CN106148284A - 小分子定向组织和器官再生的多能人类干细胞技术、方法和产品 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了小分子定向组织和器官再生的多能人类干细胞技术、方法和产品。本发明提供的技术可以大规模地直接从多能人类干细胞通过小分子定向分化诱导高效转化成优质性临床级无异物的高纯度特定谱系的人体细胞,为用于细胞治疗法和商业化提供了大规模生产或制造优质性临床级无异物的多能人类干细胞及其功能性人体细胞疗法衍生物的途径。具体来说,本发明的医疗创新提供了高纯度功能性人体神经细胞和心脏肌肉细胞的新颖的商业来源为中枢神经系统或心肌修复。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体地说,本发明涉及小分子定向组织和器官再生的多能人类干细胞技术、方法和产品。
背景技术
未分化的人类胚胎干细胞(human embryonic stem cells[hESC])具有长期性稳定培养生长和无限的内在潜力分化为各种类型的人体细胞。人类胚胎干细胞是从囊胚的内细胞团胚泡或外胚层的来源派生出来的,不仅提供了一个有力的体外模型系统用于研究人类胚胎发育,而且为大量供应针对疾病的特定谱系的人体细胞提供了一个体外衍生物的多功能贮存库[1-3]。然而,如何有效地可预测地引导多能人类干细胞的广泛分化潜能来产生所需的人体细胞类型一直是发育研究和临床应用上的一个重大挑战。常规方法依赖于多能干细胞自发的胚层多谱系分化倾向来产生混合细胞群内含来源于三个胚层的细胞种类,常使所希求的分化不仅效率低,而且不可控制亦不可靠[1-3]。虽然这样的细胞可在体外自发地通过一个多谱系聚集体或胚状体阶段分化成所有胚层的细胞,只有很一小部分细胞会成为一个给定的谱系的细胞。在这些人类胚胎干细胞衍生的聚集体或胚状体会同时出现大量的来源于三个胚层的大相径庭的不希求的细胞类型,常使产生所希求的细胞类型不仅效率低,而且不可控制亦不可靠。这些多能干细胞衍生的移植物在移植后往往不仅在产生所需的重建受损结构的细胞类型效率低,而且发生细胞表型异质性和不稳定性,因此,有致瘤的高风险[1-3]。目前人类胚胎干细胞衍生的第一代细胞产物含有混合细胞群,包括残留的未分化的人类胚胎干细胞和部分分化的细胞仍保留增殖和分化成不想要的细胞的潜力,提出了一个潜在的安全性问题。鉴于对使用多能人类干细胞日益增长的兴趣,包括来自非胚胎或成体细胞的人工重新编程诱导的多能细胞(hiPS细胞),移植后出现畸胎瘤和不适当的细胞类型已经成为一个经常的关注[1-3]。如果没有一个实际的策略来直接转换多能干细胞成为一个给定的谱系的细胞,以往在多能人类胚胎干细胞及其分化的多谱系聚集体的研究于人类胚胎发育提供分子控制机制的影响不大。发展了一种新的实用的方法能够有效地可预测地引导多能人类干细胞的广泛分化潜能来产生所需的人体细胞类型,是不只对于用人类胚胎干细胞的巨大潜力来发展安全和有效的细胞治疗法至关重要,同时也对揭幕人类胚胎发育中的分子和细胞线索至关重要。
最初衍生的人类胚胎干细胞需要用生长停滞的小鼠胚胎成纤维细胞来一起培养[1]。尽管已经开发了用于人类胚胎干细胞的一些用人的饲养细胞,不用饲养细 胞,和化学配制的培养系统,对多能人类干细胞的自我更新的必需因素仍未了解[1-3]。虽然这些外源的饲养细胞和生物试剂有助于保持未分化的胚胎干细胞的长期稳定性增长,但也掩盖了多能人类干细胞对发育信号作出反应的能力。因此,开发多能人类干细胞的定义培养系统不仅可使多能人类干细胞直接转化成为临床上的早期特定谱系的人体细胞不用中间的多谱系胚层或胚状体的过渡阶段,也可使用于模仿人类胚胎发育鉴定诱导器官发生过程中必需的信号分子[1-3]。
目前用于各种神经系统疾病和损伤的治疗方法可以缓解症状,但不能改变疾病的预后。细胞治疗法对恢复失去的神经组织和功能提供了再生和更换的可行方法,因此有相当大的需求。然而,适宜临床上应用的有足够的神经生长潜力的可以移植的人类干细胞来源至今缺乏,成为在开发用于恢复受损或失去的中枢神经系统的结构和神经电路的安全和有效的细胞治疗法上的严重障碍。可以移植的人类神经干细胞的传统来源一直是直接从中枢神经系统分离出来的人神经干细胞(hNSC)[4]。这些中枢神经系统衍生的初级人神经干细胞类似神经上皮细胞,对巢蛋白(nestin)标记物呈现阳性,并且可以在体外和体内自发地分化成含有未分化的人神经干细胞,神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞的混合细胞群[4]。然而,基于中枢神经系统衍生的人神经干细胞的细胞治疗法遇到供应限制和临床上使用的困难,由于其可塑性随衰老下降和增殖能力有限,这使得它难以保持大规模和长期的培养,限制了组织衍生的人神经干细胞作为合适的临床上使用的移植材料来源[1-4]。中枢神经系统衍生的人神经干细胞尽管取得了一些有益的结果,但其疗效主要是通过非神经子代细胞产生的营养和/或神经保护分子来拯救垂死的内源性宿主神经元[1-4]。移植的组织来源的干细胞只能产生少量的神经元,不足以更换受损的中枢神经系统的神经元[1-4]。
遗传稳定的多能人类胚胎干细胞提供了中枢神经系统发育中的各类神经元细胞可以用于再生和修复中枢神经系统,为许多神经系统疾病提供了治愈的途径。因此,已被视为一种提供大量的用于恢复损伤或失去的中枢神经系统神经组织和功能的人神经元细胞类型和子类型的理想来源。然而,实现人类胚胎干细胞的发育和治疗潜力一直受到产生所需的人体细胞类型通过多能干细胞的多谱系分化的低效率和不稳定性的阻碍。虽然神经谱系细胞出现在相对早期的分化阶段,只有<5%的人类胚胎干细胞自发分化为神经元[1-3]。视黄酸(Retinoic acid)不诱导维持在饲养细胞上的未分化的人类胚胎干细胞分化成神经元[1]。不像小鼠胚胎干细胞,用视黄酸处理治疗人类胚胎干细胞分化的多谱系聚集体或胚状体仅略增神经元的分化[1-3]。现用作法自多能干细胞通过多谱系分化衍生,这些神经移植物移植后在产生神经元上效率低,不仅不能充分地再生或重建受损的中枢神经系统的结构,而且也畸胎瘤和/或肿瘤形成的高风险,不能为临床应用所接受[1-3]。类似于中枢神经系统衍生的初级人神经干细胞,这些人类胚胎干细胞衍生的人神经干细胞类似神经上皮细胞,对巢蛋白(nestin)标记物呈现阳性,并且可以在体外和体内自发地分化成含有未分化的人神经干细胞,神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞的 混合细胞群[1-3]。这些次级人神经干细胞要先从人类胚胎干细胞分化的多谱系聚集体或胚状体中通过机械分离然后才能进一步的分化。类似于中枢神经系统衍生的初级人神经干细胞,这些人类胚胎干细胞衍生的人神经干细胞的治疗效果是通过神经保护或营养机制介导来拯救垂死的宿主神经元,与移植物再生或宿主髓鞘再生无关[1-3]。越来越多的证据表明,人类胚胎干细胞从体外经由常规的多谱系分化衍生的次级人神经干细胞似乎有增加的致瘤风险,但跟体内中枢神经系统分离的初级人神经干细胞相比并没有改善神经增长的潜力,仍然不足以用于中枢神经系统再生[1-3]。
目前无论是由内源性细胞或细胞移植或心脏组织工程,缺乏合适的人心肌细胞的来源已成为在再生受损人类心肌上的严重障碍[1-3]。在成人心脏中,成熟的收缩心肌细胞已经终末分化,无法再生。损伤或病态的心肌是由巨噬细胞除去并换上非功能性细胞或疤痕组织。虽然在产后的心脏中已发现细胞群表达干细胞标记物,但数量微不足道,而且它们主要分化为平滑肌细胞而不是功能性收缩心肌细胞,越来越多的证据表明他们不是真正的心脏细胞,对他们可用于心肌修复引起质疑[1-3]。没有证据表明,从其他来源的干细胞,例如间充质干细胞,骨髓细胞,脐带血干细胞,脐带血细胞,患者的心脏组织细胞,胎盘细胞,或脂肪组织来源的细胞移植入心脏后能够产生收缩的心脏细胞[1-3]。因此,无论是内源性或通过细胞移植的成体干细胞疗法尚未满足在现今的医疗保健行业再生或修复受损心脏肌肉的需求。多能人类胚胎干细胞为细胞治疗法提供了唯一的产生大量的心脏移植物的途径。由于全球心血管疾病的流行和器官捐赠或心脏移植物的严重短缺,对开发人类胚胎干细胞为基础的心脏疾病细胞疗法带有强烈兴趣[1-3]。人类胚胎干细胞和其衍生物较成体组织的免疫抗原性低很多[1-3]。另外,也可以大量存库具同型白细胞抗原的人类胚胎干细胞,从而改善与细胞移植物紧密搭配的可能性[1-3]。
然而,实现人类胚胎干细胞的治疗潜力受到产生所需的心肌细胞通过多谱系分化的低效率和不稳定性的阻碍。在人类胚胎干细胞分化的多谱系聚集体或胚状体,只是一小部分的细胞(~1-4%)自发分化成心肌细胞[1-3]。继机械分离和免疫选择之后会产生少量心肌细胞可以注入动物模型的心脏作为生物起搏器挽救受损心肌的功能[1-3]。虽然移植后,这样的人类胚胎干细胞衍生的心肌细胞可以衰减急性心肌梗死的啮齿动物模型的心脏衰竭,它们却不足以恢复心脏功能或改变一个慢性心肌梗塞动物模型的心脏衰竭[1-3]。
由于中枢神经系统和心脏疾病的全球流行,对发展多能人类干细胞为细胞为基础的细胞治疗法已产生了浓厚的兴趣。然而,多能人类干细胞本身非专门的功能性细,不能直接用于治疗。我们已认识到多能人类干细胞必须通过一个称为分化的过程变成命运限制性专门的功能细胞然后才能用于细胞治疗。现存的多能人类干细胞分化途径依赖于多能干细胞自发的不可控制亦不可靠的多谱系分化来产生胚状体或聚集体含来源于三个胚层的混合细胞群,其中只有很一小部分细胞会成为一个 给定的谱系的细胞。那些常规的多能人类干细胞分化方法的纯化或分离步骤费力,昂贵,亦耗时,仅产生少量的所需细胞,不适于商业和临床应用。越来越多的科学证据表明,那些传统的分化方法导致其细胞衍生物和组织工程构建物移植后低效,不稳定,分化不完整,表现不佳,和高肿瘤风险等问题。根据目前使用的在该领域现存的方法,多能人类干细胞衍生的细胞制品含有异质群体的混合细胞类型,包括完全分化的细胞,大量的各种程度部分分化或未分化的细胞,和少量的未分化的多能人类干细胞,提出了一个当给病症患者施用上潜在的安全性问题。此外,通常用于分离,扩增,和分化多能人类干细胞的异物或动物生物补充剂和/或饲养细胞使其细胞衍生物不适于临床应用或人体试验。发展新策略能够可专门地预测地引导多能人类干细胞的广泛分化潜能来产生特定谱系的神经或心脏细胞,不仅是对于用人类胚胎干细胞的巨大潜力来修复神经或心脏至关重要,同时也对揭幕人类胚胎发育中中枢神经系统或心脏形成的分子和细胞线索至关重要。
因此,可以看出,有必要开发新技术用于良好控制高效率引导多能人类干细胞的广泛分化潜能可专门地预测地转化成大量的神经谱系细胞,这对为修复神经系统的疾病或损伤提供大量的高纯度高效并有足够的神经生长潜力适合于临床应用的各种发育阶段的人神经细胞治疗产品至关重要。
因此,可以看出,有必要开发新技术用于良好控制高效率引导多能人类干细胞的广泛分化潜能可专门地预测地转化成大量的心脏谱系细胞,这对为修复心血管疾病中损伤的心肌提供大量的高纯度高效并有足够的心肌生长潜力适合于临床应用的各种发育阶段的人心肌细胞治疗产品至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小分子定向组织和器官再生的多能人类干细胞技术、方法和产品。
本发明的第一方面,提供了从多能人类干细胞产生特定谱系的人体细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
(i)在定义培养基中培养多能人类干细胞;
(i i)在步骤(i)的培养物中加入诱导剂,继续培养至至少90%的(优选地为至少95%的,更优选地为至少98%的,如98.5%的、99%的、99.5%的)多能人类干细胞分化成一种特定谱系的人体细胞;
其中,所述定义培养基中不含血清,并且不含异种细胞。
在另一优选例中,所述定义培养基中不含异种细胞条件培养基,不含异种蛋白,不含异种脱氧核糖核酸(DNA),不含异种核糖核酸(RNA)。在本发明中术语“异种”是指,与所培养的多能人类干细胞不同,包括:源自不同物种的、源自不同个体(同物种)的、源自不同器官(同个体)的。
在另一优选例中,所述异种细胞包括饲养细胞。
在另一优选例中,所述定义培养基包含一个基础培养基,20-100ng/ml碱 性成纤维细胞生长因子(bFGF),0.01-0.03mg/ml胰岛素(insulin),0.04-0.06mg/ml抗坏血酸(ascorbic acid),20-100ng/ml激活素(activin-A),和0.01–1mg/ml层粘连蛋白(laminin)。
在另一优选例中,所述定义培养基中层粘连蛋白的含量为0.01-1mg/ml,优选地为0.02-0.2mg/ml,更优选地为0.03-0.1mg/ml,最优选地为0.04-0.06mg/ml。
在另一优选例中,所述多能人类干细胞包括:实验用多能人类干细胞、临床级无异物的多能人类干细胞等。
在另一优选例中,所述多能人类干细胞包括多能人类胚胎干细胞。
在另一优选例中,所述的多能人类干细胞包括用当前良好生产规范(cGMP)制造的优质性多能人类干细胞。
在另一优选例中,所述多能人类干细胞至少有70%表达选自下组的至少4种细胞标记物:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase),OCT-4,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,乙酰化的组蛋白(acetylated histones),BRG-1,hSNF2H,和microRNA hsa-miR-302。
在另一优选例中,所述多能人类干细胞具有选自下组的特性:
(1)能够在定义培养基中增殖一年以上;
(2)通过长期培养后仍保持稳定的染色体核型,其中染色体是整倍体;及
(3)在培养过程中始终保持分化为内胚层,中胚层和外胚层组织的潜力。
在另一优选例中,所述的特定谱系的人体细胞包括从在步骤(ii)中的特定谱系的人体细胞中进一步分化出来的功能性衍生细胞。
在另一优选例中,所述诱导剂具有诱导所述多能人类干细胞分化为特定谱系的人体细胞的能力。
在另一优选例中,所述诱导剂选自:化合物、多肽、多核苷酸、或其组合。
在另一优选例中,所述诱导剂选自:化合物、生长因子、信号分子、细胞因子、形态发生素、核酸分子、核苷酸、寡核苷酸、微小核糖核酸(microRNA)、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、肽(peptides)、蛋白质、基于序列的分子、序列编码的分子或其组合。
在另一优选例中,所述化合物包括选自下组的至少一种分子:全反式-视黄酸(all-trans-retinoic acid);9-顺式-视黄酸(9-cis retinoic acid);维甲酸(retinoid)及其类似物、受体(receptor)、或配体(ligand);Nurr-1及其途径调剂;sonic hedgehog及其途径调剂;烟酰胺(nicotinamide)及其类似物、受体、或配体;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)(nicotinamide adenine dinucleotide)和NAD依赖性酶、其活化剂或抑制剂;和Nkx2.5及其途径调剂。
在另一优选例中,所述的特定谱系的人体细胞包括神经系统细胞和心脏系统细胞。
在另一优选例中,所述的神经系统细胞选自神经外胚层细胞、神经干细胞、 神经元源祖细胞、神经元前体细胞、神经细胞、神经元细胞、色素神经元细胞、神经元、多巴胺能神经元、运动神经元、人脑腹侧的神经前体细胞、和人脑腹侧的神经元。
在另一优选例中,所述神经系统细胞表达选自下组的至少2种细胞标记物:Nurr-1、SSEA-1、微管蛋白(beta-III-tubulin)、MAP-2、神经元核抗原(NeuN)、microRNA hsa-miR-10,microRNA hsa-let-7、乙酰化的组蛋白(acetylated histones)、BRG-1、和hSNF2H。
在另一优选例中,所述的神经系统细胞包括多巴胺能神经元和运动神经元、并且表达选自下组的至少1种细胞标记物:酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase)、Lmx1、MSX1、Pitx3、HB9、Lim3,和Isl1。
在另一优选例中,所述的心脏系统细胞选自心脏中胚层细胞、心脏细胞、心脏干细胞、心脏的前体细胞、心脏源祖细胞、心血管细胞、和心肌细胞。
在另一优选例中,所述的心脏系统细胞表达选自下组的至少2种细胞标记物:Nkx2.5、辅肌动蛋白(alpha-actinin)、SSEA-1、心肌肌球蛋白重链(MHC)、MEF2c、GATA-4、心肌肌钙蛋白-I(cTnI)、心肌钙蛋白-T(cTnT)、VE-钙粘蛋白(VE cadherin)、血管性血友病因子(von Willebrand factor)、SM22alpha、和H1-调宁蛋白(H1-calponin)。
在另一优选例中,所述的心脏系统细胞包括具有自发性节律性收缩跳动的心肌细胞。
本发明的第二方面,提供了一种制备组织工程构建物的方法,所述方法包括步骤:
(ⅰ)根据本发明第一方面所述的方法,从多能人类干细胞产生特定谱系的人体细胞;及
(ii)制造组织工程构建物,将所述特定谱系的人体细胞或其功能性衍生物加入到一个结构模板,制备所述组织工程构建物。
在另一优选例中,所述结构模板包括细胞外基质、生物材料支架、整个器官的支架、组织支架、器官支架、和合成或纯化的基质蛋白。
本发明的第三方面,提供了一种药物筛选的方法,所述方法包括步骤:
(i)根据本发明第一方面所述的方法,从多能人类干细胞产生特定谱系的人体细胞;
(ii)筛查化合物或细胞产物对于该特定谱系的人体细胞及其功能性衍生物的效果;所述效果是指>50%细胞对化合物或细胞产物产生反应。
在另一优选例中,所述步骤(ii)中使用高通量方法。
本发明的第四方面,提供了一种药物筛选的方法,所述方法包括步骤:
(i)根据本发明第二方面所述的方法制备组织工程构建物;
(ii)筛查化合物或细胞产物对于该组织工程构建的效果,所述效果是指>50%细胞对化合物或细胞产物产生反应。
在另一优选例中,所述步骤(ii)中使用高通量方法。
本发明的第五方面,提供了一种细胞治疗的方法,所述方法包括步骤:
(i)根据本发明第一方面所述的方法,直接从多能人类干细胞产生特定谱系的人体细胞;
(ii)给病症患者施用该特定谱系的人体细胞及其功能性衍生物;
(iii)确定该特定谱系的人体细胞及其功能性衍生物是否有恢复组织和功能的效力;如果有效,
(ⅳ)鉴定该特定谱系的人体细胞及其功能性衍生物为病人需要这种治疗的细胞治疗法产品或药物。
本发明的第六方面,提供了一种联合细胞治疗法的方法,所述方法包括步骤:
(i)根据本发明第二方面所述的方法制造组织工程构建物;
(ⅱ)给病症患者施用该组织工程构建物;
(iii)确定该组织工程构建物是否有恢复组织和功能的效力;如果有效,
(ⅳ)鉴定该组织工程构建物为病人需要这种治疗的联合细胞治疗法产品或药物。
在另一优选例中,所述病症包括神经系统疾病和心脏系统疾病。
在另一优选例中,所述的神经系统疾病包括神经退化性疾病,脊髓损伤,运动神经元病,阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease),帕金森氏症(Parkinson's disease),多发性硬化症(multiple sclerosis),肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis),脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy),脑损伤,中风(stroke),和黄斑退化(macular degeneration)。
在另一优选例中,所述的心脏系统疾病包括心脏疾病和衰竭,心肌梗死(myocardial infarction),心肌病(cardiomyopathy),缺血性心脏疾病(ischemic heart disease),心脏衰竭(congestive heart failure),中风,和冠心病(coronary artery disease)。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了小分子定向分化诱导良好控制高效转化多能人类干细胞直接成神经细胞新技术的概略时间表。
图2显示了小分子定向分化诱导良好控制高效转化多能人类干细胞直接成心肌细胞新技术的概略时间表。
图3显示了比较通过小分子定向分化诱导良好控制高效转化高质量临床级无异物的多能人类干细胞直接成神经细胞的新技术(Neuronal,>90%)与通过自发胚层诱导多能人类干细胞多谱系分化的常规分化方法(Control,5-10%)的分化效率。
图4显示了比较通过小分子定向分化诱导良好控制高效转化高质量临床级无异物的多能人类干细胞直接成心肌细胞的新技术(Cardiac,>90%)与通过自发胚层诱导多能人类干细胞多谱系分化的常规分化方法(Control,<4%)的分化效率。
图5显示了多能人类胚胎干细胞通过小分子诱导神经定向分化。RA通过促进神经元特异性转录因子Nurr-1的核易位诱导维持在一个定义培养系统中的未分化的高质量临床级无异物的多能人类胚胎干细胞神经衍生物高效发展为神经细胞。
图6显示了多能人类胚胎干细胞通过小分子诱导心肌定向分化。(A)NAM诱导维持在一个定义培养系统中的未分化的高质量临床级无异物的多能人类胚胎干细胞开始表达早期心肌特异性转录因子CSX/Nkx2.5。(B)NAM诱导的人类胚胎干细胞心脏衍生物高效发展为跳动的心肌细胞。(C)代表性人类胚胎干细胞衍生的跳动心肌细胞及其强节奏收缩类似临床的心电图。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究,获得一种诱导多能干细胞定向分化的技术,实验结果表明,使用本发明的方法能够高效的诱导多能人类干细胞产生特定谱系的人体细胞。在实验中本发明人意外的发现,定义培养基中的各个组分含量特别是层粘连蛋白(laminin)的含量对细胞分化具有显著的影响。经过大量的实验,本发明分别确定了诱导神经细胞和心脏细胞的定义培养基的最佳组成。
本发明一般涉及到的领域是多能人类干细胞生物学和再生医学。本发明提供的技术可以大规模地直接从多能人类干细胞通过小分子定向分化诱导高效转化成优质性临床级无异物的高纯度特定谱系的人体细胞,为用于细胞治疗法和商业化提供了大规模生产或用当前良好生产规范进行大规模制造的优质性临床级无异物的多能人类干细胞及其功能性人体细胞疗法衍生物的途径。具体来说,本发明的医疗创新提供了高纯度功能性人体神经细胞和心脏肌肉细胞的新颖的商业来源为中枢神经系统或心肌修复。本发明提供了技术,方法和产品通过小分子定向分化诱导为良好控制高效率直接转化多能人类干细胞成大量优质的人体干细胞或前体细胞或源祖细胞和临床上的特定谱系功能性人 体细胞可用于组织和器官工程和再生,细胞治疗法,药物研发和测试,用当前良好生产规范进行大规模制造,干细胞库,和临床应用。
本发明提供的技术,方法和产品通过小分子定向分化诱导为良好控制高效率直接转化多能人类干细胞成大量优质的人体干细胞或前体细胞或源祖细胞和临床上的特定谱系功能性人体细胞可用于组织和器官工程和再生,细胞治疗法,药物研发和测试,用当前良好生产规范进行大规模制造,干细胞库,和临床应用。
多能人类干细胞可以用于恢复人体组织和器官的功能,但发挥多能人类干细胞的巨大潜力一直受到产生所需的人体细胞类型通过多谱系分化的低效率和不稳定性的阻碍。本发明提供的技术可以大规模地直接从多能人类干细胞通过小分子定向分化诱导高效转化成优质性临床级无异物的高纯度特定谱系的人体细胞,为用于细胞治疗法和商业化提供了大规模生产或制造优质性临床级无异物的多能人类干细胞及其功能性人体细胞疗法衍生物的途径。具体来说,本发明的医疗创新提供了高纯度功能性人体神经细胞和心脏肌肉细胞的新颖的商业来源为中枢神经系统或心肌修复。本发明提供了技术,方法和产品通过小分子定向分化诱导为良好控制高效率直接转化多能人类干细胞成大量优质的人体干细胞或前体细胞或源祖细胞和临床上的特定谱系功能性人体细胞可用于组织和器官工程和再生,细胞治疗法,药物研发和测试,用当前良好生产规范进行大规模制造,干细胞库,和临床应用。
本发明提供了技术通过小分子定向分化诱导直接转化多能人类干细胞一致地成与临床相关上的特定谱系人体细胞。
本发明提供了技术为从多能人类干细胞用当前良好生产规范大规模高效生产高质量临床级无异物的中枢神经系统发育中的人神经前体细胞和人神经细胞类型和亚型用于针对各种神经系统疾病的神经再生和更换疗法。
本发明提供了技术为从多能人类干细胞用当前良好生产规范大规模高效生产高质量临床级无异物的人心脏前体细胞和人心肌细胞用于针对心脏疾病和衰竭的心肌再生和更换疗法。
因此,本发明的一个实施方案是提供了一种用当前良好生产规范进行大规模制造的生产方法通过小分子定向分化诱导直接从维持在一个定义培养系统中的多能人类干细胞来生产高质量临床级无异物的与临床相关上的特定谱系人体细胞。
本发明的另一个首选实施方案是提供了一种方法通过小分子定向分化诱导用当前良好生产规范进行大规模制造的高质量临床级无异物的多能人类干细胞成为特定谱系的功能性人体细胞可用于组织工程,药物研发,药物测试,和细胞疗法。
本发明的一个具体的实施方案是提供了一种方法通过使用视黄酸(retinoic acid)诱导直接从用当前良好生产规范进行大规模制造的高质量临 床级无异物的维持在一个定义培养系统中的人类胚胎干细胞中定向分化出神经外胚层通过促进神经元特异性转录因子Nurr-1的核易位及触发神经元谱系特定性的高效高纯度大规模的发展为人神经前体细胞和人神经元细胞。
本发明的另一个具体的实施方案是提供了一种方法通过使用烟酰胺(nicotinamide)诱导直接从用当前良好生产规范进行大规模制造的高质量临床级无异物的维持在一个定义培养系统中的人类胚胎干细胞中定向分化出心脏中胚层通过促进早期心肌特异性转录因子CSX/Nkx2.5的表达及触发心脏谱系特定性的高效高纯度大规模的发展为人心脏前体细胞和跳动的人心肌细胞。
下面的说明进一步阐明这些和其它一些本发明的实施方案。
发明详述
多能人类胚胎干细胞保持用于恢复细胞,组织,和器官功能的巨大潜力。然而,实现人类胚胎干细胞的发育和治疗潜力一直受到产生所需的人体细胞类型通过多谱系分化的低效率和不稳定性的阻碍。基于维持在定义培养条件下的多能人类干细胞能够通过小分子定向分化诱导一致地转变成一个特定谱系的人体细胞的发现,本发明为用于细胞治疗法和商业化提供了用当前良好生产规范进行大规模生产或制造优质性临床级无异物的多能人类干细胞及其功能性人体细胞疗法衍生物的途径。该医疗创新提供了高纯度功能性人体神经细胞和心脏肌肉细胞的新颖的商业来源为中枢神经系统或心肌修复。本发明提供了技术,方法和产品通过小分子定向分化诱导为良好控制高效率直接转化多能人类干细胞成大量优质的人体干细胞或前体细胞或源祖细胞和临床上的特定谱系功能性人体细胞可用于组织和器官工程和再生,细胞治疗法,药物研发和测试,用当前良好生产规范进行大规模制造,干细胞库,和临床应用。
具体来说,确定了视黄酸(retinoic acid)足以诱导维持在一个定义培养系统中的人类胚胎干细胞从多能状态直接定向分化成神经外胚层通过促进神经元特异性转录因子Nurr-1的核易位并触发神经元谱系特定性的高效高纯度的发展为中枢神经系统发育中的人神经前体细胞和人神经元细胞[1-3,6-13]。同样地,确定了烟酰胺(nicotinamide)足以诱导维持在一个定义培养系统中的人类胚胎干细胞从多能状态直接定向分化成心脏中胚层通过促进早期心肌特异性转录因子CSX/Nkx2.5的表达并触发心脏谱系特定性的高效高纯度的发展为人心脏前体细胞和跳动的人心肌细胞[1-3,5-7,9]。该医疗创新不仅提供了大量适于临床应用的人神经元细胞治疗产品用于针对各种神经系统疾病的神经再生和更换疗法和大量适于临床应用的人心脏细胞治疗产品用于针对心脏疾病和衰竭的心肌再生和更换疗法,而且为大量供应与临床相关的特定谱系人体细胞衍生物用于再生医学提供了小分子定向直接控制人类胚胎干细胞的多能状态的途径。
最初衍生的人类胚胎干细胞需要用生长停滞的小鼠胚胎成纤维细胞来一 起培养,,因为传递病原体,改变遗传背景,促进免疫原性蛋白的表达的风险而削弱了这些细胞的治疗潜力[1-3]。尽管已经开发了用于人类胚胎干细胞的一些用人的饲养细胞,不用饲养细胞,和化学配制的培养系统,对人类胚胎干细胞的自我更新的必需因素仍未了解[1-3]。虽然这些外源的饲养细胞和生物试剂有助于保持未分化的胚胎干细胞的长期稳定性增长,但也掩盖了人类胚胎干细胞对发育信号作出反应的能力。因此,我已试图系统地减少未分化的人类胚胎干细胞的生长需求到最少的定义组成培养元素,并确定了碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),胰岛素(insulin),抗坏血酸(ascorbic acid),和层粘连蛋白(laminin)作为维持在一个定义培养系统中的人类胚胎干细胞的胚层(epiblast)多能性的最少的定义组成培养元素,为从头衍生适于临床应用的人类胚胎干细胞及有效地使用小分子诱导人类胚胎干细胞一致地向功能性人体细胞谱系定向分化提供了一个平台[1-3]。
为了实现一致转换多能人类胚胎干细胞为特定的细胞谱系,我已用该定义培养系统来筛选各种小分子和生长因子对人类胚胎干细胞的多能状态的分化诱导作用[1-3,5,6,8]。虽然神经谱系细胞出现在人类胚胎干细胞分化相对早期的分化阶段,用视黄酸处理治疗人类胚胎干细胞分化的多谱系聚集体或胚状体仅略增神经元的分化[1]。视黄酸(Retinoic acid)不足以诱导维持在先前报道的培养条件含有饲养细胞或饲养细胞的条件培养基的未分化的人类胚胎干细胞分化成神经元[1]。不过,我发现,该定义培养条件足以使小分子视黄酸诱导人类胚胎干细胞从多能状态直接定向分化成神经外胚层并触发高效的发展为中枢神经系统发育中的人神经前体细胞和人神经元细胞通过促进神经元特异性转录因子Nurr-1的核易位,Nurr-1是孤儿核激素受体超级家族的一个成员牵连腹侧神经元发育,特别是对腹侧中脑发育和多巴胺神经元(dopaminergic neuron)分化限速步骤中的酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase)的活化[1-3,8-13]。同样地,该定义培养条件足以使小分子烟酰胺诱导人类胚胎干细胞从多能状态直接定向分化成心脏中胚层并触发高效的发展为人心脏前体细胞和跳动的人心肌细胞通过促进早期心肌特异性转录因子CSX/Nkx2.5的表达[1-3,5,6,9]。该化合物不足以诱导人类胚胎干细胞分化的多谱系聚集体或胚状体或维持在先前报道的培养条件含有饲养细胞或饲养细胞的条件培养基的未分化的人类胚胎干细胞分化[1]。这一发现为良好控制高效率通过小分子定向分化诱导直接转化多能人类干细胞成与临床相关的特定的细胞谱系提供了一个平台[1-3]。
不像那两种典型的类似神经上皮细胞对巢蛋白(nestin)标记物呈现阳性的无论是从人类胚胎干细胞或中枢神经系统衍生的人神经干细胞,这种新颖的人神经前体细胞已经视黄酸体外诱导多能人类胚胎干细胞而获得神经外胚层的特性,不表达巢蛋白,但一致呈现强度的核型的Nurr-1表达。虽然中枢神经系统衍生的人神经干细胞已经体内发育过程而获得其神经外胚层的特性并 呈现中度的核型的Nurr-1表达,人类胚胎干细胞衍生的人神经干细胞,Nurr-1定位于细胞表面和细胞质,这表明其无活性[10]。允许附着后,跟人类胚胎干细胞衍生的人神经干细胞(~6%)或中枢神经系统衍生的人神经干细胞(~13%)在相同的神经分化条件下产生beta-III-微管蛋白(-III-tubul in)的低效率相比,人类胚胎干细胞诱导的人神经前体细胞表达神经元标记物beta-III-微管蛋白并共表达MAP-2的效率的急剧增长(~94%)[10]。没出现其他神经谱系细胞,例如神经胶质细胞,对GFAP呈阳性的星形胶质细胞和对MBP呈阳性的少突胶质细胞,或非神经细胞。此类神经元细胞制品也可以胰蛋白酶(trypsin)分离并保持为单层。这些人类胚胎干细胞衍生的神经元细胞于是有相当大的比例开始表达与位于腹侧神经元群体相关联的标记物,如酪氨酸羟化酶(多巴胺神经元)和HB9/Lim3/Isl1(运动神经元)。
根据目前使用的在该领域现存的方法,多能人类干细胞衍生的细胞制品含有异质群体的混合细胞类型,包括完全分化的细胞,大量的各种程度部分分化或未分化的细胞,和少量的未分化的多能人类干细胞,提出了一个当给病症患者施用上潜在的安全性问题[1-3]。与此相反,人类胚胎干细胞诱导的细胞制品含有同质群体的人神经前体细胞具有产生大量的神经元细胞的潜力(~94%)。在这种新颖的人类胚胎干细胞衍生的细胞产物中辅助细胞(例如,其它类型的神经细胞)和不适当的细胞(例如,未分化的人类胚胎干细胞,细胞毒性细胞,和非神经细胞)是检测不到的。人类胚胎干细胞诱导的人神经前体细胞只高效地产生神经元,并没有分化成神经胶质细胞,表明这些对Nurr-1呈阳性的人神经前体细胞是一种新颖的神经元前体细胞比典型的类似神经上皮细胞对巢蛋白(nestin)标记物呈现阳性的人神经干细胞更具特定的神经元谱系。该小分子定向分化诱导方法从人类胚胎干细胞的多能状态以神经元谱系特定性地高效高纯度地直接产生对核型的Nurr-1呈阳性的中枢神经系统发育中的人神经前体细胞和人神经元细胞,因此,可以通过消除未分化的人类胚胎干细胞和非神经不适当的细胞类型的存在来最大限度地减少畸胎瘤和异位组织形成的风险。该医疗创新将大大增加依赖于移植的神经元更换和再生的临床疗效及人类胚胎干细胞衍生的细胞产品用于中枢神经系统修复的安全。同样地,该小分子定向分化诱导方法从人类胚胎干细胞的多能状态以心脏谱系特定性地高效高纯度地直接产生人心脏前体细胞和人心肌细胞,因此,可以通过消除未分化的人类胚胎干细胞和非心脏不适当的细胞类型的存在来最大限度地减少畸胎瘤和异位组织形成的风险。该医疗创新将大大增加依赖于移植的心肌细胞更换和再生的临床疗效及人类胚胎干细胞衍生的细胞产品用于心血管修复的安全。
微核糖核酸(MicroRNA)是新兴的干细胞多能性和分化的重要调节因子。微核糖核酸是小小分子,进化上保守的非编码核糖核酸,通过抑制基因(mRNA)翻译和促进基因(mRNA)降解来调节基因表达。微核糖核酸作为基因表达网络的控 制人,从而调节发育或疾病中复杂的细胞表型。微核糖核酸芯片剖面(microarray profile)分析表明,与多能性相关的微核糖核酸两个最突出的系列has-miR-302家族和has-miR-371/372/373家族的表达通过小分子定向分化诱导是急剧下降[9,11]。其中在多能人类胚胎干细胞中表达最高的hsa-miR-302家族被完全表达沉默,这表明人类胚胎干细胞诱导的人神经前体细胞不像以往的人类胚胎干细胞通过多谱系分化衍生的细胞产物,不包含任何残留的多能人类干细胞。微核糖核酸基因组的芯片剖面分析的敏感性,特异性,稳健性和精确性足以表明人类胚胎干细胞衍生的细胞产物的同质性和特质性,因此,当施用于患者时的安全性和有效性。
一组微核糖核酸的表达通过视黄酸神经诱导后显示上调,通过烟酰胺心肌诱导后显示下调[9]。值得注意的是,hsa-miR-10系列在未分化的人类胚胎干细胞中的表达沉默,但通过视黄酸神经诱导后急剧上升[9,11]。该miR-10基因位于Hox基因簇系的发育调节因子内并共同表达一组Hox基因来抑制转录[9]。小鼠Hoxb-1的基因增强因子控制对视黄酸的反应并主要在神经外胚层中调节基因表达,该因子含有视黄酸反应元件,它不仅涉及到对视黄酸的异位反应,但也对建立Hoxb-1在胚胎发育中的早期基因表达模式必不可少[9]。hsa-miR-10表达急剧上升表明,在视黄酸诱导时,视黄酸诱导Hox基因表达并共表达Hox微核糖核酸hsa-miR-10来沉默与多能性相关的基因和has-miR-302以驱动神经外胚层表型和神经元命运[9,11]。let-7微核糖核酸下调与多能性相关的基因如myc和lin28[9,11]。这些数据显示人类胚胎干细胞诱导的人神经前体细胞已经获得了神经元特性通过沉默与多能性相关的微核糖核酸的表达,并诱导高水平的与调节神经发育和功能相关的微核糖核酸的表达,与其神经生长的高能力一致。一组独特的微核糖核酸,其中许多以前不知道到涉及神经发育和功能,有助于多能人类胚胎干细胞的神经命运的起源和神经元发展[9,11]。
一组微核糖核酸的表达通过烟酰胺心肌诱导后显示上调,通过视黄酸神经诱导后显示下调[9]。一组新型的微核糖核酸,其中许多以前不知道到涉及心脏发育和功能,有助于多能人类胚胎干细胞的心脏命运的起源和心肌发展[9]。微核糖核酸基因组规模剖面分析鉴定了人类胚胎干细胞心脏和神经小分子定向分化诱导中的新型的发育起源中的小分子微核糖核酸组[9]。在人类胚胎干细胞小分子定向分化诱导中,独特的一组与多能性相关的微核糖核酸显示下调,而新颖的驱动心脏和神经的微核糖核酸表达上调,包括通过视黄酸神经诱导后沉默与多能性相关的hsa-miR-302系列的表达并大幅增加驱动神经的Hox微核糖核酸hsa-miR-10系列的表达[9]。这一发现为大量供应与临床相关的细胞谱系用于再生疗法打开了一个小分子介导的对人类胚胎干细胞多能性命运的直接调控的新的层面。该医疗创新为良好控制高效率从多能人类胚胎干细胞衍生大量的健壮的人体干细胞或前体细胞或源祖细胞和特定谱系的功能性成 体细胞可用于临床上组织和器官的再生和修复。
为了解决这种新型的人神经前体细胞是否可以安全移植于脑内并可在体内迁移和保留其神经源性能的问题,人类胚胎干细胞诱导的人神经前体细胞移植到新生小鼠的脑室。这条途径进入脑室下区很佳,脑室下区是一个辅助生发区从此细胞广泛地迁移并应对适当的区域发育线索。至少移植3个月后,将小鼠处理用于组织学和免疫细胞化学分析。人类胚胎干细胞诱导的人神经前体细胞可移植并在大脑的神经区域内广泛地迁移,广泛地产生了分散良好综合良好的人神经元,包括对nurr-1呈现阳性的多巴胺能神经元,显示了其对神经元再生和更换细胞疗法的潜力。移植后没有移植物过度生长,形成畸胎瘤或肿瘤,或出现非神经元细胞类型。
未分化的多能人类干细胞可长期大量培养并稳定增长,具有内在潜力分化成所有的人体细胞。这些特征表明多能人类干细胞具有恢复人体组织和器官功能的巨大的潜力。科学家和研究人员面临的一贯挑战是良好控制高效率诱导多能人类胚胎干细胞一致地成与临床相关上的特定谱系人体细胞。这些方面不仅对组织和器官工程及再生细胞为基础的治疗法,而且对于药物研发有关键作用。实际上,当今的人类干细胞治疗产品构成了一个新的细胞药物概念作为能够提供与恢复人体组织和功能有关的药理活性。
神经网络细胞和心肌细胞这两种细胞系统的有限的自我修复能力使它们适合于基于干细胞衍生物的神经元和心肌疗法。干细胞疗法衍生物的临床应用为许多不治之症或迄今无法治疗的神经退化疾病和心脏疾病提供了可成功的选择。然而,目前在干细胞研究上的一个限制因素是因为缺乏具有足够神经潜力可移植的适合于临床的人体干细胞或前体细胞。新颖的解决方法对开发安全和有效的细胞疗法再生各种神经疾病中受损的中枢神经系统结构和电路至关重要。对于心血管疾病的研究,缺乏具有足够心肌再生潜力的适合于临床的人体心肌细胞也是实现再生人体受损心脏肌肉的主要障碍。本发明在有关多能人类干细胞小分子定向分化诱导转化成特定谱系的人体细胞的干细胞研究上取得了显着的进步,代表在为中枢神经系统和心肌修复的人神经元和心肌治疗产品临床上的进展。本发明提供了一个技术平台提供当前唯一具有足以再生神经元和收缩心肌的药效力人体细胞产品来源可用于临床修复中枢神经系统和心脏的功能。
本发明克服了临床应用多能人类干细胞疗法衍生物的一些主要障碍,包括建立独特的定义培养系统人类干细胞技术平台用于衍生和维持临床级高质量的多能人类干细胞系及其小分子定向分化诱导的特定谱人体细胞,这为建立安全和有效的干细胞疗法以解决主要的健康问题打下了基础。
该技术可以通过小分子定向分化诱导为良好控制高效率直接转化在定义的培养条件下的多能人类干细胞成大量优质的人神经前体细胞和功能性人神经细胞足以用于临床前和临床开发针对各种神经疾病的安全和有效的干细胞 疗法再生神经。同样地,这种技术也可以通过小分子定向分化诱导为良好控制高效率直接转化在定义的培养条件下的多能人类干细胞成大量优质的人心脏前体细胞和功能性心肌细胞足以用于临床前和临床开发针对心血管疾病的安全和有效的干细胞疗法再生收缩性心肌。本发明极大地增加了移植物依赖性神经元更换的临床疗效和多能人类干细胞衍生的细胞产品的安全性可进行大量再生。
本发明提供了技术平台为大规模生产或制造高质量临床级的人神经和心肌细胞治疗产品药物可以提供足以再生中枢神经系统和心脏的药效力来满足医疗上的挑战。本发明提供定义培养系统用于衍生和维持临床级高质量的多能人类干细胞,其中允许除去,取代,和用定义的人替代品优化在培养系统中所有不良的未指明的生物成分和基质,包括那些来自于动物的,可用于从头衍生和长期维持从未被动物细胞和蛋白污染的用当前良好生产规范进行大规模制造的优质无异物稳定的多能人类干细胞及其人体细胞疗法的衍生物,因此适合于治疗开发和临床应用。本发明还提供了小分子定向分化诱导的多能人类干细胞的特定谱系人体细胞,使神经或心脏谱系细胞直接从多能人类干细胞的多能状态通过小分子定向分化诱导转化出来,是一个临床应用人类胚胎干细胞细胞疗法衍生物的重要里程碑,所有的其他现有的方法相比将提供在效率,稳定性,安全性,有效性的优点,并且可用当前良好生产规范设施进行大规模生产优质临床级人类干细胞治疗产品用于商业和治疗。
这种干细胞技术的突破将非功能多能人类干细胞转化为高质量的命运受限的功能性细胞治疗衍生物或产品有商业和治疗用途,标志着基于细胞的再生医学从目前的动物研究向人体试验或在人类的首次研究的一个转折点。该医疗创新提供了足以再生神经元和收缩心脏肌肉的人体神经细胞和心肌细胞的可用的商业来源对于许多神经和心血管疾病临床上的中枢神经系统或心肌修复至关重要。本发明提供了有商业和治疗用途的下一代人类细胞治疗产品,在纯度,大规模生产,高质量,安全性,有效性上超过所有其他现有来源的人体细胞。本发明提供了与中枢神经系统和心脏有关的人体干细胞或前体细胞或源祖细胞和功能性人神经元和心肌细胞可用于干细胞库,体外和体内的干细胞研究,移植,人类中枢神经系统和心脏组织和器官工程,基于细胞的为人类中枢神经系统和心脏疾病的再生医学或疗法,用当前良好生产规范进行大规模制造用于商业和治疗,细胞治疗法,药物筛选,药物研发和测试,毒性和安全性测试,组织工程和再生,以及其它商业和治疗目的。
该医疗创新能开发多能人类干细胞衍生的治疗产品和供应来源,包括患者特异性的人体干细胞或前体细胞或源祖细胞,针对疾病的功能性人体细胞,细胞或生物工程的人体组织和更换器官可用于临床上修理或重建或更换损坏的人体结构和网络,以及开发技术和方法为人体组织和器官的再生,包括高通量和高含量测定,分析和操作工具,治疗策略和平台,以及组织和器官工程或再 生的途径或工具。
神经元网络和心肌细胞有限的自我修复能力构成在科学界和临床领域的一个显著挑战。神经退化和心脏疾病对世界范围内的医疗体系带来昂贵的花费,所以强调对这些治疗需求提供更新更高效的解决方案。干细胞疗法衍生物的临床应用为许多不治之症或迄今无法治疗的神经退化疾病和心脏疾病提供了可成功的选择。本发明通过提供新颖,独特的临床上的解决方案来塑造医学的未来。事实上,目前认为无法治愈或无法治疗的疾病现在通过临床应用本发明的多能人类干细胞疗法衍生物能找到有力的选择。本发明提供的人类干细胞技术和细胞治疗产品代表一种新型的细胞药物能够提供新的药效,包括恢复组织和功能。该医疗创新利用小分子定向分化诱导高效率地直接转换多能人类干细胞成适合于开发新的,安全的,并具有成本效益的干细胞疗法的高纯度的人神经元和心肌细胞的商业来源。
本发明提供了技术平台以允许从高质量临床级无异物的多能人类干细胞高效生产人神经元前体细胞和人神经元细胞类型和亚型来开发针对许多神经疾病的临床设置的神经元再生和更换疗法。同样地,本发明提供了技术平台以允许从高质量临床级无异物的多能人类干细胞高效生产人心脏前体细胞和人心肌细胞来开发针对心脏疾病和衰竭的临床设置的心肌再生和更换疗法。
作为一种新型的干细胞治疗产品,临床应用多能人类胚胎干细胞疗法衍生物为神经和心脏修复是治疗市场的新机会。目前没有经过食品药品监督管理局(FDA)批准的人类胚胎干细胞治疗产品。成功开发干细胞疗法的药物,人类干细胞治疗产品进入临床试验之前必须满足在可塑性,特异性和稳定性上的某些商业标准。推动干细胞研究从目前的动物研究到人体临床试验必须解决商业和治疗性用途这些实际问题,包括:1)该人体干细胞及其细胞疗法的衍生物产品必须能以工业规模进行制造;2)该人体干细胞及其细胞疗法的衍生物产品必须能够长期保持其正常或稳定性增殖;和3)该人体干细胞及其细胞疗法的衍生物产品必须能够分化成修复或再生所需的足够数量的特定细胞类型或谱系。这些实际问题对于指定任何人类干细胞作为人类干细胞治疗产品向食品药品监督管理局提交一份研究新药申请(IND)并进入人体试验或首次人体研究是必要的。该医疗创新提供了人类干细胞疗法治疗产品原型专门解决和克服在多能人类干细胞治疗效用临床应用上的那些主要障碍或问题,包括在高效率,稳定性,低肿瘤风险,高纯度,疗效高,以及在用当前良好生产规范进行大规模制造的设施安全性和规模化生产高质量人类细胞治疗产品用于商业治疗上优于所有其他现有的途径。该医疗创新首次提供了以多能人类干细胞为基础的中枢神经系统和心脏的细胞疗法衍生物来满足人类干细胞治疗产品的商业和治疗性开发的指标。
本文所描述的方法,组合物,工具和产品是目前优选的代表实施方案,是示例性的并且不旨在作为对本发明范围的限制。其中的变化和其它用途将对本 领域技术人员发生涵盖在本发明的精神内并且由公开的范围确定。因此,对本领域技术人员这将是显而易见的对所公开的本发明可以作不同的替换和修改,而不脱离本发明的范围和精神。
方法
使用小分子诱导人类胚胎干细胞的心肌细胞系特异性分化。在所定义的培养条件下维持未分化的人类胚胎干细胞(10毫米),播种后第3天治疗4-5天,然后使其以在HESC介质浮动蜂窝集群(cardioblasts)中的悬浮液培养4-5天。允许附着到组织培养底物后,将cardioblasts进一步用NAM(10毫米),用于一个星期,并培养在分化培养基由DMEM/F-12(90%),所定义的FBS(Hyclone公司)(10%)和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-GLN(2毫米)。跳动的心肌细胞中观察到约一周停药NAM后,随着时间的增加在数字。用于电生理记录,跳动的心肌细胞群转移到华纳的RC-27室,灌注用上述培养基,并且当填充有3摩尔/L的KCl刺穿用微电极with10M阻力。记录微电极的前端被定位外面有源订约区域和记录吸管位置的静止图像的捕获用滨松冷却CCD照相机。场电位,类似于体表心电图在临床实践中通常观察到的单极,外记录,使用轴突Multiclamp 700A放大器在电流钳模式和pCLAMP软件9(Axon仪器)进行检测。
已采用的术语和表达被用作描述的术语而不是限制性的,并且使用这样的术语和表达不意图排除任何现在存在或以后开发的出示的相等的特征和描述或局部的特征和描述,不过人们认识到可以在本发明的范围内作各种修改。从而应当理解,虽然本发明已具体公开优选实施方案和自选特征,本领域技术人员可以对公开的详情作修改和/或变化,并且这样的修改和变化是在本发明的范围内。
本发明的主要优点在于:
(1)首次使多能人类干细胞通过小分子诱导直接从多能状态向人神经前体细胞和人神经细胞定向高效分化;
(2)首次使多能人类干细胞通过小分子诱导直接从多能状态向人心脏前体细胞和人心肌细胞定向高效分化;
(3)首次本提供了技术通过小分子定向分化诱导直接转化多能人类干细胞一致地成与临床相关上的特定谱系人体细胞;
(4)首次提供了以多能人类干细胞为基础的中枢神经系统和心脏的细胞疗法衍生物来满足人类干细胞治疗产品的商业和治疗性开发的指标;
(5)首次提供了人类干细胞疗法治疗产品原型专门解决和克服在多能人类干细胞治疗效用临床应用上的那些主要障碍或问题,包括在高效率,稳定性,低 肿瘤风险,高纯度,疗效高,以及在用当前良好生产规范进行大规模制造的设施安全性和规模化生产高质量人类细胞治疗产品用于商业治疗上优于所有其他现有的途径;
(6)首次提供了技术平台以允许从高质量临床级无异物的多能人类干细胞高效生产人神经元前体细胞和人神经元细胞类型和亚型来开发针对许多神经疾病的临床设置的神经元再生和更换疗法;
(7)首次提供了技术平台以允许从高质量临床级无异物的多能人类干细胞高效生产人心脏前体细胞和人心肌细胞来开发针对心脏疾病和衰竭的临床设置的心肌再生和更换疗法;
(8)首次提供了与中枢神经系统和心脏有关的人体干细胞或前体细胞或源祖细胞和功能性人神经元和心肌细胞可用于干细胞库,体外和体内的干细胞研究,移植,人类中枢神经系统和心脏组织和器官工程,基于细胞的为人类中枢神经系统和心脏疾病的再生医学或疗法,用当前良好生产规范进行大规模制造用于商业和治疗,细胞治疗法,药物筛选,药物研发和测试,毒性和安全性测试,组织工程和再生,以及其它商业和治疗目的;
(9)首次提供了一个技术平台提供当前唯一具有足以再生神经元和收缩心肌的药效力人体细胞产品来源可用于临床修复中枢神经系统和心脏的功能;
(10)首次提供了小分子定向分化诱导高效率地直接转换多能人类干细胞成适合于开发新的,安全的,并具有成本效益的干细胞疗法的高纯度的人神经元和心肌细胞的商业来源。
(11)本发明人意外的发现,定义培养基中的各组分含量,特别是层粘连蛋白(laminin)的含量对细胞分化具有显著的影响。经过大量的实验,本发明分别确定了诱导神经细胞和心脏细胞的定义培养基的最佳组成。
下面结合具体实施例,进一步详陈本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1
本实施例提供了一种方法通过小分子定向分化诱导用当前良好生产规范进行大规模制造(cGMP)的高质量临床级无异物的多能人类干细胞成为功能性人体神经或细胞可用于组织工程,药物研发,药物测试,和细胞疗法。
未分化的多能人类胚胎干细胞接种并维持在一个定义培养系统中,含有 DMEM/F-12或KO-DMEM(knockout-DMEM)(80%),敲除血清替代品(KO)(20%),L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-GLN(2mM),MEM非必需氨基酸(MNAA,1X),巯基乙醇(0.1mM),纯化的人层粘连蛋白(40微克/毫升)[在冷的DMEM/F-12中1:30稀释]或层粘连蛋白/胶原蛋白作为基质蛋白,和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子,20纳克/毫升[ng/ml])。敲除血清替代品(KO)可以用含有MEM必需氨基酸(MEAA,1X),人胰岛素(20微克/毫升)和抗坏血酸(50微克/毫升)的定义人类要素替换,其中加入人激活素-A(activin-A)(50纳克/毫升[ng/ml]),人白蛋白(10毫克/毫升)和人转铁蛋白(8微克/毫升)以增加细胞存活和维持正常的细胞集落形态和健康。所得的高质量临床级无异物的多能人类干细胞可以在定义的条件下维持>50代(>12个月),定期进行分析,证实表达未分化状态的标准标志物,核型稳定,可分化为三个胚层的细胞(图5)。
实施例2
本实施例提供了一种方法通过使用视黄酸(retinoic acid[RA])诱导直接从用当前良好生产规范进行大规模制造(cGMP)的高质量临床级无异物的维持在一个定义培养系统中的人类胚胎干细胞中定向高效分化出神经外胚层通过促进神经元特异性转录因子Nurr-1的核易位,及触发神经元谱系特定性的高效高纯度大规模的发展为人神经前体细胞和人神经元细胞(>90%)(图1,3,5)。
直接从人类胚胎干细胞的多能状态神经元谱系特异性分化。接种并维持未分化的高质量临床级无异物的多能人类胚胎干细胞在一个定义培养系统中3天后,加入RA(0.01mM)在定义培养条件下继续培养4-5天。然后转移这些神经外胚层分化的人类胚胎干细胞至无血清无bFGF的培养基悬浮培养4-5天,以允许人神经前体细胞形成。为进一步分化成神经元表型细胞,所述的人神经前体细胞然后允许附着到组织培养板/底物中含有DMEM/F-12,N-2补充剂(1%),肝素(8微克/毫升),VEGF(20纳克/毫升),NT-3(10纳克/毫升),和BDNF(10纳克/毫升)的一个定义培养基中连续培养约2周,以产生表达微管蛋白和MAP-2,广泛突起轴承的典型在腹脑的神经元细胞和色素细胞,神经元细胞数量随着培养时间增加(图1,3,5)。
按照上述方法进行神经细胞诱导分化,验证不同的定义培养基组分对细胞分化的影响。结果发现,定义培养基中包含如下组分时神经细胞分化较好:20-100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、0.01-0.03mg/ml胰岛素(insulin)、0.04-0.06mg/ml抗坏血酸(ascorbic acid)、20-100ng/ml激活素(activin-A)、和0.01–1mg/ml层粘连蛋白(laminin)。实验发现,包含20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、0.02mg/ml胰岛素(insulin)、0.05mg/ml抗坏血 酸(ascorbic acid)、20ng/ml激活素(activin-A)、和0.04mg/ml层粘连蛋白(laminin)的定义培养基中,神经细胞的分化效果最好,分化比率能够达到约99.5%。
另外,申请人发现,定义培养基中层粘连蛋白的含量对神经细胞的分化影响显著,在较低(<0.01mg/ml)和较高(>0.1mg/ml)的情况下,神经细胞的分化效果显著降低。定义培养基中,层粘连蛋白的含量在0.03-0.04mg/ml的情况下,神经细胞分化效率最高,能够达到98%以上。
实施例3
本实施例提供了一种方法通过使用烟酰胺(nicotinamide[NAM])诱导直接从用当前良好生产规范进行大规模制造(cGMP)的高质量临床级无异物的维持在一个定义培养系统中的人类胚胎干细胞中定向高效分化出心脏中胚层通过促进早期心肌特异性转录因子CSX/Nkx2.5的表达,及触发心脏谱系特定性的高效高纯度大规模的发展为人心脏前体细胞和跳动的人心肌细胞(>90%)(图2,4,6)。
使用小分子诱导多能人类胚胎干细胞的心肌细胞系特异性分化。接种并维持未分化的高质量临床级无异物的多能人类胚胎干细胞在一个定义培养系统中3天后,加入NAM(10mM)在定义培养条件下继续培养4-5天。然后转移这些心脏中胚层分化的人类胚胎干细胞至无血清无bFGF的培养基悬浮培养4-5天,以允许人心脏前体细胞形成。允许附着到组织培养板/底物后,将人心脏前体细胞进一步用NAM(10mM)诱导约一个星期,并培养在心肌分化培养基中含有DMEM/F-12(90%),定义的FBS(Hyclone公司)(10%)和L-丙氨酰-L-谷氨酰胺或L-GLN(2mM)。停用NAM约一周后可观察到跳动的心肌细胞,心肌细胞数量随着培养时间增加,可用于电生理记录检测(图2,4,6)。
按照上述方法进行心肌细胞诱导分化,验证不同的定义培养基组分对细胞分化的影响。结果发现,定义培养基中包含如下组分时心脏细胞分化较好:20-100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、0.01-0.03mg/ml胰岛素(insulin)、0.04-0.06mg/ml抗坏血酸(ascorbic acid)、20-100ng/ml激活素(activin-A)、和0.01–1mg/ml层粘连蛋白(laminin)。实验发现,包含20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、0.02mg/ml胰岛素(insulin)、0.05mg/ml抗坏血酸(ascorbic acid)、20ng/ml激活素(activin-A)、和0.05mg/ml层粘连蛋白(laminin)的定义培养基中,心肌细胞的分化效果最好,分化比率能够达到约99.2%。
另外,申请人发现,定义培养基中层粘连蛋白的含量对心肌细胞的分化影响 显著,在较低(<0.02mg/ml)和较高(>0.2mg/ml)的情况下,心肌细胞的分化效果显著降低。定义培养基中,层粘连蛋白的含量在0.05-0.06mg/ml的情况下,心肌细胞分化效率最高,能够达到98%以上。
结论
本发明提供了技术直接从多能人类干细胞用当前良好生产规范大规模高效高纯度生产高质量临床级无异物的特定谱系的人体细胞。本发明声称提供了一种方法通过通过促进神经或心肌分化用小分子定向分化诱导多能人类干细胞成为用当前良好生产规范进行大规模制造的高质量临床级无异物的人神经元或心肌谱系细胞。本发明一个明确要求的主题是提供了一种方法通过使用视黄酸诱导直接从用当前良好生产规范进行大规模制造的高质量临床级无异物的维持在一个定义培养系统中的人类胚胎干细胞中定向分化出神经外胚层并触发神经元谱系特定性的高效高纯度大规模的发展为人神经前体细胞和人神经元细胞。本发明另一个明确要求的主题是提供了一种方法通过使用烟酰胺诱导直接从用当前良好生产规范进行大规模制造的高质量临床级无异物的维持在一个定义培养系统中的人类胚胎干细胞中定向分化出心脏中胚层并触发心肌谱系特定性的高效高纯度大规模的发展为人心脏前体细胞和跳动的人心肌细胞。本发明为用于细胞治疗法和商业化提供了大规模生产或制造优质性临床级无异物的多能人类干细胞及其功能性人体细胞疗法衍生物的途径。具体来说,本发明的医疗创新提供了高纯度功能性人体神经细胞和心脏肌肉细胞的新颖的商业来源为中枢神经系统或心肌修复。本发明提供了技术,方法和产品通过小分子定向分化诱导为良好控制高效率直接转化多能人类干细胞成大量优质的人体干细胞或前体细胞或源祖细胞和临床上的特定谱系功能性人体细胞可用于组织和器官工程和再生,细胞治疗法,药物研发和测试,用当前良好生产规范进行大规模制造,干细胞库,和临床应用。
工业实用性
本发明提供了与人类中枢神经系统和心脏相关细胞用于移植,研究,药物开发,药物研发和测试,组织和器官工程,组织和器官再生,用当前良好生产规范进行大规模制造,细胞治疗法,干细胞库银,临床应用和其他用途。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
参考文献
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Claims (10)
1.从多能人类干细胞产生特定谱系的人体细胞的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(i)在定义培养基中培养多能人类干细胞;
(ii)在步骤(i)的培养物中加入诱导剂,继续培养至至少90%的(优选地为至少95%的,更优选地为至少98%的,如98.5%的、99%的、99.5%的)多能人类干细胞分化成一种特定谱系的人体细胞;
其中,所述定义培养基中不含血清,并且不含异种细胞。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述定义培养基包含一基础培养基,以及
20-100ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、0.01-0.03mg/ml胰岛素(insulin)、0.04-0.06mg/ml抗坏血酸(ascorbic acid)、20-100ng/ml激活素(activin-A)、和0.01–1mg/ml层粘连蛋白(laminin)。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述定义培养基中层粘连蛋白的含量为0.01-1mg/ml,优选地为0.02-0.2mg/ml,更优选地为0.03-0.1mg/ml,最优选地为0.04-0.06mg/ml。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述多能人类干细胞包括:实验用多能人类干细胞、临床级无异物的多能人类干细胞等。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述多能人类干细胞至少有70%表达选自下组的至少4种细胞标记物:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase),OCT-4,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81,乙酰化的组蛋白(acetylated histones),BRG-1,hSNF2H,和microRNA hsa-miR-302。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述多能人类干细胞具有选自下组的特性:
(1)能够在定义培养基中增殖一年以上;
(2)通过长期培养后仍保持稳定的染色体核型,其中染色体是整倍体;及
(3)在培养过程中始终保持分化为内胚层,中胚层和外胚层组织的潜力。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的特定谱系的人体细胞包括神经系统细胞和心脏系统细胞;
优选地,所述神经系统细胞表达选自下组的至少2种细胞标记物:Nurr-1、SSEA-1、微管蛋白(beta-III-tubulin)、MAP-2、神经元核抗原(NeuN)、microRNAhsa-miR-10,microRNA hsa-let-7、乙酰化的组蛋白(acetylated histones)、BRG-1、和hSNF2H;
优选地,所述的心脏系统细胞表达选自下组的至少2种细胞标记物:Nkx2.5、辅肌动蛋白(alpha-actinin)、SSEA-1、心肌肌球蛋白重链(MHC)、MEF2c、GATA-4、心肌肌钙蛋白-I(cTnI)、心肌钙蛋白-T(cTnT)、VE-钙粘蛋白(VE cadherin)、血管性血友病因子(von Willebrand factor)、SM22alpha、和H1-调宁蛋白(H1-calponin)。
8.一种制备组织工程构建物的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(ⅰ)根据权利要求1所述的方法,从多能人类干细胞产生特定谱系的人体细胞;及
(ii)制造组织工程构建物,将所述特定谱系的人体细胞或其功能性衍生物加入到一个结构模板,制备所述组织工程构建物。
9.一种药物筛选的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(i)根据权利要求1所述的方法,从多能人类干细胞产生特定谱系的人体细胞;和
(ii)筛查化合物或细胞产物对于该特定谱系的人体细胞及其功能性衍生物的效果。
10.一种药物筛选的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
(i)根据权利要求8所述的方法制备组织工程构建物;和
(ii)筛查化合物或细胞产物对于该组织工程构建的效果。
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PB01 | Publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20161123 |