CN110499293A - 用于提高多能干细胞重编程效率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法，涉及多能干细胞领域，旨在解决现有技术中体细胞重编程速度慢、效率低的问题，包括向培养基中的多能干细胞中引入多梳抑制复合物，调节基因的H3k27me3的修饰，所述多梳抑制复合物包括PRC1复合物和PRC2复合物，在过表达不同组合的主要干性因子时，调节多梳抑制复合物主要因子的表达，所述多梳抑制复合物的主要因子包括Ezh2,Eed,Kdm2B和Ring。本发明通过添加多梳抑制复合物，依次调节其主要因子的表达，提高抑制分化相关基因的速度，加快激活内源主要干性因子，从而提高重编程效率。

Description

用于提高多能干细胞重编程效率的方法
技术领域
本发明涉及多能干细胞领域，尤其涉及一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法。
背景技术
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESCs)是一类高度未分化细胞，具发育全能性。在适当条件下可以无限增殖，能分化出成体动物组织和器官的所有细胞，如造血细胞、神经细胞胰岛素细胞、心肌细胞等，在动物克隆、转基因动物生产、疾病治疗、组织工程、再生医学、疾病机理和治疗研究、药物发现和评价等诸多领域极具应用价值。
人ESCs的研究一直面临着许多难题和争议。支持者认为这项研究有助于根治很多疑难杂症，是一种挽救生命的慈善行为，是科学进步的表现。而反对者则认为，进行ESCs研究就必须破坏胚胎，而胚胎是人尚未成形时的生命形式。破坏胚胎已经触及了人类伦理观念甚至宗教和法律等问题，这是人ESCs研究面临的最大障碍。同时，作为为临床组织器官或细胞移植提供大量材料的“种子细胞”，ESCs定向诱导分化的终末器官或细胞不能存在同种异型个体间的移植排斥，这就要求剔除ESCs中的免疫排斥基因，而这一难题一直困扰着免疫学界及医学界。伦理法律以及免疫排斥等壁垒，制约了ESCs技术的进一步发展和应用。
人们努力尝试不同途径实现体细胞重编程以获取ESCs或ESCs样的细胞。细胞核移植是其中的一种主要技术，即将患者体细胞与ESCs的细胞融合，但这种方法获得的ESCs是四倍体，不适用于临床，而且克隆效率低，产生的许多后代在各个阶段出现严重的发育异常。同时，卵母细胞来源使得核移植实验受到强烈伦理学质疑。
诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的问世，较好地回避了长期以来围绕人类胚胎干细胞使用问题的伦理争论，同时自体细胞重编程也克服了异体移植存在的免疫排异问题。
2006，日本科学家通过导入4种转录因子Oct4，Sox2，c-Myc，Klf4成功将鼠的体细胞重编程为ESCs状态，即iPSCs，随后，人的iPSCs也用同样的基因改造方法获得。这是科学史上的重大突破，在干细胞、发育生物学和医学研究领域中具有里程碑意义。iPSCs具有与ESCs类似的生物学特征，如细胞体积较小，细胞核大，胞质胞浆少。体外培养时，细胞排列紧密，呈克隆状生长，克隆和周围存在明显界限，而形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。表达时相专一性胚胎抗原(Stage specific embryonic antigen，SSEA)，可以检查到Oct4基因的表达，SSEA和Oct4蛋白是发育全能性的标志。iPSCs还表达ESCs其它特征性表面抗原如Tra-1-60、Tra-1-81，细胞特征性内源蛋白Nanog、Sox2、Lin28等，iPSCs中碱性磷酸酶AP及端粒酶活性也较高。将iPSCs注入免疫缺陷小鼠体内，能形成含有3个胚层的畸胎瘤。iPSCs体外可以分化成多种细胞谱系，如：神经前体细胞、功能性的成熟神经细胞，造血前体细胞、造血细胞、血管内皮细胞，分泌胰岛素的β细胞，心肌细胞等。2009年7月，中国科学家周琪、曾凡一、高绍荣等利用iPSCs克隆出活体实验鼠，首次证明iPSCs与ESCs一样具有全能性。全基因组微阵列分析表明，iPSCs基因总表达谱接近于ESCs，而不是原来的靶向细胞。
患者来源的体细胞重编程获得的iPSCs，是“个体特异的”或“疾病特异的”iPSCs，不仅可以在体外大量扩增，还可以根据患者的需要，定向分化成与患者遗传上相匹配的特定组织的健康细胞，用来取代病变细胞。体细胞重编程技术为解决干细胞移植中存在的细胞来源不足，MHC不合，移植物抗宿主病(GVHD)和宿主抗移植物反应(HVGR)免疫排斥等问题提供了新思路和新技术。疾病特异性的iPSCs也是研究疾病发生机理和筛选阻止组织退行药物的重要工具。因此，iPSCs的问世成功不仅规避了干细胞研究一直以来面临的伦理和法律等障碍，而且消除了潜在的移植免疫排异反应，iPSCs替代ESCs在医学领域、组织工程、药物发现与评价等方面显示出广阔的应用前景。
在现有技术中，人的多能干细胞的诱导主要是通过过表达重要的干性转录因子的不同组合的产生，而在各种诱导方法中，即使是重编程效率最高的逆转录病毒载体诱导细胞重编程，其重编程效率也仅为0.01％左右，而慢病毒、腺病毒更低，因此，病人难以得到有效及时的个性化细胞治疗。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法，该方法解决了现有的体细胞重编程速度慢、效率低的问题
为实现上述技术目的，本发明提供的一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法，包括向培养基中的多能干细胞中引入多梳抑制复合物，调节基因的H3k27me3的修饰。
在一些实施方式中，所述多梳抑制复合物包括PRC1复合物和PRC2复合物。
在一些实施方式中，在过表达不同组合的主要干性因子时，调节多梳抑制复合物主要因子的表达。
在一些实施方式中，所述主要干性因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。
在一些实施方式中，所述多梳抑制复合物的主要因子包括Ezh2,Eed,Kdm2B和Ring。
在一些实施方式中，包括：
S1:选择生长状态良好的鼠胚胎成纤维细胞，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养诱导性多能干细胞的饲养层，取体细胞用于病毒转染制备诱导性多能干细胞；
S2：将含有四种转录因子的病毒按照1:5的比例加入培养系统中；
S3：将PRC1复合物/PRC2复合物按照1:10的比例加入培养系统中；
S4:调节Ezh2,Eed,Kdm2B和Ring依次表达。
综上所述，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
本发明通过依次表达Ezh2,Eed,Kdm2B和Ring，不仅能够调节基因的H3k27me3的修饰，提高抑制分化相关基因的速度，还能加快激活内源主要干性因子，从而提高诱导速度和诱导效率。
具体实施方式
实施例1：一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法，包括以下步骤
S1:选择生长状态良好的鼠胚胎成纤维细胞，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养诱导性多能干细胞的饲养层，取体细胞用于病毒转染制备诱导性多能干细胞；
S2：将含有四种转录因子的病毒按照1:5的比例加入培养系统中；
S3：将PRC1复合物按照1:10的比例加入培养系统中；
S4:调节Ezh2,Eed,Kdm2B和Ring依次表达。
由实施例1进行多组实验，测得平均重编程效率为0.015％，时长为1-2周。
实施例2：一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法，包括以下步骤
S1:选择生长状态良好的鼠胚胎成纤维细胞，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养诱导性多能干细胞的饲养层，取体细胞用于病毒转染制备诱导性多能干细胞；
S2：将含有四种转录因子的病毒按照1:5的比例加入培养系统中；
S3：将PRC2复合物按照1:10的比例加入培养系统中；
S4:调节Ezh2,Eed,Kdm2B和Ring依次表达。
由实施例2进行多组实验，测得平均重编程效率为0.018％，时长为1-2周。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法，其特征在于，包括向培养基中的多能干细胞中引入多梳抑制复合物，调节基因的H3k27me3的修饰。
2.根据权利要求1所述的一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法，其特征在于，所述多梳抑制复合物包括PRC1复合物和PRC2复合物。
3.根据权利要求2所述的一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法，其特征在于，在过表达不同组合的主要干性因子时，调节多梳抑制复合物主要因子的表达。
4.根据权利要求3所述的一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法，其特征在于，所述主要干性因子包括Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc。
5.根据权利要求4所述的一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法，其特征在于，所述多梳抑制复合物的主要因子包括Ezh2,Eed,Kdm2B和Ring。
6.根据权利要求4所述的一种用于提高多能干细胞重编程效率的方法，其特征在于，包括：
S1:选择生长状态良好的鼠胚胎成纤维细胞，经丝裂霉素C处理，作为诱导和培养诱导性多能干细胞的饲养层，取体细胞用于病毒转染制备诱导性多能干细胞；
S2：将含有四种转录因子的病毒按照1:5的比例加入培养系统中；
S3：将PRC1复合物/PRC2复合物按照1:10的比例加入培养系统中；
S4:调节Ezh2,Eed,Kdm2B和Ring依次表达。
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