CN103068969A - 化学成分确定的无血清细胞培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于培养例如间充质干细胞等细胞的含有营养和生长因子且不含任何血清的化学成分确定的细胞培养基的实施方式，和利用所述细胞培养基的实施方式来扩增例如间充质干细胞等细胞群并同时保持多能表型的方法，以及通过在所述细胞培养基的实施方式中混入分化因子从而诱导间充质干细胞的软骨发生和骨发生的方法。

Description

化学成分确定的无血清细胞培养基
此国际专利合作条约专利申请要求2010年6月17日的美国临时专利申请第61/397,847号的权益，并将该临时专利申请以援引方式并入本文。
技术领域
本发明总体涉及用于细胞培养的化学成分确定的无血清细胞培养基。具体而言，本发明涉及用于培养间充质干细胞的化学成分确定的无血清细胞培养基，所述培养基可用于扩增并同时保持可获取软骨细胞和骨细胞的多能表型，本发明还涉及利用这群扩增的间充质干细胞群治疗受益于施用治疗量的这种扩增和分化的间充质干细胞群的疾病的方法。
背景技术
在整形外科中、创伤外科中或摘除肿瘤病灶后的骨和软骨片段的重构中都要进行骨和软骨的移植。目前，用于该目的的是自体来源的或者来自活着或死亡的捐献者的人体组织。随着干细胞研究的进展，源自间充质干细胞的骨和软骨细胞正成为用于骨骼修复的细胞来源。
间充质干细胞(MSC)可见于身体的某些组织中，例如骨髓、血液、真皮和骨膜中。它们具有分化为其它类型的细胞的能力，因此可有助于损伤后组织的愈合。MSC可以从骨髓中分离纯化并在体外培养扩增。
目前，MSC的体外扩增是在补充有胎牛血清(下文中称作“FBS”)或补充有人的自体血清或基本相似或等同的血清(也称为“血清”)的培养基中进行。然而，从MSC培养物的潜在治疗应用的角度来看，MSC培养物中存在动物或人血清具有某些弊端和局限。首先，牛血清、人血清或其它动物血清可能含有血液传播的病原体，例如病毒和疯牛病朊病毒、牛海绵状脑病(“BSE”)等。其次，牛血清会激发抗异型生物质蛋白的抗体的产生，异型生物质蛋白可激发受体患者的免疫应答。第三，牛血清显示出批间差异，可导致不一致的性能。
显然，如果本发明的细胞培养基和使用本发明的细胞培养基的方法能够实现包括MSC在内的细胞的扩增并进而实现MSC在培养物中的分化，那么仅含有化学成分确定的物质且不含血清和异型生物质的细胞培养基对MSC(以及其他细胞)的培养而言将非常理想。
发明内容
因此，本发明的主要目的可以是提供用于细胞培养的化学成分确定的发明性无血清培养基(也称为“无血清培养基”)的一种或多种实施方式，并且涉及用于体外扩增MSC群(包括但不限于人MSC(“hMSC”))的该发明性无血清培养基的具体的非限制性实施方式。
本发明的另一主要目的可以是提供含有化学成分的组合的无血清培养基的实施方式，所述化学成分能够支持MSC在离体体外细胞培养物中的、特别是在不含任何血清(例如胎牛血清、自体血清或其它动物血清)的MSC体外培养物中的活力、增殖和分化。另外，本发明的培养基的实施方式可用于支持MSC的活力、增殖和分化，其效果或结果与含有血清的常规细胞培养基相比基本相似或更好。
本发明的另一主要目的可以是在导致MSC群扩增和MSC分化以产生软骨细胞或骨细胞的本发明的培养基中培养细胞(例如MSC，特别是人MSC)的方法。
本发明的又一主要目的可以是在带负电的塑料表面(例如带负电的聚苯乙烯塑料表面)上培养细胞(例如MSC)的方法，该方法避免了以纤连蛋白等包被表面的步骤。
当然，本发明的其它目的在说明书的其它部分、附图、照片和权利要求中都有公开。
附图说明
图1提供了对在含10%FBS的常规培养基中培养的hMSC和在本发明的无血清培养基的特定实施方式中培养的hMSC的细胞培养物形态学进行比较的图。
图2是细胞数量对天数的作图，该图比较了在含10%FBS的常规培养基中培养的hMSC的生长速率和在本发明的无血清培养基的特定实施方式中培养的hMSC的生长速率。
图3是细胞数量对传代数的作图，该图比较了每次分瓶(split)时的hMSC总数，其中，起始传代数为4，从含10%FBS的常规培养基进入本发明的无血清培养基的特定实施方式中或进入含10%FBS的常规培养基中。
图4提供了对在本发明的无血清培养基的特定实施方式中培养的hMSC和在含10%FBS的常规培养基中培养的hMSC的集落形成能力进行比较的图。
图5提供了对在本发明的无血清培养基的特定实施方式中长期培养后的hMSC和在含10%FBS的常规培养基中培养的hMSC的多向分化潜能进行比较的图。
图6是细胞数量对传代数的作图，该图显示出，在本发明的无血清培养基的特定实施方式中的hMSC的生长速率在使用和未使用培养容器上的平板包被层的情况下都相似。
图7是细胞数量对传代数的作图，该图比较了在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的基础培养基的实施方式中培养的源自脐带血的MSC的生长速率与在本发明的无血清培养基的特定实施方式中培养的源自脐带血的MSC的生长速率。
图8是细胞数量对传代数的作图，该图比较了在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的基础培养基中培养的源自脂肪组织的MSC的生长速率与在本发明的无血清培养基的特定实施方式中培养的源自脂肪组织的MSC的生长速率。
图9是在本发明的无血清培养基的特定实施方式中培养hMSC时总细胞数对所用的培养瓶的类型的柱状图。
具体实施方式
本发明涉及用于培养细胞的化学成分确定的无血清细胞培养基。具体而言，本发明涉及用于培养间充质干细胞的化学成分确定的无血清细胞培养基，所述培养基可用于单个核细胞(mononuclear cell)的离体扩增并同时保持多能表型，其中软骨细胞和骨细胞可源自所述间充质干细胞。本发明还涉及利用化学成分确定的无血清细胞培养基使体外扩增的间充质干细胞群分化为软骨细胞和骨细胞并治疗可受益于所获取的软骨细胞或骨细胞群的骨和软骨疾病的方法。
对于本发明，术语“无血清”表示不存在任何物种的任何血清，包括但不限于，不存在胎牛血清、小牛血清或人血清等或者它们的组合。
对于本发明，无论是否明确指出，本文中所有数值均设定为由术语“约”修饰。对于本发明，各范围可以表示为从“约”一个具体值至“约”另一个具体值。当表述了这样的范围时，另一实施方式包括从所述一个具体值至所述另一个具体值。通过端点来描述的数值范围包括了该范围内所含的所有数值。例如，1至5的数值范围包括了数值1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5等。还应该理解的是，每个范围的端点不论相对于另一个端点还是独立于另一个端点都具有显著意义。当利用了在前的“约”来将一个值表示为近似值时，应该理解的是，该特定值构成了另一实施方式。
对于本发明，术语“组合”是指将两种以上材料合在一起的任何方法。所述方法包括但不限于混合、共混、掺和、调混、匀化、合并、掺混或搅拌等。
对于本发明，术语“一个”或“一种”事物是指一个/种或多个/种该事物；例如，“一种蛋白”或“一种肽”是指一种或多种所述化合物或至少一种化合物。这样，术语“一个”或“一种”、“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文中可以互换使用。此外，“选自由……组成的组的”化合物是指其中所列的一种或多种化合物，包括两种以上这些化合物的组合。根据本发明，分离的化合物是已从其天然环境中取出的化合物。这样，“分离的”不必反映出该化合物的纯化程度。本发明的分离的化合物可从其天然来源获得，可利用分子生物学技术来制备，或者可以通过化学合成来制备。
另外，虽然描述了本发明实施方式的特定成分或要素的某些来源以及这些成分或要素的具体产品号，但本发明并不限于此，而且，适合用于本发明实施方式的相同、等同或基本相似的成分或要素可以从多种多样的来源获得。
包括本发明最佳模式的本发明的培养基的实施方式可提供无血清的基础培养基(也称为“基础培养基”)。无血清的基础培养基可包括Dulbecco’s Modified EagleMedium或组成相同、等同或基本相似的培养基(下文中称为“DMEM”)(本发明的实施方式使用的适合的DMEM可获自Invitrogen,5791Van Allen Way，Carlsbad,CA,PN11965(液体形式)或PN12100(粉末)，并根据制造商提供的使用说明制备)与MCDB201培养基或组成相同、等同或基本相似的培养基(下文中称为“MCDB”)(本发明的实施方式使用的适合的MCDB可获自Sigma-Aldrich(PN M6770))的混合物。还可以获得加入了某些成分(例如谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES、酚红、葡萄糖)且不含某些成分(例如蛋氨酸、半胱氨酸或钙)的每种所述常规培养基，且每种所述培养基都可以根据用途而用于基础培养基的某些实施方式中。
基础培养基的特定实施方式可包含DMEM和MCDB，且DMEM:MCDB的组合比(v/v)为约0.75:1.25至约1.25:0.75；然而，本发明并不限于此，利用选自以下组的DMEM:MCDB比能够制得在具体用途中带来益处的实施方式，所述组包括：约0.75:1.25至约0.85:1.15，约0.80:1.20至约0.90:1.10，约0.85:1.15至约0.95:1.05，约90:110至约1.05:0.95，约1.00:1.00至约1.10:0.90，约1.05:0.95至约1.15:0.85，约1.10:0.90至约1.20:0.80，和约1.15:0.85至约1.25:0.75。关于用于培养间充质干细胞(“MSC”)、特别是人间充质干细胞(“hMSC”)的本发明的特定实施方式，可利用具有适当结果的约1:1v/v的DMEM:MCDB比。
基础培养基的实施方式还可以包含一种或多种下文中进一步描述的成分，根据用途，这些成分可以与DMEM和MCDB的组合以各种排列方式、组合方式、浓度或量组合在一起。在每种情况中，可以以所述的范围或量来使用所述一种或多种成分，并且，根据成分的用途或组合，可以采用针对任何特定成分或要素所描述的范围的选定区段来实现某些益处。
基础培养基的实施方式还可以包含缓冲剂，例如量为约3.2g/L基础培养基至约4.2g/L基础培养基的碳酸氢钠，在特定实施方式中，为约3.7g/L。可利用一定量的氢氧化钠将基础培养基的pH调节为约7.3至约7.5的最终pH，在特定实施方式中pH为约7.4。
基础培养基的实施方式还可以包含调控铁源，该调控铁源在结合所培养的细胞的受体时会释放一定量的铁。调控铁源的非限制性实例可以是一定量的转铁蛋白，其在所述基础培养基中的浓度为约2mg/L至约10mg/L。在基础培养基的特定实施方式中，转铁蛋白的量可选自以下组，该组包括：约2mg/L至约4mg/L，约3mg/L至约5mg/L，约4mg/L至约6mg/L，约5mg/L至约7mg/L，约6mg/L至约8mg/L，约7mg/L至约9mg/L，和约8mg/L至约10mg/L。基础培养基的特定实施方式可包含量为约5mg/L的转铁蛋白。
基础培养基的实施方式还可以包含电子传递激活剂。电子传递激活剂可包含一定量的硒或一定量的亚硒酸；然而，本发明不限于此，还可以利用其它微量元素、金属酶或蛋白来支持电子传递。在基础培养基包含一定量的亚硒酸的实施方式中，其量可以为约0.0000025g/L至约0.0000050g/L，特定实施方式包含约0.0000037g/L。
基础培养基的实施方式还可以包含一种或多种抗氧化剂。作为非限制性实例，抗氧化剂可包含一定量的α-生育酚乙酸酯或一定量的抗坏血酸-2-磷酸酯，或一定量的α-生育酚乙酸酯和抗坏血酸-2-磷酸酯。特定实施方式可包含量为约0.0001g/L至约0.0003g/L的α-生育酚乙酸酯和量为约0.02g/L至约0.04g/L的抗坏血酸-2-磷酸酯。一个非限制性实例包含量为约0.0002g/L的α-生育酚乙酸酯和量为约0.0322g/L的抗坏血酸-2-磷酸酯。
基础培养基的实施方式还可以包含一种或多种类固醇。作为非限制性实例，类固醇可包含一定量的地塞米松或一定量的氢化可的松，或一定量的地塞米松和氢化可的松。特定实施方式可包含量为约2.0μg/L至约5.0μg/L的地塞米松与量为约0.5mg/mL至约1.5mg/mL的氢化可的松的组合。基础培养基的一个非限制性实例包含量为约0.000004g/L的地塞米松与量为约0.001g/L的氢化可的松的组合。
基础培养基的实施方式还可以包含量为约0.001g/L至约0.003g/L的5-羟色胺。基础培养基的一个非限制性实例包含量为约0.002g/L的5-羟色胺。
基础培养基的实施方式还可以包含一定量的人血清白蛋白(“HSA”)(其可以是重组人血清白蛋白(“rHSA”))。特定实施方式可包含量为约0.1g/L至约0.3g/L的HSA。基础培养基的一个非限制性实例包含量为约0.25g/L的HSA。
用于培养MSC或hMSC的基础培养基的非限制性特定实施方式可以包含各自的终浓度如表1所示的成分组合，或基本由该成分组合构成，或由该成分组合构成。
表1.用于MSC培养的培养基
成分 终浓度
MCDB201 0.5L/L
DMEM 0.5L/L
碳酸氢钠 3.7g/L DMEM
用于1L混合物的NaOH 最终pH=7.39
rHSA 0.25g/L
转铁蛋白 0.005g/L
亚硒酸 0.0000037g/L
抗坏血酸-2-磷酸酯 0.032205g/L
5-羟色胺 0.002127g/L
地塞米松 0.000003925g/L
氢化可的松 0.001g/L
α-生育酚乙酸酯 0.0002g/L
可以理解的是，基础培养基的该特定实施方式并非意图进行限制，而是例示了可利用等同或基本相似的成分来进行制备的各种各样的实施方式，其中所述成分的浓度根据培养中的特定细胞、细胞系、MSC或hMSC来调整。表1的实施方式所列的终浓度可以根据具体用途而在与制备时的正常方差相关的范围内在绝对值附近变化，以用于培养MSC或hMSC。另外，本发明的某些实施方式可包含比表1所列成分更少的成分，并且这些实施方式也包含在本发明的范围内。
本发明的实施方式还可以包含可以与基础培养基组合的基础培养基补充剂(该组合也称为“经补充的培养基”)。基础培养基补充剂可以包含多种排列组合的一种或多种细胞生长因子、一种或多种磷脂生长因子和一种或多种WNT信号传导途径激活剂。可以理解的是，根据用途，本发明的无血清培养基的实施方式不必但可以包含多种排列组合的所述一种或多种细胞生长因子、所述一种或多种磷脂生长因子或者所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂。
因此，基础培养基补充剂的实施方式可包含一种或多种细胞生长因子，例如：胰岛素，其可获自Sigma-Aldrich(PN I6634)(CAS NO.:11070-73-8)；人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，其可获自Sigma-Aldrich(PN F0291-25UG)(CAS No.:106096-93-9)；血小板源性生长因子bb(PDGF-bb)，其可获自Sigma-Aldrich(PN P3201)；表皮生长因子(EGF)，其可获自Sigma-Aldrich(PN E9644)(CAS NO.:62253-63-8)；和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)(CAS NO.:7733-29-1)，其可获自Sigma-Aldrich(PN I8779或PNI3769)。
基础培养基补充剂的实施方式可包含一定量的胰岛素。在特定实施方式中，其在无血清培养基中的浓度可为约0.004g/L至约0.006g/L。在一个非限制性实例中，胰岛素的量为约0.005g/L。
基础培养基补充剂的实施方式可包含一定量的bFGF。在特定实施方式中，bFGF在无血清培养基中的浓度可为约5ng/mL至约20ng/mL。在一个非限制性实例中，bFGF的量为约10ng/mL。
基础培养基补充剂的实施方式可包含一定量的PDGF-bb。在特定实施方式中，PDGF-bb在无血清培养基中的浓度可为约5ng/mL至约20ng/mL。在一个非限制性实例中，PDGF-bb在无血清培养基中的量为约10ng/mL。
基础培养基补充剂的实施方式可包含一定量的EGF。在特定实施方式中，EGF在无血清培养基中的浓度可以为约15ng/mL至约25ng/mL。在一个非限制性实例中，EGF在无血清培养基中的量为约20ng/mL。
基础培养基补充剂的实施方式可包含一定量的IGF-1。在特定实施方式中，IGF-1在无血清培养基中的浓度可以为约2ng/mL至约10ng/mL。在一个非限制性实例中，IGF-1在无血清培养基中的量为约5ng/mL。
对于每个上述细胞生长因子：PDGF-bb、bFGF、EGF和IGF-1，其在无血清培养基中的浓度选自下组时可具有益处，该组包括：约2ng/mL至约4ng/mL，约3ng/mL至约5ng/mL，约4ng/mL至约6ng/mL，约5ng/mL至约7ng/mL，约6ng/mL至约8ng/mL，约7ng/mL至约9ng/mL，约8ng/mL至约10ng/mL，约9ng/mL至约11ng/mL，约10ng/mL至约12ng/mL，约11ng/mL至约13ng/mL，约12ng/mL至约14ng/mL，约13ng/mL至约15ng/mL，约14ng/mL至约16ng/mL，约15ng/mL至约17ng/mL，约16ng/mL至约18ng/mL，约18ng/mL至约20ng/mL，和约19ng/mL至约20ng/mL。
基础培养基补充剂的实施方式可包含一种或多种磷脂生长因子，例如：溶血磷脂酸(“LPA”)(CAS NO.:22022-87-5)，其可获自Sigma-Aldrich(PN L7260)；和鞘氨醇1-磷酸(“S1P”)(CAS NO.:26993-30-6)，其可获自Sigma-Aldrich(PN S9666)。在特定实施方式中，LPA和/或S1P在无血清培养基中的浓度可以为约80nM至约200nM。一个非限制性实例包含在无血清培养基中的量为约100nM的LPA与在无血清培养基中的量为约150nM的S1P的组合。
对于每种上述磷脂生长因子，其在无血清培养基中的浓度选自下组时可具有益处，该组包括：约80nM至约100nM，约90nM至约110nM，约100nM至约120nM，约110nM至约130nM，约120nM至约140nM，约130nM至约150nM，约140nM至约160nM，约150nM至约170nM，约160nM至约180nM，约190nM至约200nM。
基础培养基补充剂的实施方式可包含一种或多种WNT信号传导途径激活剂。WNT信号传导途径激活剂可选自下述非限制性组，该组包括：人WNT-3a蛋白(“WNT3A”)，其可获自StemRD Inc.,Burlingame,CA(PN W3A-H005)；和R-spondin-1(“RSPO1”)，其可获自StemRD Inc.,Burlingame,CA(PN RSPO-005)。在特定实施方式中，所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂在无血清培养基中的浓度各自为约10ng/mL至约50ng/mL。一个非限制性实例包含在无血清培养基中的量为约20ng/mL的WNT3A与在无血清培养基中的量为约40ng/mL的RSPO1的组合。
用于培养MSC或hMSC的基础培养基补充剂的特定的非限制性实施方式可以包含各自在无血清培养基中的终浓度如表2所示的成分组合，或基本由该成分组合构成，或由该成分组合构成。
表2：化学成分确定的MSC培养基生长因子
生长因子 终浓度
胰岛素 0.005g/L
PDGF-bb 10ng/mL
bFGF 10ng/mL
EGF 20ng/mL
IGF-1 5ng/mL
LPA 100nM
S1P 150nM
WNT3A 20ng/mL
RSPO1 40ng/mL
同样，虽然表2列出了用于扩增培养MSC的在本发明的无血清培养基的具体实施方式中所采用的各种细胞生长因子、脂质生长因子和WNT信号传导途径激活剂的终浓度，但本发明并不限于此，可实现本发明的其它实施方式以进行细胞培养，包括但不限于：以多种排列组合使用该表中所列的一种或多种或全部生长因子(其中各成分或要素的浓度根据应用而发生上文所述的变化)，从而从MSC或hMSC获得软骨细胞和骨细胞。
无血清培养基的实施方式还可以包含一定量的转化生长因子β1(“TGFB1”)，其可获自StemRD Inc.,Burlingame,CA(PN TGF-b-005)。TGFB1的量可以是对于从在上述化学成分确定的无血清细胞培养基中培养的间充质干细胞获得软骨细胞而言足够的量。在无血清培养基的特定实施方式中，TGFB1在无血清培养基中的浓度可以为约0.5ng/mL至约5ng/mL。在一个非限制性实例中，TGFB1在无血清培养基中的浓度为约1ng/mL。
无血清培养基的实施方式还可以包含一定量的骨形态发生蛋白2(“BMP2”)，其可获自Sigma-Aldrich(PN B3555)。BMP2的量可以是对于从在上述化学成分确定的无血清细胞培养基中培养的间充质干细胞获得骨细胞而言足够的量。在无血清培养基的特定实施方式中，BMP2在无血清培养基中的浓度可以为约0.5ng/mL至约5ng/mL的。在一个非限制性实例中，TGFB1在无血清培养基中的浓度为约1ng/mL。
可以理解的是，实施方式可包含对于从MSC或hMSC获得软骨细胞群或骨细胞群或获得同时包含软骨细胞群和骨细胞群的群而言足够多的TGFB1和/或BMP2。适于从hMSC获得软骨细胞或骨细胞的无血清培养基的特定实施方式可包含表1和表2中列出的成分的组合并随后在该组合中混入一定量的TGFB1和/或BMP2，或基本由上述组合构成，或由上述组合构成。
以下实施例意在阐释制备和利用本发明的化学成分确定的无血清细胞培养基的方法(包括本发明的基础培养基和本发明的经补充的培养基的某些实施方式)，其足以使本领域技术人员制备和利用本发明所涵盖的广泛的实施方式。
实施例1.冻存细胞的复苏
无论此前用于培养或冷冻细胞的是何种培养基，冷冻的细胞(包括但不限于：MSC，特别是hMSC)都能够适应上述的本发明的无血清培养基。分步的程序包括使冷冻细胞(例如hMSC)在约37℃的水浴中解冻。可将hMSC转入50mL锥形底离心管或其他适合的容器中。对于每1mL的hMSC悬浮液，在轻轻搅拌的同时逐滴添加约10mL的预先温热至约37℃的本发明的无血清培养基。将锥形底离心管中的内容物转移至组织培养瓶中或在组织培养板的多孔中进行平板接种。作为另一选择，亦可将hMSC在约250×g(～1200rpm)下离心约10分钟，重悬在本发明的无血清培养基(根据用途选择基础培养基或经补充的培养基)中，然后进行转移或平板接种。hMSC可在含约4%至约6%二氧化碳的湿润氛围中在约36℃至约38℃下温育。约24小时后，将转移或平板接种有hMSC的本发明的无血清培养基替换为新鲜的本发明的无血清培养基。每2天更换本发明的无血清培养基以维持hMSC细胞培养物，直至细胞扩增需要进行传代或分瓶。
实施例2.细胞传代
在本发明的无血清培养基的实施方式(例如，“基础培养基”或“经补充的培养基”)中培养细胞(包括但不限于：MSC，特别是人MSC)时，不必需对细胞培养容器的表面进行包被或其他处理。利用未包被的常规组织培养容器可以实现充分的且通常最佳的细胞贴附和细胞生长(包括MSC和hMSC)。作为非限制性实例，带负电的聚苯乙烯容器，例如细胞传代用的25cm2的组织培养瓶(可获自BD Primaria,1Becton Drive,Franklin Lakes,New Jersey(BD Cat#353808))和BD Primaria,Falcon6孔板(BD Cat#353046)，可不经平板包被而用于本发明的培养基的实施方式中；然而，本发明并不限于此，如有需要，可以在约37℃下用约0.5微克/cm2表面积至1.0微克/cm2表面积的纤连蛋白包被容器表面约1小时，然后将细胞平板接种在本发明的无血清培养基中。在含血清培养基或无血清培养基中培养的细胞(包括MSC和hMSC)能够快速且容易地适应本发明的实施方式的无血清培养基。在多数情况中，从含血清培养基到本发明的实施方式的无血清培养基的一步转移就能够足够。如果需要，还可以进行如下的利用逐渐增加的本发明的无血清培养基的量(例如，25%、50%等)的逐步适应。
在显微镜下目视检查细胞培养物原液(无论细胞是在本发明的无血清培养基中生长还是在其它培养基中生长)，并确定细胞是否已经可以进行传代。为保持MSC的生长能力，可以在细胞达到约70%汇合时传代。如果MSC或hMSC培养物达到约80%以上的汇合，则细胞在传代后可能停止增殖。因此，为了避免该结果，可以在MSC和hMSC达到80%汇合前将其传代。在容器中添加约0.05%胰蛋白酶/EDTA溶液或TrypLETMExpress，在室温下倾斜容器以覆盖所有细胞。
在显微镜下观察MSC或hMSC或细胞。当细胞开始脱附时，轻轻敲击容器侧面，从而帮助剩余细胞松动。如果MSC或hMSC已在本发明的无血清培养基的实施方式中培养，则细胞脱附所需时间为约1分钟至约3分钟。有趣的是，在常规的含血清培养基中生长的细胞可能需要更长的温育时间来脱附。
一旦细胞已经脱附，就进行下一步。在细胞已经脱附后，不要将MSC长时间地留在细胞解离酶(例如胰蛋白酶或TrypLETMExpress)中，因为这将不利地影响MSC的生长。
细胞脱附后，添加足量的Dulbeccos磷酸盐缓冲盐水(“DPBS”)以覆盖表面(适合用于本发明方法中的DPBS可获自Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri，产品号D4031)。将细胞悬浮液收集在在无菌的15mL锥形底离心管中。必要时通过强力敲击瓶或对悬浮液进行吹吸来将细胞团块打散。
将细胞在1200rpm(250×g)下离心10分钟。将基本上全部上清液吸出并丢弃。将细胞重悬在DPBS或本发明的无血清培养基中，并再次离心。吸出上清液，并将细胞重悬在预先温热的本发明的培养基中。从细胞悬液中取一份等分试样进行细胞计数。
将细胞以约3.6×103个细胞/cm2的密度转移至组织培养容器中。将容器倾斜数次，以确保细胞悬液均匀分布。在4%至6%CO2的湿润气氛中在36℃至38℃下进行温育。每2天将培养基换为新鲜的预先温热的本发明的培养基。当细胞汇合达到约70%时传代细胞(通常为每3天)。
实施例3.细胞的冻存
将基础培养基与约10%经补充的培养基和10%二甲基亚砜(DMSO)混合以制备冻存溶液。将离心得到的细胞(例如MSC)团块轻轻地重悬在冻存液中至约1.0×106个细胞/mL，然后转移至冻存小瓶中。将冻存小瓶放置在冷冻容器(例如Nalgene,5100CryoFreezing Container，产品号5100-0001)中，并置于-70℃的冷冻箱中过夜。将冻存小瓶转移至液氮中以进行长期保存。
实施例4.细胞的软骨发生
可以对在本发明的无血清培养基中扩增的细胞(例如MSC或hMSC)的分化潜能进行体外测试。在所述实验条件下可以将扩增的细胞诱导形成软骨细胞。
可以将扩增的MSC转移至不依赖于贴壁的条件中，并作为团块培养物在本发明的无血清基础培养基中保持约1周至约4周，除此之外可利用此前Johnstone等，Exp.Cell Res.238,265-272(1998)所述的方法，从而对在本发明的无血清培养基中扩增的MSC的软骨发生进行诱导。
结果表明，在本发明的无血清基础培养基的实施方式中扩增的MSC形成了软骨结构，其在阿辛蓝和II型胶原染色中呈阳性，并且在I型胶原染色中通常为阴性。如上所述，通过在本发明的基础培养基中添加TGFB1和WNT途径抑制剂、或利用经补充的培养基，可以增强软骨发生程度。
结果表明，本发明的基础培养基、进一步含有TGFB1和WNT途径抑制剂的本发明的基础培养基、或经补充的培养基的某些实施方式可以诱导软骨发生，且其程度、速率或效率与含有FBS的常规培养基相比相同或更高。
实施例5.间充质干细胞的骨发生
可以对在本发明的培养基中扩增的细胞(例如MSC或hMSC)的分化潜能进行体外测试。在所述实验条件下可以将扩增的细胞诱导形成骨细胞。
结果表明，在本发明的基础培养基中扩增的细胞(例如MSC)形成了骨结构，其在茜素红S染色中能够呈阳性。如上所述，通过在本发明的基础培养基的实施方式中添加BMP2和WNT途径激活剂、或利用经补充的培养基，可以增强骨发生的程度。
结果可表明，利用本发明的基础培养基、基础培养基或经补充的培养基的方法可以诱导骨发生，且其程度、速率或效率与含有FBS的常规培养基相比相同或更高。
实施例6.结果
现在主要参看图1，图1提供了对在含10%FBS的常规培养基中生长的hMSC细胞培养物和在本发明的无血清培养基(在图中亦称为“MesenGro”)中生长的hMSC细胞培养物(各自为40%汇合和80%汇合)进行比较的图片。图片的比较表明，本发明的无血清培养基中的hMSC培养物未表现出与含10%FBS的常规培养基中的hMSC培养物有实质区别。本发明的无血清培养基具有不必利用FBS的优势，而FBS可能在组成上有很大程度的差异，并且不能追溯至供体动物，并可能抑制或阻止MSC或hMSC的分化。本发明的无血清的培养基可提供以下进一步描述的其它益处。
现在主要参看图2，其是细胞数量对时间(以天数计)的作图，其对含10%FBS的常规培养基中的hMSC的细胞生长和本发明的无血清培养基(“MesenGro”)中的细胞生长进行了比较。在各时间点对每个孔(24孔板)中的细胞数进行计数，并且每2天对培养基进行更换。令人惊讶的是，该图表明hMSC在本发明的无血清培养基中的细胞生长速率可大于含10%FBS的常规培养基。在某些用途中，这提供了可以在更早的时间点进行传代的益处，或提供了以更少量的时间获得所需细胞数的益处。
现在主要参看图3，其是总hMSC数对传代数的作图，其对含10%FBS的常规培养基中的hMSC的细胞生长与本发明的无血清培养基(称为“MesenGro”)中的细胞生长进行了比较。每次分瓶时(每3天)对每个孔(6孔板)中的总细胞数进行计数。起始传代数是4(从含10%FBS的常规培养基进入本发明的无血清培养基或进入含10%FBS的常规培养基)，且初始细胞密度为约20,000个/孔。该图表明，hMSC在本发明的无血清培养基中与在常规培养基中具有相似的指数扩增。
现在主要参看图4，其提供了对在含10%FBS的常规培养基中培养的hMSC的集落形成能力与在本发明的无血清培养基(称为“MesenGro”)中培养的hMSC的集落形成能力进行比较的图。该图表明，与在含10%FBS的常规培养基中培养的hMSC相比，在本发明的无血清培养基中培养的hMSC的集落形成能力没有实质差别。
现在主要参看图5，其提供了对在本发明的无血清培养基(称为“MesenGro”)中长期培养后的hMSC与在含10%FBS的常规培养基中长期培养后的hMSC的多向分化潜能进行比较的图。在第9次传代时，将细胞平板接种在6孔板中，并在18至24天后将在本发明的无血清培养基中实现的分化与在含10%FBS的常规培养基中实现的分化相比较。结果表明，与在含10%FBS的常规培养基中培养的hMSC相比，在本发明的无血清培养基中培养的hMSC保留了相似的、可能更强的多向分化潜能。
现在主要参看图6，其是细胞数量对传代数的作图。在使用或未使用上述纤连蛋白包被层的BD Primaria Falcon6孔板(BD Cat#353046)上，源自骨髓的hMSC(CellularEngineering Technologies)在本发明的无血清培养基中的生长速率相似。这与需要板包被步骤来实现相似的细胞数量-传代数结果的若干种其它市售的无血清培养基(例如来自Invitrogen的StemPro MSC SFM(PN A10332-01)和来自StemCell Technologies的MesenCult-XF(PN05420))相比具有优势。
现在主要参看图7，其是细胞数量对传代数的作图，其比较了在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的基础培养基的实施方式中培养的源自脐带血的MSC(Cellular Engineering Technologies)的生长速率与在本发明的无血清培养基(称为“MesenGro”)的实施方式中培养的源自脐带血的MSC的生长速率。
源自脐带血的MSC在含10%FBS的培养基中传代培养2至6次。然后将所培养的MSC分为两组，并将这两组各自培养在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的基础培养基中或培养在本发明的无血清培养基(称为“MesenGro”)中。
将这两组在BD Primaria T25瓶中培养，并每3至4天进行传代。每次传代的接种密度为1.25×105个细胞/瓶。源自脐带血的MSC在本发明的无血清培养基(称为“MesenGro”)中的生长速率(以总细胞数计)明显大于在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的基础培养基中的生长速率。
现在主要参看图8，其是细胞数量对传代数的作图，该图比较了在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的基础培养基的实施方式中培养的源自脂肪组织的MSC(Cellular Engineering Technologies)的生长速率与在本发明的无血清培养基(称为“MesenGro”)的实施方式中培养的源自脂肪组织的MSC的生长速率。
源自脂肪组织的MSC在含10%FBS的培养基中传代培养2至6次。然后将所培养的MSC分为两组，并将这两组各自培养在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的基础培养基中或培养在本发明的无血清培养基(称为“MesenGro”)中。
将这两组在BD Primaria T25瓶中培养，并每3天至4天进行传代。每次传代的接种密度为1.25×105个细胞/瓶。源自脂肪组织的MSC在本发明的无血清培养基(称为“MesenGro”)中的生长速率(以总细胞数计)明显大于在补充有10%FBS、L-谷氨酰胺和青霉素-链霉素的基础培养基中的生长速率。
现在主要参看图9，其提供了总细胞数对在培养hMSC时所用的培养瓶的类型的柱状图。按照实施例1的程序使冷冻的源自骨髓的MSC(Cellular EngineeringTechnologies)解冻。随后，将已经在未包被的Primaria T25瓶中在本发明的无血清培养基(“MesenGro”)中传代6次的源自骨髓的MSC以0.09×106/瓶接种在2种不同的瓶中：BD Primaria T25和Corning CellBIND T25。每种不同的瓶均未包被，且细胞均在本发明的无血清培养基(“MesenGro”)中培养。4天后，对各瓶的细胞数量进行计数。在不同种类的未包被的培养瓶之间，MSC的总数没有显著差别。这表明本发明的无血清培养基可用于在多种不同的未包被的培养瓶中培养MSC，其中每种培养瓶根据相应不同的制造商的规格来制造。
在无血清培养基中培养MSC的益处
与在补充有胎牛血清或人自体血清的培养基中或在其它含血清的培养基中培养MSC或hMSC的情况相比，本发明的无血清培养基具有多种益处。
首先，本发明的无血清培养基的实施方式不含牛血清、人血清或其它动物血清。因此，本发明的无血清培养基的实施方式不会含有任何相应的血液传播的病原体，例如，病毒和疯牛病朊病毒、牛海绵状脑病(“BSE”)等。
其次，本发明的无血清培养基的实施方式不会激发抗异型生物质蛋白的抗体的产生，在体内转移有离体扩增的MSC群以治疗软骨和骨疾病的患者中，异型生物质蛋白可激发免疫应答。
第三，本发明的无血清培养基的实施方式在组成上具有明显更少的批间差异，因而可以利用本发明的无血清培养基的更加一致的批间性能。
第四，本发明的无血清培养基的实施方式可以与由多个不同的制造商制造的未包被的培养瓶一起使用。相比之下，其它的市售无血清培养基(例如Invitrogen的StemPro MSC SFM或StemCell Technologies的MesenCult-XF)需要用贴附材料预先包被培养瓶。
第五，如图7和图8以及上述描述所示，与补充有胎牛血清的常规培养基相比，本发明的无血清培养基的实施方式在支持源自各种MSC来源的MSC(例如，源自脐带基质、脐带血、骨髓和脂肪组织的MSC)的扩增方面显示了出乎意料的良好结果。
在无血清培养基的实施方式中培养的MSC的应用
本发明的无血清培养基的实施方式的第一非限制性应用可以是提供一种细胞培养试剂盒，该试剂盒包含可以或已经以各种排列组合方式组合在一起的本发明的无血清培养基的一部分成分或全部成分，以用于制备无血清培养基的多种实施方式，以实现离体扩增细胞、MSC或hMSC群的目的。
另外，鉴于在本发明的无血清培养基的实施方式中以上述预料不到的良好结果实现了一般性的MSC群(特别是hMSC群)的离体扩增且所述群可进一步分化产生软骨细胞或骨细胞，因此显而易见的是，可以使用这种扩增的或分化的MSC群来治疗在可受益于转移一种或多种这扩增的MSC群(无论是否分化)的疾病。作为非限制性实例，可以以上述方式获得利用本发明的无血清培养基离体扩增的间充质干细胞群。可以将治疗有效量的以上述方式扩增的间充质干细胞群施用于个体。
在某些情况下，个体可能患有软骨组织疾病，可以获得源自用本发明的无血清培养基离体扩增的间充质干细胞群的骨细胞群，并可以将治疗有效量的或足量的所述骨细胞群施用至个体，以有益于、辅助重构或重构软骨组织。
在某些情况下，个体可能患有骨疾病，可以获得源自用本发明的无血清培养基离体扩增的间充质干细胞群的软骨细胞群，并可以将治疗有效量的或足量的所述软骨细胞群施用至个体，以有益于、辅助重构或重构骨。
由此容易理解的是，本发明的基本概念可以以多种方式实施。本发明涉及无血清培养基的多种多样的实施方式，包括用于细胞、MSC和hMSC的离体扩增与分化和用于治疗受益于施用MSC群或源自所述MSC的分化群的疾病的最佳模式。
因此，说明书公开的或本申请附图或表格所显示的本发明的特定实施方式或要素不意图具有限制性，而是例示了本发明所广泛涵盖的各种各样的实施方式或按照其任何特定要素而涵盖的等同方式。另外，对本发明的单个实施方式或要素的具体描述可能未明确描述所有可能的实施方式或要素，因为多种替代方式已由说明书和附图隐含公开。
应该理解，装置的各要素或方法的各步骤可通过装置术语或方法术语来描述。在需要时可以替换这些术语，以使得赋予本发明的隐含宽范围变得明确。仅作为一个例子，应该理解的是方法的所有步骤都可以作为行为、采取该行为的手段或引起该行为的要素而公开。相似的是，装置的各要素都可以作为物理要素或该物理要素所推动的行为而公开。仅作为一个例子，对“细胞培养”的公开应理解为包括对“培养细胞”的行为的公开——无论是否进行明确论述——反之，如果实际上公开了“培养细胞”的行为，则这种公开应理解为包括对“细胞培养”的公开，甚至包括对“培养细胞的手段”的公开。各要素或步骤的这种替代性术语应理解为明确地包含在本说明书中。
另外，对于所用的每种术语，应该理解的是除非其在本申请中的用法与所述解释不一致，否则应理解为说明书中包含了各术语的常用工具书定义，如Random HouseWebster’sUnabridged Dictionary第二版中所含的定义，在此通过引用将各定义并入本文。
无论是否明确指出，本文中所有数值均设定为由术语“约”修饰。对于本发明，个范围可以表示为从“约”一个具体值至“约”另一个具体值。当表述了这样的范围时，另一实施方式包括从所述一个具体值至所述另一个具体值。通过端点来描述的数值范围包括了该范围内所含的所有数值。例如，1至5的数值范围包括了数值1、1.5、2、2.75、3、3.80、4和5等。还应该理解的是，每个范围的端点不论相对于另一个端点还是独立于另一个端点都具有显著意义。当利用了在前的“约”来将一个值表示为近似值时，应该理解的是，该特定值构成了另一实施方式。
因此，应当理解申请人要求保护至少：i)本文公开和描述的无血清细胞培养基，ii)公开和描述的相关方法，iii)这些设备和方法中每一种的相似、等同甚至隐含的变形，iv)实现每种所显示、所公开或所描述的功能的替代性实施方式，v)实现隐含表明可实现所公开或所描述的每种功能的替代性设计和方法，vi)作为单独的和独立的发明而示出的每种特征、成分和步骤，vii)由所公开的各种体系或成分增强的用途，viii)由所述体系或成分产生的产物，ix)基本如此前公开的并参考了任何所附实施例的方法和装置，x)公开的各在先要素的各种组合和排列。
本专利申请的背景技术部分声明了本发明所属的专业领域。该部分还可以引入或含有对本发明所涉及的技术水平的相关信息、问题或关系中有用的某些美国专利、专利申请、公开文本或所要求保护的发明的主题的释义。并不意图将本文所引用或并入的任何美国专利、专利申请、公开文本、声明或其他信息理解、解读或视为作为与本发明相关的现有技术而加入。
由此，将本国际PCT专利说明书中所述的权利要求通过引用并入而作为本发明说明书的一部分，并且申请人明确保留使用所述权利要求的这些并入内容的全部或一部分来支持任何一个或全部权利要求或其任何要素或成分的权利，并且申请人还明确保留下述权利：在必要时将所述权利要求的并入内容的任何部分或全部或其任何要素或成分从说明书中移入权利要求中(或反之)，从而限定本申请或其任何后续申请或延续申请、分案申请或部分延续申请所要保护的主题，或者根据任何国家或条约的专利法、法规或细则获得任何权益或费减，或符合所述任何国家或条约的专利法、法规或细则的权利，并且通过引用而并入的这种内容应当在该申请(包括其任何后续申请或延续申请、分案申请或部分延续申请)的整个审查期间或其再公告或续期中有效。
本国际PCT专利申请说明书中所述的权利要求还意图描述本发明的有限数量的优选实施方式的界限，并且不应被解读为本发明的最宽实施方式或本发明的可能要求保护的所有实施方式。申请人不会放弃任何以下权利：根据上述描述另外发展权利要求来作为任何延续申请、分案申请或部分延续申请或相似申请的一部分。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种化学成分确定的无血清细胞培养基，其包含：
a)基础培养基，其中所述基础培养基不含血清；和
b)基础培养基补充剂，其包含：
i)胰岛素；
ii)一种或多种磷脂生长因子；和
iii)一种或多种WNT信号传导途径激活剂。
2.如权利要求1所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基包含一定量的DMEM和一定量的MCDB，其中DMEM与MCDB之比为约0.75:1.25v/v至约1.25:0.75v/v。
3.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述DMEM与MCDB之比选自由下述范围组成的组：约0.75:1.25至约0.85:1.15，约0.80:1.20至约0.90:1.10，约0.85:1.15至约0.95:1.05，约90:110至约1.05:0.95，约1.00:1.00至约1.10:0.90，约1.05:0.95至约1.15:0.85，约1.10:0.90至约1.20:0.80，和约1.15:0.85至约125:0.75。
4.如权利要求1所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含选自由bFGF、PDGF-bb、EGF、TGF-β1和IGF-1组成的组的一种或多种细胞生长因子。
5.如权利要求1所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述胰岛素在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中的浓度为约4mg/L至约6mg/L。
6.如权利要求4所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述bFGF、PDGF-bb、EGF、TGF-β1和IGF-1中的每一种在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中的浓度为约1ng/mL至约20ng/mL。
7.如权利要求6所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述bFGF、PDGF-bb、EGF、TGF-β1和IGF-1中的每一种在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中的浓度选自由下述范围组成的组：约1ng/mL至约4ng/mL，约3ng/mL至约5ng/mL，约4ng/mL至约6ng/mL，约5ng/mL至约7ng/mL，约6ng/mL至约8ng/mL，约7ng/mL至约9ng/mL，约8ng/mL至约10ng/mL，约9ng/mL至约11ng/mL，约10ng/mL至约12ng/mL，约11ng/mL至约13ng/mL，约12ng/mL至约14ng/mL，约13ng/mL至约15ng/mL，约14ng/mL至约16ng/mL，约15ng/mL至约17ng/mL，约16ng/mL至约18ng/mL，约18ng/mL至约20ng/mL，和约19ng/mL至约20ng/mL。
8.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种脂质生长因子选自由LPA和S1P组成的组。
9.如权利要求8所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种脂质生长因子在所述基础培养基中的浓度为约100nM至约200nM。
10.如权利要求9所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种脂质生长因子在所述基础培养基中的浓度选自由下述范围组成的组：约100nM至约120nM，约110nM至约130nM，约120nM至约140nM，约130nM至约150nM，约140nM至约160nM，约150nM至约170nM，约160nM至约180nM，约190nM至约200nM。
11.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂选自由人WNT3A和RSPO1组成的组。
12.如权利要求11所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂在所述基础培养基中的浓度为约20ng/mL至约200ng/mL。
13.如权利要求12所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂包含浓度为约20ng/mL的人WNT3A和浓度为约40ng/mL的RSPO1的组合。
14.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一种或多种类固醇。
15.如权利要求14所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种类固醇选自由地塞米松和氢化可的松组成的组。
16.如权利要求14所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种类固醇包含浓度为约2.0μg/mL至约5.0μg/mL的所述地塞米松和浓度为约0.5mg/mL至约1.5mg/mL的所述氢化可的松的组合。
17.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含调控铁源。
18.如权利要求17所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述调控铁源包含一定量的转铁蛋白，所述转铁蛋白在所述基础培养基中的浓度为约2mg/L至约10mg/L。
19.如权利要求18所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，转铁蛋白的浓度选自由下述范围组成的组：约2mg/L至约4mg/L，约3mg/L至约5mg/L，约4mg/L至约6mg/L，约5mg/L至约7mg/L，约6mg/L至约8mg/L，约7mg/L至约9mg/L，约8mg/L至约10mg/L。
20.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含电子传递激活剂。
21.如权利要求20所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述电子传递激活剂选自由一定量的硒和一定量的亚硒酸组成的组。
22.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一定量的HSA。
23.如权利要求22所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一定量的HSA在所述基础培养基中的浓度为约100μg/mL至约350μg/mL。
24.如权利要求23所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一定量的HSA包含一定量的重组HSA。
25.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一种或多种抗氧化剂。
26.如权利要求25所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述抗氧化剂选自由α-生育酚乙酸酯和抗坏血酸-2-磷酸酯组成的组。
27.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含量为约0.001g/L至约0.003g/L的5-羟色胺。
28.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含缓冲剂。
29.如权利要求25所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述缓冲剂包含量为约3.2g/L至约4.2g/L的碳酸氢钠。
30.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一定量的TGFB1，所述量的TGFB1对于从在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中培养的间充质干细胞获得软骨细胞而言是足够的。
31.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一定量的BMP2，所述量的BMP2对于从在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中培养的间充质干细胞获得软骨细胞而言是足够的。
32.如权利要求1所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基由以下a)至l)组成：
a)量为约0.5L/L的MCDB201；
b)量为约0.5L/L的DMEM；
c)量为约3.7g/L的碳酸氢钠；
d)量为约0.25g/L的重组人血清白蛋白；
e)量为约0.005g/L的转铁蛋白；
f)量为约0.005g/L的胰岛素；
g)量为约0.0000037g/L的亚硒酸；
h)量为约0.032205g/L的抗坏血酸-2-磷酸酯；
i)量为约0.002127g/L的5-羟色胺；
j)量为约0.000003925g/L的地塞米松；
k)量为约0.001g/L的氢化可的松；和
l)量为约0.0002g/L的α-生育酚乙酸酯。
33.如权利要求32所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基补充剂由以下a)至h)组成：
a)量为约10ng/mL的PDGF-bb；
b)量为约10ng/mL的bFGF(155aa)；
c)量为约20ng/mL的EGF；
d)量为约5ng/mL的IGF1；
e)量为约100nM的LPA；
f)量为约150nM的S1P；
g)量为约20ng/mL的WNT3A；和
h)量为约40ng/mL的RSPO1。
34.如权利要求33所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基补充剂还包含一定量的TGFB1。
35.如权利要求33所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基补充剂还包含一定量的BMP2。
36.一种制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供基础培养基，其中所述基础培养基不含血清；和
b)对所述基础培养基进行补充以使其进一步包含：
i)胰岛素；
ii)一种或多种磷脂生长因子；和
iii)一种或多种WNT信号传导途径激活剂。
37.如权利要求36所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中，提供基础培养基的所述步骤包括将一定量的DMEM和一定量的MCDB组合的步骤，其中DMEM与MCDB之比为约0.75:1.25v/v至约1.25:0.75v/v。
38.如权利要求37所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中，对所述基础培养基进行补充的所述步骤包括将以下a)至c)与所述基础培养基混合的步骤：
a)选自由bFGF、PDGF-bb、EGF、TGF-β1和IGF-1组成的组的除胰岛素以外的一种或多种生长因子；
b)选自由LPA和S1P组成的组的一种或多种脂质生长因子；和
c)选自由人WNT3A蛋白和RSPO1组成的组的一种或多种WNT信号传导途径激活剂。
39.如权利要求36所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括向所述基础培养基中混入选自由地塞米松和氢化可的松组成的组的一种或多种类固醇的步骤。
40.如权利要求39所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括向所述基础培养基中混入一定量的转铁蛋白的步骤。
41.如权利要求40所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括向所述基础培养基中混入一定量的亚硒酸的步骤。
42.如权利要求41所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括向所述基础培养基中混入一定量的5-羟色胺的步骤。
43.如权利要求42所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法,所述方法还包括向所述基础培养基中混入一定量的rHSA的步骤。
44.如权利要求43所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括向所述基础培养基中混入一定量的选自由α-生育酚乙酸酯和抗坏血酸-2-磷酸酯组成的组的抗氧化剂的步骤。
45.如权利要求44所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括混入一定量的碳酸氢钠的步骤。
46.如权利要求36所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括对所述基础培养基补充一定量的TGFB1的步骤。
47.如权利要求36所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括对所述基础培养基补充一定量的BMP2的步骤。
48.如权利要求36所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中，所述基础培养基由以下a)至l)组成：
a)量为约0.5L/L的MCDB201；
b)量为约0.5L/L的DMEM；
c)量为约3.7g/L的碳酸氢钠；
d)量为约0.25g/L的重组人血清白蛋白；
e)量为约0.005g/L的转铁蛋白；
f)量为约0.005g/L的胰岛素；
g)量为约0.0000037g/L的亚硒酸；
h)量为约0.032205g/L的抗坏血酸-2-磷酸酯；
i)量为约0.002127g/L的5-羟色胺；
j)量为约0.000003925g/L的地塞米松；
k)量为约0.001g/L的氢化可的松；和
l)量为约0.0002g/L的α-生育酚乙酸酯。
49.如权利要求48所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中所述基础培养基补充剂由以下a)至h)组成：
a)量为约10ng/mL的PDGF-bb；
b)量为约10ng/mL的bFGF155aa；
c)量为约20ng/mL的EGF；
d)量为约5ng/mL的IGF1；
e)量为约100nM的溶血磷脂酸；
f)量为约150nM的鞘氨醇1-磷酸；
g)量为约20ng/mL的WNT-3a；和
h)量为约40ng/mL的RSpondin-1。
50.如权利要求44所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中，所述基础培养基补充剂还包含一定量的TGFB1。
51.如权利要求44所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中，所述基础培养基补充剂还包含一定量的BMP。
52.一种细胞培养方法，其包括利用细胞培养基离体扩增间充质干细胞群的步骤，所述细胞培养基包含：
a)基础培养基，其中所述基础培养基不含血清；和
b)基础培养基补充剂，其包含：
i)一种或多种细胞生长因子；
ii)一种或多种磷脂生长因子；和
iii)一种或多种WNT信号传导途径激活剂。
53.如权利要求52所述的细胞培养方法，其还包括从选自由脐带血、骨髓、脐带基质和脂肪组织组成的组的来源获得所述间充质干细胞群的步骤。
54.如权利要求52所述的细胞培养方法，其还包括获得之前未暴露于血清的间充质干细胞群以进行离体扩增的步骤。
55.如权利要求52所述的细胞培养方法，其还包括通过离体扩增产生之前未暴露于血清的间充质干细胞群的步骤。
56.如权利要求52或55中任一项所述的细胞培养方法，其还包括从所述间充质干细胞群获得软骨细胞群的步骤。
57.如权利要求56所述的细胞培养方法，其还包括用一定量的TGFB1补充所述细胞培养基的步骤，并且其中所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂由人WNT3A组成。
58.如权利要求52或55中任一项所述的细胞培养方法，其还包括从所述间充质干细胞群获得骨细胞群的步骤。
59.如权利要求58所述的细胞培养方法，其还包括用一定量的BMP2补充所述细胞培养基的步骤，并且其中所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂由人WNT-3a蛋白组成。
60.如权利要求52或55中任一项所述的细胞培养方法，其还包括在未经包被的培养瓶中扩增所述间充质干细胞群的步骤。
61.一种治疗方法，其包括以下步骤：
a)获得利用细胞培养基而离体扩增的间充质干细胞群，所述细胞培养基包含：
i)基础培养基，其中所述基础培养基不含血清；和
ii)基础培养基补充剂，其包含：
-一种或多种细胞生长因子；
-一种或多种磷脂生长因子；和
-一种或多种WNT信号传导途径激活剂；
和
b)向个体施用治疗有效量的所述间充质干细胞群。
62.如权利要求61所述的治疗方法，其中，获得间充质干细胞群的所述步骤包括获得源自利用权利要求1所述的细胞培养基离体扩增的间充质干细胞群的软骨细胞群的步骤，并且其中向个体施用治疗有效量的所述间充质干细胞群的所述步骤包括向个体施用治疗有效量的所述软骨细胞群的步骤。
63.如权利要求62所述的治疗方法，其中，所述治疗有效量的所述软骨细胞群包含足以重构骨的量的所述软骨细胞群。
64.如权利要求61所述的治疗方法，其中，获得间充质干细胞群的所述步骤包括获得源自利用权利要求1所述的细胞培养基离体扩增的间充质干细胞群的骨细胞群的步骤，并且其中向个体施用治疗有效量的所述间充质干细胞群的所述步骤包括向个体施用治疗有效量的所述骨细胞群的步骤。
65.如权利要求64所述的治疗方法，其中，所述治疗有效量的所述骨细胞群包含足以重构软骨组织的量的所述骨细胞群。
66.一种用于细胞培养的试剂盒，其包含权利要求1、32、33、34或35中任一项所述的无血清细胞培养基。
67.如权利要求1、32、33、34或35中任一项所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，用于对人间充质干细胞进行无血清细胞培养的方法中。
68.基本如本文中参考任何公开的实施方式所描述的权利要求1的化学成分确定的无血清细胞培养基。
69.如本文中参考附图所示的任何实施方式所描述的化学成分确定的无血清细胞培养基。
70.基本如本文中参考任何公开的实施方式所描述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法。
71.如本文中参考附图所示的任何实施方式所描述的制备的化学成分确定的无血清细胞培养基的方法。
72.基本如本文中参考任何公开的实施方式所描述的权利要求61的治疗方法。
73.本文中所描述的或要求保护的任何发明。

Claims (73)

1.一种化学成分确定的无血清细胞培养基，其包含：
a)基础培养基，其中所述基础培养基不含血清；和
b)基础培养基补充剂，其包含：
i)一种或多种细胞生长因子；
ii)一种或多种磷脂生长因子；和
iii)一种或多种WNT信号传导途径激活剂。
2.如权利要求1所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基包含一定量的DMEM和一定量的MCDB，其中DMEM与MCDB之比为约0.75:1.25v/v至约1.25:0.75v/v。
3.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述DMEM与MCDB之比选自由下述范围组成的组：约0.75:1.25至约0.85:1.15，约0.80:1.20至约0.90:1.10，约0.85:1.15至约0.95:1.05，约90:110至约1.05:0.95，约1.00:1.00至约1.10:0.90，约1.05:0.95至约1.15:0.85，约1.10:0.90至约1.20:0.80，和约1.15:0.85至约125:0.75。
4.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种细胞生长因子选自由胰岛素、bFGF、PDGF-bb、EGF、TGF-β1和IGF-1组成的组。
5.如权利要求4所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述胰岛素在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中的浓度为约4mg/L至约6mg/L。
6.如权利要求5所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述bFGF、PDGF-bb、EGF、TGF-β1和IGF-1中的每一种在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中的浓度为约1ng/mL至约20ng/mL。
7.如权利要求6所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述bFGF、PDGF-bb、EGF、TGF-β1和IGF-1中的每一种在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中的浓度选自由下述范围组成的组：约1ng/mL至约4ng/mL，约3ng/mL至约5ng/mL，约4ng/mL至约6ng/mL，约5ng/mL至约7ng/mL，约6ng/mL至约8ng/mL，约7ng/mL至约9ng/mL，约8ng/mL至约10ng/mL，约9ng/mL至约11ng/mL，约10ng/mL至约12ng/mL，约11ng/mL至约13ng/mL，约12ng/mL至约14ng/mL，约13ng/mL至约15ng/mL，约14ng/mL至约16ng/mL，约15ng/mL至约17ng/mL，约16ng/mL至约18ng/mL，约18ng/mL至约20ng/mL，和约19ng/mL至约20ng/mL。
8.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种脂质生长因子选自由LPA和S1P组成的组。
9.如权利要求8所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种脂质生长因子在所述基础培养基中的浓度为约100nM至约200nM。
10.如权利要求9所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种脂质生长因子在所述基础培养基中的浓度选自由下述范围组成的组：约100nM至约120nM，约110nM至约130nM，约120nM至约140nM，约130nM至约150nM，约140nM至约160nM，约150nM至约170nM，约160nM至约180nM，约190nM至约200nM。
11.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂选自由人WNT3A和RSPO1组成的组。
12.如权利要求11所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂在所述基础培养基中的浓度为约20ng/mL至约200ng/mL。
13.如权利要求12所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂包含浓度为约20ng/mL的人WNT3A和浓度为约40ng/mL的RSPO1的组合。
14.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一种或多种类固醇。
15.如权利要求14所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种类固醇选自由地塞米松和氢化可的松组成的组。
16.如权利要求14所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一种或多种类固醇包含浓度为约2.0μg/mL至约5.0μg/mL的所述地塞米松和浓度为约0.5mg/mL至约1.5mg/mL的所述氢化可的松的组合。
17.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含调控铁源。
18.如权利要求17所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述调控铁源包含一定量的转铁蛋白，所述转铁蛋白在所述基础培养基中的浓度为约2mg/L至约10mg/L。
19.如权利要求18所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，转铁蛋白的浓度选自由下述范围组成的组：约2mg/L至约4mg/L，约3mg/L至约5mg/L，约4mg/L至约6mg/L，约5mg/L至约7mg/L，约6mg/L至约8mg/L，约7mg/L至约9mg/L，约8mg/L至约10mg/L。
20.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含电子传递激活剂。
21.如权利要求20所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述电子传递激活剂选自由一定量的硒和一定量的亚硒酸组成的组。
22.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一定量的HSA。
23.如权利要求22所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一定量的HSA在所述基础培养基中的浓度为约100μg/mL至约350μg/mL。
24.如权利要求23所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述一定量的HSA包含一定量的重组HSA。
25.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一种或多种抗氧化剂。
26.如权利要求25所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述抗氧化剂选自由α-生育酚乙酸酯和抗坏血酸-2-磷酸酯组成的组。
27.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含量为约0.001g/L至约0.003g/L的5-羟色胺。
28.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含缓冲剂。
29.如权利要求25所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述缓冲剂包含量为约3.2g/L至约4.2g/L的碳酸氢钠。
30.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一定量的TGFB1，所述量的TGFB1对于从在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中培养的间充质干细胞获得软骨细胞而言是足够的。
31.如权利要求2所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其还包含一定量的BMP2，所述量的BMP2对于从在所述化学成分确定的无血清细胞培养基中培养的间充质干细胞获得软骨细胞而言是足够的。
32.如权利要求1所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基由以下a)至l)组成：
a)量为约0.5L/L的MCDB201；
b)量为约0.5L/L的DMEM；
c)量为约3.7g/L的碳酸氢钠；
d)量为约0.25g/L的重组人血清白蛋白；
e)量为约0.005g/L的转铁蛋白；
f)量为约0.005g/L的胰岛素；
g)量为约0.0000037g/L的亚硒酸；
h)量为约0.032205g/L的抗坏血酸-2-磷酸酯；
i)量为约0.002127g/L的5-羟色胺；
j)量为约0.000003925g/L的地塞米松；
k)量为约0.001g/L的氢化可的松；和
l)量为约0.0002g/L的α-生育酚乙酸酯。
33.如权利要求32所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基补充剂由以下a)至h)组成：
a)量为约10ng/mL的PDGF-bb；
b)量为约10ng/mL的bFGF(155aa)；
c)量为约20ng/mL的EGF；
d)量为约5ng/mL的IGF1；
e)量为约100nM的LPA；
f)量为约150nM的S1P；
g)量为约20ng/mL的WNT3A；和
h)量为约40ng/mL的RSPO1。
34.如权利要求33所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基补充剂还包含一定量的TGFB1。
35.如权利要求33所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，其中，所述基础培养基补充剂还包含一定量的BMP2。
36.一种制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供基础培养基，其中所述基础培养基不含血清；和
b)对所述基础培养基进行补充以使其进一步包含：
i)一种或多种细胞生长因子；
ii)一种或多种磷脂生长因子；和
iii)一种或多种WNT信号传导途径激活剂。
37.如权利要求36所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中，提供基础培养基的所述步骤包括将一定量的DMEM和一定量的MCDB组合的步骤，其中DMEM与MCDB之比为约0.75:1.25v/v至约1.25:0.75v/v。
38.如权利要求37所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中，对所述基础培养基进行补充的所述步骤包括将以下a)至c)与所述基础培养基混合的步骤：
a)选自由胰岛素、bFGF、PDGF-bb、EGF、TGF-β1和IGF-1组成的组的一种或多种生长因子；
b)选自由LPA和S1P组成的组的一种或多种脂质生长因子；和
c)选自由人WNT3A蛋白和RSPO1组成的组的一种或多种WNT信号传导途径激活剂。
39.如权利要求36所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括向所述基础培养基中混入选自由地塞米松和氢化可的松组成的组的一种或多种类固醇的步骤。
40.如权利要求39所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括向所述基础培养基中混入一定量的转铁蛋白的步骤。
41.如权利要求40所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括向所述基础培养基中混入一定量的亚硒酸的步骤。
42.如权利要求41所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括向所述基础培养基中混入一定量的5-羟色胺的步骤。
43.如权利要求42所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法,所述方法还包括向所述基础培养基中混入一定量的rHSA的步骤。
44.如权利要求43所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括向所述基础培养基中混入一定量的选自由α-生育酚乙酸酯和抗坏血酸-2-磷酸酯组成的组的抗氧化剂的步骤。
45.如权利要求44所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括混入一定量的碳酸氢钠的步骤。
46.如权利要求36所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括对所述基础培养基补充一定量的TGFB1的步骤。
47.如权利要求36所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，所述方法还包括对所述基础培养基补充一定量的BMP2的步骤。
48.如权利要求36所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中，所述基础培养基由以下a)至l)组成：
a)量为约0.5L/L的MCDB201；
b)量为约0.5L/L的DMEM；
c)量为约3.7g/L的碳酸氢钠；
d)量为约0.25g/L的重组人血清白蛋白；
e)量为约0.005g/L的转铁蛋白；
f)量为约0.005g/L的胰岛素；
g)量为约0.0000037g/L的亚硒酸；
h)量为约0.032205g/L的抗坏血酸-2-磷酸酯；
i)量为约0.002127g/L的5-羟色胺；
j)量为约0.000003925g/L的地塞米松；
k)量为约0.001g/L的氢化可的松；和
l)量为约0.0002g/L的α-生育酚乙酸酯。
49.如权利要求48所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中所述基础培养基补充剂由以下a)至h)组成：
a)量为约10ng/mL的PDGF-bb；
b)量为约10ng/mL的bFGF155aa；
c)量为约20ng/mL的EGF；
d)量为约5ng/mL的IGF1；
e)量为约100nM的溶血磷脂酸；
f)量为约150nM的鞘氨醇1-磷酸；
g)量为约20ng/mL的WNT-3a；和
h)量为约40ng/mL的RSpondin-1。
50.如权利要求44所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中，所述基础培养基补充剂还包含一定量的TGFB1。
51.如权利要求44所述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法，其中，所述基础培养基补充剂还包含一定量的BMP。
52.一种细胞培养方法，其包括利用权利要求1所述的细胞培养基离体扩增间充质干细胞群的步骤。
53.如权利要求52所述的细胞培养方法，其还包括从选自由脐带血、骨髓、脐带基质和脂肪组织组成的组的来源获得所述间充质干细胞群的步骤。
54.如权利要求52所述的细胞培养方法，其还包括获得之前未暴露于血清的间充质干细胞群以进行离体扩增的步骤。
55.如权利要求52所述的细胞培养方法，其还包括通过离体扩增产生之前未暴露于血清的间充质干细胞群的步骤。
56.如权利要求52或55中任一项所述的细胞培养方法，其还包括从所述间充质干细胞群获得软骨细胞群的步骤。
57.如权利要求56所述的细胞培养方法，其还包括用一定量的TGFB1补充所述细胞培养基的步骤，并且其中所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂由人WNT3A组成。
58.如权利要求52或55中任一项所述的细胞培养方法，其还包括从所述间充质干细胞群获得骨细胞群的步骤。
59.如权利要求58所述的细胞培养方法，其还包括用一定量的BMP2补充所述细胞培养基的步骤，并且其中所述一种或多种WNT信号传导途径激活剂由人WNT-3a蛋白组成。
60.如权利要求52或55中任一项所述的细胞培养方法，其还包括在未经包被的培养瓶中扩增所述间充质干细胞群的步骤。
61.一种治疗方法，其包括以下步骤：
a)获得利用权利要求1所述的细胞培养基离体扩增的间充质干细胞群；和
b)向个体施用治疗有效量的所述间充质干细胞群。
62.如权利要求61所述的治疗方法，其中，获得间充质干细胞群的所述步骤包括获得源自利用权利要求1所述的细胞培养基离体扩增的间充质干细胞群的软骨细胞群的步骤，并且其中向个体施用治疗有效量的所述间充质干细胞群的所述步骤包括向个体施用治疗有效量的所述软骨细胞群的步骤。
63.如权利要求62所述的治疗方法，其中，所述治疗有效量的所述软骨细胞群包含足以重构骨的量的所述软骨细胞群。
64.如权利要求61所述的治疗方法，其中，获得间充质干细胞群的所述步骤包括获得源自利用权利要求1所述的细胞培养基离体扩增的间充质干细胞群的骨细胞群的步骤，并且其中向个体施用治疗有效量的所述间充质干细胞群的所述步骤包括向个体施用治疗有效量的所述骨细胞群的步骤。
65.如权利要求64所述的治疗方法，其中，所述治疗有效量的所述骨细胞群包含足以重构软骨组织的量的所述骨细胞群。
66.一种用于细胞培养的试剂盒，其包含权利要求1、32、33、34或35中任一项所述的无血清细胞培养基。
67.如权利要求1、32、33、34或35中任一项所述的化学成分确定的无血清细胞培养基，用于对人间充质干细胞进行无血清细胞培养的方法中。
68.基本如本文中参考任何公开的实施方式所描述的权利要求1的化学成分确定的无血清细胞培养基。
69.如本文中参考附图所示的任何实施方式所描述的化学成分确定的无血清细胞培养基。
70.基本如本文中参考任何公开的实施方式所描述的制备化学成分确定的无血清细胞培养基的方法。
71.如本文中参考附图所示的任何实施方式所描述的制备的化学成分确定的无血清细胞培养基的方法。
72.基本如本文中参考任何公开的实施方式所描述的权利要求61的治疗方法。
73.本文中所描述的或要求保护的任何发明。
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