CN111246863A - 用于增强健康的和病变的心肌细胞的成熟状态的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开的方法和组合物描述了制备用于诸如疾病建模、心脏毒性筛选、药物筛选和鉴定等其它用途的应用的成熟干细胞衍生的心肌细胞。所述方法涉及促进干细胞衍生的心肌细胞从胎儿表型向更成熟的表型转变的物理和生化线索，所述更成熟的表型更类似于成人心肌细胞的表型。

Description

用于增强健康的和病变的心肌细胞的成熟状态的组合物和 方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年8月16日提交的美国临时申请第62/546,438号的权益，该临时专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。
发明领域
本公开内容涉及心脏功能和疾病的体外模型。
心血管疾病仍然是全世界男性和女性死亡的主要原因，其中对发展中国家的影响迅速增长。遗传性心肌病是所有年龄组(包括儿童和年轻的在其它方面健康的成年人)中心脏病的主要原因。人多能干细胞衍生的心肌细胞(hPSC-CM)是研究心肌病的有希望的工具，因为它们极大地增加了对可表达于人心脏中存在的离子通道、蛋白质同种型以及遗传和代谢机构的完整阵列的人心肌细胞的可及性。
人多能干细胞(hPSC)定向分化成心肌细胞通常产生结构、功能和生化特性最类似于胎儿心脏中存在的细胞的细胞。然而，当与新分化的hPSC相比时，对开发具有成人心肌细胞表型的hPSC-CM存在未满足的需求，所述成人心肌细胞表型包括增强的肌节发育、增强的收缩功能、降低的搏动率、增强的线粒体容量和更成熟的转录组。当前心脏病建模工作的主要目标是深入了解心肌病的发作和进展，作为设计更有效的治疗策略的第一步。在本文所述的方法之前，成人发作的肌肉病症和心血管疾病，如杜氏肌营养不良，尚未通过hPSC-CM精确地建模。这突出显示了它们用于疾病建模和药物筛选应用中对改进的干细胞分化和成熟方法的需求。
发明概述
本文描述了工程化发育心脏生态位平台以产生成熟干细胞衍生的心肌细胞的方法。所述方法涉及促进干细胞衍生的心肌细胞从胎儿表型向更成熟的表型转变的物理和生化线索，所述更成熟的表型更类似于成人心肌细胞的表型。
本文所述的方法提供了从干细胞在体外分化的更成熟的心肌细胞，从而提供了用于评价药物的心脏毒性和筛选以鉴定调节心肌细胞或心脏功能的新药物以及其它用途的平台。产生干细胞(例如，来自正常和患病对象的诱导的多能干细胞(iPS细胞))的能力，以及在体外分化之前遗传修饰干细胞的能力提供了改善的疾病建模以及药物筛选和鉴定的平台。
因此，在一个方面，本文描述了制备干细胞衍生的心肌细胞的方法，所述方法包括使干细胞衍生的心肌细胞与以下接触：纳米图案化的基底；甲状腺激素T3；和Let7i微RNA。
在一个实施方案中，纳米图案化的基底包括具有基本上平行的槽和脊的阵列的纳米图案化的表面。
在一个实施方案中，每个槽或脊的尺寸在长度、宽度或高度上小于1000纳米。
在一个实施方案中，槽和脊为约800nm宽，并且槽为约600nm深。
在一个实施方案中，Let7i微RNA由干细胞衍生的心肌细胞表达。
在一个实施方案中，将心肌细胞与Let7i微RNA接触的步骤包括将干细胞衍生的心肌细胞与病毒载体接触。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞是人心肌细胞。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞由诱导的多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞分化。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞是遗传修饰的。
在一个实施方案中，在与编码Let7i微RNA的载体接触后，将心肌细胞与纳米图案化的基底和甲状腺激素T3接触。
在一个实施方案中，当与纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i微RNA接触之前的干细胞衍生的心肌细胞相比，所得的干细胞衍生的心肌细胞具有更成熟的心肌细胞表型。
在一个实施方案中，纳米图案化的基底包括允许电刺激和/或测量心肌细胞电生理学特性的微电极阵列。
在另一个方面，本文描述了使干细胞衍生的心肌细胞成熟的方法，所述方法包括使干细胞衍生的心肌细胞与纳米图案化的基底；甲状腺激素T3；和Let7i微RNA接触。
在一个实施方案中，纳米图案化的基底包括具有基本上平行的槽和脊的阵列的纳米图案化的表面。
在一个实施方案中，每个槽或脊的尺寸在长度、宽度或高度上小于1000纳米。
在一个实施方案中，槽和脊为约800nm宽，并且槽为约600nm深。
在一个实施方案中，Let7i微RNA由干细胞衍生的心肌细胞表达。
在一个实施方案中，将心肌细胞与Let7i微RNA接触的步骤包括将干细胞衍生的心肌细胞与病毒载体接触。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞是人心肌细胞。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞由诱导的多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞分化。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞是遗传修饰的。
在一个实施方案中，在与编码Let7i微RNA的载体接触后，将心肌细胞与纳米图案化的基底和甲状腺激素T3接触。
在一个实施方案中，当与纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i微RNA接触之前的干细胞衍生的心肌细胞相比，所得的干细胞衍生的心肌细胞具有更成熟的心肌细胞表型。
在一个实施方案中，纳米图案化的基底包括允许电刺激和/或测量心肌细胞电生理学特性的微电极阵列。
在另一个方面，本文描述了评价药剂的心脏毒性的方法，所述方法包括使通过本文所述的方法制备的干细胞衍生的心肌细胞与所述药剂接触。
在一个实施方案中，所述方法包括检测心肌细胞的至少一种表型特征。
在一个实施方案中，所述药剂选自小分子、抗体、肽、基因组编辑系统和核酸。
在一个实施方案中，药剂的心脏毒性通过药剂对以下一种或多种的影响来指示：细胞活力、细胞大小、肌节长度、组织内肌节的组织、干细胞衍生的心肌细胞群的生物电位或电特性、线粒体功能、基因表达、搏动速率、搏动强度和收缩性。
在另一个方面，本文描述了用于鉴定调节心肌细胞的功能特性的药剂的测定，所述测定包括使通过本文所述的方法制备的干细胞衍生的心肌细胞群与候选药剂接触；以及检测所述心肌细胞的至少一种功能特性，其中检测到所述心肌细胞的至少一种功能特性的变化将所述药剂鉴定为能够调节心肌细胞的功能特性的药剂。
在一个实施方案中，检测步骤包括检测以下特性中的至少一种：细胞活力、细胞大小、肌节长度、组织内肌节的组织、生物电位或电特性、线粒体功能、基因表达、搏动速率、搏动强度和收缩性。
在另一个方面，本文描述了疾病模型，其包含通过本文所述的方法制备的干细胞衍生的心肌细胞，其中所述干细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象，或者其中对所述干细胞衍生的心肌细胞或衍生所述心肌细胞的干细胞进行遗传修饰，使得所述心肌细胞表达疾病表型。
在一个实施方案中，所述肌肉疾病或病症具有心脏功能障碍的表型。
在一个实施方案中，所述肌肉疾病或病症的特征在于心脏病表型的成人发作。
在一个实施方案中，所述肌肉疾病或病症是杜氏肌营养不良。
在另一个方面，本文描述了包含在纳米图案化的基底上的干细胞衍生的心肌细胞的组合物，所述组合物还包含甲状腺激素T3和Let7i微RNA。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象。
在一个实施方案中，心肌细胞是人心肌细胞。
在一个实施方案中，对干细胞衍生的心肌细胞或衍生所述心肌细胞的干细胞进行遗传修饰，使得干细胞衍生的心肌细胞表现出心脏功能障碍表型。
在另一个方面，本文描述了组合物，其包含通过使体外分化的心肌细胞与纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i微RNA接触而制备的心肌细胞，其中与未与纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i微RNA接触的体外分化的心肌细胞相比，所述心肌细胞具有更成熟的表型。
在一个实施方案中，所述心肌细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象。
在另一个方面，本文描述了组合物，其包含对体外分化的心肌细胞或分化为所述心肌细胞的干细胞进行遗传修饰，使得它们表现出心脏功能障碍表型。
在另一个方面，本文描述了试剂盒，其包含干细胞衍生的心肌细胞、纳米图案化的基底、甲状腺激素T3、编码Let7i微RNA的载体及其包装材料。
在一个实施方案中，试剂盒包含细胞培养基和允许从干细胞衍生的心肌细胞制备成熟的体外分化的心肌细胞的说明书。
在一个实施方案中，纳米图案化的基底包括具有基本上平行的槽和脊的阵列的纳米图案化的表面。
在一个实施方案中，每个槽或脊的尺寸在长度、宽度或高度上小于1000纳米。
在一个实施方案中，槽和脊为约800nm宽，并且槽为约600nm深。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞是人的。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象。
在一个实施方案中，心肌细胞在纳米图案化的基底上。
在一个实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞是冷冻的。
在一个实施方案中，所述试剂盒允许在室温至4℃的温度下运输。
在另一个方面，本文描述了制备干细胞衍生的心肌细胞的方法，所述方法包括使干细胞衍生的心肌细胞与纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i微RNA接触，所述纳米图案化的基底包括基本上平行的槽和脊的阵列，其中所述槽和脊的宽度为800nm，并且所述槽的深度为600nm。
在另一个方面，本文描述了包含在纳米图案化的基底上的干细胞衍生的心肌细胞的组合物，所述组合物还包含纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i微RNA，所述纳米图案化的基底包括基本上平行的槽和脊的阵列，其中所述槽和脊的宽度为800nm，并且所述槽的深度为600nm。
在一个实施方案中，本文描述了方法，其中所述纳米图案化的基底包括弹性基底，其允许对其上培养的心肌细胞进行机械刺激，并且其中所述方法还包括使心肌细胞经受这种机械刺激。
在一个实施方案中，本文所述的组合物或本文所述的试剂盒，其中所述纳米图案化的基底包括弹性基底，其允许对其上培养的心肌细胞进行机械刺激。
附图简述
图1A-F显示ComboMat平台促进更成熟的转录谱。图1A显示ComboMat平台的示意性时间线。使用小分子和基于人重组蛋白的方案实现心肌细胞分化。在心肌细胞产生后，用Let7i慢病毒转染hPSC-CM，经由代谢激发(metabolic challenge)纯化，并选择用于病毒转染。然后将表达病毒载体的高纯度hPSC-CM涂铺在NP上并暴露于T3，保持3周。图1B显示三维主成分分析的可视化。hPSC-CM暴露于沿着PC2的T3簇。ComboMat组与成熟刺激的其它组合分开并与成熟刺激的其它组合不同。图1C显示由于不同处理而导致的差异表达基因的心脏成熟途径中的净富集。图1D显示与EV-平面对照相比，Let7i-NP-T3组合处理中上调基因的基因本体(GO)富集结果。颜色梯度和柱条长度代表富集的显著性。图1E-F显示PCA装载的气泡图，显示基因对RNAseq样品分离的贡献，比较了EV-平面与Let7i-NP-T3(图1E)以及胎儿与成人心肌细胞(图1F)。图1E和图1F中的气泡图突出显示了ComboMat处理的hPSC-CM和成人CM之间的特定基因的类似的上调/下调模式。
图2A-F显示hPSC-CM的结构成熟。图2A显示暴露于Combomat方案或每种单独的线索的hPSC-CM的免疫荧光图像。红色＝α-辅肌动蛋白，绿色＝F-肌动蛋白，蓝色＝DAPI。插图显示hPSC-CM内肌节结构的特写。图2B显示来自暴露于Combomat平台的标记线索的hPSC-CM的肌节的TEM图像。暴露于对照条件的hPSC-CM仅表现出Z体形成，而暴露于ComboMat平台的hPSC-CM具有更明确的Z盘结构。图2C-2F显示暴露于Combomat方案或每种单独的线索的hPSC-CM的形态变化的量化。图2C显示经由定制的2D傅立叶变换图像分析测量的肌节长度。图2D显示从TEM图像测量的Z带宽度的盒须图(box-and-whisker plot)，其中用红线标记平均Z带宽度。图2E显示双核细胞的条形图，其显示ComboMat组接近生理学双核形成百分比。图2F显示从免疫荧光图像测量的细胞面积，其显示对ComboMat平台的明显的肥厚反应。柱条代表平均值±S.E.M。*P<0.05。
图3A-G显示机电和代谢成熟。图3A显示经由定制CCQ方法测量的对照或ComboMathPSC-CM在整个视频帧上平均的收缩速度的代表性迹线。显示了峰值收缩速度和峰值松弛速度。图3B显示峰值收缩和松弛速度的量化。图3C显示对照或ComboMat hPSC-CM的收缩角分布直方图。直方图中心的线表示平均收缩角度，而线的长度表示分布与平均值对齐的程度。图3D显示在纵向和横向方向上收缩幅度的收缩各向异性比(AR)。图3E显示表示对照和Combomat hPSC-CM之间的FPD变化的代表性场电位记录。图3F显示FPD的量化，以及图3G显示对于暴露于Combmat平台或每种单独的线索的hPSC-CM，以每分钟搏动次数表示的搏动率。图3H显示使用棕榈酸酯进行脂肪酸应激测试的代表性OCR迹线。图3I显示棕榈酸酯添加后OCR的最大变化的量化。柱条代表平均值±S.E.M。*P<0.05。
图4A-E显示DMD突变的hPSC-CM与正常对照类似地响应于ComboMat平台。图4A显示与正常hPSC-CM相比，暴露于对照或ComboMat条件的DMD突变的hPSC-CM的海马代谢谱。图4B显示FCCP添加后OCR的最大变化的量化。当暴露于ComboMat平台时，正常和DMD突变的hPSC-CM都显示出最大呼吸能力的增加。图4C-D显示基于MEA的电生理学测量。图4C显示对于正常或DMD突变的hPSC-CM，以每分钟搏动次数表示的搏动率。图4D显示暴露于对照或ComboMat条件的正常或DMD突变的hPSC-CM的平均FPD。图4E显示暴露于对照(左)和ComboMat(右)条件的DMD突变的hPSC-CM的免疫荧光图像。插图显示在每种情况下肌节结构的放大部分。柱条代表平均值±S.E.M。*P<0.05。
图5A-F显示暴露了内源性DMD疾病表型。图5A显示暴露于对照或ComboMat条件的DMD突变的hPSC-CM的代表性场电位记录，其中注释了每隔一个的搏动间隔。图5B显示对暴露于对照或ComboMat条件的正常和DMD突变的hPSC-CM的连续30次搏动作图的搏动间隔(ΔBI)的变化。与正常的hPSC-CM相比，成熟的DMD突变的hPSC-CM表现出大得多的ΔBI的不稳定性。图5C显示暴露于对照或ComboMat条件的正常或DMD突变的hPSC-CM的ΔBI>250ms的平均搏动百分比。未成熟的正常hPSC-CM未显示出ΔBI>250ms的发生率。图5D显示整个30次搏动记录的平均ΔBI。未成熟的DMD突变的hPSC-CM在MEA上没有显示出明显的疾病表型，而使用ComboMat平台成熟的DMD突变的hPSC-CM与正常对应物显著不同。图5E显示暴露于对照或ComboMat条件的DMD突变的hPSC-CM的代表性Fura-2 Ca2+成像迹线。图5：细胞溶胶中舒张期Ca2+含量的量化。当使用ComboMat平台成熟时，DMD突变的hPSC-CM表现出显著较高的细胞溶质Ca2+含量。柱条代表平均值±S.E.M。*P<0.05。
图6A-F显示使用成熟hPSC-CM的DMD心肌病表型药物筛选。图6A显示用于减少响应于渗透应力的细胞死亡的通过Z得分排序的药物库。还显示了具体化合物的化学结构。图6B显示暴露于对照或ComboMat条件的正常和DMD突变的hPSC-CM的基线平均ΔBI的量化。图6C-D显示暴露于对照或ComboMat条件的正常和DMD突变的hPSC-CM在7天后响应于尼群地平和西地那非的剂量反应曲线。图6E显示在用尼群地平冲洗48小时后的平均ΔBI的测量。图6F显示成熟DMD突变的hPSC-CM的代表性Fura-2 Ca2+迹线。图6G显示在具有或没有尼群地平的情况下舒张期Ca2+含量的量化。尼群地平有助于降低成熟DMD突变的hPSC-CM中的细胞溶质Ca2+负荷。柱条代表平均值±S.E.M。*P<0.05。
图7A-C显示肌养蛋白突变体分析。图7A显示用于正常(SEQ ID NO:18)和DMD突变的(SEQ ID NO:19)hPSC-CM中DMD基因测序的引物设计的示意图，其显示了碱基对263处的G缺失。图7B显示在DMD突变的hPSC-CM中，在CRISPR工程化的bp263处缺失的DMD基因的色谱图。图7C显示正常(上)和DMD突变的(下)hiPSC-CM中预测的蛋白质序列表明作为由于外显子1中移码缺失导致的早期终止(STOP)密码子。
图8A-F显示膜片钳电生理学。图8A显示hPSC-CM的电流钳电生理学测量。暴露于ComboMat条件的hPSC-CM具有显著更快的上升速度(upstroke velocity)，但所有其它参数(图8B-F)在对照和ComboMat hPSC-CM之间没有统计学差异。柱条代表平均值±S.E.M。*P<0.05。上行斜率＝动作电位的上升速度，RMP＝静息膜电位，APD90＝90％复极化的动作电位持续时间，衰减Tau＝松弛的时间常数，振幅＝动作电位幅度，MDP＝最大舒张电位。
图9A-E显示hPSC-CM的代谢概况。图9A显示在MitoStree测定过程中响应于ATP合成酶抑制剂寡霉素、电子传输和氧化磷酸化(FCCP)的解偶联剂以及电子传输链阻断剂鱼藤酮和抗霉素的代表性OCR曲线。图9B显示基础和最大呼吸能力的量化。图9C显示使用棕榈酸酯的脂肪酸应激测试的代表性OCR迹线。图9D-E显示正常hPSC-CM响应于棕榈酸酯的OCR变化的量化。图9E显示使用ComboMat hPSC-CM进行脂肪酸激发的和BSA对照的代表性OCR曲线。细胞对BSA载体没有响应。柱条代表平均值±S.E.M。*P<0.05。
图10A-F显示疾病状态分层所必需的完整ComboMat。心律失常指标如Gilchrist等人所概述的25。当单独使用成熟线索时，正常和DMD突变的hPSC-CM之间没有统计学差异，但当组合入ComboMat方案时，在健康的正常和患病的DMD突变的hPSC-CM之间存在区别。柱条代表平均值±S.E.M。*P<0.05。
图11A-F显示在hPSC-CM中长期T3暴露的影响。图11A-B显示如经由免疫组织化学所测量的，在处理后第7天、第14天和第21天测量的T3对hPSC-CM的肌节长度和细胞面积的影响。将NP与单独的T3组合对肌节结构和肥大具有长期的负面影响。图11C-D显示在处理后第7天、第14天和第21天测量的hPSC-CM的收缩(图11C)和松弛速度(图11D)的CCQ测量。再次将NP与单独的T3组合阻碍收缩性能。图11E-F显示在处理后第7天、第14天和第21天暴露于对照或T3条件并经由MEA测量的hPSC-CM的电生理学性能。图11E显示在T3处理的细胞中在D14达到峰值的搏动周期。图11F显示暴露于单独的T3的hPSC-CM中的搏动速率变异性显著增加。柱条代表平均值±S.E.M。*P<0.05。
图12A-E显示经由代谢激发的心肌细胞纯化。图12A-B显示在低心脏纯度起始群体的乳酸盐富集之前(图12A)和之后(图12B)cTnT+细胞的流式细胞术结果。图12C显示IgG同种型对照流式细胞仪结果显示cTnT抗体没有非特异性结合。图12D-E显示在高心脏纯度起始群体的乳酸盐富集之前(图12D)和之后(图12E)cTnT+细胞的流式细胞术结果。
图13A-G显示hPSC-CM的纳米形貌尺寸依赖性结构发展。图13A显示具有各种尺寸的NP表面的扫描电子显微照片(上排)，在各种尺寸的NP表面上的hPSC-CM的亮场图像(中间排)和在各种尺寸的NP上培养的hPSC-CM的共焦免疫荧光图像(下排)。图13B显示在标记的形貌尺寸上培养的hPSC-CM的细胞面积和细胞各向异性比率。图13C显示在不同的形貌尺寸上的hPSC-CM的细胞单层密度相对于初始接种密度。图13D显示在各种形貌上hPSC-CM的hPSC-CM的相对细胞骨架纤维排列。图13E-F显示在平面和800nm NP之间hPSC-CM的Fluo-4钙成像和到达峰值时间(time-to-peak)Ca2+测量。图13G显示与平面相比，在800nm NP上的hPSC-CM的心脏成熟标志物的RT-PCR表达水平。柱条代表平均值±S.E.M。*P<0.05。
详述
本文所述的组合物和方法部分地与发现更成熟的干细胞衍生的心肌细胞可通过包括使细胞与纳米图案化的基底、甲状腺激素(T3)和Let7i微RNA接触的方法产生。具有结构和功能表型的干细胞衍生的心肌细胞比标准方法更具有成人心肌细胞的特征。本文还描述了建立工程化发育心脏生态位平台以产生hPSC衍生的心肌细胞(hPSC-CM)的方法和组合物，与标准方法相比，所述心肌细胞具有增强的肌节发育、电生理学、收缩功能、线粒体容量和更成熟的转录组。
平台的能力在本文中通过应用于具有工程化的肌养蛋白基因突变的细胞来证明。当这种发育心脏生态位应用于肌养蛋白突变体hPSC-CM时，出现了稳健的疾病表型，这在先前未与纳米图案化的基底、甲状腺激素(T3)或Let7i微RNA接触的未成熟的患病的hPSC-CM中未观察到。如经由搏动率变异性所测量的，成熟的肌养蛋白突变体hPSC-CM表现出更大的心律失常倾向，并且进一步的实验表明该作用最可能是由于较高的静息细胞溶质钙含量。在本文使用定制的纳米图案化的微电极阵列平台来筛选发育心脏生态位平台内的hPSC-CM功能证明了其它能力，其中显示例如钙通道阻断剂-尼群地平减轻了致心律失常性行为，以及测定将西地那非正确地鉴定为假阳性。
总之，本文所述的方法提供了发育心脏生态位平台，其允许稳健的hPSC-CM成熟等，从而允许更精确的疾病建模、心脏毒性评价和预测药物筛选。
定义
为了方便起见，这里收集了本文在说明书、实施例和所附权利要求中使用的某些术语。除非另有说明或者从上下文中暗示，以下术语和短语包括以下提供的含义。除非另有明确说明或者从上下文中显而易见，以下术语和短语不排除该术语或短语在其所属领域中已经获得的含义。提供这些定义以帮助描述特定的实施方案，并且不旨在限制所要求保护的发明，这是因为本发明的范围仅由权利要求限定。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，术语“接触”，当提及细胞使用时，涵盖将试剂、表面、激素等以允许细胞与药剂、表面、激素等物理接触的方式引入细胞以及引入允许试剂(例如miRNA、多肽或其它表达产物)在细胞中表达的元件，如遗传构建体或载体。应理解，经遗传修饰以表达药剂的细胞与药剂“接触”，正如表达药剂的细胞后代一样。
如本文所用，“干细胞衍生的心肌细胞”是从培养中的干细胞，即体外分化的心肌细胞。因此，虽然体内的心肌细胞最终来源于干细胞，即在组织或有机体的发育过程中，但本文所述的干细胞衍生的心肌细胞已经通过从干细胞体外分化而产生。如本文所用，从干细胞，例如诱导的多能干(iPS)细胞或胚胎干细胞(“ES细胞”或“ESC”)体外分化的细胞是“干细胞衍生的心肌细胞”，如果它至少具有自发搏动或收缩以及心肌肌钙蛋白T(cTnT)的表达的话。用于将在体外的干细胞分化为心肌细胞的方法是本领域已知的并且在本文别处描述。
本文所用的术语“干细胞”或“未分化细胞”是指处于未分化或部分分化状态的细胞，其具有自我更新的特性并具有分化成多种细胞类型的发育潜能，而没有关于发育潜能的具体隐含意义(即，全能、多能、专能等)。干细胞能够增殖并产生更多这样的干细胞，同时保持其发育潜能。理论上，自我更新可以通过两种主要机制中的任一种发生。干细胞能够不对称地分裂，这被称为强制性不对称分化，其中一个子细胞保留亲代干细胞的发育潜能，并且其它子细胞表达一些不同于亲代细胞的其它特定功能、表型和/或发育潜能。子细胞本身可被诱导增殖并产生后代，其随后分化成一种或多种成熟细胞类型，同时也潜在地保留具有亲代发育潜能的一种或多种细胞。分化的细胞可以来源于专能细胞，其本身来源于专能细胞等。虽然这些专能细胞中的每一种都可以被认为是干细胞，但每种这样的干细胞可以产生的细胞类型的范围，即它们的发育潜能可以差异很大。可选地，群体中的一些干细胞可以对称地分裂成两个干细胞(被称为随机分化)，从而将群体中的一些干细胞维持作为一个整体，而群体中的其它细胞仅产生分化的后代。因此，术语“干细胞”是指以下的任何细胞亚群，其在特定情况下具有分化成更专门化的或分化的表型的发育潜能并且在某些情况下保留增殖而基本上不分化的能力。在一些实施方案中，术语干细胞通常是指天然存在的亲代细胞，其后代(子代细胞)通常通过分化(例如通过获得完全独立的特征)而朝着不同的方向专门化，如在胚胎细胞和组织的逐步多样化中发生的那样。一些分化的细胞也具有产生具有更大发育潜能的细胞的能力。这样的能力可以是天然的或者可以在用各种因子处理时人工诱导的。从干细胞开始的细胞可以向分化的表型进行，但然后可以被诱导以“逆转”和重新表达干细胞表型，这是本领域普通技术人员通常称为“去分化”或“重编程”或“逆分化”的术语，并且如本文所用。
示例性干细胞包括胚胎干细胞、成年干细胞、多能干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉干细胞、肌肉前体干细胞、内皮祖细胞、骨髓干细胞、软骨形成干细胞、淋巴干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、中枢神经系统干细胞、外周神经系统干细胞等。干细胞的描述(包括分离和培养它们的方法)可以见于Embryonic Stem Cells,Methods and Protocols,Turksen,ed.,Humana Press,2002；Weisman等人,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.17:387 403；Pittinger等人,Science,284:143 47,1999；Animal Cell Culture,Masters,ed.,OxfordUniversity Press,2000；Jackson等人,PNAS 96(25):14482 86,1999；Zuk等人,TissueEngineering,7:211 228,2001(“Zuk等人”)；Atala等人,particularly Chapters 33 41；和美国专利第5,559,022号、第5,672,346号和第5,827,735号等处。
在细胞个体发育的上下文中，术语“分化(differentiate)”或“分化(differentiating)”是相对术语，其指示“分化细胞”是比其前体细胞沿发育途径进一步发展的细胞。因此，在一些实施方案中，如本文所定义的术语干细胞可分化成谱系受限的前体细胞(如人心脏祖细胞或中期原条心原性中胚层祖细胞)，其继而可进一步沿途径分化成其它类型的前体细胞(如组织特异性前体，如心肌细胞前体)，然后分化成末期分化细胞，其在某些组织类型中起特征性作用，并且可以保留或可以不保留进一步增殖的能力。干细胞体外分化为心肌细胞的方法是本领域已知的和/或在下文中描述。细胞的分化状态通常由特征性基因或标志物表达模式、代谢活性和形态中的一种或多种来确定。
本文所用的术语“多能的”是指在不同条件下具有分化为所有三个胚细胞层(内胚层、中胚层和外胚层)所特有的细胞类型的能力的细胞。多能细胞的特征主要在于使用例如裸鼠和畸胎瘤形成测定，多能细胞能够分化为所有三个胚层。多能性还通过胚胎干(ES)细胞标志物的表达来证明，尽管多能性的优选测试是证明能够分化为三个胚层中的每一个的细胞。
通过本领域已知的方法制备的干细胞衍生的心肌细胞通常具有比来自成体组织的心肌细胞更类似于胎儿心肌细胞的表型。通过在纳米图案化的基底上培养并用如本文所述的甲状腺激素T3和Let7i微RNA处理，可以将干细胞衍生的心肌细胞诱导为更成熟的表型，即，与在非图案化的基底上培养且不用甲状腺激素T3或Let7i微RNA处理的相同细胞相比，所述表型更类似于出生后组织或成体组织中的心肌细胞。还预期从胎儿或甚至成体组织中培养原代心肌细胞可受益于本文所述的条件，表现出比其它条件更成熟的表型或维持心肌细胞表型更长时间。在培养的心肌细胞的上下文中，“更成熟的表型”意指相对于在非图案化的表面上培养，且没有如本文所述的甲状腺激素T3和Let7i处理的相同心肌细胞相比，在纳米图案化的基底上培养以及用如本文所述的甲状腺激素T3和Let7i处理的干细胞衍生的心肌细胞中，
肌节长度、Z带宽度、收缩速度、场电位持续时间、上升速度、心肌细胞直径、心肌细胞长度和线粒体容量中的一种或多种中的一种或多种表型特征增加(如本文所定义)。在一些实施方案中，相对于在非图案化的表面上培养，且没有如本文所述的甲状腺激素T3和Let7i处理的相同心肌细胞相比，在纳米图案化的基底上培养以及用如本文所述的甲状腺激素T3和Let7i处理的干细胞衍生的心肌细胞中，肌节长度、Z带宽度、收缩速度、场电位持续时间、上升速度、心肌细胞直径、心肌细胞长度和线粒体容量中的每一种增加。在一些实施方案中，相对于在没有甲状腺激素T3或Let7i miRNA的情况下在纳米图案化的基底上培养的干细胞衍生的心肌细胞或者可选地，相对于在具有甲状腺激素T3和Let7i miRNA中任一种而非两者均有的情况下，在纳米图案化的表面上培养的干细胞衍生的心肌细胞，发生肌节长度、Z带宽度、收缩速度、场电位持续时间、上升速度、心肌细胞直径、心肌细胞长度和线粒体容量中的一种或多种的增加。
“更成熟表型”的证据还可以包括相对于在没有Let7i miRNA或甲状腺激素T3的情况下，一个或多个基因在平坦表面上培养的干细胞衍生的心肌细胞中的表达，所述基因的表达上调或增加例如至少1.5倍，或者相对于在具有甲状腺激素T3和Let7i miRNA中任一种而非两者均有的情况下，一个或多个基因在纳米图案化的表面上培养的干细胞衍生的心肌细胞中的表达，所述基因的表达上调或增加至少10％，所述基因包括毛发生长相关基因HR(赖氨酸脱甲基酶和核受体辅阻抑物)、Krupel样因子KLF9、细胞色素c氧化酶亚基6A2(COX6A2)、肌球蛋白轻链2(MYL2)和MYOM3。
当来源于患有成人发作的肌肉疾病的对象时，或当来源于经修饰以提供用于具有成人发作表型的肌肉疾病的疾病模型的干细胞时，本文所述的“成熟干细胞衍生的心肌细胞”或“具有成人表型的心肌细胞”可以呈现成人发作的肌肉疾病的疾病表型。例如，当在本文所述的促进成熟的条件下培养时(即，纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7imiRNA)，来源于患有杜氏肌营养不良的对象或来源于经修饰以突变肌养蛋白基因的干细胞的干细胞衍生的心肌细胞，可以表达通过搏动率变异性而明显的心律失常，这在没有甲状腺激素T3或Let7i miRNA的情况下，在平坦表面上培养相同的细胞时，不能观察到。
本文所用的术语“重编程”是指改变或逆转分化细胞(例如体细胞)的分化状态的过程。换言之，重编程是指将细胞的分化驱动回更未分化或更原始类型的细胞的过程。待重编程的细胞可以在重编程之前是部分分化的或终末分化的。在一些实施方案中，重编程涵盖分化细胞(例如体细胞)的分化状态完全逆转为多能状态。在一些实施方案中，重编程还涵盖分化细胞(例如体细胞)的分化状态部分逆转为多能状态。在一些实施方案中，重编程涵盖分化细胞(例如体细胞)的分化状态完全或部分逆转为未分化细胞。重编程还涵盖将体细胞的分化状态部分逆转为当进行另外的操作时使细胞更易于完全重编程为多能状态的状态。
重编程涉及受精卵发育成熟的细胞分化过程期间发生的核酸修饰(例如甲基化)、染色质浓缩、表观遗传变化、基因组印迹等至少一些可遗传模式的改变，例如逆转。
如本文所用，术语“hPSC细胞”和“人多能干细胞”可互换使用，并且是指人工衍生自分化的体细胞的多能细胞。hPSC细胞能够自我更新并分化成细胞命运定型的干细胞，包括心脏谱系的细胞以及各种类型的成熟细胞。
提及干细胞使用的术语“来源于”意指通过将分化细胞重编程为干细胞表型来产生干细胞。提及分化细胞使用的术语“来源于”意指该细胞是干细胞的分化(例如，体外分化)的结果。
本文所用的术语“基底”在广义上是指包含可在其上培养细胞的生物相容性基质、支架等的组合物。能够在单层或三维培养物(贴壁的，与悬浮培养物相对)中生长的细胞通常附着于基底上。本文所述的纳米图案化的基底提供了促进心肌细胞呈现类似于体内心肌细胞的形态和功能特性的结构线索。在某些实施方案中，基底包括合成或半合成材料。在某些实施方案中，基底包括框架或支持物，如聚合物支架。
本文所用的术语“纳米图案化的基底”是指具有宽度和高度小于1000纳米的脊和槽的平行阵列的图案化表面。深度或宽度小于约50-100纳米的图案结构比具有更大纳米级尺寸的图案结构更不可能促进更成熟的心肌细胞表型。因此，槽的深度/高度可以是100纳米或更大、或150纳米或更大、或200纳米或更大、或250纳米或更大、或300纳米或更大、或350纳米或更大、或400纳米或更大、或450纳米或更大、500纳米或更大、或550纳米或更大、或600纳米或更大、或650纳米或更大、或700纳米或更大、或750纳米或更大、或800纳米或更大、或850纳米或更大、或900纳米或更大、或950纳米或更大，但不超过1000纳米。纳米图案化的基底上的纳米图案的槽之间的槽或脊的宽度可以为100纳米或更大、或150纳米或更大、或200纳米或更大、或250纳米或更大、或300纳米或更大、或350纳米或更大、或400纳米或更大、或450纳米或更大、或500纳米或更大、或550纳米或更大。或600纳米或更大、或650纳米或更大、或700纳米或更大、或750纳米或更大、或800纳米或更大、或850纳米或更大、或900纳米或更大、或950纳米或更大，但不超过1000纳米。在一个实施方案中，槽的深度、槽的宽度和槽之间的脊的宽度都是相同的尺寸，例如，100纳米或更大、150纳米或更大、200纳米或更大、250纳米或更大、300纳米或更大、350纳米或更大、400纳米或更大、450纳米或更大、500纳米或更大、550纳米或更大、600纳米或更大、650纳米或更大、700纳米或更大、750纳米或更大、800纳米或更大、850纳米或更大、900纳米或更大、950纳米或更大，但不超过1000纳米。在另一个实施方案中，槽的深度、槽的宽度和槽之间的脊的宽度包括例如100的深度，槽宽度为100纳米、150纳米、200纳米、250纳米、300纳米、350纳米、400纳米、450纳米、500纳米、550纳米、600纳米、650纳米、700纳米、750纳米、800纳米、850纳米、900纳米或950纳米，并且脊的宽度为100纳米、150纳米、200纳米、250纳米、300纳米、350纳米、400纳米、450纳米、500纳米、550纳米、600纳米、650纳米、700纳米、750纳米、800纳米、850纳米、900纳米或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为200纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为300纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为400纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为500纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为600纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为700纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为800纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为900纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。这里提供的作为实例的尺寸甚至是50或100nm的倍数，但预期，甚至不是50或100nm的倍数的其它尺寸也可以为在具有这样的纳米图案的基质上培养的干细胞衍生的心肌细胞的表型提供益处。
应理解，纳米图案尺寸的相关差异是导致本文所述培养的心肌细胞表型差异的那些。
纳米图案化的基底可以包括聚合物、水凝胶、聚二甲基硅氧烷、塑料、玻璃、树脂、基质或本领域已知的任何其它材料，所述材料允许制造纳米图案，并允许自然地或在表面处理或涂覆之后附着干细胞衍生的心肌细胞。如果需要促进心肌细胞相互作用，可以用细胞外基质蛋白如纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白或本领域已知的其它细胞外基质材料包被纳米图案化的基底。
本文所用的术语“药剂”是指任何化合物或物质，包括但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。“药剂”可以是任何化学实体或部分，包括但不限于合成的和天然存在的蛋白质实体和非蛋白质实体。在一些实施方案中，药剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适配子、核苷酸的寡聚物、氨基酸、或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白及其修饰和组合。在某些实施方案中，药剂是包含化学部分或由化学部分组成的小分子，所述化学部分包括未取代或取代的烷基、芳族或杂环基部分，包括大环内酯、来普霉素(leptomycin)和相关的天然产物或其类似物。可以已知药剂具有期望的活性和/或特性，或者可以选自多种化合物的库。
如本文所用，术语“小分子”是指化学药剂，其可以包括具有小于约5,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物(包括杂有机化合物和有机金属化合物)、具有小于约1,000克/摩尔的分子量的有机或无机化合物、具有小于约500克/摩尔的分子量的有机或无机化合物和此类化合物的盐、酯及其它药学上可接受的形式。
术语“心脏毒性”是指这样的药物或药剂的特性，其抑制心肌细胞活力、结构或功能(包括但不限于其收缩、生物电位或电生理学特性或节律)或适当心脏功能所必需的基因表达中的一种或多种。
如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，并且包括未修饰的RNA、未修饰的DNA、修饰的RNA和修饰的DNA。多核苷酸包括但不限于单链和双链DNA和RNA多核苷酸。本文所用的术语多核苷酸包括多核苷酸的化学、酶促或代谢修饰形式，以及在病毒和细胞(包括例如简单(原核)和复杂(真核)细胞)中发现的或特有的DNA和RNA的天然存在的化学形式。本文所述的核酸多核苷酸或寡核苷酸保留与其同源互补链杂交的能力。
因此，如本文所用，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”也涵盖引物和探针以及寡核苷酸片段，并且对多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)和嘌呤或嘧啶碱基或者修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包括但不限于无碱基位点)的N-糖苷的任何其它类型的多核苷酸是通用的。在术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之间没有预期的长度区别，并且这些术语可互换使用。这些术语仅指分子的一级结构。寡核苷酸不一定是物理上衍生自任何现有的或天然的序列，但可以以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、DNA扩增、体外转录、逆转录或以上的任何组合。
如本文所述，“遗传修饰的细胞”是这样的细胞，其携带异源遗传物质或构建体，或者包含例如已通过突变(包括但不限于定点突变)操纵的基因组。异源遗传物质的引入通常导致基因或蛋白质表达相对于未修饰细胞的变化。RNA的引入可以瞬时促进外源或异源产物的表达，如同可以在细胞内引入不整合或复制的载体一样。通过连续的细胞分裂，引入整合到细胞基因组中或随着细胞核酸一起复制的构建体将更稳定。在一个实施方案中，遗传修饰是除了将体细胞重编程为干细胞表型(如iPS细胞表型)的一种或多种构建体引入之外的或者与之分开的。在另一个实施方案中，遗传修饰是除了引入Let7i miRNA或编码其的构建体之外的或者与之分开的。遗传修饰可以包括但不限于经由病毒载体引入遗传物质，或使用CRISPR/Cas或类似系统进行位点特异性重组的修饰。
本文所用的术语“功能测定”是指这样的测试，其通过测量细胞活性来评估细胞特性，如细胞的基因表达、代谢、发育状态或成熟等。功能测定包括例如测量细胞活力(例如通过染料排除、营养素摄取和/或转化、代谢物产生等)、测量电位或其它电生理学特性、测量收缩强度、收缩率或收缩节律，测量线粒体功能等。
本文所用的术语“疾病模型”是指能够再现人类疾病的一个或多个方面的动物或细胞培养系统。由于疾病相关基因的一个或多个突变或表达一种或多种疾病相关产物的异源构建体的引入，疾病的动物模型，例如小鼠或大鼠模型，通常将相当接近地类似于人类疾病。人类疾病的细胞培养模型可包括来自患有该疾病的人类对象的细胞，或经修饰以表达或干扰一种或多种疾病相关基因的表达的人类或其它细胞。仅作为一个实例，当分化为心肌细胞并如本文所述进行治疗以促进成熟时，来源于患有杜氏肌营养不良的人或其中肌养蛋白基因已失活的细胞的hPSC可以提供以显著的心律失常为特征的DMD心肌病的细胞培养模型。
本文所用的“标志物”是指有助于给定细胞的表型或与给定细胞的表型相关的一个或多个特征。标志物可用于选择包含感兴趣特征的细胞。标志物将随特定细胞而变化，并且可以是这样的特征(无论是形态、功能或生学的)，其为细胞或组织类型所特有的，或者疾病状态或表型所特有的，并且包括细胞或组织表达或展示的细胞外和细胞内分子，例如蛋白质、RNA、糖基化模式等。在一些实施方案中，这样的标志物是蛋白质，包括但不限于具有抗体表位或本领域可用的其它结合分子的蛋白质。其它标志物可包括肽、脂质、多糖、核酸和类固醇等。形态特征或特点的实例包括但不限于形状、大小和细胞核与细胞质的比率。功能特征或特点的实例包括但不限于粘附到特定基底的能力、掺入或排除特定染料的能力、在特定条件下迁移的能力、沿着特定谱系分化的能力、收缩、搏动等。可以通过本领域技术人员可用的任何适当方法检测标志物。
如本文所用，术语“电生理学”或“生物电位”是指细胞的电特性。具体而言，这些术语描述了离子电流流过细胞的离子通道行为以及例如由细胞-细胞接触所传输的电信号的特性。生物电位或电生理学特性可以通过多种技术测量，包括但不限于全细胞膜片钳电生理学记录(自动或手动的)、微电极阵列、钙成像、光学映像或xCelligenceTM实时细胞分析(Acea Biosciences,Inc.,San Diego,CA)。“机电刺激”是由与细胞或细胞群接触的底物产生的任何电位变化，和/或进一步对细胞产生机械运动或刺激。电和机械刺激可以由仪表化基底在同一时间(同相)或在不同时间(异相)产生。机械刺激的非限制性实例包括拉伸、刚性变化、相变剂、压力、振动或本领域已知的任何其它类型的机械刺激。
如本文所用，当提及基底使用时，术语“仪表化的”是指适于或设计成执行特定功能(如测量、测试、控制或刺激)的基底或装置。仪表化基底的一个实例是纳米图案化的微电极阵列。
“微电极阵列”、“多电极阵列”或“MEA”是具有微米尺寸或纳米尺寸的线电极阵列的装置，所述电极测量与电极阵列接触的细胞的生物电位和/或可向与阵列接触的细胞提供电刺激。MEA的电极通常由氧化铟锡、钛或金组成，但也可由其它类型的导电材料或包含导电和非导电材料的组合物组成。MEA用于体外研究以确定或操纵例如组织或工程组织(例如与纳米图案化的基底接触的干细胞衍生的心肌细胞)的场电位。
本文所用的术语“降低(decrease)”、“减少的(reduced)”、“减少(reduction)”、“降低(decrease)”或“抑制”通常是指统计学上显著的量的降低。然而，为了避免疑义，“减少的(reduced)”、“减少(reduction)”、或“降低(decrease)”或“抑制”意指与参考水平相比降低至少10％，例如降低至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或多达并包括100％的降低(例如，与参考样品相比不存在水平)，或与参考水平相比10-100％的任何降低。
本文所用的术语“增加的”、“增加”或“增强”或“活化”通常是指统计学上显著的量的增加。然而，为了避免疑义，术语“增加的”、“增加”或“增强”或“活化”意指与参考水平相比增加至少10％，例如与参考水平相比，增加至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或多达并包括100％增加或10-100％的任何增加，或相对于参考水平，至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍增加或更多。
如本文所用，术语“调节”是指包括增加或减少如本文所定义的那些术语的给定参数的效果。
如本文所用，术语“功能特性”，当应用于心肌细胞或心肌细胞培养物时，是指本文所述的作为心肌细胞功能或成熟心肌细胞功能的量度的任何参数。“功能特性的变化”通过功能特性的统计学上显著的增加或降低来指示。
如本文所用，“肌肉疾病或病症”是作为疾病或病症的主要作用或由于疾病或病症对影响肌肉功能的其它系统的作用而不利地影响正常肌肉功能的疾病或病症。心脏疾病或病症必然影响心肌的适当功能，并且包括但不限于心律失常、心肌病(例如肥厚和扩张)、长QT综合征、致心律失常性右心室发育不良(ARVD)、儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速(catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia,CPVT)或Barth综合征。杜氏肌营养不良影响晚期心肌功能。
术语“统计学上显著的”或“显著地”是指统计显著性，并且通常意指相对于参考的两个标准差(2SD)的变化。该术语是指存在差异的统计证据。它被定义为当无效假设实际为真时做出拒绝无效假设的决定的概率。
本文所用的术语“收缩性”是指肌肉细胞(包括心肌细胞)的行为，由此它们单独或更经常地成组地收缩。收缩性可以根据收缩率或松弛率以及例如收缩力来测量。通过力传递的生物物理和生物力学特性测量多个细胞的收缩性。使用单层或多层所述心肌细胞的相差显微镜和计算分析来测量收缩性，所述计算分析使用力传感器用直接力测量来校准。
术语“组织”是指一组或一层类似的特化细胞，它们一起执行某些特定功能。术语“组织特异的”是指来自特定组织的细胞的来源或定义特征。
如本文所用，短语“心血管病况、疾病或病症”旨在包括以不充分的、不期望的或异常的心肌功能为特征的所有病症，例如心律不齐、缺血性心脏病、高血压性心脏病和肺性高血压性心脏病、先天性心脏病和导致对象，特别是人类对象的心脏肌肉系统衰竭的任何病况。心肌功能不足或异常可能是疾病、损伤和/或衰老的结果。
本文中使用的冠词“一个/一种(a)”和“一个/一种(an)”是指一个或多于一个(例如，至少一个)该冠词的语法对象。例如，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
除了在操作实例中，或者在另外指出的情况下，本文使用的表示尺寸、成分的量或反应条件的所有数字应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。当与百分比结合使用时，术语“约”可以意指±1％。当与纳米图案尺寸结合使用时，术语“约”是指给定图案可实现的分辨率内的变化。例如，如果图案生成可实现的分辨率在±50nm内，则600纳米的尺寸应理解为涵盖550纳米至650纳米。本领域的普通技术人员将理解，产生纳米图案的不同方法将具有不同的分辨率，并且将理解给定方法的分辨率是多少。
如本文所用，术语“包含”意指除了所呈现的定义的要素之外，还可存在其它要素。“包含(comprising)”的使用表示包括而不是限制。换句话说，术语“包含”意指“主要包括但并非仅包括”。此外，词语“包含(comprising)”的变型，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”，相应地具有相同的含义。在一个方面，本文所述的与本文相关的技术将组合物、方法及其相应组分描述为对于本发明是必不可少的，但对包含必不可少的或并非必不可少的未指定要素是开放的(“包含”)。
术语“基本上由……组成”意指“主要包括但不一定仅包括至少一个”，因此，旨在意指“选择一个或多个，并且以任何组合”。换句话说，其它要素可以包括在组合物、方法或其相应组分的描述中，条件是其它要素限于不会实质上影响本发明的基本和新颖特征的那些要素(“基本上由……组成”)。这同样适用于所述方法中的步骤以及其中的组合物和组分。
本文所用的提及本发明、组合物、方法及其相应组分使用的术语“由……组成”旨在排除不被认为是组分、组合物或方法的必要要素的任何要素。
心肌功能和肌肉疾病
使用本文所述的方法和组合物，可以从干细胞衍生出许多类型的人类肌肉细胞。
肌肉细胞是这样的软组织细胞，其含有促进肌肉收缩以执行各种细胞、组织和器官水平功能的肌动蛋白和肌球蛋白的蛋白丝。肌肉细胞对于肢体的运动是必需的，但还包括食物通过消化系统的运动、心脏的搏动、调节血压的血管收缩和扩张、出生期间的子宫收缩、虹膜的聚焦以用于正常视觉、以及气道狭窄等。
肌肉产生的力是在收缩过程中通过肌球蛋白头部穿过肌动蛋白丝的运动产生的。一系列信号传导事件发生在肌细胞内以产生收缩，其通常包括：1)刺激附近肌细胞和/或神经元的电脉冲；2)引起钙从细胞的肌浆网释放的细胞内钙离子的流入；3)钙调蛋白的钙活化；4)在ATP(例如肌球蛋白轻链激酶，MLCK)的存在下，通过激酶磷酸化肌球蛋白；和5)肌球蛋白头与肌动蛋白丝之间形成“交叉桥”。这些信号传导事件对于肌肉收缩的正常发生是重要的。
肌营养不良如杜氏/贝克肌营养不良和Limb-Girdle肌营养不良是儿科患者中最常见的骨骼肌疾病，并且例如是由包括肌养蛋白及其相关分子在内的基因中的遗传突变引起的。这些退行性肌肉病症的主要症状包括：进行性肌肉消耗(progressive muscularwasting)和肌无力、平衡不良、频繁跌倒、行走困难、摇摆步态、小腿疼痛、有限范围的运动、肌肉挛缩、眼睑下垂(上睑下垂)、性腺萎缩、脊柱侧弯(脊柱弯曲)和不能行走。通常存在肌肉坏死，这导致血液中存在大量的肌肉蛋白肌酸激酶。
杜氏肌营养不良(DMD)是一种遗传的(X-连锁的)进行性肌肉退化，是由于缺乏基因产物细胞骨架蛋白肌养蛋白而引起的，并且影响大约1/3,500的男婴出生。肌养蛋白的缺乏是由编码这种肌纤维蛋白的基因突变引起的。肌养蛋白与膜结合蛋白的大复合物(称为肌养蛋白糖蛋白复合物(DGC))缔合。肌养蛋白和缔合的DGC的损失导致肌肉质膜的结构完整性受损，产生肌肉坏死和再生的破坏性循环。在不断损伤肌肉后，肌肉细胞最终被非收缩性纤维或脂肪组织取代。DMD患者的骨骼肌经历缓慢的进行性损伤，导致疾病症状。
骨骼肌、膈膜和心肌可能会受到影响。DMD是骨骼肌病症的一个实例，其也导致严重的心血管功能障碍。患有DMD的患者通常死于心律失常或猝死。这是由于与骨骼肌功能并行的心肌功能的进行性衰竭导致的。然而，DMD患者的心肌衰竭在疾病中较晚发生，并且心脏病发作通常在成年期开始。
心脏电生理和收缩功能是严格控制的过程。当离子通道调节或收缩功能在心脏细胞或组织中被破坏时，这可能导致心律失常，有时可能是致命的。许多疾病影响心肌，包括但不限于心律失常、心肌病(例如肥厚和扩张)、长QT综合征、致心律失常性右心室发育不良(ARVD)、儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速(CPVT)或Barth综合征。
干细胞衍生的心肌细胞已被用于模拟这些疾病和疾病表型(Itzhaki等人,Nature.2011；Moretti等人,NEJM.2010；Ma等人,European Heart Journal.2012；Kim等人,Nature.2013；Wang和McCain等人,Nature Medicine.2014；Jung等人,EMBO MolecularMedicine.2012)。然而，在现有模型中hPSC-CM的功能成熟普遍缺乏并且在正常的和患病的hPSC-CM中尚未得到良好控制或保持一致。对于hPSC-CM的成熟，需要质量控制标准和方法。hPSC-CM成熟的可靠方法是必需的，例如，以确保疾病表型在适当的情况下代表心脏疾病和病症的成人发作，以便鉴定有效治疗这些疾病和病症的疗法。
除了疾病建模之外，用于治疗通常与心脏功能无关的疾病或病症的药物或药剂的心脏毒性是研究性药物失败的常见原因。当心肌细胞的现有细胞培养物倾向于具有更多的胎儿或未成熟表型时，它们不能准确地反映药物对心脏组织的可能的体内作用。本文所述的方法和细胞培养平台也在本上下文中提供评价心脏毒性的益处。本文提供的方法和组合物允许产生疾病表型，如DMD心肌病，并且可以应用于具有该表型的成人发作的其它心脏疾病和病症。本文所述的方法和组合物产生功能成熟的hPSC-CM，基于本文所述的多种功能测定，其具有更成熟的表型。
预期本文所述的方法可应用于其它类型的肌肉细胞(例如骨骼肌)，其使用细胞特异性微RNA代替Let7i微RNA以使干细胞从胎儿样状态成熟为成年形式的肌肉细胞或组织。对于运动至关重要的肌肉组织的一个实例是骨骼肌。骨骼肌是在躯体神经系统的自主控制下的横纹肌组织。预期本文所述的方法可应用于通过干细胞衍生的骨骼肌细胞进行的肌肉疾病如DMD的疾病建模。
还预期本文所述的方法可应用于平滑肌。平滑肌的非限制性实例包括眼的虹膜、肺的细支气管、喉肌(声带)、胃肌层、食道、胃肠道中的小肠和大肠、输尿管、膀胱中的逼尿肌、子宫肌层、阴茎或前列腺中的那些平滑肌。预期与本文描述的那些类似的干细胞衍生的肌细胞成熟的方法可应用于干细胞衍生的平滑肌细胞的成熟。
干细胞衍生的心肌细胞的制备
因此，在一个实施方案中，用于本文所述的组合物和方法的心肌细胞可以从心脏组织即原代心肌细胞中获得。首先，虽然本公开内容集中于使用从干细胞体外分化的心肌细胞，但通过在纳米图案化的基底上与甲状腺激素T3和Let7i miRNA一起培养所提供的用于维持或促进心肌细胞表型的线索，可以有益于原代细胞。
本文还描述了从来源于对象、患者或供体的体细胞开始产生干细胞衍生的心肌细胞的方法。将体细胞重编程为诱导的多能干细胞(iPS细胞，iPSC)，然后将其分化为心肌细胞。因此，本文描述了将体细胞重编程为iPS细胞的方法，并且本文还描述了将iPS细胞分化为干细胞衍生的心肌细胞(例如人多能干细胞衍生的心肌细胞，hPSC-CM)的方法。将胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法是本领域已知的，并且在很大程度上类似于将iPS细胞分化为心肌细胞的方法。
用于重编程为iPS细胞的体细胞的来源：
从诱导为多能干细胞表型的供体细胞(然后其沿着心肌细胞谱系分化)产生干细胞衍生的心肌细胞。在没有限制的情况下，除人类以外，iPS细胞还可以由任何动物产生。在一些实施方案中，细胞供体是哺乳动物。通常，所述动物是脊椎动物，如灵长类动物、啮齿动物、家畜或狩猎动物。灵长类动物包括黑猩猩、猕猴、蜘蛛猿和猕猴，例如恒河猴。啮齿动物包括小鼠、大鼠、土拨鼠、雪貂、兔和仓鼠。家畜和狩猎动物包括牛，马，猪，鹿，野牛，水牛，猫科动物物种，例如家猫，犬科动物物种，例如狗、狐狸、狼，鸟类物种，例如鸡、鸸鹋(emu)、鸵鸟和鱼，例如鳟鱼、鲶鱼和鲑鱼。细胞供体、患者或对象可以包括适于给定用途的前述任何子集。在本文所述方面的某些实施方案中，对象是哺乳动物，例如灵长类动物，例如人。
iPS细胞也可以由供体干细胞产生。示例性干细胞包括成人干细胞、神经干细胞、肝干细胞、肌肉干细胞、内皮祖细胞、骨髓干细胞、软骨形成干细胞、淋巴干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、中枢神经系统干细胞、外周神经系统干细胞等。干细胞的描述(包括分离和培养它们的方法)可以见于Embryonic Stem Cells,Methods and Protocols,Turksen编辑,Humana Press,2002；Weisman等人,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.17:387 403；Pittinger等人,Science,284:143 47,1999；Animal Cell Culture,Masters编辑,OxfordUniversity Press,2000；Jackson等人,PNAS 96(25):14482 86,1999；Zuk等人,TissueEngineering,7:211 228,2001(“Zuk等人”)；Atala等人，特别是第33-41章；和美国专利第5,559,022号、第5,672,346号和第5,827,735号以及其它许多地方。
更常见地，iPS细胞将由分化的供体细胞产生，所述供体细胞包括有核的体细胞，包括但不限于成纤维细胞、基质细胞、肌肉细胞或成体有机体中大量组织中任一种的细胞。实际上，本文所述的实施例使用从尿液中分离并重编程为iPS细胞的人细胞(参见实施例和例如Zhou等人,J.Urology,2012,Guan等人,Stem Cell Research,2014)。供体细胞可以通过皮肤活检、尿液样品或通过抽血以及其它许多方法从对象获得。
在一些实施方案中，iPS细胞可以从获自对象(例如哺乳动物对象，包括人类对象)的心脏细胞(例如心脏成纤维细胞)或心室心肌细胞重编程。可以通过本领域已知的方法从哺乳动物供体收获来自合适的心脏组织来源的细胞混合物。将心脏组织解离，并将细胞涂铺在培养基中。心脏成纤维细胞将粘附到培养皿的表面，允许收集心脏成纤维细胞以重编程为iPS细胞。
将体细胞重编程为iPS细胞：
将分化细胞重编程为iPS细胞的方法是本领域众所周知的，并且通常涉及在细胞中强制表达Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc，尽管本领域中已知许多变型。例如，在本文提供的实施例中，使用编码人Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc的多顺反子慢病毒载体将从清洁收集(clean-catch)尿液样品中收集的细胞重编程为iPSC。根据本文所述的方法或有利于细胞活力和维持未分化的多能表型的其它条件，将hiPSC培养、扩增和传代。例如在低氧条件(例如37℃，5％CO2，5％O2)下维持hiPSC。
在没有限制的情况下，iPS细胞也可以使用其它方法产生，所述方法包括但不限于非病毒方法、使用多顺反子载体、mRNA物质、miRNA和蛋白质，包括在例如国际专利申请WO2010/019569、WO2009/149233、WO2009/093022、WO2010/022194、WO2009/101084、WO2008/038148、WO2010/059806、WO2010/057614、WO2010/056831、WO2010/050626、WO2010/033906、WO2009/126250、WO2009/143421、WO2009/140655、WO2009/133971、WO2009/101407、WO2009/091659、WO2009/086425、WO2009/079007、WO2009/058413、WO2009/032456,WO2009/032194、WO2008/103462、JP4411362、EP2128245和美国专利申请US2004/0072343、US2009/0253203、US2010/0112693、US2010/07542、US2009/0246875、US2009/0203141、US2010/00625343、US2009/0269763和US2010/059806中描述的方法，所述专利申请各自通过引用以其整体并入本文。尽管任何组织都可以提供用于产生iPS细胞以分化成心肌细胞的源细胞，但预期衍生自心脏组织的细胞可具有益处(例如表观遗传记忆)，当用于本文所述的方法中以产生iPS细胞衍生的心肌细胞时，所述益处允许成熟心肌细胞的增强产生。
将干细胞分化为干细胞衍生的心肌细胞：
如本文所述，使用细胞解离试剂(例如胰蛋白酶或乙二胺四乙酸)将iPSC解离成单细胞，并涂铺在干细胞培养基中的基质包被(例如MatrigelTM包被的)板上(参见CurrentProtocols in Stem Cell Biology.2:1C.2.1-1C2.I6,2007)以准备分化成心肌细胞。其它细胞外基质蛋白表面处理可用于iPS细胞的标准单层培养。培养皿的表面处理的非限制性实例包括蛋白质或其混合物，如明胶、胶原蛋白、纤连蛋白等。
为了制备用于分化成心肌细胞的iPS细胞，以高密度(250,000个细胞/mm2或更高)接种iPS细胞。一旦形成单层，细胞就可以分化成心肌细胞，如本文实施例中所述，或者例如如Macadangdang J等人,Cell.Mol.Bioeng.8:320-332(2015)所述。也可以使用本领域已知的将多能干细胞(iPS或ES细胞)分化为心肌细胞的其它方法。
在一些实施方案中，iPS细胞在多能状态之后或期间被遗传修饰。例如，可以使用CRISPR-Cas技术从正常亲代细胞系(例如UC3-4)产生同基因对的疾病模型细胞系(例如DMD突变的人iPS细胞)。也可以使用其它遗传修饰iPS或供体细胞的方法，包括但不限于引入病毒载体、脂质体介导的转染、显微注射等。遗传修饰可以包括增加一种或多种因子表达，或者相反地，失活或以其它方式抑制一种或多种因子表达的两种变化。
在CRISPR-Cas方法中，将靶向靶肌养蛋白基因的肌肉特异性外显子的指导序列用于突变该基因。然后通过本领域已知的测序方法确认突变。然后以与本文所述的正常或野生型细胞系相同的方式和条件维持疾病模型细胞系。
甲状腺激素和Let7i微RNA处理干细胞衍生的心肌细胞成熟
本文所述的方法和组合物包括用于使干细胞衍生的心肌细胞成熟的Let7i微RNA和甲状腺激素T3的递送。
甲状腺激素和Let7i miRNA的递送：
Let7i miRNA
在递送Let7i miRNA的上下文中，术语“接触”、“递送(delivering)”或“递送(delivery)”旨在涵盖从细胞外递送Let7i miRNA和从细胞内递送。例如，miRNA可以例如，在脂质复合物(例如，脂质体)中从细胞外引入。可选地，miRNA可以通过在细胞内从外源构建体(例如病毒或其它表达载体)表达来递送。这种构建体可以是游离的或稳定地整合在细胞基因组中。在一个实施方案中，将心肌细胞与Let7i miRNA接触的步骤包括使用从构建体稳定表达Let7i的心肌细胞。还预期了内源性Let7i miRNA基因序列的表达可以上调以实现Let7i miRNA递送。
纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i miRNA的组合提供了干细胞衍生的心肌细胞的有效成熟，并且这些不同刺激的时机可以影响成熟。在一个实施方案中，在某一点用编码Let7i miRNA的病毒载体感染体外分化的心肌细胞，在该点时，所述心肌细胞至少在非图案化的基底上形成搏动的单层并表达心肌肌钙蛋白T。时机可以变化，但在一个实施方案中，这是在分化诱导后约15天。然后将甲状腺激素T3加入到培养基中，并将细胞引入到纳米图案化的基底中。尽管不希望受到理论的束缚，但认为Let7i miRNA的一个功能是至少部分地抑制甲状腺激素T3的作用，发现这对成熟具有有益作用，但包括长期暴露后的有害作用。可以预期，在这种情况下，如果在甲状腺激素之后，而不是在甲状腺激素之前施用Let7imiRNA，Let7i miRNA将提供最佳的益处。然而，来自病毒载体的Let7i miRNA的表达在建立转基因的表达中涉及一定的延迟；预期如果与甲状腺激素同时或在甲状腺激素之后施用，更快速地提供miRNA的Let7i miRNA递送的其它手段可能是有效的。
甲状腺激素T3:
甲状腺激素T3或三碘甲状腺原氨酸(本文中也简称为“T3”)是由甲状腺产生和释放的基于酪氨酸的激素。T3在体内主要负责代谢、生长和发育、体温和心率的调节。T3与它们的靶细胞内的细胞核激素受体结合，在靶细胞内甲状腺激素受体然后结合代谢、细胞生长和发育中涉及的基因的调节区中的反应元件，并经由其活化转录。对于大多数细胞类型，T3通常导致基础代谢率的增加，这可以总体增加身体的氧和能量消耗。
在心脏中，甲状腺激素T3通过增加心肌中的肌球蛋白和β-肾上腺素能受体水平来增加心率和收缩力，这增加心输出量。此外，T3的作用可以缩短心电图上QRS复合物之间的时间(这已经由甲状腺机能亢进的动物模型证实)。T3还可以改善干细胞衍生的心肌细胞的钙处理。出生后，甲状腺激素T3的血清水平立即升高。这允许婴儿心脏的进一步成熟和改善的收缩功能。
在本文提供的实施例中，显示浓度为20ng/ml的甲状腺激素T3对心肌细胞成熟提供了有益效果。然而，浓度可以例如在1ng/ml至50ng/ml，或其间的任何浓度变化。此外，尽管甲状腺激素T3是该激素的代谢活性形式，但预期可以使用被细胞脱碘酶脱碘为活性T3形式的甲状腺激素T4，条件是细胞具有使T4形式脱碘的能力。参与T4脱碘的脱碘酶含有硒，使得含有硒的培养基可以促进这种活性。促进甲状腺激素受体活性的甲状腺激素T3的类似物也被考虑用于本文所述的心肌细胞成熟过程中。实例包括3,3’,5’-三碘甲状腺乙酸(Triac)、3,3’,5,5’-四碘甲状腺乙酸(Tetrac)、3,5-二碘甲状腺丙酸(DIPTA)和右旋(D)-T4(甲状腺素钠(choloxin))。类似物以及如何测定它们的活性描述于例如Shoemaker等人,Endocrin.Pract.18:954-964(2012)和Groeneweg等人,Mol.Cell.Endocrinol.458:82-90(2017)。
预期可以通过使用来自产生T3的甲状腺滤泡细胞(例如细胞系PCCL3)的培养物的条件培养基来提供T3(Palmero等人,Mol.Cell Endocrinol.376:12-22(2013))。
Let-7i miRNA:
miRNA被RNA聚合酶II转录为加帽的和聚腺苷酸化的初级转录物(pri-miRNA)的一部分。初级转录物被Drosha核糖核酸酶III酶切割以产生大约70nt的茎环前体miRNA(前miRNA)。前miRNA被细胞质Dicer核糖核酸酶进一步切割以产生成熟的miRNA和反义miRNA(有时称为miRNA星形(miRNA star)或miRNA*)产物。将成熟的miRNA掺入RNA诱导的沉默复合物(RISC)，该复合物通过与miRNA的不完全碱基配对结合靶mRNA，并且最通常导致靶mRNA的翻译抑制或去稳定。
脊椎动物中的Let7家族的微RNA是跨物种的保守序列，在许多发育过程中具有时间表达以促进最终分化。Let7家族的微RNA具有许多靶标，其包括例如原癌基因、细胞周期调节剂、细胞增殖调节剂、细胞凋亡和免疫，如RAS、HMGA2、细胞周期蛋白A2、CDC34、极光蛋白A和B激酶，E2F5、CDK8、CDC25A、CDK6、Casp3、Bcl2、Map3k1、Cdk5、细胞因子、toll样受体等。
除了其它基因之外，Let-7i还调节毛发生长相关基因HR的表达，该基因充当许多细胞核受体(包括甲状腺激素受体)的转录共阻抑物。
Let-7家族的成员的特征在于高度保守的18个核苷酸核心序列，其中成员Let-7a、Let-7b、Let-7c、Let-7g和Let-7i在16个核苷酸序列UGAGGUAGUAGUUUGU中共有精确的序列同一性。在染色体12q14.1编码人Let-7i。人Let-7i前体序列是(5’-3’)(SEQ ID NO:5):
Figure BDA0002442379050000341
人Let-7i成熟形式分子是具有序列(5’-3’)(SEQ ID NO:6):UGAGGUAGUAGUUUGUGCU及其互补物(SEQ ID NO:7)的双链体。
下文所示的Let-7a至Let-7i的成熟形式的序列显示相对于该家族的其它成员的最显著的变异是在成熟形式的序列的3'末端。因此，预期在3'末端或其附近的Let-7i分子的变化可能会影响Let-7i分子在心肌细胞成熟中的特异性或功能。相比之下，在允许分子在心肌细胞成熟中的功能方面，朝向成熟形式序列的5'末端或中心的变化将更可能被耐受。Let-7miRNA倾向于与其靶序列进行不完全碱基对杂交相互作用，这意味着与靶RNA的100％互补是不必要的。因此，预期5个或更少，例如4个或更少、3个或更少、2个或更少或单个核苷酸(优选在序列的5'或更中心区)的序列变异可以被耐受，同时在心肌细胞成熟中保持功能。在相对于人类成熟形式序列存在一个以上的序列差异的情况下，可能优选的是连续的差异彼此不相邻-例如，如果存在3、4或5个差异，可能优选它们不在连续的核苷酸上。最后，在本文所述的方法和组合物的上下文中，对于Let-7i miRNA最重要的是，无论单独还是与甲状腺激素T3和纳米图案化的基底组合，miRNA都能促进干细胞衍生的心肌细胞中更成熟的心肌细胞表型。使用本文所述的方法测定给定序列变体的这种活性是简单的问题。
于是，如本文所用，“Let-7i miRNA”是具有UGAGGUAGUAGUUUGUGCU(SEQ ID NO:6)的5'-3'序列及其互补物(SEQ ID NO:7)的双链体RNA分子，或者是如上所述在5个或更少核苷酸位置上不同的分子，其促进更成熟的心肌细胞表型(即，促进心肌细胞成熟)，如本文所定义的那样。Let-7i miRNA可以例如从载体表达为pri-mRNA或者在细胞中加工成成熟形式双链体的前miRNA。可选地，预期，如果需要，可将成熟形式的双链体例如经由脂质复合物或其它直接递送形式引入细胞。还预期可以使用直接递送前体miRNA或携带miRNA序列的发夹分子；在这种情况下，将细胞的加工酶用于在细胞中产生成熟形式的miRNA。
表1：人成熟Let-7微RNA序列。
Figure BDA0002442379050000351
在直接递送Let-7i miRNA的情况下(即在细胞中不表达)，该miRNA可以包括增强例如分子稳定性和/或其与靶分子的相互作用的修饰。修饰可以是例如对核碱基或对主链的修饰。修饰的核碱基的非限制性实例包括5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤素，8-氨基，8-硫醇，8-硫代烷基，8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素，特别是5-溴，5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
微RNA主链修饰可以包括但不限于脱氧核糖核酸(DNA,SEQ ID NO:1-5)、肽核酸(PNA)、吗啉代(morpholinos)、锁核酸(LNA)、二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)或本领域已知的其它异源核酸(xeno nucleic acid，XNA)形式。对于任何核碱基或主链修饰，应理解，如本文所述的心肌细胞成熟或更成熟的心肌细胞表型的促进对于在本文所述的方法和组合物中使用的修饰的miRNA是必需的。
Let7i miRNA载体也可以含有可选择的标志物，其允许对表达miRNA的干细胞衍生的心肌细胞进行阳性或阴性选择。在大多数情况下，可选择标志物将赋予细胞对诸如抗生素的药剂的抗性。可选择标志物的非限制性实例包括嘌呤霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素、博来霉素、氨甲蝶呤、G418硫酸盐等抗性基因。可以通过向细胞培养基中加入适量的选择剂以鉴定成功转导的表达Let7i miRNA的干细胞衍生的心肌细胞进行选择。
干细胞衍生的肌肉细胞成熟的仿生纳米图案化的基底的制造和应用
对于本文所述的使用仿生纳米图案化的基底用于干细胞衍生的心肌细胞的培养和成熟的组合物和方法，可以通过本领域已知的适于所使用的基底材料的任何方法来产生纳米图案化的基底。在一些实施方案中，可以如例如Kim等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.107:565-570(2010),Macadangdang等人,J.Vis.Exp.88:50039(2014)或者如U.S.9,994,812中所述，将纳米图案引入所述的基底，其各自通过引用以其整体并入本文。可以使用包括毛细管力光刻、纳米压痕、电子束光刻、静电纺丝或本领域普通技术人员已知的其它方法在内的方法来制造纳米图案化阵列平行的槽和脊。在一些实施方案中，使用毛细管力光刻。
在一些实施方案中，聚合物基底由与基于热或UV的固化方法相容的生物相容性水凝胶或允许使用毛细管力光刻的材料组成。在一些实施方案中，聚合物基底由PEG、PUA、PLGA、PMMA、PUA-PGMA或其化学变体组成。在一些实施方案中，聚合物基底包括UV固化的水凝胶聚合物、热敏水凝胶聚合物或通过溶剂蒸发产生的聚合物。在一些实施方案中，热敏聚合物是PNIPAM。
可以使用UV辅助的毛细管力光刻来制造例如具有800纳米宽的脊和600纳米深的槽的各向异性纳米加工的基底(Macadangdang J等人,Cell Mol Bioeng.2015,WO2013151755A1)。也可以使用其它尺寸。深度或宽度小于约50-100纳米的图案形成比具有更大纳米级尺寸的图案形成更不可能促进更成熟的心肌细胞表型。因此，槽的深度/高度可以是100纳米或更大、或150纳米或更大、或200纳米或更大、或250纳米或更大、或300纳米或更大、或350纳米或更大、或400纳米或更大、或450纳米或更大、或500纳米或更大、或550纳米或更大、或600纳米或更大、或650纳米或更大、或700纳米或更大、或750纳米或更大、或800纳米或更大、或850纳米或更大、或900纳米或更大、或950纳米或更大，但不超过1000纳米。纳米图案化的基底上的纳米图案的槽之间的槽或脊的宽度可以为100纳米或更大、或150纳米或更大、或200纳米或更大、或250纳米或更大、或300纳米或更大、或350纳米或更大、或400纳米或更大、或450纳米或更大、或500纳米或更大、或550纳米或更大、或600纳米或更大、或650纳米或更大、或700纳米或更大、或750纳米或更大、或800纳米或更大、或850纳米或更大、或900纳米或更大、或950纳米或更大，但不超过1000纳米。在一个实施方案中，槽的深度、槽的宽度和槽之间的脊的宽度都是相同的尺寸，例如，100纳米或更大、150纳米或更大、200纳米或更大、250纳米或更大、300纳米或更大、350纳米或更大、400纳米或更大、450纳米或更大、500纳米或更大、550纳米或更大、600纳米或更大、650纳米或更大、700纳米或更大、750纳米或更大、800纳米或更大、850纳米或更大、900纳米或更大、950纳米或更大，但不超过1000纳米。在另一个实施方案中，槽的深度、槽的宽度和槽之间的脊的宽度包括例如100的深度，槽宽度为100纳米、150纳米、200纳米、250纳米、300纳米、350纳米、400纳米、450纳米、500纳米、550纳米、600纳米、650纳米、700纳米、750纳米、800纳米、850纳米、900纳米或950纳米，并且脊宽度为100纳米、150纳米、200纳米、250纳米、300纳米、350纳米、400纳米、450纳米、500纳米、550纳米、600纳米、650纳米、700纳米、750纳米、800纳米、850纳米、900纳米或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为200纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为300纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为400纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为500纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为600纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为700纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为800纳米，且槽宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米，且脊宽度为100纳米、或150纳米、或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。在另一个实施方案中，槽深度为900纳米，且槽宽度为100纳米，或150纳米，或200纳米，或250纳米，或300纳米，或350纳米，或400纳米，或450纳米，或500纳米，或550纳米，或600纳米，或650纳米，或700纳米，或750纳米，或800纳米，或850纳米，或900纳米，或950纳米，且脊宽度为100纳米，或150纳米，或200纳米、或250纳米、或300纳米、或350纳米、或400纳米、或450纳米、或500纳米、或550纳米、或600纳米、或650纳米、或700纳米、或750纳米、或800纳米、或850纳米、或900纳米、或950纳米。这里作为实例提供的尺寸甚至是50或100nm的倍数，但预期，甚至不是50或100nm的倍数的其它尺寸也可以为在具有这样的纳米图案的基底上培养的干细胞衍生的心肌细胞的表型提供益处。
在一些实施方案中，纳米图案化的基底包括在基本上平坦的基底的一侧或两侧上的平行槽和脊的纳米纹理阵列。在一些实施方案中，心肌细胞或干细胞可以存在于纳米图案化基底的一侧或两侧。
在本文提供的实施例中描述和示出的槽和脊通常是矩形的，其中，例如，槽的侧面以垂直角度与槽之间的脊相交，或者类似地，槽的侧面与槽的底部相交。然而，体内细胞外基质的图案不包括具有垂直或矩形过渡的特征。因此，在本文还预期脊和槽之间的过渡可以是例如正弦曲线的。重要的是，图案具有如本文所述的高度和宽度的纳米级尺寸的基本平行的槽和脊。术语“平行”以其标准含义使用，即相邻的槽或脊在培养表面的跨度中不相交。然而，认识到，在不牺牲纹理的益处的情况下，可以容忍一定程度的缺陷，或者甚至一定程度的相邻槽的设计交叉。因此，尽管绝对数可能无法完全捕获可容许的非平行或相交的槽和脊的程度，但应理解，如果使用纳米图案化的基底测量心肌细胞结构或功能的培养表面的跨度上，两个相邻的槽或脊不相交，或最多在20％的时间相交，且当向下观察槽或脊的长度时仅以小于20度的锐角相交，则槽和脊“基本上平行”。总的来说，所选择的拓扑特征应允许正常或野生型干细胞衍生的心肌细胞形成肌节，使得它们呈现滑行肌动蛋白和肌球蛋白丝的有序Z带和H区。与单独的非模式细胞相比，在成熟心肌细胞中，细胞中的Z带宽度(肌原纤维束的指标)显著更大。可以例如通过干细胞衍生的心肌细胞的免疫组织化学来证实肌节的形成。
可以例如，通过用细胞外基质蛋白制剂或其它生物相容性表面处理进行涂覆来处理纳米图案化的基底以促进细胞粘附。在一些实施方案中，生物相容性表面处理可以包括，例如，聚-L-赖氨酸，聚-D-赖氨酸，聚鸟氨酸，或细胞外基质蛋白，如玻连蛋白、erythronectin、明胶、I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、纤连蛋白、纤连蛋白结构域、层粘连蛋白、或工程化的细胞外基质蛋白或肽。工程化的蛋白可以是，例如，包括CS1、RGD在内的肽片段，细胞外基质蛋白中与整联蛋白受体结合的结构域以及本领域普通技术人员通常已知的其它蛋白。
在一些实施方案中，纳米图案化的基底直接在多电极阵列上制造，用于干细胞衍生的心肌细胞的场电位记录。在一些实施方案中，用纳米柱或微柱制造纳米图案化的基底，所述纳米柱或微柱允许所述柱通过心肌细胞偏转以测量收缩性。在一些实施方案中，纳米图案化的基底在层状薄膜上制造，该层状薄膜在心肌细胞收缩或被电模拟时发生偏转。在一些实施方案中，纳米图案化的基底在层状薄膜上制造，该层状薄膜在心肌细胞收缩或被电模拟时发生偏转。在一些实施方案中，将纳米图案化的基底制造在允许心肌细胞拉伸的装置上(例如硅酮或水凝胶)。尽管可以使用其它材料，但允许机械刺激和拉伸心肌细胞以进一步改善它们的成熟的弹性体基底的实例是聚二甲基硅氧烷(PDMS)。可以在其上制造纳米图案化的基底的平台的其它实例包括在Du等人,Nat Commun.8:400(2017)，U.S.9,994,812，U.S.20120027807 A1和U.S.20120004716 A1中描述的那些。
如上所述，通过拉伸使心肌细胞经受机械刺激，例如使它们经受重复的拉伸和松弛循环可以促进更成熟的表型。尽管纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i处理的组合提供了优异的心肌细胞成熟，但预期这些线索与其它刺激或条件的组合甚至可以进一步促进这种成熟。如上所述，非限制性实例包括机械拉伸/松弛循环的应用以及向培养基中添加脂肪酸。因此，在一个实施方案中，经受本文所述的纳米图案化的基底/甲状腺激素T3/Let7i处理的心肌细胞可以进一步经受拉伸，例如通过使用与用于施加拉伸/松弛循环的装置接合的弹性体纳米图案化的基底，以进一步促进如本文所述的更成熟的表型。如本文所述的测定和测量可以提供对具有这种另外刺激的进一步成熟表型的测量。
在另一个实施方案中，在脂肪酸(包括但不限于棕榈酸酯、油酸和亚油酸)存在下的培养可以进一步促进如本文所述的更成熟的表型。作为非限制性实例，向基础培养基中添加与牛血清白蛋白(BSA)(例如，约50M)、油酸(例如，约15g/ml)或亚油酸(例如，约10g/ml)或其组合缀合的棕榈酸酯可以进一步促进如本文所述的更成熟的表型。
在另一个实施方案中，纳米图案化的基底/甲状腺激素T3/Let7i处理可以与机械刺激和脂肪酸暴露组合以进一步促进如本文所述的更成熟的表型。
干细胞来源的心肌细胞的功能表征
在本文所述的条件下成熟的干细胞衍生的心肌细胞允许评价成熟的心肌细胞对各种治疗或刺激的反应。在各种实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞的可量化参数可以包括收缩力、收缩性、改变的收缩、收缩频率、收缩持续时间、收缩耐力、心肌细胞大小、肌节组织、长度、周长、结构、多核状态、代谢呼吸能力、耗氧量、电生理学和生物物理学参数。在一些实施方案中，可量化的参数包括干细胞衍生的心肌细胞的存活和/或分裂或再生。
虽然大多数参数将提供量化读数，但在一些情况下，半量化或定性结果将是可接受的。读数可以包括单个确定的值，或者可以包括平均值、中值或方差等。典型地，从多个相同的测定中获得每个参数的参数读数范围。变异性是预期的，并且将使用标准统计方法获得各个测试参数组的值的范围，以提供有用的值。
以下描述了用于评价心肌细胞状态或功能的各种参数的测量。
免疫测定：本领域已知且未具体描述的免疫学中的标准方法一般按照Stites等人(编辑),Basic and Clinical Immunology,8th Ed.,Appleton&Lange,Norwalk,Conn.(1994)；和Mishell和Shigi(编辑),Selected Methods in Cellular Immunology,W.H.Freeman and Co.,New York(1980)进行。
通常，根据如何制备用于测定的细胞，将免疫测定用于评估细胞表面或细胞内标志物的样本。免疫细胞化学测定是本领域技术人员众所周知的。多克隆抗体和单克隆抗体都可以用于这种测定。在适当的情况下，其它免疫测定，如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定和流式细胞术可以用于检测细胞类型特异性标志物。
在专利和科学文献中广泛描述了可用的免疫测定。参见，例如，美国专利第3,791,932号；第3,839,153号；第3,850,752号；第3,850,578号；第3,853,987号；第3,867,517号；第3,879,262号；第3,901,654号；第3,935,074号；第3,984,533号；第3,996,345号；第4,034,074号；第4,098,876号；第4,879,219号；第5,011,771号；和第5,281,521号以及Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor,N.Y.,1989等。
可以使用基于免疫的方法测定的心脏特异性标志物的非限制性实例包括心肌肌钙蛋白T、心肌肌钙蛋白-C、原肌球蛋白、小窝蛋白-3,GATA-4、肌球蛋白重链、肌球蛋白轻链-2a、肌球蛋白轻链-2v、雷诺丁(ryanodine)受体、心房利钠因子等。
肌节组织：
本文所述的方法包括使用肌动蛋白和肌球蛋白丝的肌节形态和结构表征作为干细胞衍生的心肌细胞分化和成熟的量度。肌节被定义为在显微照片中显示为一系列暗线的肌肉细胞的两个相邻Z线(或Z盘、或Z体)之间的区段。Z线充当用于肌肉收缩的肌动蛋白和肌球蛋白丝的锚定点。心脏肌节包括(i)粗的肌球蛋白蛋白丝，其肌球蛋白头部几乎垂直于所述丝，(ii)细的肌动蛋白丝，和(iii)肌联蛋白(titin)丝。在每条Z线之间是未与粗的肌球蛋白丝叠加的细丝的I带。心肌细胞组织的其它结构(和可变)特征包括A带，它是单条粗的肌球蛋白丝的整个长度。H区是未与肌动蛋白细丝叠加的粗丝的区域。M线由细胞骨架的交叉连接元件形成。
肌动蛋白丝和肌联蛋白分子经由Z-线蛋白α-辅肌动蛋白在Z-盘中交联。在心脏的层状组织内，α-辅肌动蛋白垂直于肌动蛋白和肌球蛋白丝。因为心脏肌节的结构是高度有序的，所以本领域普通技术人员将认识到这些蛋白质(肌动蛋白、肌球蛋白、α-辅肌动蛋白、肌联蛋白)及其在组织或培养细胞集合中的排列作为鉴定成熟肌肉细胞和组织的标志物。发育中的心脏细胞经历“肌节生成(sarcomerogenesis)”，这会在细胞内产生新的肌节单元。肌节组织的程度提供了心肌细胞成熟的量度。
用于肌球蛋白、肌动蛋白、cTnT、原肌球蛋白等的免疫荧光测定和电子显微镜可以用于鉴定和测量肌节结构。
免疫荧光图像可以量化肌节排列、图案强度和肌节长度。这可以通过使用扫描梯度和傅立叶变换脚本来确定蛋白质的位置来实现。这是通过将每个图像分成几个小的区段用于单独的分析来完成的。使用方向导数，可以计算每个区段的图像梯度，以确定肌节的局部排列。图案强度可以通过计算在梯度方向上的一维傅立叶变换的最大峰值来确定。通过测量沿着该相同梯度方向的肌节的强度分布，可以计算肌节的长度。强度分布与它们的平均值相交处的频率允许精确地计算每个图像区段内的局部肌节长度。这种分析允许肌节图案的无偏差的亚细胞分辨率的绘制，即使在缺少由纳米形貌提供的排列线索的细胞中亦如此。
细胞形态可用于鉴定结构成熟的干细胞衍生的心肌细胞。形态和结构参数的非限制性实例包括但不限于肌节长度、Z带宽度、双核形成百分比、细胞核偏心率、细胞面积和细胞长宽比。
可选地，也可以使用肌节结构的定性分析。对于本领域普通技术人员来说，成人心肌细胞表型的标准是α-肌动蛋白与肌动蛋白丝成约90度。胎儿心肌细胞不表达α-辅肌动蛋白，或者α-辅肌动蛋白结构与本文所述的肌节结构无序。
电生理学：
成熟的心肌细胞具有产生电势的功能性离子通道，所述电势在心肌细胞之间产生信号，允许心肌收缩的同步。干细胞衍生的心肌细胞的电功能可以通过多种方法测量。这种方法的非限制性实例包括全细胞膜片钳(手动或自动)、多电极阵列、钙成像和光学映像等。干细胞衍生的心肌细胞可以在全细胞电流钳或多电极阵列记录期间被电刺激以产生电反应或收缩反应。此外，可以对干细胞衍生的心肌细胞进行遗传修饰，例如以表达允许细胞的光学刺激的通道视紫红质。
干细胞衍生的心肌细胞的场电位和生物电位的测量可用于确定分化阶段和细胞成熟。在没有限制的情况下，可以使用以下参数来确定干细胞衍生的心肌细胞的电生理功能：FPD的变化、FPD的量化、搏动频率、每分钟搏动次数、上升速度、静息膜电位、动作电位幅度、最大舒张电位、松弛时间常数、90％复极的动作电位持续时间、尖峰间期、搏动间隔变化、电流密度、活化和失活动力学等。
在疾病状态期间，心肌细胞的电生理功能可能受损，并且这可以通过使用如本文所述成熟的心肌细胞的疾病模型来重现。例如，与正常干细胞衍生的心肌细胞相比，用于模拟心律失常如长QT综合征的干细胞衍生的心肌细胞可表现出延长的FPD和APD。
代谢测定：
与以增加的线粒体功能和储备呼吸能力(spare respiratory capacity)为标记的胎儿心肌细胞相比，成人心肌细胞显示出具有增强的细胞代谢。代谢测定可用于确定本文所述的干细胞衍生的心肌细胞的分化阶段和细胞成熟。代谢测定的非限制性实例包括细胞生物能量测定(例如Seahorse Bioscience XF细胞外通量分析仪)和耗氧测试。
更具体地，细胞代谢可通过耗氧率(OCR)、脂肪酸应激测试期间的OCR迹线、OCR的最大变化、FCCP添加后OCR的最大变化和最大呼吸能力等其它参数来量化。
此外，代谢激发或乳酸盐富集测定可以提供干细胞衍生的心肌细胞成熟的量度或这些细胞的各种处理的效果的量度。哺乳动物细胞通常使用葡萄糖作为它们的主要能源。然而，心肌细胞能够从不同来源如乳酸盐或脂肪酸产生能量。在一些实施方案中，乳酸盐补充的和葡萄糖耗尽的培养基，或细胞使用乳酸盐或脂肪酸作为能源的能力可用于鉴定成熟的干细胞衍生的心肌细胞及其功能变化。
测量心脏收缩性的方法：
收缩性通常通过视频跟踪方法来测量。诸如收缩幅度、速度和角度的功能输出作为每个视频帧的矢量场输出，并且可以在空间或时间上进行平均。对于视频跟踪方法，干细胞衍生的心肌细胞的收缩(contraction)(或收缩(systole))被认为是细胞或心脏组织处于最短长度的时间点和空间点。松弛(舒张)被认为是细胞或心脏组织处于最大长度的时间点或空间点。通过使用视频内的参考帧并使用参考帧作为引导来跟踪心肌细胞或心脏组织的运动来确定这些参数。
除了视频跟踪之外，还可以进行阻抗测量。例如，本文所述的干细胞衍生的心肌细胞可以具有通过xCelligenceTM实时细胞分析(Acea Biosciences,Inc.,San Diego,CA)确定的收缩性或搏动率测量。
干细胞衍生的心肌细胞功能的一个重要参数是搏动率。收缩频率、搏动率、搏动间隔变化(ΔBI)或搏动周期可用于确定干细胞分化阶段、干细胞衍生的心肌细胞成熟以及给定处理对这种速率的影响。胎儿心肌细胞中的搏动率通常升高，并且随着心肌细胞的发展而降低。在疾病状态期间，由于电生理不稳定性或结构不稳定性，搏动率的变化可能是变化的，并且而缺乏恒定的频率。在没有限制的情况下，收缩参数还可以包括收缩速度、松弛速度、收缩角分布或收缩各向异性比。
疾病模型
DMD仅是影响心脏功能的多种疾病之一，如本文所述制备和成熟的干细胞衍生的心肌细胞可适于对其进行建模。已经描述了多种心脏疾病模型，其中心脏细胞从来源于患有各种心脏疾病的对象的iPS细胞分化。参见，例如，Ebert和Svendsen,Nat.Rev.DrugDiscov 9:367-372(2010)。
可以使用如本文所述制备和成熟的干细胞衍生的心肌细胞建模的心脏疾病包括例如在Smith等人,Biotechnol.Adv.35:77-94(2017)中论述的那些。更具体地，这样的疾病包括离子通道病，如长QT综合征，使用来源于iPS细胞的心肌细胞的针对其的模型由Moretti等人,New Engl.J.Med.363:1397-1409(2010)描述。其它模型包括由Egashira等人,Cardiovasc.Res.95:419-429(2012)描述的针对LQT1亚型的模型；由Itzhaki等人,Nature 471:225-229(2011),Lahti等人,Dis.Model Mech.5:220-230(2012)和Matsa等人,Eur.Heart J.32:952-962(2011)描述的针对LQT2亚型的模型；以及由Ma等人,Int.J.Cardiol.168:5277-5286(2013)和Terrenoire等人,J.Gen.Physiol.141:61-72(2013)描述的针对LQT3亚型的模型。产生LQT3和Brugada综合征亚型的模型由Davis等人,Circulation 125:3079-3091(2012)描述，以及来自Timothy综合征患者的针对LTQ8的模型由Yazawa等人,J.Cardiovasc.Transl.Res.6:1-9(2013)描述。
可以使用从患有这种疾病的患者分化的心脏细胞来建模的其它心脏疾病包括离子通道病儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速(CPVT)。基于分化为心肌细胞的iPS细胞的这种疾病的模型包括由Itzhaki等人,J.Am.Coll.Cardiol.60:990-1000(2012),Fatima等人,Cell Physiol.Biochem.28:579-592(2011),Jung等人,EMBO Mol.Med.4:180-191(2012)DiPasquale等人,Cell Death Dis.4:e843(2013)和Paavola等人,Europace:European pacing,arrhythmias,and cardiac electrophysiology:journal of theworking groups on cardiac pacing,arrhythmias,and cardiac cellularelectrophysiology of the European Society of Cardiology(2015)针对CPVT1描述的那些以及Novak等人,Rambam Maimonides Med.J.3:e0015(2012)针对CPVT2描述的那些。
已使用来自患有疾病的对象的iPS细胞分化建模的其它病症包括肥厚型心肌病(HCM)(Carvajal-Vergara等人,Nature 2010 465:808-812(2010)和Lan等人,Cell StemCell 12:101-113(2013))和家族性扩张型心肌病(DCM)(Sun等人,Sci Transl.Med.4:130ra47(2012),Siu等人,Aging 4:803-822(2012),Tse等人,Hum.Mol.Genet.22:1395-1403(2013))、庞贝氏症(Pompe disease)(Huang等人,Hum.Mol.Genet.20:4851-4864(2011))、弗里德里希共济失调(FRDA)(Hick等人,Dis.Model.Mech.6:608-621(2013),Barth Syndrome(Wang et al.,Nat.Med.20:616-623(2014))、致心律失常性右心室发育不良/心肌病(ARVD/C)(Calkins,Circulation Journal:official Journal of theJapanese Circulation Society 79:901-913(2015),Caspi等人,CirculationCardiovascular Genetics 6:557-568(2013),Kim等人,Nature 494:105-110(2013),Malik和Rao,Meth.Mol.Biol.997:23-33(2013))。
使用从来源于患有各种疾病的对象的iPS细胞分化的心肌细胞的上述任何或所有疾病模型可受益于本文所述的用于制备干细胞衍生的心肌细胞和使其成熟的方法。
使用干细胞衍生的心肌细胞的药物筛选平台
如本文所述制备的成熟心肌细胞为研究或评价已知或实验药物对体内心肌细胞或心脏组织的可能作用提供了平台。这可用于评价用于治疗非心脏适应症的药物的可能心脏副作用或心脏毒性。可选地，通过用例如潜在药物或药剂的库或集合进行筛选，如本文所述制备和成熟的心肌细胞也可用于鉴定对心肌细胞或心脏功能具有有益效果的新药物。来源于正常供体细胞的心肌细胞可以在两种情况下提供有用的信息，并且来源于具有心脏或其它疾病的供体的心肌细胞，或来源于经工程改造以模仿心脏疾病或病症的细胞的心肌细胞在鉴定治疗此类疾病的新药物或药剂中可能非常有用。在任一情况下，如本文所述或如本领域已知的对功能或结构参数的评价对于给定药剂的效果可以是有益的。通常，这种测定包括将如本文所述制备和成熟的心肌细胞与药剂接触，以及测量本文所述的心肌细胞的一个或多个参数作为药剂效果的指标。在观察到效果的情况下，还可以通过改变药剂的浓度和/或接触的持续时间来评价剂量反应。相对于不太成熟的培养的心肌细胞，本文所述的成熟心肌细胞的一个益处是它们在延长的培养(在最佳条件下，数周或更长)时期内保持其成熟表型。这还可以允许收集例如长期低水平暴露于药剂的数据，这对于在另一个平台中的心肌细胞是不可能的。
因此，如本文所述制备和成熟的干细胞衍生的心肌细胞可用于鉴定药剂或评价药剂对参数如标志物的表达、细胞活力、肌节排列、收缩性、电生理反应、搏动率或者本文所述或本领域已知的其它参数的影响。
在一些实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞可用于筛选选自小分子、核酸或其类似物、适配体；蛋白质或多肽或其类似物或片段的药剂以及对细胞具有有害或有益效果的其它试剂的测定中。就如本文所述制备和成熟的心肌细胞可重现或模仿药物对心脏组织的作用而言，还预期如本文所述制备和成熟的心肌细胞可用于筛选对抗可用于非心脏适应症的另一种药物的心脏副作用。
在一些实施方案中，所述药剂是感兴趣的药剂，所述药剂包括已知的和未知的化合物，其涵盖许多化学类别，主要是有机分子，其可以包括有机金属分子、无机分子、遗传序列等。如本文所述的干细胞衍生的心肌细胞的用途的一个重要方面是评价候选药物，包括毒性测试等。候选试剂还包括含有结构相互作用，特别是氢键合所必需的官能团的有机分子，并且通常包括胺、羰基、羟基或羧基，通常多于一个这样的官能化学基团。候选试剂通常包括被一个或多个上述官能团取代的环碳或杂环结构和/或芳族或聚芳族结构。候选试剂也见于生物分子中，包括肽、多核苷酸、糖类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、以上的衍生物、结构类似物或组合。
也将药理学活性药物、遗传活性分子等包括作为药剂。感兴趣的化合物包括，例如，化疗剂、激素或激素拮抗剂、生长因子或重组生长因子及其片段和变体。适用于本发明的药剂的实例是描述于“The Pharmacological Basis of Therapeutics,”Goodman和Gilman,McGraw-Hill,New York,N.Y.,(1996),第九版,在以下章节中:Water,Salts andIons；Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism；DrugsAffecting Gastrointestinal Function；Chemotherapy of Microbial Diseases；Chemotherapy of Neoplastic Diseases；Drugs Acting on Blood-Forming organs；Hormones and Hormone Antagonists；Vitamins,Dermatology；and Toxicology中的那些，其全部通过引用并入本文。还包括毒素以及生物和化学战剂，例如参见Somani,S.M.(编辑),“Chemical Warfare Agents,”Academic Press,New York,1992。
包括候选试剂在内的化合物可以从多种来源获得，包括合成或天然化合物的库。多种手段可用于随机和定向合成多种有机化合物(包括生物分子)，包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。可选地，可以获得或容易地产生细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库。另外，天然或合成产生的库和化合物容易通过常规的化学、物理和生化手段修饰，并且可用于产生组合库。可以对已知的药理学试剂进行定向或随机化学修饰，如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等，以产生结构类似物。
候选试剂包括上述所有类别的分子，并且还可以包括未知含量的样品。感兴趣的是来源于诸如植物的天然来源的天然存在的化合物的复杂混合物。虽然许多样品将包含在溶液中的化合物，但也可测定可溶于合适溶剂中的固体样品。感兴趣的样品包括环境样品，例如地下水、海水等；生物样品，例如从作物制备的裂解物、组织样品等；制造样品，例如在药物制备期间的时程；以及制备用于分析的化合物库；等。
在一些实施方案中，药剂的作用通过干细胞衍生的心肌细胞的可量化参数来确定，所述可量化参数可以包括收缩力、收缩性、改变的收缩、收缩频率、收缩持续时间、收缩耐力、心肌细胞大小、肌节组织、长度、结构、代谢呼吸能力、耗氧量以及电生理学和生物物理学参数。在一些实施方案中，可量化参数包括干细胞衍生的心肌细胞的分化、存活和再生。
包括干细胞衍生的心肌细胞的多种测定可以与不同的药剂浓度平行进行，以获得对各种浓度的差异反应。如本领域已知的，确定药剂的有效浓度通常使用由1:10或其它对数级稀释度产生的浓度范围。如果需要，可以用第二系列稀释度进一步改善浓度。通常，这些浓度中的一个用作阴性对照，即处于零浓度或低于药剂的检测水平，或者处于或低于在表型中不产生可检测变化的药剂浓度。
任选地，可以操纵筛选中使用的干细胞衍生的心肌细胞以表达期望的基因产物。
试剂盒
在一些实施方案中，如本文所述的组合物可以制备为试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒可以包含本文所述的纳米图案化的基底、甲状腺激素T3或其类似物、编码Let7i微RNA的载体或包含Let7imiRNA的制剂及其包装材料。在另一个实施方案中，所述试剂盒还包含iPS细胞或ES细胞制剂，其可以是有代谢活性的或冷冻的，并且可以任选地包含如本文所述的试剂，用于将iPS细胞或ES细胞制剂的细胞分化为心肌细胞表型。在另一个实施方案中，将干细胞衍生的心肌细胞预先铺在或附着在纳米图案化的基底上。
在其它实施方案中，试剂盒还包含细胞培养基和允许从干细胞衍生的心肌细胞制备成熟的体外分化的心肌细胞的说明书。在一个实施方案中，所述试剂盒包含适于添加到组织培养基中的脂肪酸制剂。脂肪酸制剂可以包括，例如，包含棕榈酸酯、油酸、亚油酸或其组合的制剂。
在另一个实施方案中，所述试剂盒包含干细胞衍生的心肌细胞，其可以是有代谢活性的或冷冻的。在另一个实施方案中，试剂盒和/或其任何组分可以在环境温度或室温或在例如4℃下运输和/或储存。
在一些实施方案中，iPS细胞、ES细胞或干细胞衍生的心肌细胞是人细胞、啮齿动物细胞、犬细胞等。在一些实施方案中，干细胞衍生的心肌细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象，或经遗传修饰以模拟肌肉疾病或病症，包括例如心脏疾病或病症。
实施例
实施例1：工程化发育生态位使得能够在人类营养不良心肌病中进行预测性表型筛选
心血管疾病仍然是全世界男性和女性死亡的主因，其中对发展中国家的影响迅速增长1。遗传性心肌病是所有年龄组(包括儿童和年轻的在其它方面健康的成年人)中心脏病的主要原因2。人多能干细胞衍生的心肌细胞(hPSC-CM)是研究心肌病的有希望的工具，因为它们极大地增加了人心肌细胞的可及性，所述人心肌细胞可以在理论上表达在人心脏中发现的离子通道、蛋白质同种型和遗传和代谢机制的全部阵列3。当前心脏病建模努力的主要目标是深入了解心肌病的发作和进展，作为设计更有效的治疗策略的第一步。然而，许多患有遗传性心肌病的患者直到青春期晚期或成年期早期才出现心脏症状2。这限制了hPSC-CM疾病建模的潜力，因为当前的分化方案产生的心肌细胞具有与胎儿心脏的细胞最类似的结构、功能和生化特性4。
发育成熟为心脏疾病模型中的hPSC-CM呈现了技术障碍。迄今为止，表现出胎儿样表型的hPSC-CM已被用于研究通道病5-7、代谢综合8、肥厚和扩张性心肌病9,10以及其它迟发型心脏病，如杜氏肌营养不良(DMD)心肌病11,12。尽管这些报道无疑具有开创性和价值13，但大多数发现是基于以下心肌细胞的性能：其仍然是非常初始的，具有不完全的结构组织以及胎儿和成人蛋白质同种型表达的混合物。已经投入了许多努力来开发加速hPSC-CM发育的方法4,13。尽管已经证明这种策略在增强hPSC-CM发育的特定方面是有效的，但单一方法不太可能完全重建发育中的心脏微环境生态位。产生了多方面和组合的成熟(ComboMat)平台，其结合了纳米拓扑基底线索、甲状腺激素T3和Let-7i miRNA过表达，目的在于更全面地模拟发育的心脏生态位，以便加速体外hPSC-CM的成熟。还发现，对于充分发育的心脏中适当的结构-功能关系和hPSC-CM的形态发育14至关重要的各向异性细胞外基质线索是心脏发育和循环过程中的重要因素15。已显示，甲状腺激素处理(模拟出生后血清T3水平立即升高)改善hPSC-CM中的力产生和钙处理16，而Let-7miRNA的上调增强hPSC-CM中的代谢发育17。
作为强调成熟心脏表型在体外心脏组织工程应用中的效用的手段，开发了营养不良心肌病的较为成熟的模型。营养不良心肌病，如杜氏肌营养不良(DMD)和贝克肌营养不良(BMD)，是由突变的肌养蛋白基因引起的X连锁遗传病症。由于出现支持通气作为护理标准，心脏并发症已经取代了呼吸衰竭作为DMD患者的主要死亡原因18。然而，在营养不良啮齿动物模型(如mdx小鼠)中的心肌病已被证明是临床中患者对治疗性治疗的反应的不良预测因素19,20。事实上，最近用西地那非进行的临床试验(其在mdx小鼠中显示出减轻心脏功能障碍的前景21)加剧了DMD患者的心脏症状，并且必须提早终止20。因此，存在对营养不良心肌病的改进的人类模型的未满足的医学需求。先前已经报道，与健康对照相比，肌养蛋白突变的人心肌细胞表现出表型差异，但这些差异是轻微的或由外源性急性应激(如低渗激发)诱导的11 , 22。由Lin等人12和Young等人23开发的其它肌养蛋白突变体模型提供了对DMD特异性疾病机制和潜在治疗选择的有价值的见解，但是两个报道均基于胎儿样hPSC-CM。为了不受特定理论的束缚，假设较为成熟的hPSC-CM将改善在患者中发现的营养不良心肌病的预测模型。
为了检验这一假说，将ComboMat平台应用于CRISPR产生的肌养蛋白突变的(DMD263delG)hPSC-CM，以促进体外成年发作心脏病表型的表现。在DMD基因中具有类似外显子1突变的患者(图7)表达截短的肌养蛋白并表现出BMD表型24。当使用组合方式成熟时，DMD突变的hPSC-CM在定制的纳米图案化多电极阵列(nanoMEA)心脏筛选平台上表现出更大的心律失常倾向。在没有发育的心脏生态位线索的情况下，不可能将DMD突变的hPSC-CM的功能谱与健康的同基因对照细胞区分开来。因此，ComboMat平台产生了用于疾病建模和药物筛选应用的更多生理学相关的hPSC-CM。
结果：分析ComboMat处理的心肌细胞的转录组
研究了三种不同的线索的组合影响，包括仿生纳米图案化形貌(NP)14,15、甲状腺激素T3(T3)16和Let7i miRNA过表达(Let7i)17，将其并入称为ComboMat平台的单一程序中(在图1A中示意性描述)。进行RNA-seq以观察暴露于三种成熟线索的不同组合的hPSC-CM的整个转录物组。主成分分析(图1B)显示ComboMat组(所有三种因素组合在一起)与所有其它条件分离。然后，产生由心肌细胞成熟的七种标志途径组成的富集热图(图1C)。随着更多的成熟条件在彼此之上放置，心肌细胞似乎越来越成熟。ComboMat组显示出最稳健的成熟，在6种途径中上调，并且在细胞周期途径中下调。图1D显示基于ComboMat和对照(平面上的空载体细胞)组之间的P值的8个上调基因本体(GO)术语；EV-平面)。与代谢有关的途径如葡萄糖代谢过程、长链脂肪酸输入和糖酵解过程上调。与肌肉过程相关的GO术语(包括肌肉组织发育、肌肉收缩和横纹肌细胞分化)也被上调。
产生气泡图(图1E)以比较ComboMat组和对照组沿PC1的基因表达。在成人对比胎儿以及ComboMat对比对照中，发现五十三(53)个显著较高的基因以及十三(13)个显著较低的基因。ComboMat组中沿PC1最大上调的基因是毛发生长相关基因(HR)，其为一种甲状腺激素共阻抑物。Krupel样因子(KLF9)(其为一种转录因子)也被显著上调。据报道KLF9结合PPAR-γ启动子(脂肪酸代谢中的关键基因)25。细胞色素c氧化酶亚基6A2(COX6A2)(与心脏代谢相关的另一基因)在ComboMat组中也被上调。此外，肌球蛋白轻链2(MYL2)(心室同种型和心肌细胞成熟的标志)被上调。与图1E中突出显示的相同基因相比，气泡图显示人类胎儿和成人心肌细胞基因表达(图1F)。与胎儿对照相比时，ComboMat组中高度上调的基因在成人心肌细胞中也被上调。
ComboMat处理的心肌细胞结构成熟
对于这些研究，以及所有随后的功能测定，将完整的ComboMat平台(Let7i+NP+T3)与病毒载体对照(EV+平面+无T3)进行比较，并且分离每个成熟线索：NP(EV+NP+无T3)、T3(EV+平面+T3)和Let7i(Let7i+平面+无T3)。免疫荧光成像(图2A)证实了在NP上培养的hPSC-CM在纳米形貌方向上伸长并表现出更多的各向异性的棒状形态。在NP上以较高的方向性和有序性发展了肌节，导致更多的肌节彼此配准(图2B)。与对照相比，仅暴露于T3或Let7i的hPSC-CM显著更大(图2F)，但形成圆形或不规则的形态。当暴露于ComboMat平台中的所有三种线索时，hPSC-CM变成杆状，并且比每种单独的线索都多(图2F,*p<0.05)。与在对照组中发现的圆周条带相比，暴露于ComboMat平台的hPSC-CM也显示出沿着细胞长度的重复肌节条带图案，并且具有大约1.8微米(μm)±0.012微米(μm)的较长的静息肌节长度(图2C,*p<0.05)。ComboMat组中的hPSC-CM也表现出较高的双核形成百分比(图2E,*p<0.05)。
经由透射电子显微镜(TEM)研究了hPSC-CM的超微结构。观察到暴露于对照条件的hPSC-CM表现出低密度、紊乱的肌原纤维和仅点状Z-体形成(图2B)。NP、T3或Let7i的应用单独地改进了更有组织和更宽的Z带的发展(图2D)，但是总体肌节仍相当无组织的并且处于低密度。相比之下，用ComboMat平台培养的hPSC-CM产生了更有序的肌节，出现了Z带和H区(图2B)。在ComboMat组中，细胞中的Z带宽度(肌原纤维束的指标)也显著大于对照或每种单独的线索。
ComboMat处理心肌细胞的机电和代谢成熟
为了测试ComboMat平台赋予的遗传和结构变化是否表现为hPSC-CM的增强的功能性能，使用两种非侵入性测量法来确定机电功能。使用基于相关的收缩量化(CCQ)22，测量hPSC-CM单层的收缩，在1Hz下定步，并且以每秒30帧进行拍摄。通过将这些收缩矢量一起进行空间平均，测量了对照、NP、T3、Let7i和ComboMat条件下的最大收缩和松弛速度(在图3A中标注为红色和蓝色标记)，并且发现与对照或单独的任何成熟线索相比，暴露于ComboMat平台的细胞具有显著更快的收缩(图3B)。为了帮助解释这一点，检查了收缩过程中的位移角，发现在NP上培养的hPSC-CM比在平的基底上培养的细胞在更均匀的方向上收缩(图3C)。为了量化该优选的方向性，测量收缩各向异性比(AR)，并确定NP上的细胞(如ComboMat平台中的那些)在平行于下面的纳米形貌的方向上的收缩幅度是垂直于它的方向上的收缩幅度的两倍多(ComboMat AR＝2.39±0.01)(图3D)。这与生长在传统的平基底上的细胞形成对比，在传统的平基底中，收缩是随机定向的，并且在所有方向上都表现出类似的幅度(对照AR＝1.04±0.02)。
除了收缩动力学之外，还使用微电极阵列(MEA)测量心肌细胞的电活性。为了促进NP和ComboMat条件下的hPSC-CM对齐，同时仍能够从下面的电极进行高分辨率的电生理数据捕获，使用离子可渗透树脂全氟磺酸(Nafion)在MEA(nanoMEA)上产生纳米形貌表面。图3E显示来自对照和ComboMat培养物的时间平均场电位记录。测量心脏单层的自发电活动，发现暴露于ComboMat平台的hPSC-CM具有比对照、NP和T3组显著更长的场电位持续时间(图3F)。另外，与对照或每种单独的成熟线索相比，ComboMat平台显著减缓心肌细胞的搏动率(图3G)。暴露于ComboMat平台的hPSC-CM也表现出较快的上升速度，如经由膜片钳所测量的(图8)。
RNA-seq分析表明ComboMat平台赋予的心脏代谢的显著变化。因此，心肌细胞利用外源脂肪酸的能力经由在海马线粒体流量分析仪上的“棕榈酸酯测定”来探测(图3H)。观察到暴露于ComboMat平台的hPSC-CM表现出显著更大的耗氧率(OCR)变化，如在200μM至400μM的棕榈酸酯浓度所测量的(图3I)。与对照相比，ComboMat组中的最大呼吸能力也显著较高(图9)。
ComboMat处理的肌养蛋白突变的hPSC-CM表现出疾病表型
首先，测试DMD突变的hPSC-CM是否以与它们的正常(UC3-4)同基因对应物类似的方式对ComboMat平台做出反应。使用Seahorse MitoStress测定(图4A)，观察到与对照条件相比，当在ComboMat平台下培养时，DMD突变的hiPSC-CM具有增加的最大呼吸能力(图4B)。然而，在对照或ComboMat条件下，正常和DMD突变组之间没有统计学差异。使用定制的nanoMEA平台测量DMD突变细胞的基线电生理学特性。DMD突变的hiPSC-CM的搏动率以与正常hPSC-CM相同的程度响应于ComboMat平台而降低(图4C)。另外，与对照相比，DMD突变的hPSC-CM的场电位持续时间(FPD)在暴露于ComboMat时增加，反映了从正常hPSC-CM进行的观察(图4D)。从结构的观点来看，当暴露于ComboMat平台时，DMD突变的hiPSC-CM发展了具有配准的肌节的特征性伸长形态，而暴露于对照条件的DMD突变的hiPSC-CM更圆滑，具有更无序的肌节(图4E)。
在不受特定理论束缚的情况下，假设通过诱导肥大和总体心肌细胞成熟，营养不良hPSC-CM将经历更大的机械应力和细胞损伤，导致不规则的功能活性，这在未成熟细胞中是不存在的。使用nanoMEA平台记录暴露于对照或ComboMat条件的正常和DMD突变的hPSC-CM的等基因对的自发性搏动单层的电活性。使用依赖于搏动率变异性的心律失常检测方法26，观察到暴露于ComboMat平台的DMD突变的hPSC-CM比在对照条件下不太成熟的DMD突变的hPSC-CM明显更多的致心律失常。图5A显示暴露于对照或ComboMat条件的DMD突变的hPSC-CM的代表性场电位迹线，其中注释了单独的搏动间隔。通过测量从一次搏动到下一次搏动的搏动间隔的时间差(ΔBI)，并绘制连续的30次搏动的这种变化(图5B)，发现成熟的DMD突变的hPSC-CM在搏动速率方面具有显著的不稳定性。通过测量ΔBI>250ms的搏动百分比(图5C)和在连续的30次搏动中ΔBI的算术平均值(图5D)，观察到搏动间隔的相对大的变化指示更多的致心律失常性状态。在没有体外自主神经系统的情况下，hPSC-CM应形成稳定的搏动模式，而在搏动间没有太大的变化。这种稳定行为在正常和DMD心肌细胞的对照条件下以及在健康成熟的正常细胞是显而易见的(图5B)。重要的是，观察到完整的ComboMat平台对于观察正常和DMD突变的hPSC-CM之间的功能差异是必要的。当单独应用成熟线索时，在健康正常细胞和DMD突变的hPSC-CM之间没有区别(图10)。
为了鉴定这种搏动率变异性的潜在机制，在校准以计算纳摩尔细胞内Ca2+浓度的IonOptix成像装置上，使用比率测定Ca2+指示剂Fura-2测量细胞内钙(Ca2+)。图5E描述了暴露于对照或ComboMat条件的DMD突变的hPSC-CM的代表性Ca2+迹线。与对照组中不太成熟的细胞相比，发现成熟的DMD突变的hPSC-CM具有升高的基线或舒张期静息Ca2+水平。如先前所述，对该舒张期Ca2+水平进行量化，观察到与电不稳定性类似的趋势。对照组中的正常和DMD突变的hPSC-CM具有彼此没有统计学差异的细胞溶质Ca2+水平(图5F)。然而，与正常hPSC-CM相比，使用ComboMat平台成熟的DMD突变的hPSC-CM具有升高的细胞溶质Ca2+浓度。
使用成熟的hPSC-CM进行的表型药物筛选
为了鉴定用于更详细的表型药物筛选的潜在药物靶标或药物类别，用具有各种作用机制的2,000种不同分子的小库进行初步的中等通量，半自动筛选。在低渗应激后在DMD突变的hPSC-CM中测量细胞内ATP(在高通量筛选中广泛使用的细胞活力测定)。总体而言，测定的Z-质(Z-prime)为0.71。对8,000个数据点(4种浓度的2,000种化合物)进行排序，并基于Z得分作图(图6A)。考虑到Z得分排序(>3)、重复的标准差和剂量范围递增反应，从2000个输入化合物中鉴定出39个命中(～2％命中率)(表2)。在这些命中中，9(约23％)个命中被分类为Ca2+通道阻断剂。
表2：初步筛选命中。
Figure BDA0002442379050000571
Figure BDA0002442379050000581
Figure BDA0002442379050000591
将这种初步药物筛选数据与细胞内Ca2+含量升高的发现结合(图5F)，利用nanoMEA平台测试尼群地平(在图6A中用蓝色框突出显示)，即二氢吡啶Ca2+通道阻断剂，是否能够降低成熟DMD突变的hiPSC-CM的致心律失常性行为。还测试了先前证明不能使DMD患者20受益的药剂西地那非。即使在早期时间点(四天ComboMat暴露)，成熟的正常hPSC-CM和DMD突变的hPSC-CM之间的基线搏动率变异性也存在显著差异，而未成熟细胞彼此不可区分(图6A)。
将细胞暴露于各种浓度的尼群地平或枸橼酸西地那非7天并测量其搏动率变异性。图6C-D分别显示尼群地平和西地那非的剂量反应曲线。与DMSO载体对照相比，尼群地平显著降低成熟DMD突变的hPSC-CM中的平均ΔBI。高达1μM尼群地平的剂量将搏动率变异性恢复至生理相关范围(<50ms)内的水平。然而，更高的剂量停止自发搏动。相比之下，无论剂量如何，西地那非对搏动率变异性没有影响。尼群地平和西地那非对暴露于对照条件的细胞或暴露于ComboMat平台的正常hPSC-CM的细胞的搏动率变异性都没有显著影响。如果从细胞培养基中去除，则尼群地平的益处在48小时内被洗净(图6E)。Ca2+成像显示，与DMSO对照相比，100nM尼群地平降低成熟DMD突变的hPSC-CM中的舒张期Ca2+含量(图6F-G)。尼群地平对暴露于对照条件的细胞中的舒张期Ca2+含量没有影响(图6g)。
讨论
ComboMat平台被证明是调节体外心肌细胞发育、增加细胞面积、产生更长的静息肌节长度和获得更多生理学相关的双核形成百分比的有力工具。通过RNAseq分析预测从ComboMat平台观察到的许多功能增强。肌肉发育和收缩的GO术语在ComboMat组中上调，这导致通过CCQ收缩映像测量的更快的收缩动力学。代谢GO术语如脂肪酸输入也在ComboMat组中上调，随后观察到暴露于ComboMat组的细胞具有较大的最大呼吸能力和利用外源脂肪酸的能力。因此，在ComboMat平台赋予的转录和功能变化之间达成了一致，从而证实了本文提供的方法。
本文所述方法的一个重要方面是开发成功的表型药物筛选平台。可以将诸如ComboMat平台的方法与nanoMEA电生理学筛选系统相结合进行放大，以用于新化合物的较高通量筛选。非侵入性测量可用于纵向监测细胞功能，并且疾病表型的强分层允许容易地与健康对照比较，以查看药物治疗是否与功能恢复相关。在筛选中证实了重要的Ca2+通道阻断剂并且可以从mdx小鼠模型研究中排除假阳性药物命中20。
先前的营养不良心肌病的hPSC-CM模型严重依赖于低渗激发以产生可测量的疾病表型11,23。虽然有效，但低渗激发在生理学上并不准确且仅是短暂的损害。因此，通过用ComboMat平台使DMD突变的hPSC-CM成熟，细胞存在部分由于钙过载而导致的搏动率变异性。随着通过活性氧(ROS)和线粒体细胞凋亡信号传导途径参与介导细胞损伤27，Ca2+过载长期以来已知介导心律失常28，并且在体外和体内都涉及作为DMD病理生理学背后的驱动力29。因此，已经证明DMD突变的hPSC-CM中的成熟依赖性疾病表型再创造了在患者中存在的早期疾病表型。这是与先前的DMD疾病模型和代表心脏疾病建模领域中的合理进展的模型的重要区别。Wen等人还报道了在致心律失常性右心室发育不良的hPSC-CM模型中需要成熟以产生疾病表型30，以及Tiburcy等人证明了经由长期儿茶酚胺刺激的成熟提高了它们模拟心力衰竭的能力31。基于这些发现，通过使用本文所述的方法和组合物，使用标准定向分化方法的典型胎儿阶段以外成熟hPSC-CM，可以忠实地模拟其它心肌病。
尽管已知DMD患者表现出舒张功能障碍和心律失常，但这种疾病表型的发病机理尚未完全理解18。Ca2+超载长期以来被认为在营养不良性心肌病的病理生理学中起重要作用29。细胞膜和肌浆网上的泄漏的Ca2+通道、异常的NO信号传导和肌膜中的泪液均被提出作为Ca2+进入细胞的手段，但目前尚无共识。具有由于升高的Ca2+水平而导致的内源性电生理学疾病表型的本模型，被证明是解决这些问题中的一些的有价值的工具。总之，目前的数据显示心脏成熟是精确模拟成年发作疾病(如DMD心肌病)的重要因素，并且ComboMat平台在产生更成熟的hPSC-CM中是必不可少的。此外，nanoMEA平台可结合使用以有效地筛选潜在的治疗靶标。
实施例2：方法
实验组
对暴露于以下三种成熟线索的所有不同组合的细胞进行RNAseq：NP、T3和Let7i。包括空载体(EV)阴性对照用于病毒暴露。对于所有其它测定，将完整的ComboMat平台(Let7i+NP+T3)与病毒载体对照(EV+平面+无T3)和每种单独的成熟线索NP(EV+NP+无T3)、T3(EV+平面+T3)和Let7i(Let7i+平面+无T3)进行比较。ComboMat平台利用纳米形貌基底线索、甲状腺激素T3和在培养期间特定时间点的Let-7i微RNA(miR)过表达来诱导hPSC-CM的高级结构和表型发育。选择每种线索来影响hPSC-CM发展的特定方面。纳米形貌基底线索已显示促进初级和hPSC-CM的结构成熟14,32。然而，这些生物物理线索对hPSC-CM的代谢发育影响最小。因此，引入甲状腺激素T3作为生化线索以促进hPSC-CM的代谢、钙处理和收缩性能16。但是，初步结果发现长期T3暴露对肌节发育和搏动率变异性有负面影响(图11)，让人联想到甲状腺机能亢进的并发症。为了抵消这些有害作用，使用miR如Let7家族操纵转录物组。除了改善代谢能力、肥大和遗传特性外17，Let7i还有助于调节作为许多核受体(包括甲状腺激素受体)的转录共阻抑物的毛发生长相关基因的表达。
hiPS细胞系的产生和维持
如前所述11，正常尿衍生的人诱导的多能干细胞(hiPSC)获自IRB批准的方案。简言之，使用编码人Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc33的多顺反子慢病毒载体将从清洁收集尿液样品中收集的细胞重编程为iPSC。对衍生的hiPSC系(UC3-4)进行核型分析，并且显示为正常46，XY核型。在Matrigel包被的组织培养塑料上培养hiPSC，供给mTeSR培养基(StemCellTechnologies)，并使用1.9U/mL分散酶(Dispase)(ThermoFisher)传代。在低氧条件下，在37℃，5％CO2和5％O2下培养细胞。使用CRISPR-Cas9技术产生DMD突变的hiPSC(UC1015-6)，以从正常亲本系UC3-4产生同基因对。简言之，将靶向人肌养蛋白的第一个肌肉特异性外显子的指导序列用于删除肌养蛋白基因的第263位的单个G碱基以产生突变的等位基因(图7)。经由测序证实肌养蛋白基因的突变。以与正常UC3-4亲本系相同的方式维持DMD突变的hiPSC。
心脏定向分化和细胞培养
如前所述22，使用基于单层的定向分化方案。使用Versene(ThermoFisher)将hiPSC解离成单细胞，并以在mTeSR中的高密度(250,000个细胞/cm2)涂铺到Matrigel包被的板上。一旦形成单层，用含1μM Chiron 99021(Stemgent)的mTeSR处理细胞，直到用含100nM活化素-A(R&D Systems)的RPMI 1640(ThermoFisher)溶液诱导，所述RPMI 1640补充有B27减去胰岛素(RPMI/B27/Ins-)，并在第0天切换到常氧条件(37℃，5％CO2，环境O2)。18小时后，向细胞供给含5ng/mL BMP4(R&D Systems)+1μM Chiron 99021的RPMI/B27/Ins-培养基。在诱导后第3天，向细胞供给含1μM Xav 939(Tocris)的RPMI/B27/Ins-培养基。在诱导后第5天，向细胞供给新鲜的RPMI/B27/Ins-培养基。在诱导后第7天，将细胞转换到含有胰岛素的RPMI-B27培养基中，并且每隔一天更新培养基(RPMI/B27/Ins+)。对于T3处理组，将20ng/mlT3新鲜加入到RPMI/B27/Ins+中。
Let7i miRNA的慢病毒转导和心肌细胞的纯化
在Kuppusamy等人的文献中可以找到Let7i过表达(OE)构建体的创建的完整描述17。Let7i的对照载体是在U6启动子下的eGFP表达pLKO.1 TRC载体(Addgene)。在pLKO.1TRC载体的AgeI和EcroRI位点之间克隆eGFP构建体。为了产生慢病毒颗粒，在转染前1天将293FT细胞涂铺。在转染当天，将293FT细胞与psPAX2(Addgene#12260)、pMD2.G(Addgene#12259)载体和聚乙烯亚胺(PEI)共转染。24小时后更换培养基，然后24小时和48小时后收获慢病毒颗粒。使用PEG-it病毒沉淀溶液(5x)(System Biosciences)浓缩慢病毒颗粒。
在诱导后第15天，在37℃下，用含有钙和10U/mL DNA酶的DPBS中的10U/mL I型胶原酶解离hiPSC-CM的搏动单层1小时。然后收集细胞，离心，并重悬于含有10U/mL DNA酶的TrypLE(ThermoFisher)中保持5分钟。使用P1000微量移液器研磨TrypLE中的hiPSC-CM团块，直至获得单细胞。然后将细胞以100,000个细胞/cm2涂铺在Matrigel包被的板上。第二天，通过在RPMI/B27/Ins+培养基中存在海美溴铵(聚凝胺(Polybrene)，6μg/ml)的情况下稀释病毒过夜来进行细胞的病毒转导。第二天用PBS洗涤细胞并更换RPMI/B27/Ins+。
然后通过向细胞供应含有2％马血清和4mM乳酸盐的不含葡萄糖、丙酮酸钠或谷氨酰胺(ThermoFisher)的DMEM，持续三天而不更换培养基，通过代谢激发34纯化心肌细胞。进行心脏纯度的流式细胞术以证实高纯度样品(图12)。然后，将hiPSC-CM切换回含有2μg/mL嘌呤霉素二盐酸盐的RPMI/B27/Ins+培养基中，保持3天，以选择成功转导的hiPSC-CM。
纳米图案化的基底和nanoMEA的制造
如前所述35，经由毛细管力光刻制造纳米图案化的基底。通过将液体PUA预聚物滴加分配到具有预期纳米形貌几何形状(800nm宽的脊和槽，具有600nm深度)的深离子蚀刻硅母模上以及将透明聚酯(PET)膜置于顶部来制造聚氨酯丙烯酸酯(PUA)母模。选择纳米图案尺寸以增强hPSC-CM的结构和功能(图13)。在高功率UV光源下固化之后，从硅母模上剥离PUA和PET膜以产生PUA母模。为了产生纳米图案化的细胞培养基底，将基于聚氨酯的可UV固化的聚合物(NOA76,Norland Optical Adhesive)滴加分配到经玻璃底漆(glass primer)处理的18mm，#1盖玻片(Fisher Scientific)上，并将PUA母模置于顶部。在用UV光源固化后，剥离PUA母模，留下纳米图案化表面(NP)。使用相同的方法制造对照平面基底，但是用未图案化的PET膜代替纳米图案化的PUA母版。
为了制备用于细胞培养的表面，用70％乙醇洗涤基于PU的NP和对照平面基底，用50W的氧等离子体处理5分钟，置于UV-C光源下保持1小时以灭菌，然后在37℃下与5μg/cm2人纤连蛋白(Life Technologies)一起温育24小时。将hPSC-CM以150,000个细胞/cm2的密度涂铺。
如美国专利第20160017268A1号中所述制造纳米图案化的MEA(nanoMEA)。简言之，经由溶剂介导的毛细管力光刻，将离子可渗透聚合物全氟磺酸(Sigma-Aldrich)图案化到商业多孔MEA板(Axion Biosystems)上。在细胞接种之前，对照平面或nanoMEA全氟磺酸表面用UV-C光灭菌，然后在37℃下与5μg/cm2人纤连蛋白(Life Technologies)温育6小时。将hPSC-CM以液滴方式以25,000个细胞/孔的MEA板进行涂铺。
免疫荧光成像和形态学分析
在ComboMat平台三周后，通过在室温下在4％多聚甲醛(Affymetrix)中固定15分钟制备用于免疫荧光分析的细胞。然后用含0.1％Triton X-100(Sigma-Aldrich)的PBS透化样品，并用5％山羊血清封闭。然后将细胞与在1％山羊血清中的小鼠抗α-辅肌动蛋白单克隆抗体(1:1000,Sigma-Aldrich)一起在4℃温育过夜。用PBS洗涤后，用Alexa-594缀合的山羊-抗-小鼠第二抗体(1:200,Invitrogen)以及Alexafluo 488标记的鬼笔环肽(Phalloidin)(1:200,Invitrogen)对样品进行染色。用含有DAPI的Vectashield(VectorLabs)进行细胞核复染。使用具有Nikon CFI PlantApo VC 60x水浸物镜的NikonA1R共焦显微镜捕获用于肌节分析的详细免疫荧光图像，同时使用20x空气物镜来获得用于测量细胞双核形成百分比的细胞的低倍图像。使用来自两个客观物镜的细胞来测量细胞大小。对于形态学和肌节分析，将hPSC-CM以10,000个细胞/cm2涂铺。对于每种条件，将至少三个生物样本涂铺，其中每个样本成像至少7个细胞。
量化肌节分析
使用MATLAB(Mathworks)中的扫描梯度/傅立叶变换脚本量化免疫荧光图像的肌节排列、模式强度和肌节长度。将每个图像分成几个小的区段，分别进行分析。使用方向导数，计算每个区段的图像梯度以确定肌节的局部排列。然后通过计算在梯度方向上的一维傅立叶变换的最大峰来确定图案强度。通过测量沿该相同梯度方向的肌节的强度分布来计算肌节的长度。强度分布与它们的平均值交叉的频率允许精确地计算每个图像区段内的局部肌节长度。一旦完成，该分析允许肌节图案的无偏亚细胞分辨率作图，甚至在缺乏纳米形貌提供的排列线索的细胞中亦如此。
钙成像
如前所述36，使用比率指示染料fura2-AM测量细胞内钙含量。简言之，在37℃下，将细胞在含0.2μM fura2-AM染料的Tyrode溶液中温育20分钟，并用PBS洗涤。然后用与Nikon倒置荧光显微镜耦合的Ionoptix Stepper开关系统来监测自发的Ca2+瞬变。使用40xOlympus物镜获得荧光信号，通过510nm滤光器，并使用光电倍增管量化该信号。在IonOptix软件IonWizard中使用以下公式量化舒张期静息钙浓度：
Figure BDA0002442379050000651
其中
Kd＝fura2钙解离常数＝225nM
Rmax和Rmin＝分别在饱和钙水平下以及在不存在钙的情况下测量的比值。
Sf2/Sb2＝分别在零以及饱和钙溶液中背景减去波长2激发的荧光之间的比率。
电子显微镜和超微结构分析
在ComboMat平台下3周后，在室温下，将hiPSC-CM在含4％戊二醛的二甲胂酸钠缓冲液中固定2小时，用于透射电子显微镜(TEM)分析。然后在缓冲液中洗涤样品，并在冰上于缓冲的1％四氧化锇中染色30分钟。然后，将样品在水中洗涤，并在分级系列的乙醇中脱水。然后通过1:1的乙醇：Epon-Araldite环氧树脂的渗透，随后通过两次改变纯的Epon-Araldite来处理样品。此时，将第二盖玻片置于60℃烘箱中的样品的顶部用于聚合。第二天，使用氢氟酸溶解盖玻片，并将样品封装在块上进行切片。在用JEOL JEM 1200EXII在80kV下成像之前，将单细胞的超薄(70-80nm)轴向切片与柠檬酸铅对比(contrasted)。使用ImageJ(National Institutes of Health)来测量Z带宽度，定义为肌节结构内连续电子致密带的宽度。
MEA电生理学分析
使用AxIS软件(Axion Biosystems)收集自发搏动的心肌细胞的电生理学分析，持续2分钟。在原始数据收集之后，使用巴特沃斯(Butterworth)带通滤波器和90μV尖峰检测阈值(spike detection threshold)对信号进行滤波。使用多项式拟合T波检测算法自动确定场电位持续时间。如先前公布的26，对连续30次搏动进行搏动间隔分析(参见表3)。
表3：搏动间隔分析参数。
Figure BDA0002442379050000661
Figure BDA0002442379050000671
线粒体功能测定
如先前公布的17，使用Seahorse XF96细胞外流量分析仪测量细胞代谢功能。用ComboMat平台处理3周后，用胰蛋白酶消化细胞，并以每孔30,000个细胞的密度重新涂铺到纤连蛋白包被的(5μg/cm2)XF96板上。在重新涂铺到XF96板后3天，进行MitoStress和棕榈酸酯测定。在实验前1小时，用补充有丙酮酸钠(Gibco/Invitrogen,1mM)和25mM葡萄糖(对于MitoStress测定)或者含0.5mM肉碱的25mM葡萄糖(对于棕榈酸酯测定)的Seahorse XF测定培养基替换RPMI/B27/Ins+培养基。对于MitoStress测定，在测量期间应用底物和抑制剂的注入以实现1μM的4-(三氟甲氧基)苯基腙(FCCP；Seahorse Biosciences)、寡霉素(2.5μM)、抗霉素(2.5μM)和鱼藤酮(2.5μM)的终浓度。对于棕榈酸酯测定，在测量期间应用底物和抑制剂的注入以实现200mM棕榈酸酯或33μM BSA的终浓度。将OCR值进一步归一化为存在于各孔中的细胞数，通过使用在355nm激发和460nm发射下的荧光测量的Hoechst染色(Hoechst 33342；Sigma-Aldrich)量化。MitoStress测定中的基础呼吸被定义为寡霉素添加之前的OCR，而最大呼吸能力被定义为寡霉素添加之后OCR对响应于来自OCR的FCCP的变化。外源脂肪酸利用被定义为棕榈酸酯添加后OCR相对于基线的最大变化。
收缩分析
使用基于视频的收缩分析算法(被称为基于相关的收缩量化(CCQ))，利用粒子图像测速和数字图像相关算法37来跟踪来自先前公开22的亮场视频记录的细胞的运动。诸如收缩幅度、速度和角度的功能输出作为每个视频帧的矢量场输出，并且可以在空间或时间上进行平均。简言之，参考帧被划分为具有设定大小的窗口的网格。为了跟踪运动，每个窗口通过比较第二帧的相关方案运行，提供该窗口在第二帧中的位置。所使用的相关方程提供了具有概率性质的高斯相关峰值，该概率性质提供了子像素精度。用Nikon相机以20x放大率和30帧/秒拍摄用于该分析的视频。
RNA-seq分析
使用Trizol(Thermo Fisher Scientific)从RUES2 hESC-CM中提取总RNA。使用Tophat(PMID:19289445,版本2.0.13)，将RNA-seq样品与hg19进行比对。使用EnsemblGRCh37基因注释，使用htseq-计数(PMID:25260700)量化基因水平读取计数。保留RNA-seq样品中总表达高于3个RPKM的基因用于进一步分析。使用来自R的princomp函数进行主成分分析。DESeq(PMID:20979621)用于差异基因表达分析。倍数变化>1.5的基因被认为是差异表达的。topGO R包装(PMID:16606683)用于基因本体富集分析。
对于途径富集的热图，将每种条件与对照(EV-平面)条件进行比较，并鉴定上调基因(>1.5倍变化)和下调基因(<-1.5倍变化)。分别对上调和下调的基因进行超几何测试，以富集对心脏成熟有益的一组策划的途径，从而产生了m×n矩阵，其中m是途径的数目(m＝7)，并且n是条件的数目(n＝10)。计算上调和下调的基因的富集p值之间的比率的负log10以代表处理的总体净“益处”：大的正值(>0)意指处理导致心脏成熟途径中基因的上调多于这些基因的下调，并且大的负值意指处理导致心脏成熟途径中基因的更多下调。
流式细胞术
在乳酸盐纯化和嘌呤霉素选择之前和之后，将细胞解离并制备用于流式细胞术以确定选择效率。首先将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟。然后用0.75％皂苷使细胞透化，并在含有5％FBS的PBS中用1:100小鼠抗cTnT或同种型对照小鼠IgG抗体染色。使用Alexa-488缀合的山羊-抗-小鼠二级抗体(1:200,Invitrogen)进行可视化。在BD Sciences FACSCanto流式细胞仪上运行样品，并用FlowJo软件分析。
高通量药物筛选
分化后14天，通过在TrypLE(Life Technologies)中温育5分钟，将心肌细胞解离成单细胞悬液，并以10,000个细胞/孔涂铺在不透明底部的384孔板(Nunc)上，所述孔板为在37℃下用1mg/mL Matrigel(Corning)预包被1小时。然后将细胞在384孔板上再培养16天，每72小时更换一次培养基。15天后，使用CyBi Well Vario 384/25液体处理器(Cybio,Germany)将溶解在DMSO中的化合物分配到板中，以一式两份获得10-8、10-7、10-6、10-5M的浓度。温育18小时后，吸出培养基并使用BioTek EL406 Washer Dispenser(BioTek,Winooski,VT)注入纯水以达到12.5％的正常渗透压。30分钟温育后，去除上清液，并通过根据制造商的说明添加CellTiter Glo(Promega)来测定平板。5分钟后，使用EnVisionMultilable Resaer(PerkinElmer)测量发光。通过Tibco Spotfire(Tibco Spotfire,Boston,MA)处理所有数据并使其可视化。通过将来自每个孔的信号与单独用DMSO处理的对照孔的平均值(32个对照孔/板)进行比较来计算活力百分比。
统计分析
除非另有说明，否则使用来自SigmaPlot软件的图基成对事后(Tukey's pairwisepost hoc)分析，使用单向或双向方差分析来确定群组之间的统计学显著性。对于所有统计分析，p值小于0.05被认为是显著的。误差条代表平均值的标准误差(SEM)。
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序列
SEQ ID NO:1
CTGGCTGAGG TAGTAGTTTG TGCTGTTGGT CGGGTTGTGA CATTGCCCGCTGTGGAGATAACTGCGCAAG CTACTGCCTT GCTA
SEQ ID NO:2
CTGGCTGAGG TAGTAGTTTG TGCTGTTGGT CGGGTTGTGA CATTGCCCGCTGTGGAGATAACTGCGCAAG CTACTGCCTT GCTAG
SEQ ID NO:3
CTGGCTGAGG TAGTAGTTTG TGCTGTTGGT CGGGTTGTGA CATTGCCCGCTGTGGAGATAACTGCGCAAG CTACTGCCTT GCT
SEQ ID NO:4
GGGCCCTGGC TGAGGTAGTA GTTTGTGCTG TTGGTCGGGT TGTGACATTGCCCGCTGTGGAGATAACTGC GCAAGCTACT GCCTTGCTAG TG
SEQ ID NO:5
CUGGCUGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUUGGUCGGGUUGUGACAUUGCCCGCUGUGGAGAUAACUGCGCAAGCUACUGCCUUGCUAG
SEQ ID NO:6
UGAGGUAGUAGUUUGUGCU
SEQ ID NO:7
UCTCCUTCUTCUUUCUCGU
SEQ ID NO:8(SEQ ID NO:6的反向互补物)
UGCUCUUUCTUCTUCCTCU
SEQ ID NO:9(SEQ ID NO:6的反向序列)
UCGUGUUUGAUGAUGGAGU
SEQ ID NO:10
UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
SEQ ID NO:11
UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU
SEQ ID NO:12
UGAGGUAGUAGGUUGUAUGGUU
SEQ ID NO:13
AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGU
SEQ ID NO:14
UGAGGUAGGAGGUUGUAUAGU
SEQ ID NO:15
UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU
SEQ ID NO:16
UGAGGUAGUAGUUUGUACAGU
SEQ ID NO:17
UGAGGUAGUAGUUUGUGCU
SEQ ID NO:18
ATGCTTTGGTGGGAAGAAGTAGAGGACTGTT
SEQ ID NO:19
ATGCTTTGGTGGGAAGAATAGAGGACTGTT

Claims (57)

1.制备干细胞衍生的心肌细胞的方法，所述方法包括使干细胞衍生的心肌细胞与以下接触：
a.纳米图案化的基底；
b.甲状腺激素T3；和
c.Let7i微RNA。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米图案化的基底包括具有基本上平行的槽和脊的阵列的纳米图案化的表面。
3.如权利要求2所述的方法，其中每个槽或脊的尺寸在长度、宽度或高度上小于1000纳米。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述槽和脊的宽度为800nm，并且所述槽的深度为600nm。
5.如权利要求1所述的方法，其中由所述干细胞衍生的心肌细胞表达Let7i微RNA。
6.如权利要求1所述的方法，其中使所述心肌细胞与Let7i微RNA接触的步骤包括使所述干细胞衍生的心肌细胞与病毒载体接触。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞衍生的心肌细胞是人心肌细胞。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞衍生的心肌细胞由诱导的多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞分化。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞衍生的心肌细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述干细胞衍生的心肌细胞是遗传修饰的。
11.如权利要求10所述的方法，其中在与编码Let7i微RNA的载体接触后，所述心肌细胞与纳米图案化的基底和甲状腺激素T3接触。
12.如权利要求1所述的方法，其中当与所述纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i微RNA接触之前的干细胞衍生的心肌细胞相比，所得的干细胞衍生的心肌细胞具有更成熟的心肌细胞表型。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米图案化的基底包括允许电刺激和/或测量心肌细胞电生理学特性的微电极阵列。
14.使干细胞衍生的心肌细胞成熟的方法，所述方法包括使干细胞衍生的心肌细胞与以下接触：
a.纳米图案化的基底；
b.甲状腺激素T3；和
c.Let7i微RNA。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述纳米图案化的基底包括具有基本上平行的槽和脊的阵列的纳米图案化的表面。
16.如权利要求15所述的方法，其中每个槽或脊的尺寸在长度、宽度或高度上小于1000纳米。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述槽和脊的宽度为800nm，并且所述槽的深度为600nm。
18.如权利要求14所述的方法，其中由所述干细胞衍生的心肌细胞表达Let7i微RNA。
19.如权利要求14所述的方法，其中使所述心肌细胞与Let7i微RNA接触的步骤包括使所述干细胞衍生的心肌细胞与病毒载体接触。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述干细胞衍生的心肌细胞是人心肌细胞。
21.如权利要求14所述的方法，其中所述干细胞衍生的心肌细胞由诱导的多能干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞分化。
22.如权利要求14所述的方法，其中所述干细胞衍生的心肌细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象。
23.如权利要求14所述的方法，其中所述干细胞衍生的心肌细胞是遗传修饰的。
24.如权利要求23所述的方法，其中在与编码Let7i微RNA的载体接触后，所述心肌细胞与纳米图案化的基底和甲状腺激素T3接触。
25.如权利要求14所述的方法，其中当与所述纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i微RNA接触之前的干细胞衍生的心肌细胞相比，所得的干细胞衍生的心肌细胞具有更成熟的心肌细胞表型。
26.如权利要求14所述的方法，其中所述纳米图案化的基底包括允许电刺激和/或测量心肌细胞电生理学特性的微电极阵列。
27.评价药剂的心脏毒性的方法，所述方法包括使通过权利要求1或权利要求14所述的方法制备的干细胞衍生的心肌细胞与所述药剂接触。
28.如权利要求27所述的方法，其还包括检测所述心肌细胞的至少一种表型特征。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述药剂选自小分子、抗体、肽、基因组编辑系统和核酸。
30.如权利要求27所述的方法，其中药剂的心脏毒性通过所述药剂对以下一种或多种的影响来指示：细胞活力、细胞大小、肌节长度、组织内肌节的组织、干细胞衍生的心肌细胞群的生物电位或电特性、线粒体功能、基因表达、搏动速率、搏动强度和收缩性。
31.用于鉴定调节心肌细胞的功能特性的药剂的测定，所述测定包括：
a.使通过权利要求1或权利要求14所述的方法制备的干细胞衍生的心肌细胞群与候选药剂接触；以及
b.检测所述心肌细胞的至少一种功能特性，
其中在接触步骤(a)后检测到所述心肌细胞的至少一种功能特性的变化将所述药剂鉴定为能够调节心肌细胞的功能特性的药剂。
32.如权利要求31所述的测定，其中检测步骤(b)包括检测以下特性中的至少一种：细胞活力、细胞大小、肌节长度、组织内肌节的组织、生物电位或电特性、线粒体功能、基因表达、搏动速率、搏动强度和收缩性。
33.疾病模型，其包含通过权利要求1或权利要求14所述的方法制备的干细胞衍生的心肌细胞，其中所述干细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象，或者其中对所述干细胞衍生的心肌细胞或衍生所述心肌细胞的干细胞进行遗传修饰，使得所述心肌细胞表达疾病表型。
34.如权利要求33所述的疾病模型，其中所述肌肉疾病或病症具有心脏功能障碍的表型。
35.如权利要求33所述的疾病模型，其中所述肌肉疾病或病症的特征在于所述心脏表型的成年发作。
36.如权利要求33所述的疾病模型，其中所述肌肉疾病或病症是杜氏肌营养不良。
37.组合物，其包含在纳米图案化的基底上的干细胞衍生的心肌细胞，所述组合物还包含甲状腺激素T3和Let7i微RNA。
38.如权利要求37所述的组合物，其中所述干细胞衍生的心肌细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象。
39.如权利要求37所述的组合物，其中所述心肌细胞是人心肌细胞。
40.如权利要求37所述的组合物，其中对所述干细胞衍生的心肌细胞或衍生所述心肌细胞的干细胞进行遗传修饰，使得所述干细胞衍生的心肌细胞表现出心脏功能障碍表型。
41.组合物，其包含通过使体外分化的心肌细胞与纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i微RNA接触而制备的心肌细胞，其中与未与所述纳米图案化的基底、甲状腺激素T3和Let7i微RNA接触的体外分化的心肌细胞相比，所述心肌细胞具有更成熟的表型。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述心肌细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象。
43.如权利要求41所述的组合物，其中对所述体外分化的心肌细胞或分化为所述心肌细胞的干细胞进行遗传修饰，使得它们表现出心脏功能障碍表型。
44.试剂盒，其包含干细胞衍生的心肌细胞、纳米图案化的基底、甲状腺激素T3、编码Let7i微RNA的载体及其包装材料。
45.如权利要求44所述的试剂盒，其还包含细胞培养基和允许从所述干细胞衍生的心肌细胞制备成熟的体外分化的心肌细胞的说明书。
46.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述纳米图案化的基底包括具有基本上平行的槽和脊的阵列的纳米图案化的表面。
47.如权利要求46所述的试剂盒，其中每个槽或脊的尺寸在长度、宽度或高度上小于1000纳米。
48.如权利要求46所述的试剂盒，其中所述槽和脊的宽度为800nm，并且槽的深度为600nm。
49.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述干细胞衍生的心肌细胞是人的。
50.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述干细胞衍生的心肌细胞来源于患有肌肉疾病或病症的对象。
51.如权利要求44所述的试剂盒，其中所述干细胞衍生的心肌细胞是冷冻的。
52.制备干细胞衍生的心肌细胞的方法，所述方法包括使干细胞衍生的心肌细胞与以下接触：
a.纳米图案化的基底，其包括基本上平行的槽和脊的阵列，其中所述槽和脊的宽度为800nm，并且所述槽的深度为600nm；
b.甲状腺激素T3；和
c.Let7i微RNA。
53.组合物，其包含在纳米图案化的基底上的干细胞衍生的心肌细胞，所述组合物还包含：
a.纳米图案化的基底，其包括基本上平行的槽和脊的阵列，其中所述槽和脊的宽度为800nm，并且所述槽的深度为600nm；
b.甲状腺激素T3；和
c.Let7i微RNA。
54.如权利要求1-32和53中任一项的方法，其中所述纳米图案化的基底包括弹性基底，其允许对其上培养的心肌细胞进行机械刺激，并且其中所述方法还包括使所述心肌细胞经受这种机械刺激。
55.如权利要求38-41或54中任一项所述的组合物，或者如权利要求45-52中任一项所述的试剂盒，其中所述纳米图案化的基底包括弹性基底，其允许对其上培养的心肌细胞进行机械刺激。
56.如权利要求43-51中任一项所述的试剂盒，其中所述心肌细胞在所述纳米图案化的基底上。
57.如权利要求43-51和57中任一项所述的试剂盒，其允许在室温至4℃的温度下运输。
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