CN102286532A - 一种获得诱导性多能干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种获得诱导性多能干细胞的方法，利用p53siRNA、VPA和Vc联合Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc之间的协同作用，有效抑制p53蛋白表达，降低细胞凋亡，促进多能基因Oct4表达，改变细胞周期，获得高效诱导性多能干细胞。本发明方法获得的诱导性多能干细胞可促进了多能干细胞在药物筛选、疾病机理研究、生物组织工程、细胞移植等生物学领域的应用。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种高效获得诱导性多能干细胞的方法。
背景技术
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)是一类高度未分化细胞，具发育全能性。在适当条件下可以无限增殖，能分化出成体动物组织和器官的所有细胞，如造血细胞、神经细胞、胰岛素细胞、心肌细胞等，在动物克隆、转基因动物生产、疾病治疗、组织工程、再生医学、疾病机理和治疗研究、药物发现和评价等诸多领域极具应用价值。
人ESCs的研究一直面临着许多难题和争议。支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行ESCs研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时的生命形式。破坏胚胎已经触及了人类伦理观念甚至宗教和法律等问题，这是人ESCs研究面临的最大障碍。同时，作为为临床组织器官或细胞移植提供大量材料的“种子细胞”，ESCs定向诱导分化的终末器官或细胞不能存在同种异型个体间的移植排斥，这就要求剔除ESCs中的免疫排斥基因，而这一难题一直困扰着免疫学界及医学界。伦理法律以及免疫排斥等壁垒，制约了ESCs技术的进一步发展和应用。
人们努力尝试不同途径实现体细胞重编程以获取ESCs或ESCs样的细胞。细胞核移植是其中的一种主要技术，即将患者体细胞与ESCs的细胞融合，但这种方法获得的ESCs是四倍体，不适用于临床，而且克隆效率低，产生的许多后代在各个阶段出现严重的发育异常。同时，卵母细胞来源使得核移植实验受到强烈伦理学质疑。
诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的问世，较好地回避了长期以来围绕人类胚胎干细胞使用问题的伦理争论，同时自体细胞重编程也克服了异体移植存在的免疫排异问题。
2006，日本科学家通过导入4种转录因子Oct4，Sox2，c-Myc，Klf4成功将鼠的体细胞重编程为ESCs状态，即iPSCs，随后，人的iPSCs也用同样的基因改造方法获得。这是科学史上的重大突破，在干细胞、发育生物学和医学研究领域中具有里程碑意义。iPSCs具有与ESCs类似的生物学特征，如细胞体积较小，细胞核大，胞质胞浆少。体外培养时，细胞排列紧密，呈克隆状生长，克隆和周围存在明显界限，而形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。表达时相专一性胚胎抗原(Stage specific embryonic antigen，SSEA)，可以检查到Oct4基因的表达，SSEA和Oct4蛋白是发育全能性的标志。iPSCs还表达ESCs其它特征性表面抗原如Tra-1-60、Tra-1-81，细胞特征性内源蛋白Nanog、Sox2、Lin28等，iPSCs中碱性磷酸酶AP及端粒酶活性也较高。将iPSCs注入免疫缺陷小鼠体内，能形成含有3个胚层的畸胎瘤。iPSCs体外可以分化成多种细胞谱系，如：神经前体细胞、功能性的成熟神经细胞，造血前体细胞、造血细胞、血管内皮细胞，分泌胰岛素的β细胞，心肌细胞等。2009年7月，中国科学家周琪、曾凡一、高绍荣等利用iPSCs克隆出活体实验鼠，首次证明iPSCs与ESCs一样具有全能性。全基因组微阵列分析表明，iPSCs基因总表达谱接近于ESCs，而不是原来的靶向细胞。
患者来源的体细胞重编程获得的iPSCs，是“个体特异的”或“疾病特异的”iPSCs，不仅可以在体外大量扩增，还可以根据患者的需要，定向分化成与患者遗传上相匹配的特定组织的健康细胞，用来取代病变细胞。体细胞重编程技术为解决干细胞移植中存在的细胞来源不足，MHC不合，移植物抗宿主病(GVHD)和宿主抗移植物反应(HVGR)免疫排斥等问题提供了新思路和新技术。疾病特异性的iPSCs也是研究疾病发生机理和筛选阻止组织退行药物的重要工具。因此，iPSCs的问世成功不仅规避了干细胞研究一直以来面临的伦理和法律等障碍，而且消除了潜在的移植免疫排异反应，iPSCs替代ESCs在医学领域、组织工程、药物发现与评价等方面显示出广阔的应用前景。
但人们对iPSCs技术的研究尚在初级阶段，其效率低是iPSCs应用面临的主要障碍之一。在各种诱导方法中，逆转录病毒载体诱导细胞重编程效率最高，也仅为0.01％左右，慢病毒、腺病毒更低。为获得高效的iPSCs转化技术，其核心是如何通过异源表达Oct4、Sox2等基因快速启动细胞内源性Oct4、Nanog等多能相关性基因的表达。研究表明，利用小分子化合物影响染色质的表观遗传修饰，激活或抑制部分信号通路(如Wnt、P53-p21、MAPK、GSK3等通路)，调控基因的沉默与表达有助于提高成体细胞逆分化为iPSCs的效率。另外，许多具有抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和存活，有利克隆形成的功能性的非肽类/肽类的小分子物质也能够提高iPSCs诱导效率。有研究相继报道，组氨酸去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂丙戊酸(valproic acid，VPA)，p53干扰RNA(short-interfering RNA，siRNA)，维生素C(vitamin C，Vc)有效促进iPSCs生成效率。VPA通过抑制组蛋白去乙酰化酶来改变染色体的表观遗传修饰，提高细胞的重编程效率。通过对p53基因调控的蛋白功能进行分析，发现p53-p21信号通路抑制iPSCs的生成，而p53siRNA通过抑制p53-p21信号通路降低细胞的凋亡，可以将皮肤细胞重编程效率提高百倍。Vc通过促进相关胚胎干细胞基因表达，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，有利鼠和人体细胞的完全重编程。细胞重编程过程是一个动态和复杂的过程，该过程中涉及的信号通路的关闭或开启机理还不清楚。当细胞从分化的状态重塑回到类ESCs的过程中，细胞获得了趋向永生化和多向分化潜能的特征，因此通过影响染色质表观遗传修饰、激活ESCs相关信号通路、抑制细胞凋亡以及改变细胞周期等不同方面都可能有利于提高细胞重编程的效率，我们猜测联合p53siRNA，VPA和Vc，从改变染色体表观遗传修饰、细胞永生化、细胞存活率以及细胞基因表达谱的变化等不同方面协同作用，对细胞重编程效率的影响可能高于单个物质的作用。
如何获得高效的iPSCs技术成为目前国际上干细胞研究领域的热点。
人骨髓间充质干细胞(human bone marrow-derived mesenchymal stem cells，hBM-MSCs)是骨髓造血微环境的重要组成部分，对血细胞的再生和调控有着重要意义。虽因具有强大的可塑性、弱免疫原性及与血液系统关系的紧密而被广泛用于血液系统疾病、部分免疫缺陷性疾病治疗，但仍然解决不了干细胞移植中存在的问题。另外，体内hBM-MSCs数量有限，体外培养时，分裂次数有限，这些不足也限制了hBM-MSCs的临床应用。
以hBM-MSCs为目的细胞，建立高效获得iPSCs的方法，不仅积极推进iPSCs和hBM-MSCs的临床应用和研究，而且为获得病人特异的细胞提供了源源不断的种子细胞来源，并为研究疾病机理、筛选药物等提供理想的细胞模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种获得诱导性多能干细胞的方法，通过以下技术方案实现：
1.细胞制备
获取胎鼠的成纤维细胞(mouse embryo fibroblast，MEF)(购自上海斯丹赛生物技术有限公司)，选择生长状态良好的MEF，丝裂霉素C处理，作为诱导和培养iPSCs的饲养层。
取骨髓，密度梯度离心结合贴壁筛选法，获得hBM-MSCs。选择生长状态良好的hBM-MSCs，用于病毒转染制备iPSCs。
2.建立高效获得诱导性多能干细胞的方法
在建立高效获得诱导性多能干细胞的方法中，利用含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒(质粒购自addgene，网址http://www.addgene.org)和p53siRNA病毒(购自stegment)转染，并在培养系统中加入VPA和维生素C(Vc)的人骨髓间充质干细胞人骨髓间充质干细胞(hBM-MSCs)为实验组，含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒单独处理或病毒分别联合p53siRNA、VPA、Vc或VPA+Vc的hBM-MSCs作为对照组，以确定p53siRNA、VPA、Vc的不同组合联合病毒转染hBM-MSCs获得iPSCs的效率，从而进一步确定高效获得iPSCs的方法。
病毒包装按照常规方法进行：利用脂质体2000转染试剂盒进行或者将根据表1-4准备好的各个溶液加到293T细胞(购自中科院上海细胞库)中，孵育24-72小时。收集病毒和病毒滴度测定。选择生长良好的hBM-MSCs，将含有四种转录因子的病毒按照1∶5比例加入培养系统中，进行病毒转染，实验组和相应的对照组同时进行p53siRNA病毒转染。病毒转染24小时后，将病毒转染过的目的细胞转到处理好的MEF中，第二天将培养基更换为ESCs培养基，实验组中的培养基加入VPA和Vc，对照组中的培养基或加入VPA或加入Vc或VPA+Vc或什么都不加。VPA连续加7天，Vc加到克隆形成，对克隆进行碱性磷酸酶检测或挑选形态上类似胚胎干细胞的克隆进行扩大培养并进行诱导性多能干细胞生物学特征检测。对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，被确定为诱导性多能干细胞。
显微镜下观察细胞形态变化。根据克隆形成情况，病毒转染18-22天后，对克隆进行碱性磷酸酶AP染色，确定各种方法获得iPSCs的效率；或对克隆进行机械传代以扩大培养，并进一步对获得的克隆进行生物学特征的鉴定。
3.iPSCs生物学特征鉴定
碱性磷酸酶AP活性检测，计数不同方法处理的hBM-MSCs中AP阳性克隆占种植hBM-MSCs的比例，以确定不同方法获得iPSCs的效率。
免疫荧光检测获得的ESC样克隆中ESCs相关蛋白的表达，抗体分别为anti-Oct4、anti-Nanog、anti-SSEA4、anti-Tra-1-81等。对于核蛋白，需要进行PBT(PBS+0.1％Triton-100)处理，以使相应的抗体进入细胞核中与相应抗原结合。
RT-PCR检测获得的ESC样克隆中ESCs多能基因表达，如Oct4、Sox2、Nanog、Rex1等。
分化潜能研究
分化潜能研究通过体外和体内分化实验进行。体外分化利用拟胚体的形成以及拟胚体的自发分化形成各种细胞进行验证。体内分化潜能研究是将获得的ESC样克隆注射入NOD-SCID小鼠，观察畸胎瘤形成并分析畸胎瘤中三胚层分化情况。
4.Western blot检测P53蛋白表达
P53蛋白具有抑制肿瘤发生，促进细胞凋亡的作用，也是细胞重编程过程中最主要障碍之一。根据p53siRNA、Vc、VPA对细胞功能的影响，在病毒、p53siRNA、Vc、VPA等不同组合的处理方法中，我们选择了病毒+p53siRNA+VPA+Vc处理组，病毒+p53siRNA，病毒+对照siRNA和病毒+Vc处理组进行Western blot检测分析，确定不同处理方法中P53蛋白表达情况，以确定高效的iPSCs诱导方法。
5.RT-PCR检测诱导过程中多能基因Oct4基因表达情况
细胞能否成功实现重编程，最关键的一步是利用外源表达的转录因子启动内源性多能基因的表达。根据p53siRNA、Vc、VPA对细胞功能的影响，在病毒、p53siRNA、Vc、VPA等不同组合的处理方法中，我们选择了病毒+p53siRNA+VPA+Vc处理组和病毒+VPA+Vc处理组，检测各组中内源性Oct4基因表达情况，以确定高效的iPSCs诱导方法。
ImagJ软件分析Oct4基因表达的荧光强度与诱导时间关系，根据荧光强度与诱导时间关系的分析，确定高效的iPSCs诱导方法。
6.流式细胞仪检测细胞周期
细胞周期对于细胞处于增值状态还是分化状态至关重要。细胞处于G0期有利于细胞进行重编程。根据p53siRNA、Vc、VPA对细胞功能的影响，在病毒、p53siRNA、Vc、VPA等不同组合的处理方法中，我们选择了病毒+p53siRNA+VPA+Vc处理组和病毒处理组，检测各组中细胞周期情况，以确定高效的iPSCs诱导方法。
本发明方法的特点是利用p53siRNA、VPA和Vc三种物质联合含有转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒诱导人骨髓间充质干细胞重编程为多能干细胞，建立高效获得诱导性多能干细胞的方法，促进多能干细胞在药物筛选、细胞移植、疾病机理研究、生物组织工程等生物学领域的研究与应用。
附图说明
图1是p53siRNA、VPA、Vc联合病毒诱导hBM-MSCs重编程为iPSCs的方案。含有转录因子的病毒和p53siRNA病毒转染细胞以及培养系统中加入VPA、Vc的时间按照方案进行。
图2是利用含有转录因子的逆转录病毒诱导hBM-MSCs重编程时，细胞形态的变化、克隆形态及AP染色的结果。A：病毒转染10天左右，部分细胞形态发生明显变化，体积变小，细胞质收缩，细胞核变多、变大，呈现克隆生长。
图3是ESC样克隆表达ESCs特有蛋白。
图4是ESC样克隆表达胚胎干细胞特异性基因。
图5是ESC样克隆具有体外和体内分化潜能，A：去除饲养层和bFGF，克隆产生EBs，B：将细胞贴壁培养，EBs分化成多种形态的细胞，C：畸胎瘤形成及病理鉴定。
图6是p53siRNA、VPA、Vc协同作用，有效抑制P53蛋白生成。
图7是p53siRNA、VPA、Vc协同作用，有效促进多能基因Oct4表达。
图8是流式细胞仪检测细胞周期。
图9是p53siRNA、VPA、Vc协同作用，有效提高AP阳性克隆数量，从而促进iPSCs生成效率。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1细胞培养，病毒制备和转染
1.细胞制备
①滋养层MEF制备：将购自上海斯丹赛生物技术有限公司的鼠胚胎成纤维细胞MEF，液氮中取出，37℃迅速融化。改良Eagle培养基(Dulbecco′s modification of Eagle′s mediumDulbecco，DMEM)，含10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)重悬，种植于培养瓶中，37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养。当细胞80-90％融合时，0.25％胰酶&0.02％乙二胺四乙酸(Trypsin&EDTA)消化传代。选择生长状态良好的第三至第六代MEF。当细胞70％融合时，10μg/ml丝裂霉素C处理2小时，作为诱导和培养iPSCs的饲养层。
②hBM-MSCs的制备：取骨髓4ml(含抗凝剂肝素钠)，用淋巴分离液(LymphocyteSeparation Medium)密度梯度离心，结合贴壁筛选法，获得hBM-MSCs。细胞培养液DMEM，含10％FBS，100U/ml青霉素(ampicillin)，100U/ml链霉素(streptomycin)。选择生长状态良好的第二至第四代hBM-MSCs，用于病毒转染。
2.高效获得iPSCs方法的建立
①病毒制备：制备293T包装细胞(购自中科院上海细胞库)，将100％融合的293T细胞1∶4传代于明胶处理的培养皿中，第二天当80％融合时，用作转染。病毒制备可以根据脂质体2000转染试剂盒说明书进行。转染6小时后，将培养瓶中的培养基弃去，加入含有10％FBS的DMEM培养液5mL。收集转染24-72小时后的病毒上清，0.45um过滤器过滤，-80℃保存，取部分做病毒滴度测定。将293T细胞种植在24孔板中，分别取病毒上清2ul、5ul至293T细胞培养。48小时后，免疫细胞化学检测病毒滴度，抗体分别为anti-Oct4、anti-Sox2、anti-c-Myc、anti-Klf4，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色显示细胞数量。病毒滴度(IU/mL)＝荧光细胞占总细胞数的百分比÷加入的病毒上清体积×细胞数×103。
停止收集病毒上清，用75％酒精或者巴斯消毒液处理培养瓶方可弃去。
②另外，病毒的制备还可以利用氯化钙法进行。按照表1-4准备溶液，放置30分钟。将准备好的各个溶液分别快速加到293T细胞中，37℃，10％CO2，孵育6小时，更换培养基为含有100ul 0.6M丁酸钠(sodium butyrate)(工作浓度为6mM)新鲜的10ml培养基。
表1
表2
表3
表4
病毒收集和病毒滴度测定：转染12小时后，将培养瓶中的培养基弃去，加入含有10％FBS的DMEM培养液5mL。收集转染24-72小时后的病毒上清，0.45um过滤器过滤，-80℃保存，取部分做病毒滴度测定。将293T细胞种植在24孔板中，分别取病毒上清2ul、5ul至293T细胞培养。48小时后，免疫细胞化学检测病毒滴度，抗体分别为anti-Oct4、anti-Sox2、anti-c-Myc、anti-Klf4，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色显示细胞数量。病毒滴度(IU/mL)＝荧光细胞占总细胞数的百分比÷加入的病毒上清体积×细胞数×103。
停止收集病毒上清，用75％酒精或者巴斯消毒液处理培养瓶方可弃去。
利用脂质体2000转染试剂盒或氯化钙法制备的病毒滴度没有显著差异，下述实验以脂质体2000转染试剂盒包被的病毒来转染hBM-MSCs。
③病毒转染：选择生长良好的50％融合状态第三或第四代hBM-MSCs，弃去培养基，按照1∶5比例即一个细胞对应5个病毒加入上述收集的含有转录因子的病毒，实验组和相应的对照组加入p53siRNA病毒，加入凝聚胺，工作浓度为10ug/ml，37℃，5％CO2，孵育6小时，更换为含有10％FBS的DMEM。具体方案参加图1A(图1A：p53 siRNA、VPA、Vc联合病毒诱导hBM-MSCs重编程为iPSCs的方案。含有转录因子的病毒和p53siRNA病毒转染细胞以及培养系统中加入VPA、Vc的时间按照方案进行。对照组中，p53siRNA、VPA、Vc的加入按照上述方法进行)。
④病毒转染24小时后，将病毒转染过的目的细胞转到处理好的MEF中，第二天将培养基更换为ESCs培养基：DMEM/F12，20％血清替代物(KnockOut Serum Replacement，KSR)，2mM L-谷氨酰胺的衍生物GlutaMAX，0.1mM β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol)，1％非必需氨基酸(nonessential amino acids，NEAA)，50U/m L penicillin，50mg/mL streptomycin和4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，37℃，5％CO2的培养箱中培养，每天更换培养基。实验组和相应的对照组中加入2μM VPA，25μg/ml Vc，37℃，5％CO2的培养箱中培养，每天更换培养基。VPA一直连续加7天，Vc加至克隆形成。具体方案参加图1A(图1A：p53siRNA、VPA、Vc联合病毒诱导hBM-MSCs重编程为iPSCs的方案。含有转录因子的病毒和p53siRNA病毒转染细胞以及培养系统中加入VPA、Vc的时间按照方案进行)。
⑤显微镜下观察细胞形态变化和克隆形成情况。病毒转染10天左右，部分细胞形态发生明显变化，从原来的纺锤体状变成椭圆状，体积变小，细胞质收缩，细胞核变多、变大，呈现克隆生长，参见图2A(图2A：病毒转染10天左右，部分细胞形态发生明显变化，体积变小，细胞质收缩，细胞核变多、变大，呈现克隆生长)。转染18-22天时产生ESCs样克隆，参见图2B(图2B：逆转录病毒诱导hBM-MSCs重编程18-22天时产生的ESCs样克隆)。
实施例2 iPSCs生物学特征鉴定
1.碱性磷酸酶AP活性检测：4％多聚甲醛固定1-2min，TBST洗涤(TBST：20mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15M NaCl，0.05％Tween-20)，根据碱性磷酸酶检测试剂盒(Alkaline PhosphataseDetection Kit，上海斯丹赛生物技术有限公司)说明书处理细胞。发现部分ESC样的克隆呈现阳性表达，参见图2C(图2C：对逆转录病毒诱导hBM-MSCs重编程产生的克隆进行AP染色，部分克隆呈现阳性表达)，而同期培养的hBM-MSCs中既没有ESCs样克隆产生，也没有AP阳性克隆出现，参见图2D和2E(图2D和2E：同期培养的hBM-MSCs中既没有ESCs样克隆产生，也没有AP阳性克隆出现)。
根据克隆形成情况，病毒转染18-22天后，对克隆进行机械传代，扩大培养，第二代培养的细胞中出现很多ESCs样克隆，参见图2F(图2F：对逆转录病毒诱导hBM-MSCs重编程产生的克隆进行机械传代，第二代培养的细胞中出现很多ESCs样克隆)。图2中Bar为100μm。
2.免疫荧光检测ESCs相关蛋白的表达：4％多聚甲醛固定细胞30分钟。检测Oct4，Nanog等核蛋白时，细胞需要在无水乙醇中浸泡两次，每次20min(或3次，10min/次)。对于膜蛋白如SSEA和Tra等，不需要此步骤。PBS洗涤，抗体稀释液(0.2％BSA和0.1％Triton-100溶于PBS)洗涤。封闭液(含1％BSA+4％山羊血清+0.4％TritonX100的PBS溶液)室温处理30分钟，封闭非特异反应。加入anti-Oct4、anti-Nanog、anti-SSEA3、anti-Tra81等抗体，4℃孵育过夜。PBT(PBS+0.1％Triton-100)洗涤。后面步骤，样品要注意避光！将连接有FITC或Cy3的二抗稀释在抗体稀释液中，加到细胞样品上，室温放置30分钟。PBT洗涤。DAPI室温处理3-5分钟。PBS洗涤，4％多聚甲醛室温固定30分钟。PBS洗涤。荧光显微镜观察。结果参见图3。图3A-B：ESC样克隆表达Oct4核蛋白，A和B说明表达的Oct4蛋白位于细胞核中；图3C-D：ESC样克隆表达Nanog核蛋白，C和D说明表达的Nanog蛋白位于细胞核中；图3E-F：ESC样克隆表达SSEA3膜蛋白，E和F说明表达的SSE3蛋白位于细胞膜上；图3G-H：ESC样克隆表达Tra-1-81膜蛋白，G和H说明表达的Tra-1-81蛋白位于细胞膜上。DAPI荧光染色显示相应细胞核的位置，以确定上述各蛋白在细胞中的表达位置。图3中Bar：100μm。
3.RT-PCR检测ESCs多能相关基因表达
①根据Primer Premier 5.0设计多能基因Oct4，Sox2，Rex1等及阳性对照GAPDH的引物。参见表5。
表5：hBM-MSCs重编程获得ESC样克隆时，相关多能基因检测的引物设计
②抽提RNA：收集细胞，加500μl TRIZOL裂解细胞至均一通亮。每500μl TRIZOL加0.1ml氯仿。用力摇晃试管15秒，室温孵育2-3min。在2-8℃下12,000×g高速冷冻离心15分钟。将水样层转移到一干净的试管中，每500μl TRIZOL对应0.25ml异丙醇。将混合的样品在15-30℃条件下孵育10min。2-8℃下12,000×g高速冷冻离心10分钟。移去上层悬液。75％乙醇洗涤RNA，每500μl的TRIZOL加0.5ml的75％乙醇。旋涡振荡混合样品，2-8℃下以7，500×g高速冷冻离心5分钟。简单干燥RNA沉淀。取DEPC水溶解RNA，并在55-60℃下孵育10分钟。紫外分光光度计测RNA浓度。
③反转录RNA获得cDNA
取5μgRNA加适量DEPC水至11μl，再加1μl Oligo dT Primer共12μl体系混匀，70℃5min；置冰上，加4μl反转录缓冲液，1μlRNA抑制剂，2μldNTP混匀，37℃5min；置冰上，加1μl反转录酶混匀，42℃1小时；70℃10min失活反转录酶，得到的cDNA用于后续RT-PCR实验。
④RT-PCR检测相关基因表达
RT-PCR检测Oct4，Sox2等基因在各处理组中的表达情况，GAPDH为阳性对照。
PCR反应体系：
双蒸水H2O加到20μl体系。
PCR反应程序：94℃4min；
51℃(c-Myc，Nanog，Rex-1)，35个循环；53℃(GAPDH)，35个循环；55℃(Oct4，Klf4)，35个循环；58℃(hTERT)，30个循环；68℃(Sox2)，30个循环；35s，72℃1min；72℃10min。
hBM-MSCs和ESCs(H1)的cDNA分别作阴性和阳性对照。结果参见图4：ESC样克隆表达胚胎干细胞特异性基因，表达水平与ESCs(H1)没有显著差异，而hBM-MSCs中不表达多能相关基因或表达的水平处于相对较低水平。
5.分化潜能研究
①体外分化潜能研究
拟胚体的制备：将得到的hBM-MSC-iPSCs扩增培养后，按正常传代步骤消化下来，洗涤去除MEF细胞，将细胞吹打至小团块(比正常传代大小再小一些)，然后悬浮培养在MEF培养液中。3天后换第一次液，之后每2-3天换液一次，直至收集。将收集的EBs于0.1％明胶处理的皿中，EBs将自发形成各种细胞。结果参见图5的A和B，其中A是去除饲养层和bFGF，克隆产生拟胚体EBs；B是将细胞贴壁培养，拟胚体EBs分化成多种形态的细胞。
②体内分化潜能研究
将得到的hBM-MSC-iPSCs传代培养至10代以上后，按正常传代方式消化下来洗涤，去除滋养层细胞污染后，悬浮在小于400ul的培养液中，无菌注射入5周龄的NOD-SCID小鼠的后腿根部肌肉中(浙江大学动物实验中心)，每个注射点的细胞量约为2-3×106。每个细胞系均注射3-5只小鼠。8-10周后，肌肉注射氯胺酮(80mg/kg)，麻醉小鼠，取出畸胎瘤，4％多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋、切片(6-8μm厚度)等处理，进行HE染色，观察三胚层分化情况。结果参见图5的C，说明ESC样克隆具有体内分化潜能，外胚层：a上皮样组织，b神经样组织；中胚层：c平滑肌样组织，d脂肪样组织；内胚层：e和f小肠上皮样组织。
实施例3 p53siRNA、Vc、VPA组合联合病毒转染有效提高hBM-MSC重编程为iPSCs的效率。
1.Western blot检测P53蛋白表达
对于病毒、p53siRNA、Vc、VPA等不同组合的处理组，进行Western blot分析，以检测不同处理组中P53蛋白表达情况。
①收集和定量蛋白样品：分别收集病毒处理组、病毒+p53siRNA处理组、病毒+Vc处理组、病毒+p53siRNA+Vc+VPA处理组处理3天的细胞；M-PER/M-PER蛋白裂解液裂解细胞，提取蛋白；BCA kit(Pierce)定量蛋白浓度。
②电泳：在收集的蛋白样品中按照1∶1与2X SDS-PAGE蛋白上样缓冲液沸水加热3-5min，以充分变性蛋白；上样与电泳。
③转膜：选择PVDF膜，把转膜槽放置在冰浴中进行。设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为100min。丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果，观察蛋白的残留情况。
④封闭：转膜结束后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST(20mM Tris-HCl，pH7.2-7.5，150mM NaCl，0.1％Tween-20)中，漂洗1-2min，以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，避免产生较高的背景。
5％脱脂奶粉封闭，4℃封闭过夜。
⑤一抗孵育：孵育一抗anti-P53，anti-β-actin，4℃过夜。TBST洗涤，5-10分钟。共3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
⑥二抗孵育：辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)1∶1000稀释，室温在摇床上缓慢摇动孵育一小时，缓慢摇动洗涤5-10min，洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
⑦ECL+检测蛋白表达。
P53相对表达使用软件ImageJ software，β-actin值作为内参。
检测的样品重复三批。
结果参见图6，其中A：western blot检测P53蛋白表达水平，B：Image J灰度值检测P53蛋白相对表达量。平均值±SD(standard deviation)，数据来源于三组独立实验。p53siRNA+VPA+Vc组表示p53siRNA+VPA+Vc联合含有四种转录因子的病毒处理目的细胞的样品，对照组表示含有四种转录因子的病毒处理目的细胞的样品，p53siRNA组表示p53siRNA联合含有四种转录因子的病毒处理目的细胞的样品，Vc组表示Vc联合含有四种转录因子的病毒处理目的细胞的样品。
2.RT-PCR检测诱导过程中多能基因Oct4基因表达情况
细胞能否成功实现重编程，最关键的一步是利用外源表达的转录因子启动内源性多能基因的表达。在检测VPA+p53 siRNA+Vc之间的协同作用中，我们选择了病毒+p53siRNA+VPA+Vc处理组、病毒+VPA+Vc处理组，检测各组中内源性Oct4基因表达情况。
RT-PCR方法按照按照建立人骨髓间充质干细胞重编程为诱导性多能干细胞的方法进行。
ImagJ软件分析Oct4基因表达的荧光强度与诱导时间关系。
结果参见图7，p53siRNA、VPA、Vc协同作用，有效促进多能基因Oct4表达，其中A：不同处理组中多能基因Oct4表达情况检测，p53siRNA+VPA+Vc组表示p53siRNA、VPA、Vc这三种物质联合含有四种转录因子的病毒处理目的细胞的样品，VPA+Vc组表示VPA、Vc联合含有四种转录因子的病毒处理目的细胞的样品。实验结果表明p53siRNA+VPA+Vc处理组相对VPA+Vc处理组，能够有效促进多能基因Oct4的表达；B：Image J荧光强度分析多能基因Oct4的表达与诱导时间的关系。平均值±SD，数据来源于三组独立实验。
3.流式细胞仪检测细胞周期
细胞周期对于细胞处于增值状态还是分化状态至关重要。
①分别收集病毒+p53siRNA+VPA+Vc处理组、病毒处理组处理3天的细胞106。
②用预冷的70％乙醇重悬细胞沉淀，4℃固定1小时，1000rpm离心7分钟，去上清。PBS清洗3次。
③重悬细胞于500μl含100unit/ml RNaseA的PBS缓冲液中，避光37℃孵育30分钟。
④加2mg/ml PI至终浓度50μg/ml，避光孵育30分钟；
⑤PBS清洗3次，加入流式专用管上机检测细胞周期。以PI荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标，在流式细胞仪上计数细胞周期各期的细胞数目。
⑥PI可结合DNA，在一定波长的激发光作用下可发出荧光，其强度与DNA含量成正比。
结果参见图8，其中A：p53siRNA、VPA和Vc联合处理的细胞，发现有70％左右的细胞处于G0/G1期，说明细胞处于非增值期，而处于一种利于分化的状态，B：没有p53siRNA、VPA和Vc处理的细胞，发现有20％左右的细胞处于G0/G1期。
4.AP染色的阳性克隆比较
选择病毒处理组，病毒联合p53siRNA、Vc、VPA组合处理组，病毒处理18天后，4％多聚甲醛固定1-2min，TBST洗涤(TBST：20mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15M NaCl，0.05％Tween-20)，根据碱性磷酸酶检测试剂盒(Alkaline Phosphatase Detection Kit，上海斯丹赛生物技术有限公司)说明书处理细胞。计数AP阳性克隆的比例。结果参见图9，其中A：不同处理组中，hBM-MSCs重编程为AP阳性细胞克隆的比较，病毒诱导与病毒联合p53siRNA+VPA+Vc诱导效率之间有显著差异(分别为0.01％和0.1％)；B：AP染色：病毒处理组(左)，p53siRNA+VPA+Vc联合病毒处理组(右)，(种植细胞5×104诱导22天)；C：ESCs样克隆机械分离成小的细胞团，种植于丝裂霉素C处理的MEF上，用ESCs培养基继续培养，有很多ESCs样克隆出现。
<110> 浙江大学
<120> 一种获得诱导性多能干细胞的方法
<160>16
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 转录因子Oct4基因的DNA序列的上游引物
<400> 1
TTCAGCCAAA CGACCATC 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>转录因子Oct4基因的DNA序列的下游引物
<400> 2
GGAAAGGGAC CGAGGAGTA 19
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>转录因子Sox2基因的DNA序列的上游引物
<400> 3
AAACAGCCCG GACCGCGTCA A 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>转录因子Sox2基因的DNA序列的下游引物
<400> 4
TCGCAGCCGC TTAGCCTCGT 20
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>转录因子 Klf4基因的DNA序列的上游引物
<400> 5
CCACCGTGTC CTCGTCA 17
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>转录因子 Klf4基因的DNA序列的下游引物
<400> 6
CAGGGCTGCC TTTGCT 16
<210> 7
<211>16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 转录因子c-Myc基因的DNA序列的上游引物
<400> 7
GCTGCCAAGA GGGTCA 16
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>转录因子c-Myc基因的DNA序列的下游引物
<400> 8
CGCACAAGAG TTCCGTAG 18
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 转录因子Nanog 基因的DNA序列的上游引物
<400> 9
CCTATGCCTG TGATTTG 17
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>转录因子 Nanog 基因DNA序列的下游引物
<400> 10
AGAAGTGGGT TGTTTGC 17
<210> 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 转录因子Rex1 基因的DNA序列的上游引物
<400> 11
GGCAAAGACA AGACACC 17
<210> 12
<211>16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 转录因子Rex1基因的 DNA序列的下游引物
<400> 12
GCAAATTCTG CGAGCT 16
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 转录因子hTERT基因的 DNA序列的上游引物
<400> 13
CAGAGGTCAG GCAGCATCG 19
<210> 14
<211>17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>转录因子hTERT基因的 DNA序列的下游引物
<400> 14
CGCCCGCTCG TAGTTGA 17
<210> 15
<211>17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 转录因子GAPDH基因的 DNA序列的上游引物
<400> 15
AAGGTCGGAG TCAACGG 17
<210> 16
<211>19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 转录因子GAPDH基因的 DNA序列的下游引物
<400> 16
GGAAGATGGT GATGGGATT 19
Claims (2)
1.一种获得诱导性多能干细胞的方法，通过以下技术方案实现：
(1)细胞制备
选择生长状态良好的鼠胚胎成纤维细胞，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养诱导性多能干细胞的饲养层，
取骨髓，通过密度梯度离心结合贴壁筛选法，获得人骨髓间充质干细胞，选择生长状态良好的人骨髓间充质干细胞，用于病毒转染制备诱导性多能干细胞；
(2)获得诱导性多能干细胞
利用含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒和p53干涉RNA病毒转染，并在培养系统中加入组蛋白去乙酰基酶抑制剂丙戊酸钠和维生素C的人骨髓间充质干细胞人骨髓间充质干细胞为实验组，含有四种转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc的病毒单独处理或病毒分别联合p53干涉RNA、丙戊酸钠、维生素C或丙戊酸钠+维生素C的人骨髓间充质干细胞作为对照组，以确定p53干涉RNA、丙戊酸钠、维生素C的不同组合联合病毒转染人骨髓间充质干细胞获得诱导性多能干细胞的效率；
病毒包装按照常规方法进行，利用脂质体2000转染试剂盒进行293T细胞转染，孵育24-72小时，收集病毒和病毒滴度测定，选择生长良好的人骨髓间充质干细胞，将含有四种转录因子的病毒按照1∶5比例加入培养系统中，进行病毒转染，实验组和相应的对照组同时进行p53干涉RNA病毒转染，病毒转染24小时后，将病毒转染过的目的细胞转到处理好的鼠胚胎成纤维细胞中，第二天将培养基更换为胚胎干细胞的培养基，实验组中的培养基加入丙戊酸钠和维生素C，对照组中的培养基或加入丙戊酸钠或加入维生素C或丙戊酸钠+维生素C或什么都不加，丙戊酸钠连续加7天，维生素C加到克隆形成，对克隆进行碱性磷酸酶检测或挑选形态上类似胚胎干细胞的克隆进行扩大培养并进行诱导性多能干细胞生物学特征检测，对于符合诱导性多能干细胞生物学特征的克隆，被确定为诱导性多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种获得诱导性多能干细胞的方法，其特征在于，病毒包装使用氯化钙法进行，氯化钙法所涉及的溶液1-4分别为：
溶液1-4中，三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液的PH 7.9、10X，将溶液1-4加到293T细胞中，孵育24-72小时，后续操作同权利要求1。
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