CN107345216A - 一种脂肪干细胞培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脂肪干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，添加剂为溶血磷脂酸(LPA)或1‑磷酸鞘氨醇(S1P)中的一种或两种。本发明针对现有脂肪干细胞体外培养方法中使用的培养基进行优化，与现有产品相比，添加了特殊的LPA及S1P成分。体外实验及体内试验表明，在脂肪干细胞的培养过程中单独或同时添加LPA或S1P均能够提高干细胞抵抗逆境生长压力的能力，同时能够保证脂肪干细胞的持续增值，并维持脂肪干细胞的表型和功能的稳定。本发明在脂肪干细胞体外培养的增值效率、表型稳定性及安全性方面达到了现有培养体系水平，同时由于极大提高了移植后治疗急性肝损伤和酒精肝的效率，使所培养的脂肪干细胞更适用于在多种疾病的干细胞移植临床治疗中使用。

Description

一种脂肪干细胞培养基及其应用

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，更具体地，涉及一种脂肪干细胞培养基及其应用。

背景技术

药物、毒素或酒精引起的急性或慢性肝损伤是世界范围内严重的临床问题，例如，每年约有10%的急性肝炎病例为药物性肝损伤。在美国，据报道有1510万名成年人患有酒精滥用，其中包括980万名男性和530万名女性。据估计每年有88000人死于酒精引起的疾病。这些药物/毒素或酒精引起的肝损伤可能进展为肝功能衰竭，需要及时的肝移植。

由于再生医学的快速发展，干细胞移植成为一种很有前途的治疗药物、毒素、酒精引起的严重肝损害的有效策略，以解决肝移植过程中的诸多问题，如供体器官不足，排斥反应和感染等。现今临床上干细胞移植主要应用于代谢性肝病，也用于急性肝功能衰竭和终末期肝病。

脂肪干细胞是由中胚层发育而来的多能干细胞，能够被诱导分化为多种细胞，包括同样中胚层来源的成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。还可以跨胚层分化为内胚层来源的肝细胞、胰岛β样细胞，外胚层来源的神经细胞、心肌细胞、表皮细胞等。与其他间充质干细胞相比，脂肪干细胞来源丰富，取材简便，是优秀的组织工程与细胞治疗的种子细胞。研究表明脂肪干细胞在肝组织损伤修复过程中能够起到治疗性作用。

然而在临床实践过程中，干细胞移植疗法仍需要克服几个主要问题，如移植治疗所需干细胞数量相对较大，且对干细胞移植后的融合率及细胞功能的保持要求颇高。而移植环境中的炎症和氧化损伤等因素使得移植后脂肪干细胞死亡率高、不容易成活，移植的细胞不能很好地融入宿主组织，或者在成功融合后短时间内消失。研究表明，在干细胞的体外培养及增值过程中如能增强细胞抵抗氧化应激和炎症的能力，则在如急性肝衰竭和心肌梗死等多种疾病模型的移植治疗过程中疗效显著提高。

现有移植治疗用干细胞培养过程中为增强细胞增殖能力，多选择补充不同种类和浓度的生长因子（如HGF、EGF、PDGF、VEGF、TGF-β等）或其他信号通路激活、抑制分子，从而加快脂肪干细胞的增殖及移植后存活能力。而缓解炎症及氧化压力方面则多使用抗氧化剂。然而，这些生长因子或小分子成分的加入，一定程度上将影响移植治疗用干细胞的表型和移植后的稳定性，且未能显著增加移植后的干细胞抗逆境生长环境的能力及移植治疗效果，较难直接应用于临床治疗。因此，如何建立稳定高效的扩增体系，保持干细胞的生理特性和移植后稳定的修复作用是临床用干细胞培养中亟待解决的问题。

发明内容

本发明根据现有技术中的不足，提供了一种脂肪干细胞培养基。

本发明另外提供了上述脂肪干细胞培养基在用于移植治疗急性肝损伤和/或酒精肝的脂肪干细胞培养中的应用。

本发明针对现有脂肪干细胞体外培养方法中使用的培养基进行了优化，添加了特有的LPA及S1P成分，在保证脂肪干细胞体外生长、维持了脂肪干细胞的表型和功能的稳定的同时，显著增加了干细胞体外培养抗逆境的能力，以及移植后治疗急性肝损伤和酒精肝的效率，使所培养的脂肪干细胞更适用于在多种疾病的干细胞移植临床治疗中使用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种脂肪干细胞培养基，包括基础培养基和添加剂，添加剂为溶血磷脂酸或1-磷酸鞘氨醇中的一种或两种。

本发明的发明人通过研究发现：在培养脂肪干细胞时，在培养基内加入溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid，LPA）和1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine 1-phosphate，S1P）两种成分可以显著增加干细胞体外培养抗逆境的能力，以及移植后治疗急性肝损伤和酒精肝的效率，使所培养的脂肪干细胞更适用于在临床中使用。

优选地，添加剂为溶血磷脂酸时，溶血磷脂酸的浓度为1~25μM。

优选地，添加剂为1-磷酸鞘氨醇时，1-磷酸鞘氨醇的浓度为0.05~0.5μM。

优选地，添加剂为溶血磷脂酸和1-磷酸鞘氨醇时，溶血磷脂酸的浓度为1~25μM；1-磷酸鞘氨醇的浓度为0.05~0.5μM。

优选地，溶血磷脂酸的浓度为5μM、1-磷酸鞘氨醇的浓度为0.25μM。

优选地，基础培养基为DMEM、M199、MEM、HBSS、F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153中的一种或多种混合培养基。

优选地，基础培养基中含有5~10%的胎牛血清。

最优选地，基础培养基为DMEM/F12混合培养基。

本发明同时提供脂肪干细胞培养基的制备方法，包括将基础培养基、胎牛血清和添加剂混合，低温下保存。

本发明同时保护所述的脂肪干细胞培养基在用于移植治疗急性肝损伤和/或酒精肝的脂肪干细胞培养中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

本发明针对现有脂肪干细胞体外培养方法中使用的培养基进行了优化，与现有产品相比，添加了特殊的LPA及S1P成分。体外实验及体内试验表明，在脂肪干细胞的培养过程中单独或同时添加LPA或S1P均能够提高干细胞抵抗逆境生长压力的能力，同时能够保证脂肪干细胞的持续增值，并维持脂肪干细胞的表型和功能的稳定。本发明在脂肪干细胞体外培养的增值效率、表型稳定性及安全性方面达到了现有培养体系水平，同时由于极大提高了移植后治疗急性肝损伤和酒精肝的效率，使所培养的脂肪干细胞更适用于在多种疾病的干细胞移植临床治疗中使用。

附图说明

图1 为不同配方和浓度的LPA和/或S1P对脂肪干细胞抵抗LPS及H₂O₂造成细胞损伤的作用。其中A为添加不同浓度LPA或S1P时，在LPS刺激下，对比对照组能够保持更好的细胞活性；B图显示未经添加LPA或S1P的细胞在LPS刺激下有较大比例呈现凋亡状态；C显示添加LPA或S1P能够显著降低LPS导致的Caspase-3/7活性。

图2为不同配方和浓度的LPA和/或S1P对脂肪干细胞抵抗酒精造成细胞损伤的作用。其中A为添加LPA或S1P时，在酒精刺激下，对比对照组能够保持更好的细胞活性；B显示添加LPA或S1P能够显著降低酒精导致的Caspase-3/7活性；C图显示未经添加LPA或S1P的细胞在酒精刺激下有较大比例呈现凋亡状态。

图3为不同配方和浓度的LPA和/或S1P对脂肪干细胞抵抗LPS及H₂O₂造成氧化压力和炎症反应的作用。其中A为在添加LPA或S1P的条件下，使用LPS刺激后，细胞经DMPO染色结果；B图显示细胞经LPS刺激时，添加LPA或S1P可以显示提高GSH/GSSG比例；C说明在细胞经LPS刺激时，添加LPA或S1P可以显著增加抗氧化酶CAT及SOD的表达；D及E显示在细胞经LPS刺激后，添加LPA及S1P可以显著降低炎性因子TNF-a和IL-6的表达。

图4为不同配方和浓度的LPA和/或S1P对脂肪干细胞抵抗酒精造成氧化压力和炎症反应的作用。其中A为在添加LPA或S1P的条件下，使用酒精刺激后，可降低DMPO对细胞的染色；B图显示细胞经酒精刺激时，添加LPA或S1P可以显示提高GSH/GSSG比例；C及D说明在细胞经LPS刺激时，添加LPA或S1P可以显著降低炎性因子TNF-a和IL-6的表达。

图5为不同配方和浓度的LPA和/或S1P对小鼠急性肝衰竭脂肪干细胞移植治疗的作用。其中A为移植后小鼠HE染色结果；B显示使用LPA及S1P培养的干细胞移植小鼠肝纤维化程度显著降低；C表明显示使用LPA及S1P培养的干细胞在受体小鼠体内归巢能力较强；D-I为各项肝功能评价指标，LPA或S1P的使用，能使干细胞移植后ALT、AST、MDA、TNF-a、Caspase-3/7等指标显著下降，并提高OSM的表达。

图6为不同配方和浓度的LPA和/或S1P对小鼠酒精肝脂肪干细胞移植治疗的作用。其中A为移植后小鼠HE染色结果；B显示使用LPA及S1P培养的干细胞移植小鼠肝NAFLD活动度积分显著降低；C表明显示使用LPA及S1P培养的干细胞在受体小鼠体内归巢能力较强；D-L为各项肝功能评价指标，LPA或S1P的使用，能使干细胞移植后ALT、AST、MDA、TNF-a、Caspase-3/7等指标显著下降，并升高OSM的表达，降低SREBP-1c及TGF-b1表达，提高ALDH2活性。M显示使用LPA或S1P后，CYP2E1表达量降低。

图7为不同配方和浓度的LPA和/或S1P对脂肪干细胞分化特性的影响。其中A显示在添加LPA或S1P时，与对照组相比，干细胞的成骨性与成脂性均为受任何影响；B显示在添加LPA或S1P后，PPAR、LEP、FABP4、RUNX2、OCN及ALP的表达均未受影响。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图进一步说明本发明，其实施例在附图中图示并在后面加以说明，给出了部分详细的实施方式和具体的操作过程。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1：

本发明的LPA/S1P培养基可以采用干粉或液态DMEM、M199、MEM、HBSS、F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153或其混合培养基进行配制。

以DMEM/F12混合培养基为例，标准体积1000ml的脂肪干细胞体外培养完全培养基的配制方法：

（1）将10g DMEM/F12干粉溶解于800ml超纯水中，添加100ml FBS，随后添加1~25μM LPA及0.05~0.5μM S1P中的任一种或两种，充分溶解后使用超纯水定容至1000ml，采用0.22-0.1μm滤膜过滤，充分混合溶解后4℃保存备用。

（2）将1000ml的液体DMEM/F12培养基，添加10%FBS，随后添加1~25μM LPA及0.05~0.5μM S1P中的任一种或两种，充分混合溶解后4℃保存备用。

实施例2 本发明的最优化LPA/S1P体外培养完全培养基的配制

本发明的LPA/S1P培养基可以采用干粉或液态DMEM、M199、MEM、HBSS、F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153或其混合培养基进行配制。

以DMEM/F12混合培养基为例，标准体积1000ml的脂肪干细胞体外培养完全培养基的配制方法：

（1）将10g DMEM/F12干粉溶解于800ml超纯水中，并依此添加100ml FBS、5μM LPA及0.25μM S1P，充分溶解后使用超纯水定容至1000ml，采用0.22-0.1μm滤膜过滤，充分混合溶解后4℃保存备用。

（2）将1000ml的液体DMEM/F12培养基，依次添加10%FBS、5μM LPA及0.25μM S1P，充分混合溶解后4℃保存备用。

实施例3 利用本发明的LPA/S1P培养基进行脂肪干细胞抗细胞损伤实验

采用使用实施例1（2）和实施例2（2）配制的LPA/S1P脂肪干细胞培养基，在体外培养脂肪干细胞并分别进行体外抗细胞损伤性生长实验。

实验分别选择0.1μg/ml LPS和200μM H₂O₂，及400mM纯酒精处理，处理时间均为24小时。实验通过细胞计数、流式细胞术检测细胞凋亡以及ELISA试剂盒检测细胞caspase-3/7活性变化等三种方法分别检测单独使用LPA、S1P及同时使用LPA和S1P，在推荐浓度内脂肪干细胞对LPS、H₂O₂及乙醇造成细胞损伤的抵抗能力的变化。如图1和图2所示，在推荐浓度内无论单独添加LPA或S1P都可增强脂肪干细胞抵抗细胞损伤的能力，同时添加5μM LPA及0.25μM S1P时作用最强。

具体地，图1A是不同处理后干细胞活性的变化，均以未受到任何处理的对照组为100%。最左边的图是不同浓度LPA（0~25）在没有LPS/H₂O₂损伤的情况下的实验，显示不会对细胞造成活性上的影响。而当有LPS/H₂O₂杀伤细胞了以后，LPS可以剂量依赖地恢复细胞的活性，其中，5μM视为最好的处理浓度。同理，中间的图也发现S1P有着类似的效果，且0.25μM的浓度较好。最右边的图是说当LPA和S1P协同处理后，细胞活性恢复的效果要好于LPA或S1P单独处理的效果，且对于正常细胞没有影响。

图1B是流式细胞仪分析干细胞凋亡的结果，右上角的百分比是坏死细胞，右下角的百分比是凋亡细胞。这个结果说明LPS/H₂O₂处理造成了干细胞严重死亡，LPA和/或S1P可以有效抑制细胞死亡。且LPS+S1P协同处理的效果最好。

图1C是干细胞caspase-3/7活性的变化结果。Caspase-3/7是细胞凋亡的直接标志物，它的变化与细胞凋亡呈正相关关系。该结果进一步说明LPS/ H₂O₂处理造成了干细胞的严重凋亡，LPA和/或S1P可以有效抑制细胞凋亡。且LPS+S1P协同处理的效果最好。

与图1类似，图2中干细胞的损伤是由酒精所引起的。图2A中直接用最优浓度的LPA和S1P来处理，发现LPA和S1P能够有效恢复由于酒精造成的细胞活性的损伤，且协同使用的时候效果最好。图2B是caspase-3/7活性的结果，图2C是流式细胞仪的结果。

实施例4 利用本发明的LPA/S1P培养基进行脂肪干细胞抗氧化压力和炎症反应实验

使用实施例2（2）配制的LPA/S1P脂肪干细胞培养基，在体外培养脂肪干细胞并分别进行体外抗氧化压力和炎症反应实验。

实验分别选择0.1μg/ml LPS和200μM H₂O₂，及400mM纯酒精处理，处理时间均为24小时。实验通过DMPO染色、GSH/GSSG比例检测、抗氧化酶CAT及SOD检测、分泌型TNF及IL-6的ELISA检测等四种方法，评价在使用LPA/S1P培养基后，脂肪干细胞对LPS、H₂O₂及乙醇造成氧化压力和炎症反应的抵抗能力的变化。如图3和图4所示，在最优化浓度下无论单独添加LPA或S1P都可增强脂肪干细胞抵抗氧化压力和炎症反应的能力，同时添加时作用最强。

具体地，图3A是DMPO荧光染色的结果。DMPO是一种自由基染料，能够显示细胞中自由基的分布。绿色是DMPO的染色。蓝色是细胞核。右边的柱状图是左边图像的定量数据（DMPO绿色部分）。图3B是干细胞内GSH/GSSG的比例变化。GSH/GSSG的比例越高，代表细胞内的氧化应激压力越小。图3C是CAT和SOD1两种细胞内重要的抗氧化压力蛋白的变化。这两种蛋白水平越高，代表细胞抗氧化的能力越强。图3D和3E是干细胞在培养时分泌出来的肿瘤坏死因子和白介素-6蛋白水平的变化。这两种促炎症因子的分泌越多，代表细胞内炎症水平越高。

与图3类似，图4为将损伤模型从LPS/H₂O₂换成了酒精。

实施例5 利用本发明的LPA/S1P培养基进行小鼠急性肝衰竭脂肪干细胞移植治疗的实验

使用实施例2（2）配制的LPA/S1P脂肪干细胞培养基，分别在体外培养脂肪干细胞，随后进行小鼠急性肝衰竭移植治疗。实验使用6周NOD/SCID雄性小鼠，采用腹腔注射法同时注射600mg/kg Gal及8μg/kg LPS的PBS溶液构建小鼠急性肝衰竭模型。6小时后采用尾静脉注射法注射2x10⁶预先培养的脂肪干细胞进行移植治疗。3日后收集小鼠血清及肝脏组织进行：a.肝组织HE染色；b.ALT、AST、MDA、TNF、caspase、OSM mRNA等肝功能及肝再生检测；c.通过人唐氏综合征基因检测结果评估脂肪干细胞在小鼠肝内的归巢效率。如图5所示，在最优化浓度下无论单独添加LPA或S1P都可增强脂肪干细胞移植后治疗小鼠急性肝衰竭的能力，同时添加时作用最强。

具体地，图5是利用Gal/LPS诱导小鼠造成急性肝衰竭之后再移植干细胞治疗的结果。主要说明干细胞治疗能够有效改善急性肝衰竭。而LPA或者S1P预处理过的干细胞治疗的效果更好。图5A是小鼠肝脏HE染色的结果，明显看到没有干细胞移植的急性肝衰竭小鼠肝内有大量的炎症细胞和坏死细胞。干细胞移植后的肝脏要好很多，而LPA或者S1P预处理后的干细胞治疗能力更强。图5B是对图A中肝脏细胞坏死区域的定量结果。图5C是小鼠肝脏中人类唐氏综合症序列信号的定量结果，用来反应究竟有多少人类的干细胞整合到了小鼠的肝脏里面。图5D-5E是小鼠血清中ALT和AST的定量结果。这两种转氨酶是最常用的衡量肝损伤的标志物。图5F是小鼠肝脏内MDA的水平。MDA是最常用的衡量肝脏内氧化应激压力的标志物。图5G是小鼠肝内TNF的含量。图5H是小鼠肝内caspase-3/7活性的变化。图5I是小鼠肝内OSM（oncostatin M）基因的水平变化。这个基因水平越高，代表肝脏自我再生的能力越强。

实施例6 利用本发明的LPA/S1P培养基进行小鼠酒精肝脂肪干细胞移植治疗的实验

使用实施例2（2）配制的最优化LPA/S1P脂肪干细胞培养基，分别在体外培养脂肪干细胞，随后进行小鼠酒精肝移植治疗。实验使用NOD/SCID雄性小鼠，连续10天喂食5%的Lieber-DeCarli酒精餐食，并在正常进食后饮用5g/kg酒精，构建NIAAA小鼠酒精肝模型。小鼠发生酒精性肝损伤后3日及9日采用尾静脉注射法分别注射2x10⁶预先培养的脂肪干细胞进行移植治疗。小鼠饮用酒精9小时后收集小鼠血清及肝脏组织进行：a.肝组织HE染色；b.NAS、ALT、AST、MDA、TNF、caspase、OSM mRNA、SREBP-1c、TGF-b1、ALDH2及CYP2E1等肝功能指标、酒精肝指标、肝纤维化指标、肝再生指标检测；c.通过人唐氏综合征基因检测结果评估脂肪干细胞在小鼠肝内的归巢效率。如图6所示，在最优化浓度下无论单独添加LPA或S1P都可增强脂肪干细胞移植后治疗小鼠酒精肝的能力，同时添加时作用最强。

与图5类似，图6为将损伤模型换成了NIAAA模型（即美国国立卫生研究院慢性酒精性肝损伤模型）。与图5不同的地方包括图6A中多了天狼星红染色。天狼星红主要染肝脏中纤维化的组织。天狼星红越多，说明肝纤维化越严重。图6B是NAS指标。全名是NAFLDactivity score，是定量脂肪性肝病的一个指标，包括肝内脂滴、炎症和纤维化水平的综合定量。图6J是肝内SREBP-1c蛋白表达水平的变化，这个蛋白越高，说明脂肪合成代谢越活跃，与脂肪肝呈正相关关系。图6K是肝内TGF-b蛋白的变化，这个蛋白越多，说明肝内纤维化的程度越高。图6L是肝内ALDH2（乙醛脱氢酶2）的水平，这个酶是肝内代谢乙醛的主要工具，ALDH2的水平不足会造成乙醛堆积，极大地损伤肝脏。图6M是肝内CYP2E1酶的蛋白水平，这个酶是肝脏内代谢各种毒物最主要的酶。一般认为酒精肝时它的水平会不正常地升高。

实施例7 利用本发明的LPA/S1P培养基进行脂肪干细胞分化特性实验

使用实施例2（2）配制的最优化LPA/S1P脂肪干细胞培养基，在体外培养脂肪干细胞并进行脂肪干细胞分化特性的实验。实验通过分别检测培养后的脂肪干细胞的成脂、成骨及成软骨特性，评估LPA和/或S1P是否影响脂肪干细胞的分化特性。如图7所示，在最优化浓度下无论单独添加LPA或S1P还是同时添加LPA及S1P均不影响脂肪干细胞的分化特性。

Claims (10)

1.一种脂肪干细胞培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，添加剂为溶血磷脂酸或1-磷酸鞘氨醇中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的脂肪干细胞培养基，其特征在于，添加剂为溶血磷脂酸时，溶血磷脂酸的浓度为1~25μM。

3.根据权利要求1所述的脂肪干细胞培养基，其特征在于，添加剂为1-磷酸鞘氨醇时，1-磷酸鞘氨醇的浓度为0.05~0.5μM。

4.根据权利要求1所述的脂肪干细胞培养基，其特征在于，添加剂为溶血磷脂酸和1-磷酸鞘氨醇时，溶血磷脂酸的浓度为1~25μM；1-磷酸鞘氨醇的浓度为0.05~0.5μM。

5.根据权利要求4所述的脂肪干细胞培养基，其特征在于，溶血磷脂酸的浓度为5μM，1-磷酸鞘氨醇的浓度为0.25μM。

6.根据权利要求1所述的脂肪干细胞培养基，其特征在于，基础培养基为DMEM、M199、MEM、HBSS、F12、BME、RPMI1640、MCDB104、MCDB153中的一种或多种混合培养基。

7.根据权利要求1所述的脂肪干细胞培养基，其特征在于，基础培养基中含有5~10%的胎牛血清。

8.根据权利要求1至7任一所述的脂肪干细胞培养基，其特征在于，基础培养基为DMEM/F12混合培养基。

9.一种权利要求7所述的脂肪干细胞培养基的制备方法，其特征在于，将基础培养基、胎牛血清和添加剂混合，低温下保存。

10.权利要求1至8中任一所述的脂肪干细胞培养基在用于移植治疗急性肝损伤和/或酒精肝的脂肪干细胞培养中的应用。