JP6381442B2 - 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 - Google Patents
効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6381442B2 JP6381442B2 JP2014516857A JP2014516857A JP6381442B2 JP 6381442 B2 JP6381442 B2 JP 6381442B2 JP 2014516857 A JP2014516857 A JP 2014516857A JP 2014516857 A JP2014516857 A JP 2014516857A JP 6381442 B2 JP6381442 B2 JP 6381442B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- acid encoding
- vector
- human
- ebna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 81
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 224
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 223
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 130
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 130
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 130
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 102
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims description 92
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 91
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 78
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 56
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 claims description 53
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 claims description 53
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 51
- 101150086694 SLC22A3 gene Proteins 0.000 claims description 49
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 37
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 claims description 32
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 31
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 31
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 30
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 25
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 25
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims description 18
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 18
- -1 L-Myc Proteins 0.000 claims description 14
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 14
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 9
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 claims description 8
- 108091057508 Myc family Proteins 0.000 claims description 7
- 241000131390 Glis Species 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 4
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims description 4
- 101100342337 Caenorhabditis elegans klf-1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100257372 Caenorhabditis elegans sox-3 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150072501 Klf2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100310657 Mus musculus Sox1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100310648 Mus musculus Sox17 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100257376 Mus musculus Sox3 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100462520 Mus musculus Tp53 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 3
- 101150001847 Sox15 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 108010031111 EBV-encoded nuclear antigen 1 Proteins 0.000 claims 26
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 claims 10
- ULBKMFLWMIGVOJ-CFXUUZMDSA-M propicillin potassium Chemical compound [K+].N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)C(CC)OC1=CC=CC=C1 ULBKMFLWMIGVOJ-CFXUUZMDSA-M 0.000 claims 7
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 claims 2
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 claims 2
- 102100030124 N-myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims 2
- 108060003196 globin Proteins 0.000 claims 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 claims 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 79
- 101000721661 Homo sapiens Cellular tumor antigen p53 Proteins 0.000 description 79
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 43
- 230000006870 function Effects 0.000 description 33
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 30
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 19
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 18
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 17
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 17
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 17
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 16
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 9
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 8
- 101150099612 Esrrb gene Proteins 0.000 description 7
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 7
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 6
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 6
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 6
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 6
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 5
- 101150033269 ESRRG gene Proteins 0.000 description 5
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 5
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 5
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 5
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 5
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 4
- 101150059079 EBNA1 gene Proteins 0.000 description 4
- 101100540311 Human papillomavirus type 16 E6 gene Proteins 0.000 description 4
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 description 4
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 4
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 4
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 4
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 4
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N Valproic acid Chemical compound CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 4
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 4
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 3
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 3
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 3
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 2
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 2
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 2
- 102100039996 Histone deacetylase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 2
- 101001035024 Homo sapiens Histone deacetylase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000013000 chemical inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 108010056030 retronectin Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 210000001988 somatic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 2
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- JUNHQBJCWZVSAT-BQYQJAHWSA-N (e)-n-hydroxy-3-[1-methyl-4-(4-methylbenzoyl)pyrrol-2-yl]prop-2-enamide Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1C(=O)C1=CN(C)C(\C=C\C(=O)NO)=C1 JUNHQBJCWZVSAT-BQYQJAHWSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEBBCNXOYOVGQS-BNHYGAARSA-N 4-amino-1-[(2r,3r,4s,5s)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxyamino)oxolan-2-yl]pyrimidin-2-one Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](NO)O1 GEBBCNXOYOVGQS-BNHYGAARSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229940122642 Calcium channel agonist Drugs 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010061764 Chromosomal deletion Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 108010008655 Epstein-Barr Virus Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000702191 Escherichia virus P1 Species 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 102000001267 GSK3 Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 108010014905 Glycogen Synthase Kinase 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000011787 Histone Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108010036115 Histone Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000986084 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000777245 Homo sapiens Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000000646 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 101150107363 Lif gene Proteins 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101100058550 Mus musculus Bmi1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100404103 Mus musculus Nanog gene Proteins 0.000 description 1
- 101100310650 Mus musculus Sox18 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100037369 Nidogen-1 Human genes 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N Trichostatin A Natural products ONC(=O)C=CC(C)=CC(C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108091026822 U6 spliceosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100031278 Undifferentiated embryonic cell transcription factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 description 1
- 241001492404 Woodchuck hepatitis virus Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001552 airway epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011316 allogeneic transplantation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002453 autonomic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000000801 calcium channel stimulating agent Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000002932 cholinergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000000254 ciliated cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 210000000555 contractile cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010502 episomal replication Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003499 exocrine gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 210000001813 extracellular matrix secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 102000013370 fibrillin Human genes 0.000 description 1
- 108060002895 fibrillin Proteins 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000002660 insulin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003697 methyltransferase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 108091072810 miR-294 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091076076 miR-295 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091030789 miR-302 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 239000002829 mitogen activated protein kinase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- FMURUEPQXKJIPS-UHFFFAOYSA-N n-(1-benzylpiperidin-4-yl)-6,7-dimethoxy-2-(4-methyl-1,4-diazepan-1-yl)quinazolin-4-amine;trihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.C=12C=C(OC)C(OC)=CC2=NC(N2CCN(C)CCC2)=NC=1NC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 FMURUEPQXKJIPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DOBKQCZBPPCLEG-UHFFFAOYSA-N n-benzyl-2-(pyrimidin-4-ylamino)-1,3-thiazole-4-carboxamide Chemical compound C=1SC(NC=2N=CN=CC=2)=NC=1C(=O)NCC1=CC=CC=C1 DOBKQCZBPPCLEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n-ethylnitrous amide Chemical compound CCN(N=O)C(C)(C)C AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001178 neural stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 208000028169 periodontal disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002856 peripheral neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 102000000568 rho-Associated Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010041788 rho-Associated Kinases Proteins 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000697 sensory organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000009580 stem-cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 210000004357 third molar Anatomy 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N trichostatin A Chemical compound ONC(=O)/C=C/C(/C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 RTKIYFITIVXBLE-QEQCGCAPSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 description 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
- C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/602—Sox-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/603—Oct-3/4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/604—Klf-4
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/606—Transcription factors c-Myc
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/60—Transcription factors
- C12N2501/608—Lin28
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/11—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from blood or immune system cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
- C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
[1]以下の(1)および(2):
(1)核初期化因子をコードする核酸を搭載した1以上のエピソーマルベクター;および
(2)(1)とは別のEBNA-1をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクター
を体細胞に導入する工程を含む、iPS細胞の製造方法。
[2]さらに、p53の機能阻害物質をコードする核酸をエピソーマルベクターの形態で導入する、[1]に記載の方法。
[3]前記p53の機能阻害物質が、p53 shRNAまたはp53のドミナントネガティブ変異体である、[2]に記載の方法。
[4]前記p53のドミナントネガティブ変異体がp53DDである、[3]に記載の方法。
[5]前記核初期化因子が、Octファミリー、Klfファミリー、Soxファミリー、Mycファミリー、LinファミリーおよびGlisファミリーのメンバーからなる群から選択される1以上である、[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]前記核初期化因子が、Oct3/4、Klf4、Sox2、L-MycおよびLin28である、[5]に記載の方法。
[7]前記核初期化因子が、Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28およびGlis1である、[6]に記載の方法。
[8]前記核初期化因子をコードする核酸が、2つまたは3つのエピソーマルベクターに分かれて搭載されている、[1]〜[7]のいずれかに記載の方法。
[9]前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、pCEB-hSK-OおよびpCEB-hUL-Gである、[1]に記載の方法。
[10]前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULである、[1]に記載の方法。
[11]前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULである、[2]に記載の方法。
[12]前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルプラスミドベクターが、pCE-hOCT3/4-shp53、pCE-hSKおよびpCE-hULである、[2]に記載の方法。
[13]前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルプラスミドベクターが、pCE-hOCT3/4、pCE-hSKおよびpCE-hULであり、前記p53の機能阻害物質をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターがpCE-mp53DDである、[2]に記載の方法。
[14]前記EBNA-1をコードする核酸を搭載したプラスミドベクターが、pCXWB-EBNA1である、[9]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[15]前記EBNA-1をコードする核酸を搭載したプラスミドベクターが、pCXB-EBNA1である、[12]または[13]に記載の方法。
[16]前記体細胞が、ヒト線維芽細胞(HDF)または血液細胞から選択される、[1]〜[15]のいずれかに記載の方法。
[17]前記血液細胞が、末梢血単核球細胞(PMNC)である、[16]に記載の方法。
[18]前記末梢血単核球細胞(PMNC)が、T細胞である、[17]に記載の方法。
[19]iPS細胞の樹立効率改善法であって、核初期化因子をコードする核酸を搭載した1以上のエピソーマルベクターを体細胞に導入する工程において、該ベクターとともに、EBNA-1をコードする核酸を搭載した別のエピソーマルベクターを体細胞に導入することを特徴とする、方法。
[20]さらに、p53の機能阻害物質をコードする核酸をエピソーマルベクターの形態で導入する、[19]に記載の方法。
[21]前記p53の機能阻害物質が、p53 shRNAまたはp53のドミナントネガティブ変異体である、[20]に記載の方法。
[22]前記p53のドミナントネガティブ変異体がp53DDである、[21]に記載の方法。
[23]EBNA-1をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターを含む、iPS細胞樹立効率改善剤。
[24]iPS細胞を製造するためのキットであって、以下の(1)および(2):
(1)核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクター;および
(2)(1)とは別のEBNA-1をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクター
を含む、キット。
[25]さらに、p53の機能阻害物質をコードする核酸Aを、エピソーマルベクターの形態で含む、[24]に記載のキット。
[26]前記p53の機能阻害物質が、p53 shRNAまたはp53のドミナントネガティブ変異体である、[25]に記載のキット。
[27]前記p53のドミナントネガティブ変異体がp53DDである、[26]に記載のキット。
[28]前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、pCEB-hSK-OおよびpCEB-hUL-Gである、[24]に記載のキット。
[29]前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULである、[24]に記載のキット。
[30]前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hULである、[25]に記載のキット。
[31]前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルプラスミドベクターが、pCE-hOCT3/4-shp53、pCE-hSKおよびpCE-hULである、[25]に記載のキット。
[32]前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルプラスミドベクターが、pCE-hOCT3/4、pCE-hSKおよびpCE-hULであり、前記p53の機能阻害物質をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターがpCE-mp53DDである、[25]に記載のキット。
[33]前記EBNA-1をコードする核酸を搭載したプラスミドベクターが、pCXWB-EBNA1である、[28]〜[30]のいずれかに記載のキット。
[34]前記EBNA-1をコードする核酸を搭載したプラスミドベクターが、pCXB-EBNA1である、[31]または[32]に記載のキット。
[35][1]〜[18]のいずれかに記載の方法により得られるiPS細胞に分化処理を行い、体細胞に分化させることを含む、体細胞の製造方法。
iPS細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等)由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞(例、角質化表皮細胞)、粘膜上皮細胞(例、舌表層の上皮細胞)、外分泌腺上皮細胞(例、乳腺細胞)、ホルモン分泌細胞(例、副腎髄質細胞)、代謝・貯蔵用の細胞(例、肝細胞)、境界面を構成する内腔上皮細胞(例、I型肺胞細胞)、内鎖管の内腔上皮細胞(例、血管内皮細胞)、運搬能をもつ繊毛のある細胞(例、気道上皮細胞)、細胞外マトリックス分泌用細胞(例、線維芽細胞)、収縮性細胞(例、平滑筋細胞)、血液と免疫系の細胞(例、Tリンパ球)、感覚に関する細胞(例、桿細胞)、自律神経系ニューロン(例、コリン作動性ニューロン)、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞(例、随伴細胞)、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞(例、星状グリア細胞)、色素細胞(例、網膜色素上皮細胞)、およびそれらの前駆細胞(組織前駆細胞)等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞 (体性幹細胞も含む) であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞(体性幹細胞)が挙げられる。特に血液細胞(末梢血単核球細胞(T細胞および非T細胞(CD34陽性細胞および幹・前駆細胞を含む)を含む)、末梢血リンパ球、臍帯血細胞など)は、入手が容易でありかつ侵襲を伴わないため、今後iPS細胞バンクのための体細胞ソースとしての利用が期待される。また歯髄幹細胞も、智歯や歯周病等で抜いた歯から単離、調製することができるため、入手が容易であり、同様にiPS細胞バンクのための体細胞ソースとしての利用が期待される。
体細胞として末梢血単核球細胞を用いる場合、T細胞受容体(TCR)遺伝子座がV(D)J組み換えを生じていても生じていなくてもよい。好ましい末梢血単核球細胞は、T細胞受容体(TCR)遺伝子座がV(D)J組み換えを生じているT細胞であるが、これに限定されない。
哺乳動物から分離した体細胞は、核初期化工程に供するに先立って、細胞の種類に応じてその培養に適した自体公知の培地で前培養することができる。そのような培地としては、例えば、約5〜20%の胎仔ウシ血清(FCS)を含む最小必須培地(MEM)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、RPMI1640培地、199培地、F12培地などが挙げられるが、それらに限定されない。例えば、体細胞として歯髄幹細胞を用いる場合には、Mesenchymal stem cells basal medium (Lonza社) などの間葉系幹細胞用培地を用いることが好ましい。また、血液細胞を用いる場合には、T細胞を濃縮して用いるために、IL-2、抗CD3抗体および抗CD28抗体を培養液に添加して用いてもよい。同様に、非T細胞を濃縮して用いるために、IL-3、IL-6、G-CSFおよびGM-CSFを培養液に添加して用いてもよい。尚、細胞の濃縮は、上記(1)および(2)の本発明のエピソーマルベクター(さらにp53の機能阻害物質をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターを含む場合がある;以下、「本発明のベクターセット」ともいう)を導入前であっても導入後であってもよい。本発明のベクターセット、および、必要に応じてiPS細胞の樹立効率改善物質との接触に際し、例えば、カチオニックリポソームなど導入試薬を用いる場合には、導入効率の低下を防ぐため、無血清培地に交換しておくことが好ましい場合がある。
本発明において「核初期化因子」とは、体細胞からiPS細胞を誘導することができるタンパク性因子(群)を意味する。本発明に用いられる核初期化因子は、それらをコードする核酸を体細胞に導入することによりiPS細胞を誘導しうる限り、いかなるタンパク性因子(群)であってもよく、例えば、Octファミリー、Klfファミリー、Soxファミリー、Mycファミリー、LinファミリーおよびGlisファミリーのメンバーからなる群より選択される1以上のタンパク性因子であり得る。好ましくは、本発明に用いられる核初期化因子は、少なくともOct3/4、Klf4およびSox2を含み(但し、Klf4および/またはSox2はそれらの機能を代替し得ることが報告されている他の因子に置換してもよい)、p53の機能阻害物質を併用しない場合は、核初期化因子としてさらにL-MycおよびLin28もしくはLin28bを組み合わせることが好ましい。また、本発明に用いられる核初期化因子は、Nanogを含まないことを特徴とする。具体的には、核初期化因子として、以下の組み合わせが例示される。
(1) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc(ここで、Sox2はSox1, Sox3, Sox15, Sox17またはSox18で置換可能である。また、Klf4はKlf1, Klf2またはKlf5で置換可能である。)
(2) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, SV40 Large T antigen(以下、SV40LT)
(3) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E6
(4) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E7
(5) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
(6) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, Bmi1
(7) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28
(8) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, Glis1
(9) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, SV40LT
(10) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, TERT, SV40LT
(11) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, SV40LT
(12) Oct3/4, Esrrb, Sox2, L-Myc (EsrrbはEsrrgで置換可能である。)
(13) Oct3/4, Klf4, Sox2
(14) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40LT
(15) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6
(16) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7
(17) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7
(18) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmil
(19) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28
(20) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, SV40LT
(21) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, TERT, SV40LT
(22) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40LT
(23) Oct3/4, Esrrb, Sox2 (EsrrbはEsrrgで置換可能である。)
また、上記(1)-(23)には該当しないが、それらのいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化因子」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記(1)-(23)のいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化因子」の範疇に含まれ得る。
上記の各核初期化因子のマウスおよびヒトcDNA配列情報は、WO 2007/069666に記載のNCBI accession numbersを参照することにより取得することができ(Nanogは当該公報中では「ECAT4」との名称で記載されている。尚、Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg、L-MycおよびGlis1のマウスおよびヒトcDNA配列情報は、それぞれ下記NCBI accession numbersを参照することにより取得できる。)、当業者は容易にこれらのcDNAを単離することができる。
遺伝子名 マウス ヒト
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
L-Myc NM_008506 NM_001033081
Glis1 NM_147221 NM_147193
本発明は、上記の核初期化因子に加えて、p53の機能阻害物質を体細胞と接触させることがより好ましい。本明細書において「p53の機能阻害物質」とは、a)p53タンパク質の機能もしくはb)p53遺伝子の発現を阻害し得る限り、いかなる物質であってもよい。すなわち、p53タンパク質に直接作用してその機能を阻害する物質や、p53遺伝子に直接作用してその発現を阻害する物質のみならず、p53のシグナル伝達に関与する因子に作用することにより、結果的にp53タンパク質の機能やp53遺伝子の発現を阻害する物質も、本明細書における「p53の機能阻害物質」に含まれる。
p53の機能阻害物質の具体例、それらの取得方法および体細胞との接触方法については、WO 2009/157593に詳細に記載されている。
本発明において特に好ましいp53のドミナントネガティブ変異体は、マウスp53の14-301位(ヒトp53では11-304位に対応)のアミノ酸を欠失させたp53DD(Bowman, T., Genes Develop., 10, 826-835 (1996))である。
p53のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸は、例えば、以下の手法により得ることができる。まず、マウスまたはヒトのp53 cDNA配列情報に基づいて適当なオリゴヌクレオチドをプローブもしくはプライマーとして合成し、マウスまたはヒトの細胞・組織由来のmRNA、cDNAもしくはcDNAライブラリーから、ハイブリダイゼーション法や(RT-)PCR法を用いてマウスまたはヒトp53 cDNAをクローニングし、適当なプラスミドにサブクローニングする。p53DDのような欠失変異体の場合には、欠失させる部位の外側にプライマーを設計し、これを用いてp53 cDNAを挿入したプラスミドを鋳型とするインバースPCRを行うことにより、目的のドミナントネガティブ変異体をコードするcDNAを取得する。
単離されたcDNAは、前記核初期化因子をコードする核酸の場合と同様に、後述のエピソーマルベクターに挿入され、体細胞に導入され得る。
具体的には、配列5’-GACTCCAGTGGTAATCTACTGctcgagCAGTAGATTACCACTGGAGTC-3’(配列番号1;下線部がp53のターゲット配列。大文字がdsRNAを形成する部分)を有するヒトp53に対するshRNA等が、本発明における特に好ましいshRNAとして使用され得る。
このようにして構築したshRNA発現カセットは、前記核初期化因子をコードする核酸の場合と同様に、後述のエピソーマルベクターに挿入され、体細胞に導入され得る。
上記の核初期化因子をコードする核酸(およびp53の機能阻害物質をコードする核酸)は、単独でもしくは任意の組み合わせで発現カセットを構成することができ、これらの発現カセットは任意の組み合わせでエピソーマルベクターに搭載され得る。例えば、Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28およびL-Mycを初期化因子として用いる場合、これらの初期化因子をコードする5つの核酸は、以下の3つの発現カセットとしてエピソーマルベクターに搭載される。
(a) Oct3/4をコードする核酸(O)を含む発現カセット;
(b) Sox2をコードする核酸(S)とKlf4をコードする核酸(K)とが5’から3’方向にこの順序(S-K)でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット;および
(c) L-Mycをコードする核酸(U)とLin28をコードする核酸(L)とが5’から3’方向にこの順序(U-L)でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット
(d) Glis1をコードする核酸(G)を含む発現カセット
との4つの発現カセットとしてエピソーマルベクターに搭載される。
(a) Oct3/4をコードする核酸(O)を含む発現カセット;
(b) Sox2をコードする核酸(S)とKlf4をコードする核酸(K)とが5’から3’方向にこの順序(S-K)でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット;
(c) L-Mycをコードする核酸(U)とLin28をコードする核酸(L)とが5’から3’方向にこの順序(U-L)でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結された発現カセット;および
(d’) p53 shRNAもしくは(d”)p53DDをコードする核酸を含む発現カセット
本発明に用いられるエピソーマルベクターとしては、例えば、EBV、SV40等に由来する、哺乳動物細胞内での自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。哺乳動物細胞内での自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点と、該複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、EBVにあっては複製開始点oriPとEBNA-1遺伝子、SV40にあっては複製開始点oriとSV40 large T antigen遺伝子が挙げられる。より好ましくはoriPとEBNA-1遺伝子が使用される。
本発明では、Extra EBNA-1ベクターの併用により著しくiPS細胞樹立効率が改善されるので、本発明のベクターセットは、上記(a)〜(c)、あるいは(a)〜(d)、(d’)もしくは(d”)の発現カセットがそれぞれ1もしくは2つずつ、2、3もしくは4つのエピソーマルベクター上に、任意の組み合わせで、任意の順序で、任意の位置に搭載され得る。
哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質(例えば、EBNA-1、SV40 large T antigen等、好ましくはEBNA-1)をコードする遺伝子(センス鎖)の3’側を起点として(以下、発現カセットのエピソーマルベクター上での位置を示す場合は、すべてこの起点を用いる。)、5’から3’方向に[発現カセットA]−[発現カセットB]の順序で発現カセットが配置されるとした場合、
1) 上記(a)の発現カセット(Oct3/4をコードする核酸(O)を含む)は発現カセットBの位置に配置される;好ましくは、
2) 上記(b)の発現カセット(Sox2をコードする核酸(S)とKlf4をコードする核酸(K)とが5’から3’方向にこの順序(S-K)でジシストロニックな発現を可能にする介在配列を介して連結されている)は発現カセットAの位置に配置される。
上記の発現カセットの配置において、各発現カセットの転写方向は特に制限されず、2つの発現カセットが同一方向に転写されるように挿入されていてもよいし(head-to-tail)、反対方向に転写されるように挿入されていてもよい(head-to-headまたはtail-to-tail)。また、各発現カセットの転写方向は、哺乳動物細胞で機能的な複製開始点に結合して該ベクターの哺乳動物細胞内での複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子の転写方向と同一方向であってもよいし、反対方向であってもよい。好ましい一実施態様においては、すべての発現カセットが該遺伝子と同一方向に転写されるようにベクター上に搭載される。
別の好ましい実施態様においては、本発明のベクターセットは、上記(a)〜(c)の発現カセットがそれぞれ1つずつ、3つのエピソーマルベクター上に搭載されたものである。より具体的には、このような3つのエピソーマルベクターとして、pCXLE-hOCT3/4(Addgene#27076)、pCXLE-hSK(Addgene#27078)およびpCXLE-hUL(Addgene#27080)(Nat. Methods, 8(5): 409-412 (2011)参照)や、後述の実施例および図2に示されるpCE-hOCT3/4、pCE-hSKおよびpCE-hULが例示される。
あるいは、p53の機能阻害物質の発現カセットは、上記(a)〜(c)の発現カセットがそれぞれ搭載された3つのエピソーマルベクターのいずれかに一緒に搭載されていてもよい。好ましくは、上記(a)の発現カセットとともにエピソーマルベクターに搭載され得るが、それに限定されない。初期化因子をコードする核酸とともにエピソーマルベクターに搭載される場合、その順序は特に制限されないが、例えば、p53の機能阻害物質の発現カセット−初期化因子の発現カセットの順に配置することができる。具体例としては、pCXLE-hOCT3/4-shp53-F(Addgene#27077)(「pCXLE-hOCT3/4-shp53」ともいう。Nat. Methods, 8(5): 409-412 (2011)参照)や、後述の実施例および図2に示されるpCE-hOCT3/4-shp53-F(「pCE-hOCT3/4-shp53」ともいう)が挙げられる。
(i) エピソーマルベクターの哺乳動物細胞内での複製に必要なベクター要素(例えば、EBNA-1遺伝子やSV40 Large T antigen遺伝子、好ましくはEBNA-1遺伝子)の5’側および3’側にloxP配列が同方向に配置されている。
(ii) 初期化因子をコードする核酸がCAGプロモーターの制御下にある。
(iii) 初期化因子またはp53のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸がCMV前初期エンハンサーの制御下にある。
(iv) 初期化因子またはp53のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸がウサギβ-グロビンpolyA付加シグナルの制御下にある。
(v) 初期化因子またはp53のドミナントネガティブ変異体をコードする核酸とpolyA付加シグナルとの間にWPRE配列を含む。
(vi) p53 shRNAをコードする核酸がU6プロモーターの制御下にある。
(vii) 細菌で機能的な複製起点(例えば、pUC ori、ColE1 ori、好ましくはpUC ori)、および細菌での選択を可能にするマーカー遺伝子(例えば、アンピシリン耐性遺伝子)を含む。
(viii) エピソーマルベクターの哺乳動物細胞内での複製に必要なベクター要素(例えば、EBNA-1遺伝子やSV40 Large T antigen遺伝子、好ましくはEBNA-1遺伝子)と、ベクター上に搭載される各初期化因子またはp53機能阻害物質をコードする核酸とが、同一方向に転写される。
EBNA-1 (Epstein-Barr virus nuclear antigen 1)タンパク質は、EBV(Epstein-Barr virus)が細胞内に潜伏感染するに際して、そのエピソームの複製、維持、さらにはウイルス遺伝子群の転写発現に極めて重要な役割を果たすタンパク質であり、そのような機能は、当該タンパク質がEBVゲノムDNAのOriP領域に結合することにより達成されることが知られている(Frappier, L., and O’Donnell, M. (1991) J. Biol. Chem. 266, 7819-7826)。本発明におけるExtra EBNA-1ベクタープラスミドは、そのようなEBNA-1の機能を利用してOriP領域を有するエピソーマルベクターの自律複製を可能にするものである。本発明におけるExtra EBNA-1ベクタープラスミドは、EBNA-1タンパク質をコードする遺伝子を搭載しており、哺乳動物細胞内においてEBNA-1タンパク質を一過的もしくは構成的に発現し得る。
・pCX-EGFPのpA配列の5’側にWPRE配列を挿入し、さらに制限酵素BamHI処理によりSV40oriを取り除く。
・次いで、このベクターのEGFP部分をEcoRIで取り除き、代わりにEBNA-1コード領域を挿入する。
そのようにして得られたExtra EBNA-1ベクタープラスミドは、本明細書において別名「pCXWB-EBNA-1」と呼ばれる。
・pCX-EGFPを制限酵素BamHIにより処理し、self ligationさせる(pCXB-EGFP)。
・次いで、このベクターを制限酵素EcoRIで処理し、pCXWB-EBNA1のEcoRIフラグメント(EBNA-1コード領域)を挿入する。
そのようにして得られたExtra EBNA-1ベクタープラスミドは、本明細書において別名「pCXB-EBNA1」と呼ばれる。
以下、本明細書において、エピソーマルベクターを用いて樹立されたiPS細胞を「epi-iPS cells」または「epi-iPSCs」と略することがある。また、本発明における導入遺伝子の組み合わせを「C1, T1, T2, Y3, Y3+EBNA1, Y4, Y4+EBNA1, Y5+EBNA1, Y6+EBNA1」と略する場合、これらの組合せは以下の表1に示すとおりである。
上記のエピソーマルベクターの組合せからなるベクターセットは、例えばリポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて体細胞に導入することができる。具体的には、例えばScience, 324: 797-801 (2009)、WO 2011/016588 A1またはNature Methods, 8(5), 409-412 (2011)等に記載される方法を用いることができる。
iPS細胞からエピソーマルベクターの哺乳動物細胞内での複製に必要なベクター要素が除去されたか否かの確認は、該ベクター要素内部および/または(loxP配列を用いた場合には)loxP配列近傍の塩基配列を含む核酸をプローブまたはプライマーとして用い、該iPS細胞から単離したエピソーム画分を鋳型としてサザンブロット分析またはPCR分析を行い、バンドの有無または検出バンドの長さを調べることにより実施することができる(WO 2011/016588 A1、Nature Methods, 8(5), 409-412 (2011)参照)。エピソーム画分の調製は当該分野で周知の方法と用いて行えばよく、例えば、Science, 324: 797-801 (2009)、WO 2011/016588 A1またはNature Methods, 8(5), 409-412 (2011)等に記載される方法を用いることができる。
公知のiPS細胞樹立効率改善物質を体細胞に接触させることにより、iPS細胞の樹立効率をさらに高めることが期待できる。そのようなiPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤[例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA(例、HDAC1 siRNA Smartpool(登録商標) (Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等)等の核酸性発現阻害剤など]、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤[例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA(例、G9a siRNA(human) (Santa Cruz Biotechnology)等)等の核酸性発現阻害剤など]、L-calcium channel agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、細胞内シグナル伝達の修飾剤[例えば、Wnt Signaling活性化剤(例えばsoluble Wnt3a)(Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008))、TGF-βの阻害剤、MEK阻害剤、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))]、他の天然もしくは合成低分子化合物(例、5’-azacytidine、thiazovivin、ビタミンC等)、ES細胞特異的miRNA(例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08、WO2009/075119)、miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10)、miR-291-3p, miR-294およびmiR-295 (以上、Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009)))等が挙げられるが、それらに限定されない。前記において核酸性の発現阻害剤はsiRNAもしくはshRNAをコードするDNAを含む発現ベクターの形態であってもよい。
iPS細胞の樹立効率改善物質は、該物質の非存在下と比較して体細胞からのiPS細胞樹立効率が有意に改善される限り、本発明のベクターセットと同時に体細胞に接触させてもよいし、また、どちらかを先に接触させてもよい。
体細胞の核初期化工程において低酸素条件下で細胞を培養することにより、iPS細胞の樹立効率をさらに改善することができる。本明細書において「低酸素条件」とは、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度が、大気中のそれよりも有意に低いことを意味する。具体的には、通常の細胞培養で一般的に使用される5-10% CO2/95-90%大気の雰囲気中の酸素濃度よりも低い酸素濃度の条件が挙げられ、例えば雰囲気中の酸素濃度が18%以下の条件が該当する。好ましくは、雰囲気中の酸素濃度は15%以下(例、14%以下、13%以下、12%以下、11%以下など)、10%以下(例、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下など)、または5%以下(例、4%以下、3%以下、2%以下など)である。また、雰囲気中の酸素濃度は、好ましくは0.1%以上(例、0.2%以上、0.3%以上、0.4%以上など)、0.5%以上(例、0.6%以上、0.7%以上、0.8%以上、0.95以上など)、または1%以上(例、1.1%以上、1.2%以上、1.3%以上、1.4%以上など)である。
低酸素条件下で細胞培養を開始する時期は、iPS細胞の樹立効率が正常酸素濃度(20%)の場合に比して改善されることを妨げない限り特に限定されず、体細胞への本発明ベクターセットの接触より前であっても、該接触と同時であっても、該接触より後であってもよいが、例えば、体細胞に該ベクターセットを接触させた直後から、あるいは接触後一定期間(例えば、1ないし10(例、2,3,4,5,6,7,8または9)日)おいた後に低酸素条件下で培養することが好ましい。
本発明のベクターセット(さらに必要に応じてiPS細胞の樹立効率改善物質)を接触させた後、細胞を、例えばES細胞の培養に適した条件下で培養することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor(LIF)を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、LIFの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)および/または幹細胞因子(SCF)を添加することが望ましい。また、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞の共存下で培養されてもよく、これらのフィーダー細胞の代わりに細胞外マトリックスをコートした培養皿を用いて培養されてもよい。マウス胎仔由来の線維芽細胞としては、通常STO細胞株(ATCC CRL-1503)等がフィーダーとしてよく使われるが、iPS細胞の誘導には、STO細胞にネオマイシン耐性遺伝子とLIF遺伝子を安定に組み込んだSNL細胞(SNL76/7 STO細胞; ECACC 07032801)(McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990))等がよく使われている。また、マウス胎仔由来の初代線維芽細胞(MEF)も用いることができる。マイトマイシンC処理済のMEFは、ミリポア社やリプロセル社から市販されている。これらのフィーダー細胞との共培養は、本発明のベクターセットの接触より前から開始してもよいし、該接触時から、あるいは該接触より後(例えば1-10日後)から開始してもよい。
iPS細胞の候補コロニーの選択は、薬剤耐性とレポーター活性を指標とする方法と目視による形態観察による方法とが挙げられる。前者としては、例えば、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子(例えば、Fbx15、Nanog、Oct3/4など、好ましくはNanogまたはOct3/4)の遺伝子座に、薬剤耐性遺伝子および/またはレポーター遺伝子をターゲッティングした組換え体細胞を用い、薬剤耐性および/またはレポーター活性陽性のコロニーを選択するというものである。そのような組換え体細胞としては、例えばFbx15遺伝子座にβgeo(β-ガラクトシダーゼとネオマイシンホスホトランスフェラーゼとの融合タンパク質をコードする)遺伝子をノックインしたマウス由来のMEF(Takahashi & Yamanaka, Cell, 126, 663-676 (2006))、あるいはNanog遺伝子座に緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子とピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んだトランスジェニックマウス由来のMEF(Okita et al., Nature, 448, 313-317 (2007))等が挙げられる。一方、目視による形態観察で候補コロニーを選択する方法としては、例えばTakahashi et al., Cell, 131, 861-872 (2007)に記載の方法が挙げられる。レポーター細胞を用いる方法は簡便で効率的ではあるが、iPS細胞がヒトの治療用途を目的として作製される場合、安全性の観点から目視によるコロニー選択が望ましい。
このようにして樹立されたiPS細胞は、種々の目的で使用することができる。例えば、ES細胞で報告されている分化誘導法を利用して、iPS細胞から種々の細胞(例、心筋細胞、血液細胞、神経細胞、血管内皮細胞、インスリン分泌細胞等)への分化を誘導することができる。したがって、患者本人やHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から採取した体細胞を用いてiPS細胞を誘導すれば、そこから所望の細胞(即ち、該患者が罹病している臓器の細胞や疾患に対する治療効果を発揮する細胞など)に分化させて該患者に移植するという、自家もしくは同種異系移植による幹細胞療法が可能となる。さらに、iPS細胞から分化させた機能細胞(例、肝細胞)は、対応する既存の細胞株よりも実際の生体内での該機能細胞の状態をより反映していると考えられるので、医薬候補化合物の薬効や毒性のin vitroスクリーニング等にも好適に用いることができる。
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されないものとする。
pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL、およびpCXLE-hOCT3/4-shp53-Fの4種のプラスミドは以前に作製したものを用いた(Okita et al., Nature Methods, 8(5), 409-412(2011)、国際公報WO2011/016588)。各プラスミドの構成の概要は、下記のとおりである。
1) pCXLE-hOCT3/4(Addgene#27076):
ヒトOct3/4の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にWPRE配列とウサギβ-グロビンpolyA付加シグナルを含む。以下同じ)を、EBNA-1遺伝子(センス鎖)の3’側を起点にして(以下同じ)、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド。
2) pCXLE-hSK(Addgene#27078):
ヒトSox2およびヒトKlf4の各翻訳領域を口蹄疫ウイルス(FMV)2A配列 (PLoS ONE 3, e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007)をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、EBNA-1遺伝子(センス鎖)の3’側を起点にして、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド。
3) pCXLE-hUL(Addgene#27080):
ヒトL-MycおよびヒトLin28の各翻訳領域を口蹄疫ウイルス(FMV)2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、EBNA-1遺伝子(センス鎖)の3’側を起点にして、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド。
4) pCXLE-hOCT3/4-shp53-F(Addgene#27077):
p53shRNAをコードする核酸領域とヒトOct3/4の翻訳領域とを、それぞれU6プロモーターとCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセットを、5’から3’方向にこの順序で配置したプラスミド。
1) pCEB-hSK-O:
pCX-EGFP(大阪大学、岡部勝博士より供与された, FEBS Letters, 407, 313-319, 1997)のpA配列の5’側にWPRE配列を挿入し、さらに制限酵素BamHI処理によりSV40oriを取り除いた。このベクターをpCXWBとした。このベクターのEGFP部分をEcoRIで取り除き、換わりにpCXLE-hOCT3/4より同様にEcoRIで切り出したヒト遺伝子の翻訳領域を挿入した。これをpCXWB-hOCT3/4と名付けた。このベクターをSalIで処理して、そこに同様にSalI処理したpCXLE-hSKを挿入することによりpCEB-hSK-Oを作製した(図1A)。
2) pCXLE-hGLIS1:
pMXs-hGLIS1からhGLIS1部分をPCRで増幅して、pCR2.1に挿入した。次いで、制限酵素EcoRIで処理してhGLIS1フラグメントを切り出し、それを制限酵素EcoRIで処理しておいたpCXLE-EGFPに挿入した。
3) pCEB-hUL-G:
pCXWBのEGFP部分をEcoRIで取り除き、換わりにpCXLE-hGLIS1より同様にEcoRIで切り出したヒト遺伝子の翻訳領域を挿入した。これをpCXWB-hGLIS1と名付けた。このベクターをSalIで処理して、そこに同様にSalI処理したpCXLE-hULを挿入することによりpCEB-hUL-Gを作製した(図1B)。
4) pCE-EGFP:
pBluescriptII KS-を制限酵素BamHI/XhoIで処理して、そこにリンカーを挿入し、pBS-XhoBamを作製した。次いで、pBS-XhoBamを制限酵素SalI/MfeIで処理して、そこにpCEP4のSalI/EcoRIフラグメントを挿入し、pBS-CEPcassetteを作製した。次いで、pCX-EGFPを制限酵素BamHIで処理して、そこにpBS-CEPcassetteのBamHI/BglIIフラグメントを挿入することにより、pCE-EGFPを作製した。
5) pCE-hOCT3/4(図2A):
上記pCE-EGFPを制限酵素EcoRIで処理して、そこにpCXLE-hOCT3/4のEcoRIフラグメントを挿入した。
6) pCE-hOCT3/4-shp53-F(図2B):
上記pCE-hOCT3/4を制限酵素BamHIで処理して、そこにpCXLE-hOCT3/4-shp53-FのBamHIフラグメントを挿入した。
7) pCE-hSK(図2C):
上記pCE-EGFPを制限酵素EcoRIで処理して、そこにpCXLE-hSKのEcoRIフラグメントを挿入した。
8) pCE-hUL(図2D):
上記pCE-EGFPを制限酵素EcoRIで処理して、そこにpCXLE-hULのEcoRIフラグメントを挿入した。
9) pCE-mp53DD(図2E):
pENTR-p53DDからmp53DD部分をPCRで増幅して、pCR2.1に挿入し、pTopo-mp53DDを作製した。次いで、pCXLE-EGFPを制限酵素EcoRIで処理して、そこにpTopo-mp53DDのEcoRIフラグメントを挿入し、pCXLE-mp53DDを作製した。次いで、上記pCE-EGFPを制限酵素EcoRIで処理して、そこにpCXLE-mp53DDのEcoRIフラグメントを挿入することにより、pCE-mp53DDを作製した。
効率的にトランスジーンを発現させるために、pCX-EGFP(大阪大学、岡部勝博士より供与された, FEBS Letters, 407, 313-319, 1997)のpA配列の5’側にWPRE配列を挿入し、さらに制限酵素BamHI処理によりSV40oriを取り除いた。このベクターをpCXWBとした。次いで、pCXWBのEGFP部分をEcoRIで取り除き、代わりにpCEP4(Invitrogen)からPCR増幅させたEBNA-1コード領域を挿入した。このベクターを「pCXWB-EBNA1」と名付けて、以下の実験において使用した(図3A)。
また、別のExtra EBNA-1ベクタープラスミドであるpCXB-EBNA1を下記のとおり作製した。最初に、pCX-EGFPを制限酵素BamHIにより処理し、self ligationさせた。このベクターをpCXB-EGFPとした。次いで、pCXB-EGFPを制限酵素EcoRIで処理し、pCXWB-EBNA1のEcoRIフラグメント(EBNA-1コード領域)を挿入することにより、pCXB-EBNA1を得た(図3B)。
プラスミドの組み合わせ(pCEB-hSK-OおよびpCEB-hUL-G)、ならびにそれとpCXWB-EBNA1の組み合わせを用いて、ヒト線維芽細胞(HDF1419)からiPS細胞の樹立を行った。
ヒト線維芽細胞(HDF1419)を、Cell Applications, Incから購入した。この線維芽細胞を、10% ウシ胎児血清(FCS, Invitrogen)を補充したDMEM (Nacalai Tesque, Japan)を培養液として使用し、100 mm 培養ディッシュで37℃、5% CO2の条件で培養し、維持した。プラスミド導入時には、培地を除き、PBS 5 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、6x105細胞を15 mL遠心チューブに回収した。800 rpmで5分間遠心して上清を除いた。各プラスミド1.5 μg(pCXLE-hSK-OおよびpCEB-hUL-G)を、Microporator(エアブラウン)を用いて細胞に導入した。導入時の条件は100 μLチップを用い、1650 V, 10 ms, 3回のパルスで行った。導入後の細胞はあらかじめDMEM/10% FCSを3 mL入れておいた6 well培養プレート (Falcon) へ移し、37℃、5% CO2の条件で6日間培養した。その後培地を除き、PBS 2 mLを加えて細胞を洗浄した。PBSを除いた後、0.25% Trypsin/1 mM EDTA (Invitrogen) を加えて、37℃で5分間程度反応させた。細胞が浮き上がったらDMEM/10% FCSを加えて懸濁し、1x105の細胞を、あらかじめフィーダー細胞を蒔いておいた100 mm dishに蒔いた。フィーダー細胞としては、マイトマイシンC処理をしたMEF、またはマイトマイシンC処理をしたSNL76/7を使用した。翌日に霊長類ES細胞用培地(リプロセル)に4 ng/mLとなる様にbFGF (Wako) を加えた培地に交換し、以後2日おきに培地交換を続けた。プラスミド導入から24日目にES様コロニーおよび非ES様コロニーの数を数えた結果を図4に示す。
pCEB-hSK-OおよびpCEB-hUL-GをpCXWB-EBNA1と組み合わせて用いることで、iPS細胞樹立効率が上昇することが明らかとなった。
実施例3と同様の方法により、プラスミドの組み合わせY4(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hUL)、ならびにそれとpCXWB-EBNA1の組み合わせを用いて、ヒト線維芽細胞(HDF1388)からiPS細胞の樹立を行った。
その結果、Y4をpCXWB-EBNA1と組み合わせて用いることで、iPS細胞樹立効率が上昇することが明らかとなった(図5)。
プラスミドの組み合わせT2(pEP4EO2SET2KおよびpEP4EO2SCK2MEN2L)、Y3(pCXLE-hOCT3/4、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hUL)およびY4(pCXLE-hOCT3/4-shp53-F、pCXLE-hSKおよびpCXLE-hUL)、ならびにそれらとpCXWB-EBNA1の組み合わせを用いて、ヒト末梢血単核球細胞(PMNC)からiPS細胞の樹立を行った。
血液は、治験審査委員会(Institutional Review Board)の指針に基づき、インフォームドコンセントを得た健常なドナーより採取したものを使用した。この血液より、Ficoll-paque Plus (GE Healthcare)またはBD Vacutainer CPT (BD)を用いて、密度勾配遠心法にてPMNCを回収した。NucleofectorII(Lonza)を用いて、3 μgの発現プラスミド混合物を3-5 × 106 PMNCに導入した。導入にはAmaxa(R) Human T Cell Nucleofector(R) Kitを用いた。導入後の細胞を、あらかじめMEFフィーダー細胞(マイトマイシンC処理済)を播種しておいた6 well培養プレート (Falcon) へ移し、37℃、5% CO2の条件下で培養した。培地には、30 U/ml IL-2 (PeproTech)および 5 μl/well Dynabeads Human T-activator CD3/CD28を添加したX-vivo10培地(Lonza)(T細胞からの誘導用)または10% FCS, 10 ng/ml IL-3, 10 ng/ml IL-6, 10 ng/ml G-CSFおよび10 ng/ml GM-CSFを添加したαMEM培地またはStemSpan H3000 (StemCell Technologies)(非T細胞からの誘導用)を用いた。プラスミド導入2日目に、培地を交換することなく、4 ng/mL bFGFおよび10 μM Y27632を添加した等量の霊長類ES細胞用培地(リプロセル)を各ウェルに加えた。次いで、プラスミド導入4日目に、培養培地を、4 ng/mL bFGFおよび10 μM Y27632を添加した霊長類ES細胞用培地(リプロセル)に交換した。プラスミド導入20〜25日目にES様コロニー(iPS細胞コロニー)数を計測した。
Claims (25)
- 以下の(1)および(2):
(1)Oct3/4、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Mycファミリーメンバー、LinファミリーメンバーおよびGlisファミリーメンバーからなる群から選択される1以上の核初期化因子をコードする核酸を搭載し、かつoriPおよびEBNA-1をコードする核酸を有する、1以上のエピソーマルベクター;および
(2)EBNA-1をコードする核酸を搭載し、かつ核初期化因子をコードする核酸およびp53 shRNAをコードするDNAを搭載しない、非エピソーマルプラスミドベクター
を体細胞に導入する工程を含む、iPS細胞の製造方法であって、(1)のエピソーマルベクターは、以下の(a)または(b):
(a)Oct3/4をコードする核酸;Klf4をコードする核酸;およびSox2をコードする核酸
(b)Oct3/4をコードする核酸;Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5から選択されるKlfファミリーメンバーをコードする核酸;Sox1、Sox2、Sox3、Sox15およびSox17から選択されるSoxファミリーメンバーをコードする核酸;並びにc-Myc、L-MycおよびN-Mycから選択されるMycファミリーメンバーをコードする核酸
を少なくとも含む、方法。 - さらに、p53の機能阻害物質をコードする核酸をエピソーマルベクターの形態で導入する、請求項1に記載の方法。
- 前記p53の機能阻害物質が、p53 shRNAまたはp53のドミナントネガティブ変異体である、請求項2に記載の方法。
- 前記p53のドミナントネガティブ変異体がp53DDである、請求項3に記載の方法。
- 前記核初期化因子が、Octファミリー、Klfファミリー、Soxファミリー、Mycファミリー、LinファミリーおよびGlisファミリーのメンバーからなる群から選択される1以上である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核初期化因子が、Oct3/4、Klf4、Sox2、L-MycおよびLin28である、請求項5に記載の方法。
- 前記核初期化因子が、Oct3/4、Klf4、Sox2、L-Myc、Lin28およびGlis1である、請求項6に記載の方法。
- 前記核初期化因子をコードする核酸が、2つまたは3つのエピソーマルベクターに分かれて搭載されている、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、
(i)ヒトSox2およびヒトKlf4の各翻訳領域を口蹄疫ウイルス(FMV)2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にWPRE配列とウサギβ-グロビンpolyA付加シグナル(pA)を含む)、pUC ori、アンピシリン耐性遺伝子、ヒトOct3/4の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にWPRE配列とpAを含む)、EBNA-1遺伝子、及びoriPを含むベクター;並びに
(ii)ヒトL-MycおよびヒトLin28の各翻訳領域をFMV 2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にWPRE配列とpAを含む)、pUC ori、アンピシリン耐性遺伝子、ヒトGlis1の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にWPRE配列とpAを含む)、EBNA-1遺伝子、及びoriPを含むベクター
である、請求項1に記載の方法。 - 前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、
(i)ヒトOct3/4の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、ヒトp53に対するshRNAのコード領域をマウスU6プロモーターの制御下に配置した発現カセット、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター;
(ii)ヒトSox2およびヒトKlf4の各翻訳領域をFMV 2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター;並びに
(iii)ヒトL-MycおよびヒトLin28の各翻訳領域をFMV 2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター
である、請求項2に記載の方法。 - 前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、
(i)ヒトOct3/4の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター;
(ii)ヒトSox2およびヒトKlf4の各翻訳領域をFMV 2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター;並びに
(iii)ヒトL-MycおよびヒトLin28の各翻訳領域をFMV 2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター
であり、前記p53の機能阻害物質をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが
(iv)マウスp53 DDの翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター
である、請求項2に記載の方法。 - 前記EBNA-1をコードする核酸を搭載し、かつ核初期化因子をコードする核酸およびp53 shRNAをコードするDNAを搭載しない、非エピソーマルプラスミドベクターが、
EBNA-1の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にWPRE配列とpAを含む)、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター
である、請求項9または10に記載の方法。 - 前記EBNA-1をコードする核酸を搭載し、かつ核初期化因子をコードする核酸およびp53 shRNAをコードするDNAを搭載しない、非エピソーマルプラスミドベクターが、
EBNA-1の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター
である、請求項11または12に記載の方法。 - 前記体細胞が、ヒト線維芽細胞(HDF)または血液細胞から選択される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記血液細胞が、末梢血単核球細胞(PMNC)である、請求項14に記載の方法。
- 前記末梢血単核球細胞(PMNC)が、T細胞である、請求項15に記載の方法。
- iPS細胞を製造するためのキットであって、以下の(1)および(2):
(1)Oct3/4、Klfファミリーメンバー、Soxファミリーメンバー、Mycファミリーメンバー、LinファミリーメンバーおよびGlisファミリーメンバーからなる群から選択される1以上の核初期化因子をコードする核酸を搭載し、かつoriPおよびEBNA-1をコードする核酸を有する、1以上のエピソーマルベクター;および
(2)EBNA-1をコードする核酸を搭載し、かつ核初期化因子をコードする核酸およびp53 shRNAをコードするDNAを搭載しない、非エピソーマルプラスミドベクターを含み、(1)のエピソーマルベクターは、以下の(a)または(b):
(a)Oct3/4をコードする核酸;Klf4をコードする核酸;およびSox2をコードする核酸
(b)Oct3/4をコードする核酸;Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5から選択されるKlfファミリーメンバーをコードする核酸;Sox1、Sox2、Sox3、Sox15およびSox17から選択されるSoxファミリーメンバーをコードする核酸;並びにc-Myc、L-MycおよびN-Mycから選択されるMycファミリーメンバーをコードする核酸
を少なくとも含む、キット。 - p53の機能阻害物質をコードする核酸を、エピソーマルベクターの形態で含む、請求項17に記載のキット。
- 前記p53の機能阻害物質が、p53 shRNAまたはp53のドミナントネガティブ変異体である、請求項18に記載のキット。
- 前記p53のドミナントネガティブ変異体がp53DDである、請求項19に記載のキット。
- 前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、
(i)ヒトSox2およびヒトKlf4の各翻訳領域をFMV 2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にWPRE配列とpAを含む)、pUC ori、アンピシリン耐性遺伝子、ヒトOct3/4の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にWPRE配列とpAを含む)、EBNA-1遺伝子、及びoriPを含むベクター;並びに
(ii)ヒトL-MycおよびヒトLin28の各翻訳領域をFMV 2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にWPRE配列とpAを含む)、pUC ori、アンピシリン耐性遺伝子、ヒトGlis1の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にWPRE配列とpAを含む)、EBNA-1遺伝子、及びoriPを含むベクター
である、請求項17に記載のキット。 - 前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、
(i)ヒトOct3/4の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、ヒトp53に対するshRNAのコード領域をマウスU6プロモーターの制御下に配置した発現カセット、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター;
(ii)ヒトSox2およびヒトKlf4の各翻訳領域をFMV 2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター;並びに
(iii)ヒトL-MycおよびヒトLin28の各翻訳領域をFMV 2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター
である、請求項18に記載のキット。 - 前記核初期化因子をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが、
(i)ヒトOct3/4の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター;
(ii)ヒトSox2およびヒトKlf4の各翻訳領域をFMV 2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター;並びに
(iii)ヒトL-MycおよびヒトLin28の各翻訳領域をFMV 2A配列をはさんで繋げたコンストラクトを、CAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター
であり、前記p53の機能阻害物質をコードする核酸を搭載したエピソーマルベクターが
(iv)マウスp53 DDの翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、EBNA-1遺伝子、oriP、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター
である、請求項18に記載のキット。 - 前記EBNA-1をコードする核酸を搭載し、かつ核初期化因子をコードする核酸およびp53 shRNAをコードするDNAを搭載しない、非エピソーマルプラスミドベクターが、
EBNA-1の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にWPRE配列とpAを含む)、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター
である、請求項21に記載のキット。 - 前記EBNA-1をコードする核酸を搭載し、かつ核初期化因子をコードする核酸およびp53 shRNAをコードするDNAを搭載しない、非エピソーマルプラスミドベクターが、
EBNA-1の翻訳領域をCAGプロモーターの制御下に配置した発現カセット(翻訳領域の下流にpAを含む)、pUC ori、及びアンピシリン耐性遺伝子を含むベクター
である、請求項22または23に記載のキット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261650694P | 2012-05-23 | 2012-05-23 | |
US61/650,694 | 2012-05-23 | ||
PCT/JP2013/064409 WO2013176233A1 (ja) | 2012-05-23 | 2013-05-23 | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2013176233A1 JPWO2013176233A1 (ja) | 2016-01-14 |
JP6381442B2 true JP6381442B2 (ja) | 2018-08-29 |
Family
ID=49623914
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014516857A Active JP6381442B2 (ja) | 2012-05-23 | 2013-05-23 | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10519425B2 (ja) |
EP (1) | EP2853592B1 (ja) |
JP (1) | JP6381442B2 (ja) |
KR (1) | KR102066761B1 (ja) |
CN (1) | CN104471060B (ja) |
AU (1) | AU2013264708B2 (ja) |
CA (1) | CA2874259C (ja) |
ES (1) | ES2725827T3 (ja) |
HK (1) | HK1208492A1 (ja) |
SG (1) | SG11201407917PA (ja) |
WO (1) | WO2013176233A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020213725A1 (ja) | 2019-04-17 | 2020-10-22 | 学校法人慶應義塾 | 誘導多能性幹細胞の製造方法及びキット |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101774206B1 (ko) | 2009-08-07 | 2017-09-04 | 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 | 유도된 다능성 줄기 세포의 효율적인 확립 방법 |
CN104471060B (zh) | 2012-05-23 | 2021-11-05 | 国立大学法人京都大学 | 用于建立诱导性多能干细胞的高效方法 |
WO2015006725A2 (en) | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Cedars-Sinai Medical Center | Generation of induced pluripotent stem cells from normal human mammary epithelial cells |
CN103923920B (zh) * | 2014-04-04 | 2016-09-21 | 清华大学 | 一种增强人类细胞中非整合性基因表达的方法 |
EP3169770A1 (en) * | 2014-07-16 | 2017-05-24 | Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud | Methods for generating induced pluripotent stem cells |
CA3010764A1 (en) * | 2016-01-12 | 2017-07-20 | Lonza Walkersville, Inc. | Methods and vectors to produce vector free induced pluripotent stem cells |
CN109072198B (zh) | 2016-04-22 | 2022-08-26 | 国立大学法人京都大学 | 产多巴胺神经祖细胞的制备方法 |
CN105861447B (zh) * | 2016-06-13 | 2017-12-19 | 广州市搏克生物技术有限公司 | 一种非病毒iPSCs诱导组合物及其试剂盒 |
CN106086071B (zh) * | 2016-06-13 | 2019-08-09 | 广州市搏克生物技术有限公司 | 一种非病毒iPSCs诱导方法及其诱导组合物、试剂盒及其获得的iPSCs |
US10221395B2 (en) * | 2016-06-16 | 2019-03-05 | Cedars-Sinai Medical Center | Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells |
US11572545B2 (en) | 2016-06-16 | 2023-02-07 | Cedars-Sinai Medical Center | Efficient method for reprogramming blood to induced pluripotent stem cells |
CN106244558B (zh) * | 2016-08-31 | 2020-01-21 | 四川新生命干细胞科技股份有限公司 | 一种人单个核细胞重编程为诱导多能干细胞的方法 |
JP2018082639A (ja) * | 2016-11-21 | 2018-05-31 | 学校法人千葉工業大学 | 体細胞から人工多能性幹細胞を製造する方法及び人工多能性幹細胞を未分化のまま培養するための培地 |
EP3681993A1 (en) * | 2017-09-13 | 2020-07-22 | BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH | Rna replicon for reprogramming somatic cells |
WO2020009714A1 (en) * | 2018-07-02 | 2020-01-09 | Lin Shi Lung | In-Vitro Induction of Adult Stem Cell Expansion and Derivation |
CN109913494A (zh) * | 2019-02-12 | 2019-06-21 | 北京呈诺医学科技有限公司 | 一种新的ips细胞的诱导方法 |
US12060581B2 (en) | 2020-11-24 | 2024-08-13 | Monash University | Methods and cellular structures |
CN114645023B (zh) * | 2022-05-18 | 2022-09-20 | 上海爱萨尔生物科技有限公司 | 将外周血单个核细胞重编程为诱导多能干细胞的系统和方法 |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4937190A (en) | 1987-10-15 | 1990-06-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Translation enhancer |
AU2006210955A1 (en) | 2005-01-31 | 2006-08-10 | Es Cell International Pte Ltd. | Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof |
PT1970446E (pt) | 2005-12-13 | 2011-09-01 | Univ Kyoto | Factor de reprogramação nuclear |
US8278104B2 (en) | 2005-12-13 | 2012-10-02 | Kyoto University | Induced pluripotent stem cells produced with Oct3/4, Klf4 and Sox2 |
EP1981970A4 (en) | 2006-01-11 | 2009-10-21 | Technion Res & Dev Foundation | TISSUE CONSTRUCTION TISSUE TREATMENT DERIVED FROM A HUMAN EMBRYONIC STEM CELL |
EP3399025A1 (en) | 2007-03-23 | 2018-11-07 | Wisconsin Alumini Research Foundation | Somatic cell reprogramming |
WO2008144580A2 (en) | 2007-05-17 | 2008-11-27 | Oregon Health & Science University | Primate stem cells produced by somatic cell nuclear transfer |
KR101564044B1 (ko) | 2007-10-31 | 2015-10-28 | 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 | 핵초기화 방법 |
AU2008286249B2 (en) | 2007-12-10 | 2013-10-10 | Kyoto University | Efficient method for nuclear reprogramming |
JP2011516042A (ja) | 2008-03-17 | 2011-05-26 | へルムホルツ・ツェントルム・ミュンヘン−ドイチェス・フォルシュングスツェントルム・ヒューア・ゲズントハイト・ウント・ウムヴェルト(ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング) | 部位特異的組み換えを用いて無ベクター誘導多能性幹(iPS)細胞を作製するベクターおよびその方法 |
CN101550406B (zh) | 2008-04-03 | 2016-02-10 | 北京大学 | 制备多潜能干细胞的方法,试剂盒及用途 |
KR101648019B1 (ko) | 2008-06-04 | 2016-08-16 | 셀룰러 다이내믹스 인터내셔널, 인코포레이티드 | 비-바이러스 접근법을 사용한 iPS 세포의 생산 방법 |
EP2288692B1 (en) | 2008-06-27 | 2017-08-02 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
EP2307539B1 (en) | 2008-07-30 | 2014-11-19 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
WO2010147612A1 (en) * | 2009-06-18 | 2010-12-23 | Lixte Biotechnology, Inc. | Methods of modulating cell regulation by inhibiting p53 |
JP2010273680A (ja) * | 2009-05-29 | 2010-12-09 | Kyoto Univ | 初期化因子が除去された人工多能性幹細胞の作製方法 |
KR101774206B1 (ko) * | 2009-08-07 | 2017-09-04 | 고쿠리츠 다이가쿠 호진 교토 다이가쿠 | 유도된 다능성 줄기 세포의 효율적인 확립 방법 |
US9719146B2 (en) * | 2009-09-09 | 2017-08-01 | General Electric Company | Composition and method for imaging stem cells |
WO2011032166A2 (en) * | 2009-09-14 | 2011-03-17 | The Johns Hopkins University | Reprogramming blood cells to pluripotent and multipotent stem cells |
CA2789749C (en) * | 2010-02-16 | 2018-09-04 | Kyoto University | Method of efficiently establishing induced pluripotent stem cells |
WO2011119942A1 (en) * | 2010-03-25 | 2011-09-29 | Vistagen Therapeutics, Inc. | Induction of ips cells using transient episomal vectors |
CA2806858C (en) * | 2010-08-04 | 2021-06-15 | Cellular Dynamics International, Inc. | Reprogramming immortalized b cells |
WO2013022022A1 (ja) * | 2011-08-08 | 2013-02-14 | 国立大学法人京都大学 | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 |
CN104471060B (zh) | 2012-05-23 | 2021-11-05 | 国立大学法人京都大学 | 用于建立诱导性多能干细胞的高效方法 |
-
2013
- 2013-05-23 CN CN201380026797.6A patent/CN104471060B/zh active Active
- 2013-05-23 JP JP2014516857A patent/JP6381442B2/ja active Active
- 2013-05-23 AU AU2013264708A patent/AU2013264708B2/en active Active
- 2013-05-23 WO PCT/JP2013/064409 patent/WO2013176233A1/ja active Application Filing
- 2013-05-23 CA CA2874259A patent/CA2874259C/en active Active
- 2013-05-23 ES ES13793513T patent/ES2725827T3/es active Active
- 2013-05-23 US US14/402,310 patent/US10519425B2/en active Active
- 2013-05-23 EP EP13793513.6A patent/EP2853592B1/en active Active
- 2013-05-23 KR KR1020147036011A patent/KR102066761B1/ko active IP Right Grant
- 2013-05-23 SG SG11201407917PA patent/SG11201407917PA/en unknown
-
2015
- 2015-09-15 HK HK15108987.1A patent/HK1208492A1/xx unknown
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020213725A1 (ja) | 2019-04-17 | 2020-10-22 | 学校法人慶應義塾 | 誘導多能性幹細胞の製造方法及びキット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2853592B1 (en) | 2019-02-20 |
SG11201407917PA (en) | 2015-01-29 |
EP2853592A4 (en) | 2016-01-13 |
JPWO2013176233A1 (ja) | 2016-01-14 |
KR102066761B1 (ko) | 2020-01-15 |
WO2013176233A1 (ja) | 2013-11-28 |
KR20150014512A (ko) | 2015-02-06 |
AU2013264708A1 (en) | 2015-01-15 |
US20150175973A1 (en) | 2015-06-25 |
CN104471060B (zh) | 2021-11-05 |
CN104471060A (zh) | 2015-03-25 |
CA2874259C (en) | 2021-02-09 |
ES2725827T3 (es) | 2019-09-27 |
AU2013264708B2 (en) | 2019-03-07 |
CA2874259A1 (en) | 2013-11-28 |
US10519425B2 (en) | 2019-12-31 |
EP2853592A1 (en) | 2015-04-01 |
HK1208492A1 (en) | 2016-03-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6381442B2 (ja) | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 | |
JP5340265B2 (ja) | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 | |
JP5827220B2 (ja) | 人工多能性幹細胞の樹立効率改善方法 | |
JP5376478B2 (ja) | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 | |
JP5888753B2 (ja) | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 | |
JP5794588B2 (ja) | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 | |
JP6460482B2 (ja) | 多能性幹細胞から生殖細胞への分化誘導方法 | |
JP5995237B2 (ja) | 多能性幹細胞からの好酸球の製造方法 | |
JP6676260B2 (ja) | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 | |
WO2013022022A1 (ja) | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 | |
JP5804280B2 (ja) | 多能性幹細胞からの肥満細胞の製造方法 | |
JP6385340B2 (ja) | 巨核球の成熟化促進物質 | |
JP5807879B2 (ja) | 人工多能性幹細胞の選択方法 | |
JP2019162054A (ja) | 効率的な人工多能性幹細胞の樹立方法 | |
JPWO2016167329A1 (ja) | 体細胞への分化誘導に適した幹細胞クローンを製造する方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160419 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170328 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170529 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170727 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20171219 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180403 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180523 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20180703 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20180731 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6381442 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |