JP2018514220A - プライム型多能性幹細胞のナイーブ型多能性幹細胞への復帰 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年5月5日に出願された、米国仮出願第62/157,411号、及び2015年11月16日に出願された、米国仮出願第62/255,990号に対する優先権を主張し、それらの全内容は参照により本明細書に組み込まれ、依拠する。
本明細書で使用されるとき、以下の用語は以下の意味を有する。
「約」という用語は、数値指定、例えば、範囲を含む、温度、時間、量、濃度などの前に使用されるとき、(+)または(−)10%、5%、または1%変動し得る近似を示す。
本発明は、薬剤の特定のカクテルが基本培地を補足し、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞(PSC)に復帰できるという発見に基づく。
復帰培地
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本開示は、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に復帰させ、かつ/またはPSCをナイーブ状態に維持するための細胞培養培地を提供する。本明細書で使用されるとき、プライム型PSCをナイーブ型PSCに復帰させ、かつ/またはPSCをナイーブ状態に維持するための細胞培養培地は、「復帰培地」と称され得る。
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本開示は、プライム型多能性幹細胞を培養するための細胞培養培地を提供する。本明細書で使用されるとき、プライム型PSCを培養するための細胞培養培地は、「プライム培地」と称され得る。
本開示のプライム型PSC及びナイーブ型PSCは、当該技術分野で既知の任意の条件下で培養され得る。例えば、任意の成長物質、例えば、とりわけ、フィーダー細胞(例えば、マウス胚性フィーダー(MEF)及びマウスLIF及びネオマイシン耐性(SNL)で形質転換されたマウス線維芽細胞STO細胞)、細胞外基質(例えば、Matrigel(登録商標)、Cultrex(登録商標)BME PathClear、Geltrex(登録商標))、ゼラチン、コラーゲン、ポリ−リジン、ポリ−オルニチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、またはラミニンが使用され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、フィブロネクチン層上で培養される。いくつかの実施形態では、ラミニンは、ラミニン−511、例えば、組換えラミニン−511)(iMatrix,Clontech,Mountain View,CA,USA)である。好ましい一実施形態では、細胞は、無フィーダー条件下で培養される。
本開示を読めば当業者には明らかであるように、本開示は、ナイーブ型多能性幹細胞を誘導する方法を提供する。一態様では、本開示は、有効量のリゾホスファチジン酸受容体(LPAR)のアゴニストを含む培養培地中でプライム型多能性幹細胞を培養し、それにより、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に復帰させることを含む、ナイーブ型多能性幹細胞を誘導するための方法を提供する。
本開示の方法は、体細胞(例えば、線維芽細胞)のiPSCへのリプログラミング効率を改善するための、復帰培地、プライム培地、またはこれらの両方の使用も企図する。いくつかの実施形態では、復帰培地、プライム培地、またはこれらの両方を使用することにより、iPSCを発生させるための従来の方法の因子を少なくできることが企図される。リプログラミングの方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Takahashi et al.,(2007)Cell 131(5):861−872、Yu et al.,(2007)Science 318(5858):1917−1920、Shi et al.,(2008)Cell Stem Cell 2(6):525−528、Nakagawa et al.,(2008)Nat.Biotechnol.26(1):101−106、Okita et al.(2013)Stem Cells 31(3):458−466を含む。
また、(a)プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に復帰させるための細胞培養培地であって、この培地はLPARのアゴニストを含む、細胞培養培地と、(b)指示書と、を含むキットも開示される。いくつかの実施形態では、キットは、(b)bFGF、アクチビンA、トランスフォーミング成長因子β(TGF−β)、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、単離されたナイーブ型多能性幹細胞をさらに含む。他の実施形態では、キットは、単離されたプライム型多能性幹細胞をさらに含む。
体細胞リプログラミング中、ヒトXiはSNLフィーダー細胞上でリプログラミングされたhiPSCにおいて確実に再活性化される。この結果は、SNLフィーダー培養条件がXi再活性化を誘導する因子を含有することを示唆する。まず、リプログラミング中のXiの促進された再活性化がXaXiであるマウスEpiSCのXi再活性化も促進したかどうかを決定した。緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子が異なる培地においてX染色体上に位置するX−GFP mEpiSCリポーター系の培養結果は、蛍光顕微鏡によりアッセイされた。Gillich et al.,(2012)Cell Stem Cell 10(4):525−439、Bao et al.,(2009)Nature 461(7268):1292−1295。Xi−GFP mEpiSCは、Azim Surani博士及びSiqin Bao博士の好意により提供され、N2B27基本培地(StemCells Inc(Palo Alto,CA,USA)、そして後に20ng/mlのアクチビンA(R&D systems(Minneapolis,MN,USA)及び12ng/mlのbFGF(Millipore(Billerica,MA,USA))で補足されたClontech(Mountain View,CA,USA)からのNdiff 227培地)において、フィブロネクチン(Sigma,St.Louis,MO,USA)コーティングされたプレート(無フィーダー条件)上で慣例的に維持された。細胞は、アキュターゼ(Millipore(Billerica,MA,USA))で剥離/掻爬及び解離された後、前の培養からの1:20希釈で2〜3日毎に継代された。
アクチビンA及びbFGFはmEpiSCにおいてプライム型多能性を維持するために必要であり、それらは、LIF−媒介Xi再活性化を拮抗するMEF−CM活性の候補であり得ることを示唆する。前の実験で使用された全ての非CM培地はbFGFで補足されたため、最初の焦点はアクチビンAの潜在的な役割に対してであった。示される培地中のLIF及びアクチビンAの濃度はELISAを使用して決定された。マウスLIFが使用され、製造業者の指示に従い、ヒト/マウス/ラットアクチビンA Quantikine ELISAキット(R&D Systems(Minneapolis,MN,USA))が使用された。MEF−CMは11ng/mlのアクチビンAを含有し、一方、SNL−CMはただ1ng/mlのアクチビンAを含有することが分かった(図2、パネルA)。この因子がXi再活性化に影響を与えるかどうかを検査するために、SNL−CMまたはLIFを含有する非CMを使用して、LIF媒介Xi再活性化に対する外因性アクチビンAの添加の作用を評価した。アクチビンAの添加がSNL−CM及び非CM+LIFの両方においてGFP+クラスターの数を大幅に低減したことが分かった(図2、パネルB)。
Xi再活性化を効率的に誘導しなかった培地とは対照的に、最大Xi再活性化を産生したSNL−CM及び非CM+LIFの2つの培地は両方とも、アスコルビン酸及びKSRからの脂質混合物を含有する(Garcia−Gonzalo et al.,PLoS One 3(1):e1384)(図3、パネルA)。したがって、これらの小分子でN2B27培地を補足することにより、アスコルビン酸及び脂質混合物がXi再活性化を促進する能力を有するかどうかを検査した。アスコルビン酸だけでなく、脂質混合物の添加が、LIFのみと比較してGFP/CD31二重陽性細胞の%を増加させたことが分かった(図3、パネルC)。したがって、両方の構成成分は、LIF誘導Xi再活性化に対して正の作用を有する。
Xi−GFP mEpiSCをアキュターゼで単一細胞懸濁液中に解離し、転換実験を開始する1日前に、単一細胞を、2つの異なる細胞密度(20,000細胞または3,000細胞/ウェルの6ウェルプレート)のアクチビンA及びbFGF含有培地において、フィブロネクチンコーティングされたプレート上に播種した。播種の24時間後、陰性対照として新しいプライム培地を補充するか、またはナイーブ培地に交換した。アッセイ培地を24時間毎に交換し、GFP蛍光を顕微鏡検査で8(20,000開始細胞)〜13日(3,000開始細胞)間毎日チェックした。
ナイーブ型多能性遺伝子発現パターンの確立時期を決定するために、逆転写及び定量的ポリメラーゼ連鎖反応(RT−qPCR)を使用して、主要な多能性転写因子KLF2、KLF4、PRDM14及びNANOGのRNAレベルを検査した(Gillich et al.,(2012)Cell Stem Cell 10(4):425−429、Guo et al.,(2009)Development 136(7):1063−1069、Silva et al.,(2009)Cell 138(4):722−737)。Xi−GFP mEpiSCをLBAO培地中で培養し、培養の2日目から24時間毎にRNAの回収を始めた。KLF2、KLF4、及びPRDM14は、未処理のXi−GFP mEpiSCと比較して強く上方調節されたが、それらの速度は異なった(図5、パネルA)。KLF2及びKLF4は、2日目にほぼ最大レベルに達した(図5、パネルA)。PRDM14は、2〜3日目まで誘導されず、4日目に最大レベルに達した(図5、パネルA)。対照的に、NANOGは、Xi−GFP mEpiSCにおいて高い発現を示し、LBAOによる処理の2日目に一過性の減少を示した(図5、パネルA)。まとめると、これらのデータは、LBAO培地がKLF2、KLF4、及びPRDM14の発現を確実に誘導することを示す。GFP+CD31+細胞は5日目以降に出現するため(図(5、パネルB)、ナイーブ型多能性に関連する転写因子の発現は、CD31+GFP+細胞の出現に先行した。したがって、転写因子の誘導は、ナイーブ型多能性への転換に必須であり得る。
ヒトH9 hESC及び雌iPSC(集合的に「ヒトPSC」と称される)は、7日間プライム培地中で培養され、培地は毎日交換される。翌日、プライム培地を復帰培地に交換する。ヒトPSCを復帰培地中で14日間培養する。14日目までに、ヒトPSCの一部は核においてatrx及びtsixの両方の2つの新規転写産物フォーカスを発現し、それらがXaXaであることを示唆することが企図される。加えて、復帰ヒトPSCは多能性マーカー遺伝子を発現するが、mESC中の分化マーカー遺伝子と類似するレベルで、それらを抑止することが企図される。最後に、Gafni et al.,(2013)Nature 504(7479):282−286及びTakashima et al.,(2014)Cell 158(6):1254−1269に記載されるように、プライム型ヒトPSCとは対照的に、ヒト−マウスキメラ胚は復帰ヒトPSCのマウス胚盤胞への注入後に容易に得られることが企図される。
ヒト線維芽細胞は正常な線維芽細胞培地(DMEM中10%FBS)中で培養される。線維芽細胞の拡大後、線維芽細胞は、Okita et al.(2013)Stem Cells 31(3):458−466により記載される方法を使用して、エピソームリプログラミングベクターをヌクレオフェクト(nucleofecting)することにより、iPSCにリプログラミングされる。線維芽細胞培地におけるヌクレオフェクションの数日後、ヌクレオフェクトされた細胞をナイーブ培地に移し、3〜4週間培養する。線維芽細胞がナイーブ培地対従来の培地においてリプログラミング及び維持されるときに観察されたリプログラミング効率において100倍増加することが企図される。加えて、ナイーブ培地において誘導されたiPSCはより未分化の表現型を呈することが企図される。これらのデータは、LBAOが直接的なリプログラミングならびにナイーブ型iPSCを効率的に誘導するブースターとして機能することを示唆する。
マウスESC及びiPSCとは対照的に、大半のヒトESC及びiPSCは、XCI状態、コロニー形態、ならびにKLF4、TFCP2L1、及びTBX3などのマーカー遺伝子発現によりアッセイされたとき、プライム状態にある。LPA処理はマウス多能性細胞においてプライム状態からナイーブ状態への転換を刺激したため、次に、この生理活性脂質がヒト細胞においてナイーブ型多能性を促進し得るかどうかが決定された。ヒトiPSC(hiPSC)のための従来の培養方法は、線維芽細胞成長因子(bFGF)及びトランスフォーミング成長因子ベータ(TGF−β)またはアクチビンA(ActA)の成長培地への添加により多能性状態にhiPSCを維持し、これらの因子の除去は分化をもたらす。
ヒトiPSCは、Okita et al.(2011)Nature Methods 8(5):409−412により記載される方法を使用して、p52に対してOct4、Sox2、Klf4、myc、Lin28、及びshRNAを発現するエピソームベクターにより発生された。StemFit基本培地(またはmTeSR orE8)にbFGF及びTGF−βを含有するプライム培地中でhiPSCを成長させた。次に、プライム型hiPSCは復帰培地に切り替えられ、低酸素条件下で、ラミニン−511上で培養された。復帰培地は、様々な濃度の脂質(2μM OMPT、1μM OMPT、1μM OMPT+20nM LPA、または脂質なし)と共に、StemFit基本培地に、10ng/mLのLIF、10ng/mLのアクチビンA、100ng/mLのbFGF、1μM PD0325901 MEK阻害剤、1μM CHIR99021 GSK3β阻害剤、及び2mM N−アセチルシステインを含有した。5〜7日後、ナイーブ型多能性幹細胞に特有の3次元ドーム型コロニーが観察された。脂質(OMPTまたはOMPT/LPA)の存在下で成長したヒトiPSCは、1ヶ月を超えて3次元ドーム型コロニーを維持し(およそ5回の継代)、一方、脂質の不在下で培養された対照細胞は、プライム型多能性幹細胞に特有の平坦なコロニーを呈した(図7)。ナイーブ型細胞は、ナイーブ型ヒト多能性幹細胞のNANOG、KLF4、KLF17、及びTFCP2L1マーカーも発現した(図9)。これらのデータは、追加のリプログラミング因子の不在下でさえ、脂質OMPT及びLPAがプライム型hiPSCをナイーブ型hiPSCに復帰させ、ナイーブ型多能性状態を維持できることを示唆する。
Claims (55)
- ナイーブ型多能性幹細胞の誘導方法であって、有効量のリゾホスファチジン酸受容体(LPAR)のアゴニストを含む培養培地中でプライム型多能性幹細胞を培養し、それにより、前記プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に復帰させることを含む、方法。
- ナイーブ型多能性幹細胞の、そのナイーブ状態での維持方法であって、有効量のLPARのアゴニストを含む培養培地中で前記ナイーブ型多能性幹細胞を培養することを含む、方法。
- 前記培地が、有効量の骨形成タンパク質(BMP)、酸化防止剤、または脱メチル化酵素のうちの1つ以上をさらに含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記培養培地が、有効量のシグナル伝達兼転写活性化因子3(STAT3)をさらに含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記STAT3活性化因子が、白血病抑制因子(LIF)である、請求項4に記載の方法。
- 前記LPARのアゴニストが、1−オレオイル−2−メチル−sn−グリセロ−3−ホスホチオネート(OMPT)、リゾホスファチジン酸(LPA)、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記有効量の前記LPARのアゴニストが、約10nM〜約5μMである、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記酸化防止剤が、n−アセチルシステインである、請求項3に記載の方法。
- 前記脱メチル化酵素が、アスコルビン酸である、請求項3に記載の方法。
- 前記培養培地が、有効量のERK1/2阻害剤、GSK3β阻害剤、及びPKC阻害剤のうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記培養培地が、有効量のアクチビンA、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記ナイーブ型多能性幹細胞が、胚性幹細胞、胚盤胞、誘導多能性幹細胞、及び体細胞からなる群から選択される、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記ナイーブ型多能性幹細胞が、ヒト細胞である、請求項1または請求項2に記載の方法。
- フィブロネクチン層またはラミニン層上で前記プライム型多能性幹細胞及び/またはナイーブ型多能性幹細胞を培養することをさらに含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記プライム型多能性幹細胞が、10日未満で前記ナイーブ型多能性幹細胞に復帰する、請求項1に記載の方法。
- 前記プライム型多能性幹細胞が、少なくとも1つの外因性リプログラミング因子、少なくとも1つの外因性RNA、またはこれらの両方を発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの外因性リプログラミング因子が、Oct4、Sox2、L−Myc、C−Myc、Klf4、またはLin28である、請求項17に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの外因性RNAが、p53またはLin28の発現を下方調節する、請求項17に記載の方法。
- ある一定期間の間、低酸素条件下で前記プライム型多能性幹細胞及び/または前記ナイーブ型多能性幹細胞を培養するステップをさらに含む、請求項1または請求項2に記載の方法。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法により調製された、単離されたナイーブ型多能性幹細胞。
- 前記ナイーブ型多能性幹細胞が、X染色体不活性化特異的転写産物(XIST)を発現する、請求項20に記載の単離されたナイーブ型多能性幹細胞。
- 単離されたナイーブ型多能性幹細胞と、有効量のLPARのアゴニストと、を含む、組成物。
- 有効量のBMP、酸化防止剤、または脱メチル化酵素のうちの1つ以上をさらに含む、請求項22に記載の組成物。
- 有効量のSTAT3活性化因子をさらに含む、請求項22に記載の組成物。
- 前記STAT3活性化因子が、白血病抑制因子(LIF)である、請求項24に記載の組成物。
- 前記LPARのアゴニストが、OMPT、LPA、またはこれらの組み合わせである、請求項22に記載の組成物。
- 前記LPARのアゴニストが、約10nM〜約5μMの濃度で前記培地中に存在する、請求項22に記載の組成物。
- 前記酸化防止剤が、n−アセチルシステインである、請求項23に記載の組成物。
- 前記脱メチル化酵素が、アスコルビン酸である、請求項23に記載の組成物。
- 有効量のERK1/2阻害剤、GSK3β阻害剤、PKC阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項22に記載の組成物。
- 有効量のアクチビンA、TGFβ、bFGF、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項22に記載の組成物。
- 前記単離されたナイーブ型多能性幹細胞の少なくとも一部が、少なくとも1つの外因性リプログラミング因子、少なくとも1つの外因性RNA、またはこれらの両方を発現するように改変されている、請求項22に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのリプログラミング因子が、Oct4、Sox2、L−Myc、C−Myc、Klf4、またはLin28である、請求項32に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つのRNAが、p53またはLin28の発現を下方調節する、請求項33に記載の組成物。
- 前記ナイーブ型多能性幹細胞が、低酸素条件下で培養される、請求項22に記載の組成物。
- 10nM〜約10μMのLPARのアゴニストを含む、細胞培養培地。
- 前記細胞培養培地が、有効量のBMP、酸化防止剤、または脱メチル化酵素のうちの1つ以上をさらに含む、請求項36に記載の細胞培養培地。
- 前記細胞培養培地が、有効量のSTAT3活性化因子をさらに含む、請求項36に記載の細胞培養培地。
- 前記STAT3活性化因子が、LIFである、請求項38に記載の細胞培養培地。
- 前記LPARのアゴニストが、OMPT、LPA、またはこれらの任意の組み合わせである、請求項36に記載の細胞培養培地。
- 前記LPARのアゴニストが、約10nM〜約5μMの濃度で前記培地中に存在する、請求項36に記載の細胞培養培地。
- 前記酸化防止剤が、n−アセチルシステインである、請求項37に記載の細胞培養培地。
- 前記脱メチル化酵素が、アスコルビン酸である、請求項37に記載の細胞培養培地。
- 前記細胞培養培地が、有効量のERK1/2阻害剤、GSK3β阻害剤、PKC阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項36に記載の細胞培養培地。
- bFGFと、アクチビンAまたはトランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)のうちの1つ以上と、を含む、プライム型多能性幹細胞を培養するための細胞培養培地。
- ナイーブ型多能性幹細胞の誘導方法であって、培養培地中でプライム型多能性幹細胞を培養することを含み、前記培養培地が、ERK1/2阻害剤、GSK3β阻害剤、PKC阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせを実質的に含まない、方法。
- 単離されたプライム型多能性幹細胞であって、前記単離されたプライム型多能性幹細胞が、LPARのアゴニストを含む培地の存在下でインキュベートされ、前記プライム型ヒト多能性幹細胞が、インキュベーション中またはインキュベーション後に、ナイーブ型多能性幹細胞に復帰される、単離されたプライム型多能性幹細胞。
- 前記培地が、有効量の骨形成タンパク質(BMP)、酸化防止剤、脱メチル化酵素、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項47に記載の細胞。
- 前記培地が、有効量のSTAT3活性化因子をさらに含む、請求項47に記載の細胞。
- 前記STAT3活性化因子が、LIFである、請求項49に記載の細胞。
- 前記LPARが、LPAR1である、請求項47に記載の細胞。
- 前記LPARのアゴニストが、OMPT、LPA、またはこれらの組み合わせである、請求項48に記載の細胞。
- 前記酸化防止剤が、n−アセチルシステインである、請求項49に記載の細胞。
- 前記脱メチル化酵素が、アスコルビン酸である、請求項49に記載の細胞。
- 前記培養培地が、有効量のERK1/2阻害剤、GSK3β阻害剤、PKC阻害剤、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項48に記載の細胞。
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