准备的小鼠桑椹胚(E2.5胚胎)。24小时后，将发育至囊胚期的胚胎(E3.5胚胎)，分别用于验证MFi2CLTSCs^{EGFP /tdTomato+}体外和体内嵌合体的形成能力。母源因子诱导的2C样全能干细胞体外嵌合体形成与分化能力鉴定结果参见图27，如图27中的a部分所示，高达45％的单颗MFi2CLTSCs^{EGFP /tdTomato+}细胞分化发育嵌合到滋养层细胞系；而单颗MFi2CLTSCs^{EGFP/tdTomato-}细胞没有嵌合到滋养层细胞系(图27中的b部分所示)。

实施例9：MFi2CLTSCs^{EGFP/tdTomato+}体内嵌合体形成与分化能力鉴定

继续实施例8，将已分化发育至囊胚期的胚胎移植到假孕E2.5天雌性小鼠子宫角。分别在孕鼠E6.5和E10.5天时，用断颈法处死，从小鼠子宫取出胚胎和胚外组织，用荧光提示显微镜检查MFi2CLTSCs^{EGFP/tdTomato+}嵌合到胚胎、胎盘和卵黄囊组织情况。母源因子诱导的2C样全能干细胞体内嵌合体形成与分化能力鉴定结果如图28所示，MFi2CLTSCs^{EGFP/tdTomato+}在E6.5和E10.5天小鼠的胎盘嵌合率分别高达40％(图28中的a)和60％(图28中的b)，而MFi2CLTSCs^{EGFP/tdTomato-}不能嵌合到胚胎外胚层(图28中的c和d)。

本申请发明人通过上述实施例6-9验证了MFi2CLTSCs^tdTomato+的分化潜能，进一步证实了4MFs诱导的2C报告细胞其是一种2C样全能干细胞。

以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 北京大学深圳医院

<120> 母源因子诱导的2C样全能干细胞及其转化应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1512

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

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actgtctcct ag 1512

<210> 2

<211> 1086

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

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atttag 1086

<210> 3

<211> 2049

<212> DNA

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

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<213> 小鼠(Mus musculus)

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aagaagccag tgaccaagaa atga 624

Claims (11)

1.一种母源因子顺式表达盒，其特征在于，所述母源因子顺式表达盒从5’到3’依次包含以下元件：

（1）强启动子；

（2）由具有自我剪接功能的2A多肽碱基序列连接的四个母源因子cDNA序列组合；

（3）终止密码子；

所述四个母源因子为Hsf1、Zar1、Padi6和 Npm2；所述Hsf1的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示；所述Zar1的cDNA序列如SEQ ID NO：2所示；所述Padi6的cDNA序列如SEQ ID NO：3所示；所述Npm2的cDNA序列如SEQ ID NO：4所示；所述强启动子为EF1α。

2.根据权利要求1所述的母源因子顺式表达盒，其特征在于，还包含表达标签蛋白mGFP的cDNA序列或表达标签多肽C-Myc-DDK的cDNA序列，设置于所述四个母源因子cDNA序列组合和所述终止密码子之间。

3.根据权利要求1或2所述的母源因子顺式表达盒，其特征在于，所述2A多肽碱基序列为P2A、T2A和E2A，所述P2A的碱基序列为：

GCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGATGTTGAAGAAAACCCCGGGCCT；

所述T2A的碱基序列为：

GAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCA；

所述E2A的碱基序列为：

CAGTGTACTAATTATGCTCTCTTGAAATTGGCTGGAGATGTTGAGAGCAACCCAGGTCCC。

4.一种母源因子顺式表达载体，其特征在于，所述母源因子顺式表达载体含有权利要求3所述的母源因子表达盒，并且表达四个母源因子或表达四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C-Myc-DDK；表达载体为慢病毒载体pLenti-IRES-Puro。

5.一种体外利用权利要求4所述母源因子顺式表达载体重编程体细胞获得2C样全能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1: 构建权利要求4所述的母源因子顺式表达载体；

S2: 制备包含所述四个母源因子的慢病毒或包含所述四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C-Myc-DDK的慢病毒；

S3：构建2C报告细胞；

S4：利用包含所述四个母源因子的慢病毒或包含所述四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C-Myc-DDK的慢病毒感染所述2C报告细胞，获得2C样全能干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤S2中，将编码水疱性口炎病毒糖蛋白G的质粒，编码呼吸道合胞病毒 rev的质粒，包含囊膜核基质表达基因Gag的质粒，包含表达蛋白酶、反转录酶和整合酶表达基因Pol的质粒，包含表达Rev应答元件RRE的质粒pMDLg/pRRE以及包含所述四个母源因子的顺式表达载体或包含所述四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C-Myc-DDK的顺式表达载体，分别共同转染293T细胞，转染后收集293T细胞培养上清，过滤去除细胞脆片后，进行低温高速离心收集，得到包含所述四个母源因子的慢病毒或包含所述四个母源因子加标签蛋白mGFP或标签多肽C-Myc-DDK的慢病毒。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤S3中，利用限制性内切酶ClaI酶切及线性化Rosa26：：2C::dtTomato载体，将所述载体转染至AB2.2 胚胎干细胞，转染细胞获得抗潮霉素抗性，添加潮霉素到细胞培养基筛选，获得嵌入Rosa26：：2C::dtTomato载体的可表达2C：：tdTomato的报告细胞，即2C报告细胞。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括采用PCR方法对所述2C报告细胞进行鉴定的步骤，所述PCR引物组序列为：引物组1：5’ - ACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACC-3’和5’-TCTCGAAGACCTGTTGCTGCTCAG-3’ ；引物组2：5’-CTAGGTAGGGGATCGGGACT-3’和5’-CCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTC-3’。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在步骤S4中，所述四个母源因子在所述2C报告细胞中表达并重编程所述2C报告细胞获得2C样全能干性和诱导产生母源因子诱导的2C样全能干细胞，高表达2C::tdTomato标记蛋白、2C细胞标记基因Mervl及其异构体和Zscan4以及RNA-seq测序结果呈现的转录基因组学特征。

10.一种利用2C样全能干细胞体外分化形成囊胚的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A1：根据权利要求5-9任一项所述的方法获得2C样全能干细胞；

A2：胰酶消化所述2C样全能干细胞克隆制备单细胞悬液；

A3：去除所述单细胞悬液中的饲养细胞；

A4：离心收集所述单细胞悬液的上清细胞后在基质胶中进行培养形成类胚体；

A5：去除基质胶后继续诱导分化培养所述类胚体至囊胚样结构形成。

11.一种利用2C样全能干细胞注射到透明带壳形成透明带壳类胚体并分化形成透明带壳囊胚的方法，其特征在于，包括以下步骤：

B1：根据权利要求5-9任一项所述的方法获得2C样全能干细胞；

B2：将所述2C样全能干细胞注射到去除了胚胎细胞的8-细胞胚胎期的空卵透明带壳内；

B3：培养所述卵透明带壳内的2C样全能干细胞，形成透明带壳类胚体；

B4：继续培养所述透明带壳类胚体至分化为透明带壳囊胚。

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