JP2017222581A - 肝臓組織再生用組成物 - Google Patents
肝臓組織再生用組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017222581A JP2017222581A JP2016117367A JP2016117367A JP2017222581A JP 2017222581 A JP2017222581 A JP 2017222581A JP 2016117367 A JP2016117367 A JP 2016117367A JP 2016117367 A JP2016117367 A JP 2016117367A JP 2017222581 A JP2017222581 A JP 2017222581A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- composition
- liver
- human
- stem cells
- dental pulp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 101
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 title claims abstract description 50
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 210000005258 dental pulp stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 65
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 claims abstract description 51
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 claims description 16
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 12
- 208000008338 non-alcoholic fatty liver disease Diseases 0.000 claims description 10
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 6
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 claims description 5
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 claims description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 5
- 206010019663 Hepatic failure Diseases 0.000 claims description 4
- 238000009098 adjuvant therapy Methods 0.000 claims description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 claims description 4
- 208000007903 liver failure Diseases 0.000 claims description 4
- 231100000835 liver failure Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000003393 splenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 claims description 3
- 102100024210 CD166 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 claims description 3
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 claims description 3
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 claims description 3
- 101000980840 Homo sapiens CD166 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000881679 Homo sapiens Endoglin Proteins 0.000 claims description 3
- 101000935043 Homo sapiens Integrin beta-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000610551 Homo sapiens Prominin-1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 claims description 3
- 101000800116 Homo sapiens Thy-1 membrane glycoprotein Proteins 0.000 claims description 3
- 102100025304 Integrin beta-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100040120 Prominin-1 Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 claims description 3
- 102100033523 Thy-1 membrane glycoprotein Human genes 0.000 claims description 3
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 claims description 3
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims description 3
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims description 3
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 claims description 3
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 38
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 description 31
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 30
- 229940072288 prograf Drugs 0.000 description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 13
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 13
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 12
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 12
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 11
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 11
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 8
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 8
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 8
- 210000004489 deciduous teeth Anatomy 0.000 description 8
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 8
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 7
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 7
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 7
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 6
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 6
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 6
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 6
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 6
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 6
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004357 third molar Anatomy 0.000 description 5
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 4
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 4
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 3
- 102000003745 Hepatocyte Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000100 Hepatocyte Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 3
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 2
- 101710113083 Carbamoyl-phosphate synthase Proteins 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 2
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 2
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 210000004262 dental pulp cavity Anatomy 0.000 description 2
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 2
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 2
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 2
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDBGGTQNNUOQRC-UHFFFAOYSA-N Allidochlor Chemical compound ClCC(=O)N(CC=C)CC=C MDBGGTQNNUOQRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N Chlorhexidine Chemical compound C=1C=C(Cl)C=CC=1NC(N)=NC(N)=NCCCCCCN=C(N)N=C(N)NC1=CC=C(Cl)C=C1 GHXZTYHSJHQHIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000031226 Hyperlipidaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 210000000013 bile duct Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229960003260 chlorhexidine Drugs 0.000 description 1
- 108010023417 cholesterol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000001968 dental pulp cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- CPTNXTSDQJQEFA-ZKOWQLKRSA-N mastoparan-A Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(N)=O)=CNC2=C1 CPTNXTSDQJQEFA-ZKOWQLKRSA-N 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 244000309715 mini pig Species 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004537 pulping Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011425 standardization method Methods 0.000 description 1
- 108010085346 steroid delta-isomerase Proteins 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【課題】肝臓組織再生用組成物、特には、肝疾患の治療ための肝臓組織再生用組成物を提供する。
【解決手段】肝臓組織再生用組成物に、有効成分としてヒト歯髄幹細胞を含有させる。
【選択図】なし
【解決手段】肝臓組織再生用組成物に、有効成分としてヒト歯髄幹細胞を含有させる。
【選択図】なし
Description
本発明は、肝臓組織再生用組成物、特には、肝疾患の治療のための肝臓組織再生用組成物に関する。
従来、各種組織の修復や再生、疾患の治療を目的として細胞移植が行われてきた。細胞移植は、組織を構成する細胞自体または組織の構築を補助する細胞を成体に投与するものであることから直接的な治療効果が期待される。例えば、肝臓組織の再生や肝疾患の治療の分野において、これまでの前臨床研究および臨床研究では、例えばＣＤ３４陽性骨髄幹細胞を肝臓等に移植することがなされてきた（例えば、非特許文献１）。しかしながら、肝疾患の治療という観点からは、このようなＣＤ３４陽性骨髄幹細胞の移植では、肝疾患の若干の改善が見られるにとどまり、治癒には程遠く、余命または死体肝移植・生体肝移植を待つ期間を長くする程度の効果があるに過ぎなかった。
一方で、歯髄幹細胞は、乳歯や智歯といった、従来は廃棄されていた脱落歯や抜去歯から容易に採取可能であることから、組織の再生や疾患の治療に利用できる幹細胞として期待されている。しかしながら、これまで、歯髄幹細胞から肝臓細胞を分化・成熟させ、肝臓組織を哺乳動物体内で大量に作製（再生）する方法は未だ確立されていない。また、歯髄幹細胞を用いて肝疾患を治療する方法についても確立していないのが現状である。
Nakamura et al., Journal of Gastroenterology and Hepatology, Vol. 29, 2014, pages 1830-1838
本発明者は、今般、鋭意研究を行った結果、特定の歯髄幹細胞を用い、肝臓組織を効果的に再生し得ることを見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。
したがって、本発明は、ヒト歯髄幹細胞を有効成分として含む、哺乳動物の肝臓組織再生用組成物を提供することを目的とする。
すなわち、本発明としては、具体的には以下のものが例示される。
［１］ヒト歯髄幹細胞を有効成分として含む、哺乳動物の肝臓組織再生用組成物。
［２］前記ヒト歯髄幹細胞が肝細胞に分化している、［１］に記載の肝臓組織再生用組成物。
［３］前記ヒト歯髄幹細胞がヒト乳歯歯髄幹細胞である、［１］または［２］に記載の肝臓組織再生用組成物。
［４］前記ヒト歯髄幹細胞が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１３３を発現しない、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［５］ヒトの肝疾患を治療するための、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［６］非ヒト哺乳動物の肝疾患を治療するための、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［７］肝疾患の治療の対象となる前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の体重１５ｋｇ当たり５×１０６〜４×１０１０個のヒト歯髄幹細胞が、前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与される、［５］または［６］に記載の肝臓組織再生用組成物。
［８］前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の脾洞に投与される、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［９］前記肝疾患が、肝臓がん、肝不全、肝硬変、肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患および転移性がん、ならびに、がんの化学療法に起因する副作用に対し補助療法を必要とする病態からなる群から選択される、［５］〜［８］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［１］ヒト歯髄幹細胞を有効成分として含む、哺乳動物の肝臓組織再生用組成物。
［２］前記ヒト歯髄幹細胞が肝細胞に分化している、［１］に記載の肝臓組織再生用組成物。
［３］前記ヒト歯髄幹細胞がヒト乳歯歯髄幹細胞である、［１］または［２］に記載の肝臓組織再生用組成物。
［４］前記ヒト歯髄幹細胞が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１３３を発現しない、［１］〜［３］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［５］ヒトの肝疾患を治療するための、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［６］非ヒト哺乳動物の肝疾患を治療するための、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［７］肝疾患の治療の対象となる前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の体重１５ｋｇ当たり５×１０６〜４×１０１０個のヒト歯髄幹細胞が、前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与される、［５］または［６］に記載の肝臓組織再生用組成物。
［８］前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の脾洞に投与される、［１］〜［７］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
［９］前記肝疾患が、肝臓がん、肝不全、肝硬変、肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患および転移性がん、ならびに、がんの化学療法に起因する副作用に対し補助療法を必要とする病態からなる群から選択される、［５］〜［８］のいずれか一つに記載の肝臓組織再生用組成物。
本発明によれば、容易に採取可能なヒト歯髄幹細胞を用いて、哺乳動物の肝臓組織再生を行うことが可能となる。また、本発明によれば、非アルコール性肝疾患（Non-Alcoholic Fatty Liver Disease（ＮＡＦＬＤ））をはじめとする肝疾患の治療を効果的に行うことが可能となる。
本発明の肝臓組織再生用組成物は、ヒト歯髄幹細胞を有効成分として含んでなる。本発明の組成物に含まれるヒト歯髄幹細胞は、ヒトの乳歯、永久歯または智歯（親知らず）のいずれに由来するものであってもよいが、脱落乳歯または智歯に由来する歯髄幹細胞であることが好ましい。
本発明において用いられる歯髄幹細胞は、本発明を実施する前に予め調製したものを使用してもよく、また、一般に市販されているものを使用してもよい。本発明の組成物における歯髄幹細胞を調製する場合、歯髄幹細胞を採取する個体は、当該歯髄幹細胞を含む本発明の組成物の適用対象となる個体と同一の個体または異なる個体のいずれであってもよい。歯髄幹細胞を採取する個体と、当該歯髄幹細胞を含む本発明の組成物の適用対象となる個体とが異なる場合、両個体のヒト白血球抗原（HLA：Human Leucocyte Antigen）型が一致していることが必須であり、両個体がHLA型の一致する近親個体であることがより好ましい。これらのうち、組成物適用時の拒絶反応の発生を抑制し生着効率および再生効率を高めるという観点から、本発明の組成物においては、本発明の組成物の適用対象となる個体と同一の個体から採取された歯髄幹細胞を用いることが最も好ましく、次いでHLA型が一致する近親者の歯髄幹細胞を用いることが好ましい。一方、一般に市販されているヒト歯髄幹細胞としては、例えば、ヒト歯髄幹細胞（ＣＬＩ社製、製品番号：３００７０２−ＳＦ）やｈＤＰＳＣ−歯髄幹細胞（ロンザジャパン株式会社製、製品番号：ＰＴ−５０２５）等が挙げられる。
本発明において、予め調製した歯髄幹細胞を用いる場合の、歯髄幹細胞の採取および処理方法の一例を以下に示す。この採取および処理方法では、（１）歯髄の採取、（２）酵素処理、（３）細胞培養、（４）細胞の回収を順に行う。
（１）歯髄の採取
自然脱落直前に抜去したヒトの乳歯または親知らずなどの永久歯をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液で消毒した後、滅菌した抜髄針またはスプーンエキスカベータ―を用いて、歯根管または歯髄腔を介して歯髄組織を採取する。
自然脱落直前に抜去したヒトの乳歯または親知らずなどの永久歯をクロロヘキシジンまたはイソジン溶液で消毒した後、滅菌した抜髄針またはスプーンエキスカベータ―を用いて、歯根管または歯髄腔を介して歯髄組織を採取する。
（２）酵素処理
採取した歯髄組織を、それぞれ４ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩおよびディスパーゼにより、３７℃で１時間処理する。
採取した歯髄組織を、それぞれ４ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩおよびディスパーゼにより、３７℃で１時間処理する。
（３）細胞培養
酵素処理により得られた細胞懸濁液を、面積２５ｃｍ２のディッシュに播種し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、ＣＯ２濃度５％の下で培養する。培養細胞が８５〜９０％のコンフルエントに達するまで細胞を培養し、面積２５ｃｍ２の新たなディッシュに約１０５個／ｃｍ２となるように播種する。
酵素処理により得られた細胞懸濁液を、面積２５ｃｍ２のディッシュに播種し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、ＣＯ２濃度５％の下で培養する。培養細胞が８５〜９０％のコンフルエントに達するまで細胞を培養し、面積２５ｃｍ２の新たなディッシュに約１０５個／ｃｍ２となるように播種する。
（４）細胞の回収
培養細胞を、トリプシン処理等によりディッシュから剥離した後、遠心処理を施すことによって細胞を回収して、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ：Hanks’ Balanced Salt Solution）に約２×１０６個／１００μｌとなるように再懸濁する。このようにして回収した細胞を、本発明で使用する歯髄幹細胞として用いる。
培養細胞を、トリプシン処理等によりディッシュから剥離した後、遠心処理を施すことによって細胞を回収して、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ：Hanks’ Balanced Salt Solution）に約２×１０６個／１００μｌとなるように再懸濁する。このようにして回収した細胞を、本発明で使用する歯髄幹細胞として用いる。
調製された細胞が歯髄幹細胞であることを確認する方法としては、歯髄幹細胞に特異的なマーカーの発現パターンを指標として確認する方法が挙げられる。具体的には、歯髄幹細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を発現しており、一方で、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１３３を発現していないことを一つの特徴としている。これらのマーカーの発現は、いずれも、例えば、免疫蛍光染色法やＦＡＣＳ（Fluorescence activated cell sorting）等によって検出・確認することができる。
本発明において用いられるヒト歯髄幹細胞は、肝細胞に分化させて用いることが好ましい。歯髄幹細胞を肝細胞に分化させる方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、歯髄幹細胞を従来公知の方法（例えば、Okada et al., “Hydrogen sulphide increases hepatic differentiation of human tooth pulp stem cells compared with human bone marrow stem cells,” International Endodontic Journalに記載の方法）に基づいて行うことができる。具体的には、歯髄幹細胞を、１％のインスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウムおよび胚栄養因子を添加した無血清ＤＭＥＭで、７０％程度のコンフルエントになるまで培養した後、２０ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）を添加して５日間処理し、その後、オンコスタチンＭおよびデキサメタゾンを添加してさらに１５日間処理する。
歯髄幹細胞が肝細胞に分化したことを確認する方法としては、特に限定されるものではないが、実際に生体の肝臓に移植してその分化能を確認する方法や、アルブミンやα−フェトプロテイン等の肝細胞分化に特徴的な遺伝子マーカーの発現レベルをＥＬＩＳＡやリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ等を用いて解析する方法により行われる。なお、歯髄幹細胞から分化した肝細胞を選択するにあたっては、α−フェトプロテインの免疫組織学的な発現が認められ、かつ、移植後のα−フェトプロテインの血中濃度が２０ｎｇ／ｍｌ以上になる程度の幼弱な肝細胞を選択することが好ましい。このような肝細胞を用いた場合、肝臓組織に付随する脈管や胆管等を含めた肝臓組織の再生が見込まれる。
本発明の組成物に含まれるヒト歯髄幹細胞は、分離した状態の歯髄幹細胞であってもよいが、組成物適用時の歯髄幹細胞の生着効率および再生効率を高めるために、スフィア（sphere）を形成した状態の歯髄幹細胞を用いてもよい。また、本発明の組成物は、ヒト歯髄幹細胞を有効量含めば固体または液体のいずれの形態をとってもよく、組成物を適用する方法に応じて、薬学上許容される担体または添加剤を配合して、固体または液体状の組成物として調製することもできる。
本発明の組成物に含有されるヒト歯髄幹細胞の量は、肝臓組織を再生できる限り特に制限されないが、適用対象となる哺乳動物の種類や重量に合わせて適宜設定することができ、例えば、適用対象となる哺乳動物の体重１５ｋｇに対して、５×１０６〜４×１０１０個の歯髄幹細胞を含有させる。好ましくは、対象となる哺乳動物の体重１５ｋｇに対して、１×１０７〜４×１０７個の歯髄幹細胞を含有させる。
本発明の組成物を適用する対象は、哺乳動物であれば特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、非ヒト哺乳動物であってもよい。また、本発明の組成物は、例えば、霊長目、偶蹄目、鯨偶蹄目または奇蹄目等に属する高等哺乳動物に対して特に好ましく用いられる。
また、本発明の組成物の適用箇所としては、特に限定されるものではないが、肝臓、脾臓および腹膜等の臓器である。また、本発明の組成物の適用方法としては、適用箇所となる臓器または組織等に、注入、埋入、填入または塗布等の従来公知の方法によって適用される。適切な溶媒等の担体を用いて本発明の組成物を適度な流動性を有するゲル状に調製することにより、填入、注入または塗布等の、簡便な手法で適用することができる。また、ゲル状であれば、注射針等を用いて対象臓器等に容易に適用することができる。例えば、本発明の組成物を脾臓に適用する場合は、直接脾臓に適用してもよいが、脾洞に、注射器で注入して、血流により脾臓に搬送して適用してもよい。本発明の組成物を使用して、肝臓以外の臓器に肝臓組織を再生した場合、当該臓器の機能を損なうことなく肝臓組織を再生できることが確認されている。
本発明の組成物を用いて肝臓組織の再生を行う場合、組成物の適用による免疫反応を抑制するために、組成物の適用前に適用対象となる動物に対して免疫抑制処理を行うことが好ましい。免疫抑制処理は、市販の免疫抑制剤を使用して行うことができる。市販の免疫抑制剤としては、例えば、タクロリムス（製品名：プログラフ（登録商標）、アステラス製薬株式会社製）等を使用することができる。免疫抑制処理は、使用する免疫抑制剤ごとに従来公知の方法によって行うことができる。
免疫抑制剤としてプログラフを使用して本発明の組成物を適用する場合の、プログラフおよび本発明の組成物の適用スケジュールの一例を以下に示す。
まず、本発明の組成物の適用前日の早朝と夜のそれぞれに、プログラフ顆粒１ｍｇ包（顆粒５００ｍｇ）および０．２ｍｇ包（顆粒１００ｍｇ）を用いて、顆粒０．０７５ｍｇ／ｋｇ体重の量で経口投与する（１日の合計投与量０．１５ｍｇ／ｋｇ体重）。適用当日は、０．１５ｍｇ／ｋｇ体重の量のプログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を生理食塩水２００ｍｌに溶解したプログラフ生理食塩水溶液を、早朝と夜にそれぞれ１００ｍｌずつ、２時間の持続点滴により静脈内投与する（１日の合計投与量は０．１５ｍｇ／ｋｇ体重）。適用の翌日から適用後２８日までは、０．１０ｍｇ／ｋｇ体重の量のプログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を生理食塩水２００ｍｌに溶解したプログラフ生理食塩水溶液を、早朝と夜にそれぞれ１００ｍｌずつ、２時間の持続点滴により静脈内投与する（１日の合計投与量は０．１０ｍｇ／ｋｇ体重）。体重が１５ｋｇの個体に投与する場合は、本発明の組成物の適用前日の朝と夕方にそれぞれ、プログラフ１１２５ｍｇ（プログラフ顆粒１ｍｇ包を２包と０．２ｍｇ包を１と１／４包）を経口投与する。適用当日は、２．２５ｍｇ（プログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を４５０μｌ）を２００ｍｌの生理食塩水に溶解したプログラフ生理食塩水溶液を、早朝と夜にそれぞれ１００ｍｌずつ、２時間の持続点滴により静脈内投与する。適用の翌日から適用後２８日までは、１．５ｍｇ（プログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を３００μｌ）を２００ｍｌの生理食塩水に溶解したプログラフ生理食塩水溶液を、早朝と夜にそれぞれ１００ｍｌずつ、２時間の持続点滴により静脈内投与する。なお、本発明の組成物適用の翌日以降は、プログラフの血中濃度を毎日測定し、血中濃度が０．０１ｍｇ／ｍｌ以下とならないように、１．５ｍｇ（プログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）３００μ）を２００ｍｌの生理食塩水に溶解したプログラフ生理食塩水溶液を適宜静脈内投与することが好ましい。
本発明の組成物の適用後４〜１０週間に、適用した本発明の組成物に含まれるヒト歯髄幹細胞およびそこから分裂・増殖した細胞を含む組織（細胞群）を採取する。肝臓組織の再生がされているかどうかの確認は、採取された組織（細胞群）と正常個体の肝臓組織とを、組織染色等の組織学的解析、各種肝臓マーカーに対する免疫染色、in situハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、ＲＴ−ＰＣＲもしくはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いた分析、または電子顕微鏡解析等を用いて比較して行う。各種肝臓マーカーとしては、特に限定されるものではないが、アルブミン、α−フェトプロテインおよびＣＰＳ（カルバモイルリン酸合成酵素）、ならびに、ミトコンドリア等が挙げられる。これらの肝臓マーカーが、正常個体の肝臓における発現量と同程度に発現している場合、また、肝臓の機能が欠損している対象に適用する場合には、欠損した肝臓の機能が改善および／または補完されている場合に、採取された細胞群は肝臓組織に分化したもの、すなわち肝臓組織が再生したものと判断する。
本発明の組成物は、哺乳動物の肝疾患の治療に用いることができる。したがって、本発明の別の態様によれば、本発明の組成物を含む医薬組成物が提供される。また、本発明の別の態様によれば、医薬組成物の製造における、本発明の組成物の使用が提供される。また、本発明の好ましい態様によれば、上記医薬組成物は、哺乳動物の肝疾患の治療に用いられる。上記医薬組成物においては、本発明の組成物をそのまま用いてもよく、本発明の組成物に、薬学上許容可能な担体を適宜添加して用いてもよい。
本発明の組成物の治療対象となる肝疾患は、特に限定されるものではないが、肝臓がん、肝不全、肝硬変、肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患および転移性がん、ならびに、がんの化学療法に起因する副作用に対し補助療法を必要とする病態などである。がんの化学療法に起因する副作用に対し補助療法が必要な病態とは、具体的には、肝不全や肝転移がんのような病態のことを意味する。また、本発明の組成物の適用対象となる哺乳動物は、上記肝疾患とともに、肥満、糖尿病、高脂血症または高血圧などの生活習慣病を併発していてもよい。
本発明の組成物における肝疾患の治療効果の確認は、本発明の組成物を適用した後に、本発明の組成物を適用した臓器または組織の全体の組織染色による病理学的所見、および／または通常行われている血液検査に基づいて行うことができる。ここで、「本発明の組成物を適用した臓器または組織の全体」とは、適用された本発明の組成物に含まれるヒト歯髄幹細胞およびそこから分裂・増殖した細胞からなる細胞群を含む臓器または組織を意味する。
本発明の組成物の肝疾患治療効果の確認を血液検査に基づいて行う場合、以下の（１）〜（６）から選択される少なくとも１つのパラメータについて正常個体と比較することにより行われる。
（１）血中総コレステロール濃度
（２）血中アルブミン濃度
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度
（６）血中ヒアルロン酸濃度
具体的には、肝疾患に罹患した哺乳動物の個体において、本発明の組成物を適用した場合に、上記パラメータの少なくとも１つが正常個体と同程度の値となるか、または、正常個体の値に近づく傾向を示した場合に、本発明の組成物が肝疾患に対する治療効果を有するものであると判断する。
（１）血中総コレステロール濃度
（２）血中アルブミン濃度
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度
（６）血中ヒアルロン酸濃度
具体的には、肝疾患に罹患した哺乳動物の個体において、本発明の組成物を適用した場合に、上記パラメータの少なくとも１つが正常個体と同程度の値となるか、または、正常個体の値に近づく傾向を示した場合に、本発明の組成物が肝疾患に対する治療効果を有するものであると判断する。
また、本発明の別の態様によれば、哺乳動物における上記肝疾患を治療する方法であって、本発明の組成物の有効量を、哺乳動物に投与することを含む方法が提供される。
本発明の組成物の有効量は、特に限定されるものではないが、対象となる哺乳動物の種類、年齢、性別、状態等に応じて医師により適宜決定される。
本発明の組成物の投与方法は、特に限定されるものではないが、例えば、上述した肝臓組織の再生と同様の手順により行うことができる。
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これら実施例により制限されるものではない。
歯髄幹細胞の調製
常法に従い、６〜１２歳の健常なヒトから乳歯を採取した。なお、乳歯の採取、ならびに採取した乳歯の歯髄幹細胞の調製および使用については、事前に対象またはその保護者に説明し、同意を得てから行った。採取した乳歯から、滅菌した抜髄針を用いて歯根管を介して歯髄組織を採取した。採取した歯髄組織を、４ｍｇ／ｍｌのディスパーゼＩＩ（GIBCO社製、製品番号：1728484）および４ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩ（和光純薬工業株式会社製、製品番号：CTH2297）を用いて３７℃で１時間消化した。消化後の細胞懸濁液を、面積２５ｃｍ２のディッシュ（TPP社製）を用いて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Invitrogen社製、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢを含有）で、ＣＯ２濃度５％の雰囲気下、３７℃の環境下で培養した。培養細胞が８５〜９０％のコンフルエントに達するまで培養した後、新たなディッシュに１×１０５個／ｃｍ２となるように継代した。
常法に従い、６〜１２歳の健常なヒトから乳歯を採取した。なお、乳歯の採取、ならびに採取した乳歯の歯髄幹細胞の調製および使用については、事前に対象またはその保護者に説明し、同意を得てから行った。採取した乳歯から、滅菌した抜髄針を用いて歯根管を介して歯髄組織を採取した。採取した歯髄組織を、４ｍｇ／ｍｌのディスパーゼＩＩ（GIBCO社製、製品番号：1728484）および４ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩ（和光純薬工業株式会社製、製品番号：CTH2297）を用いて３７℃で１時間消化した。消化後の細胞懸濁液を、面積２５ｃｍ２のディッシュ（TPP社製）を用いて、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Invitrogen社製、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌのアムホテリシンＢを含有）で、ＣＯ２濃度５％の雰囲気下、３７℃の環境下で培養した。培養細胞が８５〜９０％のコンフルエントに達するまで培養した後、新たなディッシュに１×１０５個／ｃｍ２となるように継代した。
１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地で３回継代した後、トリプシンを用いて細胞をディッシュから剥離した。剥離した細胞をManual MACS（登録商標） Cell Separation protocolに供して、ＣＤ１１７＋歯髄幹細胞を単離した。ＣＤ１１７＋歯髄幹細胞を、２０ｎｇ／ｍｌの肝細胞増殖因子（HGF社製）を含む血清非含有ＤＭＥＭで５日間培養し、その後、１０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチンＭ（R&D社製）および１０ｎＭのデキサメタゾン（和光純薬株式会社製）を培地に添加して、さらに１５日間培養した。培養終了後の細胞をハンクス平衡塩溶液（Gibco社製）に懸濁して約１×１０７個／ｍｌとし、本発明の組成物として用いた。
肝疾患罹患動物モデルの作製
マイクロミニブタを用いて、以下の手順で肝疾患（非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ））罹患の動物モデルを作製した。
マイクロミニブタを用いて、以下の手順で肝疾患（非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ））罹患の動物モデルを作製した。
約７ヶ月齢（体重約１０ｋｇ）の雄マイクロミニブタ（系統：Fuji Micromini Pig）を富士マイクラ株式会社から購入し、１２個体について、自然換気、温度：２０±５℃、相対湿度：５５±２５％、照明サイクル：７：００〜１９：００が明、１９：００〜７：００が暗の飼育環境の下、通常飼料である固形飼料ＭＰ−Ａ（オリエンタル酵母株式会社製、含有コリン：０．２９％、含有粗タンパク質：１５．３％）を飼料として、１日３００ｇ給餌して馴化を行った。なお、給餌は各日の８：００頃に行った。
一週間程度の馴化期間の終了後の正常な１２個体（正常個体）の血液検査を行った。具体的には、正常な１２個体のそれぞれについて静脈血の採血を行い血清を得、得られた血清試料を用いて、以下の（１）〜（６）の各項目について測定を行い、その測定値を「正常値」とした。（１）〜（６）の各項目と、その正常値は以下の通りであった。
（１）血中総コレステロール濃度：２１４ｍｇ／ｄｌ
（２）血中アルブミン濃度：４．１９２ｍｇ／ｄｌ
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値：２１．９％
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度：０．０９５μｇ／ｍｌ
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度：３２Ｕ／ｌ
（６）血中ヒアルロン酸濃度：３２ｎｇ／ｍｌ
（１）血中総コレステロール濃度：２１４ｍｇ／ｄｌ
（２）血中アルブミン濃度：４．１９２ｍｇ／ｄｌ
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値：２１．９％
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度：０．０９５μｇ／ｍｌ
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度：３２Ｕ／ｌ
（６）血中ヒアルロン酸濃度：３２ｎｇ／ｍｌ
上記（１）〜（６）の各項目の測定は、以下の手法およびキット等を用いて行った。
（１）血中総コレステロール濃度については、コレステロール脱水素酵素（ＵＶ）法を用いて測定した。
（２）血中アルブミン濃度については、ネフェロメトリー（ＢＣＰ改良法）を用いて測定した。
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）値については、凝固時間測定を用いて測定した。
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度については、Type IV collagen ELISA kit, ACB（フナコシ株式会社製）を用いて測定した。
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度については、ＪＳＣＣ標準化対応法を用いて測定した。
（６）血中ヒアルロン酸濃度については、ラテックス凝集免疫比濁法を用いて測定した。
（１）血中総コレステロール濃度については、コレステロール脱水素酵素（ＵＶ）法を用いて測定した。
（２）血中アルブミン濃度については、ネフェロメトリー（ＢＣＰ改良法）を用いて測定した。
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）値については、凝固時間測定を用いて測定した。
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度については、Type IV collagen ELISA kit, ACB（フナコシ株式会社製）を用いて測定した。
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度については、ＪＳＣＣ標準化対応法を用いて測定した。
（６）血中ヒアルロン酸濃度については、ラテックス凝集免疫比濁法を用いて測定した。
正常値を測定した後、タンパク質を実質的に含有しないＣＤＡＡ飼料（RESERCH DIETS社製、製品番号：A15022101）を飼料として、１日３００ｇ給餌して、同一の飼育環境の下、１６週間にわたり自由摂餌により飼育した。なお、給餌は各日の８：００頃に行った。１６週間にわたる自由摂餌により飼育した後の１２個体を肝疾患罹患モデルとした。１２個体の肝疾患罹患モデルについて、正常個体と同様に血液検査を行った。
得られた肝疾患罹患モデルのうちの１個体の肝臓組織を取り出して生検写真を得た。生検写真を図１に示す。図１の生検写真において、灰色で示す部分は肝細胞を示し、白色の小さな粒状部分は脂肪（脂肪滴）を示す。本発明の方法により得られたマイクロミニブタの肝臓組織においては、正常の肝臓組織では認められないような、多量の脂肪（脂肪滴）の肝細胞への沈着が生じており、生検写真からも肝疾患の所見が認められた。
また、１２個体の肝疾患罹患モデルの血液検査の結果は以下の通りであった。これらの測定値を「罹患値」とした。
（１）血中総コレステロール濃度：８７ｍｇ／ｄｌ
（２）血中アルブミン濃度：１．７６８ｍｇ／ｄｌ
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値：６．９％
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度：０．９９８μｇ／ｍｌ
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度：２４６Ｕ／ｌ
（６）血中ヒアルロン酸濃度：５１ｎｇ／ｍｌ
（１）血中総コレステロール濃度：８７ｍｇ／ｄｌ
（２）血中アルブミン濃度：１．７６８ｍｇ／ｄｌ
（３）ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値：６．９％
（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度：０．９９８μｇ／ｍｌ
（５）血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度：２４６Ｕ／ｌ
（６）血中ヒアルロン酸濃度：５１ｎｇ／ｍｌ
上記血液検査の結果から、肝疾患の所見（マーカー）である、（１）血中総コレステロール濃度の低下、（２）血中アルブミン濃度の低下、（３）ＨＰＴ値の低下、（４）血中ＩＶ型コラーゲン濃度の上昇、（５）血中ＡＬＴ濃度の上昇、および（６）血中ヒアルロン酸濃度の上昇が認められた。
このように、得られた肝疾患罹患モデルは、生検写真による所見および血液検査による所見から、肝疾患（ＮＡＦＬＤ）に外挿可能な肝疾患罹患モデルであった。
＜実施例：歯髄幹細胞を含む組成物の適用による肝疾患の治療効果の検討＞
上述した方法により調製された、歯髄幹細胞を含む本発明の組成物を、上述した方法により作製された肝疾患罹患モデルの脾臓に適用して、本発明の組成物の肝疾患治療効果について検討した。
上述した方法により調製された、歯髄幹細胞を含む本発明の組成物を、上述した方法により作製された肝疾患罹患モデルの脾臓に適用して、本発明の組成物の肝疾患治療効果について検討した。
上述した方法により作製された１２個体の肝疾患罹患モデルを、本発明の組成物を適用する６個体の適用群と、適用しない６個体のコントロール群とに分けた。
適用群には、以下の方法により、歯髄幹細胞を含む本発明の組成物を肝疾患罹患モデルの脾臓に適用した。まず、適用群の６個体に対して、本発明の組成物の適用開始の前日に、タクロリムス（製品名：プログラフ（登録商標）顆粒、アステラス製薬株式会社製）を、１回のプログラフ投与量が０．０７５ｍｇ／ｋｇ体重となるように、早朝と夜の２回経口投与して免疫抑制を行った（１日の合計投与量は０．１５ｍｇ／ｋｇ体重）。次に、上述した方法により作製された本発明の組成物（歯髄幹細胞を約１×１０７個／ｍｌ含む）を、１ｍｌ注射器（Terumo社製、製品番号：SS-01T）を用いて、適用群の６個体の脾洞に注射した。適用開始４週間後に、各個体について静脈血の採血を行い血清を得、得られた血清試料を用いて血液検査を行った。なお、本発明の組成物適用の当日に、プログラフ（登録商標）注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を、１回のプログラフ投与量が０．０７５ｍｇ／ｋｇ体重となるように、生理食塩液（大塚製薬株式会社製、製品番号：D05352）１００ｍｌに溶解して、早朝と夜の２回静脈内投与して免疫抑制を行った（１日の合計投与量は０．１５ｍｇ／ｋｇ体重）。本発明の組成物適用の翌日以降は、プログラフ（登録商標）注射液（５ｍｇ／ｍｌ）を、１回のプログラフ投与量が０．０５ｍｇ／ｋｇ体重となるように、生理食塩水１００ｍｌに溶解して、早朝と夜の２回静脈内投与して免疫抑制を行った（１日の合計投与量は０．１０ｍｇ／ｋｇ体重）。なお、本発明の組成物適用の翌日以降は、各個体のプログラフの血中濃度を毎日測定し、静脈血中のプログラフ濃度が約０．０１３ｍｇ／ｍｌとなるように、１．５ｍｇ（プログラフ注射液（５ｍｇ／ｍｌ）３００μｌ）のプログラフを２００ｍｌの生理食塩水に溶解したプログラフ生理食塩水溶液を適宜静脈内投与して免疫抑制を維持した。コントロール群ではプログラフに代えて同量の生理食塩水を投与した。
適用群およびコントロール群のそれぞれの血液検査の結果（６個体の平均値：「処置値」）と、正常値および罹患値を項目ごとにまとめたグラフを図２〜６に示す。図２〜６の結果から明らかなように、適用群においては、血液検査における肝疾患の各マーカーが、本発明の組成物の適用開始４週間で正常値に近づいており（罹患値から処置値への推移）、これは、本発明の組成物を適用したことにより肝疾患が治癒していることを意味するものである。なお、図には示していないが、本発明の組成物の適用開始４週間後の血液検査において、ヘパプラスチンテスト（ＨＰＴ）の値は１１．０％であり、血中ＩＶ型コラーゲン濃度は０．３８２μｇ／ｍｌであった。これらの肝疾患マーカーも、本発明の組成物の適用開始４週間で正常値に近づく傾向を示しており、本発明の組成物を適用したことにより肝疾患が治癒していることを示すものである。
一方、コントロール群においては、肝疾患の各マーカーが、罹患値と処置値の間でほとんど変化がなかった。具体的には、処置値が正常値にわずかに近づく傾向を示すか、処置値が罹患値よりも正常値から離れる結果となった。これらの結果は、肝疾患がほとんど治癒されていないか、むしろ進展していることを示すものである。
また、適用群から、本発明の組成物の適用開始４週間後に１個体の脾臓組織を取り出して、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いて染色した。染色後の生検写真を図７に示す。図７の生検写真において、黒色の小さな粒状部分が肝臓細胞を示す。この生検写真から、本発明の組成物を適用した脾臓においては、肝臓組織が再生しており、肝臓の機能を補完する、いわば第２の肝臓が作出されていることが分かる。病理学的所見に基づけば、この生検写真の結果は、さらなる時間の経過に伴って肝臓組織の再生がさらに進行し、肝臓疾患の治癒に至る病理像を示すものである。
以上より、血液検査および生検写真に基づき、ヒト歯髄幹細胞を含む本発明の組成物を適用することにより、肝臓組織の再生、およびそれに伴う肝疾患の治療という効果が奏されることが明らかとなった。また、この結果から、ヒト歯髄幹細胞を含む本発明の組成物が、肝臓組織の再生および肝疾患の治療に用いられ得ると言える。
本発明により、脱落歯や抜去歯から容易に採取可能なヒト歯髄幹細胞を用いて、肝臓組織の再生および肝疾患の治療のための組成物を製造することが可能となる。
Claims (9)
- ヒト歯髄幹細胞を有効成分として含む、哺乳動物の肝臓組織再生用組成物。
- 前記ヒト歯髄幹細胞が肝細胞に分化している、請求項１に記載の肝臓組織再生用組成物。
- 前記ヒト歯髄幹細胞がヒト乳歯歯髄幹細胞である、請求項１または２に記載の肝臓組織再生用組成物。
- 前記ヒト歯髄幹細胞が、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＣＤ１６６を発現し、ＣＤ３４、ＣＤ４５およびＣＤ１３３を発現しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
- ヒトの肝疾患を治療するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
- 非ヒト哺乳動物の肝疾患を治療するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
- 肝疾患の治療の対象となる前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の体重１５ｋｇ当たり５×１０６〜４×１０１０個のヒト歯髄幹細胞が、前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物に投与される、請求項５または６に記載の肝臓組織再生用組成物。
- 前記ヒトまたは非ヒト哺乳動物の脾洞に投与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
- 前記肝疾患が、肝臓がん、肝不全、肝硬変、肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患および転移性がん、ならびに、がんの化学療法に起因する副作用に対し補助療法を必要とする病態からなる群から選択される、請求項５〜８のいずれか一項に記載の肝臓組織再生用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016117367A JP6894674B2 (ja) | 2016-06-13 | 2016-06-13 | 肝臓組織再生用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2016117367A JP6894674B2 (ja) | 2016-06-13 | 2016-06-13 | 肝臓組織再生用組成物 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2020036031A Division JP2020079329A (ja) | 2020-03-03 | 2020-03-03 | 肝臓組織再生用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2017222581A true JP2017222581A (ja) | 2017-12-21 |
| JP6894674B2 JP6894674B2 (ja) | 2021-06-30 |
Family
ID=60687640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2016117367A Active JP6894674B2 (ja) | 2016-06-13 | 2016-06-13 | 肝臓組織再生用組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6894674B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022531709A (ja) * | 2019-05-08 | 2022-07-08 | インダストリー－アカデミック コーポレーション ファウンデーション キョンサン ナショナル ユニバーシティ | 歯周組織由来の分化多能性幹細胞を含む男性不妊症予防又は治療用薬学的組成物 |
| JP2022546856A (ja) * | 2019-09-06 | 2022-11-09 | インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション キョンサン ナショナル ユニバーシティ | 歯周組織由来の多分化能幹細胞を含む肥満または非アルコール性脂肪肝の予防または治療用薬学的組成物 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150299661A1 (en) * | 2009-07-21 | 2015-10-22 | Unversitat Internacional De Catalunya | Pluripotent stem cells obtained from dental pulp |
| WO2016001839A1 (en) * | 2014-06-30 | 2016-01-07 | Stempeutics Research Pvt. Ltd. | Management of liver disease using pooled mesenchymal stromal cells |
-
2016
- 2016-06-13 JP JP2016117367A patent/JP6894674B2/ja active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20150299661A1 (en) * | 2009-07-21 | 2015-10-22 | Unversitat Internacional De Catalunya | Pluripotent stem cells obtained from dental pulp |
| WO2016001839A1 (en) * | 2014-06-30 | 2016-01-07 | Stempeutics Research Pvt. Ltd. | Management of liver disease using pooled mesenchymal stromal cells |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| ISHKITIEV, N. ET AL.: "Transplantation of hepatic-like cells differentiated from human dental pulp cells", THE 60TH ANNUAL MEETING OF JAPANESE ASSOCIATION FOR DENTAL RESEARCH PROGRAM AND ABSTRACTS OF PAPERS, JPN6018037518, 2012, pages p. 70 * |
| J. TISSUE ENG. REGEN. MED., vol. Vol. 11, JPN6018037521, September 2015 (2015-09-01), pages pp. 1888-1896 * |
| STEM CELLS TRANSL. MED., vol. Vol. 5, JPN6018037520, 8 June 2016 (2016-06-08), pages pp. 1416-1424 * |
| TISSUE ENG. PART A, vol. Vol. 21, No. 3-4, JPN6018037517, 2015, pages pp. 586-593 * |
| 再生医療, vol. Vol. 15 Suppl., JPN6018037522, 1 February 2016 (2016-02-01), pages p. 131 * |
| 日小外会誌, vol. Vol. 50, No. 3, JPN6018037519, 2014, pages p. 694 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2022531709A (ja) * | 2019-05-08 | 2022-07-08 | インダストリー－アカデミック コーポレーション ファウンデーション キョンサン ナショナル ユニバーシティ | 歯周組織由来の分化多能性幹細胞を含む男性不妊症予防又は治療用薬学的組成物 |
| JP2022546856A (ja) * | 2019-09-06 | 2022-11-09 | インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション キョンサン ナショナル ユニバーシティ | 歯周組織由来の多分化能幹細胞を含む肥満または非アルコール性脂肪肝の予防または治療用薬学的組成物 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6894674B2 (ja) | 2021-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103989710B (zh) | 分离的肝脏干细胞 | |
| JP4749331B2 (ja) | 脂肪由来前駆細胞の細胞分化 | |
| US11821005B2 (en) | Umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) and culture method and application thereof | |
| US20150202234A1 (en) | Injectable Brown Adipose Microtissues for Treatment and Prevention of Obesity and Diabetes | |
| JP2008188021A (ja) | 脂肪組織から幹細胞を調製するための方法およびシステム | |
| KR20180114073A (ko) | 향상된 성체 간 전구 세포 제제 | |
| CN103930542A (zh) | 棕色脂肪细胞组合物及方法 | |
| CN103585177A (zh) | 间充质干细胞和基因修饰的间充质干细胞的用途 | |
| WO2008018190A1 (fr) | Cellules de la crête neurale dérivées de tissu adipeux | |
| JP6883904B2 (ja) | 線維芽細胞の製造方法及びｇ−ｃｓｆ陽性線維芽細胞集団 | |
| TW202020144A (zh) | 源自齒髓的細胞之製造方法 | |
| KR20080042761A (ko) | 렙틴을 이용한 줄기세포 증식방법 | |
| JP5388297B2 (ja) | アディポクラスター | |
| JP6894674B2 (ja) | 肝臓組織再生用組成物 | |
| JP2021029174A (ja) | ヒト脂肪肝モデル細胞 | |
| JP6147419B2 (ja) | 心臓内膜由来の成体幹細胞及びこれの製造方法 | |
| TW202146033A (zh) | 包含源自牙髓的細胞之醫藥組成物 | |
| KR20180130625A (ko) | 인간 성체 간세포 리프로그래밍 배지 조성물 | |
| CN103619342B (zh) | 用于治疗肥胖症和/或代谢综合征的方法 | |
| EP4366744A1 (en) | Mesenchymal stem cells for use in the treatment of chronic gingivostomatitis | |
| KR102549781B1 (ko) | 간 조직 재생용 조성물 | |
| JP2020079329A (ja) | 肝臓組織再生用組成物 | |
| TWI752077B (zh) | 肝臟組織再生用組成物 | |
| JP7003283B2 (ja) | 末梢血から間葉系幹細胞集団を製造する方法及びその使用 | |
| JP3898467B2 (ja) | ヒト臍帯血有核細胞由来の肝細胞 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171207 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180928 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20181127 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190125 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190607 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190806 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20191203 |
|
| C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20200303 |
|
| C116 | Written invitation by the chief administrative judge to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C116 Effective date: 20200313 |
|
| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20200313 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20200413 |
|
| C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C22 Effective date: 20201016 |
|
| C13 | Notice of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C13 Effective date: 20201204 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210202 |
|
| C23 | Notice of termination of proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C23 Effective date: 20210326 |
|
| C03 | Trial/appeal decision taken |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C03 Effective date: 20210507 |
|
| C30A | Notification sent |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C3012 Effective date: 20210507 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20210604 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6894674 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |