JP2016520288A - 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、以下の工程を含むｉＰＳ細胞の製造方法を提供する：（ｉ）初期化因子を体細胞に導入する工程；（ｉｉ）工程（ｉ）で得た細胞を１１日より長くかつ２９日以下の間培養する工程；（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得た細胞からＴＲＡ−１−６０陽性細胞を選別する工程；（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で選別したＴＲＡ−１−６０陽性細胞を培養する工程；（ｖ）工程（ｉｖ）により得たコロニーを、別の培養容器へ移す工程；および（ｖｉ）工程（ｖ）で得た細胞を培養し、ｉＰＳ細胞を得る工程。工程（ｖ）で得た細胞を、１０回以上継代培養することが好ましい。本発明は、上記の方法により得たｉＰＳ細胞の分化を誘導することを含む、未分化細胞の残存率が低減された分化細胞集団の製造方法も提供する。【選択図】図４

Description

本発明は、人工多能性幹（以下、ｉＰＳという）細胞の効率的な樹立方法に関する。本発明は、分化誘導した際に、腫瘍形成リスクが低減された安全なｉＰＳ細胞の製造方法にも関する。

人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、４つの転写因子Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ−Ｍｙｃ（ＯＳＫＭ）の組合せを、胚性及び成体マウス線維芽細胞に導入することにより、２００６年に最初に作製された（非特許文献１）。続いて、同じ因子の組合せ（ＯＳＫＭ）（非特許文献２）、又は例えばＯＳにＬＩＮ２８及びＮＡＮＯＧを加えるなどの異なるが重複する因子の組合せ（非特許文献３）のいずれかを用い、線維芽細胞からヒトｉＰＳＣが作製された。線維芽細胞に加え、ｉＰＳＣは、肝細胞、胃上皮細胞（非特許文献４）、血液細胞（非特許文献５）及び神経細胞（非特許文献６−８）を含む様々な種類の体細胞から得られてきた。

ｉＰＳＣは再現性良く作製することができるが、初期化因子を受けとった体細胞のごく一部のみがｉＰＳＣになる。我々の最初の報告（非特許文献２）において、ＯＳＫＭの形質導入７日後に再播種した５ｘ１０^５の線維芽細胞から、およそ１０のｉＰＳＣコロニーが出現した。この低い効率（〜０．２％）は、ｉＰＳＣの起源が、体細胞培養物中に共存する、幹細胞又は前駆細胞のまれな集団である可能性を提起する。しかしながら、遺伝的組み換えを経て最終分化したＴリンパ球（非特許文献９、非特許文献１０）及びＢリンパ球（非特許文献５）から、ｉＰＳＣを作製することができるため、この可能性は正式に除外されている。しかしながら、残された重要な問いは、なぜ形質導入された体細胞のうちごく一部のみがｉＰＳＣになることができるのかということである。

この重要な問いに答えるためには、２０〜３０日かかる初期化の過程で、ＯＳＫＭを形質導入された細胞の運命を観察することが重大である。この目的を達成するためには、形質導入され続いて初期化された細胞を検出することが必須である。マウスにおいて、ＯＳＫＭ（非特許文献６、非特許文献１１）、及びＳＳＥＡ−１などの特定のマーカー（非特許文献１２、非特許文献１３）を一様に導入するセカンダリｉＰＳＣ誘導システムが、初期化中の細胞を検出するために、いくつかの研究で利用されてきた。これらの研究は、初期化中に起こる分子事象に焦点を当ててきており、ｉＰＳＣになることのできなかった細胞は分析しなかった。さらに、ヒトｉＰＳＣ作製の分子過程についてはほとんど知られていない。さらに、セカンダリｉＰＳＣ誘導システムは、ＯＳＫＭの外部からの送達によるプライマリ誘導と、実質的に異なるかもしれない。

Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．＆Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００６）Ｃｅｌｌ １２６，６６３−６７６ Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｃｅｌｌ １３１，８６１−７２ Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８，１９１７−２０ Ａｏｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１，６９９−７０２ Ｈａｎｎａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃｅｌｌ １３３，２５０−６４ Ｗｅｒｎｉｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，９１６−２４ Ｅｍｉｎｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２６，２４６７−７４ Ｋｉｍ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔｕｒｅ ４５４，６４６−５０ Ｌｏｈ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ７，１５−９ Ｓｅｋｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ７，１１−４ Ｅｍｉｎｌｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ４１，９６８−７６ Ｂｕｇａｎｉｍ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０，１２０９−２２ Ｐｏｌｏ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｃｅｌｌ １５１，１６１７−３２

本発明において、我々は、導入遺伝子を受けとった細胞を検出するために、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をつなげたＳＯＸ２導入遺伝子を用いた。我々は、ヒトｉＰＳＣ及び胚性幹細胞（ＥＳＣ）において発現するが体細胞では発現しない糖タンパク質であるＴＲＡ−１−６０の、該細胞での発現も観察した。ＴＲＡ−１−６０は、最良のヒト多能性幹細胞マーカーの一つである（Ｃｈａｎ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７，１０３３−７；Ａｎｄｒｅｗｓ，Ｐ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ３，３４７−６１）。我々は、フローサイトメトリーによりＥＧＦＰ及び／又はＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を検出し選別することにより、レトロウイルスによってヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）へＯＳＫＭが形質導入された後にどのようにして初期化され始めた細胞が出現しｉＰＳＣへと成熟するか、なぜ形質導入された細胞の多くがｉＰＳＣになることができないのか、理解しようと試みた。

結果として、我々は、ほとんどのＨＤＦが、ＯＳＫＭ導入遺伝子を受けとると初期化過程を開始することを明らかにした。７日以内に、これらの形質導入された細胞の〜２０％が、ＴＲＡ−１−６０抗原に対し陽性になったが、しかしながら、これらの初期化され始めた細胞のごく一部（〜１％）のみが、再播種後に人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）のコロニーをもたらした。我々は、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の多くが、その後の培養の間に、再び陰性に戻ったことを見出した。形質導入後７日目又は１１日目にＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を選別しＳＮＬフィーダー細胞上に再播種した際には、それらの約半数がＴＲＡ−１−６０（−）状態に戻った。一方、１５日目に選別した際には、逆戻り率が１０％未満になった。さらに、７日目又は１１日目に選別したＴＲＡ−１−６０（＋）細胞からのｉＰＳＣコロニー形成の効率は、低い（〜１％）ままだった。一方、１５日目又は２０日目に選別したＴＲＡ−１−６０（＋）細胞は、著しく増加したｉＰＳＣコロニー形成効率を示した。これらの結果は、初期化され始めた細胞がこの期間（１１日目から１５日目の間）に成熟することと、この期間後にＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を選別し再播種することにより、ｉＰＳ細胞の樹立効率を著しく改善することができることを示す。

直接初期化（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）を増進することが以前に報告されている因子のうち、ＬＩＮ２８が初期化の逆戻りを著しく阻害したが、ＮＡＮＯＧ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１又はｐ５３ ｓｈＲＮＡはしなかった。これらのデータは、開始ではなく成熟が、多能性へのヒト線維芽細胞の直接初期化の律速段階であること、それぞれの副初期化（ｐｒｏ−ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）因子は異なる作用機序を有することを実証する。

我々は、２１日以降に選別したＴＲＡ−１−６０（＋）細胞が、分化誘導後に未分化細胞を保持しているかどうかも検討した。結果として、１０回以上継代後のポリクローナルなＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の保持する未分化細胞は十分に低減した。

我々は、これらの知見に基づきさらに研究を行い、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］以下の工程を含むｉＰＳ細胞の製造方法：
（ｉ）初期化因子を体細胞に導入する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得た細胞を１１日より長くかつ２９日以下の間培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得た細胞からＴＲＡ−１−６０陽性細胞を選別する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で選別したＴＲＡ−１−６０陽性細胞を培養する工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）により得たコロニーを、別の培養容器へ移す工程；および
（ｖｉ）工程（ｖ）で得た細胞を培養し、ｉＰＳ細胞を得る工程。
［２］初期化因子が、
（ａ）Ｏｃｔ３／４又はそれをコードする核酸；
（ｂ）Ｓｏｘ２又はそれをコードする核酸；及び
（ｃ）Ｋｌｆ４又はそれをコードする核酸、
を含む、上記［１］に記載の方法。
［３］初期化因子がさらに、（ｄ）Ｌｉｎ２８又はそれをコードする核酸を含む、上記［２］に記載の方法。
［４］ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である、上記［１］に記載の方法。
［５］工程（ｉｉ）の培養期間が１５〜２０日である、上記［１］に記載の方法。
［６］工程（ｖｉ）で得た細胞を１０回以上継代培養する、上記［１］に記載の方法。
［７］上記［６］に記載の方法により得たｉＰＳ細胞の分化を誘導することを含む、未分化細胞の残存率が低減された分化細胞集団の製造方法。

初期化因子が導入された細胞を導入後１１日より長い期間培養した後にＴＲＡ−１−６０陽性細胞を選別することにより、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞がＴＲＡ−１−６０陰性状態に戻ることを顕著に抑制することができるので、ｉＰＳ細胞の樹立効率を改善することができる。また、このようにして選別したＴＲＡ−１−６０細胞を１０回以上継代培養する場合、分化誘導した際の、未分化細胞の残存率が顕著に低減され、ｉＰＳ細胞由来の安全な移植用細胞を提供することができる。

図１は、ｉＰＳＣ誘導の効率を示す。Ａ 様々なＨＤＦ系統へのＯＳＫＭの形質導入から７日後のＥＧＦＰ（＋）細胞の割合を、フローサイトメトリーにより解析した。ＨＤＦは様々な年齢（年；ｙ，月；ｍ）のコーカサス人及び日本人の男性（Ｍ）及び女性（Ｆ）に由来する。Ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｂ ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞、ＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞及びＥＧＦＰ（−）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞ごとに、組込まれたレトロウイルス導入遺伝子の数を、７日目、１１日目及び１５日目に定量的ゲノムＰＣＲ解析により解析した。形質導入していない親ＨＤＦを、陰性対照として用いた。Ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を示す。Ｃ ２４日目の、ＯＳＫＭを形質導入した２．５ｘ１０^５個のＨＤＦに由来するｉＰＳＣコロニーの数。ＨＤＦは様々な年齢（年；ｙ，月；ｍ）のコーカサス人及び日本人の男性（Ｍ）及び女性（Ｆ）に由来する。Ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。 図２は、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の特性評価を示す。Ａ ７日目の、ＥＧＦＰ（＋）細胞の集団における、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の割合。ＨＤＦは様々な年齢（年；ｙ，月；ｍ）のコーカサス人及び日本人の男性（Ｍ）及び女性（Ｆ）に由来する。Ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｂ ＯＳＫＭを形質導入した１１日目のＴＲＡ−１−６０（＋）細胞、ＴＲＡ−１−６０（−）細胞又はＥＧＦＰ（−）細胞２．５ｘ１０^５個に由来する、選別２１日後（３２日目）のｉＰＳＣコロニーの数。Ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｃ ７日目、１１日目及び１５日目の、ＨＤＦ、ＥＳＣ、ＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞及びＥＧＦＰ（−）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞における、並びに７日目、１１日目、１５日目、２０日目及び２８日目の、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞における、ＨＤＦ−Ｇ又はＥＳ−Ｇ発現のヒートマップ。Ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｄ 形質導入後７日目、１１日目、１５日目の、ＯＳＫＭを形質導入したＴＲＡ−１−６０（＋）細胞における多能性遺伝子の相対的発現レベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲにより解析した。全ての値は、ＥＳＣにおける発現に対して、標準化されている。Ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｅ 左のベン図は、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞及びＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞の間で、ＨＤＦと比較して１０倍増加したＥＳ−Ｇの重複を示す。右のベン図は、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞及びＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞の間で、ＨＤＦと比較して１０分の１に減少したＨＤＦ−Ｇの重複を示す。Ｆ ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞、ＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞及びＥＧＦＰ（−）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞における、ＥＳ−Ｇ及びＨＤＦ−Ｇの遺伝子発現レベルについてのＰＣＡ。Ｎ＝３。 図３は、初期化中の単一細胞発現解析の結果を示す。Ａ 各単一細胞における遺伝子発現のヒートマップを、ＢｉｏＭａｒｋシステムを用いて決定した。ＴＲＡ−１−６０（−）／ＥＧＦＰ（＋）細胞又はＴＲＡ−１−６０（−）／ＥＧＦＰ（−）細胞を、形質導入後７日目、１１日目及び１５日目に選別した。ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を、形質導入後７日目、１１日目、１５日目、２０日目及び２８日目に選別した。ヒートマップは、１２〜２６サイクルの単一細胞ｑＲＴ−ＰＣＲにおけるＣｔ値を示す。黒は、Ｃｔ値が２６より高い場合に示される、検出できないほどに低い発現を示す。Ｂ 図３Ａに示す同じ単一細胞における遺伝子発現のＣｔ値のヴァイオリンプロット。白い点は、中央値を示す。Ｃｔ３０は、Ｃｔ値が２６より高い場合に定義される、検出不可能な発現を示す。Ｃ 図３Ａに示す個別の細胞のそれぞれにおける、遺伝子発現レベルのＰＣＡ。Ｄ 図３Ａに示すＴＲＡ−１−６０（＋）細胞における遺伝子発現の変動性を、ＪＳＤを用いて決定した。エラーバーは、９５％信頼区間を示す。 図４は、ｉＰＳＣ誘導中の逆戻りを示す。Ａ ７日目、１１日目、１５日目及び２０日目のＴＲＡ−１−６０（＋）細胞に由来する、ｉＰＳＣコロニーの作製効率。ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を、フィーダー細胞上に播種した。播種２１日後に、ｉＰＳＣコロニーの数を計測した。Ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を示す。Ｂ ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞から逆戻りしたＴＲＡ−１−６０（−）細胞の割合。様々な日（７日目、１１日目及び１５日目）に、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を選別しフィーダー細胞上に播種した。ＴＲＡ−１−８５（＋）細胞集団における、ＴＲＡ−１−６０（−）細胞の割合を、播種４日後に解析した。マウスフィーダー細胞とヒト細胞を区別するため、ヒト特異的マーカーＴＲＡ−１−８５を用いた。Ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｃ マイクロアレイデータからの、初期化中及び逆戻り中のＥＳ−Ｇ及びＨＤＦ−Ｇの発現のＰＣＡ。黒丸は、ＨＤＦからｉＰＳＣ／ＥＳＣへの初期化中の細胞の遺伝子発現パターンを示す。３日：ＥＧＦＰ（＋）細胞。７日、１１日、１５日及び２８日：形質導入後、それぞれの日におけるＴＲＡ−１−６０（＋）細胞。色付きの円は、１５日目（緑）及び２０日目（赤紫）の、１１日目のＴＲＡ−１−６０（＋）細胞と比較して逆戻りしたＴＲＡ−１−６０（−）細胞の発現パターンを示す。色付きの四角は、それぞれの日の、逆戻りしていないＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を示す。 図５は、副初期化因子の初期化への効果を示す。Ａ ２４日目の、ＯＳＫＭに加え様々な副初期化因子で処理したＨＤＦから形成したｉＰＳＣコロニーの数。Ｐ値は、ＯＳＫＭ単独で処理した細胞（Ｍｏｃｋ）に対し、異なる群を比較するＴ検定を用いて計算した；Ｎ＝３ アスタリスクはｐ＜０．０５を示す。Ｂ ７日目のＴＲＡ−１−６０（−）細胞中のＢｒｄＵ（＋）細胞の相対的な割合。全ての値は、ＯＳＫＭ単独を形質導入した細胞（Ｍｏｃｋ）のものに対して、標準化されている。Ｎ＝３。エラーバーは標準偏差を示す。Ｃ 形質導入後７日目の、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の相対的な割合。全ての値は、ＯＳＫＭ単独を形質導入した細胞（Ｍｏｃｋ）のものに対して、標準化されている。Ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｄ ７日目のＴＲＡ−１−６０（＋）細胞へのＢｒｄＵの取り込みの相対的な割合。全ての値は、ＯＳＫＭ単独を形質導入した細胞（Ｍｏｃｋ）のものに対して、標準化されている。Ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｅ １１日目のＴＲＡ−１−６０（＋）細胞中のアポトーシス細胞の割合。ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞をＡｎｎｅｘｉｎＶで免疫染色した。Ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｆ ＴＲＡ−１−６０陽性から陰性状態への逆戻りに対する、副初期化因子の効果。１１日目に選別したＴＲＡ１−６０（＋）細胞をフィーダー細胞上に播種した４日後の、全ＴＲＡ−１−８５（＋）細胞集団中の、ＴＲＡ−１−６０（−）細胞の割合。Ｎ＝３。エラーバーは、標準偏差を示す。 図６は、初期化過程のモデルを示す。レトロウイルス系を用いて、ＯＫＭに加えＳＯＸ２−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰをＨＤＦ（黒の点）に導入した。細胞の約６〜２０％に成功裏に初期化因子を導入した。ＥＧＦＰ（＋）細胞（緑の点）の大多数が初期化を開始した。形質導入されていない細胞（黒い点）では、初期化が開始されなかった。形質導入された細胞の約１２〜２４％が、ＴＲＡ−１−６０（＋）（赤紫の点）になった。ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞において初期化が進行したが、ＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞においては進行しなかった。成熟過程で、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の少なくとも５０％が、逆戻りを経験し、４日後にＴＲＡ−１−６０（−）になった。逆戻りは、ＬＩＮ２８によって阻害された。成熟過程で起きる初期化の障害のため、ＨＤＦの総数の０．２％未満がｉＰＳＣコロニーを形成した。開始及び成熟過程のいずれにおいても、形質導入された細胞がアポトーシスを経験した。

人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡまたはタンパク質の形態で体細胞に導入することによって製造することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＳ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２；Ｊ．Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０；Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；ＷＯ２００７／０６９６６６）。

本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ＥＳ細胞などの生殖系列細胞及び分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。

体細胞のソースとしての哺乳動物個体の選択は特に制限されない；しかしながら、ｉＰＳ細胞を、ヒトにおける疾患の治療に使用する場合、移植片拒絶及び／又はＧｖＨＤを予防するという観点から、体細胞は、患者本人の細胞であるか、あるいは患者のＨＬＡ型と同一又は実質的に同一であるＨＬＡ型を有する他人から採取されることが好ましい。本明細書中使用される「実質的に同一であるＨＬＡ型」とは、ドナーのＨＬＡ型が、免疫抑制剤等の使用を伴う患者に移植した場合に、ドナーの体細胞由来のｉＰＳの分化誘導により得られた移植細胞が生着可能である程度に、患者のものと一致することを意味する。例えば、主たるＨＬＡ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの主要な３遺伝子座、あるいはさらにＨＬＡ−Ｃｗを含む４遺伝子座）が同一であるＨＬＡ型等が挙げられる（以下同様の意味を適用）。

初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはノンコーディング（ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ）ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはノンコーディングＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３、Ｇｌｉｓ１等が例示される。これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５−７９７、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８、Ｅｍｉｎｌｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２６：２４６７−２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ Ｄ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９−１２７５、Ｓｈｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，５６８−５７４、Ｚｈａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３：４７５−４７９、Ｍａｒｓｏｎ Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，３，１３２−１３５、Ｆｅｎｇ Ｂ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：１９７−２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５９−４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ ＣＡ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０６：８９１２−８９１７、Ｋｉｍ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１：６４９−６４３、Ｉｃｈｉｄａ ＪＫ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．５：４９１−５０３、Ｈｅｎｇ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．６：１６７−７４、Ｈａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３：１０９６−１００、Ｍａｌｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３−７２０及びＭａｅｋａｗａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ． ４７４：２２５−９に記載の組み合わせが例示される。

好ましい態様において、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４（ＯＳＫ）を初期化物質として用いることができる。より好ましくは、該３因子に加え、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ及びｃ−Ｍｙｃ（Ｔ５８Ａ変異体を含む）から選択されるＭｙｃファミリーメンバー（Ｍ）を用いることができる。さらに、下記実施例に示すように、Ｌｉｎ２８は、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞の形成を促進し、ＴＲＡ１−６０陰性細胞への逆戻り転換を阻害するので、３因子（ＯＳＫ）又は４因子（ＯＳＫＭ）に加え、Ｌｉｎ２８を初期化物質として使用することも好ましい。

上記初期化因子には、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１ ｓｉＲＮＡ Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ ２９ｍｅｒ ｓｈＲＮＡ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７及びＰＤ０３２５９０１）、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３阻害剤（例えば、ＢｉｏおよびＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５−アザシチジン）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ−０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈｌ、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢｌおよびＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、Ｌ−チャネルカルシウムアゴニスト（例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ−８３−０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５およびｍｉｒ−３０２などのｍｉＲＮＡ、Ｗｎｔシグナリング（例えば可溶性Ｗｎｔ３ａ）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２およびプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれるが、それらに限定されない。本明細書においては、これらの樹立効率を高めることを目的として用いられる因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。

初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。

初期化因子がＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎのベクター）（ＷＯ２０１０／００８０５４）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができ、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。

また、ＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、５−メチルシチジンおよびシュードウリジン（ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を取り込ませたＲＮＡを用いても良い（Ｗａｒｒｅｎ Ｌ，（２０１０）Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．７：６１８−６３０）。

ｉＰＳ細胞誘導のための培養液としては、例えば、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる）または市販の培養液［例えば、マウスＥＳ細胞培養用培養液（ＴＸ−ＷＥＳ培養液、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（ｍＴｅＳＲ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）］などが含まれる。

本発明は、部分的には、初期化因子導入後１１日目までは、いったんＴＲＡ−１−６０陽性となった初期化中の細胞の約半数以上が、その後の培養の間にＴＲＡ−１−６０陰性に戻り、最終的にｉＰＳ細胞とならないのに対し、該細胞を１１日間よりも長い間培養した後でＴＲＡ−１−６０陽性細胞を選別し続いて培養を行った場合には、約９０％以上の細胞がＴＲＡ−１−６０陽性状態を維持し、ｉＰＳ細胞として樹立されることを見出したことに基づく。

結果的に、本発明の方法は、
（ｉ）初期化因子を体細胞に導入する工程；
（ｉｉ）工程（ｉ）で得た細胞を１１日より長い間培養する工程；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得た細胞からＴＲＡ−１−６０陽性細胞を選別する工程；
を含む。

上記工程（ｉ）の培養方法の例としては、５％ＣＯ_２の存在下３７℃で、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液中、体細胞と初期化因子を接触させることが挙げられる。無血清培地を用いる培養方法もまた例として挙げることができる（Ｓｕｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０６：１５７２０−１５７２５）。さらに、樹立効率を増進させるため、低酸素条件でｉＰＳ細胞を樹立してもよい（酸素濃度０．１％以上かつ１５％以下）（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｙ，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．５：２３７−２４１又はＷＯ２０１０／０１３８４５）。

上記培養の間、培養開始２日目以降から、培養液を１日１回新鮮な培養液と交換する。核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ^２あたり約５×１０^３〜約５×１０^６細胞である。

該導入後、該細胞を、工程（ｉ）で使用した同じ培養液中で１１日より長い間培養することができる。工程（ｉｉ）の培養期間は１１日より長ければ特に制限されず、例えば、１２日以上、１３日以上、１４日以上又は１５日以上であり、好ましくは１５日以上である。培養期間の上限も特に制限されないが、３０日以上培養する場合、完全に初期化されたｉＰＳ細胞のコロニーのみが残るので、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞を選別する意義が実質的に失われる。従って、培養期間は２９日以下であり、好ましくは２５日以下、より好ましくは２０日以下である。

ＴＲＡ−１−６０陽性細胞の選別は、例えば、市販の抗ＴＲＡ−１−６０抗体を用いたフローサイトメトリーにより行うことができる。

選別したＴＲＡ−１−６０陽性細胞を、（ｉｖ）フィーダー細胞（例、マイトマイシンＣで処理したＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上又は細胞外基質でコーティングしたディッシュ上に再播種し、ｂＦＧＦを含有する霊長類ＥＳ細胞用培養液中で培養することができる。細胞は、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培養液（さらにＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含有むことができる）中で、フィーダー細胞上、５％ＣＯ_２の存在下、３７°Ｃで培養することもできる。

あるいは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞自体又は細胞外基質（例、ラミニン−５（ＷＯ２００９／１２３３４９）及びマトリゲル（ＢＤ））を用いる方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．（２００９），ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．４：ｅ８０６７又はＷＯ２０１０／１３７７４６）を挙げることができる。

本発明はさらに、
（ｖ）工程（ｉｖ）により得たコロニーをピックアップして、別の培養容器へ移す工程；および
（ｖｉ）工程（ｖ）で得た細胞をさらに培養し、ｉＰＳ細胞を得る工程、
を含む。

工程（ｖ）において、単一のコロニー（クローン）を別々にピックアップしてもよく、それぞれのコロニー（クローン）を別々の培養容器で継代培養してもよい。あるいは、複数のコロニーをピックアップして一緒に別の培養容器に移し、バルクで培養してもよい。

ポリクローナルにコロニーをピックアップしてバルクで１０回以上継代培養した場合、体細胞に分化誘導した際の、未分化細胞の残存率を顕著に低減させることができる。従って、腫瘍形成リスクの低減されたクローンを選抜することなく、安全なｉＰＳ細胞を提供することができる。本発明において「継代培養する」とは、ｉＰＳ細胞を培養容器から剥離させ、全細胞又は細胞の１／２、１／３若しくは１／４程度を別の培養容器へ移す作業を意味する。

以下に、実施例によって本発明を更に説明するが、本発明は以下の実施例になんら限定されるものではない。

材料及び方法
統計的分析の指針

全ての定量的実験は、少なくとも生物学的に３重に行った。全ての図において、アスタリスクは、対応のあるＴ検定により決定されたＰ値＜０．０５を示す。エラーバーは標準偏差を示す。１０の独立なＨＤＦ系統と１０の独立なＥＳＣ系統（表１）の比較に基づいて、ＨＤＦ−Ｇ及びＥＳ−Ｇを倍率変化（ｆｏｌｄ−ｃｈａｎｇｅ（ＦＣ））＞１００、Ｐ＜０．０５と定義した。

細胞培養
Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｅｒｃｈ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ及びＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ＩｎｃからＨＤＦ系統を購入した。ＨＤＦは、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｔｈｅｒｍｏ）、０．５％ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）中で維持した。ＰＬＡＴ−Ｅ細胞は、１μｇ／ｍｌピューロマイシン及び１０μｇ／ｍｌブラストサイジンＳを含む１０％ＦＢＳ培地で培養した。ＥＳＣ系統は、京都大学及びＷｉＣＥＬＬから入手し、マイトマイシンＣで処理したＳＮＬフィーダー上で、４ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（Ｗａｋｏ）を添加したヒトＥＳＣ培地（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）中で維持した。使用した全ての細胞系統は、表１に記載した。

プラスミド作製
本研究に用いられる遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＰＣＲによって増幅し、ｐＥＮＴＲ−Ｄ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へサブクローニングし、配列決定によって確認した。その後、ＯＲＦは、Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ反応（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者のプロトコルに従い、ｐＭＸｓ−ｇｗレトロウイルスベクターに移した。ＴＰ５３のためのノックダウンベクターはＡｄｄｇｅｎｅから入手した（＃１０６７２）。

ｉＰＳＣコロニー形成
初期化は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びＹａｍａｎａｋａ（Ｃｅｌｌ １２６，６６３−６７６（２００６））に記載されたように行った。レトロウイルスを作製するため、我々は、それぞれの因子をコードするレトロウイルスベクターを、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬を製造者の推奨どおりに用いて、ＰＬＡＴ−Ｅ細胞へ導入した。翌日、我々は、該培地を、１０％ＦＢＳを含有する新鮮な培地に交換し、約２４時間該細胞のインキュベーションを行った。ウイルスを含む培地を、その後、回収し、０．４５μｍ孔径の酢酸セルロースフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ）を用いてろ過した。次に、我々は、適切な組合せのウイルスを混合し、マウスＳｌｃ７ａ１遺伝子を発現するＨＤＦを、４μｇ／ｍｌポリブレン（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ）と共にウイルスに一晩さらして使用した。我々は、この時点を０日目とした。１０％ＦＢＳを含有する培地を用い、形質導入した細胞を７日間培養した。我々は、形質導入後７日目に、該細胞を回収し、２．５ｘ１０^５細胞を、マイトマイシンＣで不活性化したＳＮＬフィーダー細胞上に再播種した。翌日、培地を、ヒトＥＳＣ培地に置換した。培地は、１日おきに交換した。我々は、形質導入後２４日目に、ｉＰＳＣコロニーの数を計測した。

ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞、ＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞及びＥＧＦＰ（−）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞の解析
ＯＫＭに加えＳＯＸ２−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを形質導入した細胞を、１０％ＦＢＳを含有する培地で、８日間培養した。その後、培養液をヒトＥＳＣ培地に置換した。形質導入後７日目、１１日目及び１５日目に、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて形質導入された細胞を回収し、７０μｍ孔径の細胞ストレイナー（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてろ過した。次に細胞を、抗ＴＲＡ−１−６０マイクロビーズキットで処理し、ａｕｔｏ ＭＡＣＳ ｐｒｏ装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ｂｉｏｔｅｃ）により、それらのＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を選別した。ＭＡＣＳ後のＴＲＡ−１−６０（−）画分から、ＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞及びＥＧＦＰ（−）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ機器（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により選別した。形質導入後２０日目及び２８日目にＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を回収するため、我々は、ＭＡＣＳで選別した５ｘ１０^５のＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を、形質導入後１１日目に、１０ｃｍの培養ディッシュ中の、マイトマイシンＣで不活性化したＳＮＬフィーダー上に再播種した。次に、細胞をＹ−２７６３２（１０μＭ）を含むヒトＥＳＣ培地中で、２日間培養した。次に、２日毎に、培地を新鮮なヒトＥＳＣ培地に置換した。２０日目及び２８日目に、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を上記のＭＡＣＳプロトコルを用いて選別した。

単一のＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の選別及び培養
ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を、上記のＭＡＣＳプロトコルを用いて選別した。選別したＴＲＡ−１−６０（＋）細胞は、死細胞を検出するため、ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）で３０分間染色した。各ＴＲＡ−１−６０（＋）／ＤＡＰＩ（−）細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ機器を用いて、９６穴プレートのウェルへ、マイトマイシンＣで不活性化したＳＮＬフィーダー上に、直接、選別した。細胞は、Ｙ−２７６３２（１０μＭ）を含むヒトＥＳＣ培地中で培養した。選別２日後、我々は、Ｙ−２７６３２を含む新鮮なヒトＥＳＣ培地を加えた。我々は、選別４日後から、２日毎の培地の置換を始めた。我々は、形質導入後３２日目に、ｉＰＳＣコロニーが存在するウェルの数を計測した。

フローサイトメトリー及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
解析のため、形質導入後１日おきに、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて、形質導入された細胞を回収した。少なくとも１ｘ１０^５細胞を、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ中、２％ＦＢＳ、０．３６％グルコース）中で、以下の抗体を用いて、室温で３０分間染色した。解析のため、以下の抗体を使用した。Ａｌｅｘａ６４７結合ＴＲＡ−１−６０（１：２０、５６０１２２、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ａｌｅｘａ−４８８結合ＴＲＡ−１−６０（１：２０、５６０１７３、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フィコエリトリン結合ＴＲＡ−１−８５（１：１０、ＦＡＢ３１９５Ｐ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、

逆戻りの解析
我々は、上記のＭＡＣＳプロトコルを用いてＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を選別した。Ｙ−２７６３２（１０μＭ）を含むヒトＥＳＣ培地を用い、マイトマイシンＣで不活性化したＳＮＬフィーダー上で、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を２日間培養した。その後、さらに２日間又は７日間（形質導入後１５日目又は２０日目まで）、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を培養した。培地を新鮮なヒトＥＳＣ培地で２日毎に置換した。ＴＲＡ−１−６０（−）状態への逆戻りを検出するため、ＦＡＣＳプロトコル中にすでに記載したように、形質導入された細胞を、ＴＲＡ−１−８５抗体及びＴＲＡ−１−６０抗体で染色した。ＴＲＡ−１−８５（＋）集団中のＴＲＡ−１−６０（−）細胞の割合を計算して、逆戻りを検出した。マイクロアレイの前に、逆戻りしたＴＲＡ−１−６０（−）／ＴＲＡ−１−８５（＋）細胞を、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ機器を用いて選別した。

単一細胞遺伝子発現解析
我々は、まず、０．２ｘＴａｑｍａｎプローブミックス（１９のＴａｑｍａｎプローブ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｂｉｎａｒｙ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）；１μｌｘ１９，ＤＮＡ懸濁バッファー（Ｔｅｃｎｏｖａ）；４μｌ，水；７７μｌ）を作製した。本研究に使用したＴａｑｍａｎプローブを表２に記載する。

ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ機器を用いて、９μｌのマスターミックス（Ｃｅｌｌｓ Ｄｉｒｅｃｔ ２ｘ反応ミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、５μｌの０．２ｘＴａｑｍａｎプローブミックス、２．５μｌのＳｕｐｅｒ ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑミックス（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び０．２μｌのＤＮＡ懸濁バッファー（Ｔｅｃｎｏｖａ）；１．３μｌ）中に、単一細胞を直接選別した。５０℃、１５分間の単一細胞の溶解及び逆転写、並びに９５℃、２分間の逆転写酵素の不活性化のため、サーマルサイクラー中で反応混合物のインキュベーションを行った。ＴａｑＭａｎアッセイにおいて、２２サイクルの間、９５℃、１５秒間及び６０℃、４分間で、ｃＤＮＡを特異的に増幅させた。ＴａｑＭａｎアッセイを用いて単一細胞ｑＰＣＲを行い、増幅したｃＤＮＡをＢｉｏＭａｒｋ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）の４８．４８Ｄｙｎａｍｉｃ Ａｒｒａｙ中で５倍に希釈した。製造者により提供されたソフトウェアプログラム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ解析）によって、Ｃｔ値を計算した。Ｃｔ値が２６より高い場合、発現検出不可能／低発現として、フィルターをかけて除外した。全てのＴａｑＭａｎアッセイは、単一細胞レベルで遺伝子発現を定量化できることを確認して確かめた。

マイクロアレイ
全ＲＮＡを、Ｃｙａｎｉｎｅ３を用いて標識した。標本を、全ヒトゲノムマイクロアレイＳｕｒｅＰｒｉｎｔ Ｇ３ Ｈｕｍａｎ ＧＥ ８ｘ６０Ｋ（Ｇ４１１２Ｆ、Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とハイブリダイズさせた。各標本は、単色プロトコルを用いて一度ハイブリダイズさせた。Ｇ２５６５ＢＡマイクロアレイスキャナーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、アレイをスキャンした。全てのマイクロアレイの結果は、Ｇｅｎｅｓ ｐｒｉｎｇ ｖ １１ソフトウェアプログラム（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて解析した。標本は、７５パーセンタイルシフトにより標準化した。エンティティーは、パーセンタイルによってフィルターをかけた。標本の少なくとも１つが、２０パーセンタイルに対し１００以内の値を持っていた場合、エンティティーはフィルターを通過した。さらに、エンティティーはフラグ値に基づいてフィルターをかけた。エンティティーが、標本の少なくとも１つにおいて、Ｐｒｅｓｅｎｔ値又はＭａｒｇｉｎａｌ値を持っていた場合、エンティティーはフィルターを通過した。

ＢｒｄＵの取り込み
解析１日前に、培地を新鮮な培地に交換した。翌日に、３０分間、３７℃で、１０μＭ ＢｒｄＵを用いて細胞のインキュベーションを行った。次に、ＦＡＣＳプロトコルにおいてすでに記載したように、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて、細胞を回収し、抗ＴＲＡ１−６０抗体と、室温で３０分間インキュベーションを行った。ＢｒｄＵの取り込みは、ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて検出した。

アポトーシス
ＯＳＫＭが形質導入された細胞を、１１日目に０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡを用いて回収した。次に、それらをＡｐｏＡｌｅｒｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて速やかに染色し、ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩ機器を用いて染色を検出した。

ＪＳＤ
Ｂｕｇａｎｉｍ ｅｔ ａｌ（Ｃｅｌｌ １５０，１２０９−２２（２０１２）に従い計算を行った。

ＳＦＥＢｑ法
ＳＦＥＢｑ法は、次の通り行った。得た細胞を、Ａｃｃｕｍａｘ（登録商標）を用いて、５分間３７℃のインキュベーションを行って分離し、洗浄し、細胞数を計測した。細胞を、前記分化培地へ懸濁し、低接着９６穴プレート（Ｌｉｐｉｄｕｒｅ−ｃｏａｔ ｐｌａｔｅ：日油株式会社）へ９０００細胞／ウエルで播種した。細胞は、１０μＭ Ｙ−２７６３２（ＷＡＫＯ）、０．１μＭ ＬＤＮ１９３１８９（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）、０．５μＭ Ａ８３−０１（ＷＡＫＯ）、８％ＫＳＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（ＷＡＫＯ）を含有するＧＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で、１４日間培養した。Ｙ２７６３２は初回培養のために加えた。培地は、７日目までは交換せず、その後は３日おきに交換した。神経前駆細胞への誘導後、細胞を単一細胞に分散させ、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の数をフローサイトメーターを用いて決定した。

結果
我々は、ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣ用のｐＭＸｓレトロウイルスベクターを、ＳＯＸ２−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを発現するもう一つのｐＭＸｓベクターと共に、４人のコーカサス人及び６人の日本人ドナーを含む様々な年齢（０〜８１歳）のドナーに由来する１０のＨＤＦ系統に導入した。形質導入後７日目に、ＨＤＦの〜２０％（５．９〜２４．５％）は、ＥＧＦＰ（＋）になった（図１Ａ）。我々は、ＥＧＦＰ（＋）細胞を選別し、定量的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、形質導入されたレトロウイルスのコピー数を評価した。形質導入後１１日目又は１５日目に、我々は、各導入遺伝子（ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４又はｃ−ＭＹＣ）に対し、ＥＧＦＰ（＋）細胞において、およそ５コピー／細胞のレトロウイルスを検出した（図１Ｂ）。一方、ＥＧＦＰ陰性（−）細胞において、我々は、少数のコピー／細胞のみのレトロウイルスを検出した。７日目に、我々は、ＥＧＦＰ（＋）細胞及び（−）細胞のいずれにおいても、およそ２倍のコピー数のレトロウイルスを検出した。７日目に、一見したところ、より高いコピー数である理由は、明確ではない。それにもかかわらず、ＥＧＦＰ（＋）細胞は、より多数のレトロウイルスのＯＳＫＭを受けとったＨＤＦを意味し、一方、ＥＧＦＰ（−）ＨＤＦは著しく少数コピーのレトロウイルスの導入遺伝子が組込まれていることが、結果により確かめられた。

７日目に、我々は、２．５ｘ１０^５細胞をＳＮＬフィーダー細胞上に再播種し、線維芽細胞培地を多能性幹細胞用培地に置換した。２４日目に、我々は、９〜５８３のｉＰＳＣコロニーを観察した（図１Ｃ）。その結果、以前に報告された結果と同様に（非特許文献２）、再播種したＨＤＦからの推測上のｉＰＳＣ作製効率は、０．００３６〜０．２３％と低かった。

我々は、ｉＰＳＣ作製の低い効率と対照的に、形質導入後７日目に、ＥＧＦＰ（＋）細胞の〜２０％がＴＲＡ−１−６０（＋）になることを見出した（図２Ａ）。我々は、ｉＰＳＣコロニーのほとんどがこれらのＴＲＡ−１−６０（＋）細胞に由来することを確認した（図２Ｂ）。我々は、７日目、１１日目及び１５日目にＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を選別し、マイクロアレイ解析により、それらの遺伝子発現を解析した。ＨＤＦとヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）との間の遺伝子発現の比較により、我々は、ＨＤＦにおける発現レベルがＥＳＣにおける発現レベルより少なくとも１００倍高い、１６９の線維芽細胞に豊富な遺伝子（ＨＤＦ−Ｇ）、及びＥＳＣにおける発現レベルがＨＤＦにおける発現レベルより少なくとも１００倍高い、１９６のＥＳＣに豊富な遺伝子（ＥＳ−Ｇ）を選択した。我々は、これらのＥＳ−Ｇのおよそ半数が、７日目に、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞において、ＨＤＦにおけるそれらのレベルと比較して、少なくとも１０倍増加したことを見出した（図２Ｃ）。これらは、例えばＮＡＮＯＧ及び内在性ＯＣＴ３／４などの周知のＥＳＣマーカー遺伝子を含んでおり、逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによりそれらの増加した発現を確認した（図２Ｄ）。一方、例えばＬＩＮ２８及び内在性ＳＯＸ２などの他のＥＳＣマーカーは、低いままだった。ＨＤＦ−Ｇのおよそ半数が、多くとも１０分の１に減少した（図２Ｃ）。これらのデータは、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞が、形質導入後７日目までに、部分的に初期化された状態を獲得していたことを示す。

予想外なことに、我々は、ＴＲＡ−１−６０（−）にとどまっていたＥＧＦＰ（＋）細胞においても、部分的な初期化を検出した（図２Ｃ）。ＤＮＡマイクロアレイ解析は、ＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞において、１９６のＥＳ−Ｇの中、７７の遺伝子の発現が、７日目においてＨＤＦにおけるそれらのレベルと比較して、少なくとも１０倍増加したことを示した。１６９のＨＤＦ−Ｇ中、６５の遺伝子の発現レベルが、多くとも１０分の１に減少した。一方、ＥＧＦＰ（−）細胞において、ＥＳ−Ｇ及びＨＤＦ−Ｇのうちの少数のみの発現が＞１０倍に変化した（１７のＥＳ−Ｇ及び２のＨＤＦ−Ｇ）。ＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞においても同様に変化したが、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞のものよりもわずかながら顕著でなかった（図２Ｅ）。

ＥＳ−Ｇ及びＨＤＦ−Ｇの主成分分析（ＰＣＡ）は、ＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞と同様に、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞における部分的な初期化を実証したが、ＥＧＦＰ（−）細胞においてはしなかった（図２Ｆ）。注目すべきことに、我々は、７日目、１１日目及び１５日目で、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の初期化の進行を検出した。一方、そのような進行はＴＲＡ−１−６０（−）細胞においては見られなかった。これらのデータは、高いコピー数のＯＳＫＭ導入遺伝子を受けとったＨＤＦの大多数において、初期化が開始されるが、初期化の成熟は、ＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞ではなくＴＲＡ−１−６０（＋）細胞においてのみ起こることを実証した。

我々は次に、１３のＥＳ−Ｇ及びＨＤＦ−Ｇを定量的に検出したＴａｑｍａｎプローブを用いて単一細胞ＲＴ−ＰＣＲを行った（図３Ａ及びＢ、表３）。

７日目のＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の大多数において、ＮＡＮＯＧ、Ｌ１ＴＤ１、ＧＤＦ３、ＧＡＬ、ＳＡＬＬ４、ＡＰＯＥ、ＣＤＨ１及びＥＰＣＡＭを含む８のＥＳ−Ｇの発現が、ＨＤＦにおけるレベルより少なくとも１０倍増加した。一方、ＤＰＰＡ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＤＮＭＴ３Ｂ及びＧＡＢＲＢ３を含む他の５のＥＳ−Ｇは、２０日目又は２８日目まで抑制されたままであった。ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の大多数において、４つ全てのＨＤＦ−Ｇ（ＭＭＰ１、ＤＣＮ、ＬＵＭ及びＣＤ１３）は抑制された。ＥＧＦＰ（＋）／ＴＲＡ−１−６０（−）細胞は、類似しているが小さな変化を示した。際立って対照的なことに、ＥＧＦＰ（−）細胞においては、ＥＳ−Ｇ及びＨＤＦ−Ｇの発現レベルの変化がほとんど観察されなかった。ＰＣＡは、７日目から２８日目までに、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の初期化が、徐々に進行したことを実証した（図３Ｃ）。７日目、１１日目及び１５日目にＴＲＡ−１−６０（＋）細胞は、それらの遺伝子発現に関して、オリジナルののＨＤＦ又はＥＳＣよりもより異種遺伝子性であった（図３Ｄ）。これらのデータにより、高いコピー数のＯＳＫＭ導入遺伝子を受けとったＨＤＦのほとんどにおいて、初期化が開始され、次にＴＲＡ−１−６０（＋）細胞特異的に、初期化が徐々に進行することを確認した。

初期化され始めた細胞の運命を探索するため、我々は、磁気活性化細胞分離（ＭＡＣＳ）を用いて、７日目、１１日目、１５日目及び２０日目にＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を選別し、ＳＮＬフィーダー上に再播種した。我々は、播種２０日後のｉＰＳＣコロニーの数を計測した（図４Ａ）。７日目又は１１日目に選別したＴＲＡ−１−６０（＋）細胞からのｉＰＳＣコロニー形成の効率は、低いままであった（〜１％）。一方、１５日目又は２０日目に選別したＴＲＡ−１−６０（＋）細胞は、著しく増加したｉＰＳＣコロニー形成効率を示し、１１日目から１５日目に初期化が成熟することを示した。

選別後のＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の運命をさらにたどるために、我々は、再播種したヒト細胞をマウスフィーダー細胞と区別する必要があった。この目的を達成するために、我々は、ヒト特異的抗原ＴＲＡ−１−８５を使用した。ＥＳＣ又は樹立したｉＰＳＣを、ＴＲＡ−１−６０で選別し、再播種した場合、９９％より多くが再播種４日後に陽性を維持していた（図４Ｂ）。一方、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を選別し形質導入後７日目に再播種した場合、再播種４日後以内に、それらの〜５０％が逆戻りしＴＲＡ−１−６０（−）になった。１１日目に選別したＴＲＡ−１−６０（＋）細胞も、強い逆戻り傾向を示した。一方、１５日目に選別したＴＲＡ−１−６０（＋）細胞は、１０％未満の逆戻りを示した（図４Ｂ）。従って、逆戻りの度合及びｉＰＳＣコロニー形成の効率は、逆相関を示した。

１９６のＥＳ−Ｇ及び１６９のＨＤＦ−ＧのＰＣＡにより、ＴＲＡ−１−６０（−）運命に戻った細胞において、初期化の逆戻りがあったことを確認した（図４Ｃ）。１１日目に選別したＴＲＡ−１−６０（＋）細胞と比較して、１５日目及び２０日目に陰性に戻った細胞は、遺伝子発現において、元のＨＤＦへの漸進的変化を示した。一方、１５日目及び２０日目でＴＲＡ−１−６０（＋）を維持した細胞において、我々は、遺伝子発現パターンにおける初期化の進行を検出した。

次に、我々は、線維芽細胞の増殖、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞への転換、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の増殖、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞死及び逆戻りを含む、ｉＰＳＣ作製の様々な側面に対する、報告された副初期化因子の効果を調査した。我々は、ＮＡＮＯＧ（Ｙｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８，１９１７−２０；Ｈａｎｎａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６２，５９５−６０１；Ｓｉｌｖａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１，９９７−１００１）、ＬＩＮ２８（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）、上記）、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１（Ｅｄｅｌ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２４，５６１−７３）、及びｐ５３ｓｈＲＮＡ（Ｈａｎｎａ ｅｔ ａｌ．（２００９）、上記；Ｈｏｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６０，１１３２−５；Ｋａｗａｍｕｒａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６０，１１４０−４；Ｕｔｉｋａｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６０，１１４５−８；Ｍａｒｉｏｎ，Ｒ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６０，１１４９−１１５３；Ｌｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ ４６０，１１３６−９）の効果を分析した。我々は、ＯＳＫＭと共に、これらの因子のそれぞれをＨＤＦに導入し、形質導入２８日後にｉＰＳＣコロニーの数を計測した。我々は、ＮＡＮＯＧを除くこれらの因子の全てが、ｉＰＳＣコロニーの数を著しく増加させたことを見出した（図５Ａ）。Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１及びｐ５３ ｓｈＲＮＡによりＨＤＦの増殖が増加したが、ＮＡＮＯＧ又はＬＩＮ２８ではしなかった（図５Ｂ）。ＴＲＡ−１−６０（＋）ステータスへの転換は、ＬＩＮ２８により増進したが、ＮＡＮＯＧ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１又はｐ５３ ｓｈＲＮＡによっては増進しなかった（図５Ｃ）。ＴＲＡ−１−６０陽性細胞の増殖は、ＬＩＮ２８により増進した（図５Ｄ）。従って、転換の増加は、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の選択的な拡大に起因するかもしれない。ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞死は、ｐ５３ ｓｈＲＮＡにより抑制された（図５Ｅ）。ＴＲＡ−１−６０（＋）状態から（−）状態への逆戻りは、ＬＩＮ２８により抑制された（図５Ｆ）。これらのデータは、ｉＰＳＣ作製の間、各副初期化因子が、異なる作用機序を有することを実証した。

上記と同様の方法によりレトロウイルスを用いてＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ−Ｍｙｃをヒト線維芽細胞（ＴＩＧ１１９またはＴＩＧ１２０）へ導入し、線維芽細胞を初期化した（ｄ０）。

遺伝子導入後１１日目（ｄ１１）に、上記の方法によりＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を選別し、マイトマイシンＣ処理したＳＮＬ細胞上へ播種した。その後、１０日目（ｄ２１）又は１８日目（ｄ２９）に、同様にＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を選別し、ＳＦＥＢｑ法により神経前駆細胞へ分化させた。残存するＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の数により分化抵抗性を評価した。さらに、播種後１７日目（ｄ２８）にＴＲＡ−１−６０陽性細胞をソーティングし、マイトマイシンＣで処理したＳＮＬ細胞上へ再播種し、５回継代後（ｐ５）又は１０回継代後（ｐ１０）についても、同様に分化抵抗性を評価した。継代培養は、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｋ，ｅｔ ｅ ａｌ（Ｃｅｌｌ（２００６）、上記）に記載の方法で行った。

ＳＦＥＢｑ法による神経前駆細胞への誘導後、細胞を単一細胞に分散させ、フローサイトメーターを用いてＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の数を測定した。ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の含有率（％）を表４に示す。これらのデータは、低い分化抵抗性を有するｉＰＳ細胞の製造には、ＴＲＡ−１−６０陽性細胞選別後の継代が重要であることを実証した。

２０１Ｂ７は、分化感受性が確認されている標準株であり（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ｅ ａｌ．Ｃｅｌｌ（２００６）、上記）、ＴＩＧ１０８−４ｆ３は、分化抵抗性が確認されている標準株である。

考察
本研究において、ＯＳＫＭ初期化因子を受けとったヒト線維芽細胞において、我々は、これまでに予測されたよりもはるかに頻繁に初期化が開始されることを示した（図６）。我々は、高いコピー数のＯＳＫＭレトロウイルスが形質導入されたＨＤＦの大多数において、初期化が開始されていることを示す、多くのＥＳ−Ｇの素早い誘導及びＨＤＦ−Ｇの抑制を検出した。形質導入７日後以内に、これらの形質導入されたＨＤＦのおよそ２０％は、最もよく知られた多能性幹細胞マーカーの一つであるＴＲＡ−１−６０陽性になった。これらのＴＲＡ−１−６０（＋）細胞は、その遺伝子発現パターンにおいて、ｉＰＳＣ／ＥＳＣにおける遺伝子発現パターンへの漸進的変化を示した。しかしながら、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞のごく一部のみが、初期化過程を完了し、ｉＰＳＣになった。従って、作製低効率の原因であるのは、開始ではなく、成熟である。

我々は、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞が初期化を完了できないことの根底にある重要な機構の一つが、ＴＲＡ−１−６０（−）状態への逆戻りであることも示した。ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞を選別し、ＳＮＬフィーダー細胞上に７日目に再播種した場合、再播種４日後に陽性のままであったのは、半数未満だった。逆戻りしたＴＲＡ−１−６０（−）細胞の増殖は、陽性細胞より著しく低かった（データは示さず）ため、ＴＲＡ−１−６０（−）状態へ戻った細胞の実際の割合は、５０％以上であったはずである。１１日目に細胞を選別した場合、逆戻り率は、依然として高かった。一方、１５日目に選別した場合、逆戻り率は、１０％未満になった。この結果は、初期化され始めた細胞が、この期間（１１日目から１５日目の間）中に成熟することを示す。

本研究のもう一つの重要な発見は、各副初期化因子が、ｉＰＳＣ作製の促進において、異なる作用機序を有することである。我々は、ＯＳＫＭを共導入した場合、ＬＩＮ２８、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１及びｐ５３ ｓｈＲＮＡの３つの因子がｉＰＳＣコロニーの数を著しく増加させることを見出した。しかしながら、ＮＡＮＯＧは、我々のアッセイにおいて、副初期化活性を示さなかった。副初期化活性を示した３つの因子のうち、Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１及びｐ５３ ｓｈＲＮＡは、主に増殖を促進し細胞死を抑制することによってｉＰＳＣコロニーの数を増加させた。一方、ＬＩＮ２８は、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の形成を促進し、（−）細胞への逆戻り転換を阻害した。我々は、ＴＲＡ−１−６０（＋）細胞が成熟していく際に、内在性のＬＩＮ２８が初期化の後期に活性化されたことを見出した。このようにＬＩＮ２８は、初期化の成熟を促進するようである。注目すべきことに、我々は、ＬＩＮ２８はＴＲＡ−１−６０（＋）細胞の増殖を促進するが、ＴＲＡ−１−６０（−）細胞の増殖は促進しないことを見出した。この初期化され始めた細胞に特異的な活性化は、ＬＩＮ２８の副初期化機能に貢献するはずである。

本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神及び範囲に包含されるすべての変更を含むものである。

特許及び特許出願を含む、ここで述べられた全ての刊行物に記載された内容は、ここに参照により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本出願は米国仮特許出願第６１／８３３，７２２号に基づくものであり、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (7)

1. 以下の工程を含む人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の製造方法：
   （ｉ）初期化因子を体細胞に導入する工程；
   （ｉｉ）工程（ｉ）で得た細胞を１１日より長くかつ２９日以下の間培養する工程；
   （ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で得た細胞からＴＲＡ−１−６０陽性細胞を選別する工程；
   （ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で選別したＴＲＡ−１−６０陽性細胞を培養する工程；
   （ｖ）工程（ｉｖ）により得たコロニーを、別の培養容器へ移す工程；および
   （ｖｉ）工程（ｖ）で得た細胞を培養し、ｉＰＳ細胞を得る工程。
2. 初期化因子が、
   （ａ）Ｏｃｔ３／４又はそれをコードする核酸；
   （ｂ）Ｓｏｘ２又はそれをコードする核酸；及び
   （ｃ）Ｋｌｆ４又はそれをコードする核酸、
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. 初期化因子がさらに、（ｄ）Ｌｉｎ２８又はそれをコードする核酸を含む、請求項２に記載の方法。
4. ｉＰＳ細胞がヒトｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の方法。
5. 工程（ｉｉ）の培養期間が１５〜２０日である、請求項１に記載の方法。
6. 工程（ｖｉ）で得た細胞を１０回以上継代培養する、請求項１に記載の方法。
7. 請求項６に記載の方法により得たｉＰＳ細胞の分化を誘導することを含む、未分化細胞の残存率が低減された分化細胞集団の製造方法。