WO2020213725A1 - 誘導多能性幹細胞の製造方法及びキット - Google Patents

誘導多能性幹細胞の製造方法及びキット Download PDF

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WO2020213725A1
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marmoset
neural stem
stem cell
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岡野　栄之
誠司 塩澤
祥 吉松
一弥 枝村
青空 井口
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学校法人慶應義塾
学校法人日本大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method and a kit for producing induced pluripotent stem cells.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2019-078907 filed in Japan on April 17, 2019, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • canine iPS cells can be established by continuously expressing a reprogramming factor in canine fetal-derived fibroblasts (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • canine iPS cells can be established from canine fetal-derived fibroblasts (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • porcine iPS cells can be established by continuously expressing a reprogramming factor in porcine fetus-derived fibroblasts (see, for example, Non-Patent Document 3).
  • Nishimura T et al. Feeder-independent canine induced pluripotent stem cells maintained under serum-free conditions. Mol. Reprod. Dev., Vol. 84, 329-339, 2017. Tsukamoto Met al., Generation of Footprint-Free Canine Induced Pluripotent Stem Cells Using Auto-Erasable Sendai Virus Vector. Stem Cells Dev., 27, 1577-1586, 2018. Du X et al., Barriers for Deriving Transgene-Free Pig iPS Cells with Episomal Vectors. Stem Cells, vol.33, 3228-3238, 2015.
  • An object of the present invention is to provide a new technique for establishing iPS cells from mammalian somatic cells.
  • the present invention includes the following aspects.
  • a method for producing induced pluripotent stem cells which comprises a step of obtaining pluripotent stem cells, wherein the reprogramming factors include OCT family, SOX family, KLF family, MYC family, LIN28 family and P53 function inhibitor.
  • the neural stem cell culture medium contains a MAP kinase inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a TGF ⁇ inhibitor.
  • [5] The production method according to any one of [1] to [4], wherein the growth medium contains bFGF.
  • FIG. 4B is a photograph of cells in which the EP-A vector set was introduced into E02M and cultured in a growth medium for 30 days. It is a figure which shows the process for establishing an iPS cell from a marmoset somatic cell.
  • (A) to (d) are photographs of iNSL cells in Experimental Example 2.
  • (A) is a photograph of colonies formed by introducing the EP-A vector set into E01F and then culturing in a neural stem cell culture medium.
  • (B) is a photograph of colonies formed by introducing the EP-B vector set into E01F and then culturing in a neural stem cell culture medium.
  • FIG. 1 is a photograph of colonies formed by introducing the EP-A vector set into E02M and then culturing in a neural stem cell culture medium.
  • D is a photograph of colonies formed by introducing the EP-B vector set into E02M and then culturing in a neural stem cell culture medium. It is a graph which shows the result of having calculated the colony forming ability at the time of using a marmoset embryonic fibroblast in Experimental Example 2.
  • (A) and (b) are diagrams showing the results of alkaline phosphatase staining in Experimental Example 2.
  • FIG. (A) is a diagram showing the results of alkaline phosphatase staining of colonies obtained by introducing the EP-A vector set into E01F and culturing in a neural stem cell culture medium.
  • FIG. (B) is a diagram showing the results of alkaline phosphatase staining of colonies obtained by introducing the EP-B vector set into E01F and culturing in a neural stem cell culture medium. It is a photograph of iNSL cell and iPS cell in Experimental Example 3.
  • (A) is a photograph of colonies formed by introducing an EP-A vector set into marmoset embryonic fibroblasts (E01F) and culturing them in a neural stem cell culture medium.
  • (B) is a photograph of colonies formed by introducing an EP-A vector set into marmoset embryonic fibroblasts (E01F), culturing in a neural stem cell culture medium, and then culturing in a growth medium.
  • (C) is a photograph of colonies formed by introducing an EP-B vector set into marmoset embryonic fibroblasts (E02M) and culturing them in a neural stem cell culture medium.
  • (D) is a photograph of colonies formed by introducing an EP-B vector set into marmoset embryonic fibroblasts (E02M), culturing in a neural stem cell culture medium, and then culturing in a growth medium.
  • FIG. 5 is a photograph of iNSL cells derived from adult marmoset fibroblasts in Experimental Example 5. It is a figure which shows the colony forming ability of the fibroblast-derived iNSL cell of an adult marmoset in Experimental Example 5. It is a figure which shows the result of alkaline phosphatase staining of the iNSL cell derived from the fibroblast of an adult marmoset in Experimental Example 5. It is a photograph of a colony of marmoset iPS cells derived from adult marmoset fibroblasts in Experimental Example 5. It is a figure which shows the result of alkaline phosphatase staining of the iPS cell derived from the fibroblast of an adult marmoset in Experimental Example 5.
  • human genes and proteins, genes and proteins of pluripotent induction-resistant animals are represented by the uppercase alphabet.
  • human genes and genes of other species may be represented by uppercase alphabets without strict distinction.
  • human proteins and other types of proteins may be represented by uppercase alphabets without strict distinction.
  • the notation "SOX2" means both the SOX2 protein and the nucleic acid encoding the SOX2 protein.
  • the notation “reprogramming factor” means both the reprogramming protein and the nucleic acid encoding the reprogramming protein.
  • the notation "SOX family” means both the SOX protein and the nucleic acid encoding the SOX protein.
  • induced pluripotent stem cells may be referred to as iPS cells or iPSCs.
  • induced neural stem cell like cells may be referred to as iNSL cells or iNSLC.
  • the present invention introduces a reprogramming factor into mammalian somatic cells and cultures them in a neural stem cell culture medium to obtain induced neural stem cell-like cells (a), and proliferates induced neural stem cell-like cells.
  • Induction which comprises the step (b) of culturing in a medium to obtain induced pluripotent stem cells, wherein the reprogramming factors include OCT family, SOX family, KLF family, MYC family, LIN28 family and P53 function inhibitor.
  • the mammal may be a pluripotency induction resistant animal.
  • the pluripotent induction-resistant animal establishes iPS cells even when the reprogramming factors of the OCT family, SOX family, KLF family, and MYC family are expressed in combination in the adult somatic cells of the animal. Refers to mammals that cannot.
  • pluripotent induced animals include, but are not limited to, monkeys, pigs, ferrets, sheep, cats, dogs, horses, cows, goats, rabbits, and the like.
  • monkeys include marmosets.
  • examples of somatic cells of pluripotent-induced animal resistant animals used as materials for producing iPS cells include somatic cells derived from a fetus and somatic cells derived from an adult.
  • somatic cells include adipocytes, chondrocytes, osteoblasts, osteoocytes, muscle cells, vascular cells, immune cells, epithelial cells, nerve cells, hepatocytes, pancreatic cells, and progenitor cells thereof.
  • the somatic cells described above may be undifferentiated cells or differentiated cells.
  • Marmosets, dogs, pigs, and ferrets are typical pluripotent induction-tolerant animals.
  • the reprogramming factor is produced by transiently expressing the reprogramming factor intracellularly from adult somatic cells of marmosets, dogs, pigs and ferrets by the production method of the present embodiment. It is possible to establish iPS cells that do not have an expression construct to be expressed in the cells.
  • a non-episomal vector having a nucleic acid encoding EBNA-1 together with a reprogramming factor into mammalian somatic cells.
  • reprogramming factors include OCT family, SOX family, KLF family, MYC family, LIN28 family and P53 function inhibitor.
  • OCT family examples include OCT3 / 4, OCT1, OCT2, OCT6 and the like.
  • OCT3 / 4 is preferable.
  • SOX family examples include SOX2, SOX1, SOX3, SOX15, SOX17 and the like.
  • KLF family examples include KLF1, KLF2, KLF4, KLF5 and the like.
  • MYC family examples include C-MYC, N-MYC, L-MYC and the like.
  • Examples of the LIN28 family include LIN28 and LIN28B.
  • NANOG is a transcription factor with a homeodomain.
  • NANOG is expressed in somatic cells together with OCT4, SOX2, and LIN28, iPS cells can be established (see, for example, Yu Jet al., Science, 318, 1917-1920 (2007)).
  • the P53 function inhibitor may be any substance as long as it suppresses the function of P53 protein or the expression of P53 gene (for example, International Publication No. 2009 / No. 157593).
  • Substances that suppress the function of P53 protein include dominant negative variants of P53, chemical substances that inhibit the function of P53 protein, anti-P53 antagonist antibodies, decoy nucleic acids containing a consensus sequence of P53 response elements, and inhibitors of the P53 pathway. Can be mentioned.
  • Examples of the substance that suppresses the expression of the P53 gene include siRNA and shRNA for P53.
  • P53DD in which the amino acid at position 14-301 of mouse P53 (corresponding to position 11-304 in human P53) is deleted is preferable (for example, Bowman, T., Genes & Development, 10). , 826-835 (1996)).
  • the reprogramming factor may further include one or more selected from the group consisting of KDM family, GLIS family and NANOG.
  • the reprogramming factors preferably include the OCT family, the SOX family, the KLF family, the MYC family, the LIN28 family, the P53 function inhibitor, the KDM family, the GLIS family and NANOG.
  • the KDM family has Lysine Demethylase activity and demethylates K9 of histone H3.
  • KDM1, KDM2, KDM3, KDM4, KDM5, and KDM6 are known. Forced expression of KDM4D or KDM4A demethylates the 9th lysine residue of histone H3 and promotes somatic cell reprogramming (eg, Matoba et al., Cell, 159, 884-895 (2014); Chung See YG et al., Cell Stem Cell, 17, 758-766 (2015)).
  • the KDM family used as an initialization factor is not particularly limited, and examples thereof include KDM1, KDM2, KDM3, KDM4, KDM5, and KDM6.
  • KDM4A and KDM4D are preferable.
  • the GLIS family (GLI Simial family) is a zinc finger-type transcription factor.
  • GLIS1, GLIS2, and GLIS3 are known as the GLIS family. Forced expression of GLIS1 promotes the formation of iPS cells (see, for example, Maekawa et al., Nature, 474, 225-229 (2011)).
  • GLIS1, GLIS2, and GLIS3 play various roles in stem cells (see, for example, Scoville DW et al., Stem Cell Investig, 4:80 (2017)).
  • the GLIS family used as an initialization factor is not particularly limited, and examples thereof include GLIS1, GLIS2, and GLIS3. As the GLIS family, GLIS1 is preferable.
  • the reprogramming factor may include the ESRR family.
  • the ESRR family (Estrogen-related receptor family) is a nuclear receptor.
  • ESRRA, ESRRB, and ESRRRG are known.
  • Forcible expression of ESRRB or ESRRG with OCT4 and SOX2 can reprogram somatic cells (eg, Feng B et al., Nat. Cell. Biol., Vol. 11, 197-203 (2009)). reference).
  • the ESRR family used as an initialization factor is not particularly limited, and examples thereof include ESRRB and ESRRRG.
  • Examples of the combination of the reprogramming factors include, but are not limited to, the combinations exemplified in Table 1 as described in International Publication No. 2015/056804.
  • the reprogramming factor may have mutations as long as it has the activity to reprogram pluripotent induction resistant somatic cells. If the reprogramming factor has a mutation, the reprogramming factor preferably has 80% or more sequence identity to the protein or mRNA identified by the NCBI accession number exemplified in Table 1, 90%. It is more preferable to have the above sequence identity, and further preferably to have 95% or more of the sequence identity.
  • sequence identity of the amino acid sequence is a value indicating the ratio of the target amino acid sequence (target amino acid sequence) to the reference amino acid sequence (reference amino acid sequence).
  • the animal species from which the reprogramming factor is derived may be the same as or different from the animal species from which the somatic cell into which the reprogramming factor is derived.
  • Those skilled in the art can obtain the amino acid sequence or mRNA sequence of the reprogramming factor of the desired animal species from the database.
  • the reprogramming factor may be the mRNA identified by the NCBI accession number exemplified in Table 2, the protein encoded by the mRNA, or the gene that transcribes the mRNA (for example, Japanese Patent No. 5098028, Japanese Patent No. 6381442). See Gazette, International Publication No. 2015/030111, International Publication No. 2015/056804).
  • the accession numbers shown in Table 1 are human cDNA sequences.
  • the reprogramming factor of the present embodiment may be introduced in the form of a protein, or may be introduced in the form of a nucleic acid such as an mRNA encoding the protein or an expression vector.
  • the reprogramming factors preferably include OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28 and mP53DD. Further, as will be described later in the examples, the reprogramming factors preferably include OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, mP53DD, KLF2, KDM4D, GLIS1 and NANOG.
  • inducible neural stem cell-like cells are obtained by introducing a reprogramming factor into mammalian somatic cells and culturing them in a neural stem cell culture medium.
  • the mammal may be a pluripotency induction resistant animal.
  • the reprogramming factor is protein or RNA
  • a conventional method such as microinjection or electroporation can be used as a method for incorporating the reprogramming factor into cells.
  • examples of the method for incorporating the reprogramming factor into cells include a method using a protein transfer reagent, a method using a protein transfer domain (PTD) fusion protein, and a microinjection method. ..
  • Examples of the protein introduction reagent include BioPORTER (Gelantis), Pro-DeliverIN (OZ Bioscience), Ab-DeliverIN (OZ Bioscience), PULSin Kit (Polyplus-transfection SAS), and ProteinSinfection (S).
  • Cationic lipid type introduction reagent such as Genetics; Chariot (Active motif), Xfect Protein (Clontech), JBS Transition Kit (Jena Bioscience), Cellverter (GE Healthcare), etc.
  • Lipid-type introduction reagents such as Targeting Systems
  • known reagents such as HVJ envelope-type introduction reagents such as GenomONETM-Neo (FD) (Cosmo Bio) can be used.
  • TransIT-mRNA Transfection Reagent TaKaRa
  • Lipofectamine MessengerMAX TM Thermo Fisher Scientific
  • Xfect TM RNA Transfection etc.
  • Transfection Reagent for example, TransIT-mRNA Transfection Reagent (TaKaRa), Lipofectamine MessengerMAX TM (Thermo Fisher Scientific), Xfect TM RNA Transfection, etc.
  • TaKaRa TransIT-mRNA Transfection Reagent
  • Lipofectamine MessengerMAX TM Thermo Fisher Scientific
  • Xfect TM RNA Transfection etc.
  • the reprogramming factor may be an expression construct in which a DNA encoding the reprogramming factor and a promoter are linked.
  • the promoter may be one having activity in a target cell, or an expression-inducing promoter capable of inducing activity by a drug or the like.
  • the promoter may be, for example, a cytomegalovirus promoter (CMV promoter), a CMV early enhancer / ticken beta actin (CAG promoter), or the like, which has strong promoter activity in almost all cells, or is tissue-specific. It may be a promoter having promoter activity or the like.
  • CMV promoter cytomegalovirus promoter
  • CAG promoter CMV early enhancer / ticken beta actin
  • expression-induced promoter examples include, but are not limited to, a doxycycline-induced promoter, a Cumate-induced promoter, a heat shock promoter, a light-induced promoter, and the like.
  • a system in which expression is induced during Cre recombinant enzyme action by a protein translation stop codon or a polyadenylation sequence sandwiched between loxP sites may be used.
  • the above-mentioned expression construct may be incorporated into, for example, a transposon vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, a plasmid vector, an episomal vector, or the like.
  • the vector a vector in which the vector is not integrated into the genome or a vector that is temporarily integrated into the genome but can be removed from the genome by an artificial operation is preferable.
  • the above construct when the above construct is incorporated into a transposon vector, it can be easily incorporated into the chromosome of a cell by introducing it into a cell and causing a transposase to act on it.
  • the above-mentioned construct integrated into the chromosome can be excised from the chromosome and removed without leaving a trace.
  • the transposon may be, for example, piggyBac, Sleeping Beauty, Tol II, mariner or the like.
  • loxP sequences may be placed at both ends of the above construct, and after iPS cells are established, Cre recombination enzyme may be allowed to act to remove the sequence sandwiched between the loxP sequences.
  • an episomal vector is preferable.
  • the episomal vector include a vector derived from EBV, SV40, etc., which contains a sequence necessary for autonomous replication in mammalian cells.
  • Examples of the sequence required for autonomous replication in a mammalian cell include a replication origin that functions in the mammalian cell, a gene that encodes a protein that binds to the replication origin and controls replication, and the like.
  • the replication origin oriP and the EBNA-1 gene can be mentioned.
  • the SV40 vector include the replication origin ori and the SV40 large T antigen gene.
  • Examples of the method for introducing a vector into cells include a lipofection method, a DEAE-dextran method, a calcium phosphate method, a microinjection method, an electroporation method, a gene gun method, and a viral vector method.
  • Examples of devices for carrying out the electroporation method include NEPA21 (Neppagene), 4D-Nucleofector (Lonza), Neon (Thermo Fisher Scientific), Gene Pulsar Xcell (Bio-Rad), and ECM839 (BTX Harvard Apparus). Company) etc. can be used.
  • a transfection reagent may be used as a method for introducing the vector into cells.
  • the reagents for transfection include Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Hook), StemFect (STEMGEN), FuGENE6 / HD (Promega), CRISPRMAX (Thermo Fisher Scientific Hook), and jetPRIME Kit (Polyplus Transfection).
  • DreamFect Oz Bioscience
  • GenePorter3000 Oz Bioscience
  • calcium phosphate method reagents and the like can be used.
  • somatic cells of pluripotent induction-resistant animals into which a reprogramming factor has been introduced are cultured in a neural stem cell culture medium.
  • the neural stem cell culture medium preferably contains a MAP kinase inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a TGF ⁇ inhibitor.
  • the neural stem cell culture medium may further contain Leukemia Inhibitory Factor (LIF) as a differentiation inhibitor and basic fibroblast growth factor (bFGF) as a growth factor.
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • GSK3 ⁇ inhibitor examples include CHIR99021, SB-415286, SB-2167, indirubin-3'-Monoxime, Kenpaullone, etc. Among these, CHIR99021 and Kenpaullone are particularly preferable.
  • concentration of the GSK inhibitor added to the medium is, for example, 0.1 to 10 ⁇ M, preferably 1 to 3 ⁇ M.
  • TGF- ⁇ inhibitor examples include A83-01, SB-431542, SB-505124, SB-525334, SD-208, LY-36494, SJN-2511 and the like. Among these, A83-01 is preferable.
  • the concentration of the TGF- ⁇ inhibitor added to the medium is, for example, 0.1 to 10 ⁇ M, preferably 0.5 to 1 ⁇ M.
  • MAP kinase inhibitors include, for example, MAP kinase pathways such as MAPK, ERK, MEK, MEKK, ERK1, ERK2, Raf, MOS, p21ras, GRB2, SOS, JNK, c-jun, SAPK, JNKK, PAK, RAC, p38. It may inhibit the constituent factors of.
  • MAP kinase inhibitor examples include PD0325901, PD184352, VX-745, SB202190, anisomycin, PD98059, SB203580, U0126, AG126, apigenin, HSP25 kinase inhibitor, 5-iodotubercidin, and MAP kinase antisense oligonucleotide.
  • PD0325901 is preferable.
  • the concentration of the MAP kinase inhibitor added to the medium is, for example, 0.01 to 10 ⁇ M, preferably 0.03 to 1 ⁇ M.
  • Step (b) In this step, the induced neural stem cell-like cells obtained in step (a) are cultured in a growth medium to obtain induced pluripotent stem cells.
  • induced pluripotent stem cells can be obtained by culturing the induced neural stem cell-like cells obtained in step (a) in a growth medium.
  • a growth medium a known medium for culturing ES cells can be used, but the medium is not limited to this, and any medium suitable for culturing ES cells may be used.
  • the growth medium may contain bFGF (FGF2).
  • the growth medium may be Dulbecco's modified Eagle's medium containing 20% KSR (Knockout serum replenishment, Thermo Fisher Scientific) and 4 to 10 ng / mL bFGF.
  • KSR Kerbecco's modified Eagle's medium containing 20% KSR (Knockout serum replenishment, Thermo Fisher Scientific) and 4 to 10 ng / mL bFGF.
  • the present invention provides induced pluripotent stem cells produced by the production method described above.
  • the iPS cells of the present embodiment endogenously express the pluripotent stem cell markers OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, LIN28, ZFP42, TRA-1-60, and SSEA4.
  • the iPS cells of the present embodiment can be differentiated into endoderm, mesoderm, and ectoderm.
  • the iPS cells of the present embodiment can form teratomas and differentiate into differentiated glandular epithelium, blood vessels, cartilage, adipocytes, and nerve cells.
  • the iPS cells of the present embodiment are produced by expressing the above-mentioned reprogramming factors in somatic cells. Therefore, a gene encoding a reprogramming factor may be introduced.
  • step (a) the iPS cells are brought into contact with the somatic cells of pluripotent induction-resistant animals with an efficiency-improving substance capable of improving the establishment efficiency of known iPS cells.
  • the efficiency of establishment may be improved.
  • HDAC histone deacetylase
  • VPA valproic acid
  • MC 1293, M344 small molecule inhibitors
  • siRNA and shRNA against HDACs eg, HDAC1 siRNA Smartpool TM (Millipore), HuSH 29mer Nucleic acid expression inhibitors such as shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene), etc.
  • DNA methyl transferase inhibitors eg 5'-azacytidine
  • G9a histone methyltransferase inhibitors eg, BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008)), siRNAs and shRNAs against G9a (eg, G9a siRNA (human) (Santa Cruz Biotechnology) ) Etc.), etc.] L-channel calcium agonist (for example, Bayk 8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008)), UTF1 (Cell Stem Cell, 3, 475-479) (2008) )), Wnt Signaling activator (eg soluble Wnt3a) (Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)), 2i / LIF (2i is an inhibitor of mitogen-activated protein kinase signaling and glycogen synthase kinase-3, PloS Biology, 6 (10), 2237-2247 (2008)), ES cell-specific miRNA (eg miR-302-367 cluster (
  • the efficiency of establishing iPS cells may be improved by culturing somatic cells, iNSL cells, and iPS cells under hypoxic conditions.
  • the oxygen concentration in the atmosphere when culturing cells can be 18% or less.
  • the invention comprises a reprogramming factor comprising an OCT family, a SOX family, a KLF family, a MYC family, a LIN28 family and a P53 function inhibitor, and a nerve comprising a MAP kinase inhibitor, a GSK3 ⁇ inhibitor and a TGF ⁇ inhibitor.
  • a kit for producing induced pluripotent stem cells from somatic cells of pluripotent induction-resistant animals, including a stem cell culture medium, is provided.
  • iPS cells are produced by introducing the reprogramming factor attached to the kit of the present embodiment into somatic cells of a pluripotent induction-resistant animal and then culturing in the neural stem cell culture medium attached to the kit of the present embodiment. can do.
  • the above-mentioned MAP kinase inhibitor, GSK3 ⁇ inhibitor and TGF ⁇ inhibitor may be the above-mentioned inhibitors in the production method.
  • the kit described above may further include a growth medium containing bFGF.
  • the growth medium may be any medium as long as it can culture ES cells, and may be a known medium.
  • induced pluripotent stem cells can be easily produced even in somatic cells of pluripotent induction-resistant animals.
  • the reprogramming factor included in the kit of the present embodiment may further include one or more selected from the group consisting of KDM family, GLIS family and NANOG.
  • the reprogramming factors preferably include the OCT family, the SOX family, the KLF family, the MYC family, the LIN28 family, the P53 function inhibitor, the KDM family, the GLIS family and NANOG.
  • the reprogramming factor described above may be a protein or a nucleic acid encoding a protein described above in the production method.
  • the P53 function-inhibiting substance attached to the kit of the present embodiment is any substance that suppresses the function of the P53 protein or the expression of the P53 gene, as described above in the production method. May be good.
  • the kit of this embodiment may include a non-episomal vector having an expression construct for expressing a reprogramming factor and a nucleic acid encoding EBNA-1.
  • the expression construct include those in which a gene fragment encoding a reprogramming factor is linked downstream of a promoter as described above in the production method.
  • E01F and E02M mean the strain names of embryonic fibroblasts of marmosets
  • I5061F and CM421F mean the strain names of fibroblasts of adult marmosets.
  • the description of these strain names may mean cells from which iPS cells and iNSL cells are derived.
  • EP-A means an EP-A vector set
  • EP-B means an EP-B vector set.
  • the description of EP-A and EP-B may mean a vector set introduced into cells.
  • the reprogramming gene expression construct inserted into the vector described below was prepared.
  • the reprogramming genes are OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, mP53DD, KLF2, NANOG, KDM4D, GLIS1.
  • Oct4, SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, KLF2, NANOG, KDM4D, GLIS1 are human genes.
  • the mP53DD protein is a dominant negative form in which the C-terminal of the mouse P53 protein is deleted (Okita K et al., An Efficient Non-viral Method to Generate Integration-Free Human iPS Cells from Cord Blood and Peripheral Blood Cell. Cells, vol.31, 458-466, 2013).
  • FIGS. 1 and 2 Expression constructs introduced into marmoset somatic cells are shown in FIGS. 1 and 2.
  • the expression construct has the following structure.
  • PCE-hOCT3/4 expressing OCT4 has the ORF of the OCT4 gene downstream of the CAG promoter, and further, the ORF of the EBNA1 gene (EBV Nuclear Agent 1) downstream of the EBV (Epstein-Barr Virus) promoter and the EBV. It has a replication origin of OriP.
  • EBNA1 EBV Nuclear Agent 1
  • the pCE-hSK expressing SOX2 and KLF4 has the ORF of SOX2, the 2A sequence of foot-and-mouth disease virus, and the ORF of KLF4 downstream of the CAG promoter, and the ORF of the EBNA1 gene and the ORF of EBV downstream of the EBV promoter. It has a replication origin OriP.
  • the pCE-hUL expressing L-MYC and LIN28 has an ORF of L-MYC downstream of the CAG promoter, a 2A sequence of foot-and-mouth disease virus, and an ORF of LIN28, and an ORF of the EBNA1 gene downstream of the EBV promoter.
  • OriP which is the replication origin of the EBV.
  • the pCE-mP53DD expressing mP53DD has an ORF of mP53DD downstream of the CAG promoter, an ORF of the EBNA1 gene downstream of the EBV promoter, and an OriP origin of replication of EBV.
  • the pCXLE-EGFP expressing EGFP has an ORF of EGFP downstream of the CAG promoter, an ORF of the EBNA1 gene downstream of the EBV promoter, and an Origin of replication OriP of EBV.
  • PCXB-EBNA1 expressing EBNA1 has the ORF of the EBNA1 gene downstream of the CAG promoter.
  • the pCE-K2N expressing KLF2 and NANOG has the ORF of KLF2, the 2A sequence of foot-and-mouth disease virus, and the ORF of NANOG downstream of the CAG promoter, and the ORF of the EBNA1 gene and the ORF of EBV downstream of the EBV promoter. It has a replication origin OriP.
  • the pCE-KdGI expressing KDM4D and GLIS1 has the ORF of KDM4D, the 2A sequence of foot-and-mouth disease virus, and the ORF of GLIS1 downstream of the CAG promoter, and the ORF of the EBNA1 gene and the ORF of EBV downstream of the EBV promoter. It has a replication origin OriP.
  • the EP-A vector set consists of pCE-hOCT3 / 4, pCE-hSK, pCE-hUL, pCE-mP53DD, pCXLE-EGFP, and pCXB-EBNA1.
  • the EP-B vector set consists of pCE-hOCT3 / 4, pCE-hSK, pCE-hUL, pCE-mP53DD, pCXLE-EGFP, pCXB-EBNA1, pCE-K2N, and pCE-KdGI.
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium containing 20% KSR (Knockout serum replacement, Thermo Fisher Scientific) and 4 to 10 ng / mL bFGF was used.
  • KSR Kerbecco's modified Eagle's medium
  • Thermo Fisher Scientific 4 to 10 ng / mL bFGF was used.
  • the composition of the growth medium is shown in Table 3 below.
  • the EP-A vector set was introduced into the embryonic fibroblasts (E01F) of marmosets, and the cells were directly cultured in the growth medium without being cultured in the neural stem cell culture medium. The results are shown in FIG.
  • FIG. 3A is a photograph of cells in which the EP-A vector set was introduced and cultured in a growth medium for 4 days in a bright field.
  • FIG. 3 (b) is a photograph of EGFP fluorescence of cells into which the EP-A vector set was introduced and cultured in a growth medium for 4 days.
  • the EP-A vector set was introduced into embryonic fibroblasts (E01F, E02M) of marmosets, and the obtained cells were cultured in an ES cell culture medium for 30 days.
  • FIG. 4A is a photograph of cells in which the EP-A vector set was introduced into E01F and cultured in a growth medium for 30 days.
  • FIG. 4B is a photograph of cells in which the EP-A vector set was introduced into E02M and cultured in a growth medium for 30 days.
  • FIG. 5 shows a process for establishing iPS cells from marmoset somatic cells.
  • a reprogramming factor expression construct was introduced into marmoset somatic cells by electroporation.
  • the obtained cells were cultured in Dulbecco-modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum (FBS).
  • FBS fetal bovine serum
  • the obtained cells were cultured using MEF as a feeder cell. Subsequently, the obtained cells were cultured in a neural stem cell culture medium.
  • a medium containing a MAP kinase inhibitor (PD0325901), a GSK3 ⁇ inhibitor (CHIR99021) and a TGF ⁇ inhibitor (A83-01) was used as the neural stem cell culture medium.
  • the composition of the neural stem cell culture medium is shown in Table 4 below.
  • the DMEM / F12 medium is a medium in which DMEM and Ham's F-12 are mixed 1: 1.
  • the Neurobasal medium is manufactured by Thermo Fisher Scientific.
  • the EP-A vector set or EP-B vector set was introduced into marmoset embryonic fibroblasts (E01F, E02M) and cultured in a neural stem cell culture medium. The results are shown in FIG.
  • FIG. 6A is a photograph of colonies formed by introducing the EP-A vector set into E01F and then culturing in a neural stem cell culture medium.
  • FIG. 6B is a photograph of colonies formed by introducing the EP-B vector set into E01F and then culturing in a neural stem cell culture medium.
  • FIG. 6 (c) is a photograph of colonies formed by introducing the EP-A vector set into E02M and then culturing in a neural stem cell culture medium.
  • FIG. 6 (d) is a photograph of colonies formed by introducing the EP-A vector set into E02M and then culturing in a neural stem cell culture medium.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of calculating the colony forming ability when marmoset embryonic fibroblasts are used.
  • FIG. 8A is a diagram showing the results of alkaline phosphatase staining of colonies obtained by introducing E01F into an EP-A vector set and culturing in a neural stem cell culture medium.
  • FIG. 8B is a diagram showing the results of alkaline phosphatase staining of colonies obtained by introducing E01F into an EP-B vector set and culturing in a neural stem cell culture medium.
  • iNSLC induced natural Stem Cell LIKE Cell
  • iNSL induced neural stem cell-like cells
  • Example 3 (Establishment of marmoset iPS cells) A reprogramming factor was introduced into marmoset embryonic fibroblasts, cultured in a neural stem cell culture medium, and then cultured in a growth medium (ES cell culture medium) to establish marmoset iPS cells. The same medium as in Experimental Examples 1 and 2 was used as the neural stem cell culture medium and the growth medium.
  • the EP-A vector set or EP-B vector set was introduced into marmoset embryonic fibroblasts (E01F, E02M). Subsequently, the obtained cells were cultured in a neural stem cell culture medium and then cultured in a growth medium.
  • FIG. 9A is a photograph of colonies formed by introducing an EP-A vector set into marmoset embryonic fibroblasts (E01F) and culturing them in a neural stem cell culture medium.
  • FIG. 9B is a photograph of colonies formed by introducing an EP-A vector set into marmoset embryonic fibroblasts (E01F), culturing in a neural stem cell culture medium, and then culturing in a growth medium.
  • FIG. 9 (c) is a photograph of colonies formed by introducing an EP-B vector set into marmoset embryonic fibroblasts (E02M) and culturing them in a neural stem cell culture medium.
  • FIG. 9A is a photograph of colonies formed by introducing an EP-A vector set into marmoset embryonic fibroblasts (E01F) and culturing them in a neural stem cell culture medium.
  • FIG. 9 (c) is a photograph of colonies formed by introducing an EP-B vector set into marmoset embryonic
  • marmoset ES cells No. 40 ESC
  • marmoset iPS cells A-2-2, A-2-6, A-2-7, E02M-derived B-0-6 derived from E01F.
  • B-0-7, B-0-11 colonies were subjected to Hoechst stain, immunostaining with anti-TRA-1-60 antibody, and anti-SSEA4 antibody.
  • TRA-1-60 and SSEA4 are genes expressed in ES cells. The results are shown in FIG.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of analyzing the expression of ES cell markers in marmoset iPS cells. As a result, it was clarified that these marmoset iPS cells express TRA-1-60 and SSEA4 in the same manner as ES cells.
  • FIG. 11 is a diagram showing the results of subjecting marmoset iPS cells to alkaline phosphatase staining. As a result, it was revealed that these colonies were stained by alkaline phosphatase staining as well as undifferentiated cells.
  • FIG. 12 is a diagram showing the results of analysis of the expression of ES cell markers in marmoset iPS cells. As a result, it was revealed that colonies of these marmoset iPS cells, like ES cells, express OCT4 and NANOG.
  • FIGS. 13 and 14 are diagrams showing the results of analyzing the expression of ES cell markers in marmoset iPS cells. As a result, it was revealed that the marmoset iPS cells endogenously express the OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, DRPA5, ZFP42, and TERT genes in the same manner as the marmoset ES cells.
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of analysis of the presence or absence of an expression vector in marmoset iPS cells.
  • marmoset iPS cells (A-2-2, A-2-6, A-2-7, B-0-7) were suspended and cultured to differentiate into each germ layer.
  • AFP Alpha-fetoprotein
  • ⁇ SMA ⁇ -Smooth muscle actin
  • MAP2 Microtubule associated protein 2
  • ⁇ III-tubulin ⁇ III-tubulin
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of analysis of marker expression in three germ layers differentiated from marmoset iPS cells. As a result, it was clarified that each germ layer formed from marmoset iPS cells expresses a marker gene characteristic of each germ layer.
  • qRT shows the expression of AFP after culturing embryoid bodies formed from marmoset iPS cells for 2 or 4 weeks using KnockOut Serum Replacement medium (KSR medium) or a medium containing 10% fetal bovine serum. -Analyzed by PCR. The results are shown in FIGS. 17 and 18.
  • FIG. 17 is a diagram showing the results of analyzing the expression of AFP expressed by marmoset iPS cells cultured in KSR medium.
  • FIG. 18 is a diagram showing the results of analysis of AFP expression in marmoset iPS cells cultured in a medium containing FBS.
  • EB indicates an embryoid body
  • 2w indicates after 2 weeks
  • 4w indicates after 4 weeks.
  • the obtained mermoset iPS cells (A-2-2, A-2-7, B-0-7) were injected into the germ layer of immunodeficient mice (NOD / SCID), and 2-3 months later, the germ layer was injected.
  • the teratomas formed inside were excised, and the tissues differentiated from endoderm, mesoderm, and ectoderm were observed.
  • glandular epithelium differentiated from endoderm blood vessels differentiated from mesodermal, cartilage, and fat cells were observed by hematoxylin-eosin staining (HE staining), and nerve cells differentiated from ectodermal were observed. It was observed by HE staining and immunostaining with an antibody against neurofilament 200 kDa. The results are shown in FIG.
  • FIG. 19 is a diagram showing the results of analysis of teratomas formed from marmoset iPS cells. As a result, it was clarified that differentiated glandular epithelium, blood vessels, cartilage, adipocytes, and nerve cells are formed in teratomas.
  • FIG. 20 is a photograph of iNSL cells derived from adult marmoset fibroblasts.
  • iNSL cells derived from adult marmoset fibroblasts form cell clusters and colonies.
  • FIG. 21 is a diagram showing the ability of adult marmosets to form colonies of iNSL cells derived from fibroblasts.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of alkaline phosphatase staining of iNSL cells derived from adult marmoset fibroblasts.
  • iNSL cells derived from adult marmoset fibroblasts express alkaline phosphatase. That is, it was revealed that iNSL cells derived from adult marmoset fibroblasts have undifferentiated state.
  • FIG. 23 is a photograph of a colony of marmoset iPS cells derived from adult marmoset fibroblasts. As a result, it was clarified that the marmoset iPS cells cultured in the growth medium form colonies similar to the ES cell colonies.
  • FIG. 24 is a diagram showing the results of alkaline phosphatase staining of iPS cells derived from adult marmoset fibroblasts. As a result, it was suggested that the established marmoset iPS cells were undifferentiated.
  • FIG. 25 is a diagram showing the results of analysis of the expression of ES cell markers in marmoset iPS cells derived from adult marmosets fibroblasts. As a result, it was clarified that the obtained marmoset iPS cells express TRA-1-60 and SSEA4 in the same manner as ES cells.
  • FIGS. 26 to 29 are diagrams showing the results of analysis of the expression of ES cell markers in marmoset iPS cells derived from adult marmosets fibroblasts. As a result, it was clarified that the obtained marmoset iPS cells express the above-mentioned genes in the same manner as the marmoset ES cells.
  • marmoset iPS cells were differentiated into endoderm, mesoderm, and ectoderm by the same method as in Experimental Example 4, and the expression of the marker gene in each germ layer was analyzed.
  • FIGS. 30 and 31 are diagrams showing the results of analysis of marker expression in three germ layers differentiated from adult marmoset fibroblast-derived marmoset iPS cells. As a result, it was clarified that each germ layer formed by differentiating from the obtained marmoset iPS cells expresses a marker gene characteristic of each germ layer.
  • teratomas were prepared from the obtained marmoset iPS cells in the same manner as in Experimental Example 4, and tissues differentiated from endoderm, mesoderm, and ectoderm were observed.
  • the glandular epithelium differentiated from the endoderm and the blood vessels differentiated from the mesoderm were observed by HE staining, and the nerve cells differentiated from the ectoderm were observed by HE staining and immunostaining with an antibody against neurofilament 200 kDa. The results are shown in FIG.
  • FIG. 32 is a diagram showing the results of analysis of teratomas formed from marmoset iPS cells derived from adult marmoset fibroblasts. As a result, it was clarified that differentiated glandular epithelium, blood vessels, and nerve cells are formed in teratomas.
  • FIG. 33 is a diagram showing the results of analysis of whether the vector remains in marmoset iPS cells derived from adult marmoset fibroblasts. As a result, it was clarified that no vector remained in the obtained marmoset iPS cells.
  • FIG. 34 is a photograph of marmoset iNSL cells. As a result, it was confirmed that iNSL cells were obtained.
  • FIG. 35 is a diagram showing the results of analysis of the remaining vector in iNSL cells.
  • FIG. 36 is a diagram showing the results of analyzing the expression of endogenous OCT4, NANOG, SOX2, KLKF4, and ZFP42 in iNSL cells.
  • FIG. 37 is a diagram showing the results of analyzing the expression of DPPA5 and TERT in iNSL cells.
  • the obtained iNSL cells endogenously express SOX2 and TERT, but do not endogenously express OCT4, NANOG, KLF4, ZFP42 and DPPA5.
  • FIG. 38 is a diagram showing the results of analysis of endogenous and exogenous expression of OCT4, NANOG, KLF4, and Lin28 in iNSL cells.
  • FIG. 39 is a diagram showing the results of analyzing the expression of PAX6 in iNSL cells.
  • FIG. 40 is a diagram showing the results of analyzing the expression of SOX1 and ZFP521 in iNSL cells.
  • FIG. 41 is a diagram showing the results of analyzing the expression of T and SOX17 in iNSL cells. As a result, it was confirmed that T and SOX17 are expressed in marmoset ES cells but not in the obtained inducible neural stem cells.
  • FIG. 42 is a schedule of neural differentiation assays. Specifically, suspension culture was carried out for 7 days, and then adhesive culture was carried out for 7 days. The results are shown in FIGS. 43 and 44.
  • FIG. 43 is a diagram showing the results of immunostaining of cells differentiated from the obtained induced neural stem cells with Hoechst stain and anti- ⁇ III-tubulin antibody. As a result, it was clarified that the cells differentiated from the obtained induced neural stem cells were differentiated into nerve cells.
  • FIG. 44 is a graph showing the proportion of cells in which ⁇ III-tubulin expression was observed among the cells differentiated into nerve cells. As a result, it was clarified that cells differentiated from marmoset ES cells and marmoset iPS cells do not express ⁇ III-tubulin, but cells differentiated from marmoset-induced neural stem cells express ⁇ III-tubulin.
  • the iNSL cells obtained by introducing the EP-A vector set or the EP-B vector set into adult fibroblasts of Marmoset and culturing them in a neural stem cell culture medium acquire the neural stem cell traits. It became clear.
  • iNSL cells when iNSL cells are continuously cultured in the neural stem cell culture medium without being transferred to the growth medium, the iNSL cells retain the neural stem cell traits and the ES cell traits even though they continue to retain the vector. It became clear that it would not win.
  • each cell was divided into a group of fibroblasts, ES cells and iPS cells, and inducible neural stem cells.
  • FIG. 48 is a photograph of colonies formed by canine iPS cells. As a result, it was clarified that the canine iPS cells form colonies similar to the colonies formed by ES cells.
  • FIG. 49 is a diagram showing the results of analysis of the expressions of OCT4, SOX2, and NANOG in canine iPS cells by RT-PCR.
  • canine iPS cells express OCT4, SOX2, and NANOG. That is, it was suggested that canine iPS cells have traits similar to ES cells.
  • Canine iPS cells were injected into the testis of immunodeficient mice (NOD / SCID), and after 2 to 3 months, the teratoma formed in the testis was removed and the teratoma was observed. The results are shown in FIG.
  • FIG. 51 is a diagram showing the results of analysis of bone, cartilage, nerve cells, retina, sebaceous gland, hair follicle epithelium, and glandular tissue.
  • FIG. 53 is a photograph of the obtained colonies of porcine iPS cells. It was revealed that porcine iPS cells form colonies similar to those formed by ES cells.
  • FIG. 54 is a diagram showing the results of analysis of the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in porcine iNSL cells and porcine iPS cells.
  • porcine iPS cells express OCT4, SOX2, and NANOG. It was also revealed that porcine iNSL cells express SOX2.
  • FIG. 55 is a photograph of the obtained colony of ferret iPS cells. It was revealed that ferret iPS cells form colonies similar to those formed by ES cells.
  • FIG. 56 shows the results of analysis of the expressions of OCT4, SOX2, and NANOG in ferret iNSL cells and ferret iPS cells by RT-PCR.
  • ferret iPS cells express OCT4, SOX2, and NANOG. It was also revealed that ferret iNSL cells express SOX2.

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Abstract

哺乳動物の体細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養して誘導神経幹細胞様細胞を得る工程と、前記誘導神経幹細胞様細胞を増殖用培地で培養して誘導多能性幹細胞を得る工程と、を含み、前記初期化因子が、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法。

Description

誘導多能性幹細胞の製造方法及びキット
　本発明は、誘導多能性幹細胞の製造方法及びキットに関する。本願は、２０１９年４月１７日に日本に出願された特願２０１９－０７８９０７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ヒト、マウスの体細胞からｉＰＳ細胞を樹立する技術は、改良と簡便化が進み、ｉＰＳ細胞を樹立する効率は従来よりも向上している。一方、特に成体の体細胞からｉＰＳ細胞を樹立することが困難な動物（多能性誘導耐性動物）が存在する。多能性誘導耐性動物としては、イヌ、ブタ、マーモセット、ネコ、ウシ、ウマ等が知られている。
　例えば、イヌ胎児由来線維芽細胞において初期化因子を持続的に発現させることにより、イヌｉＰＳ細胞を樹立することができる（例えば、非特許文献１を参照）。また、センダイウイルスを用いることにより、イヌ胎児由来線維芽細胞からイヌｉＰＳ細胞を樹立することができる（例えば、非特許文献２を参照）。また、ブタ胎児由来線維芽細胞において初期化因子を持続的に発現させることによりブタｉＰＳ細胞を樹立することができる（例えば、非特許文献３を参照）。
Nishimura T et al., Feeder‐independent canine induced pluripotent stem cells maintained under serum‐free conditions. Mol. Reprod. Dev., vol. 84, 329-339, 2017. Tsukamoto M et al., Generation of Footprint-Free Canine Induced Pluripotent Stem Cells Using Auto-Erasable Sendai Virus Vector. Stem Cells Dev., 27, 1577-1586, 2018. Du X et al., Barriers for Deriving Transgene-Free Pig iPS Cells with Episomal Vectors. Stem Cells, vol.33, 3228-3238, 2015.
　本発明は、哺乳動物の体細胞から、ｉＰＳ細胞を樹立する新たな技術を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の態様を含む。
［１］哺乳動物の体細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養して誘導神経幹細胞様細胞を得る工程と、前記誘導神経幹細胞様細胞を増殖用培地で培養して誘導多能性幹細胞を得る工程と、を含み、前記初期化因子が、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法。
［２］前記初期化因子が、更に、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される一種以上を含む、［１］に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
［３］前記体細胞が成体由来である、［１］又は［２］に記載の製造方法。
［４］前記神経幹細胞培養培地が、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む、［１］～［３］のいずれかに記載の製造方法。
［５］前記増殖用培地が、ｂＦＧＦを含む、［１］～［４］のいずれかに記載の製造方法。
［６］［１］～［５］のいずれかに記載の製造方法により製造された、誘導多能性幹細胞。
［７］ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む初期化因子と、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む神経幹細胞培養培地と、を含む、多能性誘導耐性動物の体細胞から誘導多能性幹細胞を製造するためのキット。
［８］前記初期化因子が、前記初期化因子が、更に、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される一種以上を含む、［７］に記載のキット。
［９］ｂＦＧＦを含む増殖用培地を更に含む、［７］又は［８］に記載のキット。
　本発明によれば、哺乳動物の体細胞から、ｉＰＳ細胞を樹立する新たな技術を提供することができる。
初期化因子を発現させるためのＥＰ－Ａベクターセットを模式的に表す図である。 初期化因子を発現させるためのＥＰ－Ｂベクターセットを模式的に表す図である。 （ａ）、（ｂ）は実験例１における細胞の写真である。（ａ）は、ＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で４日間培養した細胞を明視野で撮影した写真である。（ｂ）は、ＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で４日間培養した細胞のＥＧＦＰの蛍光を撮影した写真である。 （ａ）、（ｂ）は実験例１における細胞の写真である。（ａ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で３０日間培養した細胞の写真である。図４（ｂ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で３０日間培養した細胞の写真である。 マーモセット体細胞からｉＰＳ細胞を樹立するための工程を表す図である。 （ａ）～（ｄ）は実験例２におけるｉＮＳＬ細胞の写真である。（ａ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｂ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ｂベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｃ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｄ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ｂベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。 実験例２における、マーモセット胚性線維芽細胞を用いた場合のコロニー形成能を算出した結果を示すグラフである。 （ａ）、（ｂ）は実験例２におけるアルカリフォスファターゼ染色した結果を示す図である。（ａ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ａベクターセットに導入し、神経幹細胞培養培地で培養して得られたコロニーをアルカリフォスファターゼ染色した結果を示す図である。（ｂ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ｂベクターセットに導入し、神経幹細胞培養培地で培養して得られたコロニーをアルカリフォスファターゼ染色した結果を示す図である。 実験例３における、ｉＮＳＬ細胞とｉＰＳ細胞の写真である。（ａ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｂ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｃ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０２Ｍ）にＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。（ｄ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０２Ｍ）にＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。 実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞をアルカリフォスファターゼ染色に供した結果を示す図である。 実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例３における、マーモセットｉＰＳ細胞における、発現ベクターの有無を解析した結果を示す図である。 実験例４における、マーモセットｉＰＳ細胞から分化させた三胚葉における、マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例４における、ＫＳＲ培地で培養したマーモセットｉＰＳ細胞が発現するＡＦＰの発現を解析した結果を示す図である。 実験例４における、ＦＢＳを含む培地で培養したマーモセットｉＰＳ細胞が発現するＡＦＰの発現を解析した結果を示す図である。 実験例４における、マーモセットｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマを解析した結果を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞の写真である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞のコロニー形成能を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞の、アルカリフォスファターゼ染色の結果を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来の、マーモセットｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞の、アルカリフォスファターゼ染色の結果を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞から分化した三胚葉における、マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞から分化した三胚葉における、マーカーの発現を解析した結果を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマを解析した結果を示す図である。 実験例５における、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞にベクターが残存するか解析した結果を示す図である。 実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞の写真である。 実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞において残存するベクターを解析した結果を示す図である。 実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞の、内在性の、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＫＦ４、ＺＦＰ４２の発現を解析した結果を示す図である。 実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞の、ＤＰＰＡ５及びＴＥＲＴの発現を解析した結果を示す図である。 実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞の、内在性及び外来性の、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８の発現を解析した結果を示す図である。 実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞におけるＰＡＸ６の発現を解析した結果を示す図である。 実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞における、ＳＯＸ１とＺＦＰ５２１の発現を解析した結果を示す図である。 実験例６における、マーモセットｉＮＳＬ細胞における、ＴとＳＯＸ１７の発現を解析した結果を示す図である。 実験例６における、神経分化アッセイのスケジュールである。 実験例６における、得られた誘導神経幹細胞から分化した細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色及び抗βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎ抗体により免疫染色した結果を示す図である。 実験例６における、神経細胞に分化した細胞のうち、βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎの発現が認められた細胞の割合を示すグラフである。 実験例７における、クラスタリング解析の結果を示す図である。 実験例７における、遺伝子発現量を解析した結果を示す図である。 実験例７における、主成分分析の結果を示す図である。 実験例８における、イヌｉＰＳ細胞が形成したコロニーの写真である。 実験例８における、イヌｉＰＳ細胞における、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの発現を解析した結果を示す図である。 実験例８における、イヌｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマの写真である。 実験例８における、イヌｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマ内の、骨、軟骨、神経細胞、網膜、皮脂腺、毛包上皮、腺組織を解析した結果を示す図である。 実験例８における、イヌｉＰＳ細胞においてベクターが残存しているか否かを解析した結果を示す図である。 実験例９における、ブタｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実験例９における、ブタｉＮＳＬ細胞及びブタｉＰＳ細胞における、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの発現を解析した結果を示す図である。 実験例１０における、フェレットｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。 実験例１０における、フェレットｉＮＳＬ細胞及びフェレットｉＰＳ細胞における、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの発現を解析した結果を示す図である。
［遺伝子名及びタンパク質名の表記］
　本明細書では、ヒト遺伝子及びヒトタンパク質、多能性誘導耐性動物の遺伝子及びタンパク質は、大文字のアルファベットで表すものとする。しかしながら、場合により、ヒト遺伝子、その他の種の遺伝子を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。また、ヒトタンパク質、その他の種のタンパク質を厳密に区別せずに大文字のアルファベットで表す場合がある。
　本明細書において、例えば「ＳＯＸ２」との表記は、ＳＯＸ２タンパク質及びそれをコードする核酸の双方を意味する。また、例えば「初期化因子」との表記は、初期化タンパク質及びそれをコードする核酸の双方を意味する。また、例えば「ＳＯＸファミリー」との表記は、ＳＯＸタンパク質及びそれをコードする核酸の双方を意味する。
［細胞名の表記］
　本明細書では、誘導多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）を、ｉＰＳ細胞、ｉＰＳＣという場合がある。また、誘導神経幹細胞様細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｎｅｕｒａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌ）を、ｉＮＳＬ細胞、ｉＮＳＬＣという場合がある。
［製造方法］
　１実施形態において、本発明は、哺乳動物の体細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養して誘導神経幹細胞様細胞を得る工程（ａ）と、誘導神経幹細胞様細胞を増殖用培地で培養して誘導多能性幹細胞を得る工程（ｂ）と、を含み、初期化因子が、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法を提供する。本実施形態において、哺乳動物は、多能性誘導耐性動物であってもよい。
　本明細書において、多能性誘導耐性動物とは、該動物の成体の体細胞において、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリーの初期化因子を組み合わせて発現させても、ｉＰＳ細胞を樹立することができない哺乳動物のことを指す。
　多能性誘導耐動物としては、例えば、サル、ブタ、フェレット、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、ウサギ等が挙げられるが、これらに限定されない。サルとしては、例えば、マーモセットが挙げられる。
　本実施形態において、ｉＰＳ細胞を作製するための材料として用いる多能性誘導耐動物の体細胞としては、例えば、胎児由来の体細胞、成体由来の体細胞を挙げることができる。体細胞としては、脂肪細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、筋細胞、血管細胞、免疫細胞、上皮細胞、神経細胞、肝細胞、膵臓細胞、それらの前駆細胞等が挙げられる。上述の体細胞は、未分化な細胞、分化した細胞であってもよい。
　マーモセット、イヌ、ブタ、フェレットは、代表的な多能性誘導耐性動物である。実施例において後述するように、本実施形態の製造方法により、マーモセット、イヌ、ブタ及びフェレットの成体の体細胞から、一過的に初期化因子を細胞内に発現させることにより、初期化因子を発現する発現コンストラクトを細胞内に有しないｉＰＳ細胞を樹立することができる。
　本実施形態において、哺乳動物の体細胞に対して、初期化因子と共に、ＥＢＮＡ－１をコードする核酸を有する、非エピソーマルベクターを導入することが好ましい。
（初期化因子）
　本実施形態において、初期化因子は、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む。
　ＯＣＴファミリーとしては、例えば、ＯＣＴ３／４、ＯＣＴ１、ＯＣＴ２、ＯＣＴ６等が挙げられる。ＯＣＴファミリーとしては、ＯＣＴ３／４が好ましい。
　ＳＯＸファミリーとしては、例えば、ＳＯＸ２、ＳＯＸ１、ＳＯＸ３、ＳＯＸ１５、ＳＯＸ１７等が挙げられる。
　ＫＬＦファミリーとしては、例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５等が挙げられる。
　ＭＹＣファミリーとしては、Ｃ－ＭＹＣ、Ｎ－ＭＹＣ、Ｌ－ＭＹＣ等が挙げられる。
　ＬＩＮ２８ファミリーとしては、ＬＩＮ２８、ＬＩＮ２８Ｂ等が挙げられる。
　ＮＡＮＯＧは、ホメオドメインを有する転写因子である。ＮＡＮＯＧを、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８と共に体細胞に発現させると、ｉＰＳ細胞を樹立することができる（例えば、Yu J et al., Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）。
　本明細書において、Ｐ５３機能阻害物質とは、Ｐ５３タンパク質の機能を抑制する物質又はＰ５３遺伝子の発現を抑制する物質であれば、どのようなものであってもよい（例えば、国際公開第２００９／１５７５９３号）。
　Ｐ５３タンパク質の機能を抑制する物質としては、Ｐ５３のドミナントネガティブ変異体、Ｐ５３タンパク質の機能を阻害する化学物質、抗Ｐ５３アンタゴニスト抗体、Ｐ５３応答エレメントのコンセンサス配列を含むデコイ核酸、Ｐ５３経路の阻害物質等が挙げられる。
　Ｐ５３遺伝子の発現を抑制する物質としては、Ｐ５３に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。
　Ｐ５３のドミナントネガティブ変異体としては、マウスＰ５３の１４－３０１位（ヒトＰ５３では１１－３０４位に対応）のアミノ酸を欠失させたＰ５３ＤＤが好ましい（例えば、Bowman, T., Genes & Development, 10, 826-835 (1996)を参照）。
　初期化因子は、更に、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される一種以上を含んでもよい。
　初期化因子は、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー、Ｐ５３機能阻害物質、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧを含むことが好ましい。
　ＫＤＭファミリーは、Ｌｙｓｉｎｅ　Ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ活性を有し、ヒストン　Ｈ３のＫ９を脱メチル化する。ＫＤＭファミリーとして、ＫＤＭ１、ＫＤＭ２、ＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５、ＫＤＭ６が知られている。ＫＤＭ４Ｄ又はＫＤＭ４Ａの強制発現は、ヒストン　Ｈ３の９番目のリジン残基を脱メチル化し、体細胞の初期化を促進する（例えば、Matoba et al., Cell, 159, 884-895 (2014）; Chung YG et al., Cell Stem Cell, 17, 758-766 (2015)を参照）。
　初期化因子として用いられるＫＤＭファミリーとしては、特に限定されず、ＫＤＭ１、ＫＤＭ２、ＫＤＭ３、ＫＤＭ４、ＫＤＭ５、ＫＤＭ６が挙げられる。ＫＤＭファミリーとしては、ＫＤＭ４Ａ、ＫＤＭ４Ｄが好ましい。
　ＧＬＩＳファミリー（ＧＬＩ　Ｓｉｍｉｌａｒ　ファミリー）は、Ｚｉｎｃ　フィンガー型転写因子である。ＧＬＩＳファミリーとして、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ２、ＧＬＩＳ３が知られている。ＧＬＩＳ１の強制発現は、ｉＰＳ細胞の形成を促進する（例えば、Maekawa et al., Nature, 474, 225-229 (2011)を参照）。また、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ２、ＧＬＩＳ３は幹細胞において多様な役割を果たす（例えば、Scoville DW et al., Stem Cell Investig, 4:80 (2017)を参照。）。
　初期化因子として用いられるＧＬＩＳファミリーとしては、特に限定されず、ＧＬＩＳ１、ＧＬＩＳ２、ＧＬＩＳ３が挙げられる。ＧＬＩＳファミリーとしては、ＧＬＩＳ１が好ましい。
　初期化因子は、ＥＳＲＲファミリーを含んでもよい。
　ＥＳＲＲファミリー（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒファミリー）は、核内受容体である。ＥＳＲＲファミリーとして、ＥＳＲＲＡ、ＥＳＲＲＢ、ＥＳＲＲＧが知られている。ＯＣＴ４及びＳＯＸ２と共に、ＥＳＲＲＢ又はＥＳＲＲＧを強制発現させると、体細胞を初期化させることができる（例えば、Feng B et al., Nat. Cell. Biol., vol. 11, 197-203 (2009)を参照）。
　初期化因子として用いられるＥＳＲＲファミリーとしては、特に限定されず、ＥＳＲＲＢ、ＥＳＲＲＧが挙げられる。
　初期化因子の組み合わせとしては、国際公開２０１５／０５６８０４号に記載されているように、表１に例示する組み合わせを挙げることができるが、これらに限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　初期化因子は、多能性誘導耐性体細胞を初期化する活性を有する限り変異を有していてもよい。初期化因子が変異を有する場合、初期化因子は、表１に例示されるＮＣＢＩアクセッション番号により特定されるタンパク質又はｍＲＮＡに対して、８０％以上の配列同一性を有することが好ましく、９０％以上の配列同一性を有することがより好ましく、９５％以上の配列同一性を有することが更に好ましい。
　ここで、アミノ酸配列の配列同一性は、対象のアミノ酸配列（対象アミノ酸配列）が、基準となるアミノ酸配列（基準アミノ酸配列）に対して一致している割合を示す値である。基準アミノ酸配列に対する、対象アミノ酸配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列をアラインメントする。ここで、各アミノ酸配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準アミノ酸配列及び対象アミノ酸配列において、一致したアミノ酸の数を算出し、下記式（１）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
　配列同一性（％）＝一致したアミノ酸の数／対象アミノ酸配列の総アミノ酸数×１００　…（１）
　同様に、基準塩基配列に対する、対象塩基配列の配列同一性は、例えば次のようにして求めることができる。まず、基準塩基配列及び対象塩基配列をアラインメントする。ここで、各塩基配列には、配列同一性が最大となるようにギャップを含めてもよい。続いて、基準塩基配列及び対象塩基配列において、一致した塩基の数を算出し、下記式（２）にしたがって、配列同一性を求めることができる。
　配列同一性（％）＝一致した塩基の数／対象塩基配列の総塩基数×１００　…（２）
　本実施形態において、初期化因子が由来する動物種は、初期化因子を導入する体細胞が由来する動物種に対して、同一であってもよいし、異なっていてもよい。当業者であれば、所望の動物種の初期化因子のアミノ酸配列又はｍＲＮＡ配列をデータベースから取得することができる。
　初期化因子は、表２に例示されるＮＣＢＩアクセッション番号によって特定されるｍＲＮＡ、それらｍＲＮＡがコードするタンパク質、それらｍＲＮＡを転写する遺伝子であってもよい（例えば、特許５０９８０２８号公報、特許６３８１４４２号公報、国際公開２０１５／０３０１１１号、国際公開２０１５／０５６８０４号を参照。）。表１に示されるアクセッション番号はヒトのｃＤＮＡ配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本実施形態の初期化因子は、タンパク質の形態で導入してもよいし、そのタンパク質をコードするｍＲＮＡや発現ベクター等の核酸の形態で導入してもよい。
　実施例において後述するように、初期化因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８及びｍＰ５３ＤＤを含むことが好ましい。
　また、実施例において後述するように、初期化因子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ｍＰ５３ＤＤ、ＫＬＦ２、ＫＤＭ４Ｄ、ＧＬＩＳ１及びＮＡＮＯＧを含むことが好ましい。
（工程（ａ））
　本工程では、哺乳動物の体細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養することにより、誘導神経幹細胞様細胞を得る。ここで、哺乳動物は、多能性誘導耐性動物であってもよい。
　初期化因子がタンパク質又はＲＮＡである場合には、初期化因子を細胞に取り込ませる方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等の定法を用いることができる。
　初期化因子がタンパク質である場合には、初期化因子を細胞に取り込ませる方法として、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。
　タンパク質導入試薬としては、例えば、ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ（Ｇｅｌａｎｔｉｓ）、Ｐｒｏ－ＤｅｌｉｖｅｒＩＮ（ＯＺ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ａｂ－ＤｅｌｉｖｅｒＩＮ（ＯＺ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＰＵＬＳｉｎ　Ｋｉｔ（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ＳＡＳ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｆｅｃｔｉｎ（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｆｕｓｅ－Ｉｔ　Ｐ（ＮＩＰＰＯＮ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）等のカチオン性脂質型導入試薬；Ｃｈａｒｉｏｔ（Ａｃｔｉｖｅ　ｍｏｔｉｆ）、Ｘｆｅｃｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ＪＢＳ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｊｅｎａ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｃｅｌｌｖａｄｅｒ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）等の膜透過性ペプチド型導入試薬；Ｐｒｏｆｅｃｔ－１（Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）等の脂質型導入試薬；ＧｅｎｏｍＯＮＥＴＭ－Ｎｅｏ（ＦＤ）（Ｃｏｓｍｏ　Ｂｉｏ）等のＨＶＪエンベロープ型導入試薬等の公知の試薬を用いることができる。
　ｍＲＮＡを導入する試薬としては、例えば、ＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴａＫａＲａ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＸｆｅｃｔＴＭ　ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）等の公知の試薬を用いることができる。
　初期化因子は、初期化因子をコードするＤＮＡとプロモーターを連結した発現コンストラクトであってもよい。プロモーターとしては、対象細胞において活性を有するものであってもよいし、薬剤などにより活性を誘導可能な発現誘導型プロモーターであってもよい。
　プロモーターとしては、例えば、ほぼ全ての細胞において強いプロモーター活性を有する、サイトメガロウイルス・プロモーター（ＣＭＶプロモーター）やＣＭＶ　ｅａｒｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｒ／ｃｈｉｃｋｅｎ　ｂｅｔａ　ａｃｔｉｎ（ＣＡＧプロモーター）等であってもよいし、組織特異的なプロモーター活性を有するプロモーター等であってもよい。
　発現誘導型プロモーターとしては、例えば、ドキシサイクリン誘導型プロモーター、キュメート（Ｃｕｍａｔｅ）誘導型プロモーター、熱ショックプロモーター、光誘導プロモーター等が挙げられるがこれに限定されない。また、ｌｏｘＰサイトで挟まれたタンパク質翻訳ストップコドンやポリアデニン配列によって、Ｃｒｅ組換え酵素作用時に発現が誘導されるシステムでもよい。
　上述の発現コンストラクトは、例えば、トランスポゾンベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、プラスミドベクター、エピソーマルベクター等に組み込まれたものであってもよい。
　ベクターとしては、ベクターがゲノムに組み込まれないもの、又は、一時的にゲノムに組み込まれるが、人為的な操作によってゲノムから除去することのできるベクターが好ましい。
　例えば、上記のコンストラクトがトランスポゾンベクターに組み込まれている場合、細胞に導入してトランスポザーゼを作用させることにより、容易に細胞の染色体中に組み込むことができる。また、トランスポザーゼを作用させることにより、染色体中に組み込まれた上記のコンストラクトを、染色体から切り出し、痕跡を残さずに除去することもできる。トランスポゾンは、例えば、ｐｉｇｇｙＢａｃ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ　Ｂｅａｕｔｙ、Ｔｏｌ　ＩＩ、ｍａｒｉｎｅｒ等であってもよい。
　あるいは、上記のコンストラクトの両端にｌｏｘＰ配列を配置しておき、ｉＰＳ細胞を樹立した後で、Ｃｒｅ組換え酵素を作用させ、ｌｏｘＰ配列に挟まれた配列を除去してもよい。
　ベクターとしては、エピソーマルベクターが好ましい。エピソーマルベクターとしては、例えば、ＥＢＶ、ＳＶ４０等に由来する、哺乳動物細胞内で自律複製するために必要な配列を含むベクターが挙げられる。
　哺乳動物細胞内で自律複製するために必要な配列としては、哺乳動物細胞内で機能する複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。
　具体的には、ＥＢＶ由来のベクターについては、複製開始点ｏｒｉＰとＥＢＮＡ－１遺伝子が挙げられる。ＳＶ４０のベクターについては、複製開始点ｏｒｉとＳＶ４０　ｌａｒｇｅ　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎ遺伝子が挙げられる。
　ベクターを細胞に導入する方法としては、例えば、リポフェクション法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法、ウイルスベクター法等が挙げられる。
　エレクトロポレーション法を実施する装置としては、例えばＮＥＰＡ２１（ネッパジーン社）、４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ロンザ社）、Ｎｅｏｎ（サーモフィッシャーサイエンティフック社）、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｘｃｅｌｌ（バイオラッド社）、ＥＣＭ８３９（ＢＴＸ　Ｈａｒｖａｒｄ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ社）等を使用することができる。
　ベクターを細胞に導入する方法として、トランスフェクション用試薬を使用してもよい。トランスフェクション用試薬としては、例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（サーモフィッシャーサイエンティフック社）、ＳｔｅｍＦｅｃｔ（ＳＴＥＭＧＥＮ社）、ＦｕＧＥＮＥ６／ＨＤ（プロメガ社）、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（サーモフィッシャーサイエンティフック社）、ｊｅｔＰＲＩＭＥ　Ｋｉｔ（ポリプラストランスフェクション社）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（オズバイオサイエンス社）、ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ３０００（オズバイオサイエンス社）、リン酸カルシウム法用試薬等を使用可能である。
　続いて、工程（ａ）において、初期化因子を導入した多能性誘導耐性動物の体細胞を、神経幹細胞培養培地で培養する。神経幹細胞培養培地は、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含むことが好ましい。
　神経幹細胞培養培地は、更に、分化抑制因子として、Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）、成長因子として塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含んでもよい。
　ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ－４１５２８６、ＳＢ－２１６７、ｉｎｄｉｒｕｂｉｎ－３’－Ｍｏｎｏｘｉｍｅ、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ等が挙げられるが、これらの中でも特にＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅが好ましい。また、ＧＳＫ阻害剤の培地への添加濃度としては、例えば、０．１～１０μＭ、好ましくは１～３μＭが挙げられる。
　ＴＧＦ－β阻害剤としては、例えば、Ａ８３－０１、ＳＢ－４３１５４２、ＳＢ－５０５１２４、ＳＢ－５２５３３４、ＳＤ－２０８、ＬＹ－３６４９４、ＳＪＮ－２５１１等が挙げられる。これらの中でも、Ａ８３－０１が好ましい。また、ＴＧＦ－β阻害剤の培地への添加濃度としては、例えば、０．１～１０μＭ、好ましくは０．５～１μＭが挙げられる。
　ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、例えば、ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、Ｒａｆ、ＭＯＳ、ｐ２１ｒａｓ、ＧＲＢ２、ＳＯＳ、ＪＮＫ、ｃ－ｊｕｎ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫＫ、ＰＡＫ、ＲＡＣ、ｐ３８等のＭＡＰキナーゼ経路の構成因子を阻害するものであってもよい。
　ＭＡＰキナーゼ阻害剤としては、例えば、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２、ＶＸ－７４５、ＳＢ２０２１９０、アニソマイシン、ＰＤ９８０５９、ＳＢ２０３５８０、Ｕ０１２６、ＡＧ１２６、アピゲニン、ＨＳＰ２５キナーゼ阻害剤、５－ヨードツベルシジン、ＭＡＰキナーゼアンチセンスオリゴヌクレオチド、コントロールＭＡＰキナーゼオリゴヌクレオチド、ＭＡＰキナーゼカスケード阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤セット１、ＭＡＰキナーゼ阻害剤セット２、ＭＥＫ阻害剤セット、オロモウシン（Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）、イソオロモウシン、Ｎ９イソプロピルオロモウシン、ｐ３８　ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２０２４７４、ＳＢ２０２１９０塩酸塩、ＳＢ２０２４７４二塩酸塩、ＳＢ２０３５８０スルホン、Ｉｏｔｏ－ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２２００２５、ＳＣ６８３７６、ＳＫＦ－８６００２、チルホスチン（Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ）ＡＧ　１２６、Ｕ０１２４、Ｕ０１２５、ＺＭ３３６３７２等が挙げられる（例えば、特許第６２１８２２９号公報を参照。）。これらの中でも、ＰＤ０３２５９０１が好ましい。また、ＭＡＰキナーゼ阻害剤の培地への添加濃度としては、例えば、０．０１～１０μＭ、好ましくは０．０３～１μＭが挙げられる。
（工程（ｂ））
　本工程では、工程（ａ）で得られた誘導神経幹細胞様細胞を増殖用培地で培養して誘導多能性幹細胞を得る。
　実施例において後述するように、工程（ａ）で得られた誘導神経幹細胞様細胞を、増殖用培地で培養することにより、誘導多能性幹細胞を得ることができる。増殖用培地としては、ＥＳ細胞を培養するための公知の培地を用いることができるが、これに限定されず、ＥＳ細胞の培養に適した培地であればどのようなものであってもよい。実施例において後述するように、増殖用培地は、ｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）を含んでいてもよい。
　実施例において後述するように、増殖用培地は、２０％　ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び４～１０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦを含む、ダルベッコ改変イーグル培地であってもよい。
［誘導多能性幹細胞］
　１実施形態において、本発明は、上述した製造方法により製造された誘導多能性幹細胞を提供する。
　実施例において後述するように、本実施形態のｉＰＳ細胞は、多能性幹細胞マーカーである、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＬＩＮ２８、ＺＦＰ４２、ＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ４を内在的に発現する。また、本実施形態のｉＰＳ細胞は、内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化することができる。また、本実施形態のｉＰＳ細胞はテラトーマを形成し、分化した腺上皮、血管、軟骨、脂肪細胞、神経細胞に分化することができる。
　本実施形態のｉＰＳ細胞は、上述した初期化因子を体細胞内で発現させることにより製造されている。このため、初期化因子をコードする遺伝子が導入されている場合がある。
　しかしながら、例えばエピソーマルベクター等を用いて遺伝子が導入され、培養の途中で当該遺伝子が除去された場合、初期化因子を検出することは不可能である。
　本実施形態のｉＰＳ細胞と、例えば、ＥＳ細胞とは、遺伝子発現パターン等に相違が存在する可能性がある。しかしながら、そのような相違が存在するか否かは定かではなく、また、そのような相違を特定して、遺伝子発現パターン等により本実施形態のｉＰＳ細胞を特定するためには、著しく多くの試行錯誤を重ねることが必要であり、実質的に不可能である。したがって、本実施形態のｉＰＳ細胞は、上述した製造方法により製造されたことにより特定することが実際的であるといえる。
　上述した初期化因子に加えて、工程（ａ）において、公知のｉＰＳ細胞の樹立効率を改善することのできる効率改善物質を多能性誘導耐性動物の体細胞に接触させることにより、ｉＰＳ細胞を樹立する効率を改善してもよい。
　国際公開２０１５／０５６８０４号に記載されているように、iPS細胞の樹立効率改善物質としては、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸 (VPA)(Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（商標）(Millipore)、HuSH 29mer shRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば5’-azacytidine）（Nat. Biotechnol., 26(7): 795-797 (2008))、G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤［例えば、BIX-01294 (Cell Stem Cell, 2: 525-528 (2008))等の低分子阻害剤、G9aに対するsiRNAおよびshRNA（例、G9a siRNA(human)(Santa Cruz Biotechnology)等）等の核酸性発現阻害剤など］、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644) (Cell Stem Cell, 3, 568-574 (2008))、UTF1(Cell Stem Cell, 3, 475-479 (2008))、Wnt Signaling活性化剤（例えばsoluble Wnt3a）（Cell Stem Cell, 3, 132-135 (2008)）、2i/LIF (2iはmitogen-activated protein kinase signallingおよびglycogen synthase kinase-3の阻害剤、PloS Biology, 6(10), 2237-2247 (2008))、ES細胞特異的miRNA（例えば、miR-302-367クラスター (Mol. Cell. Biol. doi:10.1128/MCB.00398-08)、miR-302 (RNA (2008) 14: 1-10)、miR-291-3p, miR-294およびmiR-295(以上、Nat. Biotechnol. 27: 459-461 (2009))）、3’-phosphoinositide-dependent kinase-1 (PDK1) acitvator（例、PS48 (Cell Stem Cell, 7: 651-655 (2010)) など）、神経ペプチドY（WO 2010/147395）、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）（WO 2010/068955）等が挙げられるが、それらに限定されない。
　上述の工程（ａ）、工程（ｂ）において、体細胞、ｉＮＳＬ細胞、ｉＰＳ細胞を、低酸素条件下で培養することにより、ｉＰＳ細胞の樹立効率を改善してもよい。例えば、細胞を培養する際の雰囲気中の酸素濃度としては、１８％以下の条件を挙げることができる。
［キット］
　１実施形態において、本発明は、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む初期化因子と、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む神経幹細胞培養培地と、を含む、多能性誘導耐性動物の体細胞から誘導多能性幹細胞を製造するためのキットを提供する。
　例えば、本実施形態のキットに付属した初期化因子を多能性誘導耐性動物の体細胞に導入した後、本実施形態のキットに付属した神経幹細胞培養培地で培養することにより、ｉＰＳ細胞を製造することができる。上述したＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤は、製造方法において上述した阻害剤であってもよい。
　上述のキットは、ｂＦＧＦを含む増殖用培地を更に含んでもよい。増殖用培地としては、ＥＳ細胞を培養することのできる培地であれば、どのようなものであってもよく、公知の培地であってもよい。
　本実施形態のキットを用いることにより、多能性誘導耐性動物の体細胞であっても、容易に誘導多能性幹細胞を製造することができる。
　本実施形態のキットに付属した初期化因子は、更に、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される一種以上を含んでもよい。
　初期化因子は、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー、Ｐ５３機能阻害物質、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧを含むことが好ましい。
　上述した初期化因子は、製造方法において上述した、タンパク質又はタンパク質をコードする核酸であってもよい。
　本実施形態のキットに付属したＰ５３機能阻害物質は、製造方法において上述したように、Ｐ５３タンパク質の機能を抑制する物質又はＰ５３遺伝子の発現を抑制する物質であれば、どのようなものであってもよい。
　本実施形態のキットは、初期化因子を発現させるための発現コンストラクト及びＥＢＮＡ－１をコードする核酸を有する非エピソーマルベクターを含んでもよい。発現コンストラクトとしては、製造方法において上述した、プロモーターの下流に初期化因子をコードする遺伝子断片を連結したものが挙げられる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
　なお、実施例の図１～５６中、Ｅ０１Ｆ、Ｅ０２Ｍは、マーモセットの胚性線維芽細胞の株名を意味し、Ｉ５０６１Ｆ、ＣＭ４２１Ｆは、成体マーモセットの線維芽細胞の株名を意味する。また、これらの株名の記載は、ｉＰＳ細胞、ｉＮＳＬ細胞が由来する細胞を意味する場合がある。また、ＥＰ－ＡはＥＰ－Ａベクターセットを意味し、ＥＰ－ＢはＥＰ－Ｂベクターセットを意味する。また、ＥＰ－Ａ、ＥＰ－Ｂの記載は、細胞に導入したベクターセットを意味する場合がある。
［実験例１］
（初期化因子の導入と増殖用培地での培養）
　マーモセットの体細胞に初期化因子を導入した後、得られた細胞を、神経幹細胞培養培地で培養せずに、直接、増殖用培地（ＥＳ細胞培養培地）で培養した。
　まず、次に述べるベクターに挿入された初期化遺伝子発現コンストラクトを準備した。初期化遺伝子は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ｍＰ５３ＤＤ、ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＤＭ４Ｄ、ＧＬＩＳ１である。
　ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌ－ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＫＬＦ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＤＭ４Ｄ、ＧＬＩＳ１はヒトの遺伝子である。ｍＰ５３ＤＤタンパク質は、マウスのＰ５３タンパク質のＣ末端が欠失したドミナントネガティブ体である（Okita K et al., An Efficient Non-viral Method to Generate Integration-Free Human iPS Cells from Cord Blood and Peripheral Blood Cells, Stem Cells, vol.31, 458-466, 2013）。
　マーモセット体細胞に導入した発現コンストラクトを図１、２に示す。発現コンストラクトは、次に述べるような構造を有している。
　ＯＣＴ４を発現するｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４は、ＣＡＧプロモーターの下流にＯＣＴ４遺伝子のＯＲＦを有し、更に、ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ）プロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子（ＥＢＶ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｎｔｉｇｅｎ　１）のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。
　ＳＯＸ２とＫＬＦ４を発現するｐＣＥ－ｈＳＫは、ＣＡＧプロモーターの下流に、ＳＯＸ２のＯＲＦと、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列と、ＫＬＦ４のＯＲＦとを有し、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。
　Ｌ－ＭＹＣとＬＩＮ２８を発現するｐＣＥ－ｈＵＬは、ＣＡＧプロモーターの下流に、Ｌ－ＭＹＣのＯＲＦと、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列と、ＬＩＮ２８のＯＲＦとを有し、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。
　ｍＰ５３ＤＤを発現するｐＣＥ－ｍＰ５３ＤＤは、ＣＡＧプロモーターの下流に、ｍＰ５３ＤＤのＯＲＦと、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。
　ＥＧＦＰを発現するｐＣＸＬＥ－ＥＧＦＰは、ＣＡＧプロモーターの下流にＥＧＦＰのＯＲＦを有し、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。
　ＥＢＮＡ１を発現するｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１は、ＣＡＧプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦを有している。
　ＫＬＦ２とＮＡＮＯＧを発現するｐＣＥ－Ｋ２Ｎは、ＣＡＧプロモーターの下流に、ＫＬＦ２のＯＲＦと、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列と、ＮＡＮＯＧのＯＲＦとを有し、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。
　ＫＤＭ４ＤとＧＬＩＳ１を発現するｐＣＥ－ＫｄＧＩは、ＣＡＧプロモーターの下流に、ＫＤＭ４ＤのＯＲＦと、口蹄疫ウイルスの２Ａ配列と、ＧＬＩＳ１のＯＲＦとを有し、ＥＢＶプロモーターの下流にＥＢＮＡ１遺伝子のＯＲＦと、ＥＢＶの複製起点ＯｒｉＰとを有している。
　ＥＰ－Ａベクターセットは、ｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ｈＳＫ、ｐＣＥ－ｈＵＬ、ｐＣＥ－ｍＰ５３ＤＤ、ｐＣＸＬＥ－ＥＧＦＰ、ｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１からなる。
　ＥＰ－Ｂベクターセットは、ｐＣＥ－ｈＯＣＴ３／４、ｐＣＥ－ｈＳＫ、ｐＣＥ－ｈＵＬ、ｐＣＥ－ｍＰ５３ＤＤ、ｐＣＸＬＥ－ＥＧＦＰ、ｐＣＸＢ－ＥＢＮＡ１、ｐＣＥ－Ｋ２Ｎ、ｐＣＥ－ＫｄＧＩからなる。
　増殖用培地としては、２０％　ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　ｓｅｒｕｍ　ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び４～１０ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦを含む、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）を用いた。増殖用培地の組成を下記表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　マーモセットの胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養せずに、直接、増殖用培地で培養した。結果を図３に示す。
　図３（ａ）は、ＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で４日間培養した細胞を明視野で撮影した写真である。図３（ｂ）は、ＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で４日間培養した細胞のＥＧＦＰの蛍光を撮影した写真である。
　その結果、マーモセット細胞にＥＰ－Ａベクターセットが導入され、マーカーであるＥＧＦＰを発現していることが確認された。
　マーモセットの胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ、Ｅ０２Ｍ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、３０日間、得られた細胞をＥＳ細胞培養用培地で培養した。結果を図４に示す。図４（ａ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で３０日間培養した細胞の写真である。図４（ｂ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ａベクターセットを導入し、増殖用培地で３０日間培養した細胞の写真である。
　その結果、ＥＰ－Ａベクターセットを導入したマーモセット細胞を、神経幹細胞培養培地で培養せずに、直接、ＥＳ細胞培養用培地で培養しても、細胞のコロニー、細胞塊は確認できなかった。この結果から、マーモセット細胞に初期化因子を発現させた後に、ＥＳ細胞培養用培地で培養しても、マーモセットｉＰＳ細胞は形成されないことが明らかになった。
［実験例２］
（初期化因子の導入と神経幹細胞培養培地での培養）
　マーモセット胚性線維芽細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、マーモセット細胞を脱分化させた。
　マーモセット体細胞からｉＰＳ細胞を樹立するための工程を図５に示す。まず、エレクトロポレーションにより、マーモセット体細胞へ初期化因子発現コンストラクトを導入した。続いて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地を用いて、得られた細胞を培養した。
　続いて、フィーダー細胞としてＭＥＦを用いて、得られた細胞を培養した。続いて、得られた細胞を神経幹細胞培養培地で培養した。
　神経幹細胞培養培地としては、ＭＡＰキナーゼ阻害剤（ＰＤ０３２５９０１）、ＧＳＫ３β阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）及びＴＧＦβ阻害剤（Ａ８３－０１）を含む培地を用いた。神経幹細胞培養培地の組成を下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４中、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地は、ＤＭＥＭとＨａｍ’ｓ　Ｆ－１２を１：１で混合した培地である。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地は、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製である。
　マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ、Ｅ０２Ｍ）に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養した。結果を図６に示す。
　図６（ａ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図６（ｂ）は、Ｅ０１ＦにＥＰ－Ｂベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図６（ｃ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図６（ｄ）は、Ｅ０２ＭにＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。
　その結果、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入したマーモセット細胞はいずれも、コロニーを形成することが明らかになった。
　更に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入したマーモセット細胞の、コロニー形成能を算出した。結果を図７に示す。図７は、マーモセット胚性線維芽細胞を用いた場合のコロニー形成能を算出した結果を示すグラフである。
　また、上述のコロニーをアルカリフォスファターゼ染色に供した。結果を図８に示す。図８（ａ）は、Ｅ０１ＦをＥＰ－Ａベクターセットに導入し、神経幹細胞培養培地で培養して得られたコロニーをアルカリフォスファターゼ染色した結果を示す図である。図８（ｂ）は、Ｅ０１ＦをＥＰ－Ｂベクターセットに導入し、神経幹細胞培養培地で培養して得られたコロニーをアルカリフォスファターゼ染色した結果を示す図である。
　その結果、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入したマーモセット細胞のコロニーは、アルカリフォスファターゼ染色により染色されることが明らかになった。
　この結果から、これらのコロニーは、脱分化して、未分化の状態にあることが示唆された。以後、これらのコロニーを形成する細胞を、誘導神経幹細胞様細胞、ｉＮＳＬＣ（ｉｎｄｕｃｅｄ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　ＬＩＫＥ　Ｃｅｌｌ）、ｉＮＳＬ細胞と呼ぶことがある。
［実験例３］
（マーモセットｉＰＳ細胞の樹立）
　マーモセット胚性線維芽細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地（ＥＳ細胞培養培地）で培養し、マーモセットｉＰＳ細胞を樹立した。神経幹細胞培養培地、増殖用培地は、実験例１、２と同一の培地を用いた。
　マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ、Ｅ０２Ｍ）に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入した。続いて、得られた細胞を神経幹細胞培養培地で培養した後に、増殖用培地で培養した。
　結果を図９に示す。図９（ａ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図９（ｂ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０１Ｆ）にＥＰ－Ａベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図９（ｃ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０２Ｍ）にＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。図９（ｄ）は、マーモセット胚性線維芽細胞（Ｅ０２Ｍ）にＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地で培養し、形成されたコロニーの写真である。
　その結果、マーモセット胚性線維芽細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養した後、増殖用培地で培養すると、ＥＳ細胞が形成するコロニーと形状が類似したコロニーが観察された。
　続いて、マーモセットＥＳ細胞（Ｎｏ．４０　ＥＳＣ）、上述のマーモセットｉＰＳ細胞（Ｅ０１Ｆ由来の、Ａ－２－２、Ａ－２－６、Ａ－２－７、Ｅ０２Ｍ由来の、Ｂ－０－６、Ｂ－０－７、Ｂ－０－１１）のコロニーについて、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、抗ＴＲＡ－１－６０抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体を用いた免疫染色に供した。ＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ４は、ＥＳ細胞において発現する遺伝子である。結果を図１０に示す。
　図１０は、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、これらのマーモセットｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様に、ＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ４を発現することが明らかになった。
　続いて、上述したマーモセットｉＰＳ細胞のコロニーを、アルカリフォスファターゼ染色に供した。結果を図１１に示す。図１１は、マーモセットｉＰＳ細胞をアルカリフォスファターゼ染色に供した結果を示す図である。その結果、これらのコロニーは、未分化細胞と同様に、アルカリフォスファターゼ染色により染色されることが明らかになった。
　続いて、上述したマーモセットｉＰＳ細胞のコロニーを、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色、抗ＯＣＴ４抗体、抗ＮＡＮＯＧ抗体を用いた免疫染色に供した。結果を図１２に示す。図１２は、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、ＥＳ細胞と同様に、これらマーモセットｉＰＳ細胞のコロニーは、ＯＣＴ４とＮＡＮＯＧを発現することが明らかになった。
　続いて、上述したマーモセットｉＰＳ細胞、マーモセットＥＳ細胞（Ｎｏ．４０、ＤＳＹ１２７）、マーモセット胚性線維芽細胞について、内在性のＯＣＴ４、内在性のＮＡＮＯＧ、内在性のＳＯＸ２、内在性のＫＬＦ４遺伝子の発現、ＺＦＰ４２遺伝子（Ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　４２）、ＤＰＰＡ遺伝子（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　２）、ＴＥＲＴ遺伝子（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）の発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図１３、図１４に示す。
　図１３、図１４は、マーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、マーモセットｉＰＳ細胞は、マーモセットＥＳ細胞と同様に、内在的に、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＤＲＰＡ５、ＺＦＰ４２、ＴＥＲＴ遺伝子を発現することが明らかになった。
　続いて、マーモセットｉＰＳ細胞に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットに含まれるベクターが残存しているか否かをＰＣＲ法により解析した。結果を図１５に示す。図１５は、マーモセットｉＰＳ細胞における、発現ベクターの有無を解析した結果を示す図である。
　その結果、Ｅ０１Ｆ　Ａ－２－２　ｉＰＳＣ、Ｅ０１Ｆ　Ａ－２－３　ｉＰＳＣ、Ｅ０１Ｆ　Ａ－２－５　ｉＰＳＣ、Ｅ０１Ｆ　Ａ－２－６　ｉＰＳＣ、Ｅ０１Ｆ　Ａ－２－７　ｉＰＳＣ、Ｅ０２Ｍ　Ｂ－０－６　ｉＰＳＣ、Ｅ０２Ｍ　Ｂ－０－７　ｉＰＳＣについては、細胞内にＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットが残存していないことが明らかになった。
　以上の結果から、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入したマーモセット細胞を、神経幹細胞培養培地で培養した後に、増殖用培地で培養すると、ベクターセットを失っても、ＥＳ細胞のマーカー遺伝子が発現することが明らかになった。
［実験例４］
（マーモセットｉＰＳ細胞の多能性）
　実験例３で得られたマーモセットｉＰＳ細胞を、内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化させて、各胚葉のマーカー遺伝子の発現を解析し、マーモセットｉＰＳ細胞の多能性を検証した。
　まず、マーモセットｉＰＳ細胞（Ａ－２－２、Ａ－２－６、Ａ－２－７、Ｂ－０－７）を、浮遊培養して、各胚葉に分化させた。
　続いて、内胚葉についてはＡｌｐｈａ－ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＦＰ）、中胚葉についてはα－Ｓｍｏｏｔｈ　ｍｕｓｃｌｅ　ａｃｔｉｎ（αＳＭＡ）、外肺葉についてはＭｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　２（ＭＡＰ２）、βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎの発現を、各タンパク質に対する抗体を用いて解析した。また、同時に、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色も行った。結果を図１６に示す。
　図１６は、マーモセットｉＰＳ細胞から分化させた三胚葉における、マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、マーモセットｉＰＳ細胞から形成された各胚葉は、各胚葉に特徴的なマーカー遺伝子を発現していることが明らかになった。
　また、マーモセットｉＰＳ細胞から形成された胚様体を、ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ培地（ＫＳＲ培地）又はウシ胎児血清を１０％含む培地を用いて、２週間又は４週間培養した後の、ＡＦＰの発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図１７、１８に示す。
　図１７は、ＫＳＲ培地で培養したマーモセットｉＰＳ細胞が発現するＡＦＰの発現を解析した結果を示す図である。図１８は、ＦＢＳを含む培地で培養したマーモセットｉＰＳ細胞におけるＡＦＰの発現を解析した結果を示す図である。
　図１７、１８中、ＥＢは胚様体を示し、２ｗは２週間後を示し、４ｗは４週間後を示す。その結果、マーモセットｉＰＳ細胞から形成された胚様体は、ＡＦＰを発現することが明らかになった。
　さらに、得られたマーモセットｉＰＳ細胞（Ａ－２－２、Ａ－２－７、Ｂ－０－７）を免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）の精巣に注入し、２～３か月後に、精巣内に形成されたテラトーマを摘出し、内胚葉、中胚葉、外胚葉から分化した組織を観察した。
　より具体的には、内胚葉から分化した腺上皮、中胚葉から分化した血管、軟骨、脂肪細胞については、ヘマトキシリン－エオシン染色（ＨＥ染色）により観察し、外胚葉から分化した神経細胞については、ＨＥ染色、ニューロフィラメント　２００ｋＤａに対する抗体による免疫染色により観察した。結果を図１９に示す。
　図１９は、マーモセットｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマを解析した結果を示す図である。その結果、テラトーマには、分化した腺上皮、血管、軟骨、脂肪細胞、神経細胞が形成されることが明らかになった。
［実験例５］
（成体マーモセット細胞からのｉＰＳ細胞の樹立）
　成体のマーモセットの線維芽細胞に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養し、ｉＮＳＬ細胞を樹立した。さらに、得られたｉＮＳＬ細胞を増殖用培地で培養することにより、ｉＰＳ細胞を樹立した。
　成体マーモセットの線維芽細胞（Ｉ５０６１Ｆ、ＣＭ４２１Ｆ）を用いて、上述した方法により、マーモセットｉＮＳＬ細胞を樹立した。結果を図２０に示す。図２０は、成体マーモセットの線維芽細胞由来の、ｉＮＳＬ細胞の写真である。
　その結果、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞は、細胞塊及びコロニーを形成することが明らかになった。
　続いて、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞の、コロニー形成能を算出した。結果を図２１に示す。図２１は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞のコロニー形成能を示す図である。
　図２１中、「＋ＶＰＡ」は、２日間、ヒストン脱アセチル化阻害剤（Ｖａｌｐｒｏｉｃ　Ａｃｉｄ）を加えたことを示す。その結果、成体マーモセットの線維芽細胞から、再現性良くｉＮＳＬ細胞を樹立できることが明らかになった。
　続いて、上述のｉＮＳＬ細胞について、アルカリフォスファターゼ染色を行った。結果を図２２に示す。図２２は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞の、アルカリフォスファターゼ染色の結果を示す図である。
　その結果、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞は、アルカリフォスファターゼを発現することが明らかになった。すなわち、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＮＳＬ細胞は未分化性を有していることが明らかになった。
　続いて、実験例３と同様に、上述のｉＮＳＬ細胞を増殖用培地で培養してマーモセットｉＰＳ細胞を得た。結果を図２３に示す。図２３は、成体マーモセットの線維芽細胞由来の、マーモセットｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。その結果、増殖用培地で培養されたマーモセットｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞のコロニーと類似したコロニーを形成することが明らかになった。
　続いて、得られたマーモセットｉＰＳ細胞を、アルカリフォスファターゼ染色に供した。結果を図２４に示す。図２４は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のｉＰＳ細胞の、アルカリフォスファターゼ染色の結果を示す図である。その結果、樹立したマーモセットｉＰＳ細胞は、未分化であることが示唆された。
　続いて、得られたマーモセットｉＰＳ細胞を、抗ＴＲＡ－１－６０抗体、抗ＳＳＥＡ４抗体を用いて免疫染色した。同時に、Ｈｏｅｃｈｓｔを用いて染色を行った。結果を図２５に示す。
　図２５は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、得られたマーモセットｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様に、ＴＲＡ－１－６０、ＳＳＥＡ４を発現することが明らかになった。
　続いて、得られたマーモセットｉＰＳ細胞について、内在性の、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８遺伝子の発現、ＺＦＰ４２遺伝子、ＤＰＰＡ遺伝子、ＴＥＲＴ遺伝子の発現を、ｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図２６～２９に示す。
　図２６～２９は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、得られたマーモセットｉＰＳ細胞は、マーモセットＥＳ細胞と同様に、上述の遺伝子を発現することが明らかになった。
　続いて、得られたマーモセットｉＰＳ細胞を、実験例４と同様の方法により、内胚葉、中胚葉、外胚葉に分化させて、各胚葉のマーカー遺伝子の発現を解析した。
　続いて、内胚葉についてはＡＦＰ、中胚葉についてはαＳＭＡ、外肺葉についてはＭＡＰ２、βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎの発現を、各タンパク質に対する抗体を用いて解析した。また、同時に、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色も行った。結果を図３０、３１に示す。
　図３０、図３１は、成体マーモセット線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞から分化した三胚葉における、マーカーの発現を解析した結果を示す図である。その結果、得られたマーモセットｉＰＳ細胞から分化して形成された各胚葉は、各胚葉に特徴的なマーカー遺伝子を発現していることが明らかになった。
　さらに、得られたマーモセットｉＰＳ細胞から、実験例４と同様に、テラトーマを作製し、内胚葉、中胚葉、外胚葉から分化した組織を観察した。内胚葉から分化した腺上皮、中胚葉から分化した血管については、ＨＥ染色により観察し、外胚葉から分化した神経細胞については、ＨＥ染色、ニューロフィラメント　２００ｋＤａに対する抗体による免疫染色により観察した。結果を図３２に示す。
　図３２は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞から形成されたテラトーマを解析した結果を示す図である。その結果、テラトーマには、分化した腺上皮、血管、神経細胞が形成されることが明らかになった。
　また、得られたマーモセットｉＰＳ細胞について、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットに含まれるベクターが残存しているか否かをＰＣＲ法により解析した。結果を図３３に示す。
　図３３は、成体マーモセットの線維芽細胞由来のマーモセットｉＰＳ細胞にベクターが残存するか解析した結果を示す図である。その結果、得られたマーモセットｉＰＳ細胞には、ベクターが残存していないことが明らかになった。
［実験例６］
（ｉＮＳＬ細胞の遺伝子発現パターンの解析）
　マーモセットの胚性線維芽細胞又は成体マーモセットの線維芽細胞に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養し、誘導神経幹細胞様細胞（ｉＮＳＬ細胞）を得た。得られたｉＮＳＬ細胞の、遺伝子発現パターン及び神経細胞への分化能を解析した。
　まず、マーモセットの胚性線維芽細胞に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ａベクターセットを導入した後、神経幹細胞培養培地で培養した。結果を図３４に示す。図３４は、マーモセットｉＮＳＬ細胞の写真である。その結果、ｉＮＳＬ細胞が得られたことが確認された。
　続いて、得られたｉＮＳＬ細胞に、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットが残存しているか否かをＰＣＲ法により解析した。結果を図３５に示す。図３５は、ｉＮＳＬ細胞において残存するベクターを解析した結果を示す図である。
　その結果、ベクターセットの導入後に、１０回継代したｉＮＳＬ細胞には、ＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットが残存していることが明らかになった。
　続いて、得られたｉＮＳＬ細胞の遺伝子発現パターンをｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図３６、図３７に示す。図３６は、ｉＮＳＬ細胞の、内在性の、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＫＬＫＦ４、ＺＦＰ４２の発現を解析した結果を示す図である。図３７は、ｉＮＳＬ細胞の、ＤＰＰＡ５及びＴＥＲＴの発現を解析した結果を示す図である。
　その結果、得られたｉＮＳＬ細胞は、ＳＯＸ２、ＴＥＲＴを内在的に発現するが、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＺＦＰ４２、ＤＰＰＡ５を内在的に発現していないことが明らかになった。
　続いて、得られたｉＮＳＬ細胞の、内在性遺伝子発現と、外来性（ベクターセットによる遺伝子発現）遺伝子発現を合わせた遺伝子発現量をｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。図３８は、ｉＮＳＬ細胞の、内在性及び外来性の、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８の発現を解析した結果を示す図である。
　その結果、内在性遺伝子発現と、外来性遺伝子発現を合わせた遺伝子発現量では、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、Ｌｉｎ２８は発現しているが、ＮＡＮＯＧは発現していないことが明らかになった。
　続いて、得られたｉＮＳＬ細胞について、神経幹細胞のマーカーであるＰＡＸ６（Ｐａｉｒｅｄ　ｂｏｘ　６）、ＳＯＸ１（Ｓｒｙ－ｔｙｐｅ　ＨＭＧ　ｂｏｘ　１）、ＺＦＰ５２１（Ｚｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５２１）の発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図３９、図４０に示す。
　図３９は、ｉＮＳＬ細胞におけるＰＡＸ６の発現を解析した結果を示す図である。図４０は、ｉＮＳＬ細胞における、ＳＯＸ１とＺＦＰ５２１の発現を解析した結果を示す図である。その結果、マーモセットＥＳ細胞にはＰＡＸ６は発現しないが、得られた誘導神経幹細胞はＰＡＸ６、ＳＯＸ１、ＺＦＰ５２１を発現することが明らかになった。
　続いて、得られた誘導神経幹細胞について、中胚葉マーカーであるＴ（ＴＢＸ　Ｔ）、内胚葉マーカーであるＳＯＸ１７（Ｓｒｙ－ｔｙｐｅ　ＨＭＧ　ｂｏｘ　１７）の発現をｑＲＴ－ＰＣＲにより解析した。結果を図４１に示す。
　図４１は、ｉＮＳＬ細胞における、ＴとＳＯＸ１７の発現を解析した結果を示す図である。その結果、Ｔ及びＳＯＸ１７は、マーモセットＥＳ細胞においては発現するが、得られた誘導神経幹細胞においては発現しないことが確認された。
　続いて、マーモセットＥＳ細胞、マーモセットｉＰＳ細胞、マーモセット誘導神経幹細胞について、ｕｎｂｉａｓｅｄ　ｎｅｕｒｏｎａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙにより、神経幹細胞への分化能を解析した。図４２は、神経分化アッセイのスケジュールである。具体的には、浮遊培養を７日間行った後、接着培養を７日間行った。結果を図４３、図４４に示す。
　図４３は、得られた誘導神経幹細胞から分化した細胞を、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色及び抗βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎ抗体により免疫染色した結果を示す図である。その結果、得られた誘導神経幹細胞から分化した細胞は、神経細胞に分化していることが明らかになった。
　図４４は、神経細胞に分化した細胞のうち、βＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎの発現が認められた細胞の割合を示すグラフである。その結果、マーモセットＥＳ細胞、マーモセットｉＰＳ細胞から分化した細胞はβＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎを発現しないが、マーモセット誘導神経幹細胞から分化した細胞はβＩＩＩ－ｔｕｂｕｌｉｎを発現することが明らかになった。
　以上の結果から、マーモセットの成体の線維芽細胞にＥＰ－Ａベクターセット又はＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、神経幹細胞培養培地で培養して得られたｉＮＳＬ細胞は、神経幹細胞の形質を獲得することが明らかになった。
　また、ｉＮＳＬ細胞を、増殖用培地へ移さずに神経幹細胞培養培地で培養し続けると、ｉＮＳＬ細胞はベクターを保持し続けているにもかかわらず、神経幹細胞の形質を保持し、ＥＳ細胞の形質を獲得しないことが明らかになった。
　この結果から、多能性誘導耐性動物の成体の体細胞から直接にｉＰＳ細胞を作製することはできないが、一度、神経幹細胞へ脱分化させた後に、さらにｉＰＳ細胞に脱分化させることは可能であることが明らかになった。
［実験例７］
（マーモセットｉＰＳ細胞とｉＮＳＬ細胞の遺伝子プロファイリング）
　マーモセットの、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ｉＮＳＬ細胞の遺伝子発現プロファイルについてクラスタリング解析を行った。
　マーモセットの、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、ｉＮＳＬ細胞について、網羅的遺伝子発現プロファイルに基づいて、クラスタリング解析を行った。結果を図４５に示す。その結果、マーモセットｉＰＳ細胞はマーモセットＥＳ細胞と類似性が高く、マーモセットｉＮＳＬ細胞はマーモセット線維芽細胞と類似性が高いことが明らかになった。
　続いて、各クラスターの類似性を反映している４０遺伝子について、各細胞における発現量を解析した。結果を図４６に示す。その結果、マーモセットｉＰＳ細胞とマーモセット誘導神経幹細胞とで、発現量に特徴がある遺伝子を抽出することができた。
　各細胞の遺伝子発現プロファイルについて、主成分分析を行った。結果を図４７に示す。その結果、各細胞は、線維芽細胞、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞、並びに、誘導神経幹細胞のグループに分けられることが明らかになった。
［実験例８］
（イヌｉＰＳ細胞の樹立）
　イヌの線維芽細胞に、ＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、イヌｉＰＳ細胞を樹立した。
　結果を図４８に示す。図４８は、イヌｉＰＳ細胞が形成したコロニーの写真である。その結果、イヌｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞が形成するコロニーと類似したコロニーを形成することが明らかになった。
　得られたイヌｉＰＳ細胞について、ＥＳ細胞のマーカーの発現を解析した。結果を図４９に示す。図４９は、イヌｉＰＳ細胞における、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの発現をＲＴ－ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。
　その結果、イヌｉＰＳ細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧを発現することが明らかになった。すなわち、イヌｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と類似した形質を有することが示唆された。
　イヌｉＰＳ細胞を免疫不全マウス（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）の精巣に注入し、２～３か月後に、精巣内に形成されたテラトーマを摘出して、テラトーマを観察した。結果を図５０に示す。
　得られたテラトーマを、ヘマトキシリン・エオシン染色に供して、各組織を観察した。結果を図５１に示す。図５１は、骨、軟骨、神経細胞、網膜、皮脂腺、毛包上皮、腺組織を解析した結果を示す図である。
　得られたイヌｉＰＳ細胞に導入したベクターが残存しているか否かをＰＣＲ法により解析した。結果を図５２に示す。その結果、イヌｉＰＳ細胞には発現ベクターは残存していないことが確認された。
［実験例９］
（ブタｉＰＳ細胞の樹立）
　ブタの線維芽細胞に、ＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、ブタｉＮＳＬ細胞及びブタｉＰＳ細胞を樹立した。
　図５３は、得られたブタｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。ブタｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞が形成するコロニーと類似したコロニーを形成することが明らかになった。
　続いて、ブタｉＰＳ細胞とブタｉＮＳＬ細胞における、ＲＴ－ＰＣＲによりＥＳ細胞のマーカーの発現を解析した。図５４は、ブタｉＮＳＬ細胞及びブタｉＰＳ細胞における、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの発現を解析した結果を示す図である。
　その結果、ブタｉＰＳ細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧを発現することが明らかになった。また、ブタｉＮＳＬ細胞はＳＯＸ２を発現することが明らかになった。
［実験例１０］
（フェレットｉＰＳ細胞の樹立）
　フェレットの線維芽細胞に、ＥＰ－Ｂベクターセットを導入し、フェレットｉＮＳＬ細胞及びフェレットｉＰＳ細胞を樹立した。
　図５５は、得られたフェレットｉＰＳ細胞のコロニーの写真である。フェレットｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞が形成するコロニーと類似したコロニーを形成することが明らかになった。
　続いて、フェレットｉＰＳ細胞における、ＥＳ細胞のマーカーの発現を解析した。図５６は、フェレットｉＮＳＬ細胞及びフェレットｉＰＳ細胞における、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧの発現をＲＴ－ＰＣＲにより解析した結果を示すである。
　その結果、フェレットｉＰＳ細胞は、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧを発現することが明らかになった。また、フェレットｉＮＳＬ細胞はＳＯＸ２を発現することが明らかになった。
　本発明によれば、哺乳動物の体細胞から、ｉＰＳ細胞を樹立する新たな技術を提供することができる。

Claims (9)

  1. 　哺乳動物の体細胞に初期化因子を導入し、神経幹細胞培養培地で培養して誘導神経幹細胞様細胞を得る工程と、
    　前記誘導神経幹細胞様細胞を増殖用培地で培養して誘導多能性幹細胞を得る工程と、を含み、
    　前記初期化因子が、ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む、誘導多能性幹細胞の製造方法。
  2. 　前記初期化因子が、更に、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される一種以上を含む、請求項１に記載の誘導多能性幹細胞の製造方法。
  3. 　前記体細胞が成体由来である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記神経幹細胞培養培地が、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　前記増殖用培地が、ｂＦＧＦを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法により製造された、誘導多能性幹細胞。
  7. 　ＯＣＴファミリー、ＳＯＸファミリー、ＫＬＦファミリー、ＭＹＣファミリー、ＬＩＮ２８ファミリー及びＰ５３機能阻害物質を含む初期化因子と、
    　ＭＡＰキナーゼ阻害剤、ＧＳＫ３β阻害剤及びＴＧＦβ阻害剤を含む神経幹細胞培養培地と、を含む、
    　多能性誘導耐性動物の体細胞から誘導多能性幹細胞を製造するためのキット。
  8. 　前記初期化因子が、更に、ＫＤＭファミリー、ＧＬＩＳファミリー及びＮＡＮＯＧからなる群より選択される一種以上を含む、請求項７に記載のキット。
  9. 　ｂＦＧＦを含む増殖用培地を更に含む、請求項７又は８に記載のキット。
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