WO2022191335A1 - プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法、ナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット、及びナイーブ型多能性幹細胞誘導剤 - Google Patents

プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法、ナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット、及びナイーブ型多能性幹細胞誘導剤 Download PDF

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pluripotent stem
naive
primed
stem cells
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潤 山下
▲女亜▼▲女青▼ 劉
振楠 楊
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国立大学法人京都大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention provides a method for inducing primed pluripotent stem cells into naive pluripotent stem cells, a method for producing naive pluripotent stem cells, a kit for naive pluripotent stem cell induction, and naive pluripotent stem cell induction Regarding agents.
  • Pluripotent stem cells that can differentiate into any cell in the body can be roughly divided into two types: naive and prime.
  • Naive pluripotent stem cells are considered to have undifferentiated properties equivalent to those of the inner cell mass in blastocysts.
  • Na ⁇ ve pluripotent stem cells are capable of contributing to chimera formation and of germline differentiation after implantation into an embryo.
  • prime-type pluripotent stem cells are considered to be cells corresponding to post-implantation epiblasts that have developed slightly from the blastocyst.
  • Primed pluripotent stem cells have pluripotency, but have lost the ability to form chimeras and the ability to differentiate into the germ line.
  • Mouse pluripotent stem cells exist in both naive and primed types.
  • Primate pluripotent stem cells are generally primed.
  • Human naive pluripotent stem cells are expected to be applied to new regenerative medicine, such as human organ production in animals, by utilizing their ability to form chimeras.
  • Human naive pluripotent stem cells are also expected to be applied to various new researches such as human developmental process analysis and germ cell line induction.
  • Non-Patent Document 1 Several substances have been reported so far as substances involved in the conversion of primed pluripotent stem cells to naive pluripotent stem cells (for example, Non-Patent Document 1). In addition, it has been reported that activation of adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) contributes to maintenance of naive pluripotent stem cells (Non-Patent Document 2).
  • AMPK adenosine monophosphate-activated protein kinase
  • the present invention provides a method for inducing primed pluripotent stem cells into naive pluripotent stem cells, a method for producing naive pluripotent stem cells from primed pluripotent stem cells, and methods that can be used for these methods.
  • An object of the present invention is to provide a naive pluripotent stem cell induction kit and a naive pluripotent stem cell inducer.
  • a method of inducing primed pluripotent stem cells into naive pluripotent stem cells comprising the step of culturing primed pluripotent stem cells in a medium containing an AMPK activator.
  • the AMPK activator is one or more substances selected from the group consisting of AICAR, A769662 and metformin.
  • Primed pluripotent stem cells are human-derived primed iPS cells.
  • the method of [6], wherein the primed pluripotent stem cells are primed ES cells or primed iPS cells.
  • the method of [7], wherein the primed pluripotent stem cells are human-derived primed iPS cells.
  • a method for producing naive pluripotent stem cells comprising the step of culturing primed pluripotent stem cells in a medium containing an AMPK activator.
  • the AMPK activator is one or more substances selected from the group consisting of AICAR, A769662 and metformin.
  • the production method according to any one of [9] to [11], wherein the primed pluripotent stem cells are primed ES cells or primed iPS cells.
  • the production method of [12], wherein the primed pluripotent stem cells are human-derived primed iPS cells.
  • a method for producing naive pluripotent stem cells comprising a step of activating p38 MAPK in primed pluripotent stem cells.
  • the production method of [14], wherein the primed pluripotent stem cells are primed ES cells or primed iPS cells.
  • the production method of [15], wherein the primed pluripotent stem cells are human-derived primed iPS cells.
  • kits for inducing naive pluripotent stem cells according to [17] or [18], wherein the AMPK activator is at least one substance selected from the group consisting of AICAR, A769662 and metformin.
  • kit [20] The kit for deriving na ⁇ ve pluripotent stem cells according to any one of [17] to [19], wherein the primed pluripotent stem cells are primed ES cells or primed iPS cells. [21] The naive pluripotent stem cell induction kit of [20], wherein the primed pluripotent stem cells are human-derived primed iPS cells. [22] A naive pluripotent stem cell inducer for inducing primed pluripotent stem cells into naive pluripotent stem cells, comprising a p38 MAPK activator.
  • a method for inducing primed pluripotent stem cells into naive pluripotent stem cells a method for producing naive pluripotent stem cells from primed pluripotent stem cells, and a method that can be used in these methods
  • a naive pluripotent stem cell induction kit and a naive pluripotent stem cell inducer are provided.
  • mEpiSCs Mouse primed epi-stem cells maintained with FGF2 and Activin A.
  • Upper panel cell morphology and OCt4-GFP expression.
  • Bottom panel FACS analysis of Oct4-GFP and PECAM1. SSC; side scatter.
  • Scale bar 200 ⁇ m.
  • Four sets of phase-contrast and Oct4-GFP images are shown for each condition. Scale bar, 200 ⁇ m. FACS analysis of Oct4-GFP and expression and PECAM1 expression 16 days after reversion.
  • p-p38 phosphorylated p38 (Thr180/Tyr182); p38: total p38.
  • Western blot analysis results were quantified by the p-p38/p38 density ratio. A value of 1 was assigned to the control sample.
  • a first aspect of the present disclosure is a method of inducing primed pluripotent stem cells into naive pluripotent stem cells.
  • the method of this aspect comprises culturing primed pluripotent stem cells in a medium containing an AMPK activator.
  • pluripotent stem cells A pluripotent stem cell is a stem cell that has pluripotency that can be differentiated into many cells existing in a living body and that has the ability to proliferate.
  • pluripotent stem cells include embryonic stem (ES) cells, induced pluripotent stem (iPS) cells, ntES cells (nuclear transfer Embryonic Stem Cells), mGS cells (Multipotent germline stem cells), EG Cells (Embryonic germ cells) and the like are included, but not limited to these.
  • the pluripotent stem cells are iPS cells or ES cells.
  • pluripotent stem cells may be derived from mammalian, avian, reptile, amphibian, fish, insect, and the like cells.
  • mammals include humans, non-human primates (monkeys, chimpanzees, gorillas, common marmosets, cynomolgus monkeys, etc.), rodents (mice, rats, guinea pigs, hamsters, etc.), dogs, cats, rabbits, cows, pigs, Examples include, but are not limited to, horses, goats, sheep, and the like.
  • Pluripotent stem cells can be obtained by known methods.
  • iPS cells can be produced by introducing a reprogramming factor into any somatic cell.
  • a reprogramming factor is a factor that, when introduced into a somatic cell, can induce the somatic cell to become an iPS cell.
  • initialization factors include Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERAs, ECAT15-2, Genes such as Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3, and Glis1, and their gene products.
  • Initialization factors may be used alone or in combination. Combinations of initialization factors include, for example, WO 2007/069666, WO 2008/118820, WO 2009/007852, WO 2009/032194, WO 2009/058413, International Publication No. 2009/057831, International Publication No. 2009/075119, International Publication No. 2009/079007, International Publication No. 2009/091659, International Publication No. 2009/101084, International Publication No. 2009/101407, International Publication No.
  • WO 2009/102983 WO 2009/114949, WO 2009/117439, WO 2009/126250, WO 2009/126251, WO 2009/126655, WO 2009 /157593, WO2010/009015, WO2010/033906, WO2010/033920, WO2010/042800, WO2010/050626, WO2010/056831 WO 2010/068955, WO 2010/098419, WO 2010/102267, WO 2010/111409, WO 2010/111422, WO 2010/115050, WO 2010/124290, WO 2010/147395, WO 2010/147612, Huangfu D, et al. (2008), Nat.
  • Somatic cells include both fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and healthy or diseased somatic cells of mature individuals. Somatic cells may be cultured cells, and include primary cultured cells, passaged cells, and established cell lines. Specific examples of somatic cells include (1) tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells, (2) tissue progenitor cells, and (3) blood.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells
  • tissue progenitor cells tissue progenitor cells
  • Cells peripheral blood cells, cord blood cells, etc.
  • lymphocytes epithelial cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosa cells, enterocytes, splenocytes, pancreatic cells ( pancreatic exocrine cells, etc.), brain cells, lung cells, renal cells, and differentiated cells such as adipocytes.
  • Naive type pluripotent stem cells are pluripotent stem cells that have the same or similar properties as those of preimplantation embryos. Naive pluripotent stem cells specifically have the following characteristics. (n1) shows a dome-shaped colony morphology. (n2) Formation of chimeras by implantation into embryos. (n3) having alkaline phosphatase activity; (n4) Chromosomal DNA methylation level is lower than primed pluripotent stem cells. (n5) Both X chromosomes are activated: XaXa. (n6) The lysine residue of histone H3 tends to be hypomethylated, and when immunostaining of H3K9me3 is performed, foci is not confirmed.
  • Naive markers (Rex1, Klf4, Klf2, Tfcp2l1, Stella, CD75, SUSD2, etc.; in mouse pluripotent stem cells, in addition to the above, PECAM1, Esrrb, etc.) are expressed. (n8) higher mitochondrial activity than primed pluripotent stem cells; Stained with tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) stain. (n9) Preferential use of distal enhancers in transcription of the OCT3/4 gene. (n10) Express pluripotency markers (Oct3/4, Nanog, Sox2, etc.).
  • Primed pluripotent stem cells are pluripotent stem cells that have the same or similar properties as the epiblast of post-implantation embryos. Common iPS cells and human ES cells obtained by introducing reprogramming factors into somatic cells are usually prime pluripotent stem cells. Prime pluripotent stem cells specifically have the following characteristics. (p1) shows a flattened colony morphology. (p2) Does not form chimeras upon implantation into embryos. (p3) does not have alkaline phosphatase activity; (p4) Chromosomal DNA methylation level is higher than naive pluripotent stem cells. (p5) Only one X chromosome is activated: XaXi.
  • n10 and p11 are features common to naive and primed pluripotent stem cells.
  • naive pluripotent stem cells When naive pluripotent stem cells are induced from primed pluripotent stem cells, the primed properties such as (p1) to (p10) above disappear, and naive pluripotent stem cells such as (n1) to (n9) above disappear. Replaced by the properties of the type.
  • the naive pluripotent stem cells obtained by the method of this embodiment have at least one or more properties (n1) to (n9), preferably three or more properties, and five or more properties. It is more preferable to have 7 or more properties, and it is particularly preferable to have all properties (n1) to (n9). Furthermore, it preferably has the feature of (n10).
  • primed pluripotent stem cells used in the method of this embodiment are not particularly limited as long as they are pluripotent stem cells in a primed state.
  • Preferable primed pluripotent stem cells include, for example, primed ES cells and primed iPS cells.
  • the method of this embodiment includes the step of culturing primed pluripotent stem cells in a medium containing an AMPK activator (hereinafter also referred to as "AMPK activator-containing medium").
  • AMPK activator-containing medium may be a medium obtained by adding an AMPK activator to a basal medium used for animal culture.
  • the basal medium is not particularly limited, and those commonly used for animal culture can be used without particular limitation.
  • basal media include Glasgow's MEM (GMEM) medium, N2B27 medium (NDiff 227 medium), IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, and Dulbecco's Modified Eagle'. s Medium (DMEM) medium, Ham's F12 (F12) medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, mixed media thereof, and the like, but are not limited thereto.
  • the medium may contain serum (eg, fetal bovine serum (FBS)) or may be serum-free.
  • FBS fetal bovine serum
  • albumin transferrin, knockout serum replacement (KSR) (serum replacement during ES cell culture) (Invitrogen), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acid, insulin, collagen precursor , trace elements, 2-mercaptoethanol, 3'-thiolglycerol, and the like.
  • KSR knockout serum replacement
  • N2 supplement Invitrogen
  • B27 supplement Invitrogen
  • fatty acid insulin
  • insulin collagen precursor
  • trace elements 2-mercaptoethanol
  • 2-mercaptoethanol 3'-thiolglycerol
  • lipids amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (Invitrogen), non-essential amino acids (NEAA), vitamins, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, and equivalents thereof. It may contain one or more substances.
  • the basal medium may be selected according to the species from which the pluripotent stem cells are derived.
  • a GMEM medium may be used as the basal medium, or a GMEM medium supplemented with serum, serum substitute, NEAA, pyruvic acid, or the like may be used.
  • N2B27 medium may be used as the basal medium.
  • An AMPK (5′-adenosine monophosphate-activated protein kinase) activator is a substance having a function of activating AMPK.
  • An AMPK activator for example, has a function of phosphorylating AMPK and activates AMPK by phosphorylating AMPK.
  • AMPK activator Any known AMPK activator can be used without any particular limitation.
  • Examples of AMPK activators include AICAR (5-amino-1-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1H-imidazole- 4-carboxamide), A769662 (6,7-Dihydro-4-hydroxy-3-(2′-hydroxy[1,1′-biphenyl]-4-yl)-6-oxo-thieno[2,3-b] pyridine-5-carbonitrile), metformin (N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide), and derivatives thereof.
  • Metformin may be in the form of an acid salt such as metformin hydrochloride. These compounds may be commercially available products or may be produced by oneself.
  • the concentration of the AMPK activator in the AMPK activator-containing medium can be appropriately selected according to the type of AMPK activator.
  • the AMPK activator concentration in the AMPK activator-containing medium is, for example, 0.001 to 100 mM, preferably 0.01 to 10 mM.
  • the concentration in the AMPK activator-containing medium is preferably 0.5-5 mM.
  • the concentration in the AMPK activator-containing medium is preferably 0.01 to 0.1 mM.
  • the AMPK activator-containing medium may contain optional ingredients in addition to the AMPK activator.
  • Optional components include, for example, LIF, MEK inhibitors, Wnt inhibitors, PKC inhibitors, and the like.
  • the AMPK activator-containing medium preferably contains Leukemia Inhibitory Factor (LIF).
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • the organism from which LIF is derived is not particularly limited.
  • LIF include, for example, human (Japanese Patent Publication No. 1-502985), mouse (Japanese Patent Publication No. 1-502985), sheep (Japanese Patent Publication No. 4-502554), pig (Japanese Patent Publication No. 4-502554 JP-A-8-154681) or bovine LIF (JP-A-8-154681) can be used.
  • human or mouse LIF is preferred.
  • Human LIF (NCBI Gene ID: 3976) includes, for example, a protein having the amino acid sequence of NCBI Accession Number: NP_001244064.1 or NP_002300.1.
  • Mouse LIF (NCBI Gene ID: 16878) includes, for example, a protein having the amino acid sequence of NCBI Accession No.: NP_001034626.1 or NP_032527.1.
  • LIF can be appropriately selected according to the organism from which the pluripotent stem cells are derived. For example, mouse LIF may be used when the pluripotent stem cells are derived from mice. Human LIF may be used when the pluripotent stem cells are of human origin. LIF may be a fragment or functional variant as long as it retains its function. A commercially available LIF may be used, or a protein purified from cells or a protein produced by genetic recombination may be used.
  • the concentration of LIF in the AMPK activator-containing medium is, for example, 0.01 to 1000 ng/mL, preferably 0.1 to 500 ng/mL. ⁇ 100 ng/mL is more preferred, and 1-50 ng/mL is even more preferred.
  • the concentration of LIF in the AMPK activator-containing medium is, for example, 10 to 5000 U/mL, preferably 100 to 3000 U/mL, more preferably 500 to 2000 U/mL.
  • MEK MEK/ERK kinase
  • MEK is a substance that inhibits the function of MEK.
  • MEK is a phosphorylation enzyme in the cell growth signal transduction pathway (MAP kinase pathway) where cell growth factors bind to cell receptors and reach the nucleus.
  • MEK inhibitors can be used without particular limitations.
  • MEK inhibitors include, for example, PD0325901, PD184352, PD98059, U0126, SL327, and derivatives thereof. These compounds may be commercially available products or may be produced by oneself.
  • MEK inhibitors may be antisense nucleic acids against MEK, RNA interference-inducing nucleic acids (eg, miRNA, siRNA, shRNA), dominant-negative mutants, expression vectors thereof, and the like.
  • PD0325901 is preferred as the MEK inhibitor.
  • the MEK inhibitors may be used singly or in combination of two or more.
  • the concentration of the MEK inhibitor in the AMPK activator-containing medium can be appropriately selected according to the type of MEK inhibitor.
  • the concentration of the MEK inhibitor in the AMPK activator-containing medium is, for example, 0.001 to 100 ⁇ M, preferably 0.01 to 50 ⁇ M.
  • the concentration in the AMPK activator-containing medium is preferably 0.1-10 ⁇ M, more preferably 0.5-5 ⁇ M.
  • Wnt inhibitors are substances that suppress the production of Wnts or inhibit the signaling that follows binding of Wnts to their receptors to accumulation of ⁇ -catenin.
  • Wnt inhibitors include substances that inhibit binding to Frizzled family receptors, substances that promote degradation of ⁇ -catenin, and the like.
  • Wnt inhibitors can be used without particular limitations.
  • Wnt inhibitors include DKK1 protein (for example, NCBI accession number for humans: NM_012242), sclerostin (for example, for humans, NCBI accession number: NM_025237), IWR-1, and IWP-2. , IWP-3, IWP-4, IWP-L6, C59 (or Wnt-C59), ICG-001, LGK-974 (or NVP-LGK-974), FH535, WIKI4, KYO2111, PNU-74654, and XAV939, derivatives thereof, and the like.
  • the Wnt inhibitor is preferably a tankyrase inhibitor such as XAV939 or IWR-1, more preferably XAV939. These compounds may be commercially available products or may be produced by oneself. Wnt inhibitors may be antisense nucleic acids against tankyrase, RNA interference-inducing nucleic acids (eg, miRNA, siRNA, shRNA), dominant-negative mutants, expression vectors thereof, and the like.
  • One Wnt inhibitor may be used alone, or two or more may be used in combination.
  • the concentration of the Wnt inhibitor in the AMPK activator-containing medium can be appropriately selected according to the type of Wnt inhibitor.
  • the concentration of the Wnt inhibitor in the AMPK activator-containing medium is, for example, 0.001-100 ⁇ M, preferably 0.01-50 ⁇ M.
  • the concentration in the AMPK activator-containing medium is preferably 0.1-10 ⁇ M, more preferably 0.5-5 ⁇ M.
  • PKC inhibitor is a substance that inhibits the function of PKC (protein kinase C).
  • PKC is a kind of protein kinase that phosphorylates hydroxyl groups of serine and threonine residues of substrate proteins. At least 11 isoenzymes exist, forming a large family. PKC is involved in the regulation of many cell functions, including cell proliferation and death, gene transcription and translation, cell morphology, and cell-cell contact.
  • PKC inhibitor may be any substance that inhibits at least one of the PKC isoenzymes.
  • PKC inhibitors include, for example, Go6983 (3-[1-[3-(Dimethylamino)propyl]-5-methoxy-1H-indol-3-yl]-4-(1H-indol-3-yl)-1H -pyrrole-2,5-dione), GF109203X (2-[1-(3-Dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl)maleimide), LY-333531 ((9S)-9 -[(Dimethylamino)methyl]-6,7,10,11-tetrahydro-9H,18H-5,21:12,17-di(metheno)dibenzo[e,k]pyrrolo[3,4-h][1 ,4,13]oxadiazacyclohexa
  • PKC inhibitors may be antisense nucleic acids against PKC, RNA interference-inducing nucleic acids (eg, miRNA, siRNA, shRNA), dominant-negative mutants, their expression vectors, and the like. These compounds may be commercially available products or may be produced by oneself.
  • a preferred PKC inhibitor is Go6983.
  • PKC inhibitors may be used singly or in combination of two or more.
  • the concentration of the PKC inhibitor in the AMPK activator-containing medium can be appropriately selected according to the type of PKC inhibitor.
  • the concentration of the PKC inhibitor in the AMPK activator-containing medium is, for example, 0.001-100 ⁇ M, preferably 0.01-50 ⁇ M.
  • the concentration in the AMPK activator-containing medium is preferably 0.1-10 ⁇ M, more preferably 0.5-5 ⁇ M.
  • the AMPK activator-containing medium may contain an AMPK activator and LIF.
  • the AMPK activator-containing medium contains an AMPK activator, LIF, a MEK inhibitor, a Wnt inhibitor (e.g., tankyrase inhibitor), and a PKC inhibitor. may include.
  • the AMPK activator-containing medium may contain GSK3 ⁇ inhibitors, ROCK inhibitors, growth factors (FGF, BMP, etc.) and the like in addition to the above components.
  • a culture method is not particularly limited.
  • Primed pluripotent stem cells can be cultured under culture conditions commonly used for culturing animal cells.
  • the culture temperature is not particularly limited, it is usually 25 to 40°C, preferably 30 to 40°C.
  • a specific example of the culture temperature is about 37°C.
  • Primed pluripotent stem cells can usually be cultured in an atmosphere of CO2 - containing air.
  • the CO 2 concentration can typically be about 0.3-5%, preferably about 2-5%.
  • a specific example of the CO2 concentration is about 5%.
  • the culture may be adherent culture or suspension culture.
  • the culture vessel may be coated. Coating materials include, for example, gelatin, collagen, laminin, fibronectin, Matrigel, and the like.
  • pluripotent stem cells may be co-cultured with feeder cells or the like. Examples of feeder cells include mitomycin C-treated mouse embryo-derived primary fibroblasts (MEF), STO cells, SNL cells, OP9 cells, C3H10T1/2 cells, and the like.
  • feeder cells include mitomycin C-treated mouse embryo-derived primary fibroblasts (MEF), STO cells, SNL cells, OP9 cells, C3H10T1/2 cells, and the like.
  • the culture period is not particularly limited, and can be any period.
  • the culture period may be until naive pluripotent stem cells are induced by monitoring the state of the cells during the culture. Examples of the culture period include 1 day or longer, 3 days or longer, 5 days or longer, 10 days or longer, and 14 days or longer.
  • the upper limit of the culture period is not particularly limited, but includes, for example, 50 days or less, 40 days or less, 30 days or less, and 25 days or less.
  • the medium may be replaced as appropriate during the culture period.
  • Medium exchange can be performed by removing the old medium and replacing it with a new medium containing the AMPK activator.
  • the culture period it may be passaged as appropriate.
  • the cells may be dissociated using a cell dissociation solution containing enzymes such as protease, collagenase, peptidase, and DNase, and then seeded in a new medium containing an AMPK activator.
  • the passage interval is not particularly limited, but can be, for example, about 1 to 10 days.
  • a ROCK inhibitor eg, Y27632
  • the method of this aspect may have an optional step in addition to the step of culturing in the AMPK activator-containing medium (hereinafter also referred to as “AMPK activation step”).
  • Optional steps include, for example, a pre-culturing step and a step of maintaining and culturing naive pluripotent stem cells.
  • the pre-culturing step is a step of culturing primed pluripotent stem cells prior to the AMPK activation step.
  • the medium used in the pre-culture step includes known pluripotent stem cell maintenance medium.
  • a medium obtained by adding Activin A and FGF2 to the basal medium as described above may be used.
  • a commercially available pluripotent stem cell maintenance medium may be used as the pre-culture medium.
  • Examples of commercially available pluripotent stem cell maintenance media include StemFit (registered trademark) AK02N (Ajinomoto).
  • the pre-culture medium does not contain AMPK activator.
  • the pre-culture step can be performed in the same manner as the AMPK activation step above, except that the medium is used as the pre-culture medium.
  • a naive pluripotent stem cell maintenance step may be performed.
  • a naive state can be stably maintained by the naive pluripotent stem cell maintenance step.
  • the medium used in the naive pluripotent stem cell maintenance process includes known naive pluripotent stem cell maintenance medium.
  • the naive pluripotent stem cell maintenance medium include a medium obtained by adding LIF, a MEK inhibitor, and a GSK3 ⁇ inhibitor to the basal medium as described above.
  • a GSK-3 ⁇ inhibitor is a substance that inhibits the function of GSK (Glycogen Synthase Kinase) 3 ⁇ , such as kinase activity (eg, ability to phosphorylate ⁇ -catenin).
  • GSK3 ⁇ inhibitors include, for example, the indirubin derivative BIO (also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoindirubin 3′-oxime), the maleimide derivative SB216763 (3-(2,4-dichlorophenyl)- 4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione), SB415286 (3-[(3-chloro-4-hydroxyphenyl)amino]-4-(2- Nitrophenyl)-1H-pyrrole-2,5-dione), GSK-3 ⁇ inhibitor VII (4-dibromoacetophenone), a phenyl ⁇ -bromomethyl ketone compound, and L803-mts, a cell-permeable phosphorylated peptide (also known as , GSK3 ⁇ peptide inhibitor; Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2), and CHIR99021 (6-[2-[4-(2,4-dich
  • GSK-3 ⁇ inhibitors may be antisense nucleic acids against GSK-3 ⁇ , RNA interference-inducing nucleic acids (eg, miRNA, siRNA, shRNA), dominant-negative mutants, expression vectors thereof, and the like.
  • a preferred GSK3 ⁇ inhibitor is CHIR99021.
  • GSK-3 ⁇ inhibitors may be used singly or in combination of two or more.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor in the naive pluripotent stem cell maintenance medium is, for example, 0.01 to 100 ⁇ M, preferably 0.1 to 50 ⁇ M. 5-10 ⁇ M is more preferred, and 1-5 ⁇ M is even more preferred.
  • the naive pluripotent stem cell maintenance medium includes, for example, a basal medium (e.g., Basal medium used in Examples), LIF, a MEK inhibitor (e.g., PD0325901), and GSK3 ⁇ . Media supplemented with inhibitors (eg, CHIR99021) can be used. Concentrations of the LIF and MEK inhibitors in the naive pluripotent stem cell maintenance medium include the same concentrations as in the AMPK activator-containing medium.
  • the naive pluripotent stem cell maintenance medium includes, for example, a basal medium (e.g., N2B27 medium), LIF, a MEK inhibitor (e.g., PD0325901), a Wnt inhibitor (e.g., XAV939 ), and media supplemented with PKC inhibitors (eg, Go6983) can be used.
  • a basal medium e.g., N2B27 medium
  • LIF a MEK inhibitor
  • a Wnt inhibitor e.g., XAV939
  • PKC inhibitors eg, Go6983
  • the naive pluripotent stem cell maintenance medium is a medium containing at least one inhibitor selected from the group consisting of MEK inhibitors, Wnt inhibitors, PKC inhibitors, and GSK3 ⁇ inhibitors, and LIF. good too.
  • the naive pluripotent stem cell maintenance medium preferably contains two or more of the above inhibitors. Combinations of inhibitors include combinations of MEK inhibitors and GSK3 ⁇ inhibitors, and combinations of MEK inhibitors, Wnt inhibitors and PKC inhibitors.
  • the naive pluripotent stem cell maintenance step can be performed in the same manner as the AMPK activation step above, except that the medium is a naive pluripotent stem cell maintenance medium.
  • naive pluripotent stem cells can be induced from primed pluripotent stem cells.
  • two or more drugs are often used as naive state inducers.
  • naive pluripotent stem cells can be induced by using only one AMPK inhibitor as a naive state inducer.
  • the method of this aspect may be a method of inducing primed pluripotent stem cells into naive pluripotent stem cells, comprising the step of activating p38 MAPK of primed pluripotent stem cells.
  • p38 MAPK Mitogen-activated protein kinase
  • p38 MAPK is a downstream target of activated AMPK. Therefore, p38 MAPK can be activated by using an AMPK activator.
  • p38 MAPK is one type of MAPK and is involved in cell differentiation, apoptosis, autophagy and the like. Activation of p38 MAPK is caused by phosphorylation of p38 MAPK. Therefore, activation of p38 MAPK can be confirmed by phosphorylation of p38 MAPK.
  • Naive pluripotent stem cells can also be induced when p38 MAPK is activated without using an AMPK activator.
  • p38 MAPK activators examples include AMPK activators, inflammatory cytokines (IL-1 ⁇ , etc.), endotoxin, and the like.
  • p38 MAPK activation may be induced by subjecting primed pluripotent stem cells to environmental stress (ultraviolet light, oxidative stress, heat shock stress, etc.), osmotic shock, or the like.
  • a second aspect of the present disclosure is a method for producing naive pluripotent stem cells.
  • the method of this aspect includes a step of culturing primed pluripotent stem cells in a medium containing an AMPK activator (AMPK activator-containing medium) (AMPK activation step).
  • AMPK activator-containing medium AMPK activation step
  • the AMPK activation step can be performed in the same manner as the AMPK activation step in the induction method of the first aspect.
  • the method of this embodiment may include any step in addition to the step of culturing in the AMPK activator-containing medium.
  • Optional steps include a pre-culture step, a naive pluripotent stem cell maintenance step, and the like.
  • the pre-culture step can be performed in the same manner as the pre-culture step in the induction method of the first aspect.
  • the naive pluripotent stem cell maintenance step can be performed in the same manner as the naive pluripotent stem cell maintenance step in the induction method of the first aspect.
  • the method of this embodiment may be a method for producing na ⁇ ve pluripotent stem cells, including the step of activating p38 MAPK of primed pluripotent stem cells.
  • Methods for activating p38 MAPK include the same methods as described above.
  • a third aspect of the present disclosure is a naive pluripotent stem cell induction kit.
  • the kit of this embodiment contains an AMPK activator.
  • the kit of this embodiment is used to induce primed pluripotent stem cells into naive pluripotent stem cells.
  • AMPK activators include those mentioned above.
  • the kit of this embodiment may contain any component in addition to the AMPK activator.
  • Optional components include, for example, basal medium, LIF, MEK inhibitor, Wnt inhibitor (Tankyrase inhibitor, etc.), PKC inhibitor, and the like. Specific examples of this are the same as those described above. These components can be used along with AMPK activators to prepare AMPK activator-containing media.
  • the kit of this embodiment may contain a GSK3 ⁇ inhibitor.
  • GSK3 ⁇ inhibitors can be used together with basal media, LIF, MEK inhibitors and the like to prepare naive pluripotent stem cell maintenance media.
  • the kit of this embodiment may contain FGF2.
  • the kit of this embodiment may contain Activin A. These can be used together with the basal medium to prepare the pre-culture medium.
  • the kit of this aspect may contain a ROCK inhibitor (Y27632), a cell dissociation agent, and the like. These can be used when passaging cells.
  • the kit of this embodiment may further include culture plates, instructions for use, and the like.
  • kit of this embodiment may contain other inhibitors such as ERK (extracellular-signal related kinase) inhibitors and RAF inhibitors.
  • ERK extracellular-signal related kinase
  • RAF inhibitors RAF inhibitors
  • the kit of this aspect can be used to carry out the method of the first aspect and the production method of the second aspect.
  • a fourth aspect of the present disclosure is a naive pluripotent stem cell inducer.
  • the naive pluripotent stem cell inducer of this embodiment contains a p38 MAPK activator as an active ingredient.
  • the naive pluripotent stem cell inducer of this embodiment is used to induce primed pluripotent stem cells into naive pluripotent stem cells. Examples of p38 MAPK activators include those mentioned above.
  • 129/MSM was provided by Dr. Masaki Yagi (Yagi et al., Stem Cell Rep., 12 (2019), pp. 1113-1128). Briefly, male MSM/Ms mice were mated with female 129X1/SvJ mice. Embryonic day (E) 0.5 was set at noon on the day when the plug was observed. The day before embryo isolation, mitomycin C (Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.)-treated MEFs (feeders) were harvested onto 0.2% gelatin-coated 24-well culture plates (True Line). At E6.5, the uterus was removed across the cervix and the two tubal junctions and the embryos were placed in HEPES (GIBCO).
  • Epiblasts were split from the extra-embryonic region and transferred to 24-well culture plates to induce EpiSCs. After epiblast extension, they were passaged onto feeders of 24-well culture plates (p1), 6-well culture plates (p2), 6 cm culture dishes (p3).
  • KSR Knockout TM Serum Replacement
  • NEAA non-essential amino acids
  • GBCO 0.1 mM 2-mercaptoethanol
  • penicillin/streptomycin/mL FG2/mL 129/MSM were cultured on MEF feeders in DMEM/F-12 medium (GIBCO) supplemented with 129/MSM and Activin A (20 ng/mL). Medium was changed every 2 days.
  • mEpiSCs 129/Ba1 were obtained as previously described (Sugimoto et al., Stem Cell Rep., 4 (2015), pp. 744-757).
  • mESCs Naive mouse embryonic stem cells
  • naive-like cells after reversion from mEpiSCs were cultured in Basal medium on 0.1% gelatin-coated dishes (Yamashita et al., Nature, 408 (2000), pp. 92). -96; Ying et al., Nature, 453 (2008), pp. 519-523).
  • Basal medium GMEM supplemented with 10% KSR (GIBCO), 1% fetal bovine serum (SAFC Biosciences), 0.1 mM NEAA, 1 mM sodium pyruvate (SIGMA), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, and penicillin/streptomycin GIBCO).
  • cells were optionally cultured in Ndiff 227 medium supplemented with 1000 U/mL Lif (Millipore) and two small molecule inhibitors (1 ⁇ M PD0325901 (SIGMA) and 3 ⁇ M CHIR99021 (Tocris)). Cultures were dissociated using Accumax (Innovative Cell Technologies) and passaged every 3-4 days. Medium was changed every two days.
  • the AMPK activators used were AICAR (1 mM, diluted in D2W, WAKO), A769662 (50 ⁇ M, diluted in DMSO, ADooQ ), and metformin (1 mM, diluted in D2W, TCI). rice field. Medium was changed every two days. AICAR has a growth-inhibiting effect, and the addition of AICAR reduces the number of cells when cultured for a long period of time. Therefore, the AICAR concentration was decreased to 0.5 mM for the first 6 days (d0-d6). After 16 days, all cells were dissociated with Accumax and subjected to further analysis.
  • FACS analysis Cells were washed twice with PBS, harvested with Accumax, and stained with allophycocyanin (APC)-labeled anti-CD31 (PECAM1) MoAb (BD) and DAPI (Invitrogen). Flow cytometric analysis was performed on a FACSAria TM II Cell Sorter (BD). All FACS experiments were repeated at least three times.
  • Immunostaining and alkaline phosphatase staining Immunostaining was performed as previously described (Yamashita et al., Nature, 408 (2000), pp. 92-96). Briefly, cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 15-20 minutes, washed with PBS three times, and blocked with 2% skimmed milk (BD) for 30 minutes. Cells were incubated overnight at 4°C with primary antibody.
  • PBST PBS + 0.02% Tween20, Nacalai Tesque
  • a secondary antibody anti-mouse-rabbit or goat IgG antibody conjugated with Alexa488 or Alexa546 (Invitrogen) diluted 1:500.
  • a secondary antibody anti-mouse-rabbit or goat IgG antibody conjugated with Alexa488 or Alexa546 (Invitrogen) diluted 1:500.
  • anti-Oct3/4 (Santa Cruz, sc-5279, 1:200), anti-Nanog (ReproCell, RCAB002P-F, 1:300), anti-KLF4 (R&D, AF3158 , 1:500), anti-ESRRB (Perseus Proteomics, PP-H6705-001:500), anti-TFCP2l1 (Invitrogen, PA5-34361, 1:400), anti-TFE3 (Sigma, HPA023881, 1:300), anti-FOXA2 ( Merck Millipore, 07-633, 1:500), anti-Brachyury (R&D, AF2085, 1:500), anti-Nestin (SemCell Technologies, 01418, 1:500).
  • AP Staining Kit II (manufactured by Stemgent) was used for alkaline phosphatase staining.
  • Cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 5 minutes, washed once with PBST, stained with Solution A+B+C for 10 minutes, and washed 3 times with PBS according to the manufacturer's instructions.
  • 500 cells were plated in 12-well plates and cultured for 5 days.
  • RNA isolation and quantitative PCR Total RNA was isolated using the RNeasy Mini Kit (QIAGEN). cDNA was reverse transcribed from 1 ⁇ g RNA using SuperScript III (Invitrogen). Quantitative PCR analysis was performed in duplicate using 1/50 StepOnePlus (Applied Biosystems) reverse transcription reaction with SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). All qPCR reactions were performed in triplicate of at least three independent experiments. An endogenous control, GAPDH, was used to normalize gene expression. All results are presented as mean ⁇ SD.
  • HRP horseradish peroxidase
  • the cells were subcultured several times under 2iL conditions and then used for blastocyst injection.
  • Host blastocysts were isolated from Slc:ICR female mice and no more than 12 revertant cells were injected into the blastocyst using a piezo micromanipulator (Primetech, Japan). Injected blastocysts were implanted into 2.5 dpc pseudopregnant females. Chimeric mice were determined by coat color. When the chimeric mice reached sexual maturity at 8 weeks-dpc, they were crossed with wild-type ICR mice to confirm transmission to germ cells. In the next generation, germline transmission was determined to have occurred if an agouti-coated mouse was born.
  • RNA sequencing Using 500 ng of total RNA, a sequence library was constructed by TruSeq Stranded mRNA Library Prep (Illumina, Inc.) and sequenced with HiSeq2500 in 79 cycle single read mode. All reads that passed the quality filter were extracted to FASTQ format and demultiplexed into individual cells by barcode using BCL2FASTQ Conversion Software v2.20.0.422. FASTQ converted reads were mapped to Ensembl GRCm38 release 100 reference cDNA and ncRNA sequences using Bowtie2 v2.2.5 with very-sensitive-local option.
  • PCA pluripotent cell fate
  • AMPK activators induce reversion of primed mEpiSCs to naive-like cells
  • mEpiSCs Using mEpiSCs, Oct4GIP, harboring an Oct4 promoter/enhancer-driven eGFPiresPuro transgene (Oct4-GFP) expressed in primed and naive pluripotent stem cells (Guo et al., Development, 136 (2009) , pp. 1063-1069; Wray et al., 2010).
  • Oct4GIP cells were cultured in Basal medium with various reagent combinations (Fig. 1A).
  • Oct4GIP cells were maintained in mEpiSC culture conditions containing serum-free medium Ndiff 227 supplemented with FGF2 and Activin A before switching to medium for naive reversion (Guo et al., Development, 136 (2009), pp. 1063-1069). Almost all cells (99.2 ⁇ 0.7%) were positive for Oct4-GFP and negative for the naive ESC marker PECAM1/CD31. These results indicated that these cells were primed (Day0; d0) (Fig. 1B). When cells were cultured in Basal medium alone or in Basal medium supplemented with 2 iL (naive maintenance conditions), GFP expression disappeared within 5 days.
  • AMPK activators A769662 and metformin
  • FIG. 6A Oct4-GFP + cells were observed on d16 after treatment with A769662 alone, A769662 and LIF, or metformin and LIF (Fig. 6B).
  • A769662 alone, A769662+LIF, or metformin+LIF conditions Oct4-GFP and PECAM1 double positive cells were less but detectable than AICAR treatment. It was confirmed that these AMPK activators also have the activity of returning primed mEpiSCs to the naive state (Figs. 6C and 6D). These results indicated that an AMPK activator can more effectively induce reversion of primed mEpiSCs to a naive state when used together with LIF.
  • naive-specific proteins were clearly and homogeneously expressed in the nuclei of revertant cells as well as in naive MESCs, but not in primed MEpiSCs (Fig. 2F).
  • naive-like cells induced with other AMPK activators were evaluated. Similar to those induced with AICAR, Oct4-GFP + cells induced with A769662 alone, A769662 + LIF, or metformin + LIF (d16 + 10p) selectively yielded compact, dome-shaped, naive-like colonies that homogeneously expressed Oct4-GFP. appeared (Fig. 7A).
  • FACS analysis showed that revertant cells induced by A769662 alone, A769662+LIF, or metformin+LIF treatment (d16+10p) were mostly homogenously positive for PECAM1 (FIG. 7B). These cells maintained and proliferated well under 2iL conditions (Fig. 7C) and showed AP + colony formation comparable to control naive mESCs (Fig. 7D). Many naive-specific mRNAs and proteins were expressed at levels similar to naive MESCs ( Figure 7E, Figure 7F).
  • Revertant cells showed a short distance to na ⁇ ve MESC when passaged 2 or 3 times in 2iL conditions (d16+2p, 3p), but when passaged 10 times (d16+10p), they showed a short distance to na ⁇ ve MESC. Almost matched. This result suggested that sufficient passage in 2iL conditions allowed the revertant cells to fully maintain their naive properties. On d16, naive-like cells that were double positive for Oct4-GFP and PECAM1 were also observed (FIGS. 1D, 1E, 6C, 6D). Gene expression patterns were found to be a small subset prior to passaging and expansion at 2iL, not reflecting the appearance of naive-like cells in bulk cells.
  • PC1 largely delineated the major cell populations that were differentiating and weaning from naive or primed pluripotent stem cells.
  • a heatmap of mRNA expression (Takashima et al., Cell, 158 (2014), pp. 1254-1269) selected from separate gene panels for pluripotency regulators and lineage markers induced by different AMPK activators Naive-like cells were found to share similar expression patterns with naive mESCs and differ from primed mEpiSCs (Fig. 3B).
  • naive markers such as Esrrb, Zfp42 (also known as Rex1), Prdm14, Nr5a2, Tfcp2l1, and Klf2 were expressed in revertant cells at levels comparable to naive mESCs.
  • cell lineage markers such as Emoes, T, Foxa2, GATA4, GATA6 and Sox17 were lower in revertant cells than in primed mEpiSCs.
  • AMPK-induced cells are more clearly naive by contributing to chimerism and germline transmission.
  • Two primed mEpiSCs, 129/Ba1 and 129/MSM cell lines, derived from 129/Sv ⁇ C57BL/6N (Sugimoto et al., Stem Cell Rep., 4 (2015), pp. 744-757) used the stock. After treatment with AICAR alone or AICAR+LIF and maintained at 2iL for several passages, 129/Ba1 cells exhibited naive-like colony morphology similar to Oct4GIP cells (FIG. 4).
  • 129/Ba1 cells were injected into blastocysts of ICR female mice to examine their contribution to chimera formation.
  • 129/Ba1 cells exhibited a naive-like colony morphology similar to Oct4GIP cells (Fig. 4).
  • Most of the mouse pups succeeded in fur color chimera.
  • Breeding of male chimeric mice with female ICR mice produced Agouti-coated mice, indicating germline transmission of the 129/Ba1 cell genome (Table 5).
  • 129/MSM cells normal cell morphology and AP staining assays indicative of naive-like cells were obtained (FIGS. 7G, 7H) and chimerism formation was observed (data not shown). All these results indicate that AMPK activation can induce reversion of primed mEpiSCs to naive mESCs.
  • Table 6 summarizes the reversion efficiency of AMPK activators in several cell lines. Successful reversion was defined as naive-like colonies that could be maintained in 2iL conditions from primed mEpiSCs. AMPK activators (AICAR or A769662) alone were able to induce the emergence of naive-like cells from primed mEpiSCs. Addition of LIF enhanced reversion efficiency to 100% in all primed mEpiSCs examined (Oct4GIP, 129/Ba1, 129/MSM cell lines) in combination with AMPK activators, especially AICAR. These results indicate that AMPK activation contributes to the reversion of primed mEpiSCs to a naive pluripotent state.
  • p38 is an important downstream target in reversion by AMPK activators
  • AMPK activators the molecular mechanism of reversion to naive cells by AMPK activators was investigated.
  • the present inventors have previously shown that p38 is one of the functional downstream of AMPK signaling to maintain naive pluripotency (Liu and Yamashita, Biochem. Biophys. Res. Commun., 509 ( 2019), pp. 24-31).
  • Activation of p38 has been reported to promote reprogramming of somatic cells into pluripotent stem cells (Xu et al., 2013). We therefore hypothesized that p38 might be present downstream of reversion by AMPK activators.
  • AMPK activators increased p38 phosphorylation compared to control cells (Fig. 9A).
  • AICAR+LIF a p38 inhibitor after 16 days of reversion.
  • Fig. 5A Seven days after changing the medium to 2iL conditions, AICAR+LIF-induced cells began to enrich for Oct4-GFP + /PECAM1 + cells, whereas AICAR+LIF+p38i-treated cells failed to maintain Oct4-GFP + cells.
  • Tetracycline-inducible (Tet-ON) constitutively active form of p38 containing D176A and F327S mutations (Xu et al., Cell Res., 23 (2013), pp. 131-141; Diskin et al., J. Biol. Chem., 279 (2004), pp. 47040-47049) was generated and Dox treatment activated the p38 pathway (Fig. 9D).
  • p38 activation alone or in combination with LIF induced the appearance of Oct4-GFP + colonies after 16 days in Basal medium (Fig. 5D). PECAM1 + cells were observed among these Oct4-GFP + cells (Fig. 5E).
  • Naive human PSCs were cultured in PXGL medium (PD0325901 (Sigma, 1 ⁇ M), XAV939 (Millipore, 2 ⁇ M), Go6983 (Fujifilm, 2 ⁇ M) (Bredenkamp et al., 2019. Stem Cell Reports. 1212-1222), human Lif (Fujifilm, 10 ng/ml) and Ndiff227 (Takara Bio) medium supplemented with penicillin/streptomycin (Meiji). Cultures were performed on Matrigel-coated 6-well plates using mitomycin C-inactivated mouse embryonic fibroblast (MEF) feeders.
  • AICAR (Fujifilm, 1 mM) was added to PXGL medium (Liu et al., 2019. Biophys. Res. Commun. 509, pp. 24-31; Liu et al., 2021. iScience. 25;24(7): 102783), VPA (Guo et al., 2017. Development. 144, 2748-2763) was added to Ndiff227 basal medium (PD0325901 (Sigma, 1 ⁇ M), human Lif (Fujifilm, 10 ng/ml), supplemented with penicillin/streptomycin). to induce a naive state.
  • PB-EOS-C(3+)-EiP (EGFP-IRES-Puro) has been described as a reporter of DE-OCT4 transcription and used as a naive marker (Takashima et al., 2014. Cell. 158, 1254-1269; Hotta et al., 2009. Nat. Protoc. 4, 1828-1844).
  • H1 line of human ES cells H1-EOS
  • Ff-I14 line of human iPS cells Ff-I14-EOS
  • PB - EOS-C(3+)-EiP EGFP-IRES-Pro
  • H1-EOS cells were transfected into a piggyback (PB) vector with rtTA expression coupled to mCherry with a tetracycline-inducible (PB) vector containing the cDNA of mutated p38 (D176A and F327S). Tet-ON) transfected with constitutively active p38 (CA-p38) (Xu et al., 2013. Cell Res. 23: 131-141; Liu et al., 2019. Biophys. Res. Commun. 509, pp. 24-31). Doxycycline (DOX)-treated mCherry-positive cells were purified by FACS. Transfected cells were maintained on Matrigel-coated dishes of StemFit AK02N (Ajinomoto).
  • PB piggyback
  • PB tetracycline-inducible
  • pHL-EF1a-hcPBase-iC-A was used for the piggyBac transposase.
  • NEPA21 NEPA GENE was used for electroporation.
  • Immunostaining was performed as previously described (Yamashita et al., 2000. Nature. 408, 92-96). Cells were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes and blocked with Blocking One Histo (Nacalai, diluted 1:20)/PBS+0.5% Triton for 1 hour. Cells were stained with primary antibody diluted in PBS + 0.5% Triton and incubated overnight at 4°C. Alexa488 or Alexa546 (Thermo) conjugated secondary antibodies (anti-rabbit-mouse or goat IgG antibodies) were diluted in PBS + 0.5% Triton and incubated for 1 hour at room temperature. Phosphate-buffered serine with Tween-20 was used for washing, and DAPI was used for nuclear staining.
  • CA-p38 H1-EOS cells were lysed with sample buffer solution containing 2-mercaptoethanol (ME) (Nacalai). Proteins in whole cell lysates were separated using BlotTM Gel (Invitrogen) and transferred to nitrocellulose membranes. The nitrocellulose membrane was blocked with Blocking One (Nacalai) for 30 minutes. Nitrocellulose membranes were then incubated overnight at 4° C. with the following primary antibodies: p38 (Cell Signaling (9212S), 1:1000); phosphorylated p38 (Thr180/Tyr182, Cell Signaling (9215S), 1:1000); ); and ⁇ -actin (Sigma (A5441), 1:10000).
  • ME 2-mercaptoethanol
  • Horseradish peroxidase (anti-mouse-rabbit IgG antibody conjugated with HRP (Cell Signaling, 1:3000-1:1000) was used as a secondary antibody.
  • Can Get Signal Immunoreaction Enhancer Solution kit (Toyobo) was used for antibody dilution.
  • the secondary antibody was incubated at room temperature for 2 hours before detection using an Immobilon western chemiluminescent substrate (Millipore).
  • RNA isolation and RT-qPCR Total RNA was isolated with the RNeasy Mini kit (Qiagen) and Super-Script III (Invitrogen) was used for reverse transcription. All qPCR reactions used SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems). Cells were normalized by the endogenous control RPS18.
  • Mitochondria were stained with tetramethylrhod-amine, ethylester (TMRE, final concentration 20 nM, Life Technologies) for 10 minutes and analyzed by confocal microscopy.
  • RNA sequencing was performed on primed H1-EOS, primed CA-p38 H1-EOS, AICAR-induced naive H1-EOS, CA-p38-induced naive CA-p38 H1-EOS, and VPA-induced naive H1-EOS.
  • primed cells were dissociated by TrypLE TM Select CTS TM and CD75+/SUSD2+ na ⁇ ve cells were sorted by FACS.
  • Total RNA was isolated with the RNeasy Mini kit (Qiagen) and purified with the RNA Clean & Concentrator-5 kit (Zymo Research) according to the manufacturer's instructions.
  • Polyadenylated RNA was enriched using the NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (New England BioLabs).
  • a SMART-Seq Stranded Kit (TaKaRa bio) was used to prepare the RNA-seq library, and the base sequence was determined with Novaseq 6000.
  • the lead is GRCh38. Aligned to p13 and using RSEM (RNA-Seq by Expectation-Maximization), Reads Per Kilobase of transcript, per Million mapped reads (RPKM) was calculated.
  • accessions ERP006823, SRP059279, SRP045911), SRP055810, and SRP074076 were downloaded from the European Nucleotide Archive (ENA).
  • Naive cells were "reprimed” prior to in vitro differentiation. Na ⁇ ve cells were passaged on Matrigel-coated dishes in StemFit AK02N (Ajinomoto) for approximately one month.
  • medium was switched from StemFit AK02N (Ajinomoto) to mTeSR1 (STEMCELL Technologies) and reprimed cells were cultured for 1 week.
  • mTeSR (STEMCELL Technologies) medium was switched to RPMI1640 (Gibco)+B27 medium supplemented with Activin A (R&D, 100 ng/ml) and Wnt3A (Proteintech, 25 ng/ml).
  • reprimed cells were cultured in StemFit AK02N (Ajinomoto) to confluence, followed by mouse embryonic fibroblast preparation (MEF-CM) supplemented with hbFGF (Fujifilm, 4 ng/ml). Cells were overlaid with Matrigel (Invitrogen, 1:60 dilution) for 1 day. The next day, MEF-CM was replaced with RPMI1640 (Gibco) + B27 medium (RPMI1640, 2 mM L-glutamine, x1 B27 supplement without insulin) supplemented with Activin A (R&D, 100 ng/ml) for 24 hours, and then human bone morphogenetic protein 4.
  • RPMI1640 Gibco
  • B27 medium RPMI1640, 2 mM L-glutamine, x1 B27 supplement without insulin
  • Activin A R&D, 100 ng/ml
  • Ndiff227 (Takara Bio) supplemented with hbFGF (Fujifilm, 10 ng/ml), SB431542 (Tocris, 20 mM), Noggin (R&D, 260 ng/ml) for 4 days. After that, the medium was switched to Ndiff227 (Takara Bio) supplemented with hbFGF (Fujifilm, 10 ng/ml) and SB431542 (Tocris, 20 mM).
  • Human naive PSCs was initially monitored by EOS-GFP reporter expression as a naive state marker.
  • Human PSCs expressing the EOS-GFP reporter gene were generated using H1 human ESCs (H1-EOS) and Ff-I14 human iPSCs (Ff-I14-EOS).
  • H1-EOS H1 human ESCs
  • Ff-I14 human iPSCs Ff-I14-EOS
  • VPA valproic acid
  • Fig. 11 successfully induced GFP-positive cells
  • Cell line validation was demonstrated. When these cells were treated with 1 mM AICAR in PXGL medium for 14 days, the appearance of a small GFP-positive cell population was observed.
  • Flow cytometric analysis confirmed the detection of the appearance of very few but distinct GFP-positive cells, distinct from cells treated with PXGL medium alone. It was confirmed that most cells were negative for the prime state marker CD57 and some cells were positive (less than 2%) for the naive state markers CD75 and SUSD2 (Fig. 12). . After the appearance of GFP-positive cells (day 14 of induction), the cells were passaged and cultured with decreasing concentrations of AICAR (0.5 mM) for an additional week (Fig. 10). AICAR was then removed and cells continued to grow in naive maintenance PXGL media alone on MEF feeder cells.
  • GFP-positive cells were able to grow in AICAR-free PXGL medium for more than 4 months and exhibit naive, dome-shaped colonies (Fig. 13). In this culture condition (PXGL with MEF feeder cells) the doubling time was 4-5 days.
  • the CD75+/SUSD2+/GFP+ cell population was enriched after passaging and clearly identified by flow cytometric analysis.
  • RT-qPCR analysis on FACS-purified CD75- and SUSD2-positive naive-like cells revealed that the pluripotent markers Oct4 and Nanog were significantly associated with both primed H1-EOS, VPA-induced naive-like cells, and AICAR-induced naive-like cells.
  • naive state markers Klf4, Tfcp2l1, Stella, and Klf2 were expressed only in naive-like cells (Fig. 14).
  • Immunofluorescent staining also revealed that OCT4 and NANOG were expressed in both primed H1-EOS and naive-like cells, whereas the naive marker KLF17 was expressed only in naive-like cells.
  • Nuclear translocation of TFE3 has been reported to occur in naive cells (Betschinger et al., 2013. Cell. 153(2):335-47).
  • VPA-induced naive-like cells and AICAR-induced naive-like cells showed nuclear localization of TFE3, whereas primed H1-EOS cells had a cytoplasmic localization (FIG. 15).
  • TMRE tetramethylrhodamine methyl ester
  • increased mitochondrial activity characteristic of naive PSCs was observed in AICAR-induced naive-like cells more than in primed H1-EOS cells (FIG. 16). All these results indicate that AICAR-induced cells have various features of the naive state.
  • hiPSCs Ff-I14-EOS
  • AICAR treatment successfully induced dome-shaped naive cell-like colonies of CD75+/SUSD2+/GFP+ (Fig. 17).
  • AICAR-induced naive-like human pluripotent stem cells have differentiation potential
  • the differentiation potential of AICAR-induced naive-like cells was assessed by in vitro differentiation. Since the induction protocol used was developed for primed PSCs, AICAR-induced naive-like cells were "re-primed” by culturing for 3 or more passages in primed cell medium AK02N. The reprimed cells showed differentiation into three germline lines. When differentiated using the mesoderm induction method (modified DD protocol (Uosaki et al., 2011. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 155-169)), THY1-positive or PDGFR ⁇ -positive mesodermal cells emerge. (Fig. 18(A)).
  • Endoderm (SOX17-positive or CXCR4-positive) was induced by treatment with Activin A and Wnt3A (Kroon et al., 2008. Nat. Biotechnol. 26, 443-452) (Fig. 18B). Neural differentiation was achieved using Noggin and SB431542 (Chambers et al., 2009. Nat. Biotechnol. 27, 275-280) and confirmed by immunostaining for TUJ1 and MAP2 (Fig. 18C).
  • Histone 3 lysine 9 trimethylation (H3K9me3) is one of the heterochromatin markers. H3K9me3 staining shows foci formation in primed PSCs, whereas it disappears in the naive state (Takashima et al, 2014. Cell. 158, 1254-1269). Consistent with this, H3K9me3 foci were observed in primed H1-EOS but not in AICAR-induced naive-like cells (FIG. 19). Human ICM cells, naive mouse ES cells, and naive human PSCs show global DNA hypomethylation, whereas primed mouse Epi-SCs and primed human PSCs show hypermethylation.
  • XaXi Xa: active X chromosome
  • Xi inactive X chromosome
  • X-chromosome analysis of AICAR-induced naive-like cells confirmed that they were XaXa (FIG. 21).
  • Tetracycline-inducible (Tet-ON) CA-p38 was transfected into H1-EOS (CA-p38-H1-EOS) cells. In these cells, doxycycline (DOX) treatment can phosphorylate and activate p38 ( Figures 23, 24). When p38 was activated by DOX treatment with PXGL medium for 5 days (Fig. 25), EOS-GFP positive cell clusters began to be observed. Flow cytometry analysis confirmed the appearance of CD75+/SUSD2+/CD57-/GFPdull cells (less than 2%) as in AICAR treatment (Fig. 26). CA-p38-induced GFP-positive cells were then cultured and expanded in PXGL medium on DOX-free MEF feeder cells.
  • CA-p38 induced cells were maintained for over 4 months with a doubling time of approximately 4 days. After proliferation, CA-p38-induced GFP-positive cells formed dome-shaped naive cell-like colonies (FIG. 27), which were confirmed to be EOS-GFP-positive and CD75, SUSD2-positive by flow cytometry analysis. CD75 and SUSD2 double positive cells induced by CA-p38 were sorted by FACS and analyzed by RT-qPCR. These cells expressed similar pluripotency markers (Oct4, Nanog) to primed cells (H1-EOS-GFP) and higher naive state markers (Klf4, Tfcp2l1, Stella, Klf2) than primed cells. Expression was confirmed (Fig. 28).
  • CA-p38 induced cells showed expression of pluripotent markers, expression of naive state markers, and nuclear localization of TFE3 (FIG. 29).
  • CA-p38-induced GFP-positive cells showed mitochondrial activation by TMRE staining and naive state characteristics similar to AICAR-induced naive-like cells in the epigenome (data not shown). It was confirmed that reprimed CA-p38-induced cells could differentiate into all three germinal layers (data not shown). These results confirmed the successful naiveization of hESCs by CA-p38 activation.
  • RNA-seq data of AICAR, CA-p38, or VPA-induced naive-like cells and their parental primed cells were collected and compared.
  • Principal component analysis (PCA) confirmed that HNES1 and chemically reset (VPA) cells were located in close proximity. These were cells established in the same laboratory (Guo et al., 2016. Stem Cell Rep. 6, 437-446; Guo et al., 2017. Development. 144, 2748-2763).
  • Naive-like cells induced by AICAR, CA-p38, or VPA, and naive-like cells induced by 5iL/A are clusters of HNES1 and cR cells.
  • EPS cells previously reported as a type of naive-like cells (Yang et al., 2017. Cell. 169, 243-257.e25) and NHSM/4i-induced cells (Gafni et al., 2013. Nature. 504, 282). -286) were located near primed cells.
  • Heatmap analysis of 66 genes associated with naive and primed pluripotency revealed that AICAR-induced naive-like cells and CA-p38-induced naive-like cells had gene expression similar to other naive cells, including HNES1 cells. This was clearly confirmed (Fig. 31). These data indicated that various naive-like cells formed distinct clusters with each parental primed cell (Fig. 31). These results indicate that activation of AICAR or p38 can induce reversion to the naive form in human primed PSCs.
  • a method for inducing primed pluripotent stem cells into naive pluripotent stem cells a method for producing naive pluripotent stem cells from primed pluripotent stem cells, and a method that can be used in these methods
  • a naive pluripotent stem cell induction kit and a naive pluripotent stem cell inducer are provided.

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Abstract

プライム型多能性幹細胞を、ＡＭＰＫ活性化剤を含む培地中で培養する工程を含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法。また、プライム型多能性幹細胞のｐ３８　ＭＡＰＫを活性化させる工程を含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法。また、プライム型多能性幹細胞を、ＡＭＰＫ活性化剤を含む培地中で培養する工程を含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法。また、プライム型多能性幹細胞のｐ３８　ＭＡＰＫを活性化させる工程を含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法。また、前記方法のためのナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット、及びナイーブ型多能性幹細胞誘導剤。

Description

プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法、ナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット、及びナイーブ型多能性幹細胞誘導剤
　本発明は、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法、ナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット、及びナイーブ型多能性幹細胞誘導剤に関する。
　本願は、２０２１年３月１２日に、米国に出願された米国仮出願番号６３／１５９，９９８号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　体中のあらゆる細胞に分化しうる多能性幹細胞には、大きく分けてナイーブ型とプライム型の２種類の状態がある。ナイーブ型多能性幹細胞は、胚盤胞における内細胞塊と呼ばれる部位と同等の未分化性を有していると考えられる。ナイーブ型多能性幹細胞は、胚への移植後に、キメラ形成に寄与したり、生殖細胞系列に分化したりすることが可能である。一方、プライム型多能性幹細胞は、胚盤胞からやや発生が進んだ着床後のエピブラストに相当する細胞と考えられる。プライム型多能性幹細胞は、多分化能を有するが、キメラ形成能、及び生殖細胞系列への分化能は失われている。マウス多能性幹細胞には、ナイーブ型及びプライム型の両方が存在する。一方、霊長類多能性幹細胞は、一般に、プライム型である。ヒトナイーブ型多能性幹細胞は、キメラ形成能を利用して、動物体内でヒト臓器作製を行うなどの新しい再生医療への応用が期待されている。ヒトナイーブ型多能性幹細胞は、ヒト発生過程の解析、及び生殖細胞系列の誘導などの種々の新しい研究への応用も期待されている。
　プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞への変換に関与する物質として、これまでに複数の物質が報告されている（例えば、非特許文献１）。また、アデノシン一リン酸活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）の活性化は、ナイーブ型多能性幹細胞の維持に寄与することが報告されている（非特許文献２）。
Guo G et al., Epigenetic resetting of human pluripotency. Development. 2017 Aug 1;144(15):2748-2763. Liu Y, Yamashita JK., AMPK activators contribute to maintain naive pluripotency in mouse embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun, 509:24-31, 2019.
　これまでに、プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞への変換に寄与する因子が幾つか報告されているが、どのようなシグナルが本当に重要であるかは、不明である。そのため、プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞への変換を可能にする技術開発が求められている。
　そこで、本発明は、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型能異性幹細胞に誘導する方法、及びプライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法、並びにこれらの方法に使用可能なナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット、及びナイーブ型多能性幹細胞誘導剤を提供することを課題とする。
　本開示は、以下の態様を含む。
［１］プライム型多能性幹細胞を、ＡＭＰＫ活性化剤を含む培地で培養する工程を含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法。
［２］前記培地がＬＩＦを更に含む、［１］に記載の方法。
［３］前記ＡＭＰＫ活性化剤が、ＡＩＣＡＲ、Ａ７６９６６２及びメトフォルミンからなる群より選択されるいずれか１種以上の物質である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記プライム型多能性幹細胞がプライム型ＥＳ細胞又はプライム型ｉＰＳ細胞である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の方法。
［５］前記プライム型多能性幹細胞がヒト由来のプライム型ｉＰＳ細胞である、［４］に記載の方法。
［６］プライム型多能性幹細胞のｐ３８　ＭＡＰＫを活性化させる工程を含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法。
［７］前記プライム型多能性幹細胞がプライム型ＥＳ細胞又はプライム型ｉＰＳ細胞である、［６］に記載の方法。
［８］前記プライム型多能性幹細胞がヒト由来のプライム型ｉＰＳ細胞である、［７］に記載の方法。
［９］プライム型多能性幹細胞を、ＡＭＰＫ活性化剤を含む培地で培養する工程を含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法。
［１０］前記培地がＬＩＦを更に含む、［９］に記載の製造方法。
［１１］前記ＡＭＰＫ活性化剤が、ＡＩＣＡＲ、Ａ７６９６６２及びメトフォルミンからなる群より選択されるいずれか１種以上の物質である、［９］又は［１０］に記載の製造方法。
［１２］前記プライム型多能性幹細胞がプライム型ＥＳ細胞又はプライム型ｉＰＳ細胞である、［９］～［１１］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１３］前記プライム型多能性幹細胞がヒト由来のプライム型ｉＰＳ細胞である、［１２］に記載の製造方法。
［１４］プライム型多能性幹細胞のｐ３８　ＭＡＰＫを活性化させる工程を含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法。
［１５］前記プライム型多能性幹細胞がプライム型ＥＳ細胞又はプライム型ｉＰＳ細胞である、［１４］に記載の製造方法。
［１６］前記プライム型多能性幹細胞がヒト由来のプライム型ｉＰＳ細胞である、［１５］に記載の製造方法。
［１７］ＡＭＰＫ活性化剤を含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導するための、ナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット。
［１８］ＬＩＦを更に含む、［１７］に記載のナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット。
［１９］前記ＡＭＰＫ活性化剤が、ＡＩＣＡＲ、Ａ７６９６６２及びメトフォルミンからなる群より選択されるいずれか１種以上の物質である、［１７］又は［１８］に記載のナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット。
［２０］前記プライム型多能性幹細胞がプライム型ＥＳ細胞又はプライム型ｉＰＳ細胞である、［１７］～［１９］のいずれか１つに記載のナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット。
［２１］前記プライム型多能性幹細胞がヒト由来のプライム型ｉＰＳ細胞である、［２０］に記載のナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット。
［２２］ｐ３８　ＭＡＰＫ活性化剤を含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導するための、ナイーブ型多能性幹細胞誘導剤。
　本発明によれば、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型能異性幹細胞に誘導する方法、及びプライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法、並びにこれらの方法に使用可能なナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット、及びナイーブ型多能性幹細胞誘導剤が提供される。
ナイーブ型復帰プロトコルのスキーム。 ＦＧＦ２及びＡｃｔｉｖｉｎ　Ａで維持されたマウスプライム型エピ幹細胞（ｍＥｐｉＳＣｓ）。上パネル：細胞形態及びＯＣｔ４－ＧＦＰ発現。下パネル：Ｏｃｔ４－ＧＦＰ及びＰＥＣＡＭ１のＦＡＣＳ解析。ＳＳＣ；ｓｉｄｅ　ｓｃａｔｔｅｒ。スケールバー，２００μｍ。 Ｂａｓａｌ培地単独、２ｉ／Ｌ、ＡＩＣＡＲ、又はＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦで１６日間処理した後の細胞形態とＯｃｔ４－ＧＦＰ発現量。４組の位相差画像とＯｃｔ４－ＧＦＰ画像を各条件で示す。スケールバー、２００μｍ。 復帰の１６日後のＯｃｔ４－ＧＦＰと発現及びＰＥＣＡＭ１発現のＦＡＣＳ解析。図中のパーセンテージは、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ陽性集団におけるＰＥＣＡＭ１陽性細胞のパーセンテージである。 全細胞中のＯｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞の割合と、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞中のＰＥＣＡＭ１陽性細胞の割合の定量的評価（ｎ＝５；Ｎ．Ｄ．；ｎｏｔ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ）。 ＡＩＣＡＲ誘導復帰細胞及びＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦ誘導復帰細胞の細胞形態及びＯｃｔ４－ＧＦＰ発現。スケールバー、２００μｍ。 維持されたプライム型ｍＥｐｉＳＣｓ（Ｏｃｔ４ＧＩＰ）、並びにＡＩＣＡＲ若しくはＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦで誘導された復帰細胞におけるＯｃｔ４－ＧＦＰ及びＰＥＣＡＭ１についてのＦＡＣＳ分析（ｄ１６＋１０ｐ）。図中のパーセンテージは全細胞中のＯｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞又はＰＥＣＡＭ１陽性細胞のパーセンテージである。 ＡＩＣＡＲ又はＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦで誘導された復帰細胞の増殖。５～１０継代の復帰細胞の細胞数を２ｉ／Ｌで維持されたナイーブ型ｍＥＳＣｓと比較した（平均±ＳＤ；ｎ＝５）。 アルカリホスファターゼ陽性（ＡＰ＋）コロニー形成アッセイ。平均±ＳＤ；ｎ＝５，ＮＳ：ｎｏｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ。 ナイーブ型ｍＥＳＣ、プライム型ｍＥｐｉＳＣｓ（Ｏｃｔ４ＧＩＰ）、並びにＡＩＣＡＲ若しくはＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦで誘導された復帰細胞におけるナイーブマーカー遺伝子および多能性マーカー遺伝子発現。Ｎａｉｖｅ　ｍＥＳＣｓ：２ｉＬで維持されたＲｅｘ１－ＧＦＰ細胞。発現量はＧＡＰＤＨで標準化した。データは平均値±ＳＤで表した（ｎ＝５；ｗｉｔｈ　ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）。ナイーブ型ＥＳＣｓの発現量を１とした。 ナイーブ型ｍＥＳＣ（Ｒｅｘ１－ＧＦＰ）、プライミング型ｍＥｐｉＳＣｓ（Ｏｃｔ４ＧＩＰ）、並びにＡＩＣＡＲ若しくはＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦで誘導した復帰細胞におけるナイーブマーカー及び多能性マーカーの免疫蛍光染色。スケールバー、２０μｍ。 異なる細胞種におけるＰＣＦ遺伝子シグネチャー（２０３６遺伝子）の主成分分析。 多能性制御因子及び系列マーカーの遺伝子発現のヒートマップ。 プライム型ｍＥｐｉＳＣ　１２９／Ｂａ１、並びにＡＩＣＡＲ若しくはＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦで誘導された復帰１２９／Ｂａ１細胞の形態。スケールバー、２００μｍ。 ＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦ又はＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦ＋ｐ３８阻害剤（ｐ３８ｉ；ＳＢ２０３５８０（１０μＭ））で処理した細胞のＦＡＣＳ解析。図中のパーセンテージは、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ陽性集団におけるＰＥＣＡＭ１陽性細胞の割合を示す。 ＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦまたはＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦ＋ｐ３８ｉによる復帰後、２ｉＬで７日間培養したバルク細胞のＦＡＣＳ解析。図中のパーセンテージは、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ陽性集団におけるＰＥＣＡＭ１陽性細胞の割合を示す。 ＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦ又はＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦ＋ｐ３８ｉによる復帰後、２ｉＬで７日間培養したバルク細胞のＡＰ染色。 Ｄｏｘ（１μｇ／ｍＬ）及び／又はＬＩＦ処理１６日後（ｄ１６）の代表的な細胞形態及びＯｃｔ４－ＧＦＰ発現量。スケールバー、２００μｍ。 Ｄｏｘ及び／又はＬＩＦ処理１６日後（ｄ１６）のＯｃｔ４－ＧＦＰ発現及びＰＥＣＡＭ１発現のＦＡＣＳ分析。図中のパーセンテージは、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ陽性集団におけるＰＥＣＡＭ１陽性細胞の割合を示す。 ２ｉＬ条件で増殖させた後、Ｄｏｘ＋又はＬＩＦ＋Ｄｏｘ＋条件で復帰させた細胞の代表的な細胞形態及びＯｃｔ４－ＧＦＰ発現（ｄ１６＋１０ｐ）。スケールバー、２００μｍ。 Ｄｏｘ＋又はＬＩＦ＋Ｄｏｘ＋で復帰させた細胞のＯｃｔ４－ＧＦＰおよびＰＥＣＡＭ１についてのＦＡＣＳ解析（ｄ１６＋１０ｐ）。図中のパーセンテージは、全細胞におけるＯｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞又はＰＥＣＡＭ１陽性細胞の割合を示す。 Ｄｏｘ＋又はＬＩＦ＋Ｄｏｘ＋（ｄ１６＋１０ｐ）で復帰させた細胞におけるナイーブマーカー及び多能性マーカーの免疫蛍光染色。スケールバー、２０μｍ。 ３種類のＡＭＰＫ活性化剤（ＡＩＣＡＲ（１ｍＭ）、Ａ７６９６６２（５０μＭ）、メトフォルミン（１ｍＭ））によるプライム型ｍＥｐｉＳＣｓ（Ｏｃｔ４ＧＩＰ）のＡＭＰＫ活性化の定量的評価。ウェスタンブロット解析の結果をｐ－ＡＭＰＫ／ＡＭＰＫ密度比で定量化した。コントロールサンプルの値を１とした。ｐ－ＡＭＰＫ：リン酸化ＡＭＰＫ（活性化）；ＡＭＰＫ：ｔｏｔａｌ　ＡＭＰＫ。平均値±ＳＤ、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１，Ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｔｅｓｔ。 Ａ７６９６６２、Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ、又はメトフォルミン＋ＬＩＦで１６日間処理した後のＯｃｔ４ＧＩＰの細胞形態及びＯｃｔ－ＧＦＰ発現。位相差画像及びＯｃｔ４－ＧＦＰ画像。スケールバー、２００μｍ。 ＦＡＣＳ解析で得られた全細胞におけるＯｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞の定量的評価。ｎ＝４；Ｎ．Ｄ．：ｎｏｔ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ。 ＦＡＣＳ分析で得られたＯｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞におけるＰＥＣＡＭ１陽性細胞の定量的評価。ｎ＝４；Ｎ．Ｄ．：ｎｏｔ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ。 Ａ７６９６６２、Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ、又はＡ７６９６６２＋ＬＩＦ（ｄ１６＋１０ｐ）による復帰細胞の２ｉＬ条件での増殖後の細胞形態及びＯｃｔ４－ＧＦＰ発現。スケールバー、２００μｍ。 Ａ７６９６６２、Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ、又はメトフォルミン＋ＬＩＦ（ｄ１６＋１０ｐ）で復帰させた細胞におけるＯｃｔ４－ＧＦＰ及びＰＥＣＡＭ１のＦＡＣＳ解析。図中のパーセンテージは、全細胞におけるＯｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞又はＰＥＣＡＭ１陽性細胞の割合を示す。 復帰細胞の細胞増殖。５～１０回継代中の復帰細胞の細胞数を、２ｉＬで維持したナイーブ型ｍＥＳＣと比較した。平均値±ＳＤ；ｎ＝４。 ＡＰ＋コロニー形成アッセイ。５００個の復帰細胞（ｄ１６＋１０ｐ）又はナイーブ型ｍＥＳＣｓを２ｉＬ条件でプレーティングした。５日間培養後、ＡＰ染色されたコロニーを数えた。平均値±ＳＤ；ｎ＝４，ＮＳ：ｎｏｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ。 ナイーブ型ｍＥＳＣｓ、プライム型ｍＥｐｉＳＣｓ（Ｏｃｔ４ＧＩＰ）、並びにＡ７６９６６２、Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ、若しくはメトフォルミン＋ＬＩＦ（ｄ１６＋１０ｐ）による復帰細胞ナイーブｍＥＳＣｓのナイーブマーカー及び多能性マーカーの発現（ｑＰＣＲ）。ナイーブ型ＥＳＣｓ：２ｉＬで維持されたＲｅｘ１－ＧＦＰ細胞。発現量はＧＡＰＤＨで標準化した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝４；ｗｉｔｈ　ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）で示した。ナイーブ型ｍＥＳＣｓの結果を１とした。 Ａ７６９６６２、Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ、又はメトフォルミン＋ＬＩＦ（ｄ１６＋１０ｐ）による復帰細胞におけるナイーブマーカー及び多能性マーカーの免疫蛍光染色。スケールバー、２０μｍ。 プライム型ｍＥｐｉＳＣ　１２９／ＭＳＭ、及びＡＩＣＡＲ若しくはＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦ（ｄ１６＋１０ｐ）による復帰１２９／ＭＳＭ細胞の細胞形態。スケールバー、２００μｍ。 ２ｉ／Ｌで７日間培養した復帰１２９／ＭＳＭ細胞（ｄ１６＋１ｐ）のＡＰ染色。 異なる細胞種における全遺伝子シグネチャー（３４４８９遺伝子）の主成分分析。 ＡＭＰＫ活性化剤によるｐ３８活性化の定量的評価。ｐ－ｐ３８：リン酸化ｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）；ｐ３８：ｔｏｔａｌ　ｐ３８。ウェスタンブロット解析の結果をｐ－ｐ３８／ｐ３８密度比で定量化した。コントロールサンプルの値を１とした。ｐ－ＡＭＰＫ：リン酸化ＡＭＰＫ（活性化）；ＡＭＰＫ：ｔｏｔａｌ　ＡＭＰＫ。平均値±ＳＤ、ｎ＝３、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１，Ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　ｆｏｌｌｏｗｅｄ　ｂｙ　Ｔｕｋｅｙ’ｓ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｔｅｓｔ。 Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ、Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ＋ｐ３８ｉ、メトフォルミン＋ＬＩＦ、又はメトフォルミン＋ＬＩＦ＋ｐ３８ｉによる復帰後、２ｉＬで７日間培養したバルク細胞のＦＡＣＳ解析。 Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ、Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ＋ｐ３８ｉ、メトフォルミン＋ＬＩＦ、又はメトフォルミン＋ＬＩＦ＋ｐ３８ｉによる復帰後、２ｉＬで７日間培養したバルク細胞のＡＰ染色。 Ｄｏｘ誘導型（Ｄｏｘ－ＯＮ）構成的活性型ｐ３８（ＣＡ－ｐ３８）によるｐ３８経路の活性化の定量的評価。ドキシサイクリン（１μｇ／ｍＬ）で処理した後、または処理せずに、ｐ－ｐ３８、ｐ３８、及びβ－アクチンのウェスタンブロット解析を行い、ｐ－ｐ３８／ｐ３８の密度比により定量化した。コントロール：元のＯｃｔ４ＧＩＰ細胞。コントロールサンプルの値を１とした。平均±０．ＳＤ，ｎ＝３，＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，ＮＳ：ｎｏｔ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ。 ＡＩＣＡＲを用いたナイーブ型復帰プロトコル。 ＶＰＡにより誘導されたナイーブ型ｈＥＳＣｓ（Ｈ１－ＥＯＳ）の画像（ｄａｙ９＋６ｐ）。ＶＰＡ：バルプロ酸。スケールバー、１００μｍ。 ＥＯＳ－ＧＦＰ、ＳＵＳＤ２、ＣＤ７５及びＣＤ５７発現のフローサイトメトリー解析。 ＰＸＧＬで増殖後のＥＯＳ－ＧＦＰ陽性ナイーブ様コロニー（ｄａｙ１４＋１４ｐ）。スケールバー、１００μｍ。 選別されたＳＵＳＤ２＋ＣＤ７５＋細胞、及び親プライム型ｈＥＳＣｓ（Ｈ１－ＥＯＳ）のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。 プライム型細胞及びＡＩＣＡＲ誘導細胞のＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１７、及びＴＦＥ３の蛍光免疫染色。スケールバー、５０μｍ。 ミトコンドリア膜活性に依存するミトコンドリアのＴＭＲＥ染色。スケールバー、５０μｍ。 ＡＩＣＡＲ（ｄａｙ１４＋７ｐ）で誘導したナイーブ型ｈｉＰＳＣｓ（Ｆｆ－Ｉ１４－ＥＯＳ）の画像。スケールバー、１００μｍ。 ＡＩＣＡＲ誘導ナイーブ様細胞の分化。（Ａ）中胚葉マーカー（ＴＨＹ１、ＰＤＧＦＲβ）の免疫蛍光染色。（Ｂ）内胚葉マーカー（ＳＯＸ１７、ＣＸＣＲ４）の免疫蛍光染色。（Ｃ）外胚葉マーカー（ＭＡＰ２、ＴＵＪ１）の免疫蛍光染色。スケールバー、１００μｍ。 Ｈ３Ｋ９ｍｅ３についての免疫蛍光染色。スケールバー、５０μｍ。 ５ｍＣ、５ｈｍＣ、及びＮＡＮＯＧについての免疫蛍光染色。ＡＩＣＡＲ：ｄａｙ１４＋１４ｐ。スケールバー、１００μｍ。 Ｘ染色体不活性化解析。Ｘａ：活性型。Ｘｉ：不活性型。 ｐ３８阻害剤（ＳＢ２０３５８０）処理後のＥＯＳ－ＧＦＰ、ＳＵＳＤ２、及びＣＤ７５のフローサイトメトリー解析。 Ｔｅｔ誘導型ＣＡ－ｐ３８発現システム（上パネル）。Ｄｏｘ処理後のｐ３８タンパク質についてのウェスタンブロット解析（下パネル）。 ウェスタンブロッティングによるｐ－ｐ３８発現解析。エラーバーはＳ．Ｅ．を示す。ｎ＝３。 ｐ３８活性化によるナイーブ型復帰プロトコル。 ＣＡ－ｐ３８の誘導後のＥＯＳ－ＧＦＰ、ＳＵＳＤ２、ＣＤ７５、及びＣＤ５７発現のフローサイトメトリー解析。 ＰＸＧＬでの増殖後のＥＯＳ－ＧＦＰ陽性ナイーブ様コロニー。スケールバー、１００μｍ。 選別されたＳＵＳＤ２＋ＣＤ７５＋ナイーブ型ｈＥＳＣｓ及びプライム型ｈＥＳＣｓ（ＣＡ－ｐ３８Ｈ１－ＥＯＳ）のＲＴ－ｑＰＣＲ解析。 ナイーブ様復帰細胞のＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ１７、及びＴＦＥ３についての免疫蛍光染色。 様々なナイーブ型ｈＰＳＣｓ及びプライム型ｈＰＳＣｓについてＲＮＡシーケンスを用いて解析を行った全ヒト遺伝子の遺伝子発現の主成分分析。 ナイーブ型遺伝子セット及びプライム型遺伝子セットのＲＮＡ発現のヒートマップ。
＜ナイーブ型多能性幹細胞の誘導方法＞
　本開示の第１の態様は、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法である。本態様の方法は、プライム型多能性幹細胞を、ＡＭＰＫ活性化剤を含む培地で培養する工程を含む。
（多能性幹細胞）
　多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能を有する幹細胞である。多能性幹細胞の具体例としては、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、ｎｔＥＳ細胞（ｎｕｃｌｅａｒ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ）、ｍＧＳ細胞（Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ　ｇｅｒｍｌｉｎｅ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｇｅｒｍ　ｃｅｌｌ）等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞、又はＥＳ細胞である。
　多能性幹細胞が由来する生物の種類は特に限定されない。多能性幹細胞は、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫類等の細胞に由来するものであってよい。哺乳類としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類（サル、チンパンジー、ゴリラ、コモンマーモセット、カニクイザルなど）、げっ歯類（マウス、ラット、モルモット、ハムスターなど）、イヌ、ネコ、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ等が挙げられるが、これらに限定されない。
　多能性幹細胞は、公知の方法により得ることができる。例えば、ｉＰＳ細胞は、任意の体細胞に初期化因子を導入することにより製造することができる。初期化因子とは、体細胞に導入することにより、当該体細胞をｉＰＳ細胞に誘導することが可能な因子である。初期化因子としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３、及びＧｌｉｓ１等の遺伝子、並びにこれらの遺伝子産物が挙げられる。初期化因子は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。初期化因子の組み合わせとしては、例えば、国際公開第２００７／０６９６６６号、国際公開第２００８／１１８８２０号、国際公開第２００９／００７８５２号、国際公開第２００９／０３２１９４号、国際公開第２００９／０５８４１３号、国際公開第２００９／０５７８３１号、国際公開第２００９／０７５１１９号、国際公開第２００９／０７９００７号、国際公開第２００９／０９１６５９号、国際公開第２００９／１０１０８４号、国際公開第２００９／１０１４０７号、国際公開第２００９／１０２９８３号、国際公開第２００９／１１４９４９号、国際公開第２００９／１１７４３９号、国際公開第２００９／１２６２５０号、国際公開第２００９／１２６２５１号、国際公開第２００９／１２６６５５号、国際公開第２００９／１５７５９３号、国際公開第２０１０／００９０１５号、国際公開第２０１０／０３３９０６号、国際公開第２０１０／０３３９２０号、国際公開第２０１０／０４２８００号、国際公開第２０１０／０５０６２６号、国際公開第２０１０／０５６８３１号、国際公開第２０１０／０６８９５５号、国際公開第２０１０／０９８４１９号、国際公開第２０１０／１０２２６７号、国際公開第２０１０／１１１４０９号、国際公開第２０１０／１１１４２２号、国際公開第２０１０／１１５０５０号、国際公開第２０１０／１２４２９０号、国際公開第２０１０／１４７３９５号、国際公開第２０１０／１４７６１２、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y,et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26: 2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat.Biotechnol.26:1269-1275、Shi Y,et al.,(2008),Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y,et al. (2008), Cell Stem Cell, 3: 475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat. Cell Biol. 11: 197-203、R. L. Judson et al. (2009), Nat. Biotechnol., 27: 459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461: 649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6: 167-74、Han J, et al. (2010), Nature.463: 1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28: 713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474: 225-9等に記載の組み合わせが挙げられる。
　ｉＰＳ細胞の製造に用いる体細胞の種類は特に限定されない。体細胞には、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、及び成熟し個体の健全な若しくは疾患性の体細胞のいずれも包含される。体細胞は培養細胞であってもよく、初代培養細胞、継代細胞、及び株化細胞のいずれも包含される。体細胞の具体例としては、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞、及び脂肪細胞等の分化した細胞等が挙げられる。
（ナイーブ型多能性幹細胞）
　ナイーブ（ｎａｉｖｅ）型多能性幹細胞は、着床前胚と同一若しくは類似した性質を持つ多能性幹細胞である。ナイーブ型多能性幹細胞は、具体的には、以下のような特徴を有する。
（ｎ１）ドーム型のコロニー形態を示す。
（ｎ２）胚への移植によりキメラを形成する。
（ｎ３）アルカリホスファターゼ活性を有する。
（ｎ４）染色体ＤＮＡメチル化レベルがプライム型多能性幹細胞よりも低い。
（ｎ５）両Ｘ染色体が活性化される：ＸａＸａ。
（ｎ６）ヒストンＨ３のリジン残基が低メチル化傾向であり、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の免疫染色を行った場合、フォーサイ（ｆｏｃｉ）が確認されない。
（ｎ７）ナイーブマーカー（Ｒｅｘ１，Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、Ｔｆｃｐ２ｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＣＤ７５、ＳＵＳＤ２等；マウス多能性幹細胞では前記に加えてＰＥＣＡＭ１、Ｅｓｒｒｂ等）を発現する。
（ｎ８）プライム型多能性幹細胞よりもミトコンドリア活性が高い。テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）染色で染色される。
（ｎ９）ＯＣＴ３／４遺伝子の転写において遠位エンハンサーを優先的に使用する。
（ｎ１０）多能性マーカー（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２等）を発現する。
（プライム型多能性幹細胞）
　プライム（ｐｒｉｍｅｄ）型多能性幹細胞は、着床後胚のエピブラストと同一若しくは類似した性質を有する多能性幹細胞である。体細胞に初期化因子を導入して得られる一般的なｉＰＳ細胞及びヒトＥＳ細胞は、通常、プライム型多能性幹細胞である。プライム型多能性幹細胞は、具体的には、以下のような特徴を有する。
（ｐ１）扁平なコロニー形態を示す。
（ｐ２）胚への移植によりキメラを形成しない。
（ｐ３）アルカリホスファターゼ活性を有さない。
（ｐ４）染色体ＤＮＡメチル化レベルがナイーブ型多能性幹細胞よりも高い。
（ｐ５）片方のＸ染色体のみ活性化される：ＸａＸｉ。
（ｐ６）ヒストンＨ３のリジン残基がメチル化傾向であり、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３の免疫染色を行った場合、フォーサイ（ｆｏｃｉ）が確認される。
（ｐ７）ナイーブマーカー（ＰＥＣＡＭ１、Ｒｅｘ１，Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、Ｅｓｒｒｂ、Ｔｆｃｐ２ｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、ＣＤ７５、ＳＵＳＤ２等）を発現しない。
（ｐ８）プライムマーカー（ヒト多能性幹細胞ではＣＤ５７）を発現する。
（ｐ９）ナイーブ型多能性幹細胞よりもミトコンドリア活性が低い。テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）染色で染色されない。
（ｐ１０）ＯＣＴ３／４遺伝子の転写において近位エンハンサーを優先的に使用する。
（ｐ１１）多能性マーカー（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２等）を発現する。
　（ｎ１０）及び（ｐ１１）は、ナイーブ型多能性幹細胞及びプライム型多能性幹細胞に共通する特徴である。
　プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞が誘導されると、上記（ｐ１）～（ｐ１０）のようなプライム型の性質が消失し、上記（ｎ１）～（ｎ９）のようなナイーブ型の性質に置き換わる。本態様の方法に得られるナイーブ型多能性幹細胞は、上記（ｎ１）～（ｎ９）の少なくとも１つ以上の性質を有し、３つ以上の性質を有することが好ましく、５つ以上の性質を有することがより好ましく、７つ以上の性質を有することがさらに好ましく、（ｎ１）～（ｎ９）の全ての性質を有することが特に好ましい。さらに、（ｎ１０）の特徴を有することが好ましい。
　本態様の方法で用いるプライム型多能性幹細胞は、プライム型の状態である多能性幹細胞であれば、特に限定されない。好ましいプライム型多能性幹細胞としては、例えば、プライム型ＥＳ細胞、プライム型ｉＰＳ細胞が挙げられる。
（ＡＭＰＫ活性化剤含有培地）
　本態様の方法は、ＡＭＰＫ活性化剤を含む培地（以下、「ＡＭＰＫ活性化剤含有培地」ともいう）でプライム型多能性幹細胞を培養する工程を含む。ＡＭＰＫ活性化剤含有培地は、動物培養に用いられる基礎培地に、ＡＭＰＫ活性化剤を添加した培地であってよい。
≪基礎培地≫
　基礎培地は、特に限定されず、動物培養に通常用いられるものを特に制限なく使用することができる。基礎培地としては、例えば、Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓ　ＭＥＭ（ＧＭＥＭ）培地、Ｎ２Ｂ２７培地（ＮＤｉｆｆ　２２７培地）、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓＦ１２（Ｆ１２）培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの混合培地等が挙げられるが、これらに限定されない。培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（ＦＢＳ））が含有されていてもよいし、又は無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、トランスフェリン、ＫｎｏｃｋＯｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時の血清代替物）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよい。また、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、及びこれらの同等物などの１つ以上の物質を含んでいてもよい。
　基礎培地は、多能性幹細胞が由来する生物種に応じて選択してもよい。例えば、マウス多能性幹細胞の場合、基礎培地として、ＧＭＥＭ培地を用いてもよく、ＧＭＥＭ培地に、血清、血清代替物、ＮＥＡＡ，ピルビン酸等を添加したものを用いてもよい。ヒト多能性幹細胞の場合、基礎培地として、Ｎ２Ｂ２７培地を用いてもよい。
≪ＡＭＰＫ活性化剤≫
　ＡＭＰＫ（５’ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）活性化剤は、ＡＭＰＫを活性化する機能を有する物質である。ＡＭＰＫ活性化剤は、例えば、ＡＭＰＫをリン酸化する機能を有し、ＡＭＰＫをリン酸化することによりＡＭＰＫを活性化する。
　ＡＭＰＫ活性化剤は、公知のものを特に制限なく、用いることができる。ＡＭＰＫ活性化剤としては、例えば、ＡＩＣＡＲ（５－ａｍｉｎｏ－１－［（２Ｒ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）－３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－５－（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ｏｘｏｌａｎ－２－ｙｌ］－１Ｈ－ｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）、Ａ７６９６６２（６，７－Ｄｉｈｙｄｒｏ－４－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－（２’－ｈｙｄｒｏｘｙ［１，１’－ｂｉｐｈｅｎｙｌ］－４－ｙｌ）－６－ｏｘｏ－ｔｈｉｅｎｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）、及びメトフォルミン（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄｏｄｉｃａｒｂｏｎｉｍｉｄｉｃ　ｄｉａｍｉｄｅ）等、並びにこれらの誘導体等が挙げられる。メトフォルミンは、メトフォルミン塩酸塩等の酸性塩の形態であってもよい。これらの化合物は、市販品を用いてもよく、自ら作製してもよい。
　ＡＭＰＫ活性化剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ＡＭＰＫ活性化剤含有培地におけるＡＭＰＫ活性化剤の濃度は、ＡＭＰＫ活性化剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＡＭＰＫ活性化剤含有培地におけるＡＭＰＫ活性化剤の濃度としては、例えば、０．００１～１００ｍＭが挙げられ、０．０１～１０ｍＭが好ましい。ＡＭＰＫ活性化剤がＡＩＣＡＲ又はメトフォルミンである場合、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地における濃度としては、０．５～５ｍＭが好ましい。ＡＭＰＫ活性化剤がＡ７６９６６２である場合、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地における濃度としては、０．０１～０．１ｍＭが好ましい。
≪任意成分≫
　ＡＭＰＫ活性化剤含有培地は、ＡＭＰＫ活性化剤に加えて、任意成分を含んでもよい。任意成分としては、例えば、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤等が挙げられる。
・ＬＩＦ
　ＡＭＰＫ活性化剤含有培地は、白血病阻止因子（Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｆａｃｔｏｒ：ＬＩＦ）を含むことが好ましい。ＬＩＦが由来する生物は、特に限定されない。ＬＩＦとしては、例えば、ヒト（特表平１－５０２９８５号公報）、マウス（特表平１－５０２９８５号公報）、ヒツジ（特表平４－５０２５５４号公報）、ブタ（特表平４－５０２５５４号公報）、ウシ（特表平８－１５４６８１号公報）等のＬＩＦを用いることができる。中でも、ヒト又はマウスのＬＩＦが好ましい。ヒトＬＩＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：３９７６）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１２４４０６４．１又はＮＰ＿００２３００．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。マウスＬＩＦ（ＮＣＢＩ　Ｇｅｎｅ　ＩＤ：１６８７８）としては、例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１０３４６２６．１又はＮＰ＿０３２５２７．１のアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。ＬＩＦは、多能性幹細胞が由来する生物に応じて適宜選択することができる。例えば、多能性幹細胞がマウス由来である場合、マウスＬＩＦを用いてもよい。多能性幹細胞がヒト由来である場合、ヒトＬＩＦを用いてもよい。ＬＩＦは、その機能を保持する限り、断片又は機能的改変体であってもよい。ＬＩＦは市販されているものを使用してもよいし、細胞から精製されたタンパク質や遺伝子組み換えで生産されたタンパク質を使用してもよい。
　ＡＭＰＫ活性化剤含有培地がＬＩＦを含有する場合、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地におけるＬＩＦの濃度としては、例えば、０．０１～１０００ｎｇ／ｍＬが挙げられ、０．１～５００ｎｇ／ｍＬが好ましく、１～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１～５０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。また、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地におけるＬＩＦの濃度は、例えば、１０～５０００Ｕ／ｍＬが挙げられ、１００～３０００Ｕ／ｍＬが好ましく、５００～２０００Ｕ／ｍＬがさらに好ましい。
・ＭＥＫ阻害剤
　ＭＥＫ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ）阻害剤は、ＭＥＫの機能を阻害する物質である。ＭＥＫは、細胞増殖因子が細胞の受容体に結合し、核に至るまでの細胞増殖シグナル伝達経路（ＭＡＰキナーゼ経路）にあるリン酸化酵素である。
　ＭＥＫ阻害剤は、公知のものを特に制限なく用いることができる。ＭＥＫ阻害剤としては、例えば、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、及びＳＬ３２７等、並びにこれらの誘導体等が挙げられる。これらの化合物は、市販品を用いてもよく、自ら作製してもよい。ＭＥＫ阻害剤は、ＭＥＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。ＭＥＫ阻害剤としては、ＰＤ０３２５９０１が好ましい。
　ＭＥＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ＡＭＰＫ活性化剤含有培地におけるＭＥＫ阻害剤の濃度は、ＭＥＫ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＡＭＰＫ活性化剤含有培地がＭＥＫ阻害剤を含有する場合、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地におけるＭＥＫ阻害剤の濃度としては、例えば、０．００１～１００μＭが挙げられ、０．０１～５０μＭが好ましい。ＭＥＫ阻害剤がＰＤ０３２５９０１である場合、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地における濃度としては、０．１～１０μＭが好ましく、０．５～５μＭがより好ましい。
・Ｗｎｔ阻害剤
　Ｗｎｔ阻害剤は、Ｗｎｔの産生を抑制する物質、又はＷｎｔの受容体への結合からβカテニンの蓄積へと続くシグナル伝達を阻害する物質である。Ｗｎｔ阻害剤としては、受容体であるＦｒｉｚｚｌｅｄファミリーへの結合を阻害する物質、又はβカテニンの分解を促進する物質等が挙げられる。
　Ｗｎｔ阻害剤は、公知のものを特に制限なく用いることができる。Ｗｎｔ阻害剤としては、例えば、ＤＫＫ１タンパク質（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０１２２４２）、スクレロスチン（例えば、ヒトの場合、ＮＣＢＩのアクセッション番号：ＮＭ＿０２５２３７）、ＩＷＲ－１、ＩＷＰ－２、ＩＷＰ－３、ＩＷＰ－４、ＩＷＰ－Ｌ６、Ｃ５９（または、Ｗｎｔ－Ｃ５９）、ＩＣＧ－００１、ＬＧＫ－９７４（または、ＮＶＰ－ＬＧＫ－９７４）、ＦＨ５３５、ＷＩＫＩ４、ＫＹＯ２１１１、ＰＮＵ－７４６５４、及びＸＡＶ９３９、並びにこれらの誘導体等が挙げられる。中でも、Ｗｎｔ阻害剤は、ＸＡＶ９３９、ＩＷＲ－１等のタンキラーゼ阻害剤が好ましく、ＸＡＶ９３９がより好ましい。これらの化合物は、市販品を用いてもよく、自ら作製してもよい。Ｗｎｔ阻害剤は、タンキラーゼに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　Ｗｎｔ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ＡＭＰＫ活性化剤含有培地におけるＷｎｔ阻害剤の濃度は、Ｗｎｔ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＡＭＰＫ活性化剤含有培地がＷｎｔ阻害剤を含有する場合、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地におけるＷｎｔ阻害剤の濃度としては、例えば、０．００１～１００μＭが挙げられ、０．０１～５０μＭが好ましい。Ｗｎｔ阻害剤がＸＡＶ９３９である場合、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地における濃度としては、０．１～１０μＭが好ましく、０．５～５μＭがより好ましい。
・ＰＫＣ阻害剤
　ＰＫＣ阻害剤は、ＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）の機能を阻害する物質である。ＰＫＣは、基質タンパク質のセリン残基及びスレオニン残基のヒドロキシル基をリン酸化するタンパク質キナーゼの一種である。少なくとも１１種類のアイソザイムが存在し、大きなファミリーを形成している。ＰＫＣは、細胞増殖や細胞死、遺伝子の転写及び翻訳、細胞の形態、細胞間接触等、多くの細胞機能の制御に関与する。
　ＰＫＣ阻害剤は、公知のものを特に制限なく用いることができる。ＰＫＣ阻害剤は、ＰＫＣのアイソザイムのうち少なくとも１つを阻害する作用を有する物質であればよい。ＰＫＣ阻害剤としては、例えば、Ｇｏ６９８３（３－［１－［３－（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］－５－ｍｅｔｈｏｘｙ－１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ］－４－（１Ｈ－ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｅ－２，５－ｄｉｏｎｅ）、ＧＦ１０９２０３Ｘ（２－［１－（３－Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ］－３－（ｉｎｄｏｌ－３－ｙｌ） ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ＬＹ－３３３５３１（（９Ｓ）－９－［（Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｍｅｔｈｙｌ］－６，７，１０，１１－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－９Ｈ，１８Ｈ－５，２１：１２，１７－ｄｉ（ｍｅｔｈｅｎｏ）ｄｉｂｅｎｚｏ［ｅ，ｋ］ｐｙｒｒｏｌｏ［３，４－ｈ］［１，４，１３］ｏｘａｄｉａｚａｃｙｃｌｏｈｅｘａｄｅｃｉｎｅ－１８，２０（１９Ｈ）－ｄｉｏｎｅ）、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ（［９Ｓ－（９α，１０β，１１β，１３α）］－２，３，１０，１１，１２，１３－Ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１０－ｍｅｔｈｏｘｙ－９－ｍｅｔｈｙｌ－１１－（ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－９，１３－ｅｐｏｘｙ－１Ｈ，９Ｈ－ｄｉｉｎｄｏｌｏ［１，２，３－ｇｈ：３’，２’，１’－ｌｍ］ｐｙｒｒｏｌｏ［３，４－ｊ］［１，７］ｂｅｎｚｏｄｉａｚｏｎｉｎ－１－ｏｎｅ）等、及びそれらの誘導体等が挙げられる。ＰＫＣ阻害剤は、ＰＫＣに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。これらの化合物は、市販品を用いてもよく、自ら作製してもよい。ＰＫＣ阻害剤は、Ｇｏ６９８３が好ましい。
　ＰＫＣ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ＡＭＰＫ活性化剤含有培地におけるＰＫＣ阻害剤の濃度は、ＰＫＣ阻害剤の種類に応じて適宜選択することができる。ＡＭＰＫ活性化剤含有培地がＰＫＣ阻害剤を含有する場合、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地におけるＰＫＣ阻害剤の濃度としては、例えば、０．００１～１００μＭが挙げられ、０．０１～５０μＭが好ましい。ＰＫＣ阻害剤がＸＡＶ９３９である場合、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地における濃度としては、０．１～１０μＭが好ましく、０．５～５μＭがより好ましい。
　プライム型多能性幹細胞がマウス多能性幹細胞である場合、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地は、ＡＭＰＫ活性化剤、及びＬＩＦを含むものであってもよい。プライム型多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である場合、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地は、ＡＭＰＫ活性化剤、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤（例えば、タンキラーゼ阻害剤）、及びＰＫＣ阻害剤を含むものであってもよい。
　ＡＭＰＫ活性化剤含有培地は、上記成分に加えて、ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、増殖因子（ＦＧＦ、ＢＭＰ等）等を含んでもよい。
（培養方法）
　培養方法は特に限定されない。プライム型多能性幹細胞は、動物細胞の培養に通常用いられる培養条件で培養することができる。培養温度は、特に限定されないが、通常、２５～４０℃とすることができ、好ましくは３０～４０℃である。培養温度の具体例としては、約３７℃が挙げられる。プライム型多能性幹細胞は、通常ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養することができる。ＣＯ２濃度は、通常、約０．３～５％とすることができ、好ましくは約２～５％である。ＣＯ２濃度の具体例としては約５％が挙げられる。
　培養は、接着培養でもよく、浮遊培養でもよい。接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよい。コーティング材料としては、例えば、ゼラチン、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ等が挙げられる。接着培養の場合、多能性幹細胞をフィーダー細胞等と共培養してもよい。フィーダー細胞としては、マイトマイシンＣ処理済のマウス胎仔由来の初代線維芽細胞（ＭＥＦ）、ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞、ＯＰ９細胞、及びＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞等が挙げられる。
　培養期間は、特に限定されず、任意の期間とすることができる。培養期間は、培養中に細胞の状態をモニタリングし、ナイーブ型多能性幹細胞が誘導されるまでとしてもよい。培養期間としては、例えば、１日以上、３日以上、５日以上、１０日以上、１４日以上が挙げられる。培養期間の上限は、特に限定されないが、例えば、５０日以下、４０日以下、３０日以下、２５日以下が挙げられる。
　培養期間中、適宜、培地交換を行ってもよい。培地交換は、古い培地を除去し、新たなＡＭＰＫ活性化剤含有培地に交換することにより行うことができる。培養期間中、適宜、継代してもよい。継代の際には、プロテアーゼ、コラゲナーゼ、ペプチダーゼ、ＤＮａｓｅ等の酵素を含む細胞解離液を用いて、細胞を解離した後、新たなＡＭＰＫ活性化剤含有培地に播種してもよい。継代の間隔は、特に限定されないが、例えば、１～１０日程度とすることができる。ヒト多能性幹細胞である場合、継代後の最初の２４時間程度は、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ２７６３２）を培地に添加してもよい。
（任意工程）
　本態様の方法は、上記のＡＭＰＫ活性化剤含有培地で培養する工程（以下、「ＡＭＰＫ活性化工程」ともいう）に加えて、任意の工程を有してもよい。任意工程としては、例えば、前培養工程、ナイーブ型多能性幹細胞の維持培養工程が挙げられる。
≪前培養工程≫
　前培養工程は、上記ＡＭＰＫ活性化工程の前に、プライム型多能性幹細胞を培養する工程である。前培養工程で用いる培地（前培養培地）としては、公知の多能性幹細胞維持培地が挙げられる。例えば、上記のような基礎培地に、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、及びＦＧＦ２を添加した培地等が挙げられる。前培養培地は、市販の多能性幹細胞維持培地を用いてもよい。市販の多能性幹細胞維持培地としては、例えば、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）等が挙げられる。前培養培地は、ＡＭＰＫ活性化剤を含まない。
　前培養工程は、培地を前培養培地とすること以外は、上記ＡＭＰＫ活性化工程と同様に行うことができる。
≪ナイーブ型多能性幹細胞維持工程≫
　上記ＡＭＰＫ活性化工程の後、ナイーブ型多能性幹細胞維持工程を行ってもよい。ナイーブ型多能性幹細胞維持工程により、ナイーブ型の状態を安定して維持することができる。
　ナイーブ型多能性幹細胞維持工程で用いる培地としては、公知のナイーブ型多能性幹細胞維持培地が挙げられる。ナイーブ型多能性幹細胞維持培地としては、例えば、上記のような基礎培地に、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、及びＧＳＫ３β阻害剤を添加した培地が挙げられる。あるいは、上記のような基礎培地に、ＬＩＦ、ＭＥＬ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤を添加した培地が挙げられる。
・ＧＳＫ３β阻害剤
　ＧＳＫ－３β阻害剤は、ＧＳＫ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｋｉｎａｓｅ）３βの機能、例えば、キナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質である。ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ－３β阻害剤ＩＸ；６－ブロモインジルビン３’－オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ－３β阻害剤ＶＩＩ（４－ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３－ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ－Ｎ－ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２）、及びＣＨＩＲ９９０２１（６－［２－［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イルアミノ］エチルアミノ］ピリジン－３－カルボニトリル）、並びにこれらの誘導体等が挙げられる。これらの化合物は、市販品を用いてもよく、自ら作製してもよい。ＧＳＫ－３β阻害剤は、ＧＳＫ－３βに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。ＧＳＫ３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１が好ましい。ＧＳＫ－３β阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ナイーブ型多能性幹細胞維持培地におけるＧＳＫ３β阻害剤の濃度としては、ＧＳＫ－３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である場合、例えば、０．０１～１００μＭが挙げられ、０．１～５０μＭが好ましくは、０．５～１０μＭがより好ましく、１～５μＭがさらに好ましい。
　マウス多能性幹細胞である場合、ナイーブ型多能性幹細胞維持培地としては、例えば、基礎培地（例えば、実施例で用いたＢａｓａｌ培地）に、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ０３２５９０１）、及びＧＳＫ３β阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）を添加した培地を用いることができる。ナイーブ型多能性幹細胞維持培地におけるＬＩＦ、及びＭＥＫ阻害剤の濃度としては、上記ＡＭＰＫ活性化剤含有培地と同様の濃度が挙げられる。
　ヒト多能性幹細胞である場合、ナイーブ型多能性幹細胞維持培地としては、例えば、基礎培地（例えば、Ｎ２Ｂ２７培地）に、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ０３２５９０１）、Ｗｎｔ阻害剤（例えば、ＸＡＶ９３９）、及びＰＫＣ阻害剤（例えば、Ｇｏ６９８３）を添加した培地を用いることができる。ナイーブ型多能性幹細胞維持培地におけるＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、及びＰＫＣ阻害剤の濃度としては、上記ＡＭＰＫ活性化剤含有培地と同様の濃度が挙げられる。
　ナイーブ型多能性幹細胞維持培地は、ＭＥＫ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、ＰＫＣ阻害剤、及びＧＳＫ３β阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種以上の阻害剤と、ＬＩＦとを含む培地であってもよい。ナイーブ型多能性幹細胞維持培地は、前記阻害剤の２種以上を含むことが好ましい。阻害剤の組合せとしては、ＭＥＫ阻害剤とＧＳＫ３β阻害剤との組合せ、及びＭＥＫ阻害剤とＷｎｔ阻害剤とＰＫＣ阻害剤との組み合わせが挙げられる。
　ナイーブ型多能性幹細胞維持工程は、培地をナイーブ型多能性幹細胞維持培地とすること以外は、上記ＡＭＰＫ活性化工程と同様に行うことができる。
　本態様の方法により、プライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を誘導することができる。従来のナイーブ型多能性幹細胞の誘導方法では、ナイーブ状態の誘導剤として２剤以上の薬剤が用いられることが多い。しかしながら、本態様の方法では、ナイーブ状態の誘導剤としてＡＭＰＫ阻害剤の１剤のみを用いることで、ナイーブ型多能性幹細胞を誘導することができる。
　一実施形態において、本態様の方法は、プライム型多能性幹細胞のｐ３８　ＭＡＰＫを活性化させる工程を含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法であってもよい。
　ｐ３８　ＭＡＰＫ（Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ）は、活性化ＡＭＰＫの下流標的である。したがって、ＡＭＰＫ活性化剤を用いることにより、ｐ３８　ＭＡＰＫを活性化させることができる。ｐ３８　ＭＡＰＫは、ＭＡＰＫの１種であり、細胞の分化、アポトーシス、オートファジー等に関与する。ｐ３８　ＭＡＰＫの活性化は、ｐ３８　ＭＡＰＫのリン酸化によって生じる。したがって、ｐ３８　ＭＡＰＫの活性化は、ｐ３８　ＭＡＰＫのリン酸化により確認することができる。ＡＭＰＫ活性化剤を用いずに、ｐ３８　ＭＡＰＫを活性化させた場合にも、ナイーブ型多能性幹細胞を誘導することができる。
　ｐ３８　ＭＡＰＫ活性化剤としては、ＡＭＰＫ活性化剤、炎症性サイトカイン（ＩＬ－１β等）、エンドトキシン等が挙げられる。あるいは、プライム型多能性幹細胞に、環境ストレス（紫外線、酸化ストレス、熱ショックストレス等）、又は浸透圧ショック等を与えることにより、ｐ３８　ＭＡＰＫの活性化を誘導してもよい。
＜ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法＞
　本開示の第２の態様は、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法である。本態様の方法は、プライム型多能性幹細胞を、ＡＭＰＫ活性化剤を含む培地（ＡＭＰＫ活性化剤含有培地）で培養する工程（ＡＭＰＫ活性化工程）を含む。
　ＡＭＰＫ活性化工程は、上記第１の態様の誘導方法におけるＡＭＰＫ活性化工程と同様に行うことができる。
　本態様の方法は、前記ＡＭＰＫ活性化剤含有培地で培養する工程に加えて、任意の工程を含んでもよい。任意の工程としては、前培養工程、ナイーブ型多能性幹細胞維持工程等が挙げられる。前培養工程は、上記第１の態様の誘導方法における前培養工程と同様に行うことができる。ナイーブ型多能性幹細胞維持工程は、上記第１の態様の誘導方法におけるナイーブ型多能性幹細胞維持工程と同様に行うことができる。
　本態様の方法は、プライム型多能性幹細胞のｐ３８　ＭＡＰＫを活性化させる工程を含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法であってもよい。ｐ３８　ＭＡＰＫの活性化方法としては、上記と同様の方法が挙げられる。
＜ナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット＞
　本開示の第３の態様は、ナイーブ型多能性幹細胞誘導用キットである。本態様のキットは、ＡＭＰＫ活性化剤を含む。本態様のキットは、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導するために用いられる。
（ＡＭＰＫ活性化剤）
　ＡＭＰＫ活性化剤としては、上記と同様のものが挙げられる。
（任意構成）
　本態様のキットは、ＡＭＰＫ活性化剤に加えて、任意の構成を含んでもよい。任意構成としては、例えば、基礎培地、ＬＩＦ、ＭＥＫ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤（タンキラーゼ阻害剤等）、ＰＫＣ阻害剤等が挙げられる。これの具体例としては、上記と同様のものが挙げられる。これらの成分は、ＡＭＰＫ活性化剤と共に、ＡＭＰＫ活性化剤含有培地を調製するために用いることができる。
　本態様のキットは、ＧＳＫ３β阻害剤を含んでもよい。ＧＳＫ３β阻害剤は、基礎培地、ＬＩＦ、及びＭＥＫ阻害剤等と共に用いて、ナイーブ型多能性幹細胞維持培地を調製するために用いることができる。
　本態様のキットは、ＦＧＦ２を含んでもよい。本態様のキットは、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａを含んでもよい。これらは、基礎培地と共に用いて、前培養培地を調製するために用いることができる。
　本態様のキットは、ＲＯＣＫ阻害剤（Ｙ２７６３２）、及び細胞解離剤等を含んでもよい。これらは、細胞の継代を行う際に用いることができる。本態様のキットは、さらに、培養プレート、使用説明書等を含んでもよい。
　本態様のキットは、上記に加えて、ＥＲＫ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ－ｓｉｇｎａｌ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｋｉｎａｓｅ；細胞外シグナル制御キナーゼ）阻害剤、ＲＡＦ阻害剤等の他の阻害剤を含んでもよい。
　本態様のキットは、第１の態様の方法、及び第２の態様の製造方法を実施するために用いることができる。
＜ナイーブ型多能性幹細胞誘導剤＞
　本開示の第４の態様は、ナイーブ型多能性幹細胞誘導剤である。本態様のナイーブ型多能性幹細胞誘導剤は、ｐ３８　ＭＡＰＫ活性化剤を有効成分として含む。本態様のナイーブ型多能性幹細胞誘導剤は、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導するために用いられる。ｐ３８　ＭＡＰＫ活性化剤としては、上記と同様のものが挙げられる。
　本発明を実施例に基づいて説明する。ただし、本発明の実施態様は、これら実施例の記載に限定されるものではない。
（１）マウスエピブラスト幹細胞のナイーブ型への復帰
＜材料と方法＞
（試薬等）
　使用した主な試薬等を表１～４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
（細胞培養）
　マウスエピブラスト幹細胞（ｍＥｐｉＳＣ）Ｏｃｔ４ＧＩＰを、以前に記載したように（Ying and Smith, Methods Enzymol., 365 (2003), pp. 327-341; Guo et al., Development, 136 (2009), pp. 1063-1069）、フィブロネクチン（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）－コートプレート（１０μｇ／ｍＬ／ｃｍ２）上で、３７℃で、１時間培養した。簡単に説明すると、細胞を、ＦＧＦ２（１２ｎｇ／ｍＬ、ＷＡＫＯ）及びアクチビンＡ（２０ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ）を添加したＮｄｉｆｆ　２２７（ＴａＫａＲａ　Ｂｉｏ）培地で培養し、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で解離させて３～４日毎にリプレートした。培地は２日おきに交換した。１２９／ＭＳＭは、八木正樹博士から提供された（Yagi et al., Stem Cell Rep., 12 (2019), pp. 1113-1128）。簡単に説明すると、雄のＭＳＭ／Ｍｓマウスを、雌の１２９Ｘ１／ＳｖＪマウスと交配させた。プラグが観察された日の正午を胚発生日（Ｅ）０．５とした。胚を単離する前日に、マイトマイシンＣ（協和発酵キリン株式会社）処理したＭＥＦ（フィーダー）を、０．２％ゼラチンコート２４ウェル培養プレート（Ｔｒｕｅ　Ｌｉｎｅ）上に採取した。Ｅ６．５で、子宮頸部と２つの子宮管接合部を横断して子宮を除去し、胚をＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ）中に置いた。その後、筋層を除去し、針を用いて十二指腸を剥離した。胚外領域からエピブラストを分割し、２４ウェル培養プレートに移し、ＥｐｉＳＣｓを誘導した。エピブラストの伸長後、２４ウェル培養プレート（ｐ１）、６ウェル培養プレート（ｐ２）、６ｃｍ培養皿（ｐ３）のフィーダー上に継代した。２０％　ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＧＩＢＣＯ）、０．１ｍＭ　ＭＥＭ　ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ）（ＧＩＢＣＯ）、０．１ｍＭ　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ＧＩＢＣＯ）、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ＦＧＦ２（１２ｎｇ／ｍＬ）、及びＡｃｔｉｖｉｎ　Ａ　（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ＧＩＢＣＯ）におけるＭＥＦフィーダー上で、１２９／ＭＳＭを培養した。培地は２日ごとに交換した。ｍＥｐｉＳＣｓ　１２９／Ｂａ１は、以前に記載したように入手した（Sugimoto et al., Stem Cell Rep., 4 (2015), pp. 744-757）。簡単に説明すると、１５％　ＫＳＲ、０．１ｍＭ　ＮＥＡＡ、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＦＧＦ２（１２　ｎｇ／ｍＬ）及びアクチビンＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２におけるＭＥＦフィーダー上で細胞を増殖させた。培地は２日おきに交換した。ナイーブマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）及びｍＥｐｉＳＣｓからの復帰後のナイーブ様細胞は、０．１％ゼラチンコードディッシュ上でＢａｓａｌ培地で培養した（Yamashita et al., Nature, 408 (2000), pp. 92-96; Ying et al., Nature, 453 (2008), pp. 519-523）。Ｂａｓａｌ培地：１０％ＫＳＲ（ＧＩＢＣＯ）、１％ウシ胎児血清（ＳＡＦＣ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、０．１ｍＭ　ＮＥＡＡ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ）、０．１ｍＭ　２－メルカプトエタノール、及びペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＧＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）。あるいは、場合により、１０００Ｕ／ｍＬ　Ｌｉｆ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び２つの低分子阻害剤（１μＭ　ＰＤ０３２５９０１（ＳＩＧＭＡ）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ））を添加したＮｄｉｆｆ　２２７培地で培養した。培養物は、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて解離し、３～４日ごとに継代した。培地は２日おきに交換した。
（ＡＭＰＫ活性化剤によるｍＲｐｉＳＣのナイーブ型への復帰）
　Ａｃｃｕｍａｘで解離させたｍＥｐｉＳＣｓを、ＦＧＦ２（１２ｎｇ／ｍＬ）とＡｃｔｉｖｉｎ　Ａ（２０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＮｄｉｆｆ　２２７培地のＭＥＦフィーダー上に、１日間プレーティングした（ｄ－１－ｄ０）。培地は、ｄ０で、Ｂａｓａｌ培地と図１Ａ及び表６に示す試薬との組み合わせに変更し、１６日間（ｄ０－ｄ１６）培養した。使用したＡＭＰＫ活性化剤は、ＡＩＣＡＲ（１ｍＭ、Ｄ２Ｗでの希釈、ＷＡＫＯ）、Ａ７６９６６２（５０μＭ、ＤＭＳＯでの希釈、ＡＤｏｏＱ）、及びメトフォルミン（１ｍＭ、Ｄ２Ｗでの希釈、ＴＣＩ）であった。培地は２日おきに交換した。ＡＩＣＡＲには増殖抑制作用があり、ＡＩＣＡＲを添加して長時間培養すると細胞数が減少するため、最初の６日間（ｄ０－ｄ６）はＡＩＣＡＲ濃度を０．５ｍＭまで低下させた。１６日後、全細胞をＡｃｃｕｍａｘで解離し、さらなる解析を行った。あるいは、Ｂａｓａｌ培地、又は２ｉＬ（１０００Ｕ／ｍＬ　Ｌｉｆ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と２種類の低分子阻害剤（１μＭ　ＰＤ０３２５９０１（ＳＩＧＭＡ）及び３μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ））を添加したＮｄｉｆｆ２２７培地を用いてゼラチンコート６ウェルプレートで培養した。培地は１日おきに交換し、安定したコロニーが発生するまで、少なくとも３回継代して４～７日おきに継代した。ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（１０μＭ、ＷＡＫＯ）をＡＭＰＫ活性化剤処理の１～２時間前に添加した。
（ＦＡＣＳ分析）
　細胞をＰＢＳで２回洗浄し、Ａｃｃｕｍａｘで採取した後、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ１）ＭｏＡｂ（ＢＤ）及びＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。フローサイトメトリー解析はＦＡＣＳＡｒｉａＴＭＩＩ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ）で行った。すべてのＦＡＣＳ実験は、少なくとも３回繰り返した。
（免疫染色及びアルカリホスファターゼ染色）
　免疫染色は以前記載されているように行った（Yamashita et al., Nature, 408 (2000), pp. 92-96）。簡単に説明すると、細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５～２０分間固定し、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、２％スキムミルク（ＢＤ）で３０分間ブロッキングした。細胞は一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０、ナカライテスク）で３回洗浄し、１：５００に希釈したＡｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ５４６（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を結合した二次抗体（抗マウス－ウサギ又はヤギＩｇＧ抗体）で室温で１時間処理した。核はＤＡＰＩで染色した。以下の抗体を、記載した希釈率で使用した：抗Ｏｃｔ３／４（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ、ｓｃ－５２７９、１：２００）、抗Ｎａｎｏｇ（ＲｅｐｒｏＣｅｌｌ、ＲＣＡＢ００２Ｐ－Ｆ、１：３００）、抗ＫＬＦ４（Ｒ＆Ｄ、ＡＦ３１５８、１：５００）、抗ＥＳＲＲＢ（Ｐｅｒｓｅｕｓ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、ＰＰ－Ｈ６７０５－００１：５００）、抗ＴＦＣＰ２ｌ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＰＡ５－３４３６１，１：４００）、抗ＴＦＥ３（Ｓｉｇｍａ，ＨＰＡ０２３８８１，１：３００）、抗ＦＯＸＡ２（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，０７－６３３，１：５００）、抗Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ（Ｒ＆Ｄ、ＡＦ２０８５、１：５００）、抗Ｎｅｓｔｉｎ（ＳｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０１４１８、１：５００）。アルカリホスファターゼ染色には、ＡＰ染色キットＩＩ（ステムジェント社製）を使用した。製造元の指示に従い、細胞を４％パラホルムアルデヒドで５分間固定し、ＰＢＳＴで１回洗浄し、Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ＋Ｂ＋Ｃで１０分間染色し、ＰＢＳで３回洗浄した。単一細胞のコロニー形成のために、５００個の細胞を１２ウェルプレートにプレーティングし、５日間培養した。
（ＲＮＡ単離及び定量的ＰＣＲ）
　ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてＴｏｔａｌ　ＲＮＡを単離した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１μｇ　ＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写した。定量的ＰＣＲ解析は、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の逆転写反応の１／５０を用いて、２連で実施した。全てのｑＰＣＲ反応は、少なくとも３つの独立した実験の３連で行った。遺伝子発現を正規化するために、内因性コントロールであるＧＡＰＤＨを使用した。全ての結果は、平均±ＳＤとして示した。
（ウェスタンブロット解析）
　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ナカライテスク）を含むサンプルバッファー溶液で細胞を溶解させた。細胞溶解液をｅ－ＰＡＧＥＬ　Ｇｅｌ（ＡＴＴＯ）で処理し、ニトロセルロース膜に電気泳動的に転写した。次に、細胞をＢｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）で３０分間ブロックし、以下を標的とする一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした：リン酸化－ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２５３１Ｓ、１：１０００）；ＡＭＰＫ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２５３２Ｓ、１：１０００）；リン酸化－ｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９２１５Ｓ、１：１０００）；ｐ３８（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９２１２Ｓ、１：１０００）；β－アクチン（Ｓｉｇｍａ、Ａ５４４１、１：５０００）。二次抗体は、Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）をコンジュゲートした抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，６２－６５２０，１：５００００）及びウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，　７０７４Ｓ，１：３０００－１：１０００）を使用した。室温で２時間インキュベートした後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて可視化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　ＬＡＳ４０００で検出した。一次抗体及び二次抗体はすべてＣａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（東洋紡績社製）で希釈した。ブロット結果はＩｍａｇｅ　Ｊで定量した。
（構成的にｐ３８が活性な細胞株の作製）
　Ｄ１７６Ａ及びＦ３２７Ｓ変異（Xu et al., Cell Res., 23 (2013), pp. 131-141; Diskin et al., J. Biol. Chem., 279 (2004), pp. 47040-47049）を含むｐ３８　ｃＤＮＡを、ｍＣｈｅｒｒｙ（Tanaka et al., PLoS One, 8 (2013), p. e61540）と結合したｒｔＴＡ発現を有するＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）ベクターに挿入した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ　ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍａｘａ）を用いて、Ｔｅｔ－Ｏｎ　ＣＡ－ｐ３８　ｗｉｔｈ　ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子をＯｃｔ４ＧＩＰ細胞株へ導入した。細胞を６ｃｍディッシュにプレーティングして、ＦＧＦ２（１２ｎｇ／ｍｌ）とＡｃｔｉｖｉｎ　Ａ（２０ｎｇ／ｍｌ）で３日間維持した後、選択のためにＧ４１８（４００μｇ／ｍＬ）を適用した。ＣＡ－ｐ３８の誘導は、ｍＣｈｅｒｒｙの発現で確認した。トランスフェクション後のｄ８から２４時間のＤｏｘ処理した後、ｍＣｈｅｒｒｙ＋の細胞を選別し、Ｄｏｘ非存在下でＦＧＦ２、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ、Ｇ４１８を添加したＮｄｉｆｆ　２２７培地で維持した。ウェスタンブロット解析により、ｄｏｘ＋の条件下でｐ３８経路が活性化されていることが確認された（図９Ｄ）。
（キメラ胚盤胞注入と生殖細胞への伝達）
　全ての動物実験プロトコルは、京都大学動物実験委員会の承認を得た。全ての動物実験は、日本の法律及び「実験動物の飼養と使用の手引き」に従う「京都大学動物実験指針」に従って実施した。１２９／Ｓｖ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスから作製した雄細胞株１２９／Ｂａ１を用いた（Sugimoto et al., Stem Cell Rep., 4 (2015), pp. 744-757）。細胞を、ＦＧＦ２とＡｃｔｉｖｉｎ　Ａを添加したＭＥＦで１日間前培養した後（ｄ（－１）－ｄ０）、ＡＩＣＡＲ又はＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦを添加したＢａｓａｌ培地に変更した（ｄ０－ｄ１６）。１６日後、２ｉＬ条件で数回継代培養した後、胚盤胞注入に使用した。Ｓｌｃ：ＩＣＲ雌マウスから宿主胚盤胞を分離し、ピエゾマイクロマニピュレーター（Ｐｒｉｍｅｔｅｃｈ，　Ｊａｐａｎ）を用いて１２個以下の復帰細胞を胚盤腔に注入した。注入した胚盤胞は２．５ｄｐｃの仮妊娠雌に移植した。キメラマウスは毛色で判定した。キメラマウスが８週－ｄｐｃに性成熟した時点で、生殖細胞への伝達を確認するため、野生型ＩＣＲマウスと交配した。次世代では、灰色（ａｇｏｕｔｉ）コートマウスが生まれた場合、生殖細胞系列伝達が起こったと判断した。
（画像解析）
　Ｕ－ＲＦＬ－Ｔ（Ｏｌｙｍｐｕｓ　ＩＸ７１）を搭載した倒立顕微鏡を細胞明視野とライブセル蛍光に使用した。４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５５６ｎｍ、及び６３５ｎｍのレーザーを装備したＬＳＭ７００倒立共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）をｘ１０又はｘ２０対物レンズで免疫染色像に使用した。
（ＲＮＡシーケンシング）
　５００ｎｇのｔｏｔａｌ　ＲＮＡを用いて、ＴｒｕＳｅｑ　Ｓｔｒａｎｄｅｄ　ｍＲＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，　Ｉｎｃ．）によりシーケンスライブラリを構築し、ＨｉＳｅｑ２５００の７９　ｃｙｃｌｅ　ｓｉｎｇｌｅ　ｒｅａｄ　ｍｏｄｅでシーケンスした。クオリティフィルターを通過したリードは全てＦＡＳＴＱ形式に抽出し、ＢＣＬ２ＦＡＳＴＱ　Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖ２．２０．０．４２２を用いてバーコードで個々の細胞にデマルチプレクスした。ＦＡＳＴＱ変換されたリードは、Ｂｏｗｔｉｅ２　ｖ２．２．５　ｗｉｔｈ　ｖｅｒｙ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ－ｌｏｃａｌ　ｏｐｔｉｏｎを用いて、Ｅｎｓｅｍｂｌ　ＧＲＣｍ３８　ｒｅｌｅａｓｅ　１００　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｃＤＮＡ　ａｎｄ　ｎｃＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにマッピングした。６８，１９６，５０１リードのうち、６２，６２１，６１１リード（９１．８％）がマッピングされ、ＭＡＰＱスコア≧１の閾値を持つ遺伝子として定量化された。２２サンプルで合計３４，４８９個（平均２１，５００個）の遺伝子が検出された。以下の解析は、Ｒ　ｖｅｒ．３．６．３にて非分類のＬｉｍｍａ　ｖｏｏｍ正規化（Ｌａｗ　ｅｔ　ａｌ．，　２０１４）後に実施した。ナイーブ型ＥＳＣ、プライム型ＥｐｉＳＣ、復帰細胞（ｄ１６＋２ｐ、３ｐ、１０ｐ）、及び復帰過程細胞（ｄ８、１６）の合計２２サンプルを解析した。多能性細胞運命（ＰＣＦ）遺伝子（Fidalgo et al., Cell Stem Cell, 19 (2016), pp. 1-15）の２，０３６個（ＢＣ０５２６８８を除く）及び４，４８９個の全遺伝子について２２サンプルの主成分分析（ＰＣＡ）を、それぞれ図３Ａ及び図８に示す。ヒートマップ（図３Ｂ）は、多能性制御因子と系統マーカー（Takashima et al.,  Cell, 158 (2014), pp. 1254-1269）を選択した遺伝子セットについて解析された。
（定量化解析、統計解析）
　異なるグループ間の差を比較する実験には、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定による一元配置分散分析を使用した。ｐ値＜０．０５のとき、差は有意であるとみなした。全ての実験は独立して少なくとも３回行った。ウェスタンブロット解析結果の定量化にはＩｍａｇｅ　Ｊを用いた。エラーバーは平均値±ＳＤ（標準偏差）を示す。
＜結果＞
（ＡＭＰＫ活性化剤はプライム型ｍＥｐｉＳＣをナイーブ様細胞への復帰を誘導する）
　プライム型多能性幹細胞及びナイーブ型多能性幹細胞で発現するＯｃｔ４プロモーター／エンハンサー駆動型ｅＧＦＰｉｒｅｓＰｕｒｏトランスジーン（Ｏｃｔ４－ＧＦＰ）を有するｍＥｐｉＳＣ、Ｏｃｔ４ＧＩＰを用いた（Guo et al., Development, 136 (2009), pp. 1063-1069; Wray et al., 2010）。Ｏｃｔ４ＧＩＰ細胞を、Ｂａｓａｌ培地において、様々な試薬の組み合わせとともに培養した（図１Ａ）。ナイーブ状態復帰のための培地に交換する前に、Ｏｃｔ４ＧＩＰ細胞を、ＦＧＦ２とＡｃｔｉｖｉｎ　Ａを添加した無血清培地Ｎｄｉｆｆ　２２７を含むｍＥｐｉＳＣ培養条件で維持した（Guo et al., Development, 136 (2009), pp. 1063-1069）。ほぼ全ての細胞（９９．２±０．７％）がＯｃｔ４－ＧＦＰに対して陽性であり、ナイーブＥＳＣマーカーであるＰＥＣＡＭ１／ＣＤ３１に対して陰性であった。これらの結果から、これらの細胞がプライム型（Ｄａｙ０；ｄ０）であることが示された（図１Ｂ）。Ｂａｓａｌ培地単独、又は２ｉＬを添加したＢａｓａｌ培地（ナイーブ維持条件）で細胞を培養した場合、５日以内にＧＦＰの発現が消失した。培養１６日後（ｄ１６）には、全ての細胞が分化形態を示し（図１Ｃ）、ＧＦＰの発現が消失した（図１Ｄ、図１Ｅ）。一方、ＡＭＰＫ活性化剤ＡＩＣＡＲ（５－Ａｍｉｎｏｉｍｉｄａｚｏｌｅ－４－ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ　ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を添加して培養した場合、１０日目頃に一旦ＧＦＰ発現が消失したものの、ｄ１６にいくつかのＧＦＰ＋コロニーが出現した（図１Ｃ）。ＡＩＣＡＲ及びＬＩＦの条件下では、ＧＦＰ＋コロニーの出現がより顕著に誘導された（図１Ｃ）。ＦＡＣＳ解析の結果、ＡＩＣＡＲ単独培養では、ｄ１６に全細胞の約５％（５．３４±３．２７％）がＯｃｔ４－ＧＦＰを発現した（図１Ｄ、図１Ｅ）。ＡＩＣＡＲ及びＬＩＦの条件では、全細胞の約１７％（１７．１±１１．６％）がＯＣＴ４－ＧＦＰを発現した。Ｏｃｔ４－ＧＦＰ陽性細胞において、ナイーブＥＳＣマーカーであるＰＥＣＡＭ１／ＣＤ３１（Illich et al., Cell Rep., 15 (2016), pp. 1-14）の発現を確認した。ＯＣＴ４－ＧＦＰ＋細胞のうち、ＡＩＣＡＲ単独条件では約９％（９．０４±３．８８％）、ＡＩＣＡＲ及びＬＩＦの条件では約７２％（７２．６±９．２３％）がＰＥＣＡＭ１陽性であった（図１Ｄ、図１Ｅ）。これらの二重陽性細胞の出現は、ＡＩＣＡＲ処理がプライム型ｍＥｐｉＳＣｓをナイーブ状態に復帰させることを示す。
　他のＡＭＰＫ活性化剤であるＡ７６９６６２とメトフォルミンも試験したところ、ＡＭＰＫ経路が活性化された（図６Ａ）。Ａ７６９６６２単独、Ａ７６９６６２及びＬＩＦ、又はメトフォルミン及びＬＩＦで処理した後のｄ１６に、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ＋細胞が観察された（図６Ｂ）。ＦＡＣＳ分析によると、Ａ７６９６６２単独、Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ、又はメトフォルミン＋ＬＩＦ条件では、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ及びＰＥＣＡＭ１の二重陽性細胞はＡＩＣＡＲ処理よりも少ないが検出可能であった。これらのＡＭＰＫ活性化剤もプライム型ｍＥｐｉＳＣｓに対するナイーブ状態への復帰活性を有することが確認された（図６Ｃ、図６Ｄ）。これらの結果から、ＡＭＰＫ活性化剤は、ＬＩＦとともに使用することにより、より効果的にプライム型ｍＥｐｉＳＣｓのナイーブ状態への復帰を誘導できることが示された。
（復帰細胞はナイーブ型多能性幹細胞の特徴を示す）
　次に、ＡＭＰＫ活性化剤で処理したプライム型ｍＥｐｉＳＣから出現したナイーブ様細胞が、ナイーブ型ｍＥＳＣとしての基準を満たすかどうかを確認した。Ｏｃｔ４－ＧＦＰ＋細胞が出現したｄ１６に、ＡＭＰＫ活性化剤添加培地から、ナイーブ型細胞の増殖及び維持が可能な２ｉＬ添加Ｂａｓａｌ培地に変更し、培養を行った。１０回継代した後（ｄ１６＋１０ｐ）、Ｏｃｔ４－ＧＦＰを均一に発現するコンパクトでドーム状のナイーブ様コロニーが２ｉＬ条件下で選択的に増殖した（図２Ａ）。ＦＡＣＳ解析の結果、プライム型ｍＥｐｉＳＣｓ：Ｏｃｔ４ＧＩＰは、ＯＣＴ４－ＧＦＰに対して陽性であったが、ナイーブマーカーであるＰＥＣＡＭ１に対して陰性であった。ＡＩＣＡＲ単独、又はＡＩＣＡＲ及びＬＩＦの条件で誘導したナイーブ様細胞（復帰細胞、ｄ１６＋１０ｐ）は、ＰＥＣＡＭ１に対して大部分が均質に陽性であった（図２Ｂ）。多能性遺伝子のｍＲＮＡ発現を調べたところ、復帰細胞ではＲｅｘ１、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、Ｅｓｒｒｂ、Ｔｆｃｐ２ｌ１などの多くのナイーブ特異的遺伝子がナイーブ型ＭＥＳＣと同程度に発現していることが確認された（図２Ｅ）。これらのナイーブ特異的タンパク質は、ナイーブ型ＭＥＳＣと同様に復帰細胞の核で明瞭かつ均質に発現していたが、プライミング型ＭＥｐｉＳＣでは発現していなかった（図２Ｆ）。さらに、他のＡＭＰＫ活性化剤で誘導されたナイーブ様細胞を評価した。ＡＩＣＡＲで誘導したものと同様に、Ａ７６９６６２単独、Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ、又はメトフォルミン＋ＬＩＦ（ｄ１６＋１０ｐ）で誘導したＯｃｔ４－ＧＦＰ＋細胞から、Ｏｃｔ４－ＧＦＰを均質に発現するコンパクトでドーム型のナイーブ様コロニーが選択的に出現した（図７Ａ）。ＦＡＣＳ解析の結果、Ａ７６９６６２単独、Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ、又はメトフォルミン＋ＬＩＦ処理（ｄ１６＋１０ｐ）で誘導した復帰細胞は、大部分がＰＥＣＡＭ１に対して均質な陽性であった（図７Ｂ）。これらの細胞は、２ｉＬ条件下で良好に維持及び増殖し（図７Ｃ）、コントロールのナイーブ型ｍＥＳＣと同等のＡＰ＋コロニー形成を示した（図７Ｄ）。多くのナイーブ特異的ｍＲＮＡ及びタンパク質は、ナイーブ型ＭＥＳＣと同レベルで発現していた（図７Ｅ、図７Ｆ）。
　次に、ＡＭＰＫによって誘導された復帰細胞のグローバルな遺伝子発現をＲＮＡシーケンシングによって評価した（図８）。復帰細胞は、プライム型ｍＥｐｉＳＣｓとは明らかに異なり、ナイーブ型ｍＥＳＣｓと類似していることが示された。さらに、同定されたＰＣＦ（多能性細胞運命）遺伝子シグネチャーは、グローバル転写物よりもナイーブ型多能性幹細胞とプライム型多能性幹細胞との分離を明確にすると報告されている（Fidalgo et al., Cell Stem Cell, 19 (2016), pp. 1-15,）。２，０３６個のＰＣＦ遺伝子を用いた主成分分析により、ナイーブ型細胞とプライム型細胞とを描き分けることに成功した。ＡＭＰＫ活性化剤により誘導された細胞を２ｉＬ条件（ｄ１６＋２ｐ，３ｐ，１０ｐ）で数回継代培養した後、これらの復帰細胞は全てナイーブ型ｍＥＳＣに近いクラスターに属した。このクラスターは、プライミング型ｍＥｐｉＳＣｓ、及び２ｉＬ条件（ｄ８及びｄ１６）での培養前にＡＭＰＫ活性化剤処理を行ったバルク細胞集団のクラスターと相互に排他的であった（図３Ａ）。第一主成分（ＰＣ１）は変動の多くを捉え、復帰細胞がナイーブ型細胞に明確に対応し、プライム型細胞には対応しないことが示された（図３Ａ）。復帰細胞は、２ｉＬ条件で２、３回継代した場合（ｄ１６＋２ｐ，３ｐ）にはナイーブ型ＭＥＳＣに対して短い距離を示したが、１０回継代した場合（ｄ１６＋１０ｐ）にはナイーブ型ＭＥＳＣとほぼ一致した。この結果により、２ｉＬ条件で十分に継代することにより、復帰細胞がナイーブ型の性質を完全に維持できることが示唆された。ｄ１６では、Ｏｃｔ４－ＧＦＰ及びＰＥＣＡＭ１の二重陽性を示すナイーブ様細胞も観察された（図１Ｄ、図１Ｅ、図６Ｃ、図６Ｄ）。遺伝子発現パターンは、２ｉＬで継代及び増殖する前の小さなサブセットであり、バルク細胞におけるナイーブ様細胞の出現を反映していないことが明らかになった。実際、ＰＣ１は、ｄ１６まで、ナイーブ型多能性幹細胞又はプライム型多能性幹細胞から分化及び離脱しつつある主要な細胞集団を大きく描き出していた。多能性制御因子及び系統マーカーに関する別の遺伝子パネルから選択したｍＲＮＡ発現のヒートマップ（Takashima et al., Cell, 158 (2014), pp. 1254-1269）により、異なるＡＭＰＫ活性化剤により誘導されたナイーブ様細胞は、ナイーブ型ｍＥＳＣと同様の発現パターンを共有し、プライム型ｍＥｐｉＳＣとは異なることが明らかになった（図３Ｂ）。例えば、Ｅｓｒｒｂ、Ｚｆｐ４２（Ｒｅｘ１としても知られている）、Ｐｒｄｍ１４、Ｎｒ５ａ２、Ｔｆｃｐ２ｌ１、及びＫｌｆ２などのナイーブマーカーは、ナイーブ型ｍＥＳＣと同等のレベルで復帰細胞において発現した。一方、Ｅｍｏｅｓ、Ｔ、Ｆｏｘａ２、ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６、Ｓｏｘ１７などの細胞系列マーカーは、プライム型ｍＥｐｉＳＣｓよりも復帰細胞で低くなっていた。Ｏｃｔ４ＧＩＰ　ｍＥｐｉＳＣｓに加えて、別のｍＥｐｉＳＣｓである、雌１２９Ｘ１／ＳｖＪマウスと交配した雄ＭＳＭ／ＭＳＭマウスから得られた１２９／ＭＳＭ細胞株も調べた（Yagi et al., Stem Cell Rep., 12 (2019), pp. 1113-1128）。ＰＣＡ解析及びヒートマップの両方が、１２９／ＭＳＭ　ｍＥｐｉＳＣｓもナイーブ状態に戻すことに成功したことを明確に示した（図３Ａ、図３Ｂ、図８）。したがって、ＡＭＰＫ活性化剤で誘導されたナイーブ様復帰細胞は、少なくともナイーブ型ｍＥＳＣとしてｉｎ　ｖｉｔｒｏの基準を満たすことが確認された。
（復帰細胞はキメラ形成と生殖細胞系列伝達に寄与する）
　次に、ＡＭＰＫで誘導された細胞がキメラ形成及び生殖細胞系列伝達に寄与することで、より明確にナイーブ状態であることを確認した。１２９／Ｓｖ×Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ（Sugimoto et al., Stem Cell Rep., 4 (2015), pp. 744-757）から得られた１２９／Ｂａ１細胞株と１２９／ＭＳＭ細胞株という２つのプライム型ｍＥｐｉＳＣ株を使用した。ＡＩＣＡＲ単独又はＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦで処理した後、２ｉＬで維持して数回継代すると、１２９／Ｂａ１ｃｅｌｌｓはＯｃｔ４ＧＩＰ細胞と同様のナイーブ様コロニー形態を示した（図４）。ナイーブ様に復帰した１２９／Ｂａ１細胞をＩＣＲ雌マウスの胚盤胞に注入し、キメラ形成への寄与を検討した。その結果、１２９／Ｂａ１細胞は、Ｏｃｔ４ＧＩＰ細胞に似たナイーブ様コロニー形態を示した（図４）。ほとんどの仔マウスが毛色キメラに成功した。雄のキメラマウスと雌のＩＣＲマウスを交配させたところ、Ａｇｏｕｔｉ毛色マウスが産まれ、１２９／Ｂａ１細胞ゲノムの生殖細胞系列伝達が示された（表５）。１２９／ＭＳＭ細胞では、ナイーブ様細胞を示す細胞形態及びＡＰ染色アッセイが正常に得られ（図７Ｇ、図７Ｈ）、キメラ形成が観察された（データ示さず）。これら全ての結果は、ＡＭＰＫ活性化がプライム型ｍＥｐｉＳＣｓのナイーブ型ｍＥＳＣへの復帰を誘導し得ることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　いくつかの細胞株におけるＡＭＰＫ活性化剤の復帰効率を、表６に要約した。プライム型ｍＥｐｉＳＣｓから得られた２ｉＬ条件で維持できるナイーブ様コロニーを復帰の成功と定義した。ＡＭＰＫ活性化剤（ＡＩＣＡＲ又はＡ７６９６６２）単独で、プライム型ｍＥｐｉＳＣｓからナイーブ様細胞の出現を誘導できた。ＬＩＦを添加すると、ＡＭＰＫ活性化剤、特にＡＩＣＡＲとの併用で、調べた全てのプライム型ｍＥｐｉＳＣｓ（Ｏｃｔ４ＧＩＰ、１２９／Ｂａ１、１２９／ＭＳＭ細胞系）で復帰効率が１００％まで向上した。これらの結果は、ＡＭＰＫの活性化がプライム型ｍＥｐｉＳＣｓをナイーブ型の多能性状態への復帰に寄与することを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（ｐ３８はＡＭＰＫ活性化剤による復帰において重要な下流標的である）
　次に、ＡＭＰＫ活性化剤によるナイーブ型細胞への復帰の分子機構を検討した。本発明者らは以前、ナイーブ型多能性を維持するためのＡＭＰＫシグナルの機能的下流の１つとしてｐ３８があることを示した（Liu and Yamashita, Biochem. Biophys. Res. Commun., 509 (2019), pp. 24-31）。ｐ３８の活性化は、体細胞の多能性幹細胞への再プログラミングを促進することが報告されている（Xu et al., 2013）。そこで、ＡＭＰＫ活性化剤による復帰の下流に、ｐ３８が存在する可能性があると仮定した。ＡＭＰＫ活性化剤は、コントロール細胞と比較して、ｐ３８のリン酸化を増加させた（図９Ａ）。まず、ＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦによるナイーブ状態への復帰に対するｐ３８阻害の効果を検討した。ＯＣＴ４－ＧＦＰ＋細胞の出現はあまり変わらなかったが，ＯＣＴ４－ＧＦＰ＋細胞中のＰＥＣＡＭ１＋細胞は、１６日間の復帰後、ｐ３８阻害剤（ｐ３８ｉ）であるＳＢ２０３５８０によって大きく減少した（図５Ａ）。培地を２ｉＬ条件に変更して７日後、ＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦ誘導細胞からはＯｃｔ４－ＧＦＰ＋／ＰＥＣＡＭ１＋細胞が濃縮され始めているのに対し、ＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦ＋ｐ３８ｉ処理を行った細胞からはＯｃｔ４－ＧＦＰ＋細胞が維持されなかった（図５Ｂ）。プライム型ｍＥｐｉＳＣｓを２ｉＬ条件で培養すると陰性となるＡＰ染色は、ＡＩＣＡＲ＋ＬＩＦ＋ｐ３８ｉ処理した細胞では陰性であった（図５Ｃ）。Ａ７６９６６２＋ＬＩＦ又はメトフォルミン＋ＬＩＦで誘導されるナイーブ様細胞の出現も同様にＳＢ２０３５８０でブロックされた（図９Ｂ、図９Ｃ）。これらの結果から、ｐ３８シグナルがＡＭＰＫ活性化を伴うナイーブ型への復帰過程に関与していると考えられた。
　さらに、ｐ３８の機能獲得実験を行った。Ｄ１７６Ａ及びＦ３２７Ｓ変異を含むｐ３８のテトラサイクリン誘導性（Ｔｅｔ－ＯＮ）構成的活性型（Xu et al., Cell Res., 23 (2013), pp. 131-141; Diskin et al., J. Biol. Chem., 279 (2004), pp. 47040-47049）を有するＯｃｔ４ＧＩＰ細胞株を作製し、Ｄｏｘ処理でｐ３８経路を活性化した（図９Ｄ）。ｐ３８活性化単独又はＬＩＦとの併用は、Ｂａｓａｌ培地において１６日後にＯｃｔ４－ＧＦＰ＋コロニーの出現を誘導した（図５Ｄ）。これらのＯｃｔ４－ＧＦＰ＋細胞の中には、ＰＥＣＡＭ１＋細胞が観察された（図５Ｅ）。その後、培地を２ｉＬ条件に変更し、細胞を数回継代した。ＡＭＰＫ活性化剤処理実験と同様に、ｐ３８活性化のみ（ｄｏｘ＋）でも、均質なＯｃｔ４－ＧＦＰ＋ナイーブ様コロニーが選択的に出現した（図５Ｆ）。これらの細胞は一様にＯｃｔ４－ＧＦＰ及びＰＥＣＡＭ１の二重陽性で（図５Ｇ）、明確なナイーブマーカータンパク質の発現を示した（図５Ｈ）。表６にまとめたように、ｐ３８活性化による復帰効率は、ＡＭＰＫ活性化剤ほど良好ではなかった。これらの結果は、ｐ３８が、ナイーブ状態復帰のためのＡＭＰＫの重要な下流遺伝子であるが、ＡＭＰＫ誘導による復帰を部分的に再現できることを示す。
（２）ヒト多能性幹細胞のナイーブ型への復帰
＜材料と方法＞
（細胞培養）
　ｈｉＰＳＣ株（ＦｆＩ１４）は京都大学ｉＰＳ細胞研究所から、ｈＥＳＣ株（Ｈ１）はＷｉＣＥＬＬ社から提供された。プライム型ＰＳＣｓは、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）（Kubara et al., 2018. Stem Cell Reports. 14;11(2):380-394）のＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：６０希釈）コーティングしたディッシュ上で維持した。細胞はＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ　ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ）を用いてシングルセルのまま３～７日ごとに継代した。継代後の最初の２４時間はＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、１０μＭ）を培地に添加した。
　ＮａｉｖｅヒトＰＳＣｓは、ＰＸＧＬ培地（ＰＤ０３２５９０１（Ｓｉｇｍａ，１μＭ）、ＸＡＶ９３９（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，２μＭ）、Ｇｏ６９８３（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，２μＭ）（Bredenkamp et al., 2019. Stem Cell Reports. 1212-1222）、ヒトＬｉｆ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，１０ｎｇ／ｍｌ）、及びペニシリン／ストレプトマイシン（Ｍｅｉｊｉ）を添加したＮｄｉｆｆ２２７（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ）培地）で培養した。培養は、マイトマイシンＣ不活性化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダーを用いてマトリゲルコートした６ウェルプレート上で行った。
　ＡＩＣＡＲ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、１ｍＭ）をＰＸＧＬ培地に添加し（Liu et al., 2019. Biophys. Res. Commun. 509, pp. 24-31; Liu et al., 2021. iScience. 25;24(7):102783）、ＶＰＡ（Guo et al., 2017. Development. 144, 2748-2763）をＮｄｉｆｆ２２７　ｂａｓａｌ培地（ＰＤ０３２５９０１（Ｓｉｇｍａ、１μＭ）、ヒトＬｉｆ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、１０ｎｇ／ｍｌ）、ペニシリン／ストレプトマイシンを添加）に添加して、ナイーブ状態を誘導した。細胞を、ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ　ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、シングルセルとして５～１０日ごとにＭＥＦフィーダー層で継代した。ＲＯＣＫ阻害剤Ｙ２７６３２（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ、１０μＭ）を継代後最初の２４時間培地に添加した。培地は毎日交換した。
（ＥＯＳ－ＧＦＰ及びＣＡ－ｐ３８トランスフェクション）
　ナイーブ状態のマウスＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞、ナイーブ状態のヒトＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、ＯＣＴ４転写において遠位エンハンサー（ＤＥ）を優先的に利用することが報告されている（Yeom et al, 2014. Development. 122, 881-894; Theunissen et al., 2014. Cell Stem Cell. 15, 471-487; Choi et al., 2016. Stem Cell Reports. 7, pp. 911-926）。プライム型細胞として知られるマウスＥｐｉ－ＳＣｓ、ヒトＥＳ細胞、及びｉＰＳ細胞は、近位エンハンサー（ＰＥ）を優先的に使用する（Tesar et al., 2007. Nature. 448, 196-199; Gafni et al., 2013. Nature. 504, 282-286）。ＰＢ－ＥＯＳ－Ｃ（３＋）－ＥｉＰ（ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｕｒｏ）は、ＤＥ－ＯＣＴ４転写のレポーターとして記述されており、ナイーブマーカーとして使用されている（Takashima et al., 2014. Cell. 158, 1254-1269; Hotta et al., 2009. Nat. Protoc. 4, 1828-1844）。生きたヒトＰＳＣ細胞におけるナイーブ状態からプライム状態への変換をモニターするために、ヒトＥＳ細胞のＨ１株（Ｈ１－ＥＯＳ）及びヒトｉＰＳ細胞のＦｆ－Ｉ１４株（Ｆｆ－Ｉ１４－ＥＯＳ）に、ＰＢ－ＥＯＳ－Ｃ（３＋）－ＥｉＰ（ＥＧＦＰ－ＩＲＥＳ－Ｐｒｏ）をトランスフェクションした。トランスフェクションから２４時間後、ピューロマイシン（ナカライ、１０μｇ／ｍｌ）処理により細胞を５日間選択した。トランスフェクションした細胞は、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）でマトリゲルコートしたディッシュ上で維持した。
　ＣＡ－ｐ３８　Ｈ１－ＥＯＳ細胞株の生成のために、Ｈ１－ＥＯＳ細胞を、ｍＣｈｅｒｒｙと結合したｒｔＴＡ発現を有するピギーバック（ＰＢ）ベクターに変異ｐ３８（Ｄ１７６ＡおよびＦ３２７Ｓ）のｃＤＮＡを含むテトラサイクリン誘導性（Ｔｅｔ－ＯＮ）構成的活性型ｐ３８（ＣＡ－ｐ３８）でトランスフェクトした（Xu et al., 2013. Cell Res. 23: 131-141; Liu et al., 2019. Biophys. Res. Commun. 509, pp. 24-31）。ドキシサイクリン（ＤＯＸ）処理後のｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳにより精製した。トランスフェクトされた細胞は、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）のマトリゲルコートディッシュ上で維持された。
　ｐｉｇｇｙＢａｃ　ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅには、ｐＨＬ－ＥＦ１ａ－ｈｃＰＢａｓｅ－ｉＣ－Ａを使用した。エレクトロポレーションには、ＮＥＰＡ２１（ＮＥＰＡ　ＧＥＮＥ）を使用した。
（フローサイトメトリー）
　ＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ　ＣＴＳＴＭで細胞をシングルセルに解離し、コンジュゲート抗体及び４’，６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）で染色を行った。ＳＵＳＤ２クローンＷ５Ｃ５（ＳＵＳＤ２－ＰＥ、Ｂｉｏ　Ｌｅｇｅｎｄ　３２７４０６）、ＣＤ７５／ＣＤ７５ｓクローンＺＢ５５（ＣＤ７５－ＡＰＣ、ＢＤ　５６６３５０）、及びＣＤ５７クローンＮＫ－１（ＣＤ５７－ＰＶ４２１、ＢＤ　５６３８９６）をフローサイトメトリーに用いた。
（免疫染色）
　免疫染色は、以前に記載されたように行った（Yamashita et al., 2000. Nature. 408, 92-96）。細胞を、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ　Ｈｉｓｔｏ（ナカライ、１：２０希釈）／ＰＢＳ＋０．５％　Ｔｒｉｔｏｎで１時間ブロッキングした。ＰＢＳ＋０．５％　Ｔｒｉｔｏｎで希釈した一次抗体で細胞を染色し、４℃で一晩インキュベートした。Ａｌｅｘａ４８８又はＡｌｅｘａ５４６（Ｔｈｅｒｍｏ）を結合した二次抗体（抗ウサギ－マウス又はヤギＩｇＧ抗体）をＰＢＳ＋０．５％　Ｔｒｉｔｏｎで希釈し、室温で１時間インキュベートした。洗浄にはＰｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓｅｒｉｎｅ　ｗｉｔｈ　Ｔｗｅｅｎ－２０を用い、核染色にはＤＡＰＩを用いた。
（ウェスタンブロッティング）
　ＣＡ－ｐ３８　Ｈ１－ＥＯＳ細胞を、２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ＭＥ）（Ｎａｃａｌａｉ）を含むサンプルバッファー溶液で溶解した。全細胞溶解液中のタンパク質をＢｌｏｔＴＭ　Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜はＢｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ）を用いて３０分間ブロッキングした。次に、ニトロセルロース膜を以下の一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした：ｐ３８（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（９２１２Ｓ）、１：１０００）；リン酸化ｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（９２１５Ｓ）、１：１０００）；及びβ－アクチン（Ｓｉｇｍａ（Ａ５４４１）、１：１００００）。Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰを結合した抗マウス－ウサギＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、１：３０００－１：１０００）を二次抗体として用いた。抗体の希釈には、Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎキット（東洋紡）を用いた。二次抗体を室温で２時間インキュベートした後、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　ｗｅｓｔｅｒｎ　ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて検出を行った。
（ＲＮＡ単離及びＲＴ－ｑＰＣＲ）
　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で単離し、逆転写にはＳｕｐｅｒ－Ｓｃｒｉｐｔ　ＩＩＩ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。全てのｑＰＣＲ反応は、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いた。細胞は、内因性コントロールのＲＰＳ１８によって正規化された。
（細胞代謝アッセイ）
　ミトコンドリアを、ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄ－ａｍｉｎｅ，　ｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ（ＴＭＲＥ、最終濃度２０ｎＭ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０分間染色し、共焦点顕微鏡で解析した。
（ＲＮＡシーケンシング）
　ＲＮＡシーケンシングは、プライムＨ１－ＥＯＳ、プライムＣＡ－ｐ３８　Ｈ１－ＥＯＳ、ＡＩＣＡＲ誘導ナイーブＨ１－ＥＯＳ、ＣＡ－ｐ３８誘導ナイーブＣＡ－ｐ３８　Ｈ１－ＥＯＳ、及びＶＰＡ誘導ナイーブＨ１－ＥＯＳについて実施した。サンプル調製では、プライム状態の細胞をＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｓｅｌｅｃｔ　ＣＴＳＴＭで解離させ、ＣＤ７５＋／ＳＵＳＤ２＋のナイーブ状態の細胞をＦＡＣＳでソーティングした。Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で分離し、ＲＮＡ　Ｃｌｅａｎ　＆　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５　ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で製造者の指示に従って精製した。ＮＥＢＮｅｘｔ　Ｐｏｌｙ（Ａ）　ｍＲＮＡ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｍｏｄｕｌｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）を用いてポリアデニル化ＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ）を濃縮した。ＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーの作製にはＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ　Ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ　ｂｉｏ）を使用し、Ｎｏｖａｓｅｑ　６０００で塩基配列を決定した。リードはＧＲＣｈ３８．ｐ１３にアライメントし、ＲＳＥＭ（ＲＮＡ－Ｓｅｑ　ｂｙ　Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ－Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を用いて、Ｒｅａｄｓ　Ｐｅｒ　Ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ，ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ　ｍａｐｐｅｄ　ｒｅａｄｓ（ＲＰＫＭ）を算出した。
　比較データは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ａｒｃｈｉｖｅ（ＥＮＡ）から、アクセッション　ＥＲＰ００６８２３、ＳＲＰ０５９２７９、ＳＲＰ０４５９１１）、ＳＲＰ０５５８１０、及びＳＲＰ０７４０７６のデータをダウンロードした。
　２９個のｆａｓｔｑファイルはすべて、ｃｕｔａｄａｐｔ－１．１５　ｕｓｉｎｇ　ｔｒｉｍ＿ｇａｌｏｒｅ－０．４．４＿ｄｅｖ　ｗｉｔｈ　－ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　３　ｏｐｔｉｏｎでアダプタートリミングし、Ｂｏｗ－ｔｉｅ２　ｖ２．２．５　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｖｅｒｙ－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ－ｌｏｃａｌ　ｏｐｔｉｏｎで、Ｅｎｓｅｍｂｌ　ＧＲＣｈ３８　ｒｅｌｅａｓｅ　１００　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｃＤＮＡ　ａｎｄ　ｎｃＲＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓにマッピングした。合計１，８００，０７１，７７４本のリード（ｓｉｎｇｌｅ　ｏｒ　ｐａｉｒｅｄ）のうち、１，２５４，８３９，８４４本（６９．７％）がマッピングに成功し、ＭＡＰＱ　ｓｃｏｒｅ≧１の閾値を持つ遺伝子として定量化された。２９サンプルについて、合計６１，２２２個（平均４３，８１３個）の遺伝子が検出された。
　以下の解析は、Ｒ　ｖｅｒ．　４．０．３を用いて、非分類のｌｉｍｍａ　ｖｏｏｍ正規化後に行った。ナイーブｈＥＳＣ、プライムｈＥＳＣ、ＡＩＣＡＲ－及びＣＡ－ｐ３８誘導ナイーブｈＰＳＣからの合計２６サンプルを分析した。ヒートマップ（図２８）は、多能性調節因子、ナイーブ状態、及びプライム状態の関連遺伝子の選択した遺伝子セットについて描かれるように分析された。
（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）
　ナイーブ型細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化の前に「再プライム化」された。ナイーブ型細胞は、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）中のマトリゲルコートディッシュ上で約１ヶ月間継代された。内胚葉分化のために、培地をＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）からｍＴｅＳＲ１（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に切り替え、再プライム化細胞を１週間培養した。その後、ｍＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地をＡｃｔｉｖｉｎ　Ａ（Ｒ＆Ｄ、１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｗｎｔ３Ａ（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、２５ｎｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋Ｂ２７培地に切り替えた。
　翌日、Ａｃｔｉｖｉｎ　Ａ（Ｒ＆Ｄ，　１００　ｎｇ／ｍｌ）と０．２％血清を含むＲＰＭＩ培地に交換した。
　中胚葉分化のために、再プライム化した細胞をＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）でコンフルエンス状態まで培養した後、ｈｂＦＧＦ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，４ｎｇ／ｍｌ）を添加したマウス胚性線維芽細胞調整液（ＭＥＦ－ＣＭ）で希釈したマトリゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，　１：６０　ｄｉｌｕｔｉｏｎ）で１日間細胞を覆った。翌日、ＭＥＦ－ＣＭをＡｃｔｉｖｉｎ　Ａ（Ｒ＆Ｄ，１００ｎｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋Ｂ２７　ｍｅｄｉｕｍ（ＲＰＭＩ１６４０，２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｘ１　Ｂ２７　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｉｎｓｕｌｉｎ）に２４時間置換し、その後ヒト骨形成タンパク質４（Ｒ＆Ｄ，１０ｎｇ／ｍｌ）とｈｂＦＧＦ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，１０ｎｇ／ｍｌ）を添加し、４日間培養液交換を行わなかった。最後に、ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋Ｂ２７培地（ＲＰＭＩ１６４０，２ｍＭ　Ｌ－ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，ｘ１　Ｂ２７）に切り替え、１週間培養を行った。
　外胚葉分化のため、再プライム化した細胞をｈｂＦＧＦ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，１０ｎｇ／ｍｌ）、ＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ，２０ｍＭ）、Ｎｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ，２６０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＮｄｉｆｆ２２７（タカラバイオ）で４日間培養した。その後、培地をｈｂＦＧＦ（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，１０ｎｇ／ｍｌ）及びＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ，２０　ｍＭ）を添加したＮｄｉｆｆ２２７（タカラバイオ）に切り替えた。
＜結果＞
（ＡＩＣＡＲ処理によりヒト多能性幹細胞はナイーブ状態に変化する）
　ナイーブ型ヒトＰＳＣ維持培地として、ＰＸＧＬ培地（ＰＤ０３２５９０１（１μＭ）、ＸＡＶ９３９（２μＭ）、Ｇｏ６９８３（２μＭ）、及びヒトＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＮｄｉｆｆ２２７培地）を使用した。この培養条件におけるＡＭＰＫ活性化の効果を検討した（図１０）。
　ヒトナイーブ型ＰＳＣｓの出現は、当初、ナイーブ状態マーカーとしてＥＯＳ－ＧＦＰレポーター発現によりモニターした。Ｈ１ヒトＥＳＣ（Ｈ１－ＥＯＳ）とＦｆ－Ｉ１４ヒトｉＰＳＣ（Ｆｆ－Ｉ１４－ＥＯＳ）を用いて、ＥＯＳ－ＧＦＰレポーター遺伝子を発現するヒトＰＳＣｓを作製した。
　Ｈ１－ＥＯＳ細胞を、ヒトＰＳＣのプライム状態からナイーブ状態への遷移を誘導することが報告されているバルプロ酸（ＶＰＡ）で処理すると、ＧＦＰ陽性細胞の誘導に成功し（図１１）、ＥＯＳ発現細胞系の妥当性が示された。これらの細胞をＰＸＧＬ培地中で１ｍＭのＡＩＣＡＲで１４日間処理したところ、小さなＧＦＰ陽性細胞集団の出現が観察された。フローサイトメトリー解析により、ＰＸＧＬ培地のみで処理した細胞とは異なる、ごく少数ではあるが明確なＧＦＰ陽性細胞の出現が検出されたことが確認された。ほとんどの細胞はプライム状態マーカーであるＣＤ５７に対して陰性であり、一部の細胞はナイーブ状態マーカーであるＣＤ７５及びＳＵＳＤ２に対して陽性（２％未満）であることが確認された（図１２）。ＧＦＰ陽性細胞の出現後（誘導１４日目）、細胞を継代し、ＡＩＣＡＲ濃度を下げて（０．５ｍＭ）さらに１週間培養した（図１０）。その後、ＡＩＣＡＲを除去し、ＭＥＦフィーダー細胞上のナイーブ維持ＰＸＧＬ培地のみで、細胞の増殖を継続させた。ＧＦＰ陽性細胞は、ＡＩＣＡＲを含まないＰＸＧＬ培地で４ヶ月以上増殖し、ナイーブ型のドーム状のコロニーを示すことができた（図１３）。この培養条件（ＭＥＦフィーダー細胞を含むＰＸＧＬ）では、その倍加時間は４～５日であった。ＣＤ７５＋／ＳＵＳＤ２＋／ＧＦＰ＋細胞集団は継代後に濃縮され、フローサイトメトリー解析により明確に同定された。ＦＡＣＳ精製したＣＤ７５－及びＳＵＳＤ２陽性ナイーブ様細胞についてのＲＴ－ｑＰＣＲ解析は、多能性マーカーであるＯｃｔ４及びＮａｎｏｇが、プライム型Ｈ１－ＥＯＳ、ＶＰＡ誘導ナイーブ様細胞、及びＡＩＣＡＲ誘導ナイーブ様細胞の両方で発現していることを示した。一方、ナイーブ状態マーカーであるＫｌｆ４、Ｔｆｃｐ２ｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、及びＫｌｆ２は、ナイーブ様細胞にのみ発現した（図１４）。免疫蛍光染色でも、ＯＣＴ４及びＮＡＮＯＧはプライム状態のＨ１－ＥＯＳとナイーブ様細胞の両方で発現していたが、ナイーブ状態のマーカーＫＬＦ１７はナイーブ様細胞にのみ発現していた。ＴＦＥ３の核内移行は、ナイーブ状態の細胞で起こることが報告されている（Betschinger et al., 2013. Cell. 153(2):335-47）。これと一致して、ＶＰＡ誘導ナイーブ様細胞及びＡＩＣＡＲ誘導ナイーブ様細胞はＴＦＥ３の核内局在を示したが、プライミングＨ１－ＥＯＳ細胞は細胞質局在をした（図１５）。ＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンメチルエステル）染色では、プライム型Ｈ１－ＥＯＳ細胞よりもＡＩＣＡＲ誘導したナイーブ様細胞で、ナイーブ型ＰＳＣの特徴であるミトコンドリア活性の上昇が観察された（図１６）。これらの結果はすべて、ＡＩＣＡＲ誘導細胞がナイーブ状態の様々な特徴を有することを示している。同様に、ｈｉＰＳＣ（Ｆｆ－Ｉ１４－ＥＯＳ）でも、ＡＩＣＡＲ処理によりＣＤ７５＋／ＳＵＳＤ２＋／ＧＦＰ＋のドーム状のナイーブ細胞様コロニーを誘導することに成功した（図１７）。
（ＡＩＣＡＲ誘導ナイーブ様ヒト多能性幹細胞は分化能を有する）
　ＡＩＣＡＲで誘導されたナイーブ様細胞の分化能を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ分化で評価した。使用した誘導プロトコルはプライム型ＰＳＣｓを対象に開発されたものであるため、ＡＩＣＡＲ誘導ナイーブ様細胞を、プライム型細胞培地ＡＫ０２Ｎで３継代以上培養して「再プライム化」した。この再プライム化された細胞は、３つの生殖細胞系列への分化を示した。中胚葉誘導法（改変ＤＤプロトコル（Uosaki et al., 2011. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 155-169））を用いて分化させると、ＴＨＹ１陽性又はＰＤＧＦＲβ陽性の中胚葉細胞が出現した（図１８（Ａ））。内胚葉（ＳＯＸ１７陽性又はＣＸＣＲ４陽性）は、Ａｃｔｉｖｉｎ　ＡとＷｎｔ３Ａで処理することにより誘導した（Kroon et al., 2008. Nat. Biotechnol. 26, 443-452）（図１８Ｂ）。神経分化は、Ｎｏｇｇｉｎ及びＳＢ４３１５４２（Chambers et al., 2009. Nat. Biotechnol. 27, 275-280）を用いて達成され、ＴＵＪ１及びＭＡＰ２の免疫染色によって確認された（図１８Ｃ）。
（エピゲノムの状態）
　ヒストン３リジン９トリメチル化（Ｈ３Ｋ９ｍｅ３）は、ヘテロクロマチンマーカーの一つである。Ｈ３Ｋ９ｍｅ３染色では、プライム状態のＰＳＣｓでフォーサイ（ｆｏｃｉ）形成が観察される一方、ナイーブ状態では消失する(Takashima et al, 2014. Cell. 158, 1254-1269）。これと一致して、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３のフォーサイ（ｆｏｃｉ）はプライム状態のＨ１－ＥＯＳで観察されたが、ＡＩＣＡＲで誘導されたナイーブ様細胞では観察されなかった（図１９）。ヒトＩＣＭ細胞、ナイーブ型マウスＥＳ細胞、及びナイーブ型ヒトＰＳＣｓは、グローバルなＤＮＡ低メチル化を示すが、プライム型マウスＥｐｉ－ＳＣｓ及びプライム型ヒトＰＳＣｓでは高メチル化が認められる。ＤＮＡメチル化マーカーである５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）の免疫蛍光染色を行い、ＡＩＣＡＲ誘導ナイーブ様細胞でそれらの発現が明らかに減少していることを確認した（図２０）。Ｘ染色体は、プライム型細胞ではＸａＸｉ（Ｘａ：活性型Ｘ染色体；Ｘｉ：不活性型Ｘ染色体）であり、ナイーブ型細胞ではＸａＸａである。ＡＩＣＡＲ誘導ナイーブ様細胞のＸ染色体解析では、ＸａＸａであることが確認された（図２１）。これらの結果から、ＰＸＧＬ維持条件にＡＩＣＡＲを単独で加えることにより、プライム型ヒトＰＳＣｓを、ナイーブ状態の基準を複数満たす細胞へ誘導できることが確認された。
（ｐ３８はＡＩＣＡＲ下流遺伝子であり、ヒト多能性幹細胞をナイーブ状態へと変換し得る）
　次に、ＡＩＣＡＲにより誘導されるナイーブ様細胞への変換におけるｐ３８の関与を検討した。ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０をＡＩＣＡＲとともに添加すると、ＡＩＣＡＲによるナイーブ様細胞の誘導が抑制された。この結果から、ｐ３８がナイーブ様細胞への復帰に関与していることが示された（図２２）。次に、ｐ３８がナイーブ状態への復帰を誘導できるかを検証した。構成的活性型ｐ３８（ＣＡ－ｐ３８）を薬剤で発現させることにより、ｐ３８経路を活性化できるヒトＰＳＣｓを作製した。テトラサイクリン誘導型（Ｔｅｔ－ＯＮ）ＣＡ－ｐ３８をＨ１－ＥＯＳ（ＣＡ－ｐ３８－Ｈ１－ＥＯＳ）細胞にトランスフェクトした。これらの細胞では、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）処理によりｐ３８がリン酸化され、活性化され得る（図２３、図２４）。ＰＸＧＬ培地で５日間ＤＯＸ処理をしてｐ３８を活性化すると（図２５）、ＥＯＳ－ＧＦＰ陽性細胞クラスターが観察され始めた。フローサイトメトリー解析では、ＡＩＣＡＲ処理と同様にＣＤ７５＋／ＳＵＳＤ２＋／ＣＤ５７－／ＧＦＰｄｕｌｌ細胞（２％未満）の出現が確認された（図２６）。その後、ＣＡ－ｐ３８誘導ＧＦＰ陽性細胞を、ＤＯＸを含まないＭＥＦフィーダー細胞上のＰＸＧＬ培地で培養し増殖させた。ＣＡ－ｐ３８誘導細胞は、約４日の倍加時間で、４ヶ月以上維持された。増殖後、ＣＡ－ｐ３８誘導ＧＦＰ陽性細胞は、ドーム状のナイーブ細胞様コロニーを形成し（図２７）、フローサイトメトリー解析によりＥＯＳ－ＧＦＰ陽性及びＣＤ７５、ＳＵＳＤ２陽性が確認された。ＣＡ－ｐ３８で誘導されたＣＤ７５及びＳＵＳＤ２の二重陽性細胞をＦＡＣＳで選別し、ＲＴ－ｑＰＣＲで解析した。これらの細胞は、プライム型細胞（Ｈ１－ＥＯＳ－ＧＦＰ）と同等の多能性マーカー（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ）の発現、及びプライム型細胞よりも高いナイーブ状態マーカー（Ｋｌｆ４、Ｔｆｃｐ２ｌ１、Ｓｔｅｌｌａ、Ｋｌｆ２）の発現が確認された（図２８）。これらのＣＡ－ｐ３８誘導細胞は、多能性マーカーの発現、ナイーブ状態マーカーの発現、及びＴＦＥ３の核内局在を示した（図２９）。ＣＡ－ｐ３８誘導ＧＦＰ陽性細胞は、ＴＭＲＥ染色によるミトコンドリア活性化と、エピゲノムにおいてＡＩＣＡＲ誘導ナイーブ様細胞と同様のナイーブ状態特性を示した（データは示さず）。再プライム化したＣＡ－ｐ３８誘導細胞は、３つの胚芽層全てに分化する可能性があることが確認された（データは示さず）。これらの結果から、ＣＡ－ｐ３８活性化によるｈＥＳＣのナイーブ化に成功したことが確認された。
（プライム型ｈＰＳＣ及びナイーブ型ｈＰＳＣの全遺伝子発現解析）
　既報の解析データを取得した：ヒトＩＣＭ由来の真正ナイーブ型ＨＮＥＳ１（Guo et al., 2016）；プライム型細胞から各種方法で変換されたナイーブ様ｈＰＳＣ（Takashima et al., 2014. Cell. 158, 1254-1269; Theunissen et al., 2014. Cell Stem Cell. 15, 471-487; Sperber et al., 2015. Nat. Cell Biol. 17, 1523-1535; Guo et al., 2017. Development. 144, 2748-2763; Yang et al., 2017. Cell. 169, 243-257.e25）；及びそれらの各プライム型細胞。ＡＩＣＡＲ、ＣＡ－ｐ３８、又はＶＰＡで誘導したナイーブ様細胞と、これらの親プライム型細胞のＲＮＡ－ｓｅｑデータを収集し、比較した。主成分分析（ＰＣＡ）により、ＨＮＥＳ１と化学的にリセット（ＶＰＡ）された細胞は、非常に近接して位置することが確認された。これらは、同じ研究室で樹立された細胞だった（Guo et al., 2016. Stem Cell Rep. 6, 437-446; Guo et al., 2017. Development. 144, 2748-2763）。ＡＩＣＡＲ、ＣＡ－ｐ３８、又はＶＰＡで誘導されたナイーブ様細胞、及び５ｉＬ／Ａ誘導ナイーブ様細胞（Theunissen et al., 2014. Cell Stem Cell. 15, 471-487）は、ＨＮＥＳ１及びｃＲ細胞のクラスターの近くに密集したクラスターを形成した（図３０）。ナイーブ様細胞の一種として以前に報告されたＥＰＳ細胞（Yang et al., 2017. Cell. 169, 243-257.e25）及びＮＨＳＭ／４ｉ誘導細胞（Gafni et al., 2013. Nature. 504, 282-286）は、プライム型細胞の近くに位置した。ナイーブ型及びプライム型の多能性に関連する６６遺伝子のヒートマップ解析により、ＡＩＣＡＲ誘導ナイーブ様細胞及びＣＡ－ｐ３８誘導様ナイーブ細胞が、ＨＮＥＳ１細胞を含む他のナイーブ型細胞と同様の遺伝子発現を示していることが明確に確認された（図３１）。これらのデータは、各種ナイーブ様細胞が、各親プライミング型細胞と異なるクラスターを形成していることを示した（図３１）。これらの結果から、ＡＩＣＡＲ又はｐ３８の活性化により、ヒトプライム型ＰＳＣｓにおけるナイーブ型への復帰を誘導できることが示された。
　本発明によれば、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型能異性幹細胞に誘導する方法、及びプライム型多能性幹細胞からナイーブ型多能性幹細胞を製造する方法、並びにこれらの方法に使用可能なナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット、及びナイーブ型多能性幹細胞誘導剤が提供される。
　以上、本発明の好ましい実施形態を説明および図示してきたが、これらは本発明を例示するものであり、限定的なものとみなされるべきではないことを理解すべきである。本発明の精神または範囲から逸脱することなく、追加、省略、置換、およびその他の変更を行うことができる。したがって、本発明は、前述の説明によって限定されるものとはみなされず、添付の請求項の範囲によってのみ限定される。

Claims (22)

  1. 　プライム型多能性幹細胞を、ＡＭＰＫ活性化剤を含む培地で培養する工程を含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法。
  2. 　前記培地がＬＩＦを更に含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ＡＭＰＫ活性化剤が、ＡＩＣＡＲ、Ａ７６９６６２及びメトフォルミンからなる群より選択されるいずれか１種以上の物質である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記プライム型多能性幹細胞がプライム型ＥＳ細胞又はプライム型ｉＰＳ細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記プライム型多能性幹細胞がヒト由来のプライム型ｉＰＳ細胞である、請求項４に記載の方法。
  6. 　プライム型多能性幹細胞のｐ３８　ＭＡＰＫを活性化させる工程を含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導する方法。
  7. 　前記プライム型多能性幹細胞がプライム型ＥＳ細胞又はプライム型ｉＰＳ細胞である、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記プライム型多能性幹細胞がヒト由来のプライム型ｉＰＳ細胞である、請求項７に記載の方法。
  9. 　プライム型多能性幹細胞を、ＡＭＰＫ活性化剤を含む培地で培養する工程を含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法。
  10. 　前記培地がＬＩＦを更に含む、請求項９に記載の製造方法。
  11. 　前記ＡＭＰＫ活性化剤が、ＡＩＣＡＲ、Ａ７６９６６２及びメトフォルミンからなる群より選択されるいずれか１種以上の物質である、請求項９又は１０に記載の製造方法。
  12. 　前記プライム型多能性幹細胞がプライム型ＥＳ細胞又はプライム型ｉＰＳ細胞である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の製造方法。
  13. 　前記プライム型多能性幹細胞がヒト由来のプライム型ｉＰＳ細胞である、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 　プライム型多能性幹細胞のｐ３８　ＭＡＰＫを活性化させる工程を含む、ナイーブ型多能性幹細胞の製造方法。
  15. 　前記プライム型多能性幹細胞がプライム型ＥＳ細胞又はプライム型ｉＰＳ細胞である、請求項１４に記載の製造方法。
  16. 　前記プライム型多能性幹細胞がヒト由来のプライム型ｉＰＳ細胞である、請求項１５に記載の製造方法。
  17. 　ＡＭＰＫ活性化剤を含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導するための、ナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット。
  18. 　ＬＩＦを更に含む、請求項１７に記載のナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット。
  19. 　前記ＡＭＰＫ活性化剤が、ＡＩＣＡＲ、Ａ７６９６６２及びメトフォルミンからなる群より選択されるいずれか１種以上の物質である、請求項１７又は１８に記載のナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット。
  20. 　前記プライム型多能性幹細胞がプライム型ＥＳ細胞又はプライム型ｉＰＳ細胞である、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット。
  21. 　前記プライム型多能性幹細胞がヒト由来のプライム型ｉＰＳ細胞である、請求項２０に記載のナイーブ型多能性幹細胞誘導用キット。
  22. 　ｐ３８　ＭＡＰＫ活性化剤を含む、プライム型多能性幹細胞をナイーブ型多能性幹細胞に誘導するための、ナイーブ型多能性幹細胞誘導剤。
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