CN108779440A - 改进的成体肝脏祖细胞制备物 - Google Patents

Abstract

已经从不同的人供体制造了成体肝脏祖细胞(称为HHALPC)的制备物，并通过使用允许鉴定HHALPC制备物和/或用于其制备方法的细胞表面标志物进行了表征，所述制备物和/或方法最适合用于细胞治疗，特别是用于治疗肝病或遗传性凝血障碍。

Description

改进的成体肝脏祖细胞制备物

技术领域

本发明涉及使用原代肝脏细胞产生的成体肝脏祖细胞以及其用于肝病、遗传性凝血障碍(inherited blood coagulation disorder)的医疗管理或用于筛选具有医学目的的化合物的用途。

背景技术

肝是调节机体稳态的关键器官，并且是许多重要代谢途径的场所。复杂代谢途径中仅一种蛋白质的损害便可能是非常有害的。重要肝酶的大量存在显著提高了多种肝病的风险发生。目前的治疗和长期管理不够有效。原位肝移植(Orthotopic livertransplantation，OLT)是高侵入性的、不可逆的，受到供体移植物短缺的限制并且需要最先进的手术(state-of-art surgery)。由于肝细胞制备物的质量，肝脏细胞移植(Livercell transplantation，LCT)仅可能发挥短期至中期效力。在对低温保存的耐受性、永久植入、肝再生和输注细胞的高功能性方面的进一步改善将是重大突破(Christ B等，2015；Berardis S等，2015；Forbes S等，2015；Ibars E等，2016)。

这种改善可以通过使用干细胞或祖细胞，特别是肝脏祖细胞来实现，在文献中已经使用来自不同生物体的肝组织以及在胎儿或成体肝组织中鉴定了肝脏祖细胞(Schmelzer E等，2007；Sahin MB等，2008；Azuma H等，2003；Herrera MB等，2006；Najimi M等，2007；Darwiche H和Petersen BE，2010；Shiojiri N和Nitou M，2012；Tanaka M和MiyajimaA，2012)。这样的细胞在体外暴露于肝原性刺激后和/或在体内施用后可以为细胞提供通常与肝分化相关的形态和功能特征，例如I/II期酶活性。

这些肝脏祖细胞或由它们产生的肝细胞样细胞可用于细胞移植以及用于新药物开发中的药物测试，因为在药物代谢以及体外药理学或毒理学筛选中它们代表了原代人肝细胞的替代物(Dan YY，2012；Hook LA，2012)。然而，目前还不可能确定到目前为止鉴定的哪些肝脏祖细胞是更适合于给定疾病的治疗或用途的那些，这主要是由于用于产生和表征这样的细胞以评估其在体内的潜在治疗效果的方法以及随后的药物用途的可变性。

通常，间充质干细胞(例如具有间充质特征的成体肝脏祖细胞)的活性、扩增、迁移、植入、免疫原性和分化取决于特定的表面蛋白及其免疫学谱(Berardis S等，2014；SanaG等，2014；Najar M等，2013；Raicevic G等，2015)，特别是通过获得由不同供体和/或生产方法所获得的特定细胞亚群。

然而，肝标志物、间充质标志物、四次跨膜蛋白(tetraspanin)、黏附标志物、细胞表面受体和其他类别的标志物的特定组合尚未用于鉴定来自不同人供体的肝脏祖细胞(或肝来源的间充质基质细胞)，所述肝脏祖细胞(或肝来源的间充质基质细胞)是在用于药物用途的细胞培养物中，即在GMP(良好生产规范)条件下生产的肝脏祖细胞。事实上，工业制造用于临床用途的肝脏祖细胞需要确定另外的可靠的标准，以允许在用于选择供体、细胞生产和配制、和/或选择的患者的整个过程表征其质量，由此使其具有有效的药物制备物和用途。

发明内容

本发明是基于以下观察结果：特定细胞培养条件允许获得来自不同人供体的、具有特定标志物谱的、和改善的生物特征的新成体肝脏祖细胞群。这样的细胞群可用于在GMP条件下生产基于细胞的药物组合物(或来自相应细胞培养物的条件化培养基)，其可用于组合物内，例如药物组合物，特别是用于治疗肝病、遗传性凝血障碍和其他人疾病。

这些细胞制备物代表具有标志物谱(特别是细胞表面蛋白的表达和暴露)的细胞群，所述标志物谱将其表征为与先前描述的在非GMP条件下以从人供体分离的或其他方式从人供体产生的成体肝脏祖细胞群中鉴定的那些(例如在文献中鉴定的成体肝脏祖细胞，例如ADHLSC细胞)不同(Najimi M等，2007；Khuu DN等，2011；Scheers I等，2012；BerardisS等，2014；Maerckx C等，2014)。这些另外的表面标志物可以为用于制备药物制备物的相关标准提供改善的生存力、增殖、储存和/或功能特征，特别是当它们的确定与生物活性的评估相结合时，包括与特定药物组合物和这些细胞的用途相关的那些。

此外，这些细胞表面标志物中的一些可以为表征旨在用于在GMP条件下制备期望的细胞群(制造之前或制造期间)的供体的肝细胞、或选择可以用这样的细胞制备物治疗的患者提供相关标准。

本发明的一个主要实施方案包括成体肝脏祖细胞(称为HHALPC)，其可以通过GMP要求下的药物制造方法作为细胞群以及细胞制备物和包含其的药物组合物来提供。这些细胞和细胞群呈现可在其表面上鉴定的蛋白质标志物的组合，特别地所述细胞对以下测量为阳性：

(a)间充质或多能标志物CD13、CD73、CD90和CD105；

(b)黏附标志物CD29、CD44、CD47、CD49b、CD49c、CD49e和CD147；

(c)四次跨膜蛋白CD9、CD63、CD81和CD151；以及

(d)CD98、CD140b和β2-微球蛋白。

这些细胞群可以通过对以下测量为阳性来进一步限定：

(a)选自黏附标志物CD54、CD164、CD165和CD166的至少一种标志物；和/或

(b)选自CD46、CD55、CD59和CD95的至少一种标志物。

该细胞和相关细胞群可以通过一系列可以是阳性或阴性的细胞标志物在供体上和/或制造过程中进行表征。例如，细胞对选自以下的至少一种标志物测量为阳性：CD26、CD49a、CD49d、CD58、CD61、CD71、CD142、CD146、CD201、CD340和HLA-A/-B/-C。

或者，细胞对选自以下的至少一种标志物测量为阴性：

(a)CD26、CD49a、CD49d、CD58、CD61、CD71、CD142、CD146、CD201、CD340和HLA-A/-B/-C；和/或

(b)CD45、CD117、CD34和HLA-DR中的一种或更多种。

然后HHALPC可以进一步测量为对被确定为在细胞表面上、在细胞内分泌或以其他方式由HHALPC表达的一系列其他标志物和活性为阳性，包括：

(a)对选自白蛋白、HNF-4和CYP3A4的至少一种肝标志物为阳性；

(b)对选自波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，ASMA)的至少一种间充质标志物为阳性；

(c)对细胞角蛋白-19(CK-19)为阴性。

可以以上述实施方案的任何功能和技术组合针对阳性和阴性标志物表征HHALPC，例如细胞和细胞群，其：

(a)对CD13、CD73、CD90、CD105、CD29、CD44、CD47、CD49b、CD49c、CD49e、CD147、CD9、CD63、CD81、CD151、CD98、CD140b、β2-微球蛋白、CD54、CD164、CD165、CD166、CD46、CD55、CD59、CD95、白蛋白和波形蛋白为阳性；以及

(b)对CD45、CD117、CD34和HLA-DR以及细胞角蛋白-19为阴性。

细胞和细胞群包括在体外分化之前和/或之后(以及在动物模型和/或人对象中施用后)呈现细胞类型特异性特征，特别是肝脏细胞(优选肝细胞)的功能和表达特征的细胞。这样的肝特异性活性包括与以下有关的生物活性：人CYP450酶、解毒作用、胆红素缀合、α-1-抗胰蛋白酶分泌、白蛋白分泌、凝血因子分泌、胆汁产生、血小板生成素产生、血管紧张素原产生、氨转化为尿素、胆固醇合成、糖原分解、糖原生成和/或脂肪生成。

HHALPC可以作为包含呈现上述所列大部分(例如，至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少99％)的生物活性、标志物和/或功能特征的细胞的分离细胞群提供。在一个优选的实施方案中，HHALPC子代是这样的细胞群，其包含至少60％、或60％至99％、或70％至90％的对如上所示的标志物测量为阳性以及任选地为阴性并且可能与HHALPC制造和/或使用相关的特征有关的细胞。

任一上述实施方案中的HHALPC可用于提供另外的分离的细胞群，其以HHALPC子代的名称共同分组，包含通过在GMP细胞培养条件下将它们传代而获得的如上定义的HHALPC。特别地，HHALPC子代由根据所期望用途所要求的HHALPC在细胞培养条件下(或在人中或在动物模型中植入后)的维持、增殖和/或分化得到。HHALPC子代可以作为贴壁细胞提供或形成三维细胞簇(在悬液中，在支架内，或包含在可允许提供呈现改善的储存、配制和/或活性的细胞的其他结构中)，其在培养物中的传代不超过2次、不超过3次、不超过4次、或不超过5次。此外，这样的细胞群可以在体外和/或体内进一步分化成呈现肝特异性生物活性的细胞。

HHALPC和HHALPC子代还可以通过一种或更多种化学试剂、细胞培养基、生长因子和/或核酸载体进行修饰以用于需要适当添加或消除这样的细胞的任何性质之任何体内或体外用途。

用于获得HHALPC和HHALPC子代的方法是在GMP条件下(即具有用于人中细胞治疗所需的设备、细胞培养容器和生物材料)、使用人来源的原代肝脏细胞(新鲜或冷冻保存)来建立的。用于制备HHALPC的方法的开发包括对于如上限定的标志物的特定组合测量为阳性(和任选地，也可为阴性)。然后，根据HHALPC和HHALPC子代所期望的用途，使用市售的低黏附容器(以板或U形孔的形式)、在细胞培养物堆(cell culture stack)中、在微载体或生物反应器中可以将通过该方法获得或可获得的细胞维持在允许其增殖为贴壁细胞的细胞培养条件、细胞悬液中，或者通过应用用于维持它们的特定条件增殖为肝细胞样或肝活性细胞，并且根据如上限定的其功能和/或抗原特征进行表征。

在产生HHALPC或HHALPC子代时获得的生物材料可以进一步用于鉴定可能具有特定用途(特别是用于治疗可能受益于人组织中HHALPC植入的病症的不同医学应用)的生物实体。这些生物材料不仅包括通常的HHALPC，而且还包括呈现特定特征(例如基于蛋白质或核酸的标志物、生物活性和/或形态)的亚群、细胞系及其部分，而且还包括在产生HHALPC或HHALPC子代时获得任何其他实体。本发明的生物材料包括，例如，可含有蛋白质、代谢物、膜囊泡、抗原和/或核酸以及与表征细胞本身的其他特征(例如细胞表面抗原或酶活性)一起或不一起存在的条件化细胞培养基(例如，以细胞培养上清液的形式)和这些培养基的部分，其可以被鉴定并用作检测具有医学目的的细胞的标志物或作为呈现具有医学目的(特别是用于肝病)的活性或分布的化合物或生物产品。

HHALPC、HHALPC子代、在产生HHALPC或HHALPC子代时获得的生物材料，以及包含这样的细胞或生物材料的组合物(统称为“HHALPC产品”)可用于体内或体外的许多方法和用途。优选地，可以根据WO2007071339和关于ADHLSC细胞、通常关于成体肝脏祖细胞/干细胞的文献，或在实施例中的公开内容使用HHALPC。

HHALPC产品可用于治疗疾病(例如肝病)以及用于建立方法和生物测定，所述方法和生物测定需要细胞呈现这样的生物特征(例如代谢或酶活性或抗原谱)，一旦它们在体内或体外分化，则所述生物特征在所期望的时间段内与那些对于原代肝脏细胞观察到的生物特征尽可能原代肝脏细胞相似。优选的HHALPC产品是HHALPC子代、在产生HHALPC子代时获得的生物材料、以及包含HHALPC子代或这样的生物材料的组合物。更优选地，HHALPC产品是配制成用于医学用途(即作为用于肝内、脾内、静脉内或关节内施用的细胞治疗产品)的HHALPC子代或包含HHALPC子代的组合物。

特别地，HHALPC产品可用于体内施用(在人或在动物中，例如在动物模型中)，例如以包含这样的细胞的药物组合物的形式，以用于治疗遗传性凝血障碍或肝病(例如肝脏代谢的先天性障碍、1/2/3型进行性家族性肝内胆汁淤积症、α1-抗胰蛋白酶缺陷、肝细胞转运体缺陷、卟啉症、脂肪肝或其他纤维化肝病、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、肝脏退行性疾病、非酒精性脂肪性肝炎、肝纤维化和慢加急性肝衰竭)。HHALPC产品可以以包含其的药物组合物的形式提供以用于治疗人疾病，特别是这样的疾病：其针对与肝脏细胞分泌的蛋白质相关的功能，在肝脏内或其他组织中需要酶作用、免疫调节作用或其他作用以及对肝脏或其他组织和器官(例如血液、关节、骨髓、脾脏或肠道)有影响。

这些药物组合物可以作为与适合于所期望的治疗、施用、使用和/或储存方法的支持物(例如基质、胶囊、支架或装置)和/或溶液(例如细胞培养基或缓冲液)组合的HHALPC产品，并且以用于提供这样的药物组合物的优选方式(例如，在试剂盒内)提供。还可以将可能提供任何另外作用的生物(例如，抗体或生长因子)或化学来源(例如药物、保存化合物或标记化合物)的其他试剂组合在这样的组合物中。

用于预防和/或治疗疾病的方法包括向有此需要的对象施用HHALPC产品，例如HHALPC或给定的HHALPC子代，并且优选在组合物内。特别地，在有此需要的患者中治疗疾病(例如肝病)的方法包括向患者施用有效量的HHALPC产品。

HHALPC产品的施用或治疗用途可包括施用或使用另一种产品(其可以是例如药物、治疗剂、另一种细胞类型或其他生物材料)。HHALPC产品可以用于(或应用于)如本文所述的治疗方法中，其中还向患者施用这样的另一种产品作为该方法的一部分。另一种产品可以与HHALPC产品组合施用，例如作为相同组合物的一部分，或者以同时或依次的方式(以及以任何顺序)分开施用。另一种产品可具有与HHALPC产品(例如HHALPC子代或从HHALPC子代获得的条件化细胞培养基)的作用(特别是与治疗效果)相容、附加或甚至协同的作用。

HHALPC产品还可用于体外研究，特别是用于评估一种或更多种外源组分例如生物制品(如蛋白质、核酸、脂质或糖)或化学化合物(有机的或无机的，包括盐或金属)的效力、代谢、稳定性和/或毒性的药理学研究。这种方法还可用于研究其他细胞(例如细菌或其他细胞，优选人来源的细胞)对HHALPC产品的作用，以及评估可以在以后进行纯化或以其他方式检测的肝特异性病毒(例如肝炎病毒)或寄生虫(像与疟疾和抗疟疾药物的研究有关那些疟原虫物种)的感染和/或复制。

因此，本发明还提供了用于在体外或体内评估一种或更多种外源组分(即有机或无机化合物)的效力、代谢、稳定性和/或毒性的方法，所述方法包括：

(a)提供HHALPC产品；

(b)将所述HHALPC产品暴露于一种或更多种化合物(选自化学化合物、蛋白质、核酸、脂质、糖、金属、盐、病毒、细菌和细胞)；以及

(c)在暴露于所述HHALPC产品后，检测所述一种或更多种化合物对所述HHALPC产品的作用和/或检测所述一种或更多种化合物的存在、定位或修饰。

在一些实施方案中，该一般性方法可以包括应用于特定用途和/或技术的另外的步骤和特征。例如，如上限定的步骤(c)可以包括检测对细胞形态、对细胞生存力、对肝特异性或非特异性蛋白的上调或下调、和/或对HHALPC产品中的蛋白质的降解、聚集、分泌、内化、活化或抑制的作用。此外，如上定义的步骤(c)可以包括检测这样一种或更多种化合物向HHALPC产品中的内化或与HHALPC产品的物理结合。在步骤(a)中还可以向动物(例如非人动物)提供HHALPC产品，然后，在步骤(b)中向所述动物施用一种或更多种化合物。最后，步骤(c)包括在动物中在暴露于所述HHALPC产品后，检测所述一种或更多种化合物对所述HHALPC产品或对所述动物的作用，和/或检测所述一种或更多种化合物的存在、定位或修饰。

使用HHALPC产品的方法还可以包括将步骤(b)中的细胞群、组合物或生物材料同时或以任何顺序依次暴露于(i)对细胞形态、细胞生存力、肝特异性或非特异性蛋白质的上调或下调，和/或降解、聚集、活化或抑制HHALPC产品中的蛋白质具有作用的一种或更多种化合物；以及(ii)旨在阻止或避免HHALPC产品中这样的作用的一种或更多种化合物。

在一些实施方案中，该方法旨在使用任何HHALPC产品，特别是HHALPC子代作为肝细胞模型，以用于确定当暴露于作为病原体的化合物时，作为特异性靶向病原体和/或其效果的候选药物的另一化合物是否因为它预防或阻止病原体的任何不良作用(例如病毒感染、细胞凋亡、致癌转化、肝特异性活性的降低等)而具有治疗特性。特别地，上述(i)的作为病原体的化合物包括感染性、致瘤性、细胞毒性或基因毒性试剂，以及上述(ii)的作为特异性靶向病原体和/或其效果的候选药物的另一些化合物包括蛋白质、核酸、细胞、病毒或化合物。

HHALPC产品还可以以试剂盒提供，例如，用于如上所述的应用的用途和方法，包括用于将HHALPC产品转移给临床机构并提供将其向患者施用的方法。该试剂盒可包含HHALPC产品和任选的允许使用和/或检测HHALPC产品及其活性、以及用于使用和/或检测任何相关的另外的化合物的其他要素。该试剂盒可包含一个或更多个含有HHALPC产品(例如HHALPC子代或包含HHALPC子代的组合物)的小瓶以及根据具体用途所选择的一种或更多种以下要素：装置、一次性材料、溶液、化学产品、生物制品和/或使用所述试剂盒的要素的说明书。

发明详述和实施例提供了关于细胞、细胞群、方法以及关于与HHALPC和HHALPC子代相关的本发明另外的实施方案的其他细节。

附图说明

图1：用于在GMP生产期间表征HHALPC的细胞表面蛋白的检测。将细胞表面蛋白例如CD44、VLA-2(包含CD29和CD49b的复合物)、VLA-3(包含CD29和CD49c)以及VLA-5(包含CD29和CD49e的复合物)暴露在HHALPC的表面上(A；在各个图中在0处的峰对应于同种型对照抗体的信号)。另外，在通过流式细胞术进行细胞培养传代期间仅在细胞透化作用后检测到CXCR4(CD184)，这表明其表达但是通过HHALPC快速内化。

图2：在不同的HHALPC治疗的患者(各自用不同的符号识别)的血浆中测量的体内尿素生成(Ureagenesis)，所述患者在输注HHALPC之前(基线)和输注HHALPC之后的2个随后时间点(3个月和6个月)患有不同的尿素循环障碍。

图3：患有A型血友病的患者中HHALPC的检测和治疗活性。在静脉内施用¹¹¹In-DTPA之前标记一部分HHAPLC，并且随后通过单光子发射计算机断层扫描(Single PhotonEmission Computed Tomography，SPECT)成像追踪生物分布。发现静脉内施用的经标记的HHALPC集中在肝和脾中(A)。当比较在输注后24、48、72小时和6天获得的图像时，发现在不同部位的HHALPC相对分布的信号强度在肺中降低并且同时在肝中提高(B)。当分析因子VIII消耗时，患者的因子VIII基线要求约为5000IU/周，并且在输注之前施用2000IU的额外剂量(除了在4次HHALPC注射方案期间的基线)，但是患者对于正常止血所需的因子VIII的量在接下来的15周内显著降低(C)。

图4：HHALPC在患有鸟氨酸转氨甲酰酶(ornithine transcarbamylase，OTC)缺乏且具有迟发性疾病表现(late onset disease presentation)的患者中的治疗活性。细胞治疗在4个输注日施用(inf.01至04；每天一次输注)，跨越8周时间段，在输注日之间间隔2周。在2016年2月至3月期间完成输注期。在该治疗期间，在输注后第1天和第7天对患者进行密切随访以及医疗管理。紧随输注期后，血氨水平在2个月时间段内是稳定的(A)。血液谷氨酰胺水平也在接下来的几个月内正常化(B)。

发明详述

本发明的主要实施方案包括通过生物活性与可在HHALPC和HHALPC子代表面上以及任选地在细胞内鉴定的和/或在细胞培养基中分泌的标志物的新组合表征的HHALPC和HHALPC子代。这些特征以及形态学和功能特征与用于在细胞培养条件下产生HHALPC和HHALPC子代的方法相关联地确定，这定义了表征这样的细胞的阳性(或阴性)标准。特别地，这样的方法包括：

(a)解离(dissociation)成体肝脏或其一部分以形成原代肝脏细胞群；

(b)产生(a)的原代肝脏细胞的制备物；

(c)将包含在(b)的制备物中的细胞培养到支持物上，所述支持物允许细胞向其上黏附和生长并且出现细胞群；

(d)将(c)的细胞至少传代一次；以及

(e)分离在(d)的传代后获得的对于发明内容中指定的标志物为阳性的细胞群。

关于该方法的步骤(a)，解离步骤包括获得成体肝脏或其一部分，所述成体肝脏或其一部分含有与完全分化的肝细胞一起可用于制备HHALPC的一定量的原代细胞。肝脏原代细胞优先从由成体肝脏获得的人肝组织中分离。

术语“肝脏”是指肝脏器官。术语“肝脏的部分”通常是指来源于肝脏器官的任何部分的组织样品，而对其起源的肝脏器官的所述部分或区域的量没有任何限制。优选地，肝脏器官中存在的所有细胞类型也可以展现在所述肝脏的部分中。肝脏的部分的量可以至少部分地相对于用于合理地实施本发明的方法而需要获得足够的原代肝脏细胞遵循实际进行考虑。因此，肝脏的部分可表示肝脏器官的百分比(例如，至少1％、10％、20％、50％、70％、90％或更多，通常为w/w)。在另一些非限制性实例中，肝脏的部分可以按重量来定义(例如至少1g、10g、100g、250g、500g或更多)。例如，肝脏的部分可以是肝叶(例如，右叶或左叶)，或包含在分离肝手术期间或肝活检期间切除的足够数量的细胞的任何部分或组织样品。

术语“成体肝脏”是指出生后对象的肝脏，即出生后的任何时间，优选为足月(fullterm)，以及可以是例如，出生后至少1天、1周、1个月或超过1月龄，或至少1年、5年、10年或更长时间。因此，“成体肝脏”或成熟肝脏可以存在于将另外以“婴儿”、“儿童”、“青少年”或“成人”的常规术语描述的人对象中。肝脏或其部分获自“对象”或“供体”，可互换地指脊椎动物，优选哺乳动物，更优选人。在另一个实施方案中，成体肝脏或其部分可以来自非人动物对象，优选非人哺乳动物对象(例如啮齿动物或猪)。

如根据临床接受的标准，例如“心肺”标准(涉及循环和呼吸功能不可逆转的停止)或“脑死亡”标准(涉及整个脑，包括脑干的所有功能不可逆转地停止)所确定的，供体可以是活着的或死亡的。收获可以包括已知的方法，例如活检、切除术(resection)或截取(excision)。从活的人供体收获肝组织可能需要与维持供体的进一步生命相容。肝脏或其部分可以从供体获得，尤其是具有持续循环(例如跳动的心脏)和持续的呼吸功能(例如呼吸肺或人工通气)的人供体。如按照法律和道德规范所要求的，通常可以从活的人供体中取出仅一部分肝脏(例如，通过活检或切除术)，使得在供体中维持足够水平的正常肝功能。

遵守道德和法律规范，供体可能需要或不需要是脑死亡的(例如，移除整个肝脏或其部分，这会与人供体的进一步存活不相容，在脑死亡的人中可能被允许)。从这些供体收获肝脏或其部分是有利的，因为组织不会遭受通常由缺血(循环停止)引起的显著缺氧(缺乏氧气)。在收获时，组织可能已经停止循环和/或呼吸功能，没有人工通气。虽然来自这些供体的肝脏或其部分可能已经遭受至少一定程度的缺氧，但是来自尸体供体的肝脏可用于在细胞培养条件下获得HHALPC，例如在供体的循环停止约1、3、6、12、24小时或更长时间内。

如上所述收获的组织(来自手术切除术的肝脏样品或肝活检)可以冷却至约室温，或低于室温的温度，但通常避免冷冻组织或其部分，尤其是当这样的冷冻会导致成核或冰晶生长。例如，组织可以保持在约1℃或约4℃至室温之间的任何温度，以及可以有利地保持在约4℃，例如在冰上。组织可以在全部或部分缺血时间内(即，在供体中停止循环后的时间)冷却。也就是说，组织可以经受热缺血、冷缺血或热缺血和冷缺血的组合。收获的组织可以在处理前保持例如长达48小时，优选小于24小时，例如更优选小于12小时(例如小于6小时、3小时或1小时)。在进一步处理组织之前，收获的组织可以有利地是，但不需要保持在(例如完全或至少部分地浸没在)合适的介质中和/或可以但不需要用合适的介质灌注。技术人员能够选择可以在处理之前的时间段内支持组织细胞的存活的合适的介质。

本发明的方法包括解离如上所述的成体肝组织以形成原代细胞群。本文中使用的术语“解离”通常是指部分或完全破坏组织或器官的细胞组织，即部分或完全破坏组织或器官的细胞与细胞组分之间的关联，以获得来自所述组织或器官的细胞悬液(细胞群)。悬液可包含单独的细胞或单细胞，以及物理附着以形成两个或更多个细胞的簇或团的细胞。解离优选不引起细胞生存力的降低或引起尽可能小的细胞生存力的降低。用于解离肝脏或其部分以获得原代细胞的群(悬液)的合适方法可以是本领域熟知的任何方法，包括但不限于酶促消化、机械分离、过滤、离心、及其组合。特别地，用于解离肝脏或其部分的方法可包括酶促消化肝组织以释放肝脏细胞和/或机械破坏或分离肝组织以释放肝脏细胞。通过肝脏活检获得的小的薄的肝组织部分可以直接用于进行根据以下步骤(c)细胞的培养而不需酶促或机械破坏。

如上所述的用于解离肝脏或其部分的方法在文献中记载为在两个或更多个步骤中广泛使用的胶原酶灌注技术(collagenase perfusion technique)，其已进行了多种改编和修改以使其在整个肝脏或肝脏部分中进行。用含有阳离子螯合剂(例如EDTA或EGTA)的在37℃下预热的不含二价阳离子的缓冲溶液灌注肝组织。缓冲溶液可包含盐溶液(例如HEPES、Williams E培养基)或任何其他也可包含盐(例如氯化钠或氯化钾等)的平衡盐溶液。这导致破坏将细胞保持在一起的桥粒结构。然后用含有二价阳离子(例如Ca²⁺和Mg²⁺)的缓冲溶液和用于消化组织的基质降解酶灌注组织。

通常通过温和的机械破碎和/或通过按压通过滤器释放原代肝脏细胞以完成细胞解离过程。这样的过滤器可具有允许细胞通过约0.1mm、0.25mm、0.50mm、1mm或更大的筛分尺寸。可以使用具有逐渐变小的筛分尺寸的一系列过滤器逐渐使组织解离并释放细胞。用含有蛋白酶抑制剂、血清和/或血浆的缓冲液冲洗解离的细胞以灭活在灌注过程中使用的胶原酶和其他酶，然后通过低速离心(例如在10×g至500×g下)使其沉淀从而与混合物分离。大多数(如果不是全部)的活细胞可以被沉淀，而死细胞和细胞碎片基本上在上清液中被消除，随后用冰冷的缓冲溶液洗涤以纯化细胞悬液。原代肝脏细胞的数量和质量可以根据组织的质量、使用的不同溶液的组分以及酶的类型和浓度而变化。酶通常是胶原酶，但也可以使用链霉蛋白酶、胰蛋白酶、透明质酸酶、嗜热菌蛋白酶及其组合。胶原酶可以由不完全纯化的酶混合物组成和/或表现出蛋白酶活性，这可能引起影响活细胞质量和数量的不期望的反应，这转而可以通过选择足够纯度和质量的酶制剂来避免。收获原代肝脏细胞的其他方法可以排除酶促消化技术，并且可以包括用含有蔗糖的溶液灌注肝脏，然后进行机械破碎。

关于该方法的步骤(b)，在解离肝组织后获得的肝原代细胞的制备物通常可以是原代肝脏细胞异质群，其包含属于任何构成肝脏的细胞类型的细胞，包括可能已经存在于肝实质和/或其非实质中的祖细胞或干细胞。除了可以在细胞培养条件下存在于肝组织或从肝组织衍生的干细胞或祖细胞之外，示例性的构成肝脏的细胞类型包括肝细胞、胆管细胞、库普弗细胞、肝星状细胞以及肝内皮细胞。

术语“肝细胞(hepatocyte)”包括上皮、实质肝细胞，包括但不限于不同大小或倍性(例如二倍体、四倍体、八倍体)的肝细胞。

术语“原代细胞”包括存在于通过用适当的技术解离存在于这样的外植组织(explanted tissue)或器官中的细胞而从对象的组织或器官(例如肝脏)获得的细胞悬液中的细胞。

本发明的方法可以优选地从代表大多数(如果不是全部)肝细胞类型的细胞群开始，其目的是在细胞培养条件下获得所期望的成体肝脏祖细胞。根据解离肝的方法和/或任何用于分级或富集肝细胞的初始制备物的方法和/或通过应用任何合适的技术基于物理性质(尺寸、形态)、生存力、细胞培养条件或细胞表面标志物表达的其他细胞类型，用于获得HHALPC的合适开始细胞群可包含不同比例的肝细胞(总细胞的0.1％、1％、10％或更多)。

通过解离肝脏(或其部分)在本文中定义和获得的原代细胞群可以立即用于将细胞培养物建立为新鲜的原代肝脏细胞，或者优选地，使用用于其长期保存的常见技术将其储存为原代肝脏细胞的冷冻保存的制备物。实际上，冷冻保存的细胞制备物的使用看起来对后来在细胞培养物中产生HHALPC和HHALPC子代的效率具有积极作用。这些样品中的细胞可以在细胞培养基或用于保存细胞或器官的溶液(例如Viaspan、Cryostor、Celsior)中冷冻，所述溶液补充或不补充有其他化合物，例如生长因子、血清、缓冲溶液、葡萄糖、白蛋白、乙二醇、蔗糖、右旋糖、DMSO或任何其他冷冻保护剂。每份冷冻保存的制备物可含有至少10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸个细胞或每个冷冻管或袋更多的细胞，其目的是在将样品适当解冻后以及如果需要的话，利用用于除去残留的细胞培养基的合适的缓冲液或细胞培养基或用于存储细胞或器官的溶液洗涤细胞，以在细胞培养条件下产生和分离更高量的HHALPC。

关于该方法的步骤(c)，可以将肝原代细胞的制备物(作为细胞悬液或通过肝脏活检获得的肝组织的碎片)直接培养在全合成支持物上(例如，塑料或任何聚合物质)或预先涂有饲养细胞(feeder cell)、蛋白质提取物或任何其他生物来源材料的合成支持物上，所述支持物允许相似的原代细胞的黏附和增殖以及出现具有所期望标志物的成体肝脏祖细胞群，这样的标志物优选通过免疫组织化学、流式细胞术或其他基于抗体的技术在蛋白质水平上进行鉴定。

优选地，将已黏附于所述基质的来自原代细胞群的细胞培养至少2天或更长时间，优选7天，至少10天或至少12天。更优选地，将来自原代细胞群的细胞在7天和12天内培养，以获得充分富集的可提供HHALPC的、活的原代细胞的贴壁细胞群。

术语“培养”泛指用于维持细胞培养物中细胞，特别是HHALPC和/或HHALPC子代和/或使其生长的条件。一些要素例如在其上培养细胞和允许细胞黏附(或者，当需要时，其允许细胞簇在悬液中生长)的支持物、细胞培养基的组分、接种和维持细胞的密度、O₂和CO₂浓度，可以适用于培养HHALPC和HHALPC子代，如下文和实施例中所详述的。

术语“肝脏祖细胞”是指通过培养从肝脏分离的细胞产生的非特化和具有增殖能力的细胞，其或其子代可以产生至少一种相对更特化的细胞类型。肝脏祖细胞产生可向一个或更多个谱系分化以产生越来越多的特化细胞(但优选肝细胞或肝活性细胞)的子代，其中这样的子代本身可以是祖细胞，或甚至产生终末分化(terminally differentiated)的肝脏细胞(例如，完全特化的细胞，特别是呈现与人肝细胞类似的形态和功能特征的细胞)。

HHALPC是在GMP条件下产生的成体肝脏祖细胞，其可以通过允许检测该阶段(即，在步骤(d)中所示的将细胞传代之前)的相关标志物的技术进一步表征以及在随后阶段进行初次表征，如下面步骤(e)所述。在用于鉴定这样的标志物并将其测量为阳性或阴性的技术中，优选Western印迹、流式细胞术、免疫细胞化学或细胞培养基分析，因为即使在该步骤中可获得的HHALPC量低的情况下，这也允许在蛋白质水平进行标志物检测。

HHALPC从被铺板接种在基质上的肝脏细胞原代群中出现，所述基质允许在能够促进这样的细胞的存活和/或生长的体外环境中使细胞黏附。该环境可以防止在所述环境(即细胞培养容器)与周围事物之间的不期望的物质交换(例如通过避免实验室环境的污染)，同时它可以允许在培养容器之间连续或间歇地交换其他有用的成分(例如通过偶尔或连续交换部分或全部培养基和气体)。

培养容器可以是细胞培养瓶、瓶子、孔板、多托盘细胞堆(multi-tray cellstack)、生物反应器和多种形式的培养皿，并且展现一个或更多个与细胞黏附相容的基质表面，使得铺板接种的细胞可以接触该基质以保持贴壁细胞培养。通常，允许细胞黏附于其上的基质可以是任何基本上亲水的基质，为玻璃或合成聚合物材料(例如聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚原酸酯、聚磷腈、聚磷酸酯、聚酯、尼龙或其混合物)，它们通常是成型的和经处理的以提供亲水性基质表面，从而增强有效细胞附着的可能性(如通过使用CellBind商业材料在实施例中所示)。表面处理可以采取表面涂层的形式，或者可以包括在聚合物表面上产生化学基团，所述基团对水具有一般亲和力或者以其他方式显示允许稳定吸附到另一个极性基团的足够的极性。这些官能团导致亲水性和/或表面氧的提高，并且具有认为可以增强在如此改性的基质表面上的细胞生长的性质。这样的化学基团可包括例如胺、酰胺、羰基、羧酸酯、酯、羟基或巯基的基团，所述基团也可通过用特定的基于波频率的技术处理它们而引入。

通过用一层合适的基质涂覆处理过的塑料表面可以促进细胞黏附。涂层可以包括合适的聚阳离子(例如，聚鸟氨酸或聚赖氨酸)，或优选地，可以提供用于GMP制造的细胞外基质的一种或更多种组分：层黏连蛋白、非/纤维胶原(优选1型胶原)、糖胺聚糖(例如，肝素或硫酸乙酰肝素)或蛋白质例如纤连蛋白、明胶、玻连蛋白、弹性蛋白、肌生蛋白(tenascin)、聚集蛋白聚糖、集聚蛋白、骨唾液蛋白、软骨基质蛋白、纤维蛋白原、黏蛋白或细胞黏附分子包括钙黏蛋白或连接蛋白，单独或以多种组合。优选的实例可包括胶原组合物，包含或不包含其他细胞外基质组分。或者，在该范围中可使用衍生自上文所列蛋白质的为片段或其他形式的合成肽、凝胶、分子支架和由合成材料和/或生物材料形成的其他三维结构。

可使原代细胞悬液与黏附表面接触一段时间(例如至少2、4、6、12、24小时或更长时间)，其足以使原代肝脏细胞群附着于黏附基质，之后通过从培养系统中丢弃培养基并将贴壁细胞任选地洗涤一次或更多次来从培养系统中除去任何非黏附物质(例如，非活细胞或死细胞和细胞碎片)。然后，向培养系统提供任何合适的培养基或等张缓冲液(例如PBS)。在此，选择已黏附于表面的来自原代肝脏细胞群的细胞进行进一步培养，并且可以对其进行计数以评估可以表示为每cm²所述表面铺板接种的细胞数(例如，10至10⁵个细胞/cm²)的铺板接种密度。

将直接进行铺板接种的或在洗涤细胞后的原代细胞制备物保持在支持其存活和/或细胞生长的液体培养基中。可以在将细胞引入系统之前、同时或之后向系统中添加培养基。培养基可以是新鲜的(即，之前未用于培养细胞)，或者可以包含已经通过先前在其中培养肝脏来源(或任何其他来源)的细胞所条件化(conditioned)的至少一种级分。特别地，培养基可以是如文献中所述的用于培养肝脏祖细胞的任何合适的培养基，并且可以与呈现相同或不同的特征(例如组成、pH或氧化状态)的新鲜培养基定期交换(例如，每小时、每3小时、每12小时，每24小时或更长时间)。可以改变培养基的整个体积，或者，可以仅改变培养基的一部分，使得保留通过先前培养细胞而条件化的培养基的级分。或者，直到细胞被转移到另一个培养容器中之前才更换培养基，这以大多数非目的细胞(例如，肝细胞和肝脏来源的其他完全分化细胞)脱离并死亡以及可以简单地定期添加新鲜培养基的方式延长细胞培养。

在存在液体培养基的情况下培养黏附的原代细胞以用于培养贴壁细胞，根据GMP要求，所述黏附细胞基于确定的化学培养基，所述培养基添加(或不添加)牛血清、人血清或其他动物血清。除了提供营养素和/或生长促进剂之外，这些可以补充有适当的有机或无机化合物的混合物的培养基还可以促进特定细胞类型的生长/黏附或消除/分离。

基础培养基制剂(可从例如美国典型培养物保藏中心，ATCC；或从Invitrogen，Carlsbad，California获得)可用于培养本文中的原代细胞，包括但不限于Eagle最小必需培养基(MEM)、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、α修饰的最小必需培养基(α-MEM)、基础培养基(BME)、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、BGJb培养基、F-12营养混合物(Ham)、Liebovitz L-15、DMEM/F-12、改良的Eagle必需培养基(EMEM)、RPMI-1640、培养基199、Waymouth MB 752/1或Williams培养基E，及其修改和/或组合。这些基础培养基的组成和适应培养细胞所需的培养基的/或培养基补充物浓度的标准通常是已知的。优选的基础培养基制剂可以是商业上可获得的那些中的一种，例如Williams培养基E、IMDM或DMEM，报道其维持成体肝细胞的体外培养，并且包括用于其适当生长、增殖、维持期望的标志物和/或生物活性，或长期储存的生长因子的混合物。

这样的基础培养基制剂含有本身为已知的哺乳动物细胞发育所必需的成分，例如无机盐(特别是含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P和可能的Cu、Fe、Se和Zn的盐)、生理缓冲液(例如，HEPES、碳酸氢盐)、核苷酸、核苷和/或核酸碱基、核糖、脱氧核糖、氨基酸、维生素、抗氧化剂(例如谷胱甘肽)和碳源(例如葡萄糖、丙酮酸酯)。可以使用另外的补充剂为细胞提供必要的微量元素和物质以实现最佳的生长和扩增。这样的补充剂包括胰岛素、转铁蛋白、硒盐及其组合。这些组分可以包含在盐溶液中，例如Hank平衡盐溶液(HBSS)、Earle盐溶液。可以添加其他抗氧化剂补充剂，例如，β-巯基乙醇。虽然许多基础培养基已经含有氨基酸，但是稍后可以补充一些氨基酸，例如L-谷氨酰胺，已知其在溶液中较不稳定。可以向培养基中进一步补充抗生素和/或抗真菌化合物，例如通常是青霉素和链霉素的混合物，和/或其他化合物。最重要的是，细胞培养基可以用哺乳动物血浆或血清补充，所述哺乳动物血浆或血清含有细胞因子和对于细胞生存力和扩增所必需的组分，并且在某些条件下其可以用合成组分代替。

如通常所定义的术语“血清”是通过以下步骤从全血样品中获得的，首先允许在样品中发生凝血，随后通过适当的技术(通常通过离心)将血液样品的如此形成的凝块和细胞组分与液体组分(血清)分离。惰性催化剂(例如玻璃珠或粉末)可促进凝血。有利地，可以使用血清分离容器(serum-separating vessel，SST)制备血清，所述血清分离容器含有对哺乳动物的惰性催化剂。

血清或血浆可以从商业上获得，并且来自与获得原代肝脏细胞的物种相同物种的生物。人血清或血浆可用于培养原代人肝细胞。或者，培养基包含牛血清或血浆，优选胎牛(小牛)血清或血浆，更优选胎牛(小牛)血清(FCS或FBS)。培养基包含约0.5％至约40％(v/v)的血清或血浆或血清替代物，优选约5％至20％(v/v)，例如约5％至15％(v/v)，例如约10％(v/v)。用于培养人肝细胞的培养基可包含人血浆或血清，优选人血清和牛血浆或血清，优选牛血清的混合物。

在储存或使用之前，可以对血浆或血清进行辐照(例如γ-辐照)或热灭活。本领域中使用热灭活主要是为了除去补体。热灭活通常包括在稳定搅拌下将血浆或血清在56℃下孵育30至60分钟，例如30分钟，之后使血浆或血清逐渐冷却至环境温度。任选地，也可以将血浆或血清在储存或使用之前进行灭菌(例如，通过孔径小于1μm的一个或更多个过滤器过滤)或根据任何适用的出于治疗用途用于培养人细胞的监管政策进行处理。

基础培养基的普通组分(在添加血清或血浆之前)，例如，特别是等张盐水、缓冲液、无机盐、氨基酸、碳源、维生素、抗氧化剂、pH指示剂和抗生素不被认为是本领域的生长因子或分化因子。另一方面，血清或血浆是可能包含一种或更多种这样的生长因子的复杂组合物。

如本文使用的术语“生长因子”是指影响多种细胞类型的增殖、生长、分化、存活和/或迁移的生物活性物质，并且可以单独或当由其他物质调控时影响生物体中的发育、形态和功能变化。生长因子通常可以通过作为配体与细胞中存在的受体(例如，表面或细胞内受体)结合起作用。本文中的生长因子可以特别是包含一条或更多条多肽链的蛋白质实体。术语“生长因子”包括成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员、骨形态发生蛋白(BMP)家族、血小板衍生生长因子(PDGF)家族、转化生长因子β(TGF-β)家族、神经生长因子(NGF)家族、表皮生长因子(EGF)家族、胰岛素相关生长因子(IGF)家族、肝细胞生长因子(HGF)家族、白细胞介素-6(IL-6)家族(例如制瘤素M)、造血生长因子(HeGF)、血小板衍生的内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血管生成素、血管内皮生长因子(VEGF)家族或糖皮质激素。当该方法用于人肝脏细胞时，本方法中使用的生长因子可以是人生长因子或重组生长因子。优选在本方法中使用人生长因子和重组生长因子，因为预期这样的生长因子会引起对细胞功能的理想效果。

培养基可以包含血清或血浆与一种或更多种如上定义的外源添加的生长因子的组合，其浓度优选使得其中特定生长因子可以诱导对体外培养细胞的作用。例如，培养基可包含EGF和胰岛素，或EGF和地塞米松，或胰岛素和地塞米松，或EGF、胰岛素和地塞米松中的每种。通常可以以约0.1ng/ml至1μg/ml，以及优选1ng/ml至100ng/ml，例如，约25ng/ml的浓度使用EGF；通常可以以约0.1μg/ml至1mg/ml，优选约1μg/ml至100μg/ml，例如约10μg/ml的浓度使用胰岛素；通常可以以约1mM至1μM，优选约1nM至100nM，例如约10nM的浓度使用地塞米松。在特定的GMP制造条件下，可以不存在EGF。

在细胞培养中还可以使用激素，例如D-醛固酮、己烯雌酚(DES)、地塞米松、胰岛素、雌二醇、氢化可的松、催乳素、黄体酮、促甲状腺激素、甲状腺素和L-甲状腺素。肝细胞也可以受益于用三碘甲腺原氨酸、α-生育酚乙酸酯和胰高血糖素的培养。脂质和脂质载体也可用于补充细胞培养基。这样的脂质和载体可包括但不限于环糊精、胆固醇、与白蛋白缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸和油酸、未缀合的亚油酸、与白蛋白缀合的亚油酸-油酸-花生四烯酸、与白蛋白未缀合的油酸和缀合的油酸等。白蛋白可以同样用于不含脂肪酸的制剂中。

实施例中描述的HHALPC的形态学和表型特征，不仅在冷冻保存原代肝脏细胞制备物具有低的铺板接种效率的情况下，而且在通过选择和组合不同的技术、条件和/或材料(例如合成聚合物材料、细胞外基质的组分、细胞培养基、培养箱中氧和/或CO₂的量、洗涤缓冲液等)对于用于从原代细胞的异质制备物制备黏附细胞测试和/或调整了已知技术的情况下，也可以允许获得这样的细胞。特别地，可以应用在低氧条件下的培养(如通过以毫摩尔级别添加分子的或更低浓度的抗氧化剂化合物获得的)与这些其他要素的一种或更多种组合以便以更大的量和/或更快地获得HHALPC。

如上定义的培养原代肝脏细胞的这一步骤导致在培养物中HHALPC的出现和增殖，并且可以持续直到HHALPC充分增殖。例如，可以继续培养直至细胞群达到一定程度的汇合(例如，至少50％、70％，或至少90％或更多汇合)。如本文中使用的术语“汇合”是指培养细胞的密度，其中细胞彼此接触，基本上覆盖了可用于生长的所有表面(即，完全汇合)。

关于该方法的步骤(d)，将原代细胞在细胞培养基中进行培养，所述培养基维持其黏附以及同质细胞群的增殖和出现，在至少一次传代后，所述细胞群逐渐富集HHALPC。HHALPC可以快速扩增以产生足够的细胞以用于获得具有所期望特性的HHALPC子代(例如，在给定的密度和/或分化状态下作为二维贴壁细胞或三维细胞簇)，细胞倍增可以在48至72小时内获得并维持HHALPC子代，其在至少2、3、4、5或更多次传代后仍具有所期望特性。

当传代时，将培养的细胞脱壁(detached)并与培养基质以及与彼此解离。细胞的脱壁和解离可以如本领域公知的那样进行，例如，通过蛋白水解酶(例如，选自胰蛋白酶，胶原酶，例如I、II、III或IV型，分散酶，链霉蛋白酶，木瓜蛋白酶等)的酶处理，用二价离子螯合剂(例如，EDTA或EGTA)处理或机械处理(例如，通过小孔移液管或移液管尖端重复移液)，或这些处理的任何组合。

细胞脱壁和分散的合适方法应确保所期望的细胞脱壁和分散的程度，同时保留培养物中的大部分细胞。优选地，培养细胞的脱壁和解离将产生很大比例的作为单个活细胞的细胞(例如，细胞的至少50％、70％、90％或更多)。剩余的细胞可以存在为细胞簇，每个细胞簇含有相对少量的细胞(例如，平均1至100个细胞)。

接着，可以将如此脱壁和解离的细胞(通常作为等张缓冲液或培养基中的细胞悬液)重新铺板接种到允许细胞黏附于其上的基质上，并随后在如上所述的维持HHALPC和HHALPC子代的进一步增殖的培养基中进行培养。然后可以通过以10至10⁵个细胞/cm²的密度以及约1/16至约1/2，优选地约1/8至1/2，更优选地约1/4至1/2的切分比(splittingratio)重新铺板接种它们。切分比表示被接种到与获得细胞的容器相同的表面积的空的(通常是新的)培养容器中的传代细胞的分数。培养容器的类型以及允许细胞黏附到培养容器中的表面以及细胞培养基可以与最初使用的和如上所述的相同，或者可以不同。优选地，将细胞维持在CellBind或任何其他适当的支持物上，所述支持物用细胞外基质蛋白(例如胶原蛋白，优选I型胶原蛋白)或GMP条件下可接受的合成肽涂覆。

关于上述步骤(e)，HHALPC群体的分离适用于对所列标志物为阳性的细胞，其进一步验证了用于在上述步骤(c)中初步鉴定HHALPC的标准，但考虑到传代后可用的更高量的细胞，该标准可以更容易地确定。

术语“分离”是指从细胞培养物或生物样品中物理地鉴定和分离细胞群，其可以通过应用适当细胞生物学技术进行，所述细胞生物学技术是基于细胞培养物的检查，以及基于对应于标准的细胞的表征(以及可能和期望时的物理分离)，或基于抗原的存在/不存在和/或细胞大小自动分选细胞(例如通过FACS)。在一些实施方案中，术语“分离”可以包括细胞的物理分离和/或定量(尤其是通过进行流式细胞术)的另外的步骤。

术语“细胞群”和“细胞的群”通常是指一组细胞。除非另有说明，否则该术语是指基本上由本文定义的细胞组成的、或包含本文定义的细胞细胞群。细胞群可以基本上由具有共同表型的细胞组成，或者可以包含至少一部分具有共同表型的细胞。当细胞在一种或更多种可证明的特征方面基本相似或相同时，认为细胞具有共同的表型，所述特征包括但不限于形态学外观、特定细胞组分或产物(例如RNA或蛋白质)的表达水平、某些生物化学途径的活性、增殖能力和/或动力学、分化潜能和/或对分化信号的应答、或在体外培养(例如，贴壁或单层生长)期间的行为。因此，这种可证明的特征可以定义细胞群或其一部分。如果绝大多数细胞具有共同的表型，则细胞群可以是“基本上同质的”。“基本上同质的”细胞群可包含至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，或甚至至少99％的具有共同表型的细胞，例如特定地称为HHALPC(或HHALPC子代)的表型。此外，如果群体中存在的任何其他细胞不改变细胞群的总体性质或不对细胞群的总体性质具有实质性影响，则细胞群可基本上由具有共同表型的细胞组成，例如HHALPC(即HHALPC子代)的表型，因此可以将其定义为细胞系。

一般而言，认为在技术文献公开的用于鉴定和表征特定细胞类型(例如间充质细胞、肝细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞标志物)或具有特异性定位(例如细胞内、在细胞表面上或分泌的)的细胞标志物的任何技术可能适合用于表征HHALPC和HHALPC子代。这样的技术可以分为两类：在分析期间允许维持细胞完整性的那些技术，以及基于使用这样的细胞产生的提取物(包括蛋白质、核酸、膜等)的那些技术。一些实施例包含关于如何使用这些技术来表征HHALPC和HHALPC子代的数据，例如，通过对细胞表面抗原的存在进行分析，之后用其他肝脏祖细胞或成体肝脏原代细胞进行更详细的和比较性的分析以评估其独特的特征和生物活性。

在蛋白质水平上，例如流式细胞术或免疫细胞化学的技术允许通过使用抗体或其他蛋白质特异性试剂确定HHALPC中表面或细胞内蛋白质的存在/不存在。如通过单染色或多染色技术和/或尺寸和粒度评估所确定的，流式细胞术是根据表面或细胞内标志物的组合存在/不存在来表征细胞群的优选技术。免疫细胞化学还提供关于与表面、细胞骨架和/或其他细胞内标志物的组合存在/不存在相关的形态学特征的信息。

特别地，至少一种间充质标志物、一种黏附标志物、一种四次跨膜蛋白、一种选自CD98、CD140b和β2-微球蛋白的标志物以及至少一种肝标志物的存在应通过流式细胞术、免疫细胞化学或允许评估展示受体的细胞的百分比的任何其他技术(通常利用抗体、凝集素或其他蛋白质，并且不需要蛋白质或核酸提取)来测量。可以类似地测量除了与肝脏或间充质细胞特征严格相关的那些之外的另外的细胞表面标志物(例如实施例中提到的阳性标志物)的阳性。当至少60％的细胞存在所期望的标志物或受体时，此时通过流式细胞术和免疫细胞化学定义为阳性(如实施例中所示)。类似地，当小于20％的细胞存在给定的标志物或受体时，此时通过流式细胞术和免疫细胞化学定义为阴性(如实施例中所示)。在一些实施方案中，少于10％的细胞存在给定的阴性标志物。当提及细胞表面标志物时，优选在非透化细胞(non-permeabilized cell)中测量阳性。

在一些实施方案中，当测量给定标志物时，将用于检测如上定义的标志物或细胞表面蛋白质的物质固定在固相(例如珠、平板或生物材料)上，或被标记(例如，荧光标记的)，和/或被另一种经标记的化合物(例如二抗)识别。有许多方法可以产生可通过外部手段(例如，理想地通过目视检查或通过电磁辐射、加热和化学试剂)检测的信号的标签。使用本领域已知的任何方法(例如化学交联或使用生物素-链霉抗生物素蛋白系统)也可以将产生系统组分的标签或其他信号与特异性结合配偶体、另一种分子或支持物(例如珠)结合。标签可以直接产生信号，因此，不需要另外的组分来产生信号。许多有机分子，例如荧光染料(例如FITC、PE、PC5、PC7、APC、或已知与流式细胞术相容的任何其他物质)吸收紫外光和可见光。其他类型的标签直接产生信号，例如放射性同位素和染料。或者，标签可能需要其他组分来产生信号，然后信号产生系统将包括产生可测量信号所需的所有组分，其可包括底物、辅酶、金属离子或与酶产物反应的物质(例如，辣根过氧化物酶的化学发光检测)。

HHALPC的肝特异性代谢活性包括通常与肝脏细胞(以及特别是指肝细胞)相关的、并且将肝脏细胞与存在于其他组织中的细胞区分开的生物活性，以及特别是包括涉及如文献和一些实施例中所述的蛋白质或其他底物的结合、活化和/或降解的活性。这些生物活性是基于检测肝脏特异性代谢活性而建立，所述代谢活性可以是蛋白质/药物结合活性，以及更优选地，对给定底物的酶活性，或与通过印迹技术(Western印迹或Northern印迹)、测序、等电聚焦、ELISA检测的肝脏特异性分子，或已知在肝细胞内被特异性转运和代谢的合成或天然化合物的内化相关联。可以类似地测量除了与肝特征严格相关的酶活性之外的其他相关酶活性，并与使用文献中所描述的技术在肝细胞或其他细胞类型内测量的那些相比较。根据替代方法和用途，可以在体外或在合适的体内模型中测量与内皮细胞相关的活性(例如与穿过该屏障并到达组织的途径相关)或血液(例如与凝血有关)的活性。

在核酸水平，全基因组测序、PCR或RT-qPCR可用于表征HHALPC或HHALPC子代。因此，可使用实时PCR基于循环数使其相对于1个或更多个内源对照获得的循环归一化来量化所研究的基因的表达。特别地，RT-PCR反应可以使用HHALPC和适当的引物和缓冲液来进行，但用以获得信号的循环数不应超过25、30或35个循环。

在活性水平，肝特异性代谢活性的存在可以通过任何适当的技术来测量，所述技术允许评估肝特异性酶的存在和/或活性水平，但优选应该允许在体外量化实际的酶活性，具有给定的特定终产物检测限(因为它可以在文献和市售产品的支持下容易地建立)以用于测量CYP450活性、解毒、糖原储存、α-1-抗胰蛋白酶或白蛋白的分泌、胆汁生成、血小板生成素生成、血管紧张素原生成、氨至尿素的转化、胆固醇合成、糖原分解、糖原生成和脂肪生成。特别是，当活性测量为在统计学上高于终产物的检测限(是检测限的至少两倍、五倍或十倍)或接近原代肝脏细胞的活性水平(高于、等于或至多10％；至多25％、至多50％、至多75％、或至多90％更低)时，在此定义对至少肝特异性代谢活性为阳性。

文献提供了用于评估体外人肝细胞中细胞色素P450活性的技术的广泛描述，特别是关于特异性诱导酶活性的化合物和可用于进行这些实验的形式(Gerets HH等，2012；Gomez-Lechon MJ等，2012)。在这些不同的诱导物中，在这些细胞中的药物代谢可使用咪达唑仑、乙氧基试卤灵、苯甲酸基试卤灵、安非他酮、非那西丁、双氯芬酸、甲苯磺丁脲、苯巴比妥、利福平、咖啡因、β-萘黄酮、奥美拉唑、右美沙芬、3-甲基胆蒽、瑞格列奈、或其他已知细胞/肝毒性的化合物作为文献中列出的探针(Bale S等，2014)来评估。代谢物检测和定量可以与肝酶对特定化合物的活性相关联，例如CYP1A2(通过检测副黄嘌呤或对乙酰氨基酚)、CYP3A4(通过检测1-OH-咪达唑仑或奥美拉唑砜)、CYP2C6(通过检测HO-安非他酮)、CYP2C9(通过检测4′HO-双氯芬酸)，以及对其他主要细胞色素P450活性，例如CYP1A2、CYP3A5、CYP3A7或CYP7A1(单独或以适当的组合)。

其表达或(优选地)活性可在HHALPC和HHALPC子代中建立的其他酶是UDP-葡萄糖苷酰转移酶(例如UGT1A1、UGT2B4、UGT2B7)、磺基转移酶(催化几种药理学上重要的内源性分子和生物异源物质的硫酸盐缀合)、酪氨酸转移酶、色氨酸-2，3-双加氧酶(TDO2或TDO)、吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO1或IDO2)、赖氨酰氧化酶(LOX)、谷胱甘肽S-转移酶(例如GSTα)、多药耐药蛋白(MDR或MRP-1/-2/-3)、肝特异性转运蛋白(例如OATP1B1)和其他I/II/III期生物转化酶。此外，还可以通过应用公认的方案来测量和比较白蛋白/尿素生成和分泌、氨代谢、糖原储存、胆汁生成、血小板生成素/血管紧张素原生成和半乳糖/山梨糖醇消除速率。

当通过本发明的方法获得HHALPC的制备物时，可以在允许生长和倍增而不分化的条件下维持和/或繁殖该细胞群。优选地，将HHALPC作为非分化的贴壁细胞在培养中传代不多于2次、不多于3次、不多于4次或不多于5次，因此可以评估细胞倍增的数量以用于建立用于进一步体内或体外使用的最合适条件。在该状态下传代一次或更多次后，可以诱导HHALPC分化成肝细胞样或肝活性细胞。在这两种情况下，所得细胞代表HHALPC子代。在第一种情况下，用于将HHALPC作为未分化的HHALPC子代维持的条件可以是目的在于提高可用细胞的数量的用于获得HHALPC的原始群体的相同条件。

在本发明的方法的步骤(e)之后，任选的又一步骤(f)可以包括将HHALPC维持在细胞培养条件中，所述条件允许分化成呈现肝特异性活性的细胞，例如肝细胞样或肝活性细胞(即，已经失去其对大多数(如果不是全部)间充质标志物呈现的阳性并且对肝细胞的形态学、生物学和功能特征的大多数(如果不是全部)都为阳性的成体肝脏祖细胞)。或者，HHALPC子代呈现肝和其他组织特异性特征的组合，其涉及特定GMP制造过程、配制、施用位点或体内其他化合物的同时使用。这些特性可能与具有在细胞表面表达或分泌的免疫调节特征的蛋白质特别相关，如ADHLSC的文献中所述(Berardis S等，2014；Sana G等，2014；Raicevic G等，2015)。

另外的传代(例如，细胞脱壁和分散、重新接种等)和培养(例如，培养基添加或汇合后的变化等)可以在与第一次传代基本相同或类似的条件下进行，如上所述，或者在包括将在文献中提出的修饰和/或用于HHALPC或HHALPC子代的特定用途的条件下进行。因此，用于在细胞培养中维持和/或分化HHALPC或HHALPC子代的条件可以根据不同标准来进一步优化，例如用于分化成肝细胞样或肝活性细胞的时机/培养基、用于维持三维细胞培养物作为细胞悬液的系统、特定底物或支架的使用、缺氧、生长因子和化学化合物在细胞培养基中的组合或顺序添加、或细胞密度。

在这样的后期传代期间，可以通过在暴露的细胞表面蛋白质和/或其体外糖基化的水平改造细胞而不进行遗传操作来进一步调整和/或改善HHALPC子代的活性和总体表型，以用于最终储存、配制和/或使用功能，特别是用于例如通过添加Sialyl lewis X基团或肽来改善细胞植入(Sarkar D等，2011；Wan X等，2013；Cheng H等，2012)。HHALPC子代还可以在最后阶段(就在使用或储存之前)在特定条件下培养，以使得例如通过在允许较温和的细胞释放的热敏聚合物或其他支持物上培养来更好地维持一些特性(Nash M等，2013；You J等，2013；Nagase K等，2015)。可以改善细胞植入、体内活性或者减少细胞凋亡的细胞培养基的其他修饰(例如在缺氧条件下用抗氧化剂培养、或者通过添加细胞因子或其他化合物如番茄红素)可以根据文献(Kavanagh D等，2014；Kim JY等，2015；Zeng W等，2015)用作预处理。

本发明的方法提供了HHALPC，其呈现形态学、蛋白质表达和功能特征，所述特征不同于先前描述的成体祖肝脏细胞中鉴定的那些。因此，通过上面定义的方法获得或可获得的HHALPC代表本发明的另一个实施方案。这些方法允许提供这样的细胞群：其包含高比例的特定细胞(至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)，甚至产生基本上同质的细胞群，如可以通过任何适当的标准方法(例如，通过流式细胞术或任何其他免疫染色方法)评估的，其中评估或不评估其他生物活性。

HHALPC和HHALPC子代可用于建立用于任何直接使用的或作为冷冻保存制备物储存的细胞培养物，每个制备物包含至少10³、10⁶、10⁹个细胞或更多，旨在在适当解冻制备物后产生或使用更高量的HHALPC或HHALPC子代，并且如果需要，用于产生工业规模的HHALPC和HHALPC子代(例如，使用用于改善生物加工和细胞扩增同时保持期望的细胞性质的生物反应器、膜、微球、微流体或任何其他技术方案)。对应于HHALPC和HHALPC子代中任一者的细胞群样品可以在含血清或不含血清的保存培养基(例如市售的冷冻保存制剂)中和/或在冷冻保护剂(例如适当浓度下的二甲基亚砜)存在下冷冻保存。HHALPC子代可与作为在用于药物开发和毒理学的安全性测试、病理生理学研究和其他基于细胞的微流体肝模型中的芯片器官(organ-on-a-chip)应用而开发的商业系统相容(Alepee N等，2014；Lin C等，2015)。

特别地，可以在一个或更多个小瓶中提供包含预定数量的细胞(例如50000、100000、500000、1百万、1千万、1亿、10亿或更多个细胞)的HHALPC和HHALPC子代的制备物，所述小瓶然后可以包含在包含这样的小瓶(或其他适当的器皿或容器，例如用于微流体应用的器皿或容器)的试剂盒中，所述小瓶然后可以包含在包含这样的小瓶、容器、微流体器具和任何其他合适的装置、一次性材料(例如过滤器、注射器)、溶液(例如PBS、细胞培养基、稀释剂)、化学制剂(例如酶底物、荧光染料、药物)、生物产品(例如生长因子、抗体、引物)和/或可适当包装并发送给客户以用于因此在体内(例如用于向患者或动物施用)或体外(例如用于测试作为候选药物的化合物的毒性或效力)使用HHALPC和HHALPC子代的用于使用这样的试剂盒的组分的说明书的试剂盒中。

HHALPC和HHALPC子代在细胞培养条件下(或在植入动物模型或患者中后)的维持、增殖和/或分化可根据期望用途的要求进行。文献提供了几种用于维持肝脏祖细胞和/或由其产生肝细胞样或肝活性细胞的方案。一些实施例提供了用于在细胞培养条件下获得HHALPC和HHALPC子代的方法，以及用于将它们分化成以贴壁细胞形式或作为三维细胞簇呈现肝特异性活性的细胞的方法。

在这后一种情况下，可以提供HHALPC和HHALPC子代作为三维细胞簇用于期望的用途，所述三维细胞簇类似于肝球状体或类器官，根据文献，其可以在肝内或肝外施用、用于测试化合物的肝毒性、作为冷冻保存的制备物保存、在用于扩大规模制造过程的生物反应器或多托盘堆中扩增、或用于肝辅助装置时提供具有显著改善的存活力和功能的细胞(Ebrahimkhani M等，2014；Lancaster MA等，2014；Massie I等，2011)。HHALPC和HHALPC子代还可以通过将细胞包封在合成或生物基质中来获得。特别是，可使用肝脱细胞化支架或细胞外基质作为用于培养一种或更多种细胞类型的支架、作为用于产生肝类器官的二维底物涂层和三维可注射水凝胶平台(Lee J等2014；Caralt M等，2014)。

HHALPC和HHALPC子代的维持、增殖和/或分化可以通过使用用于不同来源的干细胞、祖细胞或间充质细胞的本领域熟知的技术方案调整细胞培养条件来改善。例如，非细胞损伤低氧气氛的离体方案和用于调整体外微环境的其他方法可以促进此类细胞的存活、遗传稳定性、增殖、植入后分化、肝脏内的归巢和再增殖、旁分泌因子的分泌、以及整体治疗潜力(Muscari C等，2013；Cigognini D等，2013)。另外，将人血液来源的组分(例如脐带血清和血小板裂解物)作为细胞培养组分进行测试和开发，所述组分是牛血清的非异种替代品，并且仍然符合产生临床细胞组合物的GMP指南，而没有众所周知的与血清相关的问题，例如质量的变化、污染的风险和不希望的免疫效应(Bieback K，2013)。

在施用或以其他方式使用之前，HHALPC和HHALPC子代可以通过将所述细胞暴露于异源生物或化学试剂，或通过将所述试剂引入细胞中来瞬时或稳定地修饰。特别是HHALPC和HHALPC子代可以在细胞培养中(例如在其分化之后和/或之前)通过使用生长因子处理细胞和/或引入影响细胞的总体表达谱，优选针对特定肝特征或帮助细胞培养的特征的核酸(例如通过用微小RNA转导细胞或用表达重组蛋白的慢病毒载体转导细胞，所述重组蛋白例如生长因子、或已知影响肝分化或向任何其他细胞类型分化和/或治疗目的蛋白质之产生的转录因子、或荧光蛋白质)来修饰(或在其用适当载体转化后进行改造)。

特别是，HHALPC和HHALPC子代因此可以在它们分化成呈现全范围肝特异性活性的细胞之后和/或之前在体内和/或体外呈现改善的和/或另外的生物活性。优选地，在HHALPC和HHALPC子代分化之前对其进行改造，使得HHALPC子代被一致地修饰成具有改善的生物活性，而不依赖于任何后来的体外分化或体内使用(其可以暗示或不暗示肝或其他类型的分化)。

用被称为诱导其他已知肝脏祖细胞/干细胞分化成其他非肝细胞类型(例如骨细胞、产生胰岛素的β细胞、或骨髓细胞)的化学试剂、细胞培养基和/或核酸载体处理HHALPC子代同样可提供这样的非肝细胞类型。通过将文献中已知的这些技术应用于HHALPC(或任何特定类型的HHALPC子代)而获得的非肝细胞群是除实施例中描述的分化HHALPC子代(通过使用用于诱导肝分化的细胞培养基获得的)以外的其他类型的分化HHALPC子代，实施例中描述的分化HHALPC子代可以根据HHALPC子代因这样的处理而已丧失和/或获得的生物活性在体外和/或体内(特别是用于治疗用途)使用(例如产生和分泌可用于治疗糖尿病的胰岛素的分化的HHALPC后代)。

适用于肝脏祖细胞的常规基因转移方法可用于将核酸引入HHALPC和HHALPC子代，包括微注射、电穿孔、用磷酸钙共沉淀、脂质体或病毒转染。在其用合适的载体转化后，HHALPC和HHALPC子代可表达重组蛋白或包含允许所述细胞在其分化成肝细胞样和/或肝活性细胞之后和/或之前在体内和/或体外表现出改善的和/或额外的生物活性的核酸(例如，在建立基于肝脏祖细胞的基因治疗模型的范围内)。当载体是病毒载体(例如慢病毒载体)时，它们将通过以下方式来表征：测定其滴度以选择最佳转导效率条件和增殖速率，并且用以分析其表达谱及其安全性。

肝脏在解剖学上以这样的方式与循环系统连接，其允许多种蛋白质有效释放到血液循环中。因此，可将编码具有全身作用的蛋白质的基因插入HHALPC和HHALPC子代中(特别是在培养以获得三维细胞簇之前)以进一步改善其效力(特别是当例如通过静脉内、肌内或腹膜内注射全身施用时)，以及用于体内施用时的植入和维持。

例如，可以将编码激素或抗体的多种基因插入本发明的肝细胞中，以将其基因产物分泌到血液循环中。特别是，HHALPC和HHALPC子代可以被修饰成组成性地或瞬时过表达通常由肝细胞表达的蛋白质(并且可能已经由这样的细胞表达)，但是所述蛋白质在患者中存在缺陷或不存在(这种缺陷潜在导致患者的病理状态，例如肝代谢的先天性错误)，然后帮助恢复蛋白质的产生，从而帮助治疗患者。这样的蛋白质的实例是代谢酶，例如裂解酶、精氨酸酶、葡糖激酶、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸氨甲酰磷酸合酶、N-乙酰谷氨酸合酶、谷氨酰胺合成酶、糖原合成酶、葡萄糖-6-磷酸酶、碱性磷酸酶、琥珀酸脱氢酶、丙酮酸激酶、乙酰辅酶A羧化酶、脂肪酸合成酶、丙氨酸氨基转移酶、谷氨酸脱氢酶、细胞色素P450酶、醛脱氢酶和/或醇脱氢酶。或者，可以通过引入编码分泌的血浆蛋白例如白蛋白、生长因子或激素、胰岛素、转铁蛋白、补体蛋白(例如组分C3)、α2-巨球蛋白、纤维蛋白原α/β/γ链、凝血因子(因子V、因子VII、因子VIII、因子XI、因子XIII、因子IX)、α-1-抗胰蛋白酶等的DNA来修饰HHALPC和HHALPC子代。

在产生HHALPC和HHALPC子代时获得的生物材料可以进一步用于鉴定可能具有特定用途，特别是不同的医学应用的生物实体。这些生物材料不仅包括呈现特定标志物、活性和/或形态(如实施例3和4中所确定的)的HHALPC或HHALPC子代的亚群(或细胞系)，还包括作为中间产物或最终产物获得的任何其他生物实体，例如条件化细胞培养基和这些细胞的部分和包含可用作检测具有医学目的之细胞的生物标志物或用作呈现具有医学目的的活性或分布的化合物的蛋白质、代谢物、细胞囊泡和/或核酸的培养基。还可以通过测量条件化细胞培养基(例如以细胞培养物上清液的形式)的含量来确定另外的信息，所述条件化细胞培养基可以提供关于分泌蛋白质组，特别是关于HHALPC和HHALPC子代的旁分泌作用的相关信息。

HHALPC或HHALPC子代的相关生物特征可通过使用例如流式细胞术、免疫细胞化学、质谱、凝胶电泳、免疫分析(例如免疫印迹、Western印迹，免疫沉淀、ELISA)、核酸扩增、酶活性、组学技术(蛋白质组学、糖组学、转录组学、代谢组学)和/或其他生物活性的方法来鉴定。特别是，组学技术可以提供另外的方法，以使用为干细胞或祖细胞，特别是肝脏祖细胞发表的数据库和其他数据集对HHALPC或HHALPC子代进行比较(Yu J，等，2012；Santamaria E，等，2012；Slany A，等，2010；Sison-Young R等，2015)。这些另外的标志物可以在HHALPC子代制备的初始步骤期间或之后使用(例如用于比较和验证工业制造的HHALPC子代批次或用于评估制药用途的适合性)。

这些方法可以提供用于定义在体内或体外与成体肝脏祖细胞相关的新生物标志物的方法(例如，用于在其制备和使用之前、期间或之后确定细胞群的数量、质量和同质性)。特别是，生物标志物通常可以通过生物样品中或细胞培养物中给定细胞群(HHALPC和/或HHALPC子代)的浓度或者结合呈递特定蛋白质、脂质、酶、磷脂和/或聚糖的细胞的浓度来定义。这样的生物标志物可以对应于肽、蛋白质、磷脂、脂质、核酸、聚糖或这样的元素组分的任何组合。对于给定用途(例如，治疗特定肝病、在体外分化或用化学试剂和/或核酸载体修饰后获得肝活性细胞类型、评估特定化合物的代谢)，特别是当比较来自不同供体和/或通过应用不同的制造方法获得的HHALPC子代时，生物标志物可以特异性地用于评估作为HHALPC或HHALPC子代的细胞群的适合性。另外，生物标志物允许评估给定的肝组织(或新鲜或冷冻保存的肝细胞的样品)是否适合于更有效地获得HHALPC(例如通过筛选肝组织库和其他肝来源的生物样品库，如蛋白质提取物和cDNA文库)，以确定可以选择哪些供体和/或样品。

术语“生物标志物”或“标志物”是指在表征HHALPC和/或HHALPC子代时客观测量和评价的分子、参数、特征或实体。在特定样品(例如组织或生物流体)中与HHALPC和/或HHALPC子代相关的生物标志物的定量评估可以与总细胞的定量评估、可以产生和分离HHALPC和/或HHALPC子代的效率、特定的体外技术、或特定的医学用途或患者的状态相关联。

一旦其在体内或体外分化，或者甚至在诱导向呈现较大量和/或较强肝特异性活性的细胞(即肝活性细胞)的完全分化之前，HHALPC和HHALPC子代可用于需要呈现与原代肝细胞在期望时期所观察到的尽可能相似的生物特征(例如代谢或酶活性、抗原谱或其他表型)的细胞的再生医学和生物测定。HHALPC和HHALPC子代还可用于体外应用，例如药理学或毒理学研究(例如生物或化学试剂的筛选和表征)。HHALPC和HHALPC子代允许建立毒理学、药理学和药物遗传学(如对源自各种来源的祖细胞或干细胞的原代肝细胞和肝细胞样细胞广泛地描述的)或鉴定用于鉴定具有医学目的的体内和/或体外细胞群的生物标志物的、特别是与诊断、预防和/或治疗肝病相关的体外和动物模型。

本文所用的术语“体外”表示在动物体或人体的外面或外部。本文所用的术语“体外”应理解为包括“离体”。术语“离体”通常是指从动物体或人体中移出并在体外(例如在培养皿或生物反应器中)维持或繁殖的组织或细胞。

如果HHALPC和HHALPC子代可优选用于体内应用，则体外分化的HHALPC子代可优选用作用于药物发现/验证的分化的肝细胞样或肝活性细胞。

HHALPC和HHALPC子代(或在产生它们时获得的相应生物材料)可以在包含它们的组合物中提供，特别是以包含这样的细胞(作为新鲜细胞或适于长期储存的细胞(例如冷冻保存的细胞))的组合物的形式作为可以用于体内施用(在人或动物模型中)或体外应用的治疗方法的药物组合物。

优选地，包含HHALPC或HHALPC子代的组合物可包含至少10³、10⁶、10⁹或更多个细胞(例如，对于每个剂量或施用的5百万至5亿、或5百万至2.5亿、或5千万至5亿、或5千万至2.5亿、或1亿至5亿、或1亿至2.5亿个细胞)。这样的基于细胞的组合物还可包括可提供进一步的治疗、诊断或任何其他有用效果的生物来源(例如抗体或生长因子)或化学来源(例如药物、细胞保存或标记化合物)的其他试剂。文献提供了与基于细胞的药物组合物相容的任选的添加剂、赋形剂、载剂和/或载体的几个实例，以及将它们与HHALPC和HHALPC子代结合的方法，所述基于细胞的药物组合物可包含其他特定缓冲剂、生长因子或佐剂，其中定义了组合物的每种组分的量(以微克/毫克、体积或百分比计)。

HHALPC和HHALPC子代可以以组合物的形式施用，其取决于所选择的施用方法，可以是细胞悬液、海绵或其他三维结构，其中细胞可以在体外和/或体内生长和分化，包括生物人工肝装置、天然或合成基质、或允许细胞在适当位置(包括表达有助于细胞的归巢和植入的趋化因子的炎症或组织损伤区域)的植入和功能的其他系统。特别是，HHALPC和HHALPC子代可以通过注射(还包括导管施用、静脉内或动脉内施用)或植入来施用，例如局部注射、全身注射、脾内注射、关节内注射、腹膜内注射、门静脉内注射、注射至肝髓(例如肝囊下、肠胃外施用)或宫内注射到胚胎或胎儿中。

当全身而非局部注射时，HHALPC产品可以在远处产生影响，因为这样的HHALPC在血液循环中移动并且移植到远处(例如内部器官或关节)，或者HHALPC分泌的蛋白质由于血液而到达特定细胞类型。此外，HHALPC和HHALPC子代可用于在其中接种HHALPC或HHALPC子代(与其他干细胞、原代人细胞例如分化的肝细胞、或源自干细胞的细胞类型一样)的解毒装置的生物成分，例如具有刚性、塑料外壳和中空半透膜纤维的肝灌注或肝辅助装置。可以根据公知的程序将体液灌注通过该装置以用于解毒然后返回患者体内。

HHALPC、HHALPC子代或包含其的组合物可用于通过肝内或肝外位置的肝脏细胞移植(LCT)的组织工程和细胞治疗(包括用于调节对肝脏或其他器官和组织的移植之前或之后的免疫应答)。使用这种方法，还可以通过将人源HHALPC、人源HHALPC子代或包含它们的组合物移植进动物中来获得人肝病的动物模型，其中可以更有效地评估化合物对人肝细胞的作用并将其与在动物模型中的效果区分开。

当施用包含HHALPC或特定HHALPC子代的治疗组合物时，其通常可以以单位剂量配制。在任何情况下，可需要包括试剂和/或改变用于向患者施用细胞的已知方法，其例如通过将细胞掺入生物聚合物或合成聚合物中来确保HHALPC或HHALPC子代的活力。合适的生物聚合物的实例包括但不限于纤连蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、胶原蛋白和蛋白聚糖层黏连蛋白、黏附分子、蛋白多糖、透明质酸、糖胺聚糖链、脱壳聚糖、藻酸盐、衍生自此类蛋白质的天然或合成修饰的肽、以及合成的、可生物降解的且生物相容的聚合物。这些组合物可以生产为包含或不包含细胞因子、生长因子，并作为悬液或三维凝胶与包埋在其中的细胞一起施用。

本发明的方法不仅考虑使用肝组织的任何供体来产生HHALPC或HHALPC子代，而且考虑使用患者自身的肝组织来产生和分离HHALPC并产生HHALPC子代或包含其的组合物。这样的细胞将对患者是自体的，并且可以容易地施用于患者。另外，HHALPC可以从非患者自身的组织中产生和分离。在考虑向患者施用此类细胞的情况下，可优选选择经受本发明的方法以获得HHALPC的肝组织，以便至少在可实现的限度内最大化患者与施用的细胞之间的组织相容性，从而降低患者免疫系统排斥施用的细胞(例如，移植物抗宿主排斥)的机会。

关于HHALPC和HHALPC子代的治疗用途的问题是达到最佳效果所需的细胞数量。施用的剂量可以变化，可以包括初始施用，然后是后续施用；并且可以由本领域技术人员通过应用本公开内容的教导来确定。通常，施用的一个或更多个剂量将提供治疗有效量的细胞，并且可能需要优化施用的细胞的量。因此，待施用的细胞的量将因所治疗的对象而变化(例如，在一个周期中或对于整个治疗周期每次治疗为10²至10¹⁰个细胞；例如，在一个周期中每次治疗为1×10⁶至1×10⁷个细胞/Kg对象的体重、或2×10⁶至8×10⁶个细胞/Kg对象的体重、或3×10⁶至5×10⁶个细胞/Kg对象的体重；或者，例如，对于整个治疗周期1×10⁶至1×10⁸个细胞/Kg对象的体重、或5x10⁶至5×10⁷个细胞/Kg对象的体重、或1×10⁷至2×10⁷个细胞/Kg对象的体重)。然而，治疗有效剂量的精确确定可以基于每个患者个体的因素，包括其大小、年龄、组织损伤大小和自损伤发生以来的时间的量。

优选地，包含HHALPC或特定HHALPC子代的组合物应包含如上定义的基本上同质的细胞群，并且因此可以调节每个剂量内细胞的量。

HHALPC或HHALPC子代在其施用或植入后的分布、分化和/或增殖(以及其在施用不同治疗剂之后/之前的活性)可以在人对象或动物模型(优选啮齿动物)中测试。例如，脾内移植有HHALPC或HHALPC子代的SCID小鼠的肝的分析可以通过检测人标志物证明这些细胞能够植入肝中并重新填充(repopulate)器官，以及通过检测人白蛋白或任何其他典型的人肝特异性标志物(或先前在施用的HHALPC或HHALPC子代中转染的重组基因)证明能够分化成活性、成熟肝细胞。

本发明的另一个方面是用于预防和/或治疗肝病的方法，包括向有此需要的对象施用HHALPC、HHALPC子代或包含其的组合物。HHALPC和HHALPC子代可用于治疗肝病，特别是在鉴于观察到的并可以分成不同类别的肝质量和/或功能的丧失，根据文献需要肝移植、肝脏细胞移植或肝脏再生的对象中需要永久(或限时)重建肝功能的肝病。

用于治疗肝病的方法包括向有此需要的对象施用HHALPC产品，例如优选在组合物内的HHALPC或给定的HHALPC子代。特别地，治疗有此需要的患者中的疾病的方法包括向患者施用有效量的HHALPC产品，疾病优选为肝病或遗传性凝血障碍。

第一类肝病以肝先天性代谢缺陷为代表，其可以被进一步区分为氨基酸代谢缺陷(例如，枫糖尿症、苯丙酮尿症、酪氨酸血症、丙酸血症、有机酸尿症和尿素循环障碍(包括精氨基琥珀酸尿症、氨甲酰磷酸合酶I缺陷、瓜氨酸血症、高精胺酸血症和鸟氨酸氨甲酰转移酶缺陷))、金属代谢缺陷(例如威尔逊病或血色素沉着病)和碳水化合物代谢缺陷(例如I/II型糖原贮积病、果糖血症、或半乳糖血症)、溶酶体障碍(例如沃尔曼病、尼曼皮克病)、过氧化物酶体病(例如雷弗素姆氏病)、家族性高胆固醇血症和其他脂质代谢紊乱、线粒体性疾病(例如丙酮酸羧化酶缺陷)和高胆红素血症(例如克里格勒-纳贾尔综合症、吉尔伯特综合症、或杜宾-约翰逊综合症)。第二类是以不直接关联到凝血或代谢缺陷的其他肝病为代表，并且包括1/2/3型进行性家族性肝内胆汁淤积症、α-1抗胰蛋白酶缺陷、卡洛里病、肝细胞转运蛋白、卟啉症的缺陷(例如急性间歇性卟啉)、脂肪肝和其他纤维化性肝病(NASH/NAFLD)、原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎、肝变性疾病、或急性或慢性肝衰竭(例如肝切除后、暴发性、病毒诱导的急性上慢性肝衰竭)、或可通过用肝脏祖细胞替换肝组织来治疗的其他类型的肝变性(例如肝癌或其他恶性肿瘤)。

关于遗传性凝血障碍，该疾病可以选择例如因子V缺陷、因子VII缺陷、因子VIII缺陷、因子IX缺陷、因子XI缺陷、因子XIII缺陷和由于肝特异性表达和分泌到血液中的其他凝血相关的因子或其他蛋白质的量不足而导致的其他缺陷，例如白蛋白或组织因子，后一种产物由这些细胞表达(Stephenne X等，2012)并且对某些类型的凝血障碍相关的综合征有潜在的兴趣。

如上所述，HHALPC产品可以与另一种产品(例如药物、治疗剂、另一种细胞类型或其他生物材料)组合施用或使用。这适用于本文所述的任何施用和治疗用途。特别是，其他治疗产品可以与HHALPC产品基本上同时施用(在相同的药物组合物中或在不同的药物组合物中)或在不同的时间施用(在不同的药物组合物中以及以任何顺序或频率)。无论其他治疗产品是否与HHALPC产品分开施用，所产生的效果可以是协同的，即效果优于预期的加和效果、这样的组分之一的负面影响减轻或消失、和/或这样的组分之一的积极效果通过将其以较低量或较低频率施用来获得。

当HHALPC产品是HHALPC子代时，这些细胞可以以细胞培养物上清液的形式与另一种细胞类型(例如，原代人肝细胞、ADHLSC细胞或为原代细胞、干细胞、间充质细胞和/或祖细胞例如WO2006126219中描述的细胞和肝源的其他祖细胞或干细胞的其他人细胞类型或群体)或其相应的条件化细胞培养基组合施用(在体外条件下先共培养或不先共培养)。HHALPC与另一种细胞类型的组合可以改善人体内的一种和/或另一种细胞类型的治疗效力、植入、归巢、再增殖、增殖和/或稳定性。HHALPC子代可以作为还包含这样另一种细胞类型的制剂的一部分施用，或者可以与其他细胞类型组合但分开施用，例如依次或同时(以任何顺序)施用。这两种细胞类型可以作为细胞的悬液或共培养物施用，或者在其中细胞可以在体外和/或体内生长、增殖和分化的海绵或其他三维结构内施用，包括生物人工肝装置和维持人体内这些细胞的维持的天然或合成基质。HHALPC与另一种细胞类型的条件化细胞培养基的组合可以提供这样的HHALPC子代：其在人体内具有改善的治疗效力、植入、增殖和/或稳定性，并且具有或不具有与另一种细胞类型的条件化细胞培养基的组合物相关的其他有用性质。

或者，当HHALPC产品是HHALPC子代的条件化细胞培养基时，该制剂可以与另一种细胞类型(例如，原代人肝细胞、ADHLSC细胞或为原代细胞、干细胞、间充质细胞和/或祖细胞例如WO2006126219中描述的细胞和肝来源的其他祖细胞或干细胞的其他人细胞类型或群体)或其相应的条件化细胞培养基组合施用。HHALPC子代的条件化细胞培养基与另一种细胞类型的组合可以改善后一种细胞类型在人体内的植入、稳定性、归巢、增殖、再增殖和/或稳定性。再者，HHALPC产品可以作为还包含这样另一种细胞类型的制剂的一部分施用，或者可以与其他细胞类型组合但分开施用，例如依次或同时(以任何顺序)施用。又或者，HHALPC子代的条件化细胞培养基与另一种细胞类型的条件化细胞培养基的组合可以提供具有改善的治疗效力、可能组合本文包含的分泌蛋白的作用的溶液。再者，HHALPC子代的条件干细胞培养基可以作为还包含这样另一种条件化细胞培养基的制剂的一部分施用，或者可以与其他培养基组合但分开施用，例如依次或同时(以任何顺序)施用。

HHALPC产品的施用或治疗用途(类似于ADHLSC细胞或ADHLSC细胞的条件化细胞培养基的施用和治疗用途，如WO2015001124中所述)还可提供意想不到的积极效果。特别是，HHALPC子代或由HHALPC子代获得的条件化细胞培养基的施用或治疗用途可以与用于治疗遗传性疾病的特定需求的蛋白质(例如代谢酶(例如鸟氨酸转氨甲酰酶或UDP-葡萄糖苷酰转移酶1A1)或凝血因子(例如因子VIII、因子IX或因子XI))的施用组合。这样的蛋白质或凝血因子可以与由HHALPC产品(或由ADHLSC细胞或相应的条件化细胞培养基)提供的并且参与相同的代谢途径或生理功能(例如凝血)的蛋白质和酶一起使用，可以获得协同效果。当如上所述将HHALPC产品与另一种产品组合施用或使用时，该其他产品因此可以是用于治疗遗传性疾病的这样的蛋白质，例如代谢酶或凝血因子。此外，药物组合物可以通过冷冻保存为高浓度(1000万/ml，5000万/ml，1亿/ml或更多，在合适的商业溶液如Cryostor中)下的HHALPC产品来产生，所述HHALPC产品通过直接在冷冻保存小瓶内用适当的稀释剂重构药物组合物(不需要分类环境且具有较少的后勤要求)来解冻并施用于患者。

该方法可提供药物组合物，所述药物组合物提供相比于如通常用于治疗酶或凝血因子缺陷的分离的重组蛋白质的施用更长久和/或改善的治疗效果。药物组合物可因此包含(a)如本文所述的HHALPC产品，例如HHALPC子代或其条件化培养基；(b)如本文所述的另一种产品，例如药物、治疗剂、另一种细胞类型或其他生物材料，更特别是用于治疗遗传性疾病的蛋白质，例如代谢酶(例如鸟氨酸转氨甲酰酶或UDP-葡萄糖苷酰转移酶1A1)或凝血因子(例如因子VIII、因子IX或因子XI)；以及(c)可药用载体或稀释剂。在此范围内，可以在制造过程中选择特定类型的HHALPC产品和ADHLSC细胞(例如亚群、细胞系及其部分)，以便为参与给定的代谢途径或生理功能(例如凝血)的一系列蛋白质呈现最合适的生产水平(作为绝对值和/或作为这些蛋白质之间的比例)。例如，可以选择HHALPC或HHALPC子代的特定亚群(和相关的制造过程)，以提供具有适合于不同类型的凝血缺陷症之一，例如血友病(A型与因子缺陷有关；B型与因子IX缺陷有关；C型与因子XI缺陷有关)的多种凝血因子(例如外在因子因子V、因子VII和因子X中的两种或更多种和/或内在因子因子VIII、因子XI、因子XIII、因子XII和因子IX中的两种或更多种)的平衡表达的细胞群(其可以维持为细胞系、沉积的细胞制备物或以其他方式储存)。

通常在组合物和治疗方法中使用HHALPC或HHALPC子代可以为肝病(例如上面列出的肝病)提供治疗效果，但也可以与替代原代肝细胞或肝脏细胞系的体外研究相关联。特别是，HHALPC子代可用于用于评估化合物的效力(如果HHALPC产品表达肝特异性或非特异性疾病的潜在药物靶标)、代谢、稳定性和/或毒性(例如生物或化学实体)的(早期)药理学和毒理学方法。

这样的体外方法和用途通常应包括以下步骤：

(a)提供HHALPC产品的制备物(例如，细胞形式的HHALPC或HHALPC子代、细胞提取物或由HHALPC或HHALPC子代获得的条件化培养基)；

(b)将所述HHALPC产品暴露于选自化学化合物、蛋白质、核酸、脂质、糖、金属、盐、病毒、细菌或细胞的一种或更多种外源组分；以及(c)在暴露于HHALPC产品后检测所述一种或更多种外源组分对HHALPC产品的影响和/或检测所述一种或更多种外源组分的存在、定位或改变。

HHALPC和HHALPC子代可以以高水平表达酶和其他肝特异性蛋白质，这些蛋白质已知代谢作为已经注册的药物、仍在开发中以及临床前评估肝特异性作用的候选药物、或怀疑具有可能是不期望的(即对于肝毒性化合物)或期望的(如果HHALPC和HHALPC子代表达酶和其他肝特异性蛋白质，所述蛋白质已知其本身是肝特异性或非特异性疾病例如癌症的候选药物的靶标，则化合物可以被认为是这种疾病的候选药物)肝特异性作用的任何其他化学物质的大多数化学物质。

通常，由HHALPC或HHALPC子代获得的细胞、细胞提取物或条件化培养基形式的HHALPC产品可以在上述步骤(c)中通过分析一般特征例如细胞形态或活力(例如在细胞毒性测试中)来评估以用于评估化学制剂、无机化合物、生物制剂、细菌、病毒或细胞的代谢、消除和毒理学。然而，可以包括替代或补充的标准，例如肝特异性(或非特异性)蛋白质的上调或下调，或HHALPC产品(例如，HHALPC、HHALPC子代、或细胞提取物、或由HHALPC或HHALPC子代获得的条件化培养基)内蛋白质的任何改变(例如降解、聚集、活化或抑制)。

或者(或者与用于HHALPC或HHALPC子代及衍生的生物材料评估的标准组合)，步骤(c)可涉及分析HHALPC或HHALPC子代和衍生的生物材料如何内化和/或修饰、或不内化和/或修饰这些一种或更多种外源组分。这些分析标准根据文献中描述的外源组分的类型而变化，例如降解、与其他蛋白质结合、细胞培养中的持久性、聚集、感染性(对于病毒)、或分化或活力(对于细胞)。

关于涉及细胞和衍生产品(即细胞提取物、条件化培养基)的体外试验的文献可以提供关于可以如何体外使用细胞形式的HHALPC或HHALPC子代、组合物和衍生的生物材料(即HHALPC产品)的指导，如步骤(a)至(c)所示，例如，关于浓度、时机、培养和测定条件、以及分析技术。类似的测定还可以如下进行：在步骤(a)中向动物(例如非人动物)中引入HHALPC或HHALPC子代，然后在步骤(b)中向动物施用一种或更多种外源组分，以在步骤(c)中确定在这些动物中所述一种或更多种组分是否以及如何修饰HHALPC或HHALPC子代(或相关的生物材料)和/或被HHALPC或HHALPC子代修饰。

HHALPC产品、HHALPC和HHALPC子代特别可以用于涉及如上所述的试剂盒中的上述化学制剂或生物制剂的体内(即，用于这样的细胞的治疗用途)和体外(例如用于药物毒理学用途)方法。特别是，除了这样的细胞(或衍生的生物材料)以外，试剂盒可以包含当将它们暴露于一组化合物(由待测化合物的结构、代谢物和/或浓度的至少一种变化产生)以及有助于比较和评估在涉及使用HHALPC和HHALPC子代的测试中观察到的效果的参照化合物、溶液和/或其他细胞时允许使用和/或检测它们及其活性的其他元素。

因此，HHALPC和HHALPC子代可以提供体外模型，其包含在培养中和批次间随时间稳定的酶的肝细胞样模式的变异性有限的连续且容易获得的细胞，特别是作为“ADMET”(施用、分布、代谢、消除和毒理学)或细胞毒性试验(即关于肝细胞活力和/或功能效力)中原代肝脏细胞的替代细胞。

HHALPC和HHALPC子代可在用于测试用于治疗肝感染的或用于使特别是感染肝和肝细胞的病毒有效复制的试剂的方法中使用。HHALPC和HHALPC子代可以在暴露于病毒(例如肝炎病毒)之前或之后进行分化和/或遗传修饰。然后，可将经感染的细胞群暴露于预定量的用于治疗感染的候选化合物以观察任何有用的效果(例如对病毒复制)、可用于纯化病毒颗粒、或可用于评估病毒感染的任何潜在的体内作用，如对于与丙型肝炎感染、肝纤维化或癌发生有关的其他肝脏祖细胞所示(Wu X等，2012；Wang C等，2012；Torres DM和Harrison SA，2012)。

本文具体提及的所有参考文献的教导均通过引用并入本文。现在将通过以下实施例来说明本发明，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：HHALPC上细胞表面蛋白的分析

材料与方法

HHALPC在细胞培养中的分离和扩增

如在别处(Najimi M等，2007)所述，使用五个不同的人供体，在两步胶原酶灌注、过滤和低速离心后实现肝实质细胞部分的原代培养之后回收HHALPC。将这些肝脏细胞悬浮在用ViaSpan溶液制备的冷冻保存培养基中，然后通过使用合适的小瓶、袋或用于长期储存和保存人细胞的其他系统将其保持在液氮中。冷冻保存的肝细胞悬液通过在37℃下快速解冻并用补充有2.5g/L葡萄糖、0.084g/L碳酸氢盐和5000IE/UI/ml肝素的10×体积的人白蛋白5％洗涤两次。在4℃下以224g离心10分钟后，将细胞沉淀悬浮在所需的细胞培养基中。

将HHALPC在包含4.5g/L葡萄糖(Invitrogen)的补充有10％胎牛血清(Gibco)和1％青霉素/链霉素(Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中的培养瓶上在完全湿润的气氛(5％CO₂)中在37℃下培养。达到80％汇合后，用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)浮起细胞，并以5000个细胞/cm²的密度重新接种。可以通过使用补充的或替代的GMP级试剂使培养基和缓冲液的组成适应良好制造过程的实际要求。使用台盼蓝染料排除法评估回收细胞的活力。

使用BD Lyoplate技术通过流式细胞术筛选细胞表面标志物

使用BD Lyoplate^TM人细胞表面标志物筛选组(Cat.No.560747；BD Biosciences，Heidelberg，Germany)表征HHALPC。该试剂盒包含242个纯化的细胞表面标志物的单克隆抗体，以及评估非特异性背景的同种型对照。使用前，将包含冻干抗体的板以300g离心5分钟。然后将抗体在110μl无菌Dulbecco磷酸盐缓冲盐水(DPBS)中重建。

根据制造商的说明，用从五个供体中的每一个产生的HHALPC进行测定。简而言之，使用0.05％胰蛋白酶-EDTA在第5代收获ADHLSC。在DPBS中洗涤后，将细胞以1.25×10⁶个细胞/ml的浓度重悬于包含5mM EDTA的Pharmingen染色缓冲液中。然后将每孔80微升细胞悬液转移到96孔板中，并用20μl特异性一抗在冰上染色30分钟。此后，将细胞用包含5mM EDTA的Pharmingen染色缓冲液洗涤两次，并用100μl Alexa Fluor 647标记的抗小鼠或抗大鼠二抗(在包含5mM EDTA的Pharmingen染色缓冲液中1∶200稀释)在冰上染色30分钟。洗涤后，用BD Cytofix固定缓冲液固定细胞，并从96孔板转移至单个BD FACS管。使用FACSDiva软件用BD FACS Canto II细胞计数器对10,000个细胞测量荧光。为了分析，使用FlowJo软件基于其适当的同种型为每个样品手动设置背景荧光。结果表示为群体中阳性细胞的百分比或中值荧光强度(MFI)。

通过流式细胞术与其他抗体表征HHALPC

收获细胞，以500至1000/μl的浓度悬浮在PBS缓冲液(目录号SH30028.03，ThermoFisher)中，并用以制造商指示的浓度使用的、特异性针对指定抗原的下列荧光染料标记的抗体或根据BD Lyoplate中包含的用于抗体的说明在4℃下孵育30分钟。相应的对照同种型抗体用于评估单克隆抗体的非特异性结合。然后洗涤细胞并悬浮在PBS/BSA中，以用于用BDBiosciences FACSCanto II流式细胞仪读数。

对于CXCR4(CD184)染色，首先将肝脏细胞与1.5％的DPBS-牛血清白蛋白(BSA)在4℃下孵育20分钟以防止非特异性结合。接下来，用1.5％的DPBS-BSA洗涤细胞，并用5μl PE大鼠抗人CXCR4/CD184、APC小鼠抗人CD90或它们各自的同种型(BD Biosciences)在冰上染色30分钟。最后，使用稳定化固定剂(BD Biosciences)洗涤并固定细胞。对于细胞内染色，将肝脏细胞固定并用200μl细胞混合/细胞质缓冲液(BD Biosciences)在4℃下透化20分钟。然后用稳定化(perm)/洗涤缓冲液洗涤细胞，并用稀释在稳定化/洗涤中的PE大鼠抗人CD184或其同种型在冰上染色30分钟。接下来，将细胞洗涤两次并用稳定化固定剂(BDBiosciences)固定。使用FACSDiva软件用BD FACS Canto II细胞计数器对10,000个细胞测量荧光。用FlowJo软件进行数据分析。用抗CD90抗体的对照染色证实了在这些实验条件下方案的正确性。

实时PCR

按照制造商的说明使用TriPure分离试剂(Roche，Mannheim，Germany)从四个供体中提取总RNA。简而言之，将1.5×10⁶个细胞在TriPure试剂中均化，与氯仿混合，剧烈摇动15秒，并在4℃下以12,000g离心15分钟。将上层水相中的RNA通过异丙醇沉淀，在75％乙醇中洗涤，空气干燥，并溶解在不含RNase的水中。在用NanoDrop 2000分光光度计(ThermoScientific)定量后将RNA样品在-80℃下储存。使用高容量试剂盒(Applied Biosystems)通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)由1μg总RNA合成cDNA。此后，按照制造商的说明，将10ngRT产物沉积在阵列人细胞外基质和黏附分子(Invitrogen)的每个孔中。使用Applied Biosystems StepOnePlus实时PCR系统读板。

结果

ADHLSC细胞和HHALPC都是可来源于使用正常成年人肝(分别在非GMP和GMP条件下)产生的冷冻保存的人原代肝脏细胞的制备物，并且可以在体外分化成具有肝细胞样活性和形态的细胞，其中具有ADHLSC细胞、HHALPC和肝细胞共有的某些标志物以及将HHALPC区分为间充质干/基质细胞的其他标志物(Najimi M等，2007)。

然而，间充质干/基质细胞(MSC)例如ADHLSC细胞和HHALPC对包括肝病在内的许多疾病的治疗益处高度依赖于其GMP制备物对实际植入水平的影响。已知这样的细胞表达至少一些与植入水平相关的受体，并且共有类似于白细胞和造血干细胞的植入受损器官的机制，其依赖于多种受体以进行滚动、牢固黏附和通过内皮的迁移。细胞培养传代和条件可能影响这些受体如何在用于人用途的细胞制备物中实际存在并起作用。

HHALPC需要特定的制造和质量标准，例如符合GMP条件，提高的生长率和群体倍增水平，以及在冷冻保存和临床使用之前符合质量规格(即细胞必须保持可存活和未分化，呈现给定的阳性/阴性标志物的组合，同时保持向功能性肝细胞分化的能力)。该扩增过程(其需要一些细胞培养参数的优化)最初在多托盘堆(例如Corning CellStack)中完成，然后转移到多板生物反应器(例如PALL Xpansion 10)，这证实了肝脏祖细胞例如HHALPC可以以工业规模提供，具有均一的质量和数量(Egloff M等，2013)。将HHALPC在塑料上进行大规模培养条件下培养并扩增5代(在没有EGF的情况下进行处理以促进黏附)，然后使用BD Lyoplate^TM试剂盒，通过流式细胞仪在细胞表面蛋白水平上进行全面筛选，以使用由五种不同肝供体产生的HHALPC(表1)确定GMP制备物对于一组超过200种人细胞表面标志物的影响，所述表面标志物覆盖共刺激分子、细胞因子/趋化因子受体等。

对来自所有五个供体的细胞测量为细胞表面上的一系列间充质标志物为阳性，同时具有黏附特性、一系列四次跨膜蛋白(包括特别感兴趣的CD81，因为它负责肝细胞对疟原虫感染的宽容性(permissiveness)；Yalaoui S等，2008)、氨基酸转运蛋白例如CD98，以及仅一种特异性趋化因子受体(CD140b，对应于PDGFRβ)，而所有其他细胞因子受体看起来都没有暴露在HHALPC细胞表面。其他标志物(包括一些黏附标志物(CD54、CD164、CD165和CD166)、细胞表面受体(CD95)和补体相关蛋白(CD46、CD55和CD59))仍然检测为一致，但在所有供体中处于较低水平(表格1)。信号强度证实HHALPC以非常低的水平表达其他细胞谱系(造血、上皮和/或内皮)的细胞表面标志物，例如CD45、CD117、CD34或HLA-DR。此外，一致地发现一些其他MSC/多能性标志物在所有供体中强烈表达，包括CD13和有趣的CD105，与ADHLSC细胞相比，其在细胞表面上的表达在CellBIND上培养后显著提高(Najimi等，2007)。

作为ADHLSC细胞的HHALPC并未在所有供体中表达用于免疫应答诱导和免疫调节的主要受体(例如CD1、CD7、CD70、HLA-/-DR、CD27、CD28、CD40、CD80或CD112)，这证实了它们免疫原性不良的表型。这些细胞在所有供体中以多种水平表达一些黏附标志物(包括CD26、CD49a、CD49d、CD58、CD61、CD71、CD142、CD146、CD201、CD340和HLA-A/-B/-C；表1)。根据细胞的最终用途(作为针对特定患者的治疗用途)，当在HHALPC中发现时，上述定义为与HHALPC可变相关的那些标志物可被认为是有用的阳性标志物或阴性标志物。

表1：通过BD Lyoplate测定的HHALPC的一般特征。

包含在测定中的其他细胞表面标志物被表征为以非常低的水平表达或阴性表达，包括先前针对ADHLSC细胞表征的细胞表面标志物(例如CD34、CD45、CD117和HLA-DR)，或未对ADHLSC细胞表征而针对免疫应答表征(包括CD28、CD30、CD200、CD229、CD275、CD279、CD300和CD357)。

HHALPC还可对与细胞表面蛋白无关的一系列其他标志物和活性测量为阳性。从在特定临床适应症中使用HHALPC和优化制造过程的角度来看，可以通过识别允许表征细胞质量和优化该过程的每个步骤(即原代肝脏细胞的选择、细胞培养条件、配方、储存和/或患者的选择)的其他标志物(为细胞表面蛋白、分泌蛋白或与酶活性相关)来改进初始标准。在这组数据的基础上，对HHALPC和人原代肝脏细胞的所有样本的基于蛋白质组学/转录组学的另外比较可暗示其他相关标志物，其可以在单标志物分析或多重平行分析的水平(例如，通过使用除了包含在BD Lyoplate^TM试剂盒中的那些之外的细胞表面标志物的抗体)使用流式细胞术、ELISA或其他商业试剂盒进行测试。

BD Lyoplate阴性数据在mRNA水平上证实了某些标志物，例如CD162(PSGL-1)、岩藻糖基转移酶IV(SSEA-1)或唾液酸-Lewis X(SLeX)、E-选择素结合在它们表面上所必需的PSGL-1的四糖组分。不存在向受体例如CD44提供黏附相关的糖的这种酶使得这些受体即使在细胞表面上表达，也可能不具有作为黏附蛋白的功能。其他受体例如VLA-2(CD49b，与胶原蛋白结合)、VLA-3(CD49c，与层黏连蛋白结合)和VLA-5(CD49e，与纤连蛋白结合)在mRNA水平和流式细胞仪检测中均为高水平(图1A)。对于VLA-4没有证实相同的观察结果(只有它的β亚基CD29强烈表达，而不是它的α亚基CD49d，或者由于在细胞制备过程中进行操作导致其部分细胞外结构域的丧失)，并且最重要的是CXCR4/CD184。

CXCR4表达是参与HSC和MSC的植入/归巢过程的重要蛋白质。在损伤部位，CXCR4结合释放的SDF-1，这促进细胞向器官的迁移(Marquez-Curtis LA和A Janowska-Wieczorek，2013)。在细胞输注期间使用CXCR4拈抗剂AMD3100显示抑制MSC向急性肾损伤的迁移(Liu N等，2013)。然而，据报道，在MSC分离后CXCR4表达迅速降低，并且在几次传代后仅有非常小百分比的细胞或根本没有细胞表达CXCR4(Wynn RF等，2004)。事实上，作为细胞适应培养条件的一种方式，MSC的体外扩增诱导CXCR4的逐步内化，直至其表面上没有CXCR4残留(Pelekanos RA等，2014)。因此，通过流式细胞术在每次传代时评估CXCR4的表面表达，并且已经发现，当细胞未透化时，所有测试的供体显示出非常低的表面受体表达。然而，当细胞透化时，大部分细胞群体表达CXCR4，表明大部分细胞群体已经开始内化CXCR4(图1B)。

一些研究小组决定在MSC表面诱导CXCR4外化，这是增强MSC归巢的关键。已经使用不同的方法来上调CXCR4，例如在丙戊酸(Gul H等，2009)、SDF-1(Jones GN等，2012)、或细胞因子混合物(Shi M等，2007)存在下培养。然而，细胞因子混合物以及与SDF-1预孵育看起来都不会对CXCR4外化产生任何影响，这为开发具有改善的植入性质的HHALPC留下了其他可能性。

HHALPC对不同蛋白质类别的有限数量的细胞表面标志物的强烈阳性允许使用抗体例如抗CD140b、抗CD105、抗CD9、抗CD47、抗CD49c、抗CD49e、抗CD29、抗CD147、抗CD73、抗CD81、抗CD151和/或抗CD98来用于评估HHALPC在其制造期间和/或之前的质量、纯度和/或特性。连同文献(Najimi M等，2007)和(如果可用)提供初始原代肝脏细胞制备的人对象的临床信息中列出的其他标准，检测上面列出的细胞表面标志物可以允许进一步优化用于施用HHALPC的最合适的治疗用途和/或人对象。

通过在来自不同供体的不同HHALPC制备物中使用BD Lyoplate获得的发现为鉴定哪些其他标志物和生物活性可与HHALPC相关、并且随后改善其GMP制造及其体外或体内用途提供了指导。然而，对于HHALPC植入重要的一些黏附蛋白的表达模式可能是由培养过程导致的。多种细胞表面标志物的鉴定将有助于确定哪种GMP细胞培养条件可以改善细胞植入，从而改善HHALPC对医学用途的适应性，所述医学用途需要用肝活性细胞重新填充人肝(如某些先天性代谢性肝病或急性/创伤性主要的肝损伤，或替代肝移植)，以及可能使用这些细胞全身性地递送酶、生长因子和其他蛋白质，这些蛋白质由功能性肝细胞天然表达(如那些在患有相关疾病的患者的情况下与凝血、肝硬化、或纤维化相关的)或由转基因HHALPC适当表达的非肝蛋白质(如可用于治疗多种适应症(例如癌症、糖尿病、或炎性疾病)的抗体或激素)。在文献中已经回顾了用于验证HHALPC在肝再填充和再生方面的施用的其他临床前模型和方法(参见书″Liver Regeneration Basic Mechanisms，Relevant Models andClinical Applications″，编：Udayan M.Apte，Elsevier 2015)。

实施例2：HHALPC治疗性质的验证

材料与方法

HHALPC制备和向受尿素循环障碍影响的患者施用

HHALPC由健康人肝脏细胞悬液产生，并扩增5代，如实施例1所示，然后收获，在CryoStor-10(10％二甲基亚砜)中冷冻保存，并储存在液氮中。使用前，将HHALPC解冻并用白蛋白溶液洗涤，然后在GMP设施的无菌环境中在50ml塑料袋中配制成在0.084碳酸氢钠、5％人白蛋白和500IU肝素中的包含250x10⁶个细胞的细胞悬液。HHALPC通过经皮经肝门静脉导管静脉以0.5至2ml/分钟的流速输注，其中在全身麻醉下，在放射学和超声引导下，通过右/左门静脉直接经肝穿刺至脾门静脉汇合处的主门静脉插入。每次输注均在比伐卢定的温和抗凝治疗下进行(Stephenne X等，2012)，随后是伴随治疗(免疫抑制治疗和每位患者对尿素循环障碍的常规治疗)。

根据这些疾病的标准方案监测患者。另外，使用稳定的非放射性同位素评估体内尿素生成，通过测量以醋酸钠的形式摄入的¹³C标记的前体中进入血浆中的¹³C来评估实际的尿素循环活性，如文献中所述。(Yudkoff M等，2010)。

HHALPC制备和向受血友病影响的患者施用

如实施例1和以上所述制备HHALPC，但在其最终制剂之前被部分放射性标记并使用111-铟(¹¹¹In)施用。简而言之，将2500万HHALPC悬浮于5mL NaCl 0.9％中，在室温下用浓度为20μCi/1.10⁶个细胞的¹¹¹In-DTPA在温和振荡下孵育15分钟。然后洗涤细胞，用剂量校准器(Capintec Radioisotope Calibrator CRC12)测量标记效率并如下计算：[来自细胞的放射性]/[来自(上清液+细胞)的放射性]×100。标记效率估计为79％。

在补充有葡萄糖(0.025g/L，Stereop)、6.5mg/mL碳酸氢钠(B52 Braun)、10UI/mL肝素(LeoPharma)和0.78％Lysomucyl(Zambon)的5％人白蛋白(Hibumine，Baxter)中配制HHALPC(放射性标记或未放射性标记)。HHALPC通过放置在前臂的外周静脉导管输注，一次初始输注用铟标记的2500万个细胞，然后进行每2周2.5亿个细胞的四次输注。在细胞输注期间和之后进行心肺和凝血参数的临床监测。在该输注期间，进行了用重组因子VIII预防性治疗和标准免疫抑制(用甲基强的松龙和他克莫司)二者。将血液因子VIII水平的剂量和凝血曲线(包括血栓弹性图)作为生化反应评估参数。评估患者的因子VIII需求和临床出血特征。

通过SPECT成像进行在输注的整个持续时间期间的动态采集和在细胞输注后的指示时间点的全身成像采集。用PMOD分析程序将¹¹¹In-DTPA信号的肝保留计算为目标区域与全身摄取之比。

结果

HHALPC施用代表了需要重建受损的肝组织(例如，由于病毒感染、接触有毒化合物、纤维化疾病或癌症而导致的慢性或急性损伤)或表达在细胞内水平(例如用于代谢功能)或细胞外区室中发挥其活性(例如，作为在肝组织内发挥免疫调节活性或在通过血液循环运输这些蛋白质的组织中的其他活性的分泌蛋白质)的功能性蛋白质的肝细胞的一系列遗传性或后天性疾病的治疗解决方案。根据患者的病症和状态，可以使用不同的适当方法制备、配制和施用HHALPC。

已经在临床环境中测试了HHALPC的治疗用途，证明HHALPC是具有多种目的特性并且适合于多种施用方式和适应症的细胞治疗产品。

作为第一个实例，HHALPC施用可以提高患有尿素循环障碍的患者的尿素生成，所述尿素循环障碍是与显著的医学并发症和有限且姑息性治疗相关的遗传性代谢疾病，其给患者和家庭带来沉重的负担。基于细胞的治疗，至少在同种异体肝移植变得可行之前，可以提供足够的代谢肝功能以减弱临床过程。

可以通过门静脉途径输注包含充分表征的HHALPC的GMP产生的药物组合物。在第一项涉及具有不同疾病、体重和年龄的儿科患者的研究中，HHALPC以不同剂量(12.5x10⁶至200x10⁶个细胞/kg，在1至4天内可变数量的输注)施用，在几个月内测量一系列代谢和安全标准。特别是，HHALPC对尿素循环功能的代谢作用通过使用标记的尿素前体测量体内尿素来评估。这种与疾病相关的生物活性看起来受到HHALPC施用的积极影响，其已经在慢性长期支持性治疗的患者(如氮清除剂)中得到容忍(图2)。

另一个实例是A型血友病，一种由凝血因子VIII缺乏引起的X连锁出血性疾病，其中通过预防性、定期静脉内注射施用于患者。这种当前的护理标准与几个患者中的中和性抗因子VIII抗体的产生有关，其效力受损并且治疗成本提高(参见Kabel A，2014，关于出血性疾病及其医疗管理的综述)。正在进行这样的基于细胞的治疗，其允许以内源性和局部方式提供因子VIII，可以为患者提供更长的反应持续时间，并且具有较少的并发症。由于肝本身是因子VIII合成的主要部位并且间充质干细胞已被证明可控制血友病动物模型中的出血，因此植入人肝脏的并且免疫原性差的肝来源的祖细胞(例如HHALPC)可用于为A型血友病的患者提供因子VIII，以至少用于降低重组外源因子VIII的施用。

通过静脉内施用HHALPC治疗了患有严重A型血友病且伴有反复发作的关节紊乱导致右踝残疾(尽管以高剂量预防性注射因子VIII)的患者。这种临床静脉输注天然表达因子VIII的细胞如HHALPC与常规因子VIII施用同时进行，并且之后进行相关组织中的生物分布水平和分析以及患者对因子VIII需要的影响(图3)。输注期间的成像显示标记的HHALPC最初被限制在肺中，但随后在1小时内迅速检测到肝中的细胞，其水平远高于肺和脾。有趣的是，在输注后4小时，HHALPC也可以在右脚踝中检测到，这是患者反复发生的关节积血(haemarthrosis)的部位，这表明HHALPC也可为这种疾病提供潜在的缓解。事实上，在HHALPC注射结束后的15周内，患者的因子VIII需求急剧下降，只有在出血发作时才注射因子VIII。在该响应期间，生化标志物没有显示任何显著变化，但患者在进行体力活动时观察到更少的出血事件，即使没有事先预防性因子VIII输注，其中单次发作的关节积血需要1000IU的因子VIII用于缓解，而一般来说他会为同样的结果注入5000IU。在没有预防性因子VIII注射的情况下，他主观感受到能够在没有出血事件的情况下进行更严格的身体活动。

因此，HHALPC提供了可以根据不同方案、制剂和临床环境使用的药物产品，以实现不仅与代谢型肝相关活性相关、而且与例如因子VIII(或其他蛋白质)的蛋白质分泌相关的治疗效果，其可以在不同位置，例如在关节内发挥凝血剂或免疫调节作用，减少直接或间接靶向这些位置的其他药物的使用。

在另一个实例中，在患有尿素循环障碍的患者中进行HHALPC的静脉内施用，以监测容忍性和潜在的副作用、并在输注后探索HHALPC在肝脏中的分布。在GMP条件下产生HHALPC的批次，并且施用于患有OTC缺陷的患者，其中氨和谷氨酰胺血液水平升高并且精氨酸和瓜氨酸血液水平低。

患者接受940×10⁶个祖细胞(16.3×10⁶个细胞/Kg体重)(每次施用235×10⁶个细胞)。在重建后评估细胞的生存力为84％至88％。HHALPC通过外周导管静脉输注。在每次输注过程中，与比伐卢定(1.75mg/Kg/小时)平行地施用静脉葡萄糖作为血栓形成的预防措施。在每个输注阶段收集ACT测量值(对新鲜全血测量的活化凝血时间(ActivatedCoagulation Time))，但在输注期间没有记录到异常ACT值(所有ACT值低于350秒)。给予患者的免疫抑制治疗包括每日剂量为1.5mg的依维莫司(Certican)。

紧接输注期后，血氨水平在2个月时期内稳定。此后，患者倾向于显示更高的血浆氨水平，但血液谷氨酰胺水平在更长时间中正常化(图4)。细胞输注后的临床评估显示出一些临床改善。首次输注后5个月，研究者将患者描述为更具活力、反应为对患者自己报告的疲劳发作的降低。

因此，对于不同的病理学并使用不同的施用方法、方案和剂量，显示出由于基于HHALPC的治疗而产生的临床改善。

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Claims (16)

1.成体肝脏祖细胞，其特征在于所述细胞对以下测量为阳性：

(a)间充质或多能标志物CD13、CD73、CD90和CD105；

(b)黏附标志物CD29、CD44、CD47、CD49b、CD49c、CD49e和CD147；

(c)四次跨膜蛋白CD9、CD63、CD81和CD151；以及

(d)CD98、CD140b和β2-微球蛋白。

2.权利要求1所述的细胞，其特征在于所述细胞对以下测量为阳性：

(a)选自黏附标志物CD54、CD164、CD165和CD166的至少一种标志物；和/或

(b)选自CD46、CD55、CD59和CD95的至少一种标志物。

3.权利要求1或2所述的细胞，其特征在于所述细胞对选自以下的至少一种标志物测量为阳性：CD26、CD49a、CD49d、CD58、CD61、CD71、CD142、CD146、CD201、CD340和HLA-A/-B/-C。

4.权利要求1或2所述的细胞，其特征在于所述细胞对选自以下的至少一种标志物测量为阴性：

(a)CD26、CD49a、CD49d、CD58、CD61、CD71、CD142、CD146、CD201、CD340和HLA-A/-B/-C；和/或

(b)CD45、CD117、CD34和HLA-DR中的一种或更多种。

5.权利要求1至4所述的细胞，其特征在于所述细胞进一步测量为：

(a)对选自白蛋白、HNF-4和CYP3A4的至少一种肝标志物为阳性；

(b)对选自波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白(ASMA)的至少一种间充质标志物为阳性；以及

(c)对细胞角蛋白-19(CK-19)为阴性。

6.权利要求1所述的细胞，其特征在于所述细胞测量为：

(a)对CD13、CD73、CD90、CD105、CD29、CD44、CD47、CD49b、CD49c、CD49e、CD147、CD9、CD63、CD81、CD151、CD98、CD140b、β2-微球蛋白、CD54、CD164、CD165、CD166、CD46、CD55、CD59、CD95、白蛋白和波形蛋白为阳性；以及

(b)对CD45、CD117、CD34和HLA-DR以及细胞角蛋白-19为阴性。

7.分离的细胞群，其包含至少60％、或60％至99％、或70％至90％的前述权利要求中任一项所述的细胞。

8.前述权利要求中任一项所述的细胞或细胞群，其中所述细胞群分化成呈现肝特异性活性的细胞。

9.前述权利要求中任一项所述的细胞或细胞群，其中所述细胞或群通过一种或更多种化学试剂、细胞培养基、生长因子和/或核酸载体进行修饰。

10.从权利要求1至9中任一项所述的细胞或细胞群分离的生物材料，其中所述生物材料是包含一种或更多种分离的蛋白质、核酸、代谢物和/或抗原的条件化细胞培养基、蛋白质提取物、膜囊泡、或其任何级分。

11.组合物，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的细胞或细胞群、或包含权利要求10所述的生物材料。

12.权利要求1至9中任一项所述的细胞或细胞群、权利要求10所述的生物材料、或权利要求11所述的组合物，其用于治疗肝病。

13.权利要求1至9中任一项所述的细胞或细胞群、权利要求10所述的生物材料、或权利要求11所述的组合物，其用于治疗遗传性凝血障碍。

14.用于评估一种或更多种化合物的效力、代谢、稳定性和/或毒性的方法，所述方法包括：

(a)提供权利要求1至9中任一项所述的细胞或细胞群、权利要求10所述的生物材料、或权利要求11所述的组合物；

(b)将所述细胞、所述细胞群、所述组合物或所述生物材料暴露于一种或更多种化合物；以及

(c)在暴露于所述细胞、所述细胞群、所述组合物、或所述生物材料之后，检测所述一种或更多种化合物对所述细胞、所述细胞群、所述组合物、或所述生物材料的作用和/或检测所述一种或更多种化合物的存在、定位、或修饰。

15.权利要求1至9中任一项所述的细胞或细胞群、权利要求10所述的生物材料、或权利要求11所述的组合物用于评估一种或更多种化合物的效力、代谢、稳定性和/或毒性的用途。

16.试剂盒，其包含权利要求1至9中任一项所述的细胞或细胞群，权利要求10所述的生物材料、或权利要求11所述的组合物。