CN106609263B - 高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法 - Google Patents
高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106609263B CN106609263B CN201510690140.0A CN201510690140A CN106609263B CN 106609263 B CN106609263 B CN 106609263B CN 201510690140 A CN201510690140 A CN 201510690140A CN 106609263 B CN106609263 B CN 106609263B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- concentration
- culture
- pluripotent stem
- culture medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Abstract
本发明涉及一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法，属于生物技术领域。本发明方法在不添加任何小分子诱导的情况下，在体外模拟体内眼球发育的过程，自发的分化为RPE细胞。与已经报道的方法相比，本发明未采用任何小分子诱导刺激，严格模拟体内眼球发育，简单，快捷，高效的获得大量的由多能干细胞分化而来的RPE细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法。
背景技术
视网膜变性疾病是全球首要的致盲原因。在该疾病中，视网膜色素上皮细胞(retina pigmented epithelium,RPE)的损伤和功能异常导致光感受器细胞(photoreceptor)变性，最终影响病人视力直至失明。由于RPE和光感受器细胞的不可再生，至今在临床上缺乏对这类疾病的有效治疗措施。相较于其他治疗方法，细胞治疗对视网膜退行性疾病的治疗有更大的前景。
由于多能干细胞具有无限增殖和分化为各种细胞的能力，因此可以作为理想的移植细胞的来源。已有报道证实胚胎干细胞(ESCs)来源的RPE应用于人类视网膜退行性疾病临床研究的可行性与安全性，尽管病人术后视力与正常生活的要求还有很大差距。那么，一套稳定有效的体外多能干细胞向RPE细胞分化的方法对视网膜退行性疾病的治疗和制药研究显得尤为重要。
在过去的十几年间，多种方法被报道可以控制多能干细胞向RPE细胞分化，并且在多种动物病变模型中发挥保护作用。但是这些方法仍存在若干缺点如耗时长，方法繁琐，批次间差异大和细胞得率低等。
因此，需要一种诱导多能干细胞向RPE细胞分化的方法。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法，本发明的方法不仅可以得到成熟的有功能的视网膜色素上皮细胞，而且方法简单、耗时短、可重复性强且细胞得率高。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法，包括以下步骤：
a、将多能干细胞接种到饲养层细胞中，加入干细胞完全培养基，放置培养并定期换液至细胞达到融合状态；
b、用酶处理多能干细胞成团块并接种到培养皿中，加入添加有200ug/mlMatrigel的第一诱导分化培养基培养两天，更换无Matrigel添加的第一诱导分化培养基继续培养5天；
c、在分化第8天更换第二诱导分化培养基，放置培养并定期换液至细胞分化形成大量的色素细胞；
d、用酶处理分化细胞成团块并悬浮培养，1天后进行挑选分离，收集黑色的细胞悬球；
e、将黑色细胞悬球接种于培养皿中，加入第二诱导分化培养基，放置培养并定期换液便可得到成熟的视网膜色素上皮细胞。
优选地，所述多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)或诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)。
优选地，步骤a中所述饲养层细胞为X射线处理的小鼠胚胎成纤维细胞，所述干细胞完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、β-巯基乙醇及成纤维细胞生长因子，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L，成纤维细胞生长因子浓度为4ng/ml，所述达到融合状态为每天换液至细胞达到80％～90％的融合。
优选地，步骤b中所述酶处理为5mg/ml胶原酶IV处理12分钟并用移液器机械吹打；所述第一诱导分化培养基成分为：Neurobasal medium和DMEM/F12等体积混合的基础培养基、N2、B27、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，N2体积含量为1％，B27体积含量为1％，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L。
优选地，步骤c中所述第二诱导分化培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，血清替代物的体积分数为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L；所述形成大量的色素细胞为隔天换液至分化40天，培养皿中出现大量单层的色素细胞。
优选地，步骤d中所述酶处理为5mg/ml胶原酶IV处理20分钟并用移液器机械吹打；所述悬浮培养为将细胞团块接种到不贴壁的细胞培养皿中培养；所述挑选分离为：由于细胞悬球主要包括黑色与白色两种，根据颜色进行分离挑选。
优选地，各步骤中所述培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行。步骤b或/和步骤e中所述培养皿为有100ug/ml Matrigel包被的细胞培养皿。步骤c或/和步骤e中所述定期换液为隔天换液。步骤e中所述成熟的色素上皮细胞为具有鹅卵石样形态，色素积累的单层细胞。
目前文献报道的体外诱导hESCs向RPE分化的方法不仅耗时长(8周到数月不等)，而且获得的RPE细胞往往有其它分化细胞混合，需要人工挑取含有色素的RPE细胞进行RPE的纯化。与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
1、本发明方法未添加任何分子刺激诱导分化，避免外源添加分子可能引入污染的风险，减少批次之间的差异，提高实验的重复性。
2、本发明在体外严格模拟体内眼球发育的过程，自发的分化为RPE细胞。
3、本发明通过采用培养方法以及胞外基质的改变实现定向自发分化，而传统自发分化的方法，因非定向分化则得到的细胞种类多样，分化时间长且目的细胞少，因此本发明方法简单、快捷，并且由于本发明后期可根据颜色简单富集黑色细胞悬球，无杂细胞的污染，最终得到百分百色素上皮细胞，因而细胞得率高。通过该方法可获得高纯度和大量的成熟且有功能的RPE细胞。
附图说明
图1为本发明人ESCs分化2天形成类似神经上皮及荧光鉴定的示意图；
图2为本发明人ESCs分化7天形成类似眼区及荧光鉴定的示意图；
图3为本发明人ESCs分化14天形成类似视囊及荧光鉴定的示意图；
图4为本发明人ESCs分化40天出现大量色素细胞的示意图；
图5为本发明黑色细胞悬球在悬浮培养分离前后的示意图；
图6为本发明黑色细胞悬球贴壁后生长及形成成熟RPE的示意图；
图7为本发明的多能干细胞来源的RPE细胞染色及功能鉴定的示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
本实施例为高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的方法。
本实施例中，所述多能干细胞为人胚胎干细胞或诱导多能干细胞，均能利用本方法实现发明目的。
本实施例中，所述诱导分化包括如下步骤：
a.将多能干细胞接种到饲养层细胞中，加入干细胞完全培养基，放置培养并定期换液至细胞达到融合状态；
本步骤中所述多能干细胞为第50代人胚胎干细胞；所述饲养层细胞为X射线处理小鼠胚胎成纤维细胞；所述干细胞完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、β-巯基乙醇及成纤维细胞生长因子，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L，成纤维细胞生长因子浓度为4ng/ml；所述放置培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行；所述定期换液为每天换液；所述达到融合状态为每天换液至细胞达到80％～90％的融合。
b.用酶处理干细胞成团块并接种到培养皿中，加入添加有200ug/ml Matrigel的第一诱导分化培养基培养两天，更换无Matrigel添加的第一诱导分化培养基继续培养5天；
本步骤中所述酶处理为5mg/ml胶原酶IV处理12分钟并用移液器机械吹打；所述培养皿为100ug/ml Matrigel包被的细胞培养皿；所述放置培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行；所述第一诱导分化培养基成分为：Neurobasal medium和DMEM/F12等体积混合的基础培养基、N2、B27、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，N2体积含量为1％，B27体积含量为1％，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L。该诱导分化方法在添加200ug/ml Matrigel的第一诱导分化培养基中分化两天可得到囊泡样的极性神经上皮样结构，通过免疫组化鉴定表达ZO-1，N-cadherin和Sox-2，如图1；继续培养5天细胞开始表达眼区相关基因Pax6和Rax，如图2。
c.在分化第8天更换第二诱导分化培养基，放置培养并定期换液至细胞分化形成大量的色素细胞；
本步骤中所述第二诱导分化培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，血清替代物的体积分数为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/ml，链霉素的浓度为100ug/ml，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L；所述放置培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行；所述定期换液为隔天换液；该诱导分化方法在分化第14天已经鉴定分化细胞表达视囊相关的基因Vsx2和MITF，如图3；所述形成大量的色素细胞为在分化40天左右培养皿中已经出现大量单层的色素细胞如图4。
d.用酶处理分化细胞成团块并悬浮培养，一天后可进行挑选分离，收集黑色的细胞悬球；
本步骤中所述酶处理为5mg/ml胶原酶IV处理20分钟并用移液器机械吹打；所述悬浮培养为将细胞团块接种到不贴壁的细胞培养皿中培养；所述放置培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行；所述挑选分离为由于细胞悬球主要包括黑色与白色两种，可以根据颜色进行分离挑选，如图5。
e.将黑色细胞悬球接种于培养皿中，加入第二诱导分化培养基，放置培养并定期换液便可得到成熟的色素上皮细胞。
本步骤中所述培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行；所述培养皿有100ug/mlMatrigel包被的细胞培养皿；所述定期换液为隔天换液；所述成熟的色素上皮细胞为具有鹅卵石样形态，色素积累的单层细胞。该诱导方法将黑色细胞悬球贴壁培养两周后即可得到成熟的色素上皮细胞，如图6。
进一步对人ESCs分化来源的RPE细胞进行免疫组化鉴定，发现hESC-RPE细胞表达成熟的RPE细胞相关蛋白Bestrophin，ZO-1和RPE65，进一步检测其功能发现分化的细胞具有吞噬外节的能力，如图7。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、将多能干细胞接种到饲养层细胞中，加入干细胞完全培养基，放置培养并定期换液至细胞达到融合状态；
b、用酶处理多能干细胞成团块并接种到培养皿中，加入添加有200μg/mL Matrigel的第一诱导分化培养基培养两天，更换无Matrigel添加的第一诱导分化培养基继续培养5天；
c、在分化第8天更换第二诱导分化培养基，放置培养并定期换液至细胞分化形成大量的色素细胞；
d、用酶处理分化细胞成团块并悬浮培养，1天后进行挑选分离，收集黑色的细胞悬球；
e、将黑色细胞悬球接种于培养皿中，加入第二诱导分化培养基，放置培养并定期换液便可得到成熟的视网膜色素上皮细胞；
步骤a中所述饲养层细胞为X射线处理的小鼠胚胎成纤维细胞，所述干细胞完全培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺、β-巯基乙醇及成纤维细胞生长因子，其中，血清替代物的体积含量为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/mL ，链霉素的浓度为100μg/mL ，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L，成纤维细胞生长因子浓度为4ng/mL ；所述达到融合状态为每天换液至细胞达到80％～90％的融合；
步骤b中所述酶处理为5mg/mL 胶原酶IV处理12分钟并用移液器机械吹打；所述第一诱导分化培养基成分为：Neurobasal medium和DMEM/F12等体积混合的基础培养基、N2、B27、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，N2体积含量为1％，B27体积含量为1％，青霉素的浓度为100U/mL ，链霉素的浓度为100μg/mL ，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L；
步骤c中所述第二诱导分化培养基成分为：DMEM/F12基础培养基、血清替代物、非必须氨基酸、青霉素、链霉素、谷氨酰胺及β-巯基乙醇，其中，血清替代物的体积分数为20％，非必须氨基酸的浓度为0.01mmol/L，青霉素的浓度为100U/mL ，链霉素的浓度为100μg/mL ，谷氨酰胺的浓度为1mmol/L，β-巯基乙醇浓度为0.1mmol/L；所述形成大量的色素细胞为隔天换液至分化40天，培养皿中出现大量单层的色素细胞；
步骤d中所述酶处理为5mg/mL 胶原酶IV处理20分钟并用移液器机械吹打；所述悬浮培养为将细胞团块接种到不贴壁的细胞培养皿中培养；所述挑选分离为：细胞悬球主要包括黑色与白色两种，根据颜色进行分离挑选；
所述的多能干细胞为胚胎干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法，其特征在于，各步骤中所述培养是在37℃和5％CO2培养箱中进行。
3.根据权利要求1所述的一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法，其特征在于，步骤b或/和步骤e中所述培养皿为有100μg/mL Matrigel包被的细胞培养皿。
4.根据权利要求1所述的一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法，其特征在于，步骤c或/和步骤e中所述定期换液为隔天换液。
5.根据权利要求1所述的一种高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法，其特征在于，步骤e中所述成熟的色素上皮细胞为具有鹅卵石样形态，色素积累的单层细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510690140.0A CN106609263B (zh) | 2015-10-22 | 2015-10-22 | 高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510690140.0A CN106609263B (zh) | 2015-10-22 | 2015-10-22 | 高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106609263A CN106609263A (zh) | 2017-05-03 |
| CN106609263B true CN106609263B (zh) | 2020-04-07 |
Family
ID=58610189
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510690140.0A Active CN106609263B (zh) | 2015-10-22 | 2015-10-22 | 高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106609263B (zh) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107058214B (zh) * | 2017-05-27 | 2020-05-08 | 广州润虹医药科技股份有限公司 | 诱导多能干细胞定向分化肾脏细胞的培养基和培养方法 |
| CN108728413A (zh) * | 2017-06-13 | 2018-11-02 | 中山大学中山眼科中心 | 一种人多能干细胞来源人视网膜色素上皮细胞的制备和扩增培养方法 |
| CN108531443A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-09-14 | 温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院 | 小分子诱导多能性干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法 |
| CN109136184B (zh) * | 2018-07-16 | 2021-09-03 | 同济大学 | 诱导人多能性干细胞分化为rpe细胞的方法 |
| WO2020229628A1 (en) * | 2019-05-15 | 2020-11-19 | Novo Nordisk A/S | Methods for obtaining eye field progenitor cells from human pluripotent stem cells |
| CN110628696B (zh) * | 2019-08-28 | 2021-09-07 | 郑州大学 | 定向诱导细胞分化的小分子组合物及视网膜色素上皮细胞的制备方法 |
| CN115418343A (zh) * | 2022-10-28 | 2022-12-02 | 深圳市俊元生物科技有限公司 | 从人视网膜色素上皮细胞中提取多能干细胞的方法 |
| CN116769713B (zh) * | 2023-08-14 | 2023-10-27 | 四川大学华西医院 | 一种视网膜色素上皮细胞的制备方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2929782A1 (en) * | 2004-01-23 | 2015-10-14 | Ocata Therapeutics, Inc. | Improved modalities for the treatment of degenerative diseases of the retina |
| CN102465111A (zh) * | 2010-11-19 | 2012-05-23 | 薛志刚 | 一种体外人胚胎干细胞诱导分化为视网膜色素上皮细胞的试验方法 |
| US9850463B2 (en) * | 2012-02-01 | 2017-12-26 | The Regents Of The University Of California | Methods of culturing retinal pigmented epithelium cells, including xeno-free production, RPE enrichment, and cryopreservation |
| CN102618488A (zh) * | 2012-03-15 | 2012-08-01 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种制备视网膜色素上皮细胞的方法 |
-
2015
- 2015-10-22 CN CN201510690140.0A patent/CN106609263B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106609263A (zh) | 2017-05-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106609263B (zh) | 高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法 | |
| JP6185907B2 (ja) | 神経分化のための多能性幹細胞の予備刺激 | |
| Fligor et al. | Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells | |
| CN106609256B (zh) | 体外诱导人胚胎干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的方法 | |
| JP6824267B2 (ja) | ヒト誘導多能性幹細胞からライディッヒ細胞への分化誘導方法及びその用途 | |
| Rezanejad et al. | In vitro differentiation of adipose-tissue-derived mesenchymal stem cells into neural retinal cells through expression of human PAX6 (5a) gene | |
| Jin et al. | Generation of retinal cells from pluripotent stem cells | |
| CN113549596B (zh) | 一种诱导培养基及其使用方法和应用 | |
| Li et al. | Retinal organoids: Cultivation, differentiation, and transplantation | |
| JP2023038336A (ja) | ランドマーク転写因子を使用した幹細胞分化による神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、およびオリゴデンドロサイトの誘導 | |
| CN111088229B (zh) | 一种人多能干细胞来源的视网膜前体细胞的制备方法 | |
| JP2004511266A (ja) | 間葉間質細胞に対する治療的利用法 | |
| Markus et al. | An optimized protocol for generating labeled and transplantable photoreceptor precursors from human embryonic stem cells | |
| Banumathi et al. | High-yielding enzymatic method for isolation and culture of microvascular endothelial cells from bovine retinal blood vessels | |
| CN1884494A (zh) | 诱导人胚胎干细胞向肝脏细胞分化的方法及其专用培养基 | |
| CN109983118A (zh) | 以rna通过干细胞分化诱导肝细胞 | |
| CN102533647B (zh) | 一种诱导干细胞神经分化的方法 | |
| CN105087475B (zh) | 一种细胞培养液及其应用以及诱导牙髓干细胞向神经样细胞分化的方法 | |
| CN107164325B (zh) | MSCs来源的少突胶质细胞的制备方法及试剂盒 | |
| CN105969733B (zh) | 诱导分化hPSCs为谷氨酰胺能神经元的方法 | |
| CN106609257B (zh) | 高效分离体外诱导的rpe细胞和rpc的方法 | |
| CN111304167B (zh) | 人源脂肪干细胞来源的神经元前体细胞及其制备方法和应用 | |
| CN104130975B (zh) | 人源脂肪干细胞来源的神经元样细胞及其制备方法和应用 | |
| CN106148284A (zh) | 小分子定向组织和器官再生的多能人类干细胞技术、方法和产品 | |
| CN113272422A (zh) | 用于无载体3d球体悬浮培养中视网膜神经元生成的方法和组合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |