WO2021187380A1 - 不整脈源性心筋症患者由来の多能性幹細胞およびその利用ならびに不整脈源性心筋症治療用医薬 - Google Patents

不整脈源性心筋症患者由来の多能性幹細胞およびその利用ならびに不整脈源性心筋症治療用医薬 Download PDF

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WO2021187380A1
WO2021187380A1 PCT/JP2021/010137 JP2021010137W WO2021187380A1 WO 2021187380 A1 WO2021187380 A1 WO 2021187380A1 JP 2021010137 W JP2021010137 W JP 2021010137W WO 2021187380 A1 WO2021187380 A1 WO 2021187380A1
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pluripotent stem
ipsc
stem cell
mutation
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修一朗 肥後
俊吾 彦惣
繁 宮川
芳樹 澤
泰史 坂田
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国立大学法人大阪大学
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to pluripotent stem cells derived from patients with arrhythmogenic cardiomyopathy, their utilization, and pharmaceuticals for treating arrhythmogenic cardiomyopathy.
  • Arrhythmogenic cardiomyopathy (hereinafter also referred to as "AC") is a group of diseases mainly caused by gene mutations, resulting in ventricular arrhythmia and decreased myocardial contractility.
  • arrhythmogenic right Ventricular Cardiomyopathy (Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy), which is a rare intractable disease that mainly presents thinning of the right ventricular myocardium and dilation of the ventricles and causes fatal arrhythmias such as ventricular tachycardia and ventricular fibrillation, It was also recognized as "ARVC”), but since many cases of left ventricular dysfunction have been reported, it has come to be comprehensively recognized as AC in recent years (Non-Patent Document 1).
  • PGP2 plakophilin-2
  • PKP2 gene knockout mice cause myocardial structural abnormalities and ventricular wall rupture during the embryonic period, and PKP2 has been shown to be an important factor in cardiac formation (Non-Patent Document 2).
  • iPSCs Diseased iPS cells
  • AC patients with PKP2 mutations and comparing cardiomyocytes differentiated from iPSCs derived from AC patients with cardiomyocytes differentiated from iPSCs derived from healthy subjects, iPSCs derived from AC patients It has been reported that differentiated cardiomyocytes cause a decrease in intercalated disc-related proteins, abnormal lipid droplet deposition, an extension of the active potential rise time, an increase in PPAR ⁇ expression, and the like (Non-Patent Document 3-5).
  • desmosome is localized in the intercalated disc and works to maintain the cell structure in many organs including the heart.
  • the desmoglein cadherin gene that constitutes desmosome contains four desmogleins (DSG1-4) and three desmocollins (DSC1-3), but DSG2 and DSC2 are specifically expressed in human and mouse heart tissues. Genetic mutations in these molecules primarily cause hereditary cardiomyopathy, including AC. Mice completely deficient in DSG2 are embryonic lethal, and heart-specific DSG2 knockout mice exhibit dilated cardiomyopathy-like phenotype with ventricular enlargement, cardiomyocyte death, and interstitial fibrosis. Has been reported (Non-Patent Documents 6 and 7).
  • Non-Patent Document 8 There have been no reports of homozygous mutations in DSG2. Furthermore, there are no reports demonstrating the reproduction of cardiomyopathy pathology by DSG2 gene mutation using human iPS-differentiated myocardium or the therapeutic concept by introducing DSG2 molecule into human iPS-differentiated myocardium.
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for arrhythmogenic cardiomyopathy caused by a gene mutation.
  • the present invention is a pluripotent stem cell established from a patient with arrhythmogenic myocardial disease caused by a gene mutation, a pluripotent stem cell having the same genetic background as the pluripotent stem cell and having a zygotic mutation different from that of the patient.
  • An object of the present invention is to provide a pluripotent stem cell, a pluripotent stem cell having the same genetic background as the pluripotent stem cell and having a mutated gene modified to a normal gene.
  • a further object of the present invention is to provide a screening method for a therapeutic agent for arrhythmia-producing cardiomyopathy using the pluripotent stem cells or cardiomyocytes differentiated from the pluripotent stem cells.
  • the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
  • Arrhythmia caused by gene mutation Arrhythmia containing a gene therapeutic agent as an active ingredient for delivering a normal gene corresponding to a gene having the gene mutation to the myocardial cells of a patient with myocardial disease and expressing a normal protein. A drug for the treatment of primordial myocardial disease.
  • Pluripotent stem cells established from cells of patients with arrhythmogenic cardiomyopathy caused by mutation of plakophilin 2 gene or desmoglein 2 gene.
  • the mutation of the desmoglein 2 gene is a homozygous stop gain mutation in which cytosine at position 355 is replaced with thymine in the nucleotide sequence of the human desmoglein 2 gene shown in SEQ ID NO: 4, according to the above [3].
  • Pluripotent stem cells [8] Pluripotent stem cells having the same genetic background as the pluripotent stem cells described in [7] above and having a heterozygous mutation in the human desmoglein 2 gene that causes arrhythmogenic cardiomyopathy. .. [9] A pluripotent stem cell having the same genetic background as the pluripotent stem cell according to the above [7], wherein the human desmoglein 2 gene is modified into a normal gene.
  • pluripotent stem cell Two or three types selected from the group consisting of the pluripotent stem cell according to the above [4], the pluripotent stem cell according to the above [5], and the pluripotent stem cell according to the above [6].
  • a set of pluripotent stem cells containing pluripotent stem cells [11] Two or three types selected from the group consisting of the pluripotent stem cell according to the above [7], the pluripotent stem cell according to the above [8], and the pluripotent stem cell according to the above [9].
  • a set of pluripotent stem cells containing pluripotent stem cells Two or three types selected from the group consisting of the pluripotent stem cell according to the above [7], the pluripotent stem cell according to the above [8], and the pluripotent stem cell according to the above [9].
  • a screening method for a therapeutic agent for arrhythmogenic cardiomyopathy using cells in which a step of contacting or introducing a test substance into the cells, a step of evaluating a phenotype reflecting arrhythmogenic cardiomyopathy in the cells, and a test.
  • a screening method comprising the step of selecting a test substance that improves arrhythmogenic cardiomyopathy as compared with the evaluation result of the phenotype in the cells to which the substance has not been contacted or introduced.
  • the present invention it is possible to provide a therapeutic drug for arrhythmogenic cardiomyopathy caused by a gene mutation.
  • a pluripotent stem cell established from a patient with arrhythmogenic myocardial disease caused by a gene mutation, having the same genetic background as the pluripotent stem cell and having a zygotic mutation different from that of the patient. It is possible to provide a pluripotent stem cell, a pluripotent stem cell having the same genetic background as the pluripotent stem cell and having a mutant gene modified to a normal gene.
  • the present invention can provide a method for screening a therapeutic agent for arrhythmia-producing cardiomyopathy using the pluripotent stem cells or cardiomyocytes differentiated from the pluripotent stem cells.
  • (A) is a family tree of patients (arrows), with squares indicating males and circles indicating females, and cases with ventricular arrhythmia indicated by black circles or black squares.
  • (B) is an echocardiographic view of the patient, the left is a short-axis image of the left ventricle of the parasternal bone, and the right is a cross-sectional image of the four cavities of the parasternal bone.
  • LV left ventricle
  • RV right ventricle
  • EF ejection fraction
  • LVDd / s left ventricle dilatation / contraction diameter
  • scale bar shows 20 mm. Direct Sanger sequence analysis was performed using genomic DNA extracted from the patient's peripheral blood, and gene mutations related to hereditary cardiovascular disease were screened.
  • a heterozygous frameshift mutation (1228dupG) of the PKP2 gene was found. It is a figure which shows that it was done. It is a figure (scale bar is 50 ⁇ m) showing the result of immunostaining of patient-derived iPS cells (hereinafter referred to as “iPSC”) with an antibody against pluripotent marker proteins (SSEA4, TRA-1-60, OCT4, NANOG). .. It is a figure which shows the result of the karyotype analysis of iPSC derived from a patient.
  • FIG. 5 shows a homologous recombinant repair (HDR) template structure with a 1035 bp 5'homology arm and a 497 bp 3'homology arm corresponding to the genomic sequence near exon 5 of the PKP2 gene.
  • ddPCR droplet digital PCR
  • the enlarged image in the white frame of the second image is shown in the lower two images.
  • the figure showing the results of immunostaining of HDR-iPSC-CM and NHEJ-iPSC-CM reseeded in 96-well plates on the 10th day after the start of differentiation induction with an anti-N-cadherin antibody on the 16th day (scale bar is 50 ⁇ m). ).
  • the enlarged image in the white frame of the second image is shown in the lower two images. It is a figure (scale bar is 500 ⁇ m) showing the result of observing Hetero-iPSC-CM and HDR-iPSC-CM re-sown on a 24-well plate 14 days after the start of differentiation induction on the 28th day.
  • PKP2 gene transfer experiment It is a figure which shows the scheme of the PKP2 gene transfer experiment.
  • the PKP2 gene was introduced via AAV2 on NHEJ-iPSC-CM reseeded on a 96-well plate on the 10th day after the start of differentiation induction, and with anti-FLAG antibody and anti-troponin T antibody on the 16th day.
  • scale bar is 50 ⁇ m.
  • the image on the right is an enlarged image in the white frame on the left.
  • the amount of viral genome used was 1.04 ⁇ 10 4 viral genomes (vg) / cell for AAV2-EGFP and 1.04 ⁇ 10 4 or 2.08 ⁇ 10 4 vg / cell for AAV2-PKP2.
  • the PKP2 gene or EGFP gene was introduced into NHEJ-iPSC-CM on the 10th day after the start of differentiation induction via AAV2, and the cell observation image (scale bar was 200 ⁇ m) on the 24th day and excitatory propagation by motion vector analysis. It is a figure which shows the image which converted into a color map, and the contraction speed (CV) and deformation distance (DD) calculated by motion vector analysis.
  • A shows the domain structure of desmoglein 2 (DSG2), and the 119th arginine exists in EC1 (extracellular cadherin domain 1).
  • B is a family tree of patients (arrows), with squares indicating males and circles indicating females, and cases with ventricular arrhythmia are shown in black.
  • (C) is a diagram showing the results of Sanger sequence analysis using genomic DNA of a patient (II-1) and a patient's parents (I-1, I-2). It is a figure (scale bar is 50 ⁇ m) showing the result of immunostaining the left ventricular myocardial tissue of a patient (II-1) having a homozygous C355T mutation and a patient with dilated cardiomyopathy (DCM control) with an anti-desmoglein 2 antibody. ..
  • the lower row is an enlarged image in the upper frame.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the result (scale bar is 500 nm) of the left ventricular myocardial tissue of a patient (II-1) having a homozygous C355T mutation and a patient with dilated cardiomyopathy (DCM control) observed with a transmission electron microscope.
  • A is the result of extracting RNA from patient-derived iPSC and iPSC prepared from healthy control subjects and measuring DSG2 mRNA by RT-PCR (ACTB is endogenous control), and
  • (B) is patient-derived.
  • (A) is a diagram (scale bar is 100 ⁇ m) showing the results of immunostaining (staining the nucleus with Hoechst) with anti-desmoglein 2 antibody after immobilizing R119X-iPSC and HDR-iPSC, and (B) is R119X-. It is a figure which shows the result of having collected the protein sample from iPSC and HDR-iPSC, and detected the expression of desmoglein 2 by Western blotting.
  • a three-dimensional self-assembled ring was prepared using cardiomyocytes induced to differentiate from R119X-iPSC (R119X-iPSC-CM) and cardiomyocytes induced to differentiate from HDR-iPSC (HDR-iPSC-CM), and a compression strength measuring device was used. It is a figure which shows the result of having measured the myocardial contractile force using, (A) is the result of a typical R119X-iPSC-CM, (B) is the result of a typical HDR-iPSC-CM, and (C) is the result.
  • the upper row is a bright-field image
  • the middle row is an image in which cells are fixed and immunostained with anti-troponin T antibody
  • the lower row is an image immunostained with anti-troponin T antibody (nucleus is stained with Hoechst)
  • R119X-iPSC-CM and HDR-iPSC-CM were reseeded on a 96-well plate, and 30 days later, the cells were fixed and observed with a transmission electron microscope. The scale bar is 1 ⁇ m).
  • R119X-iPSC-CM re-seeded on a 96-well plate 14 days after the start of differentiation induction was infected with AAV2-DSG2-cHA 4 days after re-seed to introduce the DSG2 gene, and cells were introduced 7 days after infection.
  • the figure shows the results of immunostaining with an anti-desmoglein 2 antibody (scale bar is 50 ⁇ m), and the upper row is R119X-iPSC-CM into which the DSG2 gene has not been introduced. 21 days after the start of differentiation induction, R119X-iPSC-CM was infected with 2.0 ⁇ 10 5 vg / cell or 6.0 ⁇ 10 5 vg / cell AAV2-DSG2-cHA to introduce the gene, and 7 days after infection, myocardial cells It is a figure which shows the result of having collected the protein sample from the cell, and analyzed the expression of desmoglein 2 by western blotting.
  • the results of infecting R119X-iPSC-CM 9 days after the start of differentiation induction with AV2-DSG2-cHA, re-seeding 14 days after the start of differentiation induction, and observing in a bright field 30 days after the start of differentiation induction are shown. It is a figure.
  • the upper row shows the desmoglein 2 positive area using high content imaging for images obtained by immunostaining Hetero-iPSC-CM and HDR-iPSC-CM with anti-desmoglein 2 antibody on the 14th day after the start of differentiation induction.
  • the upper row shows the wild-type allele-derived PCR product, and the lower row shows the allele-derived PCR product knocked in by tdTomato. This is the result of the direct sequence performed. It is a figure which shows the PKP2 gene mutation isogenic iPSC set which produces the established wild-type DSG2 and DSG2-tdTomato fusion transcript, respectively.
  • (A) is a diagram showing the results of western blotting using each lysate of DSG2-tdT-Hetero-iPSC, DSG2-tdT-HDR-iPSC, and DSG2-tdT-NHEJ-iPSC. It is the result of grain 2 antibody, anti-red fluorescent protein (RFP) antibody, anti-pracoglobin antibody, anti-pracophyllin 2 antibody, and anti-GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) antibody.
  • RFP red fluorescent protein
  • anti-pracoglobin antibody anti-pracophyllin 2 antibody
  • anti-GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • (B) is a diagram showing the results of fixing each cell of DSG2-tdT-Hetero-iPSC, DSG2-tdT-HDR-iPSC, and DSG2-tdT-NHEJ-iPSC and staining the nucleus with Hoechst (scale bar is 50 ⁇ m).
  • the figure shows the results of time-lapse imaging using DSG2-tdT-HDR-iPSC and DSG2-tdT-HDR-iPSC-CM 14 days after the start of differentiation induction.
  • the upper row is a bright field (BF) image
  • the lower row is a bright field (BF) image. It is a fluorescent image.
  • Results of immunostaining by immobilizing each cell of DSG2-tdT-Hetero-iPSC-CM, DSG2-tdT-HDR-iPSC-CM and DSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CM 14 days after the start of differentiation induction (Scale bar is 50 ⁇ m)
  • the upper row is a fluorescent image of DSG2-tdTomato
  • the lower row is an immunostaining image with anti-troponin T antibody (nucleus stained with Hoechst).
  • (A) is a bright-field (BF) image of DSG2-tdT-Hetero-iPSC-CM and DSG2-tdT-HDR-iPSC-CM 14 days after the start of differentiation induction (left, scale bar is 50 ⁇ m), fluorescence of tdTomato.
  • the image (center) and the enlarged image (right) within the frame of the center image, and (B) is the result of quantifying the desmoglein 2 positive area using high-content imaging for the live imaging of (A). ..
  • Results of infecting DSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CM 14 days after the start of differentiation induction with an adeno-associated virus (AAV2-PKP2, see Example 1) encoding full-length human PKP2 and observing time-lapse imaging for 4 days. It is a figure which shows.
  • the present invention provides a medicament for treating arrhythmogenic cardiomyopathy (AC) (hereinafter referred to as "the medicament of the present invention”).
  • the medicament of the present invention contains a gene therapy drug for delivering a normal gene corresponding to a gene having the gene mutation to the myocardial cells of an AC patient caused by the gene mutation to express a normal protein as an active ingredient. All you need is.
  • Gene mutations that cause AC include, for example, plakophilin 2 (PKP2) gene, desmograin 2 (DSG2) gene, plakoglobin (JUP) gene, desmoprakin (DSP) gene, desmocholine 2 (DSC2) gene, TMEM43 gene, etc.
  • Lamine A / C (LMNA) gene Lamine A / C (LMNA) gene, desmin (DES) gene, catenin ⁇ 3 (CTNNA3) gene, phosphoranban (PLN) gene, TGFB3 gene, titin (TTN) gene, SCN5A gene, N cadoherin (CDH2) gene, etc.
  • LMNA Lamine A / C
  • DES desmin
  • CTNNA3 catenin ⁇ 3
  • PPN phosphoranban
  • TTN titin
  • SCN5A gene SCN5A gene
  • N cadoherin (CDH2) gene etc.
  • the normal protein is not limited to a protein having a wild-type amino acid sequence as long as it is a protein that expresses a normal function, but is preferably a protein having a wild-type amino acid sequence.
  • the nucleotide sequence of the normal gene (wild-type gene) corresponding to the gene having the gene mutation causing AC and the amino acid sequence of the normal protein (wild-type protein) encoded by the nucleotide sequence are obtained from a known database (NCBI, etc.). be able to.
  • the drug of the present invention may be an AC therapeutic drug containing a gene therapy drug for expressing normal PKP2 for administration to an AC patient having a mutation in the PKP2 gene as an active ingredient.
  • the amino acid sequence (NCBI Reference Sequence: NP_001005242.2) of normal human PKP2 (wild-type human PKP2) is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence of DNA for expressing normal PKP2 is not limited as long as it encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence of DNA for expressing normal PKP2 may be, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 (positions 47 to 2560 in the base sequence of NCBI Reference Sequence: NM_001005242.3).
  • the drug of the present invention may be an AC therapeutic drug containing a gene therapy drug for expressing normal DSG2 for administration to an AC patient having a mutation in the DSG2 gene as an active ingredient.
  • the amino acid sequence (NCBI Reference Sequence: NP_001934.2) of normal human DSG2 (wild-type human DSG2) is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence of DNA for expressing normal DSG2 is not limited as long as it encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence of DNA for expressing normal DSG2 may be, for example, the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 (positions 76 to 3432 in the base sequence of NCBI Reference Sequence: NM_001943.5).
  • a gene therapy drug for delivering a normal gene corresponding to a gene having a gene mutation to express a normal protein can be administered in the form of a non-viral vector or a viral vector.
  • a method of introducing DNA using liposomes liposome method, HVJ-liposome method, cationic liposome method, lipofection method, lipofectamine method, etc.
  • microinjection method gene gun
  • RNA viruses such as detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpesvirus, vaccinia virus, poxvirus, poliovirus, Sindobis virus, Sendai virus, SV40.
  • the gene can be introduced into the myocardial cells.
  • it is an adeno-associated virus vector.
  • the dose thereof is appropriately set in consideration of the age, weight, severity of disease, etc. of the patient.
  • a single dose of 1 ⁇ 10 10 DRP (DNase-resistant particles) to 1 ⁇ 10 14 DRP adeno-associated virus vector may be administered intrathecally in a patient using a catheter.
  • Pluripotent stem cells derived from AC patients The present invention provides pluripotent stem cells established from cells of AC patients due to mutations in the PKP2 gene or DSG2 gene.
  • Pluripotent stem cells are stem cells that have pluripotency that can differentiate into all cells existing in a living body and also have proliferative ability.
  • Pluripotent stem cells include induced pluripotent stem (iPS) cells, embryonic stem (ES) cells, embryonic stem (ntES) cells derived from cloned embryos obtained by nuclear transplantation, and sperm stem cells (“GS cells”). , Embryonic stem cells (“EG cells”), cultured fibroblasts and pluripotent cells derived from bone marrow stem cells (Muse cells). It is preferably an iPS cell (iPSC).
  • iPSCs can be made by introducing specific reprogramming factors into somatic cells in the form of nucleic acids (DNA or RNA) or proteins, with properties similar to ES cells, such as pluripotency and self-renewal. It is an artificial stem cell derived from somatic cells that has the ability to proliferate by (K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126: 663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131: 861- 872; J. Yu et al. (2007), Science, 318: 1917-1920; Nakagawa, M. et al., Nat. Biotechnol. 26: 101-106 (2008); International release WO 2007/069666).
  • Somatic cells refer to all animal cells (preferably mammalian cells including humans) except germline cells such as eggs, egg mother cells, ES cells or totipotent cells. Somatic cells include, but are not limited to, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells, as well as primary cultured cells. , Passed cells, and established cells are all included. Specifically, somatic cells include, for example, (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells, (2) tissue precursor cells, (3) lymphocytes, and epithelium.
  • tissue stem cells such as nerve stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells
  • tissue precursor cells such as lymphocytes, and epithelium.
  • Endothelial cells muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, intestinal cells, splenocytes, pancreatic cells (pancreatic exocrine cells, etc.), brain cells, lung cells, renal cells And differentiated cells such as fat cells are exemplified.
  • Reprogramming factors are genes that are specifically expressed in ES cells, their gene products or non-cording RNA, or genes that play an important role in maintaining undifferentiated ES cells, their gene products or non-cording RNA, or It may be composed of low molecular weight compounds. Genes included in the reprogramming factors include, for example, Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15. -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, Glis1, etc.
  • reprogramming factors include WO2007 / 069666, WO2008 / 118820, WO2009 / 007852, WO2009 / 032194, WO2009 / 058413, WO2009 / 057831, WO2009 / 075119, WO2009 / 079007, WO2009 / 091659, WO2009 / 101084, WO2009 / 101407, WO2009 / 102983, WO2009 / 114949, WO2009 / 117439, WO2009 / 126250, WO2009 / 126251, WO2009 / 126655, WO2009 / 157593, WO2010 / 009015, WO2010 / 033906, WO2010 / 033920, WO2010 / 042800, WO2010 / 050626, WO2010 / 056831, WO2010 /
  • Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 can be used as initialization factors. More preferably, in addition to the three factors, Myc family members (M) selected from L-Myc, N-Myc and c-Myc (including the T58A mutant) can be used.
  • M Myc family members
  • Lin28 promotes the formation of TRA-1-60 positive cells and inhibits reversion to TRA-1-60 negative cells, so in addition to factor 3 (OSK) or factor 4 (OSKM), Lin28 It is also preferable to use it as an initialization factor.
  • the reprogramming factors include, for example, histone deacetylase (HDAC) inhibitors [eg, small molecule inhibitors such as valproic acid (VPA), tricostatin A, sodium butyrate, MC 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC.
  • HDAC histone deacetylase
  • nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore), HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene), etc.], MEK inhibitors (eg PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901), Glycogen synthesis kinase -3 Inhibitors (eg Bio and CHIR99021), DNA methyltransferase inhibitors (eg 5-azacytidine), histone methyltransferase inhibitors (eg BIX-01294) and other small molecule inhibitors, Suv39hl, Suv39h2, SetDBl and G9a Nucleic acid expression inhibitors such as siRNA and shRNA against), L-channel calcium agonist (eg Bayk8644), butyric acid, TGF ⁇ inhibitor or ALK5 inhibitor (eg LY364947, SB431542, 616453 and A-83-01), p53 Inhibitors (eg siRNA and shRNA for
  • the reprogramming factor when in the form of a protein, it may be introduced into somatic cells by a method such as lipofection, fusion with a cell membrane penetrating peptide (for example, HIV-derived TAT and polyarginine), or microinjection.
  • a cell membrane penetrating peptide for example, HIV-derived TAT and polyarginine
  • the reprogramming factor when it is in the form of DNA, it can be introduced into somatic cells by, for example, a vector such as a virus, a plasmid, or an artificial chromosome, lipofection, liposome, or microinjection.
  • Viral vectors include retroviral vectors and lentiviral vectors (above, Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007. ), Adenovirus vector (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vector, Sendai virus vector (WO2010 / 008054) and the like.
  • the artificial chromosome vector includes, for example, a human artificial chromosome (HAC), a yeast artificial chromosome (YAC), a bacterial artificial chromosome (BAC, PAC) and the like.
  • HAC human artificial chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • BAC bacterial artificial chromosome
  • plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as promoters, enhancers, ribosome binding sequences, terminators, polyadenylation sites, etc.
  • nuclear reprogramming substances can be expressed, and, if desired, drug resistance genes (for example, canamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, etc.), thymidin kinase gene, diphtheriatoxin gene, and other selectable marker sequences, green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, and other reporter gene sequences.
  • drug resistance genes For example, canamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, etc.
  • thymidin kinase gene diphtheriatoxin gene, and other selectable marker sequences
  • green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, and other reporter gene sequences can include.
  • the above vector has LoxP sequences before and after the gene encoding the reprogramming factor or the promoter and the gene encoding the reprogramming factor that binds to the promoter after introduction into somatic cells. You may.
  • RNA When the reprogramming factor is in the form of RNA, it may be introduced into somatic cells by a method such as lipofection or microinjection, and RNA incorporating 5-methylcytidine and pseudouridine (TriLink Biotechnologies) in order to suppress degradation. May be used (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630).
  • Cultures for iPSC induction include, for example, DMEM, DMEM / F12 or DME cultures containing 10-15% FBS (these cultures also include LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L-glutamine, etc. Non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. can be appropriately contained), mouse ES cell culture medium (TX-WES culture medium, Thrombo X), primate ES cell culture medium (primate ES). Examples are commercially available culture media such as / iPS cell culture medium, Reprocell), serum-free pluripotent stem cell maintenance medium (for example, mTeSR (Stemcell Technology), Essential 8 (Life Technologies), StemFit AK03 (AJINOMOTO)). Will be done.
  • the somatic cells are brought into contact with the reprogramming factor on a DMEM or DMEM / F12 culture medium containing 10% FBS and cultured for about 4 to 7 days. Then, the cells were re-seeded on feeder cells (for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.), and about 10 days after the contact between the somatic cells and the reprogramming factor, the cells were used in a culture medium for bFGF-containing primate ES cell culture. It can be cultured to give rise to iPS-like colonies about 30-about 45 days or more after the contact.
  • feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • DMEM culture medium containing 10% FBS for example, LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • FBS for example, LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • FBS for example, LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • ES-like colonies can be generated after about 25 to about 30 days or more.
  • the reprogrammed somatic cells themselves are used (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4: e8067 or WO2010 / 137746), or extracellular matrix (eg, Laminin-). 5 (WO2009 / 123349) and Matrigel (BD)) are exemplified.
  • iPSC may be established under hypoxic conditions (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237- 241 or WO2010 / 013845).
  • the culture solution is exchanged with a fresh culture solution once a day from the second day after the start of the culture.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 culture dish.
  • IPSC can be selected according to the shape of the formed colony.
  • a drug resistance gene expressed in conjunction with a gene expressed when somatic cells are reprogrammed for example, Oct3 / 4, Nanog
  • a culture medium containing the corresponding drug selection.
  • Established iPSC can be selected by culturing in (culture solution).
  • iPSC is selected by observing with a fluorescence microscope when the marker gene is a fluorescent protein gene, by adding a luminescent substrate when it is a luciferase gene, and by adding a chromogenic substrate when it is a luciferase gene. be able to.
  • the pluripotent stem cell of the present invention is a peripheral blood mononuclear cell of an AC patient (diagnosis name is ARVC) having a heterozygous frameshift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the base sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2. It may be an iPSC established from. This iPSC has been deposited at RIKEN BioResource Research Center (RIKEN BRC, 3-1-1 Koyadai, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 305-0074) and is numbered HPS4885, HPS4886 and HPS4887. This iPSC can be obtained from the RIKEN BioResource Research Center.
  • the pluripotent stem cells of the present invention are AC patients having a homozygous stop gain mutation in which cytosine at position 355 is replaced with thymine in the nucleotide sequence of the human DSG2 gene shown in SEQ ID NO: 4 (diagnostic name is dilated cardiomyopathy). It may be an iPSC established from peripheral blood mononuclear cells of. This iPSC has been deposited at RIKEN BioResource Research Center (RIKEN BRC, 3-1-1 Koyadai, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture 305-0074) and is numbered HPS4879, HPS4880 and HPS4881. This iPSC can be obtained from the RIKEN BioResource Research Center.
  • the present invention has the same genetic background as pluripotent stem cells established from AC patients having a heterozygous frameshift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the nucleotide sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2 (iso). Genetic) Provides genetically modified pluripotent stem cells. Specifically, it has the same genetic background as the above iPSC established from an AC patient having a heterozygous frameshift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the nucleotide sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2, and is a human.
  • the human PKP2 gene has the same genetic background as the iPSC established from an AC patient having a heterozygous frameshift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the base sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2.
  • an iPSC having a heterozygous frameshift mutation modified to a normal gene and having no mutation in the human PKP2 gene of both alleles is provided.
  • iPSC has the same genetic background as the above iPSC established from an AC patient with a heterozygous frameshift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the nucleotide sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2, and the human PKP2 gene has AC.
  • the iPSC with the causative homozygous mutation has been deposited at RIKEN BioResource Research Center (RIKEN BRC, 3-1-1 Takanodai, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 305-0074), and the HPS numbers of HPS4889 and HPS4890 are It is attached. This iPSC can be obtained from the RIKEN BioResource Research Center.
  • the human PKP2 gene has the same genetic background as the iPSC established from an AC patient having a heterozygous frameshift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the base sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2.
  • the iPSC in which the heterozygous frameshift mutation has been modified to a normal gene has been deposited at the RIKEN BioResource Research Center (RIKEN BRC, 3-1-1 Takanodai, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 305-0074), and the HPS of HPS4888. It is numbered. This iPSC can be obtained from the RIKEN BioResource Research Center.
  • the present invention has the same geneticity as pluripotent stem cells established from an AC patient having a homozygous stop gain mutation in which cytosine at position 355 is replaced with thymine in the nucleotide sequence of the human DSG2 gene shown in SEQ ID NO: 4.
  • it has the same genetic background as the above iPSC established from an AC patient having a homozygous stop gain mutation in which cytosine at position 355 is replaced with thymine in the nucleotide sequence of the human DSG2 gene shown in SEQ ID NO: 4.
  • iPSCs with heterozygous mutations that cause AC in the human DSG2 gene.
  • iPSC has the same genetic background as the above iPSC established from an AC patient having a homozygous stop gain mutation in which thytocin at position 355 is replaced with thymine in the nucleotide sequence of the human DSG2 gene shown in SEQ ID NO: 4, and is human.
  • the iPSC with a heterozygous mutation that causes AC in the DSG2 gene is available at RIKEN BioResource Research Center (RIKEN BRC).
  • This iPSC can be obtained from the RIKEN BioResource Research Center.
  • (Isogenic) genetically modified pluripotent stem cells having the same genetic background as pluripotent stem cells established from AC patients can be produced using known gene recombination techniques. For example, it can be prepared by using a homologous recombination technique using a targeting vector or a genome editing technique such as CRISPR / Cas9, TALEN, or ZFN.
  • the mutation of the human PKP2 gene in iPSC having the causative homozygous mutation is a mutation possessed by an AC patient, that is, a frame shift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the base sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2. It may be a mutation different from the mutation possessed by the AC patient.
  • the mutation is not particularly limited as long as it is a mutation causing AC, but a mutation similar to the mutation possessed by the AC patient is preferable.
  • the human DSG2 gene has the same genetic background as the above iPSC established from an AC patient with a homozygous stop gain mutation in which cytosine at position 355 is replaced with timine in the nucleotide sequence of the human DSG2 gene shown in SEQ ID NO: 4.
  • the mutation of the human DSG2 gene in iPSC that has a heterozygous mutation that causes AC in the AC patient is a mutation that the AC patient has, that is, the cytosine at position 355 in the base sequence of the human DSG2 gene shown in SEQ ID NO: 4 is replaced with timine. It may be a stop gain mutation, or it may be a mutation different from the mutation possessed by an AC patient.
  • the mutation is not particularly limited as long as it is a mutation causing AC, but a mutation similar to the mutation possessed by the AC patient is preferable.
  • the generated stop codon produces a mutant DSG2 protein having a total length of 118 amino acids (wild DSG2 protein). Is a total length of 1118 amino acids). Therefore, it is preferable that the mutation different from the mutation possessed by the AC patient is a mutation resulting in a mutant DSG2 protein having an amino acid length similar to 118 amino acids. Similar amino acid lengths may be, for example, ⁇ 20 amino acids, ⁇ 15 amino acids, and ⁇ 10 amino acids.
  • the present invention is a pluripotent stem cell established from an AC patient having a heterozygous frame-shift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the nucleotide sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2, and the same inheritance as the pluripotent stem cell.
  • Pluripotent stem cells having a homozygous mutation that causes AC in the (isogenic) human PKP2 gene, and human PKP2 having the same genetic background as the pluripotent stem cells (isogenic) A pluripotent stem cell in which the endogenous DSG2 protein in each pluripotent stem cell in which the heterozygous frame-shift mutation of the gene has been modified to a normal gene is expressed as a fusion protein with a fluorescent protein. offer.
  • Pluripotent stem cells established from AC patients with a heterozygous frameshift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the nucleotide sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2 are assigned the HPS numbers of HPS4885, HPS4886 and HPS4887 described above. It may be any of the iPSCs that have been used.
  • Pluripotent stem cells having the same genetic background as the pluripotent stem cells (isogenic) and having a homozygous mutation that causes AC in the human PKP2 gene are numbered with the HPS numbers of HPS4889 and HPS4890 described above. It may be any of the iPSCs that are available.
  • Pluripotent stem cells having the same genetic background as the pluripotent stem cell (isogenic) and having the heterozygous frameshift mutation of the human PKP2 gene modified to a normal gene are given the HPS number of HPS4888 above. It may be an iPSC.
  • the pluripotent stem cell for endogenous DSG2 fluorescence imaging of the present invention is prepared by inserting a fluorescent protein gene downstream of the DSG2 gene of each pluripotent stem cell so that a fusion protein of DSG2 and a fluorescent protein is expressed. be able to.
  • the pluripotent stem cells expressing the fusion protein of DSG2 and fluorescent protein can be produced by using a known gene recombination technique. For example, it can be prepared by using a homologous recombination technique using a targeting vector or a genome editing technique such as CRISPR / Cas9, TALEN, or ZFN.
  • the fluorescent protein used is not particularly limited, and can be appropriately selected and used from known fluorescent proteins that can be used for living cell imaging.
  • known fluorescent proteins include tdTomato (red fluorescent protein), GFP (green fluorescent protein), and fluorescent proteins containing derivatives thereof.
  • the amino acid sequence information of a known fluorescent protein and the base sequence information of a gene encoding the same can be obtained from a known database (NCBI or the like).
  • tdTomato gene is inserted downstream of the DSG2 gene of iPSC established from an AC patient with a heterozygous frameshift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the base sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2.
  • the iPSC has been deposited at the RIKEN BioResource Research Center (RIKEN BRC, 3-1-1 Takanodai, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 305-0074) and has the HPS number of HPS5039.
  • iPSC has the same genetic background as iPSC established from an AC patient with a heterozygous frameshift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the nucleotide sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2, and causes AC in the human PKP2 gene.
  • the iPSC for endogenous DSG2 fluorescence imaging, in which the tdTomato gene is inserted downstream of the DSG2 gene of the iPSC whose shift mutation has been modified to a normal gene, has been deposited at the Bioresource Research Center of the Institute of Physical and Chemical Research and is numbered HPS5040. There is. These iPSCs can be obtained from the RIKEN BioResource Research Center.
  • the present invention is a pluripotent stem cell established from an AC patient having a heterozygous frame shift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the base sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2, and the same inheritance as the pluripotent stem cell.
  • Human with a specific background (isogenic) A pluripotent stem cell having a homozygous mutation that causes AC in the PKP2 gene, and a human with the same genetic background as the pluripotent stem cell (isogenic).
  • the pluripotent stem cell set of the present invention may be a pluripotent stem cell set consisting of two of the above three types.
  • the two types of pluripotent stem cell set are a set of pluripotent stem cells and normal pluripotent stem cells having a homozygous mutation, a set of pluripotent stem cells and normal pluripotent stem cells having a heterozygous mutation, and a homozygous mutation. It may be any set of pluripotent stem cells having a pluripotent stem cell and a pluripotent stem cell having a heterozygous mutation, but a set of pluripotent stem cells having a homozygous mutation and a normal pluripotent stem cell is preferable.
  • the present invention includes pluripotent stem cells established from an AC patient having a homozygous stop gain mutation in which cytosine at position 355 is replaced with timine in the base sequence of the human DSG2 gene shown in SEQ ID NO: 4, and the pluripotent stem cells.
  • a pluripotent stem cell set containing three types of pluripotent stem cells in which the above human DSG2 gene homozygous stop gain mutation is modified to a normal gene in both alleles.
  • the pluripotent stem cell set of the present invention may be a pluripotent stem cell set consisting of two of the above three types.
  • the two types of pluripotent stem cell set are a set of pluripotent stem cells and normal pluripotent stem cells having a homozygous mutation, a set of pluripotent stem cells and normal pluripotent stem cells having a heterozygous mutation, and a homozygous mutation. It may be any set of pluripotent stem cells having a pluripotent stem cell and a pluripotent stem cell having a heterozygous mutation, but a set of pluripotent stem cells having a homozygous mutation and a normal pluripotent stem cell is preferable.
  • the tdTomato gene is inserted downstream of the DSG2 gene of pluripotent stem cells established from an AC patient having a heterozygous frameshift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the base sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2.
  • Endogenous DSG2 pluripotent stem cells for fluorescence imaging DSG2 of pluripotent stem cells having the same genetic background as the pluripotent stem cells (isogenic) and having a homozygous mutation that causes AC in the human PKP2 gene
  • a pluripotent stem cell for endogenous DSG2 fluorescence imaging in which the tdTomato gene is inserted downstream of the gene, and a heterozygous frame-shift mutation of a human PKP2 gene having the same genetic background as the pluripotent stem cell (isogenic) To provide a pluripotent stem cell set containing three types of pluripotent stem cells for endogenous DSG2 fluorescence imaging in which the tdTomato gene is inserted downstream of the DSG2 gene of pluripotent stem cells modified to a normal gene.
  • the pluripotent stem cell set of the present invention may be a pluripotent stem cell set consisting of two of the above three types.
  • the two types of pluripotent stem cell set are a set of pluripotent stem cells and normal pluripotent stem cells having a homozygous mutation, a set of pluripotent stem cells and normal pluripotent stem cells having a heterozygous mutation, and a homozygous mutation. It may be any set of pluripotent stem cells having a pluripotent stem cell and a pluripotent stem cell having a heterozygous mutation, but a set of pluripotent stem cells having a homozygous mutation and a normal pluripotent stem cell is preferable.
  • the pluripotent stem cells of the isogenic pluripotent stem cell set of the present invention may be iPSC.
  • the present invention provides an AC research kit.
  • the AC research kit of the present invention may include the pluripotent stem cell set of the present invention.
  • the configuration of the kit other than this is not particularly limited, and may include reagents necessary for research purposes, instruments such as trays and tubes, instruction manuals, and the like.
  • the present invention provides a screening kit for an AC therapeutic agent.
  • the screening kit of the present invention may include the pluripotent stem cell set of the present invention.
  • the configuration of the kit other than this is not particularly limited, and necessary reagents, instruments such as trays and tubes, instruction manuals, and the like may be included.
  • the screening method for AC therapeutic agents described below can be carried out easily and quickly.
  • the present invention provides a method for screening an AC therapeutic agent.
  • the screening method of the present invention has the same genetic background as pluripotent stem cells established from AC patients having a heterozygous frameshift mutation in which guanine at position 1228 overlaps in the nucleotide sequence of the human PKP2 gene shown in SEQ ID NO: 2.
  • pluripotent stem cell established from an AC patient having a homozygous stop gain mutation in which the cytosine at position 355 in the base sequence of the human DSG2 gene shown in SEQ ID NO: 4 is replaced with timine is used.
  • Good hereinafter these pluripotent stem cells are referred to as "homogeneous mutant cells”.
  • the screening method of the present invention may use myocardial cells induced to differentiate from the homozygous mutant cells, or may use cells in the process of inducing differentiation from the homozygous mutant cells into myocardial cells.
  • the method for inducing differentiation from pluripotent stem cells to cardiomyocytes is not particularly limited, and known differentiation-inducing methods can be preferably used.
  • the cells in the process of inducing differentiation from homozygous mutant cells to cardiomyocytes cells at any time in the process of inducing differentiation may be used.
  • test cells the cells used in the screening method of the present invention will be referred to as "test cells".
  • the screening method of the present invention may include the following steps (1) to (3).
  • the process of selection may include the following steps (1) to (3).
  • the test substance is brought into contact with or introduced into the test cells.
  • the test substance is not particularly limited, and for example, nucleic acids, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, mammalian tissue extracts, plasma and the like. It may be.
  • the test substance may be a novel substance or a known substance.
  • the test substance may form a salt.
  • a salt with a physiologically acceptable acid or base is used as the salt of the test substance.
  • the method of contacting the test substance with the test cells is not particularly limited.
  • a method of adding a test substance to a medium for culturing test cells can be mentioned.
  • the method for introducing the test substance into the test cells is also not particularly limited, and examples thereof include lipofection, microinjection, viral vector, plasmid vector and the like.
  • Step (2) evaluates the phenotype that reflects AC in the test cells that have been contacted or introduced with the test substance in step (1).
  • Expressional evaluation items that reflect AC include, for example, (i) contraction rate, expansion rate, contraction / expansion distance, and abnormal propagation rate in motion vector analysis, (ii) intracellular calcium concentration in calcium imaging, and calcium transition.
  • Abnormal ent (iii) detection of abnormal potential using microelectrode array, (iv) abnormal tissue strength and contractile force using tissue-constructed iPS-differentiated myocardium, (v) immunostaining and fluorescently labeled protein Desmosome protein abnormal localization by live imaging, (vi) change in desmosome protein expression level by western blotting, etc. can be mentioned.
  • Motion vector analysis can be performed by the method described in, for example, "J Mol Cell Cardiol 77, 178-191, doi: 10.1016 / j.yjmcc. 2014.09.010 (2014)”.
  • Calcium imaging can be appropriately selected from known methods and used.
  • the method described in “Toxicol Sci 148, 503-516, doi: 10.1093 / toxsci / kfv201 (2015)” may be used.
  • the abnormal potential can be detected using the microelectrode array by the method described in, for example, "Stem Cell Reports 9, 1546-1559, doi: 10.1016 / j.stemcr. 2017.09.007 (2017)".
  • tissue-constructed iPS differentiated myocardium can be performed by the method described in, for example, "bioRxiv preprint first posted online Jul. 27, 2019; doi: http://dx.doi.org/10.1101/717108". Immunostaining, live imaging using a fluorescently labeled protein, and Western blotting can be appropriately selected from known methods and used.
  • a test substance that improves AC by contacting or introducing the test substance is selected by comparing with the evaluation result of the phenotype in the test cells to which the test substance has not been contacted or introduced. For example, when evaluating the results of motion vector analysis, a test substance was selected in which abnormalities in contraction rate, expansion rate, contraction / expansion distance, and propagation rate in AC were significantly improved compared to controls without the addition of test substance. do. When the evaluation is performed by calcium imaging, the test substance whose intracellular calcium concentration and calcium transient abnormality in AC are significantly improved as compared with the control in which the test substance is not added is selected.
  • the test substance whose abnormal potential in AC is significantly reduced or eliminated as compared with the control to which the test substance is not added is selected.
  • tissue-constructed iPS-differentiated myocardium is evaluated, a test substance that significantly improves the abnormalities of tissue strength and contractile force in AC as compared with the control to which the test substance is not added is selected.
  • select a test substance in which the abnormal localization of desmosome protein in AC is significantly improved as compared with the control in which the test substance is not added When evaluated by Western blotting, select a test substance that significantly improves the abnormal change in desmosome protein expression level in AC as compared with the control without the test substance added.
  • heterozygous mutant cells isogenic to the test cells and / or normal cells isogenic to the test cells may be used as control cells.
  • the isogenic cell is compared with the case where the control cell established from a conventional healthy person is used. Since only the disease gene mutation is modified in, it is useful for detecting abnormalities specific to the mutated gene and analyzing its function.
  • Example 1 Establishment of iPSC derived from AC patient with heterozygous frameshift mutation of PKP2 and preparation of isogenic iPSC set [Materials and methods] (1) Human samples The use of samples obtained from patients and genome analysis were approved by the Institutional Review Board of Osaka University Hospital, and informed consent was obtained in writing.
  • Antibodies and reagents The following antibodies and reagents were used.
  • Anti-Oct-3 / 4 antibody (C-10) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA, Cat # sc-5279, RRID: AB_628051), anti-TRA-1-60 antibody (Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, USA) , Cat # MAB4360, RRID: AB_2119183), anti-SSEA-4 antibody (Merck Millipore, Cat # MAB4304, RRID: AB_177629), anti-Nanog antibody (Abcam, Cambridge, MA, USA, Cat # ab80892, RRID: AB_2150114), anti DSG2 antibody (AH12.2) (Santa Cruz Biotechnology, Cat # sc-80663 RRID: AB_2093438), anti-PKP2 antibody (PROGEN, Germany, Cat # 651167) (immunostaining), anti-PKP2 antibody (Abcam Cat # ab151402) (We
  • Genomic DNA was extracted from the patient's peripheral blood using the QIAAmp DNA mini kit (QIAGEN). Prepare a genomic DNA library using the Ion AmpliSeq Library Kit and the Ion Ampliseq Cardiovascular Research Panel (10,430 PCR amplicon covering 404 genes known to have mutations that affect cardiovascular function) and 318 chips. The sequence was executed using the provided Ion PGM. Sequence data was analyzed using TorrentSuite (version 5.2.2, Life Technologies). Variants with a low quality score of less than 30 or variants with a low read depth of less than 30 were excluded. Synonymous mutations with no amino acid changes were excluded.
  • HGMD Human Genetic Variation Database
  • ESP 6500 Human Genetic Variation Database
  • HEK293T cells are maintained in high glucose Dulbecco-modified Eagle's medium (DMEM, Gibco) containing 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco) and penicillin / streptomycin / glutamine (PSG, Gibco). rice field.
  • DMEM high glucose Dulbecco-modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • PSG penicillin / streptomycin / glutamine
  • IPSC peripheral blood mononuclear cells
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • GE Ficoll-Paque
  • Reprogramming was performed using a Sendai virus vector (CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Life Technologies) containing OCT3 / 4, SOX2, KLF4 and c-MYC.
  • iPSCs were cultured under feeder-free conditions using StemFit AK02N (AJINOMOTO) on a laminin-coated plate (Nakagawa, M.
  • iPSC-CM myocardial cells differentiated from HDR, NHEJ and Hetero iPSC
  • differentiated monolayer myocardial cells were cultured for 10-12 days and 5 mM DL-sodium lactate (SIGMA) was added. Purify with the containing medium for 2-4 days, then on day 14 the medium was supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin and 2 mM L-glutamine (PSG, Gibco, Thermo Fisher Scientific). It was replaced with Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM).
  • FBS fetal bovine serum
  • PSG penicillin / streptomycin
  • differentiated iPSC-CM was trypsinized, re-seeded on 96-well clear plates (Greiner) precoated with gelatin (Nitta Gelatin), and used with serum-containing DMEM. Incubated.
  • iPSC Immunofluorescent staining iPSC was seeded on a 96-well clear plate (Greiner) at 1,000 cells / well and incubated at 37 ° C. for colonization. Differentiated iPSC-CM was treated with 0.25% trypsin-EDTA, suspended in DMEM containing 10% FBS, PSG and 10 ⁇ MY-27632 (Wako) and filtered through a 100 ⁇ m cell strainer (FALCON). Cardiomyocytes were seeded at 10,000 cells / well on 96-well clear plates precoated with gelatin (Nitta Gelatin).
  • This pCAG-EGxxFP vector and the pX459 vector encoding SpCas9 and the specified sgRNA were transfected into 293T cells pre-seeded in Greiner CELLSTAR 96-well plates (1 ⁇ 10 4 cells / well). Forty-eight hours after transfection, fluorescent images of EGFP were obtained with high content image analysis (IN Cell Analyzer 6000, GE) and quantitatively analyzed using the IN Cell Developer Toolbox (GE). A total of 36 non-overlapping images (9 images per well) were obtained from each sample in a single experiment using a 10 ⁇ / 0.45 NA Nikon lens.
  • Cel-I assay HEK293T cells were seeded on a 24-well plate (5 ⁇ 10 4 cells / well), and one day later, the pX459 vector was transfected with Lipofectamine 3000 (Life Technologies). Two days after transfection, the medium was replaced with a medium containing 1.0 ⁇ g / mL puromycin and Cas9 expressing cells were selected. After puromycin selection, genomic DNA was extracted using the QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN).
  • PCR Kerat Fx Neo, TOYOBO was performed under the following conditions to amplify the target region: 94 ° C for 2 minutes, followed by a cycle of 98 ° C for 30 seconds / annealing temperature of 30 seconds / 68 ° C for 30 seconds depending on the primer. cycle.
  • QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN
  • both untreated and treated allele PCR fragments were hybridized to form hetero DNA double strands.
  • the hybridized PCR heteroduplex was then enzymatically digested with a mismatch-specific endonuclease Cel-I at 42 ° C. for 60 minutes (SURVEYOR mutation detection kit) and subjected to electrophoresis.
  • a gRNA sequence targeting the peripheral genomic region of the 1228 dupG mutation of PKP2 was designed and cloned into the pX459 vector.
  • the DNA sequences of the 5'end and 3'end homologous arms around the 1228 dupG mutation in the PKP2 gene were amplified from wild-type genomic DNA and cloned into the pCR bluntII-TOPO vector (Thermo).
  • the sequence encoding the full-length human PKP2 was subcloned from the ORF clone (Dharmacon) to the pENTR / D-TOPO vector (Thermo).
  • PKP2 sequences were recombinated into pcDNA3.1 / nV5-DEST (Thermo) using the Gateway system (Invitrogen) for expression in cultured cells.
  • the FLAG epitope was inserted before the coding sequence by PCR-based mutagenesis to generate an N-terminal FLAG-tagged protein.
  • An N-terminal FLAG-tagged full-length PKP2 sequence was subcloned into a pAAV vector (TaKaRa) for AAV production.
  • AAV Extraction Solution B was added, and the mixture was stored at -80 ° C.
  • AAV recovered from HEK293T cells was purified using the AAVpro Purification Kit (TaKaRa), and the virus titer was measured using the AAV Titration Kit (TaKaRa).
  • RNA extraction and quantitative real-time PCR Total RNA was extracted using the RNeasy mini kit (QIAGEN) and converted to cDNA using the high capacity RNA-to cDNA RT kit (Thermo). Quantitative real-time PCR was performed using Cyber Green or the probe method (THUNDERBIRD SYBR, probe qPCR mix, TOYOBO). All samples were duplicated. The level of each transcript was quantified by the threshold cycle (Ct) method using TBP or GAPDH as an internal control.
  • Ct threshold cycle
  • Droplet digital PCR and quantitative real-time PCR Droplet digital PCR was performed using the QX200 ddPCR system (BIORAD).
  • a HEX or FAM-labeled probe was designed to specifically detect transcripts from the wild-type or 1228 dupG alleles of PKP2 (see Figure 6) (assay ID: dMDS329472318, BIORAD).
  • a ready-made FAM-labeled probe for PKP2 was used to detect both wild-type and 1228 dupG transcripts (see Figure 6) (assay ID: qHsaCIP0027871, BIORAD).
  • droplets generated using the QX200 Droplet Reader (BIORAD) were detected and analyzed. TBP was used as an internal control (assay ID: dHsaCPE5058363, BIORAD).
  • 5 ⁇ g of the pX459 plasmid was electroporated into 1 ⁇ 10 5 cells using the NEPA21 electroporator (polling pulse voltage: 125 V, pulse width: 5 ms, pulse count: 2, Nepagene).
  • 5 ⁇ g of repair template DNA plasmid (pCR bluntII-TOPO vector) was additionally transfected. Puromycin (0.3 ⁇ g / mL) was added within 48 hours after electroporation.
  • iPSCs were passaged into 35 mm dishes at a density of 200 cells for clonal colonization. At the same time, genomic DNA was extracted and the results of genome editing were evaluated by direct sequencing.
  • each colony (at least 24 colonies) was picked up and dispersed in single cells in sterile tubes.
  • the cell suspension was divided into two 96-well plates for both genotyping and cell proliferation. Genomic DNA was extracted, the target genomic region was amplified by PCR, cloned into the pCR bluntII-TOPO vector, and evaluated by direct sequence or sequence analysis. To obtain the target single-cloned iPSC, cells were repeatedly passaged into new dishes to form clonal colonies.
  • iPSC-CM cardiomyocytes differentiated from iPSC was obtained using the Cell Motion Imaging System (SI8000, SONY).
  • SI8000, SONY Cell Motion Imaging System
  • the video was recorded with a 4x objective lens with a frame rate of 150 fps and a resolution of 1024 x 1024 pixels.
  • Video was taken from at least 3 fields in 3 wells of each isogenic iPSC-CM cultured in a 6-well plate.
  • motion parameters were calculated from nine regions of interest (ROI) of 64 x 64 pixels. Data were obtained from three independent differentiation experiments. During the observation period, fixed positions defined as the X-axis and Y-axis were continuously observed.
  • CV maximum contraction rate
  • RV relaxation rate
  • DD mean deformation distance
  • a frameshift mutation in aspartic acid (D410fs) resulted in an amino acid arrest at residue 425 (X425). No deleterious mutations were detected in other desmosome genes reported as the causative genes of AC (DSC2, DSG2, JUP or DSP).
  • This PKP2 gene heterozygous frameshift mutation (1228dupG) was also carried by the patient's father.
  • IPSC peripheral blood mononuclear leukocytes obtained from the patient.
  • the established iPSCs were positive for the pluripotent marker proteins SSEA4, TRA-1-60, OCT4 and NANOG (Fig. 3) and possessed a normal karyotype (Fig. 4).
  • Figure 6 shows the results of preparing each cell lysate of iPSC established from patient-derived iPSC and healthy subjects (controls) and detecting the expression level of PKP2 protein by Western blotting. The expression level of PKP2 protein was shown to be reduced in patient-derived iPSCs.
  • ddPCR Droplet digital PCR analysis was performed to accurately evaluate the amount of transcripts produced from each allele of patient-derived iPSCs and cardiomyocytes (iPSC-CM) differentiated from the iPSCs. The results are shown in FIGS. 8 and 9. The number of copies of the mutant allele (1228 dupG) transcript in patient-derived iPSCs was shown to be reduced to 27% of the number of copies of the wild-type allele transcript.
  • iPSCs were differentiated into cardiomyocytes, and the proportion of troponin T-positive cells was measured by FACS analysis. The results are shown in Fig. 10. On the 10th day after induction of differentiation, about 80 to 90% of the cells were troponin T-positive cardiomyocytes.
  • Figure 11 shows the results of calculating the relative number of copies of transcripts produced from each allele of patient-derived iPSCs and cardiomyocytes (iPSC-CM) differentiated from the iPSCs. It was revealed that the number of copies of the transcript of the wild-type allele of iPSC-CM 10 days after the induction of differentiation increased by about 30 times compared to the undifferentiated iPSC. The rate of increase in transcripts of the mutant allele (1228 dupG) between undifferentiated iPSCs and iPSC-CM 10 days after induction of differentiation remained low. In post-differentiation iPSC-CM, the number of copies of the wild-type allelic transcript was approximately 10-fold that of the mutant allelic transcript. This result shows that the transcript of the mutant allele (1228dupG) is unstable, and the difference in the absolute amount of the transcript of the wild-type allele and the mutant allele (1228dupG) requires high expression of PKP2. It suggests that it increased in.
  • a single-stranded annealing (SSA) assay was performed using the pCAG-EGxxFP vector and the pX459 vector, and the cleavage activity of each gRNA was evaluated.
  • the results are shown in Fig. 13.
  • (A) is the result of cleavage of the wild-type allele
  • (B) is the result of cleavage of the mutant allele.
  • gRNA # 1 specifically cleaved the mutant sequence containing the duplicate G, but did not cleave the wild-type sequence.
  • the cleavage activity of gRNA # 2 was lower than that of gRNA # 1.
  • the cleavage activity of gRNA # 3 and # 4 was higher in gRNA # 4.
  • gRNA # 1 and # 4 The cleavage activity of gRNA # 1 and # 4 targeting the endogenous PKP2 locus of HEK293T cells was evaluated by the Cel-I assay. The results are shown in Fig. 14.
  • the target sequence of the endogenous PKP2 locus in HEK293T cells was cleaved by gRNA # 4, but not by gRNA # 1.
  • Patient-derived iPSCs were transfected with a px459 vector encoding gRNA # 1 and screened for iPSC clones with NHEJ at the PKP2 locus by Sanger sequence analysis. It became clear that it was introduced in. From these results, gRNAs # 1 and # 4 were selected to replace the target genome of the PKP2 gene of patient-derived iPSCs.
  • a homozygous frameshift mutation that mimics the patient's mutation sequence into the PKP2 gene by non-homologous end-linking repair (NEHJ)
  • the pX459 vector encoding gRNA # 4 was transfected into the patient-derived iPSC. After several sibling selections, an iPSC clone containing a homozygous frameshift allele was obtained and named NEHJ (Fig. 15).
  • NHEJ clones carry a homozygous 31 bp deletion in both alleles and are thought to produce the short PKP2 protein of 411 amino acids (Fig. 16).
  • a repair template DNA containing a wild-type sequence with a 1035 bp 5'homology arm and a 497 bp 3'homology arm placed before and after 1228G of PKP2 to replace the mutant sequence by homologous recombination repair (HDR). was prepared (Fig. 17).
  • the repair template vector and the pX459 vector encoding gRNA # 1 were combined and transfected into patient-derived iPSCs. After repeated sibling selection, iPSC clones containing homozygous wild-type alleles were obtained and named HDR.
  • iPSC clone in which the genomic sequence having a heterojunction frameshift mutation in PKP2 remains as a control was obtained and named Hetero.
  • Hetero an iPSC clone in which the genomic sequence having a heterojunction frameshift mutation in PKP2 remains as a control was obtained and named Hetero.
  • Quantitative real-time PCR analysis was performed using a common probe (see Figure 7) targeting both wild-type and mutant transcripts to evaluate the transcripts of each iPSC clone.
  • the results are shown in Fig. 18. It was shown that the relative mRNA expression level of the PKP2 gene in HDR recovered from Hetero and approached the expression level of the control iPSC.
  • droplet digital PCR (ddPCR) analysis was performed and the results are shown in FIG. Mutant transcripts from the 1228dupG allele were completely reduced in HDR and NHEJ clones, and transcripts from wild-type HDR alleles were shown to be exactly 2-fold and recovered from Hetero.
  • Western blotting analysis was performed, and the results are shown in Fig. 20.
  • PKP2 protein The expression level of PKP2 protein was not detected in NHEJ clones, and it was revealed that it was restored in HDR clones.
  • Plakoglobin encoded by the JUP gene, desmoglein 2 encoded by the DSG2 gene, and desmocollin 2 encoded by the DSC2 gene are major components of the desmocollin structure, and the expression levels of these proteins carry PKP2 mutations. It has been reported to decrease in myocardial cells differentiated from iPSC in AC patients and in the myocardium of AC patients carrying PKP2 mutations (Caspi, O.
  • FIG. 21 shows the results of evaluating the differentiation efficiency of cells 7 to 8 days after the start of differentiation induction by FACS analysis using an anti-troponin T antibody. Differentiation efficiencies were comparable between these iPSC-CMs.
  • FIG 23 shows the observation results of HDR-iPSC-CM and NHEJ-iPSC-CM 8 to 10 days after the start of differentiation induction.
  • HDR-iPSC-CM dynamic shrinkage was observed in coordination with the connected layer structure.
  • NHEJ-iPSC-CM showed hole-like defects in the connecting cardiomyocytes, which gradually increased from day 8 to day 10.
  • Ripped myocardial fibers were detected in NHEJ-iPSCM (Fig. 24), suggesting that cell-cell adhesion is weak under increased contractile tension.
  • the contraction velocity (CV) and deformation distance (DD) calculated by motion vector analysis represent contraction function or contraction force, respectively, and enable real-time evaluation of the motor characteristics of cultured iPSC-CM. Therefore, the contraction motion of HDR-iPSC-CM and NHEJ-iPSC-CM at the same position was continuously observed at specific coordinates of the 6-well plate. The results are shown in FIGS. 25 and 26.
  • the contractility of HDR-iPSC-CM was preserved, and both CV and DD did not change during the observation period from day 14 to day 28.
  • HDR-iPSC-CM showed orientation formation of contracting cardiomyocytes from 14 to 28 days (Fig. 27). This suggests that mechanical stress promoted cardiomyocyte maturation.
  • NHEJ-iPSC-CM Motion vector analysis converts the amplitude of movement into a color map and enables label-free detection of excitement propagation.
  • NHEJ-iPSC-CM directional excitatory propagation was first observed through the fibrous structure on day 14, but directional propagation was gradually inhibited from day 21 to day 28 under continuous contractile tension. It came to be done (Fig. 28).
  • conduction blocks were observed in the muscle fibers of NHEJ-iPSC-CM (Fig. 29).
  • FIG. 31 shows the results of immunostaining of HDR-iPSC-CM and NHEJ-iPSC-CM reseeded in 96-well plates on the 10th day after the start of differentiation induction with an anti-troponin T antibody on the 16th day.
  • the area of troponin T-positive cardiomyocytes in NHEJ-iPSC-CM was significantly reduced compared to HDR-iPSC-CM.
  • Figure 32 shows the results of quantitative real-time PCR using HDR-iPSC-CM and NHEJ-iPSC-CM 10 days after the start of differentiation induction.
  • the values of TNNT2 (troponin T2) and TNNI3 (troponin I3) were shown to be comparable between NHEJ-iPSC-CM and HDR-iPSC-CM. This result suggests that NHEJ-iPSC-CM significantly impairs cardiomyocyte maturation.
  • Desmosomes and focal adhesions bind cardiomyocytes, mediate intermediate filament networks between cardiomyocytes, and affect cardiomyocyte maturation via mechanotransduction.
  • PKP2 is a scaffold protein that integrates desmosomes with proteins that make up focal adhesions. Therefore, Western blotting using NHEJ-iPSC-CM and HDR-iPSC-CM as samples on the 14th and 28th days after the start of differentiation induction, and NHEJ-iPSC-CM and HDR-iPSC on the 16th day after the start of differentiation induction. -The expression and cell localization of proteins constituting desmosomes or focal adhesions were evaluated by immunostaining using CM as a sample.
  • the results of Western blotting are shown in Fig. 33.
  • the results of immunostaining of Plakoglobin are shown in FIG. 34.
  • the results of immunostaining of Plakophilin-2 (PKP2) are shown in Fig. 35.
  • the results of immunostaining of Desmoglein-2 and Desmocollin-2 are shown in FIG. 36.
  • the results of immunostaining of N-cadherin are shown in FIG. 37.
  • Plakoglobin is an anchor protein that binds desmosome cadherin to desmoplakin and is expressed in both desmosomes and focal adhesions. From Fig. 33, Fig. 34, and Fig. 35, the expression of plakophilin 2 was completely abolished in NHEJ-iPSC-CM, but the expression level and localization of plasmoglobin in NHEJ-iPSC-CM were in HDR-iPSC-CM. There was no significant difference.
  • Desmoglein 2 and desmocollin 2 are desmosome cadherins that form homopolymers and heteropolymers in the intercellular gaps and in the C-terminal tail located in the cytoplasm bound to plakophilin-2. Both desmoglein 2 and desmocollin 2 were normally expressed at the intercellular junction of HDR-iPSC-CM. On the other hand, in NHEJ-iPSC-CM, the expression level of these desmosome proteins was significantly reduced (Fig. 33), completely shed from the cell periphery, and scattered in the cytoplasm (Fig. 36).
  • Desmosome junctions extend from the extracellular space to the cytoskeletal actin filaments, and the junction complex contains a transmembrane protein composed primarily of N-cadherin.
  • NHEJ-iPSC-CM 28 days after the start of differentiation induction, the expression of N-cadherin was reduced as compared with HDR-iPSC-CM (Fig. 33). Immunostaining revealed that in NHEJ-iPSC-CM, N-cadherin expression was detected at the intercellular junction but was substantially reduced (Fig. 37).
  • FIG. 39 The experimental scheme is shown in Figure 39.
  • AAV2-PKP2 adeno-associated virus
  • NHEJ was used for iPSC, and the cells were re-seeded on a 96-well plate on the 10th day after the start of differentiation induction, and were infected with AAV2-PKP2 on the 11th day to transfer the gene (upper row after the 10th day in FIG. 39).
  • the results of immunostaining with anti-FLAG antibody and anti-troponin T antibody on the 16th day are shown in FIG. 40.
  • the introduced FLAG-tagged PKP2 protein was clearly localized around the cells of NHEJ-iPSC-CM.
  • AAV2 (AAV2-EGFP), which encodes EGFP, was used as a control.
  • the cells were re-seeded on a 96-well plate, and on the 11th day, the gene was introduced by infection with AAV2-PKP2 or AAV2-EGFP.
  • the results of immunostaining with anti-desmoglein 2 antibody, anti-desmocollin 2 antibody or anti-N-cadherin antibody on the 16th day are shown in FIG. 41.
  • the results of quantifying the expression level of each protein using high-content imaging of the images obtained from the immunostained specimen of FIG. 41 are shown in FIG.
  • FIG. 44 shows the results of observing NHEJ-iPSC-CM on the 24th day after infection with AAV2-EGFP with a fluorescence microscope and a bright field. Expression of EGFP was confirmed by fluorescence microscopy.
  • Figure 45 shows the results of Western blotting using NHEJ-iPSC-CM infected with AAV2-PKP2 or AAV2-EGFP on the 24th day as a sample.
  • Introducing human PKP2 into NHEJ-iPSC-CM increased the expression of PKP2 (plakophilin 2), desmoglein 2 and desmocollin 2.
  • NHEJ-iPSC-CM Observation image of NHEJ-iPSC-CM on day 24 infected with AAV2-PKP2 or AAV2-EGFP, image of excitement propagation converted to color map by motion vector analysis, and contraction velocity (CV) calculated by motion vector analysis.
  • DD deformation distance
  • NHEJ-iPSC-CM into which the PKP2 gene was introduced suppressed the formation of pit-like structures in contracting cardiomyocytes. It was also shown that the decrease in contraction rate (CV) and deformation distance (DD) recovered. From these results, it was clarified that gene therapy that introduces a normal PKP2 gene into AC patients caused by PKP2 gene mutation is effective.
  • NHEJ-iPSC-CM has been shown to be a useful human model for therapeutic development, suggesting that NHEJ-iPSC-CM can be used to screen for AC therapeutics.
  • Example 2 Establishment of AC patient-derived iPSC with homozygous stop gain mutation of DSG2 and preparation of isogenic iPSC set The use of samples obtained from patients and genomic analysis were approved by the Institutional Review Board of Osaka University Hospital. , Obtained written informed consent.
  • a guide RNA was designed for the DSG2 genome sequence, and a synonymous substitution sequence was introduced into one allele of the DSG2 gene of the homozygous C355T mutant iPSC (R119X-iPSC) by genome editing to repair the C355T mutation to heterozygotes.
  • a genetic iPSC HDR-iPSC was established (Fig. 51). HDR-iPSC, in which the C355T mutation was repaired to heterozygotes, restored the expression of the DSG2 protein (Fig. 52 (A), (B)).
  • tissue formation process after re-seed was observed over time, and the myocardial structure was confirmed by immunostaining with troponin 30 days after the start of differentiation induction (16 days after re-seed).
  • the formation of tissue structure was impaired, showing a reticulated myocardial morphology, but no similar changes were observed with HDR-iPSC-CMs (Fig. 54).
  • R119X-iPSC-CM and HDR-iPSC-CM 14 days after the start of differentiation induction were reseeded on a 96-well plate, and 7 days later, cells were fixed and anti-desmoglein 2 antibody and anti-desmocollin 2 antibody were used. Immunostained. Similar to the results of Western blotting, desmoglein 2 was not expressed in R119X-iPSC-CM, and the expression level of desmocollin 2 was significantly lower than the expression level of HDR-iPSC-CM (Fig. 56).
  • R119X-iPSC-CM and HDR-iPSC-CM were reseeded on a 96-well plate 14 days after the start of differentiation induction, and 30 days later, the cells were fixed and observed with a transmission electron microscope.
  • HDR-iPSC-CM a normal desmosome structure was observed
  • R119X-iPSC-CMs a torn image of the desmosome structure was observed (Fig. 57).
  • R119X-iPSC-CM 14 days after the start of differentiation induction, R119X-iPSC-CM was re-seeded on a 96-well plate, and 4 days later, 2.0 ⁇ 10 6 vg / cell AAV2-DSG2-cHA was infected and the gene was introduced. Seven days after infection, cells were fixed and immunostained with anti-desmoglein 2 antibody. In R119X-iPSC-CM into which the DSG2 gene was introduced, DSG2 was found to be localized in the intercellular desmosome (Fig. 58).
  • R119X-iPSC-CM was infected with 2.0 ⁇ 10 5 vg / cell or 6.0 ⁇ 10 5 vg / cell AAV2-DSG2-cHA to transfer the gene.
  • Protein samples were collected from cardiomyocytes 7 days after infection and the expression of desmoglein 2 was analyzed by Western blotting.
  • Cardiomyocytes (Ctrl-iPSC-CM) induced to differentiate from iPSCs established from healthy subjects were used as controls.
  • the expression of desmoglein 2 equivalent to that of Ctrl-iPSC-CM was confirmed (Fig. 59).
  • FIG. 60 is a bright field observation image 30 days after the start of differentiation induction.
  • R119X-iPSC-CM without DSG2 gene showed abnormal reticulated myocardial morphology, but R119X-iPSC-CM with DSG2 gene did not show such abnormal morphology, and DSG2 gene was introduced. It was shown that the disorder of myocardial structure was suppressed.
  • Example 3 Preparation of PKP2 gene mutation isogenic iPSC set capable of imaging the dynamics of desmoglein 2 protein NHEJ- In iPSC-CM, the expression level of desmoglein 2 protein was significantly reduced (see Fig. 33) and completely shed from the cell membrane (see Fig. 36). It was expected to be a useful molecular marker related to. Therefore, in order to evaluate the endogenous DSG2 molecular dynamics in more detail, the PKP2 gene mutation isogenic iPSC set (Hetero-iPSC, HDR-iPSC and NHEJ-iPSC) prepared in Example 1 was added to each DSG2 gene 3'end. An isogenic iPSC set in which the tdTomato fluorescent protein was inserted was prepared using genome editing technology.
  • Example 9 Expression analysis of desmoglein 2 in cardiomyocytes induced to differentiate from the isogenic iPSC set prepared in Example 1] Cardiomyocytes (Hetero-iPSC-) 14 days after the start of differentiation induction from isogenic iPSC (Hetero-iPSC) containing a heterozygous frame shift allele in the PKP2 gene and isogenic iPSC (HDR-iPSC) containing a homozygous wild-type allele. Desmograin 2 was immunostained on CM and HDR-iPSC-CM) (Fig. 61, upper row).
  • Fig. 64 Sanger sequence analysis (Fig. 64) of genomic DNA were performed along with colony selection, and the allele with SNP: C remained in the wild type, and tdTomato was heterozygous to the allele with SNP: T.
  • An isogenic iPSC set (DSG2-tdT-Hetero-iPSC, DSG2-tdT-HDR-iPSC and DSG2-tdT-NHEJ-iPSC) inserted into the mold was established (Fig. 65).
  • the karyotype of the established isogenic iPSC set was normal, and immunostaining confirmed the expression of undifferentiated markers (OCT4, SSEA4, NANOG) (Fig. 66).
  • the DSG2-tdTomato fusion protein showed a dot-like distribution after myocardial differentiation (Fig. 68).
  • DSG2-tdT-Hetero-iPSC-CM DSG2-tdT-HDR-iPSC-CM and DSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CM were fixed and immunostained 14 days after the start of differentiation induction
  • DSG2-tdT -Hetero-iPSC-CM and DSG2-tdT-HDR-iPSC-CM observed a desmosome signal localized in dots on the cell membrane, whereas DSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CM was associated with differentiation.
  • PKP2 gene delivery to DSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CM DSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CM 14 days after the start of differentiation induction was infected with an adeno-associated virus (AAV2-PKP2, see Example 1) encoding full-length human PKP2, and the PKP2 gene was introduced every day. Time-lapse imaging was observed. On the 4th day after AAV2-PKP2 infection, punctate desmoglein 2-td Tomato fusion protein accumulation was observed on the cell membrane (Fig. 71). It was shown that the introduction of human PKP2 into DSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CM restored the expression level and localization of desmoglein-2.
  • AAV2-PKP2 adeno-associated virus

Abstract

本発明は、遺伝子変異に起因する不整脈源性心筋症患者の心筋細胞に、遺伝子変異を有する遺伝子に対応する正常遺伝子を送達して正常タンパク質を発現させるための遺伝子治療薬を有効成分とする不整脈源性心筋症治療用医薬を提供する。また、本発明は、プラコフィリン２遺伝子またはデスモグレイン２遺伝子の変異に起因する不整脈源性心筋症患者の細胞から樹立された多能性幹細胞を提供する。

Description

不整脈源性心筋症患者由来の多能性幹細胞およびその利用ならびに不整脈源性心筋症治療用医薬
　本発明は、不整脈源性心筋症患者由来の多能性幹細胞およびその利用ならびに不整脈源性心筋症治療用医薬に関するものである。
　不整脈源性心筋症（Arrhythmogenic cardiomyopathy、以下「AC」とも記す）は、主に遺伝子変異を原因とし、心室性不整脈や心収縮能の低下を来す疾患群である。従来は、主に右室心筋の菲薄化、心室拡大を呈し、心室頻拍や心室細動といった致死性の不整脈を来す希少難病である不整脈源性右室心筋症（Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy、以下「ARVC」とも記す）として認識されていたが、左室機能障害を来す症例が多く報告されたことから、近年は包括してACと認識されるようになった（非特許文献１）。原因として主に介在板遺伝子異常が知られており、なかでもプラコフィリン2（Plakophilin-2、以下「PKP2」とも記す）はACの原因として最も多くの変異が同定された遺伝子である。PKP2遺伝子のノックアウトマウスでは、胎生期において心筋構造異常、心室壁破裂を来し、PKP2が心臓形成において重要な因子であることが示されている（非特許文献２）。
　PKP2変異を有するAC患者から疾患iPS細胞（iPSC）が樹立され、AC患者由来のiPSCから分化させた心筋細胞と健常者由来のiPSCから分化させた心筋細胞を比較すると、AC患者由来のiPSCから分化させた心筋細胞では、介在板関連タンパク質の減少、異常な脂肪滴沈着、活動電位立ち上がり時間の延長、PPARγの発現上昇等を来すことが報告されている（非特許文献３－５）。しかし、これらの報告は全て遺伝的背景が異なる健常者由来のiPS細胞から分化させた心筋細胞を比較対象としたものであり、同一の遺伝的背景においてPKP2遺伝子変異のみを改変し、PKP2遺伝子異常による病態を正確に評価できるヒト疾患モデル細胞を用いたものではない。また、ACの病態再現および治療法開発を進めるためには、単一心筋ではなく拍動心筋組織を模した病態モデルが必要である。
　一方、デスモゾームは、心臓を含む多くの臓器において、介在板に局在し細胞構造の保持に働く。デスモゾームを構成するデスモゾームカドヘリン遺伝子には、4つのデスモグレイン（DSG1-4）と3つのデスモコリン（DSC1-3）が存在するが、ヒトやマウス心臓組織においてはDSG2、DSC2が特異的に発現し、これらの分子における遺伝子変異は主にACを含む遺伝性心筋症を惹起する。DSG2が完全に欠損したマウスは胎生致死であり、心臓特異的にDSG2をノックアウトしたマウスは心室の拡大、心筋細胞死、間質の線維化を来し拡張型心筋症様の表現型を呈することが報告されている（非特許文献６、７）。ヒトにおいては、AC症例において多くのヘテロ接合DSG2変異が同定されており、DSG2の複合ヘテロ変異により重篤な心不全を呈することが報告されている（非特許文献８）。しかし、DSG2のホモ接合変異についてはこれまでに報告がない。さらに、ヒトiPS分化心筋を用いたDSG2遺伝子変異による心筋症病態の再現や、ヒトiPS分化心筋においてDSG2分子を導入することによる治療概念を実証した報告はない。
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　本発明は、遺伝子変異に起因する不整脈源性心筋症の治療用医薬を提供することを課題とする。また、本発明は遺伝子変異に起因する不整脈源性心筋症患者から樹立された多能性幹細胞、該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有しかつ患者と異なる接合型の変異を有する多能性幹細胞、該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有しかつ変異遺伝子が正常遺伝子に修正された多能性幹細胞を提供することを課題とする。さらに本発明は、前記多能性幹細胞または該多能性幹細胞から分化した心筋細胞を用いる不整脈源性心筋症治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
　本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］遺伝子変異に起因する不整脈源性心筋症患者の心筋細胞に、該遺伝子変異を有する遺伝子に対応する正常遺伝子を送達して正常タンパク質を発現させるための遺伝子治療薬を有効成分とする不整脈源性心筋症治療用医薬。
［２］遺伝子変異がプラコフィリン２遺伝子の変異またはデスモグレイン２遺伝子の変異である、前記［１］に記載の医薬。
［３］プラコフィリン２遺伝子またはデスモグレイン２遺伝子の変異に起因する不整脈源性心筋症患者の細胞から樹立された多能性幹細胞。
［４］プラコフィリン２遺伝子の変異が、配列番号２で示されるヒトプラコフィリン２遺伝子の塩基配列において、１２２８位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異である、前記［３］に記載の多能性幹細胞。
［５］前記［４］に記載の多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し、前記ヒトプラコフィリン２遺伝子内に不整脈源性心筋症の原因となるホモ接合変異を有する多能性幹細胞。
［６］前記［４］に記載の多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し、前記ヒトプラコフィリン２遺伝子が正常遺伝子に修正された多能性幹細胞。
［７］デスモグレイン２遺伝子の変異が配列番号４で示されるヒトデスモグレイン２遺伝子の塩基配列において、３５５位のシトシンがチミンに置換されたホモ接合ストップゲイン変異である、前記［３］に記載の多能性幹細胞。
［８］前記［７］に記載の多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し、前記ヒトデスモグレイン２遺伝子内に不整脈源性心筋症の原因となるヘテロ接合変異を有する多能性幹細胞。
［９］前記［７］に記載の多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し、前記ヒトデスモグレイン２遺伝子が正常遺伝子に修正された多能性幹細胞。
［１０］前記［４］に記載の多能性幹細胞、前記［５］に記載の多能性幹細胞および前記 ［６］に記載の多能性幹細胞からなる群から選択される２種類または３種類の多能性幹細胞を含む多能性幹細胞セット。
［１１］前記［７］に記載の多能性幹細胞、前記［８］に記載の多能性幹細胞および前記 ［９］に記載の多能性幹細胞からなる群から選択される２種類または３種類の多能性幹細胞を含む多能性幹細胞セット。
［１２］前記［４］に記載の多能性幹細胞のデスモグレイン２遺伝子の下流に蛍光タンパク質遺伝子が挿入された、内在性デスモグレイン２の蛍光イメージング用多能性幹細胞。
［１３］前記［５］に記載の多能性幹細胞のデスモグレイン２遺伝子の下流に蛍光タンパク質遺伝子が挿入された、内在性デスモグレイン２の蛍光イメージング用多能性幹細胞。
［１４］前記［６］に記載の多能性幹細胞のデスモグレイン２遺伝子の下流に蛍光タンパク質遺伝子が挿入された、内在性デスモグレイン２の蛍光イメージング用多能性幹細胞。
［１５］前記［１２］に記載の多能性幹細胞、前記［１３］に記載の多能性幹細胞および前記［１４］に記載の多能性幹細胞からなる群から選択される２種類または３種類の多能性幹細胞を含む多能性幹細胞セット。
［１６］前記［１０］、［１１］または［１５］に記載の多能性幹細胞セットを含む、不整脈源性心筋症研究用キット。
［１７］前記［１０］、［１１］または［１５］に記載の多能性幹細胞セットを含む、不整脈源性心筋症治療薬のスクリーニング用キット。
［１８］前記［５］、前記［７］もしくは［１３］に記載の多能性幹細胞、または該多能性幹細胞から分化した心筋細胞または該多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導過程の細胞を用いる不整脈源性心筋症治療薬のスクリーニング方法であって、被験物質を前記細胞に接触または導入する工程と、該細胞における不整脈源性心筋症を反映する表現型を評価する工程と、被験物質を接触または導入していない前記細胞における該表現型の評価結果と比較して不整脈源性心筋症を改善する被験物質を選択する工程とを含む、スクリーニング方法。
　本発明により、遺伝子変異に起因する不整脈源性心筋症の治療用医薬を提供することができる。また、本発明により、遺伝子変異に起因する不整脈源性心筋症患者から樹立された多能性幹細胞、該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有しかつ患者と異なる接合型の変異を有する多能性幹細胞、該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有しかつ変異遺伝子が正常遺伝子に修正された多能性幹細胞を提供することができる。さらに、本発明により、前記多能性幹細胞または該多能性幹細胞から分化した心筋細胞を用いる不整脈源性心筋症治療薬のスクリーニング方法を提供することができる。
（A）は患者（矢印）の家系図であり、四角は男性を丸は女性を示し、心室性不整脈を呈した症例は黒丸または黒四角で示される。（B）は患者の心エコー図であり、左が傍胸骨左室短軸像、右が傍胸骨四腔断面像である。LV：左心室、RV：右心室、EF：駆出率、LVDd/s：左心室拡張径/収縮径、スケールバーは20mmを示す。 患者の末梢血から抽出されたゲノムDNAを用いてダイレクトサンガーシーケンス解析を行い、遺伝性心血管疾患に関連する遺伝子変異をスクリーニングした結果、PKP2遺伝子のヘテロ接合フレームシフト変異（1228 dupG）が見出されたことを示す図である。 患者由来のiPS細胞（以下「iPSC」と記す）を多能性マーカータンパク質（SSEA4、TRA-1-60、OCT4、NANOG）に対する抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である。 患者由来のiPSCの核型分析の結果を示す図である。 患者由来のiPSCのゲノムDNAおよびトータルRNAから逆転写により得られたcDNAを用いて、ダイレクトサンガーシーケンス解析を行った結果を示す図であり、（A）はゲノムDNAの結果、（B）はcDNAの結果である。 患者由来のiPSCおよび健康な対照被験者から作製したiPSCにおけるPKP2タンパク質の発現量をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す図である。 ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）において、野生型アレルおよび変異型アレル（1228 dupG）の両方の転写産物を検出する共通のddPCRプローブ、野生型アレルの転写産物を検出するプローブ、変異型アレル（1228 dupG）の転写産物を検出するプローブを示す図である。 患者由来のiPSCおよび当該iPSCから分化した心筋細胞から取得したcDNAサンプルを用いてドロップレットデジタルPCR行った結果を示す図であり、各PKP2転写産物を標的とするPCRプローブからの代表的な陽性液滴シグナルが示されている。 ドロップレットデジタルPCR分析結果から算出した各サンプルのPKP2転写産物濃度（copy/μL）を比較した結果を示す図である（*: p<0.01、n=3、means±SD）。相対転写産物濃度は、野生型転写産物の濃度によって正規化された比率として計算した。 患者由来のiPSCから分化させた心筋細胞（iPSC-CMs）におけるトロポニンT陽性細胞の割合を、FACS分析により測定した結果を示す図である（n=3、平均値±SD）。 iPSCまたはiPSC-CMの各PKP2転写産物の相対コピー数を示す図である（*：p <0.01、＃：p=0.06、n=3、平均値±SD）。iPSCにおける野生型転写産物の値によって正規化された相対コピー数が示されている。 ヒトPKP2遺伝子のエクソン5の変異（1228 dupG）の隣接領域をゲノム編集するために設計した4つのgRNA（＃1、＃2、＃3、＃4）を示す図である。 一本鎖アニーリングアッセイにより各gRNAの切断活性を評価した結果を示す図であり、（A）は野生型アレルの切断結果、（B）は変異アレルの切断結果である。 HEK293T細胞の内因性PKP2遺伝子座を標的とするgRNA＃1およびgRNA＃4の切断活性を、Cel-Iアッセイにより評価した結果を示す図である。 作製されたアイソジェニックiPSCクローン（HDR、hetero、NHEJ）からそれぞれ取得したゲノムDNAのPKP2遺伝子の変異箇所周囲のシーケンス解析結果を示す図である。 作製されたアイソジェニックiPSCクローン（HDR、hetero、NHEJ）のPKP2の予測タンパク質長を示す図である。 PKP2遺伝子のエクソン5付近のゲノム配列に対応する、1035bpの5'ホモロジーアームと497bpの3'ホモロジーアームを有する相同組換え修復（HDR）テンプレート構造を示す図である。 各アイソジェニックiPSCクローン（HDR、hetero、NHEJ）から得られたcDNAを試料とし、野生型および変異型の両方の転写産物を標的とする共通プローブを用いて定量的リアルタイムPCR分析を行った結果を示す図である。コントロールは、健常ヒトから作製したiPSCから得られた試料の結果である（*: p<0.01 vs Het, n=3, mean±SD）。 各アイソジェニックiPSCクローン（HDR、hetero、NHEJ）から得られたcDNAを試料としてドロップレットデジタルPCR（ddPCR）分析を行った結果を示す図である（*: p<0.01 vs HDR or NHEJ, #: p<0.01 vs Hetero, n=3, means±SD）。 各アイソジェニックiPSCクローン（HDR、hetero、NHEJ）の細胞溶解液を試料として、ウエスタンブロッティング分析を行った結果を示す図である（*: p<0.05 vs Hetero, #: p<0.01 vs Hetero, n=3, means±SD）。 iPSCから心筋細胞への分化誘導実験のスキームを示す図である。 各アイソジェニックiPSC（Hetero、HDR、NHEJ）から単層で分化誘導した心筋細胞（Hetero-iPSC-CM、HDR-iPSC-CM、NHEJ-iPSC-CM）の分化誘導効率を、抗トロポニンT抗体を使用したFACSにより評価した結果を示す図である。 分化誘導開始後8～10日目における単層HDR-iPSC-CMと単層NHEJ-iPSC-CMの連続観察結果を示す図（スケールバーは1mm）である。 分化誘導開始後10日目のNHEJ-iPSC-CMに観察された断裂した心筋線維を示す図である。 細胞運動分析を用いて単層iPSC-CMを連続観察し、分化誘導開始後14日目、18日目、28日目のHDR-iPSC-CMおよびNHEJ-iPSC-CMの特定の座標における固定位置の明視野画像を示す図（スケールバーは200μm）である。白枠内は図27で拡大された領域である。 モーションベクトル解析により計算された、HDR-iPSC-CMおよびNHEJ-iPSC-CMの14日目および28日目の（A）収縮速度（Contraction velocity: CV）と（B）平均変形距離（Average deformation distance: ADD）を示す図である。 図25のHDR-iPSC-CMの明視野画像の白枠内の拡大像を示す図である。 モーションベクトルを使用したラベルフリー検出により、分化誘導開始後21日目と28日目におけるNHEJ-iPSC-CMの興奮伝播の結果を示す図（スケールバーは200μm）である。 分化誘導開始後14日目と19日目におけるNHEJ-iPSC-CMの配向した繊維構造を介した興奮伝播を連続観察した結果を示す図である。 iPSCから心筋細胞への分化誘導実験のスキームを示す図である。 分化誘導開始後10日目に96ウェルプレートに再播種したHDR-iPSC-CMとNHEJ-iPSC-CMを、16日目に抗トロポニンT抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である（*: p<0.01, n=3, means±SD）。 分化誘導開始後10日目のHDR-iPSC-CMとNHEJ-iPSC-CMを用いて定量リアルタイムPCRを行った結果を示す図である（*: p<0.001 vs HDR, n=3, mean±SD）。 分化誘導開始後14日目および28日目のNHEJ-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CMを試料とするウエスタンブロッティングの結果を示す図である。 分化誘導開始後10日目に96ウェルプレートに再播種したHDR-iPSC-CMとNHEJ-iPSC-CMを、16日目に抗プラコグロビン抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である。2段目の画像の白枠内の拡大画像を下2段に示した。 分化誘導開始後10日目に96ウェルプレートに再播種したHDR-iPSC-CMとNHEJ-iPSC-CMを、16日目に抗プラコフィリン2抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である。2段目の画像の白枠内の拡大画像を下2段に示した。 分化誘導開始後10日目に96ウェルプレートに再播種したHDR-iPSC-CMとNHEJ-iPSC-CMを、16日目に抗デスモグレイン2抗体または抗デスモコリン2抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である。2段目の画像の白枠内の拡大画像を下2段に示した。 分化誘導開始後10日目に96ウェルプレートに再播種したHDR-iPSC-CMとNHEJ-iPSC-CMを、16日目に抗N-カドヘリン抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である。2段目の画像の白枠内の拡大画像を下2段に示した。 分化誘導開始後14日目に24ウェルプレートに再播種したHetero-iPSC-CM、HDR-iPSC-CMを、28日目に観察した結果を示す図（スケールバーは500μm）である。 PKP2遺伝子導入実験のスキームを示す図である。 分化誘導開始後10日目に96ウェルプレートに再播種したNHEJ-iPSC-CMに対して11日目にAAV2を介してPKP2遺伝子を導入し、16日目に抗FLAG抗体および抗トロポニンT抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である。右画像は、左の白枠内の拡大画像である。 分化誘導開始後10日目に96ウェルプレートに再播種したNHEJ-iPSC-CMに対して11日目にAAV2を介してPKP2遺伝子またはEGFP遺伝子を導入し、16日目に抗デスモグレイン2抗体、抗デスモコリン2抗体または抗N-カドヘリン抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である。 図40の免疫染色標本から得られた画像について、ハイコンテントイメージングを使用して各タンパク質の発現量を定量した結果を示す図である（*: p<0.001, n=3, means±SD, 6 images in each experiment）。用いたウイルスゲノム量は、AAV2-EGFPが1.04×104 viral genomes (vg)/cell、AAV2-PKP2が1.04×104または2.08×104vg/cellである。 分化誘導開始後10日目に96ウェルプレートに再播種し、11日目にAAV2を介してPKP2遺伝子またはEGFP遺伝子を導入し、16日目に抗トロポニンT抗体で免疫染色し、ハイコンテントイメージングを使用してトロポニンT陽性心筋細胞の面積を測定した結果を示す図である（*: p<0.01, n=3, means±SD）。 分化誘導開始後10日目のNHEJ-iPSC-CMに対してAAV2を介してEGFP遺伝子を導入し、24日目に蛍光顕微鏡（左）および明視野（右）で観察した結果を示す図である。 分化誘導開始後10日目のNHEJ-iPSC-CMに対してAAV2を介してPKP2遺伝子またはEGFP遺伝子を導入し、24日目にこれらの細胞を試料としてウエスタンブロッティングを行った結果を示す図である。 分化誘導開始後10日目のNHEJ-iPSC-CMに対してAAV2を介してPKP2遺伝子またはEGFP遺伝子を導入し、24日目における細胞の観察画像（スケールバーは200μm）、モーションベクトル解析により興奮伝播をカラーマップに変換した画像、およびモーションベクトル解析によって計算された収縮速度（CV）および変形距離（DD）を示す図である。 （A）はデスモグレイン2（DSG2）のドメイン構造を示し、119番目のアルギニンはEC1（extracellular cadherin domain 1）に存在する。（B）は患者（矢印）の家系図であり、四角は男性を丸は女性を示し、心室性不整脈を呈した症例は黒塗りで示される。（C）は患者（II-1）および患者の両親（I-1、I-2）のゲノムDNAを用いてサンガーシーケンス解析を行った結果を示す図である。 ホモ接合C355T変異を有する患者（II-1）および拡張型心筋症患者（DCM control）の左室心筋組織を、抗デスモグレイン2抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である。下段は上段の枠内の拡大画像である。 ホモ接合C355T変異を有する患者（II-1）および拡張型心筋症患者（DCM control）の左室心筋組織を、透過電子顕微鏡で観察した結果（スケールバーは500nm）を示す図である。 （A）は患者由来のiPSCおよび健康な対照被験者から作製したiPSCからRNAを抽出し、RT-PCRにてDSG2mRNAを測定した結果（ACTBは内在性コントロール）であり、（B）は患者由来のiPSCおよび健康な対照被験者から作製したiPSCを固定し、抗デスモグレイン2抗体で免疫染色（核をHoechstで染色）した結果を示す図（スケールバーは100μm）である。 患者由来のiPSC（R119X-iPSC）およびゲノム編集により患者由来のiPSCのホモ接合C355T変異のうち、ヘテロ接合C355T変異を正常配列に改変したアイソジェニックiPSC（HDR-iPSC）のゲノムDNA配列と翻訳後のアミノ酸配列を示す図である。 （A）はR119X-iPSCおよびHDR-iPSCを固定し、抗デスモグレイン2抗体で免疫染色（核をHoechstで染色）した結果を示す図（スケールバーは100μm）であり、（B）はR119X-iPSCおよびHDR-iPSCからタンパク質サンプルを回収し、デスモグレイン2の発現をウエスタンブロッティングで検出した結果を示す図である。 R119X-iPSCから分化誘導した心筋細胞（R119X-iPSC-CM）およびHDR-iPSCから分化誘導した心筋細胞（HDR-iPSC-CM）を用いて三次元自己組織化リングを作製し、圧縮強度測定装置を用いて心筋収縮力を測定した結果を示す図であり、（A）は代表的なR119X-iPSC-CMの結果、（B）は代表的なHDR-iPSC-CMの結果、（C）は両者の平均値を比較した図である（*: p<0.05, R119X-iPSC-CM n=4, HDR-iPSC-CM n=3, mean±SD）。 分化誘導開始後30日目（再播種後16日目）のR119X-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CMの心筋構造を観察した結果を示す図（スケールバーは100μm）であり、（A）の上段は明視野画像、中段は細胞を固定し、抗トロポニンT抗体で免疫染色した画像、下段は抗トロポニンT抗体で免疫染色（核をHoechstで染色）した画像であり、（B）はHDR-iPSC-CMに対するR119X-iPSC-CMのトロポニンT陽性領域の相対比率を示す図である（*: p<0.001, いずれもn=4, mean±SD）。 分化誘導開始後14日目のR119X-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CMからタンパク質サンプルを回収し、デスモグレイン2およびデスモコリン2の発現をウエスタンブロッティングで解析した結果を示す図である。 分化誘導開始後14日目のR119X-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CMを96ウェルプレートに再播種し、その7日後に細胞を固定して抗デスモグレイン2抗体および抗デスモコリン2抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である。 分化誘導開始後14日目のR119X-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CMを96ウェルプレートに再播種し、その30日後に細胞を固定して透過電子顕微鏡による観察を行った結果を示す図（スケールバーは1μm）である。 分化誘導開始後14日目に96ウェルプレートに再播種したR119X-iPSC-CMに対して、再播種の4日後にAAV2-DSG2-cHAを感染させてDSG2遺伝子を導入し、感染7日後に細胞を固定して抗デスモグレイン2抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）であり、上段はDSG2遺伝子を導入していないR119X-iPSC-CMである。 分化誘導開始後21日目のR119X-iPSC-CMに、2.0×105vg/cellまたは6.0×105vg/cellのAAV2-DSG2-cHAを感染させて遺伝子導入し、感染7日後に心筋細胞からタンパク質サンプルを回収し、デスモグレイン2の発現をウエスタンブロッティングで解析した結果を示す図である。 分化誘導開始後9日目のR119X-iPSC-CMにAV2-DSG2-cHAを感染させ、分化誘導開始後14日目再播種し、分化誘導開始後30日目に明視野で観察した結果を示す図である。 上段は、分化誘導開始後14日目のHetero-iPSC-CMとHDR-iPSC-CMを抗デスモグレイン2抗体で免疫染色した画像を対象に、ハイコンテントイメージングを使用してデスモグレイン2陽性エリアを検出した図であり、下段は、ハイコンテントイメージングを使用してデスモグレイン2陽性エリアの定量を行った結果である（*: p<0.0001, 各n=32）。 ヒトDSG2遺伝子の終止コドン下流をターゲットとしたガイドRNA位置およびPCRで用いたプライマーの位置を示す図である。 ゲノム編集によりDSG2遺伝子3'末端へtdTomatoを挿入したDSG2-tdT-Hetero-iPSC、DSG2-tdT-HDR-iPSCおよびDSG2-tdT-NHEJ-iPSCの各ゲノムDNA、ならびにゲノム編集を行っていないHetero-iPSC、HDR-iPSCおよびNHEJ-iPSCの各ゲノムDNAを鋳型として図62で示したプライマーを用いてPCRを行った結果を示す図である。 DSG2-tdT-NHEJ-iPSCのゲノムを対象に、サンガーシークエンス解析を行った結果を示す図であり、上段が野生型アレル由来PCR産物に対して、下段がtdTomatoをノックインしたアレル由来PCR産物に対して行ったダイレクトシークエンスの結果である。 樹立した野生型DSG2およびDSG2-tdTomato融合転写産物をそれぞれ産生するPKP2遺伝子変異アイソジェニックiPSCセットを示す図である。 DSG2-tdT-Hetero-iPSC、DSG2-tdT-HDR-iPSC、DSG2-tdT-NHEJ-iPSCの核型分析の結果、および多能性マーカータンパク質（OCT4、SSEA4、NANOG）に対する抗体で免疫染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である。 （A）はDSG2-tdT-Hetero-iPSC、DSG2-tdT-HDR-iPSC、DSG2-tdT-NHEJ-iPSCの各ライセートを用いてウエスタンブロッティングを行った結果を示す図であり、上から順に抗デスモグレイン2抗体、抗赤色蛍光タンパク質（RFP）抗体、抗プラコグロビン抗体、抗プラコフィリン2抗体、抗GAPDH（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase）抗体の結果である。（B）はDSG2-tdT-Hetero-iPSC、DSG2-tdT-HDR-iPSC、DSG2-tdT-NHEJ-iPSCの各細胞を固定し、核をHoechstで染色した結果を示す図（スケールバーは50μm）である。 DSG2-tdT-HDR-iPSC、および分化誘導開始後14日目のDSG2-tdT-HDR-iPSC-CMを用いたタイムラプスイメージングの結果を示す図であり、上段は明視野（BF）画像、下段は蛍光画像である。 分化誘導開始後14日目のDSG2-tdT-Hetero-iPSC-CM、DSG2-tdT-HDR-iPSC-CMおよびDSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CMの各細胞を固定し、免疫染色を行った結果を示す図（スケールバーは50μm）であり、上段はDSG2-tdTomatoの蛍光画像、下段は抗トロポニンT抗体で免疫染色（核をHoechstで染色）した画像である。 （A）は分化誘導開始後14日目のDSG2-tdT-Hetero-iPSC-CMおよびDSG2-tdT-HDR-iPSC-CMの明視野（BF）画像（左、スケールバーは50μm）、tdTomatoの蛍光画像（中央）および中央画像の枠内の拡大画像（右）であり、（B）は（A）のライブイメージングについてハイコンテントイメージングを使用してデスモグレイン2陽性エリアの定量を行った結果である。 分化誘導開始後14日目のDSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CMに完全長ヒトPKP2をコードするアデノ随伴ウイルス（AAV2-PKP2、実施例１参照）を感染させ、４日間タイムラプスイメージングを観察した結果を示す図である。
〔不整脈源性心筋症治療用医薬〕
　本発明は、不整脈源性心筋症（AC）治療用医薬（以下「本発明の医薬」と記す）を提供する。本発明の医薬は、遺伝子変異に起因するAC患者の心筋細胞に、該遺伝子変異を有する遺伝子に対応する正常遺伝子を送達して正常タンパク質を発現させるための遺伝子治療薬を有効成分とするものであればよい。ACの原因となる遺伝子変異としては、例えば、プラコフィリン2（PKP2）遺伝子、デスモグレイン2（DSG2）遺伝子、プラコグロビン（JUP）遺伝子、デスモプラキン（DSP）遺伝子、デスモコリン2（DSC2）遺伝子、TMEM43遺伝子、ラミンA/C（LMNA）遺伝子、デスミン（DES）遺伝子、カテニンα3（CTNNA3）遺伝子、ホスホランバン（PLN）遺伝子、TGFB3遺伝子、タイチン（TTN）遺伝子、SCN5A遺伝子、Nカドヘリン（CDH2）遺伝子等が挙げられる（非特許文献１参照）。
　正常タンパク質は、正常な機能を発現するタンパク質であれば野生型のアミノ酸配列からなるタンパク質に限定されないが、好ましくは野生型のアミノ酸配列からなるタンパク質である。ACの原因となる遺伝子変異を有する遺伝子に対応する正常遺伝子（野生型遺伝子）の塩基配列およびそれがコードする正常タンパク質（野生型タンパク質）のアミノ酸配列は、公知のデータベース（NCBI等）から取得することができる。
　本発明の医薬は、PKP2遺伝子に変異を有するAC患者を投与対象とする正常PKP2を発現させるための遺伝子治療薬を有効成分とするAC治療用医薬であってもよい。正常ヒトPKP2（野生型ヒトPKP2）のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_001005242.2）を配列番号１に示す。正常PKP2を発現させるためのDNAの塩基配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするものであればよく、限定されるものではない。正常PKP2を発現させるためのDNAの塩基配列は、例えば配列番号２で示される塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_001005242.3の塩基配列における第47位～第2560位）であってもよい。
　本発明の医薬は、DSG2遺伝子に変異を有するAC患者を投与対象とする正常DSG2を発現させるための遺伝子治療薬を有効成分とするAC治療用医薬であってもよい。正常ヒトDSG2（野生型ヒトDSG2）のアミノ酸配列（NCBI Reference Sequence: NP_001934.2）を配列番号３に示す。正常DSG2を発現させるためのDNAの塩基配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードするものであればよく、限定されるものではない。正常DSG2を発現させるためのDNAの塩基配列は、例えば配列番号４で示される塩基配列（NCBI Reference Sequence: NM_001943.5の塩基配列における第76位～第3432位）であってもよい。
　遺伝子変異を有する遺伝子に対応する正常遺伝子を送達して正常タンパク質を発現させるための遺伝子治療薬は、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。非ウイルスベクターの形態で投与する場合、リポソームを用いてDNAを導入する方法（リポソーム法、HVJ-リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Gene Gun）でキャリア（金属粒子）とともにDNAを細胞に移入する方法、Nature Biotechnology volume 31, 898-907 (2013)に記載の方法などを利用することができる。ウイルスベクターの形態で投与する場合、無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、SV40などのDNAウイルスまたはRNAウイルスに、目的のDNAを導入し、心筋細胞にこの組換えウイルスを感染させることにより、心筋細胞内に遺伝子を導入することができる。好ましくは、アデノ随伴ウイルスベクターである。
　本発明の医薬が、目的の正常タンパク質をコードするDNAが導入されたアデノ随伴ウイルスベクターである場合、その投与量は、患者の年齢、体重、疾患の重篤度等を考慮して適宜設定される。例えば、1×1010DRP（DNase-resistant particles）～1×1014DRPのアデノ随伴ウイルスベクターを、カテーテルを用いて患者の冠動脈内に単回投与してもよい。
〔AC患者由来の多能性幹細胞〕
　本発明は、PKP2遺伝子またはDSG2遺伝子の変異に起因するAC患者の細胞から樹立された多能性幹細胞を提供する。多能性幹細胞は、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞である。多能性幹細胞としては、人工多能性幹（iPS）細胞、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが挙げられる。好ましくはiPS細胞（iPSC）である。
　iPSCは、特定の初期化因子を、核酸（DNAもしくはRNA）またはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。
　体細胞は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される
　初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　好ましい態様において、Oct3/4、Sox2およびKlf4（OSK）を初期化因子として用いることができる。より好ましくは、該3因子に加え、L-Myc、N-Mycおよびc-Myc（T58A変異体を含む）から選択されるMycファミリーメンバー（M）を用いることができる。さらに、Lin28は、TRA-1-60陽性細胞の形成を促進し、TRA-1-60陰性細胞への逆戻り転換を阻害するので、3因子（OSK）または4因子（OSKM）に加え、Lin28を初期化因子として使用することも好ましい。
　上記初期化因子には、例えばヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれる。本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
　初期化因子がタンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　初期化因子がDNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウイルスベクター（Science, 322, 945-949, 2008）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC、PAC）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Science, 322:949-953, 2008）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（GFP）、βグルクロニダーゼ（GUS）、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
　初期化因子がRNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine（TriLink Biotechnologies）を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
　iPSC誘導のための培養液としては、例えば、10～15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12またはDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、puromycin、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）またはマウスES細胞培養用培養液（TX-WES培養液、トロンボＸ社）、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清多能性幹細胞維持培地（例えば、mTeSR（Stemcell Technology社）、Essential 8（Life Technologies）、StemFit AK03（AJINOMOTO））などの市販の培養液が例示される。
　培養法の例としては、例えば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEMまたはDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4～7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等）上に播きなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30～約45日またはそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等）上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25～約30日またはそれ以上後にES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外マトリックス（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）およびマトリゲル（BD社））を用いる方法が例示される。
　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPSCを樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
　上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり約5×103～約5×106細胞の範囲である。
　iPSCは、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Oct3/4、Nanog）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したiPSCを選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、iPSCを選択することができる。
　本発明の多能性幹細胞は、配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者（診断名はARVC）の末梢血単核球から樹立したiPSCであってもよい。このiPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センター（RIKEN BRC、〒305-0074茨城県つくば市高野台3丁目1-1）に寄託されており、HPS4885、HPS4886およびHPS4887のHPS番号が付されている。このiPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センターから入手することができる。
　本発明の多能性幹細胞は、配列番号4で示されるヒトDSG2遺伝子の塩基配列において355位のシトシンがチミンに置換されたホモ接合ストップゲイン変異を有するAC患者（診断名は拡張型心筋症）の末梢血単核球から樹立したiPSCであってもよい。このiPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センター（RIKEN BRC、〒305-0074茨城県つくば市高野台3丁目1-1）に寄託されており、HPS4879、HPS4880およびHPS4881のHPS番号が付されている。このiPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センターから入手することができる。
〔AC患者由来の多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有する多能性幹細胞〕
　本発明は、配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立した多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有する（アイソジェニック）遺伝子改変多能性幹細胞を提供する。具体的には、配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立した上記iPSCと同一の遺伝的背景を有し、ヒトPKP2遺伝子にACの原因となるホモ接合変異を有するiPSCを提供する。さらに、配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立した上記iPSCと同一の遺伝的背景を有し、ヒトPKP2遺伝子のヘテロ接合フレームシフト変異が正常遺伝子に修正された、両アレルのヒトPKP2遺伝子に変異を有しないiPSCを提供する。
　配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立した上記iPSCと同一の遺伝的背景を有し、ヒトPKP2遺伝子にACの原因となるホモ接合変異を有するiPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センター（RIKEN BRC、〒305-0074茨城県つくば市高野台3丁目1-1）に寄託されており、HPS4889およびHPS4890のHPS番号が付されている。このiPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センターから入手することができる。また、配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立した上記iPSCと同一の遺伝的背景を有し、ヒトPKP2遺伝子のヘテロ接合フレームシフト変異が正常遺伝子に修正されたiPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センター（RIKEN BRC、〒305-0074茨城県つくば市高野台3丁目1-1）に寄託されており、HPS4888のHPS番号が付されている。このiPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センターから入手することができる。
　また、本発明は、配列番号4で示されるヒトDSG2遺伝子の塩基配列において355位のシトシンがチミンに置換されたホモ接合ストップゲイン変異を有するAC患者から樹立した多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有する（アイソジェニック）遺伝子改変多能性幹細胞を提供する。具体的には、配列番号4で示されるヒトDSG2遺伝子の塩基配列において355位のシトシンがチミンに置換されたホモ接合ストップゲイン変異を有するAC患者から樹立した上記iPSCと同一の遺伝的背景を有し、ヒトDSG2遺伝子にACの原因となるヘテロ接合変異を有するiPSCを提供する。さらに、配列番号4で示されるヒトDSG2遺伝子の塩基配列において355位のシトシンがチミンに置換されたホモ接合ストップゲイン変異を有するAC患者から樹立した上記iPSCと同一の遺伝的背景を有し、ヒトDSG2遺伝子ホモ接合ストップゲイン変異が両アレルとも正常遺伝子に修正された、ヒトDSG2遺伝子に変異を有しないiPSCを提供する。
　上記の配列番号4で示されるヒトDSG2遺伝子の塩基配列において355位のシトシンがチミンに置換されたホモ接合ストップゲイン変異を有するAC患者から樹立した上記iPSCと同一の遺伝的背景を有し、ヒトDSG2遺伝子にACの原因となるヘテロ接合変異を有するiPSC（患者由来のiPSCのホモ接合C355T変異のうち、ヘテロ接合C355T変異を正常配列に改変したiPSC）は、理化学研究所バイオリソース研究センター（RIKEN BRC、〒305-0074茨城県つくば市高野台3丁目1-1）に寄託されており、HPS4882のHPS番号が付されている。このiPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センターから入手することができる。
　AC患者から樹立した多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有する（アイソジェニック）遺伝子改変多能性幹細胞は、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。例えば、ターゲィングベクターを用いた相同組み換え技術、CRISPR/Cas9、TALEN、ZFNなどのゲノム編集技術を用いて作製することができる。
　配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立した上記iPSCと同一の遺伝的背景を有し、ヒトPKP2遺伝子にACの原因となるホモ接合変異を有するiPSCにおけるヒトPKP2遺伝子の変異は、AC患者が有する変異、すなわち配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するフレームシフト変異であってもよく、AC患者が有する変異と異なる変異であってもよい。AC患者が有する変異と異なる変異である場合、ACの原因となる変異であれば特に限定されないが、AC患者が有する変異と類似の変異が好ましい。配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するフレームシフト変異は、フレームシフトにより終止コドンが生じ424アミノ酸長の変異PKP2タンパク質が生じる（野生型PKP2タンパク質は全長837アミノ酸）。それゆえ、AC患者が有する変異と異なる変異は、424アミノ酸長と類似のアミノ酸長を有する変異PKP2タンパク質が生じる変異であることが好ましい。類似のアミノ酸長としては、例えば±20アミノ酸長、±15アミノ酸長、±10アミノ酸長であってもよい。
　配列番号4で示されるヒトDSG2遺伝子の塩基配列において355位のシトシンがチミンに置換されたホモ接合ストップゲイン変異を有するAC患者から樹立した上記iPSCと同一の遺伝的背景を有し、ヒトDSG2遺伝子にACの原因となるヘテロ接合変異を有するiPSCにおけるヒトDSG2遺伝子の変異は、AC患者が有する変異、すなわち配列番号4で示されるヒトDSG2遺伝子の塩基配列において355位のシトシンがチミンに置換されたストップゲイン変異であってもよく、AC患者が有する変異と異なる変異であってもよい。AC患者が有する変異と異なる変異である場合、ACの原因となる変異であれば特に限定されないが、AC患者が有する変異と類似の変異が好ましい。配列番号4で示されるヒトDSG2遺伝子の塩基配列において355位のシトシンがチミンに置換されたホモ接合ストップゲイン変異は、生じたストップコドンにより全長118アミノ酸長の変異DSG2タンパク質が生じる（野生型DSG2タンパク質は全長1118アミノ酸）。それゆえ、AC患者が有する変異と異なる変異は、118アミノ酸長と類似のアミノ酸長を有する変異DSG2タンパク質が生じる変異であることが好ましい。類似のアミノ酸長としては、例えば±20アミノ酸長、±15アミノ酸長、±10アミノ酸長であってもよい。
〔内在性デスモグレイン2の蛍光イメージング用AC患者由来多能性幹細胞〕
　本発明は、配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立した多能性幹細胞、当該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し（アイソジェニック）ヒトPKP2遺伝子にACの原因となるホモ接合変異を有する多能性幹細胞、および、当該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し（アイソジェニック）ヒトPKP2遺伝子のヘテロ接合フレームシフト変異が正常遺伝子に修正された多能性幹細胞の各多能性幹細胞における内在性DSG2タンパク質が蛍光タンパク質との融合タンパク質として発現されるように改変された多能性幹細胞を提供する。
　配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立した多能性幹細胞は、上記のHPS4885、HPS4886およびHPS4887のHPS番号が付されているiPSCのいずれかであってもよい。当該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し（アイソジェニック）ヒトPKP2遺伝子にACの原因となるホモ接合変異を有する多能性幹細胞は、上記のHPS4889およびHPS4890のHPS番号が付されているiPSCのいずれかであってもよい。当該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し（アイソジェニック）ヒトPKP2遺伝子のヘテロ接合フレームシフト変異が正常遺伝子に修正された多能性幹細胞は、上記のHPS4888のHPS番号が付されているiPSCであってもよい。
　本発明の内在性DSG2蛍光イメージング用多能性幹細胞は、DSG2と蛍光タンパク質の融合タンパク質が発現するように、上記各多能性幹細胞のDSG2遺伝子の下流に蛍光タンパク質遺伝子を挿入することにより作製することができる。DSG2と蛍光タンパク質の融合タンパク質を発現する上記多能性幹細胞は、公知の遺伝子組換え技術を用いて作製することができる。例えば、ターゲィングベクターを用いた相同組み換え技術、CRISPR/Cas9、TALEN、ZFNなどのゲノム編集技術を用いて作製することができる。
　用いる蛍光タンパク質は特に限定されず、生体細胞イメージングに使用可能な公知の蛍光タンパク質から適宜選択して用いることができる。公知の蛍光タンパク質としては、例えば、tdTomato（赤色蛍光タンパク質）、GFP（緑色蛍光タンパク質）、これらの誘導体を含む蛍光タンパク質などが挙げられる。公知の蛍光タンパク質のアミノ酸配列情報およびそれをコードする遺伝子の塩基配列情報は、公知のデータベース（NCBI等）から取得することができる。
　配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立したiPSCのDSG2遺伝子の下流にtdTomato遺伝子を挿入した内在性DSG2蛍光イメージング用iPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センター（RIKEN BRC、〒305-0074茨城県つくば市高野台3丁目1-1）に寄託されており、HPS5039のHPS番号が付されている。配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立したiPSCと同一の遺伝的背景を有し、ヒトPKP2遺伝子にACの原因となるホモ接合変異を有するiPSCのDSG2遺伝子の下流にtdTomato遺伝子を挿入した内在性DSG2蛍光イメージング用iPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センターに寄託されており、HPS5041のHPS番号が付されている。配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立したiPSCと同一の遺伝的背景を有し、ヒトPKP2遺伝子のヘテロ接合フレームシフト変異が正常遺伝子に修正されたiPSCのDSG2遺伝子の下流にtdTomato遺伝子を挿入した内在性DSG2蛍光イメージング用iPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センターに寄託されており、HPS5040のHPS番号が付されている。これらiPSCは、理化学研究所バイオリソース研究センターから入手することができる。
〔アイソジェニック多能性幹細胞セット〕
　本発明は、配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立した多能性幹細胞、当該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し（アイソジェニック）ヒトPKP2遺伝子にACの原因となるホモ接合変異を有する多能性幹細胞、および、当該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し（アイソジェニック）上記ヒトPKP2遺伝子のヘテロ接合フレームシフト変異が正常遺伝子に修正された多能性幹細胞の3種類の多能性幹細胞を含む多能性幹細胞セットを提供する。
　本発明の多能性幹細胞セットは、上記3種類のうちの2種類からなる多能性幹細胞セットであってもよい。2種類からなる多能性幹細胞セットは、ホモ接合変異を有する多能性幹細胞と正常多能性幹細胞のセット、ヘテロ接合変異を有する多能性幹細胞と正常多能性幹細胞のセット、ホモ接合変異を有する多能性幹細胞とヘテロ接合変異を有する多能性幹細胞のセットのいずれであってもよいが、ホモ接合変異を有する多能性幹細胞と正常多能性幹細胞のセットが好ましい。
　本発明は、配列番号4で示されるヒトDSG2遺伝子の塩基配列において355位のシトシンがチミンに置換されたホモ接合ストップゲイン変異を有するAC患者から樹立した多能性幹細胞、当該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し（アイソジェニック）ヒトDSG2遺伝子にACの原因となるヘテロ接合変異を有する多能性幹細胞、および、当該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し（アイソジェニック）上記ヒトDSG2遺伝子ホモ接合ストップゲイン変異が両アレルとも正常遺伝子に修正された多能性幹細胞の3種類の多能性幹細胞を含む多能性幹細胞セットを提供する。
　本発明の多能性幹細胞セットは、上記3種類のうちの2種類からなる多能性幹細胞セットであってもよい。2種類からなる多能性幹細胞セットは、ホモ接合変異を有する多能性幹細胞と正常多能性幹細胞のセット、ヘテロ接合変異を有する多能性幹細胞と正常多能性幹細胞のセット、ホモ接合変異を有する多能性幹細胞とヘテロ接合変異を有する多能性幹細胞のセットのいずれであってもよいが、ホモ接合変異を有する多能性幹細胞と正常多能性幹細胞のセットが好ましい。
　本発明は、配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立した多能性幹細胞のDSG2遺伝子の下流にtdTomato遺伝子を挿入した内在性DSG2蛍光イメージング用多能性幹細胞、当該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し（アイソジェニック）ヒトPKP2遺伝子にACの原因となるホモ接合変異を有する多能性幹細胞のDSG2遺伝子の下流にtdTomato遺伝子を挿入した内在性DSG2蛍光イメージング用多能性幹細胞、および、当該多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し（アイソジェニック）ヒトPKP2遺伝子のヘテロ接合フレームシフト変異が正常遺伝子に修正された多能性幹細胞のDSG2遺伝子の下流にtdTomato遺伝子を挿入した内在性DSG2蛍光イメージング用多能性幹細胞の3種類の多能性幹細胞を含む多能性幹細胞セットを提供する。
　本発明の多能性幹細胞セットは、上記3種類のうちの2種類からなる多能性幹細胞セットであってもよい。2種類からなる多能性幹細胞セットは、ホモ接合変異を有する多能性幹細胞と正常多能性幹細胞のセット、ヘテロ接合変異を有する多能性幹細胞と正常多能性幹細胞のセット、ホモ接合変異を有する多能性幹細胞とヘテロ接合変異を有する多能性幹細胞のセットのいずれであってもよいが、ホモ接合変異を有する多能性幹細胞と正常多能性幹細胞のセットが好ましい。
　本発明のアイソジェニック多能性幹細胞セットの多能性幹細胞はiPSCであってもよい。
〔AC研究用キット〕
　本発明は、AC研究用キットを提供する。本発明のAC研究用キットは、上記本発明の多能性幹細胞セットを含むものであればよい。これ以外のキットの構成は特に限定されず、研究目的に応じて必要な試薬類、トレイやチューブ等の器具類、扱説明書等が含まれていてもよい。本発明のキットを使用することにより、精度の高いAC研究を簡便かつ迅速に実施することができる。
〔AC治療薬のスクリーニング用キット〕
　本発明は、AC治療薬のスクリーニング用キットを提供する。本発明のスクリーニング用キットは、上記本発明の多能性幹細胞セットを含むものであればよい。これ以外のキットの構成は特に限定されず、必要な試薬類、トレイやチューブ等の器具類、扱説明書等が含まれていてもよい。本発明のキットを使用することにより、以下に説明するAC治療薬のスクリーニング方法を簡便かつ迅速に実施することができる。
〔AC治療薬のスクリーニング方法〕
　本発明はAC治療薬のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、配列番号2で示されるヒトPKP2遺伝子の塩基配列において1228位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異を有するAC患者から樹立した多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し、ヒトPKP2遺伝子にACの原因となるホモ接合変異を有する多能性幹細胞、または、当該多能性幹細胞のDSG2遺伝子の下流にtdTomato遺伝子を挿入した内在性DSG2蛍光イメージング用多能性幹細胞、または、配列番号4で示されるヒトDSG2遺伝子の塩基配列において355位のシトシンがチミンに置換されたホモ接合ストップゲイン変異を有するAC患者から樹立した多能性幹細胞を使用するものであってもよい（以下これらの多能性幹細胞を「ホモ接合変異細胞」と称する）。
　また、本発明のスクリーニング方法は、上記ホモ接合変異細胞から分化誘導した心筋細胞を使用するものであってもよく、上記ホモ接合変異細胞から心筋細胞への分化誘導過程の細胞を使用するものであってもよい。多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導方法は特に限定されず、公知の分化誘導方法を好適に用いることができる。ホモ接合変異細胞から心筋細胞への分化誘導過程の細胞は、分化誘導過程のいずれ時期の細胞を用いてもよい。以下、本発明のスクリーニング方法に用いる細胞を、「試験細胞」と称する。
　本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（１）～（３）を含むものであればよい。
（１）被験物質を上記試験細胞に接触または導入する工程、
（２）該細胞におけるACを反映する表現型を評価する工程、および
（３）被験物質を接触または導入していない前記細胞における該表現型の評価結果と比較してACを改善する被験物質を選択する工程。
　工程（１）は、被験物質を上記試験細胞に接触または導入する。被験物質は特に限定されず、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等であってもよい。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。
　被験物質を試験細胞に接触させる方法は特に限定されない。例えば、試験細胞を培養する培地に被験物質を添加する方法などが挙げられる。被験物質を試験細胞に導入する方法も特に限定されず、例えば、リポフェクション、マイクロインジェクション、ウイルスベクター、プラスミドベクター等が挙げられる。また、被験物質を接触または導入しない対照群を設けることが好ましい。
　工程（２）は、工程（１）で被験物質を接触または導入した試験細胞におけるACを反映する表現型を評価する。ACを反映する表現型の評価項目としては、例えば、（i）モーションベクトル解析における収縮速度、拡張速度、収縮・拡張距離、伝播速度の異常、（ii）カルシウムイメージングにおける細胞内カルシウム濃度、カルシウムトランジエントの異常、（iii）マイクロ電極アレイを用いた異常電位の検出、（iv）組織構築化したiPS分化心筋を用いた組織強度、収縮力の異常、（v）免疫染色や蛍光標識タンパク質を用いたライブイメージングによるデスモゾームタンパク質異常局在、（vi）ウエスタンブロッティングによるデスモゾームタンパク質発現量変化などが挙げられる。
　モーションベクトル解析は、例えば「J Mol Cell Cardiol 77, 178-191, doi:10.1016/j.yjmcc.2014.09.010 (2014)」に記載の方法で行うことができる。カルシウムイメージングは、公知の方法から適宜選択して用いることができる。例えば「Toxicol Sci 148, 503-516, doi:10.1093/toxsci/kfv201 (2015)」に記載の方法を用いてもよい。マイクロ電極アレイを用いた異常電位の検出は、例えば「Stem Cell Reports 9, 1546-1559, doi:10.1016/j.stemcr.2017.09.007 (2017)」に記載の方法で行うことができる。組織構築したiPS分化心筋の機能解析は、例えば「bioRxiv preprint first posted online Jul. 27, 2019; doi: http://dx.doi.org/10.1101/717108」に記載の方法で行うことができる。免疫染色や蛍光標識タンパク質を用いたライブイメージングおよびウエスタンブロッティングは、公知の方法から適宜選択して用いることができる。
　工程（３）は、被験物質を接触または導入していない試験細胞における表現型の評価結果と比較して、接触または導入することによりACを改善する被験物質を選択する。例えば、モーションベクトル解析結果を評価した場合は、ACにおける収縮速度、拡張速度、収縮・拡張距離、伝播速度の異常が、被験物質を添加していないコントロールに比べて有意に改善する被験物質を選択する。カルシウムイメージングによる評価を行った場合は、ACにおける細胞内カルシウム濃度、カルシウムトランジエントの異常が、被験物質を添加していないコントロールに比べて有意に改善する被験物質を選択する。マイクロ電極アレイを用いて電位の検出を行った場合は、ACにおける異常電位が、被験物質を添加していないコントロールに比べて有意に減少または消失する被験物質を選択する。組織構築化したiPS分化心筋を評価した場合は、ACにおける組織強度、収縮力の異常が、被験物質を添加していないコントロールに比べて有意に改善する被験物質を選択する。免疫染色や蛍光標識タンパク質を用いたライブイメージングによる評価を行った場合は、ACにおけるデスモゾームタンパク質異常局在が、被験物質を添加していないコントロールに比べて有意に改善する被験物質を選択する。ウエスタンブロッティングによる評価を行った場合は、ACにおけるデスモゾームタンパク質発現量変化の異常が、被験物質を添加していないコントロールに比べて有意に改善する被験物質を選択する。
　なお、本発明のスクリーニング方法において、コントロール細胞として上記試験細胞とアイソジェニックなヘテロ接合変異細胞および／または上記試験細胞とアイソジェニックな正常細胞を使用してもよい。コントロール細胞として上記試験細胞とアイソジェニックなヘテロ接合変異細胞および／または上記試験細胞とアイソジェニックな正常細胞を使用した場合、従来の健常人から樹立したコントロール細胞を使用した場合に比べ、アイソジェニック細胞では疾患遺伝子変異のみを改変しているため、変異遺伝子に特異的な異常を検出し、その機能解析に有用である。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例１：PKP2のヘテロ接合フレームシフト変異を持つAC患者由来iPSCの樹立とアイソジェニックiPSCセットの作製
〔材料および方法〕
（１）ヒト試料
　患者から得た試料の使用とゲノム解析は、大阪大学医学部附属病院の倫理委員会によって承認され、書面によるインフォームドコンセントを得た。
（２）抗体および試薬
　以下の抗体および試薬を使用した。抗Oct-3/4抗体(C-10)（Santa Cruz Biotechnology, Dallas, Texas, USA, Cat# sc-5279, RRID: AB_628051）、抗TRA-1-60抗体（Merck Millipore, Burlington, Massachusetts, USA, Cat# MAB4360, RRID: AB_2119183）、抗SSEA-4抗体（Merck Millipore, Cat# MAB4304, RRID: AB_177629）、抗Nanog抗体（Abcam, Cambridge, MA, USA, Cat# ab80892, RRID: AB_2150114）、抗DSG2抗体(AH12.2)（Santa Cruz Biotechnology, Cat# sc-80663 RRID: AB_2093438）、抗PKP2抗体（PROGEN, Germany, Cat#651167）（免疫染色）、抗PKP2抗体（Abcam Cat# ab151402）（ウエスタンブロッティング）、抗γ-Catenin抗体（Cell Signaling Technology, Tokyo, Japan, Cat# 2309, RRID: AB_823448）、抗Desmocollin-2/3抗体(7G6)（Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA, Cat#32-6200, RRID:AB_2533090）、抗Connexin 43抗体（Cell Signaling Technology, Cat# 3512, RRID: AB_2294590）、抗Troponin T抗体（(Abcam Cat# ab64623, RRID:AB_1139590）（ウエスタンブロッティング）、抗GAPDH抗体（Santa Cruz Biotechnology Cat# sc-47724, RRID: AB_627678）、抗Sarcomeric Alpha Actinin抗体(EA-53)（Abcam, Cat# ab9465, RRID: AB_307264）、抗Vimentin抗体（Abcam Cat# ab24525 RRID:AB_778824）、BV421 Mouse IgG1, κ Isotype Control（BD Bioscience, Tokyo, Japan, Cat# 562438, RRID: AB_2721018）、BV421 Mouse Anti-Cardiac Troponin T（BD Bioscience, Cat# 565618, RRID: AB_2739306）（フローサイトメトリー）、Puromycin dihydrochloride（SIGMA, cat# P9620-10ML）
（３）アンプリコンシーケンス解析
　QIAAmp DNAミニキット（QIAGEN）を用いて、患者の末梢血からゲノムDNAを抽出した。Ion AmpliSeq Library KitとIon Ampliseq Cardiovascular Research Panel（心血管機能に影響を与える変異を有することが知られている404遺伝子をカバーする10,430 PCRアンプリコン）を用いてゲノムDNAライブラリを調製し、318チップを備えたIon PGMを用いてシーケンスを実行した。TorrentSuite（バージョン5.2.2、Life Technologies）を使用して、シーケンスデータを分析した。30未満の低品質スコアのバリアントまたは30未満の低読み取り深度のバリアントは除外した。アミノ酸変化のない同義変異は除外した。ヒト遺伝的変異データベース（HGMD）またはESP 6500データベースにおいてアレル頻度が1％を超えて存在する場合、変異体は良性であると分類された。PKP2のヘテロ接合フレームシフト変異（c.1228 dupG、p.D410fs）は、HGMD、ESP 6500、1000ゲノムデータベースまたはARVD/C遺伝的変異データベースのいずれでも報告されていなかった。
（４）細胞培養および心筋細胞分化
　HEK293T細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS、Gibco）およびペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン（PSG、Gibco）を含む高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（DMEM、Gibco）で維持された。
　iPSCは、1228 dupG変異を持つACと診断された患者（診断名はARVC）の末梢血単核細胞（PBMC）から樹立された。フィコールパック（Ficoll-Paque、GE）を使用して末梢全血から、末梢血単核細胞（PBMC）を分離した。OCT3/4、SOX2、KLF4およびc-MYCを含むセンダイウイルスベクター（CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Life Technologies）を用いてリプログラミングを実行した。iPSCは、ラミニンコーティングプレート上でStemFit AK02N（AJINOMOTO）を用いてフィーダーフリー条件下で培養した（Nakagawa, M. et al., A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells, Sci Rep 4, 3594, doi:10.1038/srep03594 (2014)）。Burridgeら（Burridge, P. W. et al., Chemically defined generation of human cardiomyocytes, Nat Methods 11, 855-860, doi:10.1038/nmeth.2999 (2014)）のプロトコルに従って、iPSCを心筋細胞に分化させ、ヒトアルブミンとアスコルビン酸を補充したRPMI 1640培地で維持した。HDR、NHEJおよびHetero iPSCから分化させた心筋細胞（iPSC-CM）を使用した連続観察実験では、分化した単層心筋細胞を10-12日まで培養し、5 mM DL-乳酸ナトリウム（SIGMA）を含む培地で2-4日間純化し、その後、14日目に培地を10％ウシ胎児血清（FBS）、1％ペニシリン/ストレプトマイシンおよび2 mM L-グルタミン（PSG、Gibco、Thermo Fisher Scientific）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に交換した。免疫染色実験とその後のハイコンテンツイメージングのために、分化したiPSC-CMをトリプシン処理し、ゼラチン（Nitta Gelatin）でプレコートした96ウェルクリアプレート（Greiner）に再播種し、血清を含むDMEMを用いてインキュベートした。
（５）免疫蛍光染色
　iPSCを96ウェルクリアプレート（Greiner）に1,000細胞/ウェルで播種し、コロニー形成のために37℃でインキュベートした。分化したiPSC-CMを0.25％トリプシン-EDTAで処理し、10％FBS、PSGおよび10μMY-27632（Wako）を含むDMEMで懸濁し、100μm細胞ストレーナー（FALCON）でろ過した。ゼラチン（Nitta Gelatin）でプレコートした96ウェルクリアプレートに、10,000細胞/ウェルで心筋細胞を播種した。免疫染色では、細胞を4％パラホルムアルデヒドで15分間固定し、0.5％Triton X-100で15分間透過処理し、1％BSAで室温30分間または4℃一晩ブロック処理した。一次抗体を1％ウシ血清アルブミン（BSA）で希釈し、各ウェルに加え、室温1時間または4℃一晩インキュベートした。核染色用のHoechst 33342またはAlexa 568結合ファロイジン（Thermo）を含むAlexa Fluor Dyes（Molecular Probe）と結合した二次抗体を加え、室温で30分間インキュベートした。すべての画像は、IN Cell Analyzer 6000（GE Healthcare）を使用して取得した。
（６）一本鎖アニーリングアッセイ
　pCAG-EGxxFPベクター（Mashiko, D. et al., Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA, Sci Rep 3, 3355, doi:10.1038/srep03355 (2013)）のEGFP配列の中間に設けられたマルチクローニングサイト（MCS）に標的ゲノム配列をクローニングした。このベクターは標的ゲノム配列部分がgRNAとCAS9複合体により切断されるとEGFP配列が修復して細胞が緑色蛍光を発するようになる。このpCAG-EGxxFPベクターと、SpCas9および指定されたsgRNAをコードするpX459ベクター（Ran, F. A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc 8, 2281-2308, doi:10.1038/nprot.2013.143 (2013)）とを、Greiner CELLSTAR 96ウェルプレート（1×104細胞/ウェル）にあらかじめ播種した293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、EGFPの蛍光画像をハイコンテンツ画像解析（IN Cell Analyzer 6000、GE）で取得し、IN Cell Developer Toolbox（GE）を使用して定量的に解析した。10×/0.45NA ニコンレンズを使用した1回の実験で、各サンプルから合計36の非オーバーラップ画像（ウェルあたり9画像）を取得した。
（７）Cel-Iアッセイ
　HEK293T細胞を24ウェルプレートに播種し（5×104細胞/ウェル）、1日後に、Lipofectamine 3000（Life Technologies）を用いてpX459ベクターをトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、培地を1.0μg/mLのピューロマイシンを含む培地に交換し、Cas9を発現する細胞を選択した。ピューロマイシン選択後、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN）を用いてゲノムDNAを抽出した。以下の条件でPCR（KOD Fx Neo、TOYOBO）を行い、標的領域を増幅した：94℃2分に続き、98℃30秒/プライマーに応じたアニーリング温度30秒/68℃30秒のサイクルを33サイクル。QIAquick PCR精製キット（QIAGEN）を用いてPCR産物を精製した後、未処理アレルおよび処理アレルの両方のPCR断片をハイブリダイズして、ヘテロDNA二本鎖を形成した。次に、ハイブリダイズしたPCRヘテロ二本鎖を、ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼCel-Iで42℃60分間酵素的に消化し（SURVEYOR突然変異検出キット）、電気泳動に供した。
（８）プラスミド
　CRISPR Design Toolを用いてPKP2の1228 dupG変異の周辺ゲノム領域をターゲットとするgRNA配列を設計し、pX459ベクターにクローニングした。PKP2遺伝子の1228 dupG変異周辺の5’末端および3’末端相同性アームのDNA配列は、野生型ゲノムDNAから増幅し、pCR bluntII-TOPOベクター（Thermo）にクローニングした。全長ヒトPKP2をコードする配列は、ORFクローン（Dharmacon）からpENTR/D-TOPOベクター（Thermo）にサブクローニングした。培養細胞での発現のために、Gatewayシステム（Invitrogen）を使用してPKP2配列をpcDNA3.1/nV5-DEST（Thermo）に再結合した。N末端FLAGタグ付きタンパク質を生成するために、PCRベースの変異誘発により、FLAGエピトープをコード配列の前に挿入した。AAV作製のために、N末端FLAGタグ付き全長PKP2配列をpAAVベクター（TaKaRa）にサブクローニングした。
（９）AAVの作製および精製
　AAV2を作製するために、リン酸カルシウムトランスフェクション（CalPhos Mammalian Transfection Kit、TaKaRa）を用いて、N末端FLAGタグ付きPKP2をコードするpAAVベクター、pHelperベクターおよびpRC6 Vector（AAVpro Helper Free System、TaKaRa）をHEK293T細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの72時間後、1/80容量の0.5M EDTA（pH 8.0）を添加してHEK293T細胞を剥離し、低速遠心分離（2000×g、10分間）によりペレット化した。細胞ペレットをAAV Extraction Solution Aで溶解し、遠心分離した（9000×g、10分間）。上清を回収し、AAV Extraction Solution Bを添加して-80℃で保存した。HEK293T細胞から回収したAAVは、AAVpro Purification Kit（TaKaRa）を用いて精製し、AAV Titration Kit（TaKaRa）を用いてウイルス力価を測定した。
（１０）RNA抽出および定量リアルタイムPCR
　RNeasy mini kit（QIAGEN）を用いてトータルRNAを抽出し、high capacity RNA-to cDNA RT kit（Thermo）を用いてcDNAに変換した。サイバーグリーンまたはプローブ法（THUNDERBIRD SYBR, probe qPCR mix, TOYOBO）を用いて、定量リアルタイムPCRを行った。すべてのサンプルはデュプリケートで行った。各転写産物のレベルは、TBPまたはGAPDHを内部コントロールとして使用した閾値サイクル（Ct）法によって定量化した。
（１１）ドロップレットデジタルPCRおよび定量リアルタイムPCR
　ドロップレットデジタルPCR（Droplet digital PCR: ddPCR）は、QX200 ddPCRシステム（BIORAD）を使用して行った。PKP2の野生型アレルまたは1228 dupGアレルからの転写産物を特異的に検出するために、HEXまたはFAM標識プローブを設計した（図6参照）（アッセイID：dMDS329472318、BIORAD）。また、野生型および1228 dupG転写産物の両方を検出するために、既製のPKP2用FAM標識プローブを使用した（図6参照）（アッセイID：qHsaCIP0027871、BIORAD）。PCR反応後、QX200ドロップレットリーダー（BIORAD）を用いて生成したドロップレットを検出および分析した。TBPは内部コントロールとして使用した（アッセイID：dHsaCPE5058363、BIORAD）。
（１２）ヒトiPSCへのプラスミドのトランスフェクションと標的クローンの選択
　ゲノム編集用のプラスミド構築物を、Liらの方法（Li, H. L. et al. Precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9. Stem Cell Reports 4, 143-154, doi:10.1016/j.stemcr.2014.10.013 (2015)）を一部改変してiPSCにトランスフェクトした。5μgのpX459プラスミドを、NEPA21エレクトロポレーターを使用して1×105細胞にエレクトロポレーションした（ポーリングパルス電圧：125V、パルス幅：5ミリ秒、パルス数：2、Nepagene）。HDRを介したゲノム編集のために、5μgの修復テンプレートDNAプラスミド（pCR bluntII-TOPOベクター）を追加でトランスフェクトした。エレクトロポレーション後48時間以内にピューロマイシン（0.3μg/ mL）を添加した。トランスフェクションの3日後、クローンコロニー形成のためにiPSCを200細胞の密度で35mmディッシュに継代した。同時にゲノムDNAを抽出し、ゲノム編集結果が直接配列決定によって評価された。iPSCコロニーの形成後、各コロニー（少なくとも24コロニー）をピックアップし、滅菌チューブ内で単一細胞に分散させた。ジェノタイピングと細胞増殖の両方のために、細胞懸濁液を2つの96ウェルプレートに分けた。ゲノムDNAを抽出し、ターゲットゲノム領域をPCRで増幅し、pCR bluntII-TOPOベクターにクローニングした後、ダイレクトシーケンスまたはシーケンス分析で評価した。標的の単一クローンiPSCを得るために、細胞を新しいディッシュに繰り返し継代してクローンコロニーを形成させた。
（１３）ウエスタンブロッティング
　ウエスタンブロッティングのために、細胞を冷PBSで洗浄し、SDSバッファー（10% SDS、50mM Tris-HCl（pH7.4）、5mM EDTA）で直接溶解した。BCA Protein Assay Kit（Thermo）を用いてタンパク質濃度を測定した。細胞溶解液を、メルカプトエタノール（2.5％）を含む4×Laemmliサンプルバッファー（BIORAD）と混合した。タンパク質をSDS-PAGEで分離し、PVDFメンブレンに転写した。抗体は3％脱脂乳で希釈した。転写膜を3％脱脂乳で1時間ブロッキングした後、一次抗体と4℃で一晩インキュベートし、二次抗体と室温で30分間インキュベートした。膜シグナルは、ECLまたはECLプライム試薬（GE）を用いた化学発光により検出した。ImageQuant TL（GE）を用いて、タンパク質発現レベルを定量した。各タンパク質の発現レベルは、GAPDHの発現レベルによって正規化した。
（１４）細胞運動分析
　Cell Motion Imaging System（SI8000、SONY）を用いてiPSCから分化した心筋細胞（iPSC-CM）の細胞運動プロファイルを取得した。フレームレート150 fps、解像度1024×1024ピクセルの4倍の対物レンズで動画を記録した。動画は、6ウェルプレートで培養した各アイソジェニックiPSC-CMの3つのウェルの少なくとも3つのフィールドから取得した。各画像において、64×64ピクセルの9つの関心領域（ROI）からモーションパラメータを計算した。データは、3つの独立した分化実験から取得した。観察期間中、X軸およびY軸として定義された固定位置が連続して観察された。最大収縮速度（CV）、弛緩速度（RV）、および収縮－弛緩プロセス中の平均変形距離（DD）が、CVおよびRVピークの下の総面積として計算された。モーションベクトルによって計算されたCVおよびDDは、それぞれ収縮機能または収縮力を表す。カラーマッピング画像は、収縮するiPSC-CMの運動伝播を視覚化した。
（１５）統計解析
　特に明記しない限り、データは少なくとも3回の独立した実験からの平均±標準偏差で表される。統計分析は、ノンパラメトリックデータに対してスチューデントのt検定またはウィルコクソン検定のいずれかにより、JMP（SAS、Cary、NC）を使用して行った。p値が0.05未満の場合に統計的に有意であるとみなした。
〔実験１：PKP2のヘテロ接合フレームシフト変異を持つAC患者からのiPSCの樹立〕
　心室細動による院外心停止後に蘇生した19歳の女性患者は、父親と伯父に不整脈の家族歴がある（図1（A））。この患者は、3つの主要な基準（再分極異常、不整脈、およびPKP2遺伝子の病的変異を伴う家族歴）に従ってACと診断された（診断名はARVC）。患者の心エコー検査では、右心室の拡大は明らかではなく、駆出率と左心室径は正常範囲内であることが示された（図1（B））。
　この患者の末梢血からゲノムDNAを抽出し、ダイレクトサンガーシーケンス解析を行い、遺伝性心血管疾患に関連する遺伝子変異の有無を調べた。Ion Ampliseq心血管研究パネルを使用して、遺伝性心血管疾患に関連する合計404の遺伝子をスクリーニングし、以前報告されていなかったPKP2遺伝子のヘテロ接合フレームシフト変異（c.1228dup G、p D410fsX425）であることを確認した（図2）。アスパラギン酸（D410fs）のフレームシフト変異の結果、残基425（X425）でアミノ酸が停止した。ACの原因遺伝子として報告されている他のデスモソーム遺伝子（DSC2、DSG2、JUPまたはDSP）に有害な突然変異は検出されなかった。このPKP2遺伝子のヘテロ接合フレームシフト変異（1228 dupG）は、患者の父親も有していた。
　患者から得た末梢血単核白血球からiPSCを樹立した。樹立されたiPSCは、多能性マーカータンパク質であるSSEA4、TRA-1-60、OCT4およびNANOGが陽性であり（図3）、正常な核型を保有していた（図4）。
　患者由来のiPSCのゲノムDNAおよびトータルRNAから逆転写により得られたcDNAを用いて、ダイレクトサンガーシーケンス解析を行った。結果を図5に示した。ゲノムDNAのエレクトロフェログラムには野生型アレルと変異アレルの二重シグナルが観察されたが、cDNAのエレクトロフェログラムには野生型アレルのシグナルのみが観察された。この結果は、変異アレルからの転写産物が不安定であり、分解されたことを示唆している。
　患者由来のiPSCと健康な被験者（コントロール）から樹立したiPSCの各細胞溶解液を調製し、PKP2タンパク質の発現量をウエスタンブロッティングで検出した結果を図6に示した。PKP2タンパク質の発現量は、患者由来iPSCで減少していることが示された。
　患者由来のiPSCおよび当該iPSCから分化させた心筋細胞（iPSC-CM）の各アレルから生成される転写産物の量を正確に評価するために、ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）分析を行った。結果を図8および図9に示した。患者由来のiPSCにおける変異アレル（1228 dupG）の転写産物のコピー数は、野生型アレルの転写産物のコピー数の27％に減少していることが示された。
　患者由来のiPSCを心筋細胞に分化させ、トロポニンT陽性細胞の割合をFACS分析により測定した。結果を図10に示した。分化誘導後10日目において、約80～90％の細胞がトロポニンT陽性心筋細胞であった。
　患者由来のiPSCおよび当該iPSCから分化させた心筋細胞（iPSC-CM）の各アレルから生成される転写産物の相対コピー数を算出した結果を図11に示した。分化誘導後10日目のiPSC-CMの野生型アレルの転写産物のコピー数は、未分化iPSCの約30倍増加したことが明らかになった。未分化iPSCと分化誘導後10日目のiPSC-CM間の変異アレル（1228 dupG）の転写産物の増加率は低いままであった。分化後iPSC-CMにおいて、野生型アレル転写産物のコピー数は、変異アレル転写産物のおよそ10倍であった。この結果は、変異アレル（1228 dupG）の転写産物が不安定であり、野生型アレルと変異アレル（1228 dupG）の転写産物の絶対量の差が、PKP2の高発現を必要とする分化心筋細胞で増加したことを示唆している。
〔実験２：アイソジェニックiPSCセットの作製〕
　患者由来iPSCのPKP2遺伝子における、相同組換え修復（homology-directed repair: HDR）による変異フレームシフトアレルの修正と、非相同末端連結修復（non-homologous end joining: NHEJ）によるホモ接合フレームシフト変異導入のために、PKP2遺伝子のエクソン5の変異（1228 dupG）の隣接領域を標的とする4つのgRNAを設計した（図12）。gRNA＃1はPAM配列として変異AGG配列を使用し、gRNA＃2はその5'領域の変異配列に対応する20 bp配列を含むように設計した。gRNA＃3および＃4は、野生型アレルおよび変異アレルの両方が共通の標的になるように設計した。
　HEK293T細胞において、pCAG-EGxxFPベクターとpX459ベクターを使用して一本鎖アニーリング（SSA）アッセイを行い、各gRNAの切断活性を評価した。結果を図13に示した。（A）は野生型アレルの切断結果、（B）は変異アレルの切断結果である。gRNA＃1は重複したGを含む変異配列を特異的に切断したが、野生型配列を切断しなかった。gRNA＃2の切断活性は、gRNA＃1と比較して低かった。gRNA＃3および＃4の切断活性は、gRNA＃4のほうが高かった。
　HEK293T細胞の内因性PKP2遺伝子座を標的とするgRNA＃1および＃4の切断活性をCel-Iアッセイにより評価した。結果を図14に示した。HEK293T細胞の内因性PKP2遺伝子座の標的配列は、gRNA＃4によって切断されたが、gRNA＃1によって切断されなかった。患者由来のiPSCにgRNA＃1をコードするpx459ベクターをトランスフェクトし、サンガーシーケンス解析により、PKP2遺伝子座にNHEJを有するiPSCクローンをスクリーニングした結果、ゲノム切断が1228 dupG配列を含む変異部位に特異的に導入されたことが明らかになった。これらの結果から、患者由来のiPSCのPKP2遺伝子の標的ゲノムを置き換えるためにgRNA＃1および＃4を選択した。
　非相同末端連結修復（NEHJ）によりPKP2遺伝子に患者の変異配列を模倣したホモ接合フレームシフト変異を導入するために、gRNA＃4をコードするpX459ベクターを患者由来のiPSCにトランスフェクトした。数回の同胞選択後に、ホモ接合フレームシフトアレルを含むiPSCクローンを取得し、NEHJと命名した（図15）。NHEJクローンは、両方のアレルにホモ接合31bp欠失を保有しており、411アミノ酸の短いPKP2タンパク質を産生すると考えられた（図16）。次に、相同組換え修復（HDR）により変異配列を置換するために、PKP2の1228Gの前後に1035bpの5'ホモロジーアームと497bpの3'ホモロジーアームが配置された野生型配列を含む修復テンプレートDNAを作製した（図17）。修復テンプレートベクターとgRNA＃1をコードするpX459ベクターを組み合わせて患者由来のiPSCにトランスフェクトした。同胞選択を繰り返し、ホモ接合野生型アレルを含むiPSCクローンを取得し、HDRと命名した。また、同じ同胞選択手順の間に、コントロールとしてPKP2にヘテロ接合フレームシフト変異を持つゲノム配列がそのまま残っているiPSCクローンを取得し、Heteroと命名した。これらのiPSCクローンは、丸いコロニーを均一に示し、多能性マーカーを発現し、正常な核型を示した。
　各iPSCクローンの転写産物を評価するために、野生型および変異型の両方の転写産物を標的とする共通プローブ（図7参照）を使用した定量的リアルタイムPCR分析を行った。結果を図18に示した。HDRのPKP2遺伝子の相対的mRNA発現レベルがHeteroから回復し、コントロールiPSCの発現レベルに近くなったことが示された。次に、ドロップレットデジタルPCR（ddPCR）分析を行い、その結果を図19に示した。1228dupGアレルからの変異転写物はHDRおよびNHEJクローンで完全に減少し、HDRの野生型アレルからの転写産物はHeteroから正確に2倍増加して回復していることが示された。さらに、ウエスタンブロッティング分析を行い、その結果を図20に示した。PKP2タンパク質の発現レベルは、NHEJクローンでは検出されず、HDRクローンで回復したことが明らかになった。JUP遺伝子にコードされるプラコグロビン、DSG2遺伝子にコードされるデスモグレイン2およびDSC2遺伝子にコードされるデスモコリン2は、デスモソーム構造の主要なコンポーネントであり、これらのタンパク質の発現レベルは、PKP2変異を保有するAC患者のiPSCから分化した心筋細胞およびPKP2変異を保有するAC患者の心筋で減少することが報告されている（Caspi, O. et al., Circ Cardiovasc Genet 6, 557-568, doi:10.1161/CIRCGENETICS.113.000188 (2013)、Ma, D. et al., Eur Heart J 34, 1122-1133, doi:10.1093/eurheartj/ehs226 (2013)、Rasmussen, T. B. et al., Circ Cardiovasc Genet 7, 230-240, doi:10.1161/CIRCGENETICS.113.000338 (2014)）。しかし、未分化状態のアイソジェニックiPSC（Hetero、HDR、NHEJ）では、いずれのタンパク質の発現レベルも影響を受けなかった（図20）。また、いずれのタンパク質の細胞局在も影響を受けなかった。
〔実験３：各アイソジェニックiPSCから分化誘導した心筋細胞（iPSC-CM）の評価（細胞運動分析）〕
　実験スキームを図21に示した。各アイソジェニックiPSC（Hetero、HDR、NHEJ）から単層で分化誘導した心筋細胞は分化誘導開始後7～8日目に自発的な拍動が観察された。分化誘導開始後7～8日目細胞の分化効率を、抗トロポニンT抗体を使用したFACS解析により評価した結果を図22に示した。分化効率は、これらのiPSC-CM間で同等であった。
　分化誘導開始後8～10日目におけるHDR-iPSC-CMとNHEJ-iPSC-CMの観察結果を図23に示した。HDR-iPSC-CMでは、連結されたレイヤー構造と協調した動的収縮が観察された。対照的に、NHEJ-iPSC-CMでは、連結する心筋細胞に穴のような欠損が現れ、8日目から10日目まで徐々に増加した。NHEJ-iPSCMでは、断裂した心筋線維が検出され（図24）、増加した収縮張力の下では細胞間接着が脆弱であることが示唆された。
　モーションベクトル解析によって計算された収縮速度（CV）および変形距離（DD）は、それぞれ収縮機能または収縮力を表し、培養iPSC-CMの運動特性のリアルタイム評価を可能にする。そこで、6ウェルプレートの特定の座標で、HDR-iPSC-CMとNHEJ-iPSC-CMの同じ位置での収縮運動を連続的に観察した。結果を図25および図26に示した。HDR-iPSC-CMの収縮能は保たれており、14日目から28日目までの観察期間中にCVとDDの両方は変化しなかった。HDR-iPSC-CMでは、14～28日目にかけて、収縮する心筋細胞の配向性形成を認めた（図27）。これは、機械的ストレスが心筋細胞の成熟を促進したことを示唆している。対照的に、NHEJ-iPSC-CMのCVとDDは、14日目でHDR-iPSC-CMより減少していた。また、NHEJ-iPSC-CM自身のCVとDDが14日目から28日目まで徐々に減少した。
　モーションベクトル解析は、動きの振幅をカラーマップに変換し、興奮伝播のラベルフリー検出を可能にする。NHEJ-iPSC-CMでは、14日目に繊維構造を通して最初に指向性興奮伝播が観察されたが、継続的な収縮張力の下では、21日目から28日目にかけて指向性伝播が徐々に阻害されるようになった（図28）。時折、NHEJ-iPSC-CMの筋線維で伝導ブロックが観察された（図29）。これらのデータは、NHEJ-iPSC-CMが心筋細胞の成熟障害、収縮特性の低下、分化後4週間以内の進行性伝導障害などの明確な表現型を示したことを示唆している。
〔実験４：HDRおよびNHEJから分化誘導した心筋細胞の組織学的対比〕
　実験スキームを図30に示した。分化誘導開始後10日目に96ウェルプレートに再播種したHDR-iPSC-CMとNHEJ-iPSC-CMを、16日目に抗トロポニンT抗体で免疫染色した結果を図31に示した。NHEJ-iPSC-CMのトロポニンT陽性の心筋細胞の面積は、HDR-iPSC-CMと比較して有意に減少していた。
　分化誘導開始後10日目のHDR-iPSC-CMとNHEJ-iPSC-CMを用いて、定量リアルタイムPCRを行った結果を図32に示した。心筋細胞成熟のマーカー遺伝子であるNPPB（ナトリウム利尿ペプチド前駆体B）、MYL2（ミオシン軽鎖2）およびMYH7（ミオシン重鎖7）のmRNA発現レベルがNHEJ-iPSC-CMで有意に減少したが、TNNT2（トロポニンT2）とTNNI3（トロポニンI3）の値は、NHEJ-iPSC-CMとHDR-iPSC-CMの間で同等であることが示された。この結果から、NHEJ-iPSC-CMでは心筋細胞の成熟が著しく損なわれていることが示唆された。
　デスモソームと接着斑（fascia adherens）は心筋細胞を結合し、心筋細胞間の中間径フィラメントネットワークを仲介し、機械的シグナル伝達（mechanotransduction）を介して心筋細胞の成熟に影響を及ぼす。PKP2は、デスモソームと接着斑を構成するタンパク質を一体化する足場タンパク質である。そこで、分化誘導開始後14日目および28日目のNHEJ-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CMを試料とするウエスタンブロッティング、ならびに、分化誘導開始後16日目 NHEJ-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CMを試料とする免疫染色により、デスモソームまたは接着斑を構成するタンパク質の発現および細胞局在を評価した。ウエスタンブロッティングの結果を図33に示した。プラコグロビン（Plakoglobin）の免疫染色の結果を図34に示した。プラコフィリン2（Plakophilin-2: PKP2）の免疫染色の結果を図35に示した。デスモグレイン2（Desmoglein-2）およびデスモコリン2（Desmocollin-2）の免疫染色の結果を図36に示した。N-カドヘリン（N-cadherin）の免疫染色の結果を図37に示した。
　プラコグロビンは、デスモソームカドヘリンをデスモプラキンに結合するアンカータンパク質であり、デスモソームと接着領の両方に発現する。図33、図34、図35より、NHEJ-iPSC-CMでは、プラコフィリン2の発現が完全に消失したが、NHEJ-iPSC-CMにおけるプラコグロビンの発現レベルおよび局在は、HDR-iPSC-CMに対して有意差がなかった。
　デスモグレイン2およびデスモコリン2は、細胞間の間隙およびプラコフィリン-2に結合した細胞質に位置するC末端テールにおいてホモポリマーおよびヘテロポリマーを形成するデスモソームカドヘリンである。デスモグレイン2とデスモコリン2はいずれもHDR-iPSC-CMの細胞間ジャンクションで通常発現していた。一方、NHEJ-iPSC-CMでは、これらのデスモソームタンパク質の発現レベルは有意に減少し（図33）、細胞周辺から完全に脱落し、細胞質に散在した（図36）。
　接着斑ジャンクションは細胞外空間から細胞骨格アクチンフィラメントまで広がり、ジャンクション複合体は主にN-カドヘリンで構成される膜貫通タンパク質を含む。分化誘導開始後28日目のNHEJ-iPSC-CMでは、N-カドヘリンの発現はHDR-iPSC-CMと比較して減少した（図33）。免疫染色により、NHEJ-iPSC-CMでは、N-カドヘリンの発現は細胞間ジャンクションに検出されたが実質的に減少したことが明らかになった（図37）。これらの結果は、NHEJ-iPSC-CMにおいて、PKP2欠損がデスモソームカドヘリンタンパク質の安定性に深刻な影響を及ぼし、NHEJ-iPSC-CMの接着斑の組成に部分的な影響を及ぼし、心臓細胞成熟を阻害することを示唆している。
〔実験５：HDRおよびHeteroから分化した心筋細胞の組織学的対比〕
　分化後に急速に異なる表現型を示したNHEJ-iPSC-CM（図23、24参照）とは対照的に、Hetero-iPSC-CMは同じ時間経過において28日目までHDR-iPSC-CMと比較して有意な形態学的差異を示さなかった。
　分化誘導開始後14日目のHDR-iPSC-CMおよびHetero-iPSC-CMをトリプシン処理して剥がし、24ウェルプレートに再播種して28日目まで観察を行った。28日目のHetero-iPSC-CM（では心筋構造の菲薄化が観察されたが、HDR-iPSC-CMではこのような形態学的異常は観察されなかった（図38）。
〔実験６：NHEJから分化した心筋細胞へのPKP2遺伝子送達〕
　実験スキームを図39に示した。CMVプロモーターによって駆動されるN末端FLAGタグ付き完全長ヒトPKP2をコードするアデノ随伴ウイルス（AAV2-PKP2）を作製した。NHEJ-iPSC-CMに効率よく遺伝子導入するために、アデノ随伴ウイルスはAAV2血清型を選択した。iPSCにはNHEJを用い、分化誘導開始後10日目に96ウェルプレートに再播種し、11日目にAAV2-PKP2を感染させて遺伝子導入した（図39の10日目以降上段）。16日目に、抗FLAG抗体および抗トロポニンT抗体で免疫染色した結果を図40に示した。導入されたFLAGタグ付きPKP2タンパク質は、NHEJ-iPSC-CMの細胞周辺に明瞭に局在していた。
　コントロールとしてEGFPをコードするAAV2（AAV2-EGFP）を使用した。分化誘導開始後10日目に96ウェルプレートに再播種し、11日目にAAV2-PKP2またはAAV2-EGFPを感染させて遺伝子導入した。16日目に抗デスモグレイン2抗体、抗デスモコリン2抗体または抗N-カドヘリン抗体で免疫染色した結果を図41に示した。また、図41の免疫染色標本から得られた画像について、ハイコンテントイメージングを使用して各タンパク質の発現量を定量化した結果を図42に示した。NHEJ-iPSC-CMにヒトPKP2を導入することにより、デスモグレイン2、デスモコリン2およびN-カドヘリンの発現レベルと局在が用量依存的に回復することが示された。また、16日目に抗トロポニンT抗体で免疫染色した結果を図43に示した。NHEJ-iPSC-CMの心筋細胞面積も、ヒトPKP2を導入することにより回復することが示された。
　図39の10日目以降下段に示したスキームで実験を行った。分化誘導開始後10日目の細胞（NHEJ-iPSC-CM、約1×106cell/well）に、約2.0×103vg/cellのAAV2-PKP2またはAAV2-EGFPを感染させて遺伝子導入した。AAV2-EGFPを感染させた24日目のNHEJ-iPSC-CMを蛍光顕微鏡および明視野で観察した結果を図44に示した。蛍光顕微鏡観察において、EGFPの発現が確認された。AAV2-PKP2またはAAV2-EGFPを感染させた24日目のNHEJ-iPSC-CMを試料としてウエスタンブロッティングを行った結果を図45に示した。NHEJ-iPSC-CMにヒトPKP2を導入することにより、PKP2（プラコフィリン2）、デスモグレイン2およびデスモコリン2の発現が増加した。
　AAV2-PKP2またはAAV2-EGFPを感染させた24日目のNHEJ-iPSC-CMの観察画像、モーションベクトル解析により興奮伝播をカラーマップに変換した画像、およびモーションベクトル解析によって計算された収縮速度（CV）および変形距離（DD）を図46に示した。PKP2遺伝子を導入したNHEJ-iPSC-CMでは、収縮中の心筋細胞における穴様構造の形成が抑制されていた。また、収縮速度（CV）および変形距離（DD）の低下が回復したことが示された。これらの結果から、PKP2遺伝子変異に起因するAC患者に正常なPKP2遺伝子を導入する遺伝子治療が有効であることが明らかになった。加えて、NHEJ-iPSC-CMが治療開発のための有用なヒトモデルになり得ることが示され、NHEJ-iPSC-CMを用いてAC治療薬をスクリーニングできることが示唆された。
実施例２：DSG2のホモ接合ストップゲイン変異を持つAC患者由来iPSCの樹立とアイソジェニックiPSCセットの作製
　患者から得た試料の使用とゲノム解析は、大阪大学医学部附属病院の倫理委員会によって承認され、書面によるインフォームドコンセントを得た。
〔実験７：DSG2のホモ接合ストップゲイン変異を持つAC患者からのiPSCの樹立およびヘテロ接合変異を持つアイソジェニックiPSCの作製〕
　治療抵抗性不整脈および進行性の心不全を呈した若年発症の重症心不全症男性患者（診断名は拡張型心筋症）において、DSG2遺伝子におけるホモ接合ストップゲイン変異（C355T塩基置換によるストップゲイン変異により、119番目のアルギニンが終止コドンに変化（R119X））を同定した（図47（A））。この患者の家系において、当該患者以外に心筋症発症者は存在しない（図47（B））。この患者と両親のゲノムDNAを用いてサンガーシークエンス解析を行ったところ、両親はいずれもヘテロ接合C355T変異を有し、この患者はホモ接合C355T変異を有することが明らかになった（図47（C））。
　この患者および他の拡張型心筋症患者（コントロール）の左室心筋組織を、抗デスモグレイン2抗体で免疫染色した結果、この患者の心筋組織ではDSG2分子が完全に欠損していることが明らかになった（図48）。また、透過電子顕微鏡解析においてデスモゾーム構造の断裂像が観察された（図49）。
　実施例１と同じ方法で、ホモ接合C355T変異を持つ患者の末梢血単核白血球からiPSC（R119X-iPSC）を樹立した。ホモ接合C355T変異を持つR119X-iPSCでは、健常者から樹立したコントロールiPSCに比べて、DSG2mRNA発現が顕著に低下し（図50（A））、DSG2タンパク質の発現が完全に消失していた（図50（B））。
　DSG2ゲノム配列に対してガイドRNAを設計し、ゲノム編集によりホモ接合C355T変異iPSC（R119X-iPSC）のDSG2遺伝子の片方のアレルに同義置換配列を導入して、C355T変異をヘテロ接合に修復したアイソジェニックiPSC（HDR-iPSC）を樹立した（図51）。C355T変異をヘテロ接合に修復したHDR-iPSCでは、DSG2タンパク質の発現が回復した（図52（A）、（B））。
　心筋組織構造を再現するために、分化誘導開始後14日目のR119X-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CMを播種し、自発性循環進行波刺激による三次元自己組織化リング（three-dimensional self-organized tissue rings: SOTRs）（Li, J. et al., doi:10.1101/717108 (2019).）を作製した。再播種後30日目に得られたSOTRの心筋収縮力を、圧縮強度測定装置MicroTester G2（CellScale）を用いて測定した。R119X-iPSC-CMs由来のSOTRに比べ、HDR-iPSC-CMs由来のSOTRでは有意な心筋収縮力の回復を認めた（図53）。
　再播種後の組織形成過程を経時的に観察し、分化誘導開始後30日目（再播種後16日目）心筋構造をトロポニンによる免疫染色で確認したところ、R119X-iPSC-CMsでは連続した心筋組織構造の形成が障害され、網目状の心筋形態を示したが、HDR-iPSC-CMsでは同様の変化は認めなかった（図54）。
　分化誘導開始後14日目のR119X-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CMからタンパク質サンプルを回収し、デスモグレイン2およびデスモコリン2の発現をウエスタンブロッティングで解析したところ、R119X-iPSC-CMではデスモグレイン2が検出されず、デスモコリン2の発現量はHDR-iPSC-CMの発現量より顕著に低下していた（図55）。また、分化誘導開始後14日目のR119X-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CMを96ウェルプレートに再播種し、その7日後に細胞を固定して抗デスモグレイン2抗体および抗デスモコリン2抗体で免疫染色した。ウエスタンブロッティングの結果と同様に、R119X-iPSC-CMではデスモグレイン2は発現しておらず、デスモコリン2の発現量はHDR-iPSC-CMの発現量より顕著に低下していた（図56）。
　分化誘導開始後14日目のR119X-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CMを96ウェルプレートに再播種し、その30日後に細胞を固定して透過電子顕微鏡による観察を行った。HDR-iPSC-CMでは正常なデスモゾーム構造が観察されたのに対し、R119X-iPSC-CMsではデスモゾーム構造の断裂像を認めた（図57）。
〔実験８：R119X-iPSC-CMへのDSG2遺伝子送達〕
　外部からの遺伝子導入により、観察された表現型が改善されるかを検証するため、全長のヒトDSG2遺伝子をクローニングし、CMVプロモーターによって駆動されるC末端HAタグ付き完全長ヒトDSG2をコードするアデノ随伴ウイルス（AAV2-DSG2-cHA）を作製した。
　分化誘導開始後14日目のR119X-iPSC-CMを96ウェルプレートに再播種し、その4日後に2.0×106vg/cellのAAV2-DSG2-cHAを感染させて遺伝子導入した。感染7日後に細胞を固定して抗デスモグレイン2抗体で免疫染色した。DSG2遺伝子を導入したR119X-iPSC-CMでは、DSG2が細胞間のデスモゾームに局在していることが認められた（図58）。
　分化誘導開始後21日目のR119X-iPSC-CMに、2.0×105vg/cellまたは6.0×105vg/cellのAAV2-DSG2-cHAを感染させて遺伝子導入した。感染7日後に心筋細胞からタンパク質サンプルを回収し、デスモグレイン2の発現をウエスタンブロッティングで解析した。健常者から樹立したiPSCから分化誘導した心筋細胞（Ctrl-iPSC-CM）をコントロールとした。DSG2遺伝子を導入したR119X-iPSC-CMでは、Ctrl-iPSC-CMと同等のデスモグレイン2の発現が確認された（図59）。
　分化誘導開始後9日目のR119X-iPSC-CMにAV2-DSG2-cHAを感染させ、分化誘導開始後14日目再播種し、30日目まで経時的に観察した。図60は分化誘導開始後30日目の明視野観察画像である。DSG2遺伝子を導入していないR119X-iPSC-CMでは網目状の異常な心筋形態が観察されたが、DSG2遺伝子を導入したR119X-iPSC-CMではそのような異常形態は観察されず、DSG2遺伝子導入により心筋構造の障害が抑制されることが示された。
実施例３：デスモグレイン2タンパク質の動態をイメージングできるPKP2遺伝子変異アイソジェニックiPSCセットの作製
　実施例１で作製したPKP2遺伝子にホモ接合フレームシフトアレルを含むアイソジェニックiPSC（NEHJ）から分化誘導したNHEJ-iPSC-CMでは、デスモグレイン2タンパク質発現レベルが有意に低下し（図33参照）、細胞膜から完全に脱落した（図36参照）ことから、デスモグレイン2（DSG2）分子が本モデル細胞のフェノタイプに関連する有用な分子マーカーとなることが予想された。そこで、内在性DSG2分子動態をより詳細に評価するため、実施例１で作製したPKP2遺伝子変異アイソジェニックiPSCセット（Hetero-iPSC、HDR-iPSCおよびNHEJ-iPSC）の各DSG2遺伝子3'末端に、ゲノム編集技術を用いてtdTomato蛍光タンパク質を挿入したアイソジェニックiPSCセットを作製した。
〔実験９：実施例１で作製したアイソジェニックiPSCセットから分化誘導した心筋細胞におけるデスモグレイン2の発現解析〕
　PKP2遺伝子にヘテロ接合フレームシフトアレルを含むアイソジェニックiPSC（Hetero-iPSC）およびホモ接合野生型アレルを含むアイソジェニックiPSC（HDR-iPSC）から分化誘導開始後14日目の心筋細胞（Hetero-iPSC-CMおよびHDR-iPSC-CM）に対して、デスモグレイン2の免疫染色を行った（図61上段）。Hetero-iPSC-CMとHDR-iPSC-CMのどちらも、DSG2は正常に細胞膜に分布していたが、ドット状のDSG2分布像をハイコンテント画像解析装置（IN Cell Analyzer 6000、GE）を用いて定量評価したところ、DSG2で染色された個々のデスモゾームの面積は、Hetero-iPSC-CMよりHDR-iPSC-CMにおいて有意に増加していることが明らかになり（図61下段、p<0.0001、各n=32）、内在性DSG2分子が分子マーカーとして有用であることを確認した。
〔実験１０：DSG2遺伝子3'末端へのtdTomato蛍光タンパク質の挿入〕
　図62に示すように、DSG2遺伝子ストップコドンの3'側に特異的なガイドRNAを設計し、修復テンプレートDNAとともにエレクトロポレーションで導入した。DSG2ストップコドンの上流に一塩基多型（SNP: C/T、バリンをコードする同義置換）が検出されたため、ゲノム編集された転写産物を見分ける目的で、修復テンプレートの5'アーム配列のSNP部位の塩基をTとし、Cas9による再切断を防ぐため3'アーム配列にCCからAAへの変異を導入した。コロニーセレクションとともに、ゲノムDNAのPCR解析（図63）およびサンガーシークエンス解析（図64）を行い、SNP: Cが存在するアレルが野生型のままで、SNP: Tが存在するアレルにtdTomatoがヘテロ接合型に挿入されたアイソジェニックiPSCセット（DSG2-tdT-Hetero-iPSC、DSG2-tdT-HDR-iPSCおよびDSG2-tdT-NHEJ-iPSC）を樹立した（図65）。樹立したアイソジェニックiPSCセットの核型は正常であり、免疫染色により未分化マーカー（OCT4、SSEA4、NANOG）の発現を確認した（図66）。
〔実験１１：DSG2-tdTomato融合タンパク質の発現確認〕
　ウエスタンブロッティング解析（図67（A））、および核をHoechstで染色した蛍光画像（図67（B））により、DSG2-tdTomato融合タンパク質が、分化前のDSG2-tdT-Hetero-iPSC、DSG2-tdT-HDR-iPSCおよびDSG2-tdT-NHEJ-iPSCにおいて、同等に発現していることを確認した。DSG2-tdT-HDR-iPSCおよび分化分化誘導開始後14日目のDSG2-tdT-HDR-iPSC-CMの生細胞を用いたタイムラプスイメージングを行ったところ、iPSCにおいて細胞辺縁に局在していたDSG2-tdTomato融合タンパク質は、心筋分化後ドット状の分布を示した（図68）。分化誘導開始後14日目のDSG2-tdT-Hetero-iPSC-CM、DSG2-tdT-HDR-iPSC-CMおよびDSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CMを固定し免疫染色を行ったところ、DSG2-tdT-Hetero-iPSC-CM、DSG2-tdT-HDR-iPSC-CMでは細胞膜にドット状に局在するデスモゾームのシグナルが観察されたのに対し、DSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CMでは、分化に伴い膜上のtdTomatoの蛍光シグナルが消失した（図69）。分化誘導開始後14日目のDSG2-tdT-Hetero-iPSC-CMおよびDSG2-tdT-HDR-iPSC-CMのライブイメージングについてハイコンテント画像解析装置（IN Cell Analyzer 6000、GE）を用いて、膜上にドット状に局在するDSG2-tdTomato蛍光像面積を定量化したところ、DSG2-tdT-HDR-iPSC-CMではDSG2-tdT-Hetero-iPSC-CMに比べて有意な増加を認めた（図70)。
〔実験１２：DSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CMへのPKP2遺伝子送達〕
　分化誘導開始後14日目のDSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CMに、完全長ヒトPKP2をコードするアデノ随伴ウイルス（AAV2-PKP2、実施例１参照）を感染させ、PKP2遺伝子を導入し、毎日タイムラプスイメージングを観察した。AAV2-PKP2感染後4日目に、細胞膜における点状のデスモグレイン2-tdTomato融合タンパク質集積を認めた（図71）。DSG2-tdT-NHEJ-iPSC-CMにヒトPKP2を導入することにより、デスモグレイン2の発現レベルと局在が回復することが示された。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (18)

  1. 　遺伝子変異に起因する不整脈源性心筋症患者の心筋細胞に、該遺伝子変異を有する遺伝子に対応する正常遺伝子を送達して正常タンパク質を発現させるための遺伝子治療薬を有効成分とする不整脈源性心筋症治療用医薬。
  2. 　遺伝子変異がプラコフィリン２遺伝子の変異またはデスモグレイン２遺伝子の変異である、請求項１に記載の医薬。
  3. 　プラコフィリン２遺伝子またはデスモグレイン２遺伝子の変異に起因する不整脈源性心筋症患者の細胞から樹立された多能性幹細胞。
  4. 　プラコフィリン２遺伝子の変異が、配列番号２で示されるヒトプラコフィリン２遺伝子の塩基配列において、１２２８位のグアニンが重複するヘテロ接合フレームシフト変異である、請求項３に記載の多能性幹細胞。
  5. 　請求項４に記載の多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し、前記ヒトプラコフィリン２遺伝子内に不整脈源性心筋症の原因となるホモ接合変異を有する多能性幹細胞。
  6. 　請求項４に記載の多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し、前記ヒトプラコフィリン２遺伝子が正常遺伝子に修正された多能性幹細胞。
  7. 　デスモグレイン２遺伝子の変異が配列番号４で示されるヒトデスモグレイン２遺伝子の塩基配列において、３５５位のシトシンがチミンに置換されたホモ接合ストップゲイン変異である、請求項３に記載の多能性幹細胞。
  8. 　請求項７に記載の多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し、前記ヒトデスモグレイン２遺伝子内に不整脈源性心筋症の原因となるヘテロ接合変異を有する多能性幹細胞。
  9. 　請求項７に記載の多能性幹細胞と同一の遺伝的背景を有し、前記ヒトデスモグレイン２遺伝子が正常遺伝子に修正された多能性幹細胞。
  10. 　請求項４に記載の多能性幹細胞、請求項５に記載の多能性幹細胞および請求項６に記載の多能性幹細胞からなる群から選択される２種類または３種類の多能性幹細胞を含む多能性幹細胞セット。
  11. 　請求項７に記載の多能性幹細胞、請求項８に記載の多能性幹細胞および請求項９に記載の多能性幹細胞からなる群から選択される２種類または３種類の多能性幹細胞を含む多能性幹細胞セット。
  12. 　請求項４に記載の多能性幹細胞のデスモグレイン２遺伝子の下流に蛍光タンパク質遺伝子が挿入された、内在性デスモグレイン２の蛍光イメージング用多能性幹細胞。
  13. 　請求項５に記載の多能性幹細胞のデスモグレイン２遺伝子の下流に蛍光タンパク質遺伝子が挿入された、内在性デスモグレイン２の蛍光イメージング用多能性幹細胞。
  14. 　請求項６に記載の多能性幹細胞のデスモグレイン２遺伝子の下流に蛍光タンパク質遺伝子が挿入された、内在性デスモグレイン２の蛍光イメージング用多能性幹細胞。
  15. 　請求項１２に記載の多能性幹細胞、請求項１３に記載の多能性幹細胞および請求項１４に記載の多能性幹細胞からなる群から選択される２種類または３種類の多能性幹細胞を含む多能性幹細胞セット。
  16. 　請求項１０、１１または１５に記載の多能性幹細胞セットを含む、不整脈源性心筋症研究用キット。
  17. 　請求項１０、１１または１５に記載の多能性幹細胞セットを含む、不整脈源性心筋症治療薬のスクリーニング用キット。
  18. 　請求項５、請求項７もしくは請求項１３に記載の多能性幹細胞、または該多能性幹細胞から分化した心筋細胞または該多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導過程の細胞を用いる不整脈源性心筋症治療薬のスクリーニング方法であって、被験物質を前記細胞に接触または導入する工程と、該細胞における不整脈源性心筋症を反映する表現型を評価する工程と、被験物質を接触または導入していない前記細胞における該表現型の評価結果と比較して不整脈源性心筋症を改善する被験物質を選択する工程とを含む、スクリーニング方法。
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