TW202146033A - 包含源自牙髓的細胞之醫藥組成物 - Google Patents
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Abstract
本發明的課題係提供一種新穎用途之醫藥組成物，其係包含可投予至人類之源自牙髓的多潛能幹細胞製劑而成。本發明的解決手段係一種抑制嗜中性球、單核球、淋巴球之至少任一者向組織的浸潤用之醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成。組成物。
Description
本發明係關於由牙髓所得之具有軟骨細胞分化能力及骨細胞分化能力之多潛能幹細胞，例如，關於此多潛能幹細胞之製造方法。
具有分化成複數系統的細胞之分化能力的幹細胞(多潛能幹細胞)，已知能由各種組織獲得。從骨髓所分離之間葉系幹細胞為其中之一，其具有分化成骨細胞、心肌細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等各種細胞之能力(專利文獻1～4)。正嘗試利用此分化能力，將間葉系幹細胞應用於各種組織中之再生醫療。例如，已有報導指出，為了使因心肌梗塞而壞死之心肌再生，嘗試對於心肌梗塞患者投予間葉系幹細胞，藉此改善患者的心臟功能(非專利文獻1)。
如上述，已知間葉系幹細胞不限於從骨髓，亦可從脂肪組織(專利文獻5)、胎盤組織及臍帶組織(專利文獻6)等各種組織而取得。
從齒組織亦可取得多潛能幹細胞，例如，已有報導指出可從牙髓(專利文獻7～11)、齒濾泡(專利文獻12)、齒囊(專利文獻11、13)、齒乳突(專利文獻14)、齒根膜(專利文獻15)等取得多潛能幹細胞。源自齒組織之多潛能幹細胞一般被視為具有分化成脂肪細胞的能力(非專利文獻2～4)。
從牙髓取得多潛能幹細胞係大致以下述的流程進行(專利文獻16)。將使拔齒體破碎而得之組織以I型膠原蛋白酶與Dispase(註冊商標)進行處理，通過過濾器而去除細胞塊，獲得細胞的懸浮液。接著，使用包含20%FBS之DMEM培養基在細胞培養盤內使細胞增殖。將固著於細胞培養盤的內面而增殖之細胞進行胰蛋白酶處理並剝除，並將此回收。如此所回收之細胞被視為源自牙髓的多潛能幹細胞。此外，Dispase為源自多黏桿菌(Bacillus polymyxa)的中性蛋白酶。
牙髓係充滿齒的牙髓腔之疏鬆結締組織，依據存在部位而被區分成冠部牙髓與根部牙髓。又，源自齒組織之多潛能幹細胞一般被視為具有分化成脂肪細胞的能力(非專利文獻2～4)，而源自牙髓的幹細胞已有報導指出不會分化成脂肪細胞(專利文獻8)。亦即，在從牙髓所取得之幹細胞中，可能存在依據有無分化成脂肪細胞的能力而區分的至少2種類型。又，從乳齒的牙髓所取得之幹細胞，亦被報導相較於從永久齒的牙髓所取得者，具有高的增殖能力，並高表現FGF2、TGF-β、膠原蛋白I及膠原蛋白III等，且與存在於永久齒的牙髓之幹細胞的特性不同(專利文獻16)。另外，源自牙髓的多潛能幹細胞亦有報導指出，關於成為成骨細胞的分化誘導，與源自骨髓的間葉系幹細胞之性質不同(專利文獻11)。
另一方面，間葉系幹細胞產生各種分泌因子，其等被認為參與對於各種疾病的治療效果的表現。實際上，藉由基因改造技術使血管生成素-1(Angiopoietin-1，Ang-1)、HGF等因子的表現量增強之間葉系幹細胞，已有報導例指出在腦梗塞、心肌梗塞、急性肺損傷等疾病模式動物中的治療效果優異。但是，為了基因改造所使用之載體及導入基因而被基因改造之間葉系幹細胞，因伴隨著增腫瘤性等風險，故未確立臨床上的安全性。(非專利文獻5～19)
已知相較於健康正常人，腦梗塞患者在腦梗塞發病時之血中的血管生成素-1(Ang-1)的濃度低且具有統計學上有意義的差異，又，其血中濃度愈低的患者，在腦梗塞發病後3個月的時間點的症狀愈嚴重(非專利文獻20)。又，已知在伴隨著敗血症、急性肺損傷之感染症患者中，血中的血管生成素-1(Ang-1)的濃度低，在重症患者中的血中濃度特別低(非專利文獻21、22)。
腦梗塞大致分成心源性梗塞、血栓性梗塞、小間隙梗塞。其中，已報導血管生成素-1有助於小間隙梗塞的預防。又，亦已報導血管生成素-1可能對於心源性梗塞、伴隨血栓症梗塞之出血性腦梗塞具有預防性效果(非專利文獻23)。
源自牙髓的多潛能幹細胞被期待作為神經疾病治療劑之使用等臨床應用(專利文獻17)。
[先前技術文獻]
[專利文獻]
[專利文獻1]美國專利第5486359號
[專利文獻2]美國專利第5827740號
[專利文獻3]美國專利第6835377號
[專利文獻4]美國專利第6387369號
[專利文獻5]日本特開2004-129549
[專利文獻6]日本特開2004-210713
[專利文獻7]日本特開2010-252778
[專利文獻8]WO2002/007679
[專利文獻9]日本特表2008-507962
[專利文獻10]WO2009/072527
[專利文獻11]日本特開2004-201612
[專利文獻12]日本特表2009-527223
[專利文獻13]日本特表2005-516616
[專利文獻14]日本特開2006-238875
[專利文獻15]日本特開2008-295420
[專利文獻16]日本特開2010-268715
[專利文獻17]日本特開2011-219432
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Katritsis DG. et. al., Catheter Cardiovasc Interv. 65(3): 321-9(2005)
[非專利文獻2]Gronthos S. et. al., J Dent Res. 81(8): 531-5(2002)
[非專利文獻3]Tirino V. et. al., Stem Cell Rev. 7(3): 608-15(2011)
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[發明欲解決之課題]
本發明之目的係提供新穎用途之醫藥組成物，其係包含可投予至人類之源自牙髓的多潛能幹細胞製劑而成。
[用以解決課題之手段]
在為了上述目的之研究中，本發明人等進行反覆專心致志地探討的結果，發現富集來自從人類的拔齒體所取得之牙髓組織的多潛能幹細胞之源自牙髓的細胞(以下，亦稱為「源自牙髓的幹細胞」)相較於源自骨髓的多潛能幹細胞具有非常大量分泌為血管再生因子之一的血管生成素-1(Ang-1)的能力，以及該源自牙髓的幹細胞抑制血管內皮的穿透性降低、嗜中性球等往組織的細胞浸潤、及黏附因子的表現，並基於此而完成本發明。亦即，本發明係包含以下者。
1.一種抑制嗜中性球、單核球、淋巴球之至少任一者向組織的浸潤用之醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成。
2.如上述1之醫藥組成物，其抑制黏附因子的表現。
3.如上述2之醫藥組成物，其中該黏附因子表現於該組織中的血管內皮細胞的表面。
4.如上述2或3之醫藥組成物，其中該黏附因子為VCAM-1。
5.如上述2～4中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞提高抑制黏附因子的表現之因子在該組織中之濃度。
6.如上述5之醫藥組成物，其中，該因子包含血管生成素-1。
7.如1～6中任一項之醫藥組成物，其抑制該組織中之血管穿透性的亢進。
8.如上述1～7中任一項之醫藥組成物，其係伴隨發炎之疾病的治療及/或預防用。
9.如上述8之醫藥組成物，其中該伴隨發炎之疾病係選自包含腦梗塞、腦出血、包含黃斑點退化之視網膜病變、急性肺損傷、慢性的發炎性肺疾病、氣喘、急性胰臟炎、心肌梗塞、心臟衰竭、皮膚炎、及敗血症之群組。
10.如上述9之醫藥組成物，其中該伴隨發炎之疾病為急性肺損傷，該急性肺損傷係選自包含吸入性肺炎、細菌性肺炎、病毒性肺炎、急性呼吸窘迫症候群(亦被標記成ARDS)、及間質性肺炎(interstitial pneumonitis)之群組者。
11.如上述10之醫藥組成物，其中該急性肺損傷為病毒性肺炎，該病毒性肺炎的原因係感染冠狀病毒、流行性感冒病毒、或RS病毒。
12.如上述11之醫藥組成物，其中該病毒性肺炎的原因係感染冠狀病毒，該冠狀病毒為SARS-CoV、MARS-CoV、或SARS-CoV-2。
13.如上述9之醫藥組成物，其中該伴隨發炎之疾病為慢性的發炎性肺疾病，該慢性的發炎性肺疾病係選自包含囊腫纖化症(亦被標記成CF)、慢性阻塞性肺病(亦被標記成COPD)、肺發育不全症、慢性肺疾病、及病因不明性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis)(亦被標記成IPF)之群組者。
14. 如上述1～7中任一項之醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成，且係SARS-CoV、MARS-CoV、或SARS-CoV-2感染症的治療用。
15.如上述1～14中任一項之醫藥組成物，其被投予至人類。
16.如上述1～15中任一項之醫藥組成物，其中源自牙髓的幹細胞係源自人類。
17.如上述1～16中任一項之醫藥組成物，其係利用由選自包含靜脈內投予、動脈內投予、門靜脈內投予、皮內投予、皮下投予、肌肉內投予、腦室內投予、心內膜內投予、氣管內投予、眼內投予、耳腔內投予、鼻腔內投予、及關節內投予之群組的方法之投予用。
18.如上述1～17中任一項之醫藥組成物，其被單次或重複投予。
19.如上述1～18中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞具有以下的(1)～(4)的至少一個所示之特徵：
(1)CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性，被干擾素γ刺激時第二類MHC抗原成為陽性，表現前列腺素E2
及/或血管內皮增殖因子，在為前列腺素E2
的情況下，被TNFα刺激時表現量增加；
(2)CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45為陰性；
(3)CD47、CD81、及CD147的至少一個為陽性，CD19、CD34、及CD206的至少一個為陰性；
(4)CD47、CD81、及CD147的至少一個為陽性，CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個為陰性。
20.如上述1～19中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞具有分化成骨細胞及軟骨細胞的能力。
21.如上述1～20中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞在使細胞懸浮於培養基中的狀態下，其平均直徑為16～20μm。
22.如上述1～21中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞在活體外的環境下具有3次以上的細胞分裂能力，且平均倍化時間為96小時以內。
23.如上述1～21中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞具有以下的特徵：
在活體外的環境下，經過10次以上、15次以上、16次以上、或17次以上的細胞分裂，且其細胞分裂的平均時間為48小時以內；
在活體外的環境下，具有進行10次以上、14次以上、或15次以上的細胞分裂的能力，且其細胞分裂的平均時間為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內。
24.如上述1～21中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞具有以下的特徵：
在活體外的環境下，經過16次以上、21次以上、22次以上、或23次以上的細胞分裂；
在活體外的環境下，具有進行3次以上、4次以上、或5次以上的細胞分裂的能力，且其細胞分裂的平均時間為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內。
25.如上述1～24中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係CD19、CD26、CD106、CD117、及CD271的至少一個為陰性者。
26.如上述1～25中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係CD140b及HLA-A、B、C的至少一個為陽性者。
27.如上述1～26中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係CD56及CD146的至少一個為陰性者。
28.如上述1～27中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係CD49e及CD95的至少一個為陽性者。
29.如上述1～28中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係CD10、CD46、CD47、CD55、CD58、及CD59的至少一個為陽性者。
30.如上述1～29中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現MMP-2、IGFBP-4、胱抑素C(cystatin C)、IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、HGF、VEGF、TIMP-1、TIMP-2、及TIMP-3的至少一個。
31.如上述1～30中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現GROα、VCAM-I、及IP-10 (CXCL10)的至少一個。
32.如上述1～31中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現IL-6，且其表現量係藉由TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加。
33.如上述1～32中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現IL-11，且其表現量係藉由TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加。
34.如上述1～33中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現IP-10(CXCL10)，且其表現量係藉由TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加。
35.如上述1～34中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現MCP-1，且其表現量係藉由TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加。
36.如上述1～35中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係藉由TNF-α刺激而誘導GM-CSF的表現者。
37.如上述1～36中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現HGF，且其表現量係藉由TNF-α刺激而減少，及藉由干擾素γ刺激而增加。
38.如上述1～37中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現IL-8，且其表現量係藉由TNF-α刺激而增加。
39.如上述1～38中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現G-CSF，且其表現量係藉由TNF-α刺激而增加。
40.如上述1～39中任一項之醫藥組成物，其中以同一條件分別培養該源自牙髓的幹細胞及源自人類骨髓的間葉系幹細胞時，相較於該源自人類骨髓的間葉系幹細胞所產生之血管生成素-1的量，該源自牙髓的幹細胞所產生之血管生成素-1的量為3倍以上。
41.如上述1～40中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係藉由TNF-α刺激而誘導G-CSF的表現者。
42.如上述1～41中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞，該牙髓係得自人類的永久齒或乳齒者。
43.如上述1～42中任一項之醫藥組成物，其係在包含鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、碳酸氫離子、檸檬酸離子、人類血清白蛋白、及二甲亞碸的溶液中，以懸浮狀態包含該源自牙髓的幹細胞者。
44.如上述1～42中任一項之醫藥組成物，其係在含有人類血清白蛋白與二甲亞碸之重碳酸林格氏液中，以懸浮狀態包含該源自牙髓的幹細胞者。
45.如上述43之醫藥組成物，其係分別以91～113mM的濃度包含鈉離子、以2.52～3.08mM的濃度包含鉀離子、以0.95～1.16mM的濃度包含鈣離子、以0.315～0.385mM的濃度包含鎂離子、以15.6～19.2mM的濃度包含碳酸氫離子、以1.04～1.28mM的濃度包含檸檬酸離子、以46～56g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以9～11%(v/v)的濃度包含二甲亞碸者。
46.如上述43～45中任一項之醫藥組成物，其係更包含乙醯基色胺酸或其鹽及辛酸或其鹽者。
47.如上述43～46中任一項之醫藥組成物，其係以5×106
～8×107
個/mL的密度包含該源自牙髓的幹細胞者。
48.如上述43～47中任一項之醫藥組成物，其以1～20mL的量被封入容器。
49.如上述48之醫藥組成物，其中該容器為玻璃或塑膠製。
50.如上述43～49中任一項之醫藥組成物，其為冷凍狀態。
51.一種醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成，且提高組織中之血管生成素-1的濃度。
52.一種醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成，且抑制嗜中性球、單核球、淋巴球之至少任一者向組織的浸潤。
53.一種醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成，且抑制組織中之黏附因子的表現。
54.一種醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成，且用於治療或預防伴隨發炎之疾病。
[發明之效果]
根據本發明，例如，提供一種醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成，且對於嗜中性球往組織的浸潤所伴隨之疾病具有治療效果。
[用以實施發明的形態]
多潛能幹細胞係指具有自我複製能力與分化成二種以上的細胞的分化能力之細胞。藉由本發明所得之源自人類牙髓的多潛能幹細胞，較佳為具有分化成軟骨細胞及骨細胞的能力，但不特別限定於此。
藉由本發明所得之多潛能幹細胞具有分化成軟骨細胞的能力一事，例如，可藉由將在含有已知會誘導細胞分化成軟骨細胞的物質之培養基培養細胞時之聚蛋白多醣基因的表現量進行定量而確認。聚蛋白多醣係構成軟骨的細胞外基質之主要分子，若誘導細胞往軟骨細胞的分化，則表現量增加。在此測定法中，作為誘導細胞往軟骨細胞的分化之物質(軟骨細胞分化誘導物質)，例如，可使用TGF-b3。實施例20所記載之測定法係分化成軟骨細胞的能力之測定法的較佳一例。
藉由本發明所得之多潛能幹細胞具有分化成骨細胞的能力一事，例如，可藉由利用含有已知會誘導細胞分化成骨細胞的物質之培養基培養細胞時之在細胞中的鈣的累積量進行定量而確認。若誘導往骨細胞的分化，則鈣會在細胞中累積。在此測定法中，作為誘導往骨細胞的分化之物質(骨細胞分化誘導物質)，例如，可單獨使用地塞米松(dexamethasone)、β-甘油磷酸、醣胺聚醣、抗壞血酸、骨形成因子2(BMP-2)、及此等的鹽，或組合使用。例如，組合地塞米松、抗壞血酸鹽、及β-甘油磷酸而成者，可較佳地使用作為骨細胞分化誘導劑。實施例19所記載之測定法係分化成骨細胞的能力之測定法的較佳一例。
在本發明中，所謂「富集多潛能幹細胞之源自牙髓的細胞」或「多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞」，係指源自牙髓，且相較於從牙髓直接採取之細胞，多潛能幹細胞所佔的比例(個數比例)提高之細胞的集合，包含從牙髓經過由培養等所致之選擇而最終被分離的多潛能幹細胞。從牙髓直接採取之細胞係多潛能幹細胞與除此以外的細胞混合存在者。若將此進行培養，則多潛能幹細胞因增殖能力比其他細胞高，故相較於培養開始時，在培養結束時多潛能幹細胞的比例提高。藉由反覆進行培養，多潛能幹細胞的比例會變得更高，因此亦可獲得幾乎僅包含多潛能幹細胞之細胞。亦即，所謂「多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞」，包含多潛能幹細胞，所述多潛能幹細胞佔細胞整體的比例，係藉由在進行培養等的過程中多潛能幹細胞增殖，而高於剛從牙髓採取後。牙髓係源自人類者，特別稱作「多潛能幹細胞富集人類源自牙髓的細胞」。
在本發明中，從牙髓直接分離之多潛能幹細胞、及從牙髓經過培養而得的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞所含之多潛能幹細胞被統稱為「源自牙髓的多潛能幹細胞」，依據上下文有時亦僅稱為「源自牙髓的幹細胞」或「牙髓幹細胞」。牙髓係源自人類者，特別稱作「源自人類牙髓的多潛能幹細胞」，有時僅稱為「源自人類牙髓的幹細胞」或「人類牙髓幹細胞」。本說明書所記載之一實施形態的「中間體所含之細胞(中間體細胞)」及「源自牙髓的細胞製劑所含之細胞」係實質上僅包含多潛能幹細胞者，皆源自牙髓的多潛能幹細胞。
在本發明中，基於檢查對象的細胞集團，其在表面抗原標記的表現型(expression pattern)中有某抗原為陽性時，意指在整體地觀察細胞的集團時，在所觀察的細胞之中，較佳為30%以上，更佳為40%以上，再佳為50%以上，又再佳為60%以上，又再佳為70%以上，又再佳為80%以上，又再佳為90%以上，特佳為95%以上的抗原為陽性。表面抗原的表現型，例如可利用實施例21或22所記載之方法調查，但不限於此等。
在本發明中，基於檢查對象的細胞集團，其在表面抗原標記的表現型中有某抗原為陰性時，意指在整體地觀察細胞的集團時，在所觀察的細胞之中，較佳為小於20%，更佳為小於10%，再佳為小於5%，又再佳為小於2%，特佳為小於1%的抗原為陽性。表面抗原的表現型，例如可利用實施例21或22所記載之方法調查，但不限於此等。
本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在利用含有已知會誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，整體地觀察聚蛋白多醣的表現量增加。又，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在利用含有已知會誘導往骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，整體地觀察在細胞中之鈣的累積量是否增加。亦即，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在進行整體觀察時，具有分化成軟骨細胞及骨細胞的能力。
在發炎部位中，藉由在發炎部位表現之細胞激素等趨化性因子，嗜中性球、單核球、及淋巴球會聚集。此等細胞係藉由從存在於發炎部位或其附近之血管往組織浸潤，而到達發炎部位。本發明之醫藥組成物係用於抑制單核球及淋巴球往組織的浸潤者，特別為抑制可與存在於血管內皮細胞之黏附因子結合的細胞往組織的浸潤者。嗜中性球係可與存在於血管內皮細胞之黏附因子結合的細胞之一。
在本發明中，黏附因子無特別限定，但例如為可與嗜中性球、單核球、及淋巴球的至少一個結合者，作為其中之一，可列舉VCAM-1。嗜中性球係可與VCAM-1結合的細胞之一。
本發明中稱為組織時，特別意指已引起發炎之組織(發炎部位)或發炎部位加上其附近組織的部位，但只要為應發揮醫藥組成物的效果之組織，則無特別限定。例如，藉由在引起發炎前投予本發明之醫藥組成物，可防止發炎的發病，又可減弱症狀。因此，所謂組織之用語，亦包含引起發炎前的組織。又，組織可為內胚層系、中胚層系、外胚層系之任一組織，尤其為腦組織、皮膚組織、消化器官系統臟器、循環器官系統臟器、呼吸器官系統臟器。
在本發明的一實施形態中，醫藥組成物為抑制在組織中之黏附因子的表現者。醫藥組成物例如為提高抑制黏附因子的表現之因子在組織中之濃度者。作為此因子之一，可列舉血管生成素-1。
本發明所使用之源自牙髓的幹細胞，相較於在為多潛能幹細胞之點上共通之源自人類骨髓的間葉系幹細胞，血管生成素-1(Ang-1)的表現程度高，因此藉由投予至患者而可使體內的Ang-1水平上升，故可發揮更高的治療效果。
本發明的組成物若投予至人類，則為藥效成分之源自牙髓的幹細胞會分泌Ang-1，因此被使用於藉由血管內皮的穿透性的亢進、嗜中性球等往組織的細胞浸潤、及黏附因子的表現而進行之疾病的治療。
作為所適用之疾病的具體例，可列舉腦梗塞、腦出血、包含黃斑點退化之視網膜病變、急性肺損傷、氣喘、急性胰臟炎、心肌梗塞、心臟衰竭、皮膚炎、及敗血症，但不限於此等。
在腦梗塞中，由於發炎後，血管生成素-1(Ang-1)的表現量會降低，血管內皮的穿透性會亢進，引起嗜中性球的浸潤，而血腦障壁(Blood-Brain Barrier，BBB)會有破綻，而促進腦微血管疾病的進行，亦藉由黏附因子的表現而促進單核球、白血球、血小板的接著、往組織的遊走，並因發炎細胞的聚集而梗塞區域會進展。
在腦出血、血管障害、血管炎中，藉由黏附因子的表現亢進而白血球會接著於血管壁，穿透血管壁，浸潤至周邊組織，進一步使發炎進展。在包含黃斑點退化之視網膜病變中，暗示發炎與黏附因子的關聯性，發炎性細胞被補充(recruit)，症狀會惡化。在急性肺損傷、氣喘中，藉由血管內皮的穿透性亢進而產生氣管黏膜的浮腫，藉由在氣管支壁的黏附因子表現亢進，而遊走在肺組織、肺泡系統之嗜中性球會接著於血管內皮細胞，釋放活性氧等，而引起肺損傷。在急性胰臟炎中，藉由活化胰酵素，嗜中性球彈性蛋白酶被活化，發生遠端器官疾病，藉由黏附因子表現亢進，嗜中性球會接著於血管內皮細胞，產生過氧化物，因此傷害血管內皮細胞。在心肌梗塞、心臟衰竭中，在AMI(Acute myocardial infarction:急性心肌梗塞)的最早期，在梗塞部位會聚集嗜中性球並促進發炎，藉由黏附因子表現亢進而促進動脈硬化。在敗血症中，產生由血管內皮的穿透性亢進所致之各臟器的浮腫及脫水，藉由嗜中性球的浸潤而形成微小膿瘍，表現於血管內皮上之組織因子及黏附因子的表現已知會形成病態。另外，在皮膚炎等中，亦藉由嗜中性球的浸潤而促進發炎，藉由黏附因子的表現亢進而聚集嗜中性球等發炎性細胞而症狀會惡化。
本發明之醫藥組成物適用於此種藉由血管內皮的穿透性亢進、嗜中性球等細胞的浸潤、黏附因子的表現的亢進等所促進之各種疾病的治療。
本發明之醫藥組成物，在其一實施形態中，具有抑制VCAM-1的表現量之效果。VCAM-1係表現於血管內皮細胞的表面之黏附因子。嗜中性球、淋巴球、單核球等可透過VCAM-1而接著於血管內皮細胞。因此，在VCAM-1的表現量增加的部位，此等細胞例如嗜中性球變得會聚集及浸潤。
如實施例33所具體表示，VCAM-1在急性肺損傷小鼠模式之肺損傷部位的表現量增加。而且，本發明之醫藥組成物顯示具有抑制VCAM-1的表現量之效果。藉由抑制VCAM-1的表現量，亦抑制嗜中性球、淋巴球、單核球等接著於血管內皮細胞。
因此，本發明之醫藥組成物可廣泛地使用作為伴隨急性肺損傷之疾病的治療劑(包含預防用的劑)。作為此疾病，例如有吸入性肺炎、細菌性肺炎、病毒性肺炎、急性呼吸窘迫症候群(亦被標記為ARDS)、間質性肺炎。在此等之中，已知在細菌性肺炎中，在傷害部位特別是嗜中性球會浸潤，而在病毒性肺炎中，在傷害部位特別是淋巴球會浸潤。
成為本發明之醫藥組成物的治療對象之細菌性肺炎並無特別限定，但可列舉例如由肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌所致者。
成為本發明之醫藥組成物的治療對象之病毒性肺炎並無特別限定，但可列舉例如由感染冠狀病毒、流行性感冒病毒、RS病毒所致者。於此，在冠狀病毒中，包含SARS-CoV、MARS-CoV、SARS-CoV-2。新型冠狀病毒感染症(COVID-19)為由感染SARS-CoV-2所致者，為本發明之醫藥組成物的治療對象。
在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞為以86～161pg/104
個細胞的量表現血管生成素-1(Ang-1)者，相較於在多潛能幹細胞之點上共通之源自人類骨髓的間葉系幹細胞，較佳為3倍以上，更佳為5倍以上，再佳為8倍以上地表現血管生成素-1(Ang-1)。於此，血管生成素-1的表現量係例如以實施例30所記載之方法所測定者。
又，在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，此所產生之血管生成素-1(Ang-1)的量，在分別培養該源自牙髓的幹細胞及源自人類骨髓的間葉系幹細胞時，相較於源自人類骨髓的間葉系幹細胞所產生之血管生成素-1(Ang-1)的量，較佳為3倍以上，更佳為5倍以上，再佳為6倍以上，再佳為8倍以上。於此所能使用之細胞的培養法，例如為實施例30所記載者。
在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在整體(集團)地觀察此時，在表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性。同樣地，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，CD34及CD45的至少一個為陰性。例如，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，例如，CD73及CD90為陽性，且CD34為陰性。又，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性。此表現型與間葉系幹細胞共通。
又，在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原的至少一個為陰性。例如，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，例如，在表面抗原標記的表現型中，CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性。此等的表面抗原標記為陽性的細胞，在移植至同種異系的個體時，已知作為抗原而被辨識，且呈現被從活體內排除之傾向。此等的表面抗原標記的至少一個為陰性一事，表示本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞具有低免疫原性的性質，在移植至同種異型的個體時，有難以被從活體內排除之傾向。又，在此等的表面抗原標記的表現型中，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、CD86可保持陰性，第二類MHC抗原可成為陽性。例如，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性。
在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性。此時，在以IFN-γ刺激細胞時，例如，CD40、CD80、及CD86能保持陰性，第二類MHC抗原能成為陽性。
在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞(源自牙髓的多潛能幹細胞)，
(a-1)進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD29、CD46、CD47、CD59、CD73、CD81、CD90、CD147、及HLA-A、B、C的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為70%以上，更佳為80%以上，再佳為90%以上為陽性。
又，在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(a-2)進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD9、CD44、CD49b、CD49c、CD55、CD98、及EGF-R的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為65%以上，更佳為75%以上，再佳為80%以上為陽性。
又，在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(a-3)進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD49f、CD140b、及CD166的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為60%以上，更佳為70%以上，再佳為75%以上為陽性。
又，在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(a-4)進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD10、CD13、CD58、CD63、CD105、CD151、及CD164的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為60%以上，更佳為65%以上，再佳為70%以上為陽性。
在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，較佳為具有上述的(a-1)、(a-2)、(a-3)、及(a-4)所示之特徵之2個以上，更佳為3個以上，再佳為此等全部的特徵者。例如，具有上述的(a-1)及(a-2)所示之特徵的細胞為本發明的較佳的一實施形態。
在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(a-5)進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD120b、CD132、CD158a、CD161、CD184、CD195、CD206、CD210、CD212、CD226、CD244、CD267、CD278、CD279、CD282、CD294、SSEA-1(階段特異性胚胎抗原-1)、TRA-1-60、SSEA-3(階段特異性胚胎抗原-3)、CLA(皮膚淋巴球關連抗原)、及整聯蛋白β7的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為5%以下，再佳為2%以下，又再佳為僅1%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(a-6)進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD8b、CD11b、CD15s、CD16、CD19、CD24、CD31、CD32、CD62E、CD62P、CD66f、CD86、CD88、CD94、CD100、CD103、CD114、CD117、CD118、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD135、CD137、CD137配體、CD150、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD197、CD220、CD229、CD231、CD255、CD268、CD305、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、BLTR-1(白三烯B4受體)、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R(N-甲醯基甲硫胺醯基-白胺醯基-苯基丙胺酸受體)、不變性NKT(Invariant NKT)、及γδTCR(γδT細胞受體)的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為5%以下的細胞，再佳為僅2%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(a-7)進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD1a、CD1b、CD1d、CD2、CD3、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD11c、CD15、CD18、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27、CD28、CD33、CD34、CD35、CD37、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42b、CD45、CD45RB、CD45RO、CD48、CD50、CD53、CD62L、CD64、CD66(a、c、d、e)、CD69、CD70、CD72、CD80、CD84、CD85、CD87、CD89、CDw93、CD97、CD106、CD134、CD138、CD144、CD154、CD158b、CD162、CD183、CD205、CD235a、CD271、CD309、CD326、CD337、αβTCR(αβT細胞受體)、及第二類MHC抗原的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為僅5%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，較佳為具有上述的(a-1)、(a-2)、(a-3)、(a-4)、(a-5)、(a-6)、及(a-7)所示之特徵之2個以上，更佳為3個以上，再佳為此等全部的特徵者。例如，具有上述的(a-1)及(a-5)所示之特徵的細胞為本發明的較佳的一實施形態。
在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，例如，為表現前列腺素E2
(PGE2
)及/或血管內皮增殖因子(VEGF)者，為前列腺素E2
(PGE2
)時，藉由以TNFα刺激細胞，其表現量會增加。VEGF因係具有血管新生作用的物質，故多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞藉由將此投予至人類，而可透過VEGF在體內促進血管的形成，因此可使用作為應發揮血管新生作用之疾病的治療劑。又，PGE2
因具有強力的抗發炎作用，故多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係藉由將此投予至人類，而透過PGE2
在體內作用於發炎部位，可抑制伴隨發炎之組織破壞，因此可使用作為伴隨發炎之組織破壞的抑制劑。但是，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞的效果並未受限於透過VEGF與PGE2
而發揮者。
在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，係在IFN-γ的存在下進行培養時，使犬尿胺酸的分泌量增加者。犬尿胺酸可抑制T細胞的增殖，且使單核球分化成抗發炎性的M2巨噬細胞。因此，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係藉由將此投予至人類，而可透過犬尿胺酸發揮抗發炎作用。
在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD34、及CD206的至少一個或全部為陰性。又，在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個或全部為陰性。
在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD19、CD26、CD106、CD117、及CD271的至少一個，例如此等全部為陰性。
在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD140b、及HLA-A、B、C的至少一個，例如此等全部為陽性。
在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD10、CD46、CD47、CD55、CD58、及CD59的至少一個，例如此等全部為陽性。
在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45的至少一個為陰性。
在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性。此時，在以IFN-γ刺激細胞時，例如，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性。而且，為表現前列腺素E2
及/或血管內皮增殖因子(VEGF)者，為前列腺素E2
時，藉由以TNFα刺激細胞，其分泌量會增加。再者，藉由以IFN-γ進行刺激，犬尿胺酸的分泌量會增加。
本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，係在培養時會分泌各種液性因子者。
(a-8)在一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在培養時，會表現MMP-2、IGFBP-4、及胱抑素C的至少一個，較佳為表現此等全部者。
(a-9)在一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在培養時，會表現IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、GROα、HGF、VEGF、VCAM-I、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1的至少一個，較佳為表現此等全部者。
(a-10)又，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在培養時，會表現IL-23、TNF-α、IL-18、IL-33、IL-27、TARC、ENA-78、MIP-3α、MIP-1β、IP-10(CXCL10)、SCF、及ICAM-1的至少一個，較佳為表現此等全部者。
(a-11)又，在一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在培養時，不表現IL-21、伊紅趨素(Eotaxin)、MIP-1α、MIG、I-TAC、及GM-CSF的至少一個，較佳為不表現此等全部者，或幾乎不表現者。
(a-12)又，在一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在TNF-α存在下或IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，IL-6的表現量會增加者。
(a-13)又，在一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在TNF-α存在下或IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，IL-11的表現量會增加者。
(a-14)又，在一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在TNF-α存在下或IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，IP-10(CXCL10)的表現量會增加者。
(a-15)又，在一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在TNF-α存在下或IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，MCP-1的表現量會增加者。
(a-16)又，在一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在TNF-α存在下進行培養時雖誘導GM-CSF的表現，但在IFN-γ存在下進行培養時不會誘導GM-CSF的表現者。
(a-17)又，在一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在TNF-α存在下進行培養時，相較於在不存在此下進行培養時，HGF的表現量會減少，另一方面，在IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此下進行培養時，HGF的表現量會增加者。
(a-18)又，在一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在TNF-α存在下進行培養時，相較於在不存在此下進行培養時，IL-8的表現量會增加者。
(a-19)又，在一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在TNF-α存在下進行培養時雖誘導G-CSF的表現，但在IFN-γ存在下進行培養時不會誘導G-CSF的表現者。
在一實施形態中，本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，較佳為具有上述的(a-8)～(a-19)所示之特徵之2個以上，更佳為3個以上，再佳為4個以上，又再佳為此等全部的特徵者。例如，具有上述的(a-8)、(a-14)及(a-19)所示之特徵的細胞、具有上述的(a-8)、(a-13)、(a-14)及(a-19)所示之特徵的細胞為本發明的較佳的一實施形態。
本發明的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，可為幾乎被源自牙髓的多潛能幹細胞佔據者。平面培養中之源自牙髓的多潛能幹細胞，在光學顯微鏡下，多數情形係在細胞培養盤上以略紡錘形的固著細胞的形態被觀察者。但是，依據培養條件，不限於一定以紡錘形的固著細胞的形態被觀察者。
在本發明中稱為「牙髓」時，係指由包含血管、神經及淋巴管之結締組織與在邊緣部中具有從象牙質的內側進行沉積與修復的能力之生齒細胞(odontoblast)層所構成之充滿齒的牙髓腔之疏鬆結締組織。又，牙髓可依據存在部位而區分成冠部牙髓與根部牙髓，但在本發明中稱為牙髓時，係指至少包含冠部牙髓或根部牙髓之任一者。又，在本發明中能使用之牙髓的來源動物種類無特別限制，但動物種類較佳為哺乳動物，更佳為靈長類，再佳為人類。
用於取得牙髓之齒，可為永久齒亦可為乳齒，又，可為門齒、犬齒、小臼齒、及大臼齒之任一者。此齒較佳為未罹患蛀牙等之健康的齒。例如，藉由手術所拔齒之健康的拔齒體可較佳地使用於本發明。尤其，第3大臼齒因由每1個齒所得之牙髓的量多，又，因齒的矯正等理由而容易以拔齒體的形態取得健康狀態者，故可特別適合地使用。於此，取得齒之人類的年齡並無特別限定，但較佳為由10歲至50歲之人類所取得的齒，更佳為由15歲至45歲之人類所取得的齒。又，取得齒之人類的性別亦無特別限制。
用於取得牙髓之齒，較佳為使用拔齒後72小時以內，更佳為拔齒後24小時以內者，再佳為拔齒後12小時以內者。拔齒體在以重碳酸林格氏液等進行清洗後，以殺菌劑進行殺菌處理。此時能使用之殺菌劑並無特別限定，但較佳為對於革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌皆顯示抗菌作用者，例如，能使用1%葡萄糖酸洛赫西定(chlorhexidine gluconate)溶液。
牙髓可藉由機械性破碎拔齒體而使牙髓露出，藉此從拔齒體取得。由拔齒體取出之牙髓，較佳為使用剪刀等器具切碎後，藉由蛋白酶而被消化。
藉由以蛋白酶進行消化，構成牙髓之各個細胞會由從拔齒體所取得之牙髓游離。此時能使用之蛋白酶，較佳為包含絲胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶、或此等的混合物者，但並非特別受限於此等，只要為可使構成牙髓之各個細胞游離的蛋白酶，亦即可分解蛋白質性的細胞接著分子者即可。
作為此時所適合使用之金屬蛋白酶，可列舉基質金屬蛋白酶、中性金屬蛋白酶、或此等的混合物。作為基質金屬蛋白酶，可較佳地使用膠原蛋白酶、明膠酶、或此等的混合物。又，作為膠原蛋白酶，較佳為膠原蛋白酶I、膠原蛋白酶II、或此等的混合物。作為中性金屬蛋白酶，可較佳地使用嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、DispaseTM
、或此等的混合物。
作為較佳的蛋白酶的組合之一例，可列舉膠原蛋白酶I、膠原蛋白酶II、及嗜熱菌蛋白酶的混合物。將此混合物使用作為蛋白酶之情形，反應液中的蛋白酶的活性，較佳為被調整成0.17～1.33單位/mL。含有膠原蛋白酶I、膠原蛋白酶II及嗜熱菌蛋白酶之Liberase(註冊商標)(Roche公司)，可較佳地使用作為蛋白酶。
使用膠原蛋白酶第II型與Dispase的混合液之情形，膠原蛋白酶第II型與Dispase的濃度分別較佳為1～2mg/mL與3000～7000單位/mL，更佳為約1.5mg/mL與約5000單位/mL。
將從拔齒體所取得之牙髓藉由蛋白酶進行消化之際，較佳的反應溫度為35～37.5℃，又較佳的反應時間為30分鐘～3小時。例如，牙髓係藉由蛋白酶而在37℃處理2小時。但是，反應溫度及反應時間應依據蛋白酶的種類、濃度等而適當調整。
藉由蛋白酶而消化之牙髓，因使構成牙髓的各個細胞從牙髓游離，故可藉由移液器(pipetting)等機械性手段進行解體。此時，在藉由機械性手段將牙髓進行解體前，較佳為先使蛋白酶不活化。此可藉由在反應溶液中添加使蛋白酶不活化的成分而進行，作為此種成分，有EDTA等螯合劑、含有FBS之細胞培養用培養基等。藉由將牙髓進行解體，能獲得構成牙髓的細胞等以浮游狀態存在於溶液中之懸浮物。在此懸浮物中，包含從牙髓游離之多潛能幹細胞。為了將蛋白酶與上清液一起去除，較佳為先將此懸浮物進行一次離心，使細胞等不溶物沉澱。沉澱的細胞等係在去除上清液後再次懸浮。作為再懸浮所使用之溶液，例如，可使用含有FBS之細胞培養用培養基。如此進行所得之牙髓的懸浮物中，除了從牙髓游離之細胞，亦包含牙髓的組織片。
已使牙髓的解體物懸浮於細胞培養用培養基之牙髓懸浮物係添加至細胞培養盤，並被培養在該盤上。能使用於此之細胞培養用培養基，較佳為已添加胎牛血清之達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)。添加於培養基之胎牛血清的濃度(v/v%)，較佳為8～25%，更佳為10～25%，例如為20%。將達爾伯克改良伊格爾培養基(胎牛血清添加前)的詳細組成之一例顯示於表1。亦可適當將3～5mM，例如4mM之L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸添加至培養基。又，依據所期望，亦可將鏈黴素等抗生素添加至培養基。將鏈黴素添加至培養基之情形，以在培養基中其濃度成為10mg/L～250mg/L之方式，例如以成為100mg/L之方式進行。又，各成分能被取代成其同等物，例如其鹽。
將從1個拔齒體，例如1個成人的第3大臼齒所得之牙髓的懸浮物在細胞培養盤上進行培養之情形，該盤的培養面積較佳為0.3～4cm2
，更佳為0.6～2cm2
，例如為1cm2
。添加於細胞培養盤之培養基的量，每1cm2
培養面積，較佳為250μL～1mL，例如為500μL。例如，將已使從1個成人的第3大臼齒所得之牙髓的懸浮物懸浮在500μL的培養基而成者，添加至培養面積為1cm2
的細胞培養盤上並培養細胞。
[表1]
| 表1 達爾伯克改良伊格爾培養基的組成 | ||
| 成分 | mM (範圍) | mM (較佳例) |
| 胺基乙酸 | 0.2～0.6 | 0.4 |
| L-精胺酸鹽酸鹽 | 0.3～0.5 | 0.398 |
| L-胱胺酸・二鹽酸鹽 | 0.15～0.25 | 0.201 |
| L−L-麩醯胺酸 | 3～5 | 4 |
| L-組胺酸鹽酸鹽一水合物 | 0.15～0.25 | 0.2 |
| L-異白胺酸 | 0.65～0.95 | 0.802 |
| L-白胺酸 | 0.65～0.95 | 0.802 |
| L-離胺酸鹽酸鹽 | 0.65～0.95 | 0.798 |
| L-甲硫胺酸 | 0.15～0.25 | 0.201 |
| L-苯基丙胺酸 | 0.2～0.6 | 0.4 |
| L-絲胺酸 | 0.2～0.6 | 0.4 |
| L-蘇胺酸 | 0.65～0.95 | 0.798 |
| L-色胺酸 | 0.06～0.1 | 0.0784 |
| L-酪胺酸二鈉二水合物 | 0.2～0.6 | 0.398 |
| L-纈胺酸 | 0.65～0.95 | 0.803 |
| 氯化膽鹼 | 0.02～0.04 | 0.0286 |
| D-泛酸鈣 | 0.007～0.009 | 0.00839 |
| 葉酸 | 0.008～0.01 | 0.00907 |
| 菸鹼酸醯胺 | 0.03～0.05 | 0.0328 |
| 吡哆醇鹽酸 | 0.015～0.025 | 0.0196 |
| 核黃素 | 0.0008～0.0012 | 0.00106 |
| 鹽酸噻胺 | 0.01～0.014 | 0.0119 |
| i-肌醇 | 0.03～0.05 | 0.04 |
| 氯化鈣(無水物) | 1.5～2.1 | 1.8 |
| 三硝酸鐵(III)・九水合物 | 0.0002～0.0004 | 0.000248 |
| 硫酸鎂 | 0.65～0.95 | 0.814 |
| 氯化鉀 | 5～6 | 5.33 |
| 碳酸氫鈉 | 40～48 | 44.05 |
| 氯化鈉 | 100～120 | 110.34 |
| 磷酸二氫鈉一水合物 | 0.65～0.95 | 0.906 |
| D-葡萄糖 | 5～7 | 5.56 |
| 酚紅 | 0.03～0.05 | 0.0399 |
| 丙酮酸鈉 | 0.8～1.2 | 1 |
將牙髓懸浮物在細胞培養盤上進行培養時的溫度，較佳為35～37.5℃，例如為37℃。牙髓懸浮物的培養，例如，進行直至藉由細胞增殖而在該盤上形成目視可見的大小的群落為止。此時的群落，從上方觀察時呈略圓形，其直徑為1～3mm左右，但不特別限定於此等，例如，群落亦有不定型之情形。牙髓懸浮物的培養中，培養基係以成分保持在某一定範圍內之方式與新培養基進行交換。培養基的交換，例如，每1～6日、每2～4日、每1日、每2日、每3日、每4日進行。培養基的交換，可將培養基的全部量交換成新的培養基，亦可交換一部分。將培養基的一部分交換成新的培養基之情形，去除舊的培養基之例如1/4～4/5、1/4、1/3、1/2、或4/5量，接著添加等量之新的培養基。在此培養基交換的過程中，亦可去除牙髓的懸浮物所含之浮游細胞、組織片等。
藉由培養牙髓的懸浮物而在細胞培養盤上形成群落之細胞，可藉由將此以蛋白酶進行處理而使其從該盤剝離並回收。此時能使用之蛋白酶，只要為可分解蛋白質性的細胞接著分子者則無特別限定，但較佳為絲胺酸蛋白酶，更佳為胰蛋白酶。使用胰蛋白酶之情形，其濃度較佳為0.1～0.5%(w/v)，更佳為0.25%(w/v)。
由上述盤所回收之細胞，係在懸浮於細胞培養用培養基後被添加至細胞培養盤，在該盤上開始培養。將此稱為初次的細胞培養。此時能使用之培養基，較佳為已添加胎牛血清之達爾伯克改良伊格爾培養基。添加至培養基之胎牛血清的濃度(v/v%)，較佳為8～25%，更佳為8～20%，例如為10%。將達爾伯克改良伊格爾培養基(胎牛血清添加前)的詳細組成之一例揭示於表1。亦可適當地將3～5mM，例如4mM之L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸添加至培養基。又，依據期望，可將鏈黴素等抗生素添加至培養基，但通常在培養基中不添加抗生素。將鏈黴素添加至培養基之情形，以濃度成為10mg/L～250mg/L之方式，例如成為100mg/L之方式進行添加。又，各成分能取代成其同等物，例如其鹽。
在開始上述的初次的細胞培養之際，以在細胞培養盤上的活細胞密度較佳為成為2000～30000細胞/cm2
之方式，更佳為成為3000～20000細胞/cm2
之方式，例如成為3000細胞/cm2
、5000細胞/cm2
、10000細胞/cm2
、20000細胞/cm2
之方式，添加細胞。細胞的培養中，培養基係以成分保持在某一定範圍內之方式被交換。此時，培養基的交換，例如每1～6日、每2～4日、每1日、每2日、每3日、或每4日進行。培養基的交換，可將培養基的全部量交換成新的培養基，亦可交換一部分。將培養基的一部分交換成新的培養基之情形，係去除舊的培養基之例如1/4～4/5、1/4、1/3、1/2、或4/5量，接著添加等量的新的培養基。在此培養基交換的過程中，去除原本細胞所含之浮游細胞等的結果，選擇固著於細胞培養盤之細胞。
初次的細胞培養較佳為進行至細胞培養盤上的細胞幾乎成為融合(confluent)為止。例如，培養係進行直至細胞培養盤的細胞可固著的面成為85%以上、90%以上、或95%以上被細胞佔據的狀態為止。在細胞培養盤上被培養至幾乎成為融合為止之細胞，可藉由將使以蛋白酶進行處理而使其從該盤剝離並回收。此時能使用之蛋白酶中，只要為可分解蛋白質性的細胞接著分子者則無特別限定，但較佳為絲胺酸蛋白酶，更佳為胰蛋白酶。使用胰蛋白酶之情形，其濃度較佳為0.1～0.5%(w/v)，更佳為0.25%(w/v)。
由上述盤所回收之細胞，在再次懸浮於細胞培養用培養基後被添加至細胞培養盤，如此在該盤上進行培養。此時能使用之培養基，較佳為已添加胎牛血清之達爾伯克改良伊格爾培養基。添加於培養基之胎牛血清的濃度(v/v%)，較佳為8～25%，更佳為8～20%，例如為10%。將達爾伯克改良伊格爾培養基(胎牛血清添加前)的詳細組成之一例揭示於表1。亦可適當地將3～5mM，例如4mM之L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸添加至培養基。又，依據期望，可將鏈黴素等抗生素添加至培養基，但通常在培養基中不添加抗生素。將鏈黴素添加至培養基之情形，以濃度成為10mg/L～250mg/L之方式，例如成為100mg/L之方式進行添加。又，各成分能取代成其同等物，例如其鹽。而且，細胞培養進行至細胞培養盤上的細胞幾乎成為融合為止。例如，培養係進行直至細胞培養盤的細胞可固著的面成為85%以上、90%以上、或95%以上被細胞佔據的狀態為止。
如此進行，重複從細胞培養盤回收細胞與在細胞培養盤上的培養，藉此可使源自牙髓的多潛能幹細胞的細胞數增加。又，藉由培養中的培養基交換，而去除浮游細胞，優先地回收固著於細胞培養盤之細胞(其結果，被選擇)。源自牙髓的多潛能幹細胞因具有固著於細胞培養盤之性質，故藉由重複此過程，而使多潛能幹細胞變得富集。亦即，經過將牙髓懸浮物培養在細胞培養盤上之步驟、之後在培養後從該盤進行回收之步驟的細胞，為多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞。如此進行，藉由重複從細胞培養盤回收細胞與培養細胞，而使多潛能幹細胞變得更富集。
從細胞培養盤回收細胞與培養細胞，亦包含初次的細胞培養，較佳為重複3～20次，更佳為3～8次，再佳為4～8次，例如4次、5次、6次、7次或8次。在細胞培養盤上進行增殖所得之細胞，在初次的細胞培養結束時間點以光學顯微鏡進行觀察時，其多數為表現略紡錘形的形態之源自牙髓的多潛能幹細胞，但亦包含除此以外的細胞。藉由重複3次從細胞培養盤回收細胞與培養細胞，而使源自牙髓的多潛能幹細胞富集至源自牙髓的多潛能幹細胞幾乎佔據為止。若重複從細胞培養盤回收細胞與培養細胞，則源自牙髓的多潛能幹細胞逐漸富集，在光學顯微鏡下進行觀察時，變得幾乎未觀察到表現略紡錘形的形態之源自牙髓的多潛能幹細胞以外的細胞。亦即，藉由重複5次以上從細胞培養盤回收細胞與培養細胞，而源自牙髓的多潛能幹細胞變得實質上分離。
如此進行所得之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞所含之細胞整體中，源自牙髓的多潛能幹細胞所佔比例，較佳為99%以上，更佳為99.5%以上，再佳為99.9%以上，又再佳為99.95%以上。源自牙髓的多潛能幹細胞的比例，例如，可藉由在光學顯微鏡下進行觀察時，將表現略紡錘形的形態之細胞數除以全部細胞數而求取。
如此所得之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，可在已懸浮於冷凍保存液的狀態下進行冷凍保存。為了成為冷凍保存的對象，在細胞培養盤上的細胞的平均倍化時間較佳為96小時以內，更佳為84小時以內，更佳為72小時以內，再佳為48小時以內，例如36小時以內，特佳為24小時以內。可對平均倍化時間設定基準，將平均倍化時間為某一定時間以內者進行冷凍保存，供於之後的利用。作為此基準，例如可適當地設定為84小時以內、72小時以內、48小時以內。不滿足此基準值之細胞，藉由不進行冷凍保存且丟棄，而可選擇性僅保存具有某一定以上的細胞分裂能力之細胞。為平均倍化時間愈短細胞分裂能力愈高之細胞。
此時使用之冷凍保存液的組成，只要為可不使哺乳動物細胞，尤其人類的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞死亡地冷凍、解凍者，則無特別限制。冷凍保存液包含細胞保護劑。細胞保護劑，例如為具有抑制在使細胞冷凍時細胞內形成冰的結晶而破壞細胞之功能者。作為細胞保護劑之較佳者，可列舉二甲亞碸(DMSO)、乙二醇、丙二醇、絲膠、甘油。亦可將此等之中2個以上加以組合而使用作為細胞保護劑。使用二甲亞碸作為細胞保護劑之情形，其濃度較佳為5～15%(v/v)，更佳為9～11%(v/v)，例如為10%(v/v)。冷凍保存液亦可包含緩衝劑。緩衝劑較佳為可將水溶液的pH調整成6～8，例如6.8～7.8者。作為此緩衝劑，可列舉例如含有碳酸離子、檸檬酸離子及鈉離子者。冷凍保存液亦可更包含人類血清白蛋白。使用人類血清白蛋白之情形，其濃度較佳為40～100g/L，更佳為46～56g/L，例如為51g/L。在後述之重碳酸林格氏液中添加人類血清白蛋白溶液與二甲亞碸者，為作為冷凍保存液之較佳的一例。此外，後述之中間體細胞用冷凍保存液與製劑細胞用冷凍保存液皆為冷凍保存液。在製造步驟中設有使中間體細胞冷凍的步驟之情形，為了方便，將前者稱為第一冷凍保存液(中間體細胞用冷凍保存液)，將後者稱為第二冷凍保存液(製劑細胞用冷凍保存液)。
已冷凍保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，亦可使用作為後述之源自牙髓的細胞製劑，又，亦可使用作為(為了之後進一步增殖所保存之)中間體細胞。針對將多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞作為中間體細胞進行冷凍保存之情形，以下進行詳述。
將多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞作為中間體細胞進行冷凍保存之情形(以下，稱為「將細胞作為中間體細胞進行冷凍之情形」)時，從細胞培養盤回收細胞與培養細胞，亦包含初次的細胞培養，較佳為重複3～8次，再佳為4～8次，例如，4次、5次、6次、7次或8次。
又，將細胞作為中間體細胞進行冷凍之情形時，從藉由培養牙髓懸浮物而形成在細胞培養盤上之群落所回收之細胞，在將細胞進行冷凍前係在細胞培養盤上進行培養，較佳為使其分裂10次以上，更佳為使其分裂15次以上。冷凍保存分裂例如13～20次、13～23次、14～20次的細胞。理論上，藉由使其分裂15次，細胞數會增加至3×104
倍以上。
又，將細胞作為中間體細胞進行冷凍之情形時，從1個拔齒體(例如1個第三大臼齒)所得之細胞的數，通常較佳為成為3×105
個以上，更佳為成為1×106
個以上，再佳為成為1×109
個以上，使細胞增殖。
又，在作為中間體細胞之成為冷凍保存的對象中，在細胞培養盤上的細胞的平均倍化時間，較佳為96小時以內，更佳為84小時以內，更佳為72小時以內，再佳為48小時以內，例如特佳為24小時以內、36小時以內。在平均倍化時間設定基準，將平均倍化時間為某一定時間以內者進行冷凍保存，可供於之後的利用。作為此基準，例如可適當設定為84小時以內、72小時以內、48小時以內。不滿足此基準值之細胞，藉由不進行冷凍保存並丟棄，而可選擇性保存僅具有某一定以上的細胞分裂能力之細胞。可謂為平均倍化時間愈短細胞分裂能力愈高的細胞。
將細胞作為中間體細胞進行冷凍之情形，在冷凍保存前，藉由以蛋白酶進行處理而使其從細胞培養盤剝離並回收之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，係以清洗溶液進行清洗。此時使用之清洗溶液，係為了充分地去除培養基與蛋白酶者，其組成並無特別限定，可使用生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、乙酸林格氏液、重碳酸林格氏液等，但較佳為在重碳酸林格氏液中添加人類血清白蛋白之溶液。乙酸林格氏液及重碳酸林格氏液可使用市售者。例如，作為乙酸林格氏液，可使用PLASMA-LYTE(註冊商標)A(Baxter公司)、Physio(註冊商標)140(大塚製藥公司)，作為重碳酸林格氏液，可使用BICARBON(註冊商標)注(AJINOMOTO公司)。將較佳的重碳酸林格氏液的成分組成及電解質濃度的一例分別揭示於表2及表3。
[表2]
| 表2 重碳酸林格氏液的成分組成 | ||
| 成分 | mM (範圍) | mM (較佳例) |
| 氯化鈉 | 94.5～116 | 105 |
| 氯化鉀 | 3.62～4.42 | 4.02 |
| 氯化鈣二水合物 | 1.35～1.65 | 1.5 |
| 氯化鎂六水合物 | 0.45～0.55 | 0.5 |
| 碳酸氫鈉 | 22.5～27.5 | 25 |
| 檸檬酸鈉二水合物 | 1.5～1.84 | 1.67 |
| pH 6.8～7.8，對於生理食鹽水之滲透壓比0.9～1.0 |
[表3]
表3 重碳酸林格氏液所含之電解質濃度
| 電解質 | mEq/L (範圍) | mEq/L (較佳例) |
| Na+ | 122～149 | 135 |
| K+ | 3.6～4.4 | 4 |
| Ca2+ | 2.7～3.3 | 3 |
| Mg2+ | 0.9～1.1 | 1 |
| Cl- | 102～124 | 113 |
| HCO3 - | 22.5～27.5 | 25 |
| 檸檬酸根3- | 4.5～5.5 | 5 |
又，作為在重碳酸林格氏液中添加人類血清白蛋白之清洗溶液的成分組成，將較佳的一例揭示於表4。又，作為在重碳酸林格氏液中添加人類血清白蛋白之清洗溶液所含之電解質濃度，將較佳的一例揭示於表5。此外，在表4及表5所示之清洗溶液的成分之中，可省略乙醯基色胺酸鈉與辛酸鈉。
[表4]
| 表4 清洗溶液的成分組成 | ||
| 成分 | mM (範圍) | mM (較佳例) |
| 氯化鈉 | 90～110 | 100 |
| 氯化鉀 | 3.45～4.21 | 3.83 |
| 氯化鈣二水合物 | 1.29～1.57 | 1.43 |
| 氯化鎂六水合物 | 0.429～0.525 | 0.477 |
| 碳酸氫鈉 | 21.4～26.2 | 23.8 |
| 檸檬酸鈉二水合物 | 1.43～1.75 | 1.59 |
| 人類血清白蛋白 | (10.7～13.1) | (11.9) |
| 乙醯基色胺酸鈉 | 0.870～1.06 | 0.967 |
| 辛酸鈉 | 0.874～1.07 | 0.971 |
| (注)表中，人類血清白蛋白的濃度單位為g/L。 |
[表5]
表5 清洗溶液所含之電解質濃度(除了白蛋白)
| 成分 | mEq/L (範圍) | mEq/L (較佳例) |
| Na+ | 117.5～143.6 | 130.5 |
| K+ | 3.45～4.21 | 3.83 |
| Ca2+ | 2.57～3.15 | 2.86 |
| Mg2+ | 0.86～1.05 | 0.95 |
| Cl- | 96.8～118 | 107.6 |
| HCO3 - | 21.4～26.2 | 23.8 |
| 檸檬酸根3- | 4.28～5.24 | 4.76 |
| 乙醯基色胺酸離子 | 0.870～1.06 | 0.967 |
| 辛酸離子 | 0.874～1.07 | 0.971 |
將細胞作為中間體細胞進行冷凍之情形，以清洗溶液進行清洗後之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係暫時藉由離心分離等方法而被回收。被回收地細胞係在呈懸浮液的狀態(中間體細胞懸浮液)下被冷凍並保存。但是，亦可藉由將不回收細胞而使細胞懸浮之溶液的組成使用超過濾膜等進行取代，而製備中間體細胞懸浮液，並將此進行冷凍並保存。中間體細胞懸浮液的溶液部分(中間體細胞用冷凍保存液)的組成，只要為可不使哺乳動物細胞，尤其人類的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞死亡地進行冷凍、解凍者，則無特別限制。中間體細胞用冷凍保存液包含細胞保護劑。細胞保護劑，例如為具有在使細胞冷凍時抑制細胞內形成冰的結晶而破壞細胞之功能者。作為較佳的細胞保護劑，可列舉二甲亞碸(DMSO)、乙二醇、丙二醇、絲膠、甘油。亦可將此等組合2種以上而使用作為細胞保護劑。使用二甲亞碸作為細胞保護劑之情形，其濃度較佳為5～15%(v/v)，更佳為9～11%(v/v)，例如為10%(v/v)。冷凍保存液亦可包含緩衝劑。緩衝劑較佳為可將水溶液的pH調整成6～8，例如6.8～7.8者。作為此緩衝劑，可列舉例如含有碳酸離子、重碳酸離子、檸檬酸離子及鈉離子者。中間體細胞用冷凍保存液亦可進一步包含人類血清白蛋白。使用人類血清白蛋白之情形，其濃度較佳為40～100g/L，更佳為46～56g/L，例如為51g/L。
已在重碳酸林格氏液中添加人類血清白蛋白溶液與二甲亞碸者，係作為中間體細胞用冷凍保存液之一較佳例。中間體細胞用冷凍保存液較佳為，氯化鈉為59～80.4mM，氯化鉀為2.3～3.08mM，氯化鈣二水合物為0.85～1.16mM，氯化鎂六水合物為0.28～0.385mM，碳酸氫鈉為14～19.2mM，檸檬酸鈉二水合物為0.94～1.28mM，人類血清白蛋白為46～56g/L，乙醯基色胺酸鈉為3.73～4.55mM，辛酸鈉為3.74～4.58mM，DMSO為9～11%(v/v)。將中間體細胞用冷凍保存液的組成的較佳的一例揭示於表6。亦即，中間體細胞用冷凍保存液的組成大約係氯化鈉為65.8～80.4mM，氯化鉀為2.52～3.08mM，氯化鈣二水合物為0.95～1.16mM，氯化鎂六水合物為0.315～0.385mM，碳酸氫鈉為15.7～19.2mM，檸檬酸鈉二水合物為1.04～1.28mM，人類血清白蛋白為46～56g/L，乙醯基色胺酸鈉為3.73～4.55mM，辛酸鈉為3.74～4.58mM，DMSO為9～11%(v/v)。其中，可省略乙醯基色胺酸鈉與辛酸鈉。中間體細胞用冷凍保存液之對於生理食鹽水之滲透壓比，較佳為0.9～1.1。
又，包含鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、碳酸氫離子、檸檬酸離子、人類血清白蛋白、及二甲亞碸之溶液，可較佳地使用作為中間體細胞用冷凍保存液。例如，以下的溶液為一較佳例，所述溶液以91～113mM的濃度包含鈉離子，以2.52～3.08mM的濃度包含鉀離子，以0.95～1.16mM的濃度包含鈣離子，以0.315～0.385mM的濃度包含鎂離子，以15.6～19.2mM的濃度包含碳酸氫離子，以1.04～1.28mM的濃度包含檸檬酸離子，以46～56g/L的濃度包含人類血清白蛋白，及以9～11%(v/v)的濃度包含二甲亞碸。又，例如，以下的溶液為一較佳例，所述溶液以100～102mM的濃度包含鈉離子，以2.71～2.77mM的濃度包含鉀離子，以1.01～1.03mM的濃度包含鈣離子，以0.335～0.345mM的濃度包含鎂離子，以16.9～17.2mM的濃度包含碳酸氫離子，以1.13～1.15mM的濃度包含檸檬酸離子，以52.2～54.3g/L的濃度包含人類血清白蛋白，及以10.3～10.9%(v/v)的濃度包含二甲亞碸。再者，例如，以下的溶液為一較佳例，所述溶液以102mM的濃度包含鈉離子，以2.80mM的濃度包含鉀離子，以1.05mM的濃度包含鈣離子，以0.35mM的濃度包含鎂離子，以17.4mM的濃度包含碳酸氫離子，以1.16mM的濃度包含檸檬酸離子，以51g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以10%(v/v)的濃度包含二甲亞碸。再者，例如，以下的溶液為一較佳例，所述溶液以101mM的濃度包含鈉離子，以2.77mM的濃度包含鉀離子，以1.03mM的濃度包含鈣離子，以0.34mM的濃度包含鎂離子，以17.2mM的濃度包含碳酸氫離子，以1.15mM的濃度包含檸檬酸離子，以52g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以10%(v/v)的濃度包含二甲亞碸。進一步包含乙醯基色胺酸或其鹽之情形，其濃度較佳為3.73～4.55mM、4.24～4.41mM，例如為4.14mM、4.24mM。進一步包含辛酸或其鹽之情形，其濃度較佳為3.74～4.58mM、4.25～4.43mM，例如為4.16mM、4.25mM。
[表6]
| 表6 中間體細胞用冷凍保存液的成分組成 | ||||
| 成分 | mM (較佳範圍1) | mM (較佳範圍2) | mM (較佳例1) | mM (較佳例2) |
| 氯化鈉 | 65.8～80.4 | 70.8～72.3 | 73.1 | 72.3 |
| 氯化鉀 | 2.52～3.08 | 2.71～2.77 | 2.80 | 2.77 |
| 氯化鈣二水合物 | 0.95～1.16 | 1.01～1.03 | 1.05 | 1.03 |
| 氯化鎂六水合物 | 0.315～0.385 | 0.335～0.345 | 0.35 | 0.34 |
| 碳酸氫鈉 | 15.67～19.15 | 16.9～17.2 | 17.41 | 17.2 |
| 檸檬酸鈉二水合物 | 1.04～1.28 | 1.13～1.15 | 1.16 | 1.15 |
| 人類血清白蛋白 | (46～56) | (52.2～54.3) | (51) | (52.2) |
| 乙醯基色胺酸鈉 | 3.73～4.55 | 4.24～4.41 | 4.14 | 4.24 |
| 辛酸鈉 | 3.74～4.58 | 4.25～4.43 | 4.16 | 4.25 |
| DMSO | (9～11) | 10.3～10.9) | (10) | (10) |
| (注)人類血清白蛋白的濃度單位為g/L，DMSO的濃度單位為%(v/v)。 |
將細胞作為中間體細胞進行冷凍之情形，使多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞懸浮於中間體細胞用冷凍保存液的狀態之在懸浮液中之細胞密度並無特別限制，但較佳為2×106
～8×107
個/mL，更佳為4×106
～3×107
個/mL，再佳為8×106
～2×107
個/mL，例如為1.1×107
個/mL。已懸浮於中間體細胞用冷凍保存液之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在分注於細胞冷凍保存用容器後，被冷凍保存。
此時，分注於1個細胞冷凍保存用容器之細胞懸浮液的量，應依據用途等而適當調整，但較佳為1～20mL。又，分注於1個細胞冷凍保存用容器之細胞數，較佳為5×106
～9.2×108
個。
針對能使用作為細胞冷凍保存用容器之容器，只要其素材表現在低溫下的耐久性，且即使將內容物進行冷凍解凍亦不會破損者，則無特別限定。亦可使用市售者作為細胞的冷凍保存用容器。例如，玻璃製及塑膠製(例如，聚烯烴樹脂製)的低溫保存管(cryotube)，可適當地使用作為細胞冷凍保存用容器。於此，作為玻璃製者，尤其可較佳地使用素材為硼矽酸玻璃之小瓶。又，於此，在聚烯烴樹脂中，包含聚乙烯、高密度聚乙烯、低密度聚乙烯、聚丙烯、由乙烯與丙烯所組成之共聚物、熱塑性彈性體。細胞的冷凍較佳為藉由在將細胞懸浮液分注至細胞冷凍保存用容器並密封後，階段地使其溫度降低而進行。例如，作為細胞的冷凍方法，可採用在到達-6℃為止前以每1分鐘1℃的速度使溫度降低，之後進行急速冷凍之方法。細胞係以冷凍狀態被保存，但將細胞進行冷凍保存之溫度，較佳為-130℃以下，更佳為-170℃以下，再佳為-180℃以下。例如，細胞可在將細胞冷凍保存用容器浸至液體氮(沸點：-196℃)的狀態下進行保存。
如此作為中間體細胞而進行冷凍保存的細胞，係在使用時進行解凍，被供至用於製造源自牙髓的細胞製劑之下一個步驟。
在多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞之製造步驟中，設定將已增殖的細胞作為中間體細胞而暫時保存之步驟一事，在多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞的步驟管理上非常有意義。例如，無法一次取得所期望量的拔齒體之情形，若將已取得的拔齒體作為原材料，隨時開始源自牙髓的細胞的培養並製造成最終產品，則最終產品的批次尺寸變小，批次管理變得繁雜。然而，藉由事前製造並保存中間體細胞，而累積一定量的中間體細胞的結果，可將此以1批次的形式開始下一個製造步驟，因此可增大最終產品的批次尺寸，批次管理變得容易。
又，藉由設定以中間體細胞的形式進行保存之步驟，而在製造步驟的中間階段，變得能基於細胞的特性等而進行品質檢查。因此，變得能僅在以中間體細胞的形式所得之細胞為滿足所期望的品質基準者之情形，而將此供至下一個製造步驟。亦即，在中間體細胞的製造步驟結束時或其前後，可去除不滿足所期望的品質基準之細胞。藉此，不滿足所期望的品質基準之細胞變得無法進入後續的步驟，因此可提高製造滿足所期望的品質基準之最終產品的機率。亦即，可使製造時的產率上升，可刪減製造成本。
在製造步驟中將細胞進行冷凍保存一事，一般而言在冷凍的前後，伴隨著細胞的特性會變化的危險性。又，依據細胞，亦有冷凍保存後的細胞增殖能力會劣化者。相對於此，在本發明中以中間體細胞的形式所得之細胞，在冷凍的前後未確認到細胞的特性的變化，又，亦未確認到冷凍保存後的細胞增殖能力的劣化。
用於作為中間體細胞而保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，較佳為此所含之細胞中的活細胞的比例高。冷凍保存前的活細胞的比例(細胞的生存率)，較佳為50%以上，更佳為60%以上，更佳為70%以上，例如較佳為80%以上、90%以上、95%以上。藉由適當設定基準，亦可僅將冷凍保存前的細胞的生存率為某一定的數值以上者作為中間體細胞而保存。
用於作為中間體細胞而保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在活體外的環境下，較佳為經過10次以上的細胞分裂者，例如經過15次以上、16次以上、或17次以上的細胞分裂者，而且，較佳為在該細胞分裂期間中之平均細胞分裂時間為48小時以內者。
此外，在本發明中，在活體外的環境下使其進行細胞分裂係指例如將細胞在與細胞培養用的培養基一起添加至細胞培養用燒瓶等培養容器的狀態下使其進行細胞分裂。此時的培養溫度，較佳為34～38℃，更佳為36～38℃，例如為37℃。又，細胞較佳為在5%CO2
的存在下的濕潤環境進行培養。此時能使用之細胞培養用的培養基，只要為可使用於哺乳動物細胞的培養者則無特別限定，例如為含有胎牛血清(FBS)之達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)。培養基所含之FBS的濃度，較佳為2～20%，更佳為5～20%，再佳為8～15%，例如為10%。又，DMEM所含之葡萄糖的濃度為5～20mM，例如為5mM。作為較佳的培養條件，可列舉培養溫度為37℃，在5%CO2
存在下的濕潤環境，培養基含有約5mM的葡萄糖與10%FBS之DMEM者。實施例5所記載之源自牙髓的細胞的培養法(亦即，細胞培養盤上，已添加10%FBS之含有5.56mM 葡萄糖的DMEM培養基，5%CO2
存在下，37℃)，係用於在活體外的環境下使其進行細胞分裂的較佳方法的一例。
在活體外的環境下使其進行細胞分裂之情形的細胞的繼代，係使細胞從培養容器剝離，接著，以培養容器的底面積的1/20～1/3被細胞覆蓋之方式，將此細胞接種至新的培養容器而進行。在藉由細胞進行分裂而成為培養容器的底面積的70%以上、80%以上、或90%以上被細胞覆蓋的狀態之情形中，重複繼代。
在一實施形態中，用於作為中間體細胞而保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在利用含有已知會誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，整體地觀察聚蛋白多醣的表現量增加。又，用於作為中間體細胞而保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在利用含有已知會誘導往骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，整體地觀察細胞中之鈣的累積量是否增加。亦即，該多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在進行整體觀察時，具備分化成軟骨細胞及骨細胞的能力。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，CD34及CD45的至少一個為陰性。例如，該細胞，在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD73及CD90為陽性，且CD34為陰性。又，例如，該細胞，在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在進行整體觀察時，例如，在表面抗原標記的表現型中，CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原的至少一個為陰性。該細胞，在將此進行整體觀察時，例如，在表面抗原標記的表現型中，CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性。此等表面抗原標記為陽性的細胞，已知在移植至同種異型的個體時，作為抗原而被辨識，而呈現被從活體內排除之傾向。此等表面抗原標記的至少一個為陰性一事，表示以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞具有低免疫原性的性質，在移植至同種異型的個體時，有難以被從活體內排除之傾向。又，在此等表面抗原標記的表現型中，在以IFNγ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原可成為陽性。例如，在此等表面抗原標記的表現型中，在以IFN-γ刺激細胞時、CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性。又，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(b-1)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、CD90、CD147、及HLA-A、B、C的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為80%以上，更佳為90%以上，再佳為95%以上為陽性。
又，在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(b-2)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD29、CD46、CD55、CD59、CD73、及CD140b的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為70%以上，更佳為80%以上，再佳為90%以上為陽性。
又，在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(b-3)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD9、CD44、CD49b、CD49c、CD98、及EGF-R的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為65%以上，更佳為75%以上，再佳為80%以上為陽性。
又，在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(b-4)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD49f、及CD166的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為60%以上，更佳為70%以上，再佳為75%以上為陽性。
又，在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(b-5)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD10、CD13、CD58、CD63、CD105、CD151、及CD164的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為60%以上，更佳為65%以上為陽性，再佳為70%以上為陽性。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，較佳為具有上述的(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、及(b-5)所示之特徵之2個以上，更佳為3個以上，再佳為此等全部的特徵者。例如，具有上述的(b-1)及(b-2)所示之特徵的細胞為本發明的較佳的一實施形態。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(b-6)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD120b、CD132、CD158a、CD161、CD184、CD195、CD206、CD210、CD212、CD226、CD244、CD267、CD278、CD279、CD282、CD294、NKB1、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81、Vβ23、SSEA-3、CLA、及整聯蛋白β7的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為5%以下，再佳為2%以下，又更佳為僅1%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(b-7)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD8b、CD11b、CD15s、CD16、CD19、CD24、CD31、CD32、CD62E、CD62P、CD66f、CD86、CD88、CD94、CD100、CD103、CD104、CD114、CD117、CD118、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD135、CD137、CD137配體、CD150、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD197、CD220、CD229、CD231、CD255、CD268、CD305、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、BLTR-1、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R、Vβ8、不變性NKT、及γδTCR的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為5%以下的細胞，再佳為僅2%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，
(b-8)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD1a、CD1b、CD1d、CD2、CD3、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD11c、CD15、CD18、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27、CD28、CD33、CD34、CD35、CD37、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42b、CD45、CD45RB、CD45RO、CD48、CD50、CD53、CD62L、CD64、CD66(a、c、d、e)、CD69、CD70、CD72、CD74、CD80、CD84、CD85、CD87、CD89、CDw93、CD97、CD106、CD134、CD138、CD141、CD144、CD154、CD158b、CD162、CD183、CD205、CD235a、CD271、CD309、CD326、CD337、αβTCR、及第二類MHC抗原的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為僅5%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，較佳為具有上述的(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)、及(b-8)所示之特徵之2個以上，更佳為3個以上，再佳為此等全部的特徵者。例如，具有上述的(b-1)及(b-6)所示之特徵的細胞為本發明的較佳的一實施形態。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在進行整體觀察時，例如為表現前列腺素E2
(PGE2
)及/或血管內皮增殖因子(VEGF)者，在為前列腺素E2
(PGE2
)時，藉由以TNFα刺激細胞，而其表現量會增加。
在本發明的一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，係在IFN-γ存在下進行培養時，使犬尿胺酸的分泌量增加者。
在本發明的一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD34、及CD206的至少一個或全部為陰性。又，在另一實施形態中，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個或全部為陰性。
在本發明的一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45的至少一個為陰性。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性。此時，在以IFN-γ刺激細胞時，例如，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性。又，表現前列腺素E2
(PGE2
)及/或血管內皮增殖因子(VEGF)者，在為前列腺素E2
(PGE2
)時，藉由以TNFα刺激細胞，其分泌量會增加。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在進行整體觀察時，在利用含有已知會誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基進行培養之情形中，聚蛋白多醣的表現量會增加。又，在利用含有已知會誘導分化成骨細胞之物質的培養基進行培養之情形中，細胞中之鈣的累積量會增加。亦即，該多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在進行整體觀察時，具有分化成軟骨細胞及骨細胞的能力。
亦可將基於以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞所應顯示之上述的表面抗原標記表現型及/或其他基因表現型，藉由適當設定的基準，僅將顯示特定的表現型之細胞作為中間體細胞而進行保存之方式，使用於製造步驟的管理。
以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，幾乎被源自牙髓之多潛能幹細胞(源自牙髓的多潛能幹細胞)佔據。此等係在平面培養中的光學顯微鏡下，以略紡錘形的固著細胞的形式被觀察，略紡錘形的細胞在細胞整體所佔之比例，較佳為99%以上，更佳為99.5%以上，再佳為99.9%以上，再佳為99.95%以上。源自牙髓的多潛能幹細胞的比例，可藉由在光學顯微鏡下進行觀察時，將表現略紡錘形的形態之細胞數除以全部細胞數而求取。藉由基於上述而適當設定的基準，亦可將僅將略紡錘形的細胞的比例為某一定以上之細胞群作為中間體細胞而進行保存之方式，使用於製造步驟的管理。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在整體地進行觀察時，較佳為具有分化成軟骨細胞的能力與分化成骨細胞的能力者。亦即，在利用含有已知會誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基進行培養之情形，中間體細胞的聚蛋白多醣的表現量會增加。又，中間體細胞，在整體地進行觀察時，在利用含有已知會誘導分化成骨細胞之物質的培養基進行培養之情形，細胞中之鈣的累積量會增加。中間體細胞具有分化成軟骨細胞的能力及分化成骨細胞的能力一事，可分別利用實施例20及實施例19所記載之方法進行調查。可僅將藉由此等方法而顯示具有分化成軟骨細胞的能力與分化成骨細胞的能力之細胞群設為應保存的中間體細胞。但是，用於調查分化能力的方法，不限定於實施例20及19所記載之方法。亦可將僅藉由其他適當的手法而顯示具有分化成軟骨細胞的能力與分化成骨細胞的能力之細胞群設為應保存的中間體細胞。
在一實施形態中，以中間體細胞的形式所保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，可為與以下所詳述之供至進一步的培養步驟之中間體細胞相同，或實質上具有相同性質者。
以中間體細胞的形式所冷凍保存之細胞，較佳為在解凍前與解凍後，保持其特性。亦即，作為中間體細胞而進行冷凍保存之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，較佳為在已將此解凍時，生存率、表面抗原標記的表現型、細胞的形態、分化能力等係與解凍前的細胞實質上相同。藉由確認解凍後或者進行解凍而培養時的中間體細胞的特性，可僅將在解凍的前後保持其特性之細胞作為中間體細胞而供至後續的培養步驟。
以中間體細胞的形式所冷凍保存之細胞，解凍後的生存率較佳為50%以上，更佳為60%以上，更佳為70%以上，例如生存率較佳為80%以上、90%以上、95%以上。藉由適當設定的基準，可僅將解凍後的生存率為某一定的數值以上之中間體細胞供至後續的培養步驟。解凍後的細胞的生存率大約為80%～98%、85%～95%。
以中間體細胞的形式所冷凍保存之細胞，在解凍後進行培養時，較佳為具有10次以上的細胞分裂能力，更佳為具有15次以上的細胞分裂能力，例如為具有14次以上的細胞分裂能力者。又，以中間體細胞的形式所冷凍保存之細胞，在解凍後進行培養時，在細胞培養盤上的平均倍化時間較佳為96小時以內，更佳為84小時以內，更佳為72小時以內，更佳為48小時以內，再佳為36小時以內。例如，亦可在細胞分裂能力及平均倍化時間設定基準，僅將細胞分裂能力為一定以上且平均倍化時間為某一定的時間以內者供至後續的利用。此基準，例如可適當設定具有10次以上的細胞分裂能力且平均倍化時間為96小時以內者、具有14次以上的細胞分裂能力且平均倍化時間為72小時以內者、具有15次以上的細胞分裂能力且平均倍化時間為72小時以內者等。藉由不使用不滿足此基準之細胞，可僅將具有某一定以上的細胞分裂能力之中間體細胞供至後續的培養步驟。在該步驟的培養條件，針對多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，可為與上述之至此的培養條件相同或同等者。
作為中間體細胞而被冷凍保存之細胞，在活體外的環境下，較佳為經過10次以上的細胞分裂者，例如經過15次以上、16次以上、或17次以上的細胞分裂者，且較佳為，在該細胞分裂期間中之平均細胞分裂時間為48小時以內者。
供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在利用含有已知會誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，整體地觀察聚蛋白多醣的表現量的增加。又，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在利用含有已知會誘導往骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，整體地觀察細胞中之鈣的累積量是否增加。該細胞，在進行整體觀察時，具備分化成軟骨細胞及骨細胞的能力。
在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在整體地進行觀察時，在解凍後或者進行解凍而培養時的在表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，CD34及CD45的至少一個為陰性。例如，該細胞的CD73、CD90為陽性，且CD34為陰性。又例如，CD73、CD90為陽性，且CD34為陰性。該細胞的CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性。
又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在進行整體觀察時，剛解凍後或進行解凍而培養時的在表面抗原標記的表現型中，CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原的至少一個為陰性。例如，CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性。此等的表面抗原標記為陽性的細胞，已知在移植至同種異型的個體時，作為抗原而被辨識，而呈現被從活體內排除之傾向。此等的表面抗原標記為陰性，表示供至進一步的培養步驟之中間體細胞為低免疫原性，在移植至同種異型的個體時，有難以被從活體內排除之傾向。又，在此等表面抗原標記的表現型中，在以IFN-γ刺激細胞時、CD40、CD80、CD86保持陰性，第二類MHC抗原可成為陽性。例如，在以IFN-γ刺激細胞時，在此等表面抗原標記的表現型中，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性。
在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在剛解凍後或者進行解凍而培養時進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性。又，在以IFN-γ刺激細胞時、CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性。
在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，
(c-1)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、CD90、CD147、及HLA-A、B、C的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為80%以上，更佳為90%以上，再佳為95%以上為陽性。
又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，
(c-2)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD29、CD46、CD55、CD59、CD73、及CD140b的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為70%以上，更佳為80%以上，再佳為90%以上為陽性。
又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，
(c-3)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD9、CD44、CD49b、CD49c、CD98、及EGF-R的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為65%以上，更佳為75%以上，再佳為80%以上為陽性。
又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，
(c-4)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD49f、及CD166的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為60%以上，更佳為70%以上，再佳為75%以上為陽性。
又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，
(c-5)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD10、CD13、CD58、CD63、CD105、CD151、及CD164的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為60%以上，更佳為65%以上為陽性，再佳為70%以上為陽性。
在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，較佳為具有上述的(c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、及(c-5)所示之特徵之2個以上，更佳為3個以上，再佳為此等全部的特徵者。例如，具有上述的(c-1)及(c-2)所示之特徵之細胞為本發明的較佳的一實施形態。
在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，
(c-6)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD120b、CD132、CD158a、CD161、CD184、CD195、CD206、CD210、CD212、CD226、CD244、CD267、CD278、CD279、CD282、CD294、NKB1、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81、Vβ23、SSEA-3、CLA、及整聯蛋白β7的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為5%以下，再佳為2%以下，又再佳為僅1%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，
(c-7)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD8b、CD11b、CD15s、CD16、CD19、CD24、CD31、CD32、CD62E、CD62P、CD66f、CD86、CD88、CD94、CD100、CD103、CD104、CD114、CD117、CD118、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD135、CD137、CD137配體、CD150、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD197、CD220、CD229、CD231、CD255、CD268、CD305、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、BLTR-1、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R、Vβ8、不變性NKT、及γδTCR的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為5%以下的細胞，再佳為僅2%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，
(c-8)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD1a、CD1b、CD1d、CD2、CD3、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD11c、CD15、CD18、CD21、CD22、CD23、CD25、CD26、CD27、CD28、CD33、CD34、CD35、CD37、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42b、CD45、CD45RB、CD45RO、CD48、CD50、CD53、CD62L、CD64、CD66(a、c、d、e)、CD69、CD70、CD72、CD74、CD80、CD84、CD85、CD87、CD89、CDw93、CD97、CD106、CD134、CD138、CD141、CD144、CD154、CD158b、CD162、CD183、CD205、CD235a、CD271、CD309、CD326、CD337、αβTCR、及第二類MHC抗原的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為僅5%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，較佳為具有上述的(c-1)、(c-2)、(c-3)、(c-4)、(c-5)、(c-6)、(c-7)、及(c-8)所示之特徵之2個以上，更佳為3個以上，再佳為此等全部的特徵者。例如，具有上述的(c-1)及(c-6)所示之特徵之細胞為本發明的較佳的一實施形態。
又，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在進行整體觀察時，例如表現前列腺素E2
(PGE2
)及/或血管內皮增殖因子(VEGF)，在為前列腺素E2
(PGE2
)時，藉由以TNF-α刺激細胞，而其表現量會增加。
在本發明的一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，係在IFN-γ存在下進行培養時，使犬尿胺酸的分泌量增加者。
在本發明的一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD34、及CD206的至少一個或全部為陰性。又，在本發明的一實施形態中，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個或全部為陰性。
在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD19、CD26、CD106、CD117、及CD271的至少一個為陰性，例如此等全部為陰性。
在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD140b及HLA-A、B、C的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
在本發明的一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD46、CD47、CD55、CD58、及CD59的至少一個，例如此等全部為陽性。
在本發明的一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45的至少一個為陰性。
又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在整體地進行觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性。此時，以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性。又，表現前列腺素E2
(PGE2
)及/或血管內皮增殖因子(VEGF)，在為前列腺素E2
(PGE2
)時，藉由以TNFα刺激細胞，其分泌量會增加。再者，藉由以IFN-γ進行刺激，而犬尿胺酸的分泌量會增加。
供至進一步的培養步驟之中間體細胞，係在培養此時，會分泌各種液性因子者。
(c-9)在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在培養此時，表現MMP-2、IGFBP-4、及胱抑素C的至少一個，較佳為表現此等全部者。
(c-10)在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在培養此時，表現IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、GROα、HGF、VEGF、VCAM-1、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1的至少一個，較佳為表現此等全部者。
(c-11)又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在培養此時，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在培養此時，表現IL-23、TNF-α、IL-18、IL-33、IL-27、TARC、ENA-78、MIP-3α、MIP-1β、IP-10(CXCL10)、SCF、及ICAM-1的至少一個，較佳為表現此等全部者。
(c-12)又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在培養此時，不表現IL-21、IFN-α、Eotaxin、MIP-1α、MIG、I-TAC、及GM-CSF的至少一個，較佳為不表現此等全部者，或幾乎不表現者。
(c-13)又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，係在將此在TNF-α存在下或在IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，IL-6的表現量會增加者。
(c-14)又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在將此在TNF-α存在下或IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，IL-11的表現量會增加者。
(c-15)又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在將此在TNF-α存在下或在IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，IP-10(CXCL10)的表現量會增加者。
(c-16)又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在將此在TNF-α存在下或IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，MCP-1的表現量會增加者。
(c-17)又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞在將此在TNF-α存在下進行培養時，誘導GM-CSF的表現，但在IFN-γ存在下進行培養時，不誘導GM-CSF的表現者。
(c-18)又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在將此在TNF-α存在下進行培養時，相較於在其非存在下進行時，HGF的表現量會減少，另一方面，將此在IFN-γ存在下進行培養時，相較於在其非存在下進行時，HGF的表現量會增加者。
(c-19)又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在將此在TNF-α存在下進行培養時，相較於在不存在此下進行培養時，IL-8的表現量會增加者。
(c-20)又，在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在將此在TNF-α存在下進行培養時，誘導G-CSF的表現，但在IFN-γ存在下進行培養時，不誘導G-CSF的表現者。
在一實施形態中，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，較佳為具有上述的(c-9)～(c-20)所示之特徵之2個以上，更佳為3個以上，再佳為4個以上，又再佳為此等全部的特徵者。例如，具有上述的(c-9)、(c-15)及(c-20)所示之特徵之細胞、具有上述的(c-9)、(c-14)、(c-15)及(c-20)所示之特徵之細胞為本發明的較佳的一實施形態。
又，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在整體地進行觀察時，在剛解凍後或者進行解凍而培養之情形中，具有分化成軟骨細胞的能力與分化成骨細胞的能力。亦即，在利用含有已知會誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基進行培養之情形中，聚蛋白多醣的表現量會增加，又，在利用含有已知會誘導分化成骨細胞之物質的培養基進行培養之情形中，細胞中之鈣的累積量會增加。中間體細胞具有分化成軟骨細胞的能力及分化成骨細胞的能力一事，可分別以實施例20及實施例19所記載之方法進行調查。藉由此等方法，可僅將顯示具有分化成軟骨細胞的能力與分化成骨細胞的能力之細胞群作為供至進一步的培養步驟之中間體細胞。但是，調查此等分化能力之方法，不限定於實施例所記載之方法。藉由其他適當的手法，亦可僅將顯示具有分化成軟骨細胞的能力與分化成骨細胞的能力之細胞群作為中間體細胞而供至後續的培養步驟。
亦可將基於供至進一步的培養步驟之中間體細胞所應顯示之上述的表面抗原標記表現型及/或其他基因表現型，藉由適當設定的基準，僅將顯示特定的表現型之細胞作為供至進一步的培養步驟之中間體細胞之方式，使用於製造步驟的管理。
又，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在剛解凍後或者進行解凍而培養時進行整體觀察時，幾乎被源自牙髓的多潛能幹細胞佔據。其等在平面培養中的光學顯微鏡下，以略紡錘形的固著細胞的形式被觀察，略紡錘形的細胞在細胞整體所佔之比例，較佳為99%以上，更佳為99.5%以上，再佳為99.9%以上，再佳為99.95%以上。藉由基於上述而適當設定的基準，亦可僅將略紡錘形的細胞的比例為某一定以上之細胞群作為中間體細胞而供至後續的培養步驟。
又，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係在將此進行解凍而培養時，較佳為具有10次以上的細胞分裂能力，更佳為具有15次以上的細胞分裂能力，例如為具有14次以上的細胞分裂能力者。又，供至進一步的培養步驟之中間體細胞，在將此進行解凍而在細胞培養盤上進行培養時的平均倍化時間，較佳為96小時以內者，更佳為84小時以內者，再佳為72小時以內者，再佳為48小時以內者，再佳為36小時以內者。此時的細胞的培養條件，係與上述的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞的培養條件相同或同等者，例如能使用實施例5所記載之條件(亦即，在細胞培養盤上，已添加10%FBS之含有5.56mM葡萄糖的DMEM培養基，5%CO2
存在下，37℃)。藉由基於上述而適當設定的基準，可僅將細胞分裂能力為某一定以上之細胞群作為中間體細胞而供至後續的培養步驟。又藉由適當設定的基準，亦可僅將平均倍化時間為某一定的時間內之細胞群作為中間體細胞而供至後續的培養步驟。作為此基準，例如為具有10次以上的細胞分裂能力且平均倍化時間為96小時以內者、具有14次以上的細胞分裂能力且平均倍化時間為72小時以內者、具有15次以上的細胞分裂能力且平均倍化時間為72小時以內者。
亦即，供至進一步的培養步驟之中間體細胞係保持所謂具有高分裂能力且可分化成二種以上的細胞之幹細胞的性質者。供至進一步的培養步驟之中間體細胞亦可為具有高群落形成能力之細胞。於此，所謂群落形成能力，係指在將細胞接種至盤並進行培養時，在盤上細胞會分裂而形成群落的能力。
中間體細胞，在將此進行解凍時，在溶液中，例如在培養基中浮游的狀態下的直徑的平均，較佳為20μm以下、18μm以下，例如為10～20μm、10～18μm、12～20μm、14～20μm、16～20μm。
以下，將在中間體細胞的製造步驟結束時或其前後所實施之品質檢查的項目，例示作為品質檢查a～k。品質檢查係針對此等項目的1或2以上而進行。亦可將此等項目全部實施。此時供於品質檢查之細胞，可為以下任一者：(1)將作為中間體細胞而懸浮於冷凍保存液前的細胞之一部分進行分取而得的細胞；(2)將作為中間體細胞而懸浮於冷凍保存液前的細胞之一部分進行分取，使其進一步繼代而得的細胞；(3)為了作為中間體細胞而冷凍之懸浮於冷凍保存液的冷凍前的細胞；(4)將作為中間體細胞而冷凍者剛解凍後的細胞；或(5)將作為中間體細胞而冷凍者進行解凍並進一步培養而得的細胞。只要無特別指定，則可針對此等(1)～(5)的細胞的二種以上進行相同的品質檢查。
(品質檢查a)在光學顯微鏡下進行觀察時，細胞整體中，表現略紡錘形的形態所佔之細胞數的比例為99%以上、99.5%以上、99.9%以上、或99.95%以上之驗證；
(品質檢查b)細胞的生存率為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或95%以上之驗證；
(品質檢查c)在細胞的表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性之驗證、或
在細胞的表面抗原標記的表現型中，CD73及CD90的至少一個為陽性，且CD34為陰性之驗證；
(品質檢查d)在細胞的表面抗原標記的表現型中，CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性之驗證、或
在細胞的表面抗原標記的表現型中，CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原的至少一個為陰性之驗證；
(品質檢查e)在細胞的表面抗原標記的表現型中，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性之驗證、或
在細胞的表面抗原標記的表現型中，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40為陰性、CD80為陰性、CD86為陰性、及第二類MHC抗原為陽性的至少一個之驗證；
(品質檢查f)細胞為表現前列腺素E2
(PGE2
)及/或血管內皮增殖因子(VEGF)者，且在為前列腺素E2
(PGE2
)時，藉由以TNFα刺激細胞，其表現量會增加之驗證；
(品質檢查g)在利用含有已知會誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，聚蛋白多醣的表現量會增加之驗證；
(品質檢查h)在利用含有已知會誘導往骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，細胞中之鈣的累積量會增加之驗證；
(品質檢查i)在細胞培養盤上，具有10次以上、14次以上、或15次以上的細胞分裂能力之驗證；
(品質檢查j)在細胞培養盤上的細胞的平均倍化時間，在該品質檢查i的實施期間中，為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內之驗證。
(品質檢查k)在使細胞在培養基中浮游的狀態下的平均的直徑為20μm以下、18μm以下、10～20μm、10～20μm、10～18μm、12～20μm、14～20μm、或16～20μm之驗證。
上述品質檢查，可針對(品質檢查a)～(品質檢查j)之10項目進行實施。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意9項目進行實施。選擇9項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a、b、c、d、e、f、g、i、及j，但不受限。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意8項目進行實施。選擇8項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a、b、c、d、e、f、i、及j，但不受限。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意7項目進行實施。選擇7項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a、b、c、d、e、i、及j，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意6項目進行實施。選擇6項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a、b、c、d、i、及j，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意5項目進行實施。選擇5項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a、b、c、i、及j，但不受限於此。又，品質檢查，可從此等10項目之中選擇任意4項目進行實施。選擇4項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a、b、c、及j，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意3項目進行實施。選擇3項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a、b、及c，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意2項目進行實施。選擇2項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a及b、品質檢查a及c、品質檢查a及d、品質檢查a及e、品質檢查a及f、品質檢查a及g、品質檢查a及h、品質檢查a及i、品質檢查a及j、品質檢查b及c、品質檢查b及d、品質檢查b及e、品質檢查b及f、品質檢查b及g、品質檢查b及h、品質檢查b及i、品質檢查b及j、品質檢查c及d、品質檢查c及e、品質檢查c及f、品質檢查c及g、品質檢查c及h、品質檢查c及i、品質檢查c及j、品質檢查d及e、品質檢查d及f、品質檢查d及g、品質檢查d及h、品質檢查d及i、品質檢查d及j、品質檢查e及f、品質檢查e及g、品質檢查e及h、品質檢查e及i、品質檢查e及j、品質檢查f及i、品質檢查f及j、或品質檢查i及j，但不受限於此等。
[生產培養]
對於中間體細胞進行之更進一步的培養步驟，係到達製造成為最終產品之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞之培養步驟，將此步驟特稱為生產培養。
能使用於生產培養之培養基，較佳為已添加胎牛血清之達爾伯克改良伊格爾培養基。添加於培養基之胎牛血清的濃度(v/v%)，較佳為8～25%，更佳為8～20%，例如為10%。將達爾伯克改良伊格爾培養基(胎牛血清添加前)的詳細組成之一例揭示於表1。依據期望，可將3～5mM，例如4mM之L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸添加至培養基。又，在生產培養中，通常不添加抗生素。但是，亦可將鏈黴素等抗生素添加至培養基。將鏈黴素添加至培養基之情形，以在培養基中的濃度成為10mg/L～250mg/L之方式，例如成為100mg/L之方式，添加鏈黴素。又，各成分能被其同等物，例如其鹽所取代。
生產培養亦可在細胞培養盤上進行培養，亦可在細胞培養裝置內，例如生物反應器內，在微載體上進行培養。又，生產培養亦可在細胞培養盤上培養細胞使其增殖後，再在細胞培養裝置內，例如生物反應器內，在微載體上進行。又，在微載體上培養細胞之情形中，亦可使用振盪燒瓶取代生物反應器。在生產培養中，在細胞培養盤上培養細胞之情形，其條件係與上述的培養牙髓懸浮物所得之細胞的培養條件相同或類似。亦即，係藉由將解凍後的中間體細胞在細胞培養盤上重複培養與回收，而使細胞數放大者。此外，作為生物反應器，可適當地使用GE healthcare公司、Merck公司、Sartorius公司等所市售者。以下，針對使用生物反應器作為細胞培養裝置之細胞的培養法進行特別詳述。
在生產培養中，使用生物反應器，在微載體上培養細胞之情形，將已接著細胞之微載體投入生物反應器，在培養基中攪拌微載體而培養細胞。微載體係細胞可接著之素材的粒子(小粒子)，且係用於在其表面上(為多孔性者時包含孔內的表面)培養細胞者。在其意義下，微載體亦可為載體粒子或載體小粒子。細胞培養時(亦即，水合時)的微載體的直徑(粒徑)，較佳為50～400μm，例如為80～300μm、80～250μm、100～200μm、130～180μm。微載體亦可為從粒子表面向內側開孔之多孔性者。為多孔性的微載體時，細胞培養時，其孔的直徑(孔徑)較佳為3～40μm，例如為5～25μm、10～20μm、5～15μm。
針對微載體的素材並無特別限定，只要可將細胞在與表面接著的狀態下進行培養者，則可使用該素材。作為微載體，有將高分子化合物成型成粒子狀者、陶瓷製粒子，玻璃製粒子等。作為此高分子化合物，可列舉例如，乙烯基樹脂、胺基甲酸酯樹脂、環氧樹脂、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate)聚酯、聚醯胺、聚醯亞胺、矽樹脂、酚樹脂、三聚氰胺樹脂、脲樹脂、苯胺樹脂、離子聚合物樹脂、聚碳酸酯、膠原蛋白、聚葡萄糖、明膠、纖維素、藻酸鹽及此等的混合物。微載體亦可為藉由細胞接著性分子等將其表面進一步修飾者。作為此細胞接著性分子，可列舉例如，明膠、角蛋白、彈性蛋白、硫酸類肝素(heparan sulfate)、聚葡萄糖、聚葡萄糖硫酸、硫酸軟骨素、玻尿酸鈉、n-異丙基丙烯醯胺、膠原蛋白I乃至XIX、纖維接合素、玻連蛋白(vitronectin)、層連結蛋白-1乃至12、氮、肌腱蛋白(tenascin)、血小板反應蛋白(thrombospondin)、骨橋蛋白(osteopontin)、纖維蛋白原、聚-D-離胺酸、聚-L-離胺酸、幾丁質、幾丁聚醣、瓊脂糖凝膠(sepharose)、層連結蛋白、巢蛋白I(entactin I)、或包含此等細胞接著性分子的細胞接著區域之片段或者肽、及此等的混合物。又，微載體的比重，其相對於培養基之比重較佳為接近1，較佳為0.9～1.2，例如為0.9～1.1、約1.0。
素材為明膠質且細胞培養時的粒徑為130～180μm，孔徑為10～20μm(或5～15μm)者，可較佳地使用作為微載體。
生產培養中之細胞往微載體的接著，係藉由在溶液中攪拌、混合細胞與微載體而進行。此步驟稱為細胞往微載體的接著步驟。在接著步驟中，在攪拌中與微載體接觸之細胞係依序接著於微載體的表面。能使用於此步驟之溶液，較佳為細胞培養用的培養基，但不特別受限於此。亦可斷續地進行接著步驟中之細胞與微載體的攪拌。此情形，例如，在進行1分鐘～20分鐘的攪拌後，使其靜置10分鐘～2小時。
將細胞培養用的培養基使用作為溶液而進行接著步驟之情形，該步驟亦可在生物反應器內進行。在生物反應器內進行接著步驟之情形，在生物反應器中投入細胞培養用的培養基、細胞及微載體並進行攪拌，使細胞接著於微載體。細胞的接著後，可直接在生物反應器內繼續細胞培養。亦可斷續地進行在生物反應器內的接著步驟中之細胞與微載體的攪拌。此情形，例如，在進行1分鐘～20分鐘的攪拌後，使其靜置10分鐘～2小時。
生物反應器，一般而言，為固定化酵素反應裝置等生化學的反應器、與發酵槽或生物學的排水處理裝置等生物學的反應器、微生物學的反應器。本發明中之能使用於後述實施例之生物反應器，適於使多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞接著於微載體並一邊在培養基中攪拌一邊進行培養。該生物反應器具有用於培養細胞之培養槽、用於攪拌培養基之攪拌裝置、氣相投入口、液相投入口、排水口、感測器部。培養槽係具有略圓筒型的內腔之槽。在此狀態下，可在培養槽內培養已接著微載體之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞。在培養槽的內腔中，設置有用於培養槽內的培養基之攪拌裝置。攪拌裝置，例如為葉輪，藉由其旋轉而攪拌培養基。由葉輪所致之培養基的攪拌，將幾乎全部之細胞已接著的微載體，調整成不會沉澱於培養槽的內腔的底面而在培養基中浮游的狀態。葉輪的旋轉速度係應依據培養槽的形狀、葉輪的形狀、微載體的種類等而適當選擇者，但例如為30～100rpm、50～80rpm、約70rpm。氣相投入口係在培養槽中用於送入空氣、氧、二氧化碳等氣相者。氣相投入口，其出口可在培養基的液面下，此情形，氣相成為氣泡而被送入培養基。液相投入口係用於將培養基、葡萄糖溶液等各種溶液投入培養槽內者。排水口係用於排出培養槽內的培養基者，在培養基交換之際，從此排水口排出培養基。排水口又可使用於將培養基與細胞已接著的微載體一起取出。在培養中採樣微載體時，或在培養結束後回收微載體之際，可使用此排水口。感測器部包含測定培養槽內的培養基的溫度、pH、溶存氧濃度之感測器。感測器部可進一步包含測定葡萄糖濃度、乳酸濃度之感測器。用於測定溶液的溫度、pH、溶存氧濃度、葡萄糖濃度及乳酸濃度之感測器，可從周知者進行適當選擇而設置。
生物反應器的培養槽被固定於生物反應器內，或以能卸除之方式設置。藉由將培養槽以能卸除之方式設置，而變得容易清洗培養槽。通常，培養槽為金屬製或硬質樹脂製，在使用後進行清洗而重複使用。取代此種培養槽，亦可在生物反應器內安裝柔軟的樹脂製的培養用袋，在袋內投入培養基及細胞而進行培養。培養用袋係以可與通常的培養槽同樣地進行處理之方式被支持在生物反應器內。培養用袋因可拋棄，故不需要使用後的清洗操作，可提高培養時的作業效率。
在生產培養中，在培養基中的葡萄糖濃度成為某值以下之情形中，在培養基中補充葡萄糖。例如，在葡萄糖濃度成為0.1mM以下之情形中，以最終濃度成為5～7mM之方式補充葡萄糖。又，在生產培養中，在乳酸濃度成為某值以上之情形中，交換培養基的全部或一部分。例如，在乳酸濃度成為20mM以上之情形中，交換培養基的全部，或以乳酸濃度成為例如5mM以下、2mM以下之方式，交換培養基的一部分。
在生物反應器內的培養中，由氣相投入口向培養基供給氧、空氣、及CO2
。氧的供給量被控制成培養基中的溶存氧濃度成為飽和濃度的50～100%，例如，溶存氧濃度被保持在50%或100%。又，CO2
的流量係以培養基的pH可適合細胞生長之方式，例如保持在7.0～7.8之方式被供給。溶存氧濃度及pH係利用感測器部經時地監測，因此所監測的數值在所設定之值以外時，藉由因應其而增減氧、CO2
的供給量，而可將溶存氧濃度、pH保持在一定的值。又，亦可配合細胞的增殖，而將追加的微載體供給至生物反應器內。
在生物反應器內的培養，係進行至微載體的表面的某比例被細胞佔據為止。此時的比例，例如可適當設定為20%、40%、85%、95%、98%。又，在生物反應器內的培養，係進行至在微載體的表面上的細胞密度成為某值為止地被細胞佔據為止。此時的細胞密度，例如可適當設定為3000、5000、10000、20000、22000個/cm2
。
生產培養結束後作為源自牙髓的細胞製劑而冷凍之細胞，在作為利用牙髓懸浮物的培養而在細胞培養盤上形成群落之細胞而進行回收後，較佳為分裂15次以上者，更佳為分裂20次以上者。例如，將分裂15～30次、15～23次、15～20次、20～30次、20～28次、或23～26次之細胞進行冷凍保存。
經過中間體細胞後在生產培養結束後作為源自牙髓的細胞製劑而冷凍之細胞，在作為利用牙髓懸浮物的培養而在細胞培養盤上形成群落之細胞而進行回收後，在做為中間體細胞為止前，較佳為已分裂10次以上者，更佳為已分裂15次以上者。例如，將已分裂13～20次、13～23次、或14～20次之細胞作為中間體細胞而冷凍保存。接著，在將中間體細胞進行解凍並開始之生產培養中，從開始起至做成源自牙髓的細胞製劑為止，較佳為使細胞分裂5次以上，例如較佳為分裂8次以上或10次以上。尤其，在使用生產培養中之微載體的培養之際，細胞較佳為分裂2～5次，例如較佳為分裂2～3次。
從中間體細胞起至取得源自牙髓的細胞製劑為止，將細胞進行培養並使其分裂時之細胞的平均倍化時間，在細胞培養盤上培養細胞之情形中，較佳為96小時以內，更佳為84小時以內，更佳為72小時以內，再佳為48小時以內，又更佳為36小時以內。從中間體細胞起至取得源自牙髓的細胞製劑為止，將細胞進行培養並使其分裂時之細胞的平均倍化時間，在使用微載體培養細胞之情形中，較佳為8日以內，更佳為6日以內，更佳為5日以內，更佳為4日以內，例如為2～8日、2～7日、2～6日、2.5～6日、或2.5～5.5日。
亦可對生產培養全期間中之或使用微載體之培養之際的細胞的平均倍化時間設定基準，僅將平均倍化時間為該基準以內者進行冷凍保存，供至後續的利用。作為此基準，例如可適當設定為在細胞培養盤上進行培養之情形中，為84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內，在使用微載體進行培養之情形中，為8日以內、6日以內、5日以內、4日以內或3日以內等。不滿足此基準值之細胞，藉由不進行冷凍保存並丟棄，而可僅將具有某一定以上的細胞分裂能力之細胞選擇性地作為源自牙髓的細胞製劑並保存。
在生產培養中，在取得源自牙髓的細胞製劑為止前，由1個拔齒體(例如1個第三大臼齒)所得之多潛能幹細胞的數，較佳為使細胞增殖至成為1×106
個以上為止，更佳為成為1×107
個以上為止，再佳為成為3×107
個以上為止，再佳為成為1×108
個以上為止，再佳為成為1×109
個以上為止，例如，成為1×107
～1×1010
個為止。理論上，藉由分裂20次、25次、及30次，細胞數會分別增加至1×106
倍以上、3×107
倍以上、及1×109
倍以上。
[製劑的製造]
生產培養結束後，微載體係在已與細胞接著的狀態下被回收，並在該狀態下被清洗。此時可使用作為用於清洗微載體之清洗液的溶液，只要為不傷害細胞且不阻礙絲胺酸蛋白酶及金屬蛋白酶，尤其胰蛋白酶的酵素活性者，則無特別限定，但較佳為生理食鹽水、PBS、DMEM Low Glucose培養基(不含血清)、具有表4所示之組成的清洗溶液，例如，可使用DMEM Low Glucose培養基(不含血清)。
清洗後的微載體可藉由蛋白酶而進行處理。此時能使用之蛋白酶中，只要為可分解蛋白質性的細胞接著分子者則無特別限定，但較佳為絲胺酸蛋白酶、金屬蛋白酶或其混合物，作為絲胺酸蛋白酶，胰蛋白酶為較佳者之一，作為金屬蛋白酶，明膠酶為較佳者之一。藉由進行蛋白酶處理，細胞從微載體游離。又，微載體的素材為明膠等蛋白質之情形，藉由蛋白酶處理，會分解微載體本身。此時若微載體為多孔性，則固著於孔內的表面之細胞亦從微載體游離。為多孔性的明膠質的微載體之情形，藉由以蛋白酶進行處理，而明膠被分解，獲得包含已游離的細胞與明膠的分解物之懸浮液。此情形，作為蛋白酶，特佳為胰蛋白酶、明膠酶、或其混合物。
微載體的素材為明膠等蛋白質之情形，藉由蛋白酶，獲得包含已從微載體游離的細胞與為微載體的材料之蛋白質的分解物(在素材為明膠時，為明膠的分解物)之懸浮液。在將已游離之源自牙髓的細胞製劑進行製劑化中，較佳為藉由細胞的清洗操作，由此懸浮液去除蛋白酶、微載體的材料的分解物等夾雜物。以下，針對微載體的材料為明膠之情形之細胞的清洗操作進行詳述。
藉由由蛋白酶所致之處理而得之懸浮液，可重複由離心分離所致之回收與由清洗溶液所致之懸浮而進行清洗。蛋白酶及細微的明膠的分解物可藉由離心分離而去除。但是，在明膠的分解物之中，在已進行離心時，有與細胞一起沉澱的大殘渣。此種明膠的粗大殘渣之去除，可藉由膜過濾等手段而進行。由此觀點而言，在進行膜過濾之情形，其過濾膜的孔徑較佳為20～80μm。例如，可使用孔徑為25μm、26μm、27μm、28μm、30μm、50μm、70μm、80μm的過濾膜。由過濾膜所致之過濾，藉由在以大孔徑的過濾膜進行過濾後，以小孔徑的過濾膜進行過濾，而可效率佳地防止過濾膜的堵塞。例如，可在最初以孔徑為60～100μm的過濾膜進行過濾後，以孔徑為25～50μm的過濾膜進行過濾，亦可在最初以孔徑為60～75μm的過濾膜進行過濾後，以孔徑為25～30μm的過濾膜進行過濾。由過濾膜所致之過濾，藉由僅以小孔徑的過濾膜進行過濾亦可進行。能使用於此情形之過濾膜的孔徑較佳為25～50μm，更佳為25～30μm，例如，孔徑為25μm、26μm、27μm、28μm、30μm的過濾膜。此時，明膠的粗大殘渣係不通過過濾膜而殘留，在濾液中回收細胞。但是，亦可藉由將不回收細胞而使細胞懸浮之溶液使用超過濾膜等取代成後述之冷凍保存液(製劑細胞用冷凍保存液)，而製備冷凍前製劑細胞懸浮液。
能使用於上述清洗操作之清洗溶液，係用於充分地去除培養基與蛋白酶者，在微載體為明膠等蛋白質之情形，為用於連其分解物亦去除者。該清洗溶液的組成並無特別限定，可使用生理食鹽水、磷酸緩衝生理食鹽水、乙酸林格氏液、重碳酸林格氏液等，但較佳為在重碳酸林格氏液中添加人類血清白蛋白之溶液。乙酸林格氏液及重碳酸林格氏液可使用市售者。例如，作為乙酸林格氏液，可使用PLASMA-LYTE A(Baxter公司)、Physio 140(大塚製藥公司)，作為重碳酸林格氏液，可使用BICARBON INJECTION(AJINOMOTO公司)。將較佳的重碳酸林格氏液的成分組成及電解質濃度的一例分別揭示於表2及表3。
作為清洗溶液的成分組成，將較佳的一例揭示於表4。又，作為清洗溶液所含之電解質濃度，將較佳的一例揭示於表5。此外，表4及表5所示之清洗溶液的成分之中，亦可省略乙醯基色胺酸鈉與辛酸鈉。
此外，為了在由蛋白酶所致之處理後去除夾雜物，在進行離心分離與膜過濾之情形，可先進行離心分離再進行膜過濾，亦可先進行膜過濾再進行離心分離，但較佳為先進行膜過濾再進行離心分離。
以清洗溶液清洗後的回收細胞，成為懸浮於冷凍保存液(製劑細胞用冷凍保存液)的狀態。將此懸浮液(冷凍前製劑細胞懸浮液)封入細胞冷凍保存用容器並已冷凍者，在源自牙髓的細胞製劑之中，成為最適合保存及輸送的形態。冷凍前製劑細胞懸浮液的溶液部分(製劑細胞用冷凍保存液)的組成，只要為可不使哺乳動物細胞死亡，尤其是人類的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞，而進行冷凍、解凍者，則無特別限制。製劑細胞用冷凍保存液包含細胞保護劑。細胞保護劑，例如為具有在使細胞冷凍時抑制細胞內形成冰的結晶而破壞細胞之功能者。作為較佳的細胞保護劑，可列舉二甲亞碸(DMSO)、乙二醇、丙二醇、絲膠、甘油。亦可將此等組合2種以上而使用作為細胞保護劑。使用二甲亞碸作為細胞保護劑之情形，其濃度較佳為5～15%(v/v)，更佳為9～11%(v/v)，例如為10%(v/v)。冷凍保存液亦可包含緩衝劑。緩衝劑較佳為可將水溶液的pH調整成6～8，例如6.8～7.8者。作為此緩衝劑，可列舉例如含有碳酸離子、重碳酸離子、檸檬酸離子及鈉離子者。製劑細胞用冷凍保存液亦可進一步包含人類血清白蛋白。使用人類血清白蛋白之情形，其濃度較佳為40～100g/L，更佳為46～56g/L，例如為51g/L。
已在重碳酸林格氏液中添加人類血清白蛋白溶液與二甲亞碸者，係作為製劑細胞用冷凍保存液之一較佳例。製劑細胞用冷凍保存液較佳為，氯化鈉為59～80.4mM，氯化鉀為2.3～3.08mM，氯化鈣二水合物為0.85～1.16mM，氯化鎂六水合物為0.28～0.385mM，碳酸氫鈉為14～19.2mM，檸檬酸鈉二水合物為0.94～1.28mM，人類血清白蛋白為46～56g/L，乙醯基色胺酸鈉為3.73～4.55mM，辛酸鈉為3.74～4.58mM，DMSO為9～11%(v/v)。表6所示之中間體細胞用冷凍保存液，亦可較佳地使用作為製劑細胞用冷凍保存液。
亦即，製劑細胞用冷凍保存液大約可較佳地使用可使用作為中間體細胞用冷凍保存液者。例如，其組成係氯化鈉為65.8～80.4mM，氯化鉀為2.52～3.08mM，氯化鈣二水合物為0.95～1.16mM，氯化鎂六水合物為0.315～0.385mM，碳酸氫鈉為15.7～19.2mM，檸檬酸鈉二水合物為1.04～1.28mM，人類血清白蛋白為46～56g/L，乙醯基色胺酸鈉為3.73～4.55mM，辛酸鈉為3.74～4.58mM，DMSO為9～11%(v/v)。除了表6所示者以外，氯化鈉為70.8～71.3mM，氯化鉀為2.71～2.73mM，氯化鈣二水合物為1.01～1.02mM，氯化鎂六水合物為0.335～0.345mM，碳酸氫鈉為16.9～17.0mM，檸檬酸鈉二水合物為1.12～1.14mM，人類血清白蛋白為53.6～54.3g/L，乙醯基色胺酸鈉為4.36～4.41mM，辛酸鈉為4.37～4.43mM，DMSO為10.6～10.9%(v/v)。此外，其等之中，可省略乙醯基色胺酸鈉與辛酸鈉。製劑細胞用冷凍保存液之對於生理食鹽水之滲透壓比，較佳為0.9～1.1。
又，包含鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、碳酸氫離子、檸檬酸離子、人類血清白蛋白、及二甲亞碸之溶液，可較佳地使用作為中間體細胞用冷凍保存液。例如，以下的溶液為一較佳例，所述溶液以91～113mM的濃度包含鈉離子，以2.52～3.08mM的濃度包含鉀離子，以0.95～1.16mM的濃度包含鈣離子，以0.315～0.385mM的濃度包含鎂離子，以15.6～19.2mM的濃度包含碳酸氫離子，以1.04～1.28mM的濃度包含檸檬酸離子，以46～56g/L的濃度包含人類血清白蛋白，及以9～11%(v/v)的濃度包含二甲亞碸。又，例如，以下的溶液為一較佳例，所述溶液以100～102mM的濃度包含鈉離子，以2.71～2.77mM的濃度包含鉀離子，以1.01～1.03mM的濃度包含鈣離子，以0.335～0.345mM的濃度包含鎂離子，以16.9～17.2mM的濃度包含碳酸氫離子，以1.13～1.15mM的濃度包含檸檬酸離子，以52.2～54.3g/L的濃度包含人類血清白蛋白，及以10.3～10.9%(v/v)的濃度包含二甲亞碸。再者，例如，以下的溶液為一較佳例，所述溶液以102mM的濃度包含鈉離子，以2.80mM的濃度包含鉀離子，以1.05mM的濃度包含鈣離子，以0.35mM的濃度包含鎂離子，以17.4mM的濃度包含碳酸氫離子，以1.16mM的濃度包含檸檬酸離子，以51g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以10%(v/v)的濃度包含二甲亞碸。再者，例如，以下的溶液為一較佳例，所述溶液以101mM的濃度包含鈉離子，以2.77mM的濃度包含鉀離子，以1.03mM的濃度包含鈣離子，以0.34mM的濃度包含鎂離子，以17.2mM的濃度包含碳酸氫離子，以1.15mM的濃度包含檸檬酸離子，以52g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以10%(v/v)的濃度包含二甲亞碸。再者，例如，以下的溶液為一較佳例，所述溶液以100mM的濃度包含鈉離子，以2.71mM的濃度包含鉀離子，以1.01mM的濃度包含鈣離子，以0.34mM的濃度包含鎂離子，以16.9mM的濃度包含碳酸氫離子，以1.13mM的濃度包含檸檬酸離子，以53.6g/L的濃度包含人類血清白蛋白，及以10.7%(v/v)的濃度包含二甲亞碸。
進一步包含乙醯基色胺酸或其鹽之情形，其濃度較佳為3.73～4.55mM，更佳為4.24～4.41mM，例如為4.14mM、4.24mM、4.36mM等。進一步包含辛酸或其鹽之情形，其濃度較佳為3.74～4.58mM，更佳為4.25～4.43mM，例如為4.16mM、4.25mM、4.37mM等。
對於懸浮於製劑細胞用冷凍保存液的狀態之懸浮液中之細胞密度並無特別限制，但較佳為5×106
～8×107
個/mL，更佳為1.5×107
～3×107
個/mL，再佳為2.1×107
～3.0×107
個/mL，例如為2.5×107
個/mL。已懸浮之多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在分注於細胞冷凍保存用容器後被冷凍保存。
在使多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞懸浮於製劑細胞用冷凍保存液的狀態中之細胞懸浮液的組成，係依據懸浮的細胞密度而異，但大約係氯化鈉為59～61mM，氯化鉀為2.3～2.6mM，氯化鈣二水合物為0.85～0.98mM，氯化鎂六水合物為0.28～0.32mM，碳酸氫鈉為14～16mM，檸檬酸鈉二水合物為0.94～1.08mM，人類血清白蛋白為49～50g/L，乙醯基色胺酸鈉為4.0～4.1mM，辛酸鈉為4.0～4.1mM，DMSO為9～11%(v/v)。
分注於1個細胞冷凍保存用容器之細胞懸浮液的量係應適當調整者，但較佳為1～20mL。又，分注於1個細胞冷凍保存用容器之細胞數，較佳為5×106
～9.2×108
個。
用於已懸浮於製劑細胞用冷凍保存液之細胞的冷凍保存的較佳的容器、細胞的冷凍及保存的流程及條件，係與針對中間體細胞的冷凍保存而已記載者同樣。
如此進行而冷凍保存之細胞，能使用作為包含多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞作為有效成分而成之醫藥(源自牙髓的細胞製劑)。此情形，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞係在冷凍狀態下進行搬送，在使用時進行解凍而投予至患者。
經過生產培養而得之源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，剛解凍後的生存率較佳為50%以上，更佳為60%以上，更佳為70%以上，例如，生存率較佳為80%以上、90%以上、95%以上。藉由適當設定的基準，可僅將生存率為某一定的數值以上者作為源自牙髓的細胞製劑而供應作為醫藥。
源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在利用含有已知會誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，整體地觀察聚蛋白多醣的表現量的增加。又，該細胞，在利用含有已知會誘導往骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，整體地觀察細胞中之鈣的累積量是否增加。亦即，該細胞，在進行整體觀察時，具備分化成軟骨細胞及骨細胞的能力。
在本發明的一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞係以86～161pg/104
個細胞的量表現血管生成素-1(Ang-1)者，相較於在為多能性細胞之點上為共通之源自人類骨髓的間葉系幹細胞，較佳為將此表現3倍以上，更佳為5倍以上，再佳為6倍以上，再佳為8倍以上。於此，血管生成素-1的表現量，例如為以實施例30所記載之方法所測定者。
又，在本發明的一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，此所產生之血管生成素-1的量，在分別培養該源自牙髓的細胞及源自人類骨髓的間葉系幹細胞時，相較於源自人類骨髓的間葉系幹細胞所產生之血管生成素-1的量，較佳為3倍以上，更佳為5倍以上，再佳為6倍以上，再佳為8倍以上。於此，能使用之細胞的培養法，例如為實施例30所記載者。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在整體地進行觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性。同樣地，該細胞的CD34及CD45的至少一個為陰性。例如，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在整體地進行觀察時，剛解凍後或者進行解凍而培養時的在表面抗原標記的表現型中，CD73及CD90為陽性，且CD34為陰性，或例如，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性。
又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在整體地進行觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原的至少一個為陰性。例如，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在整體地進行觀察時，剛解凍後或者進行解凍而培養時的表面抗原標記的表現型係CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性者。此等的表面抗原標記為陽性的細胞，已知在移植至同種異型的個體時，作為抗原而被辨識，而呈現被從活體內排除之傾向。此等的表面抗原標記的至少一個為陰性一事，表示多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞為低免疫原性，在移植至同種異型的個體時，有難以被從活體內排除之傾向。又，在此等表面抗原標記的表現型中，在以IFN-γ刺激細胞時、CD40、CD80、CD86保持陰性，第二類MHC抗原可成為陽性。例如，在以IFN-γ刺激細胞時，例如，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性。
又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在整體地進行觀察時，剛解凍後或者進行解凍而培養時的在表面抗原標記的表現型中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性。以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，
(d-1)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD29、CD44、CD59、及CD164的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為80%以上，更佳為90%以上，再佳為95%以上為陽性。
又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，
(d-2)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD9、CD13、CD46、CD47、CD58、CD63、CD73、CD81、CD90、CD98、CD147、HLA-A、B、C及EGF-R的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為70%以上，更佳為80%以上，再佳為90%以上為陽性。
又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，
(d-3)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD49b、CD49c、CD49e、CD55、CD95、CD151、及CD166的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為65%以上，更佳為75%以上為陽性，再佳為80%以上為陽性。
又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，
(d-4)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD10、CD49f、CD105、及CD140b的至少一個，較佳為此等全部為陽性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為60%以上，更佳為70%以上為陽性，再佳為75%以上為陽性。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，較佳為具有上述的(d-1)、(d-2)、(d-3)、及(d-4)所示之特徵之2個以上，更佳為3個以上，再佳為此等全部的特徵者。例如，具有上述的(d-1)及(d-2)所示之特徵之細胞為本發明的較佳的一實施形態。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，
(d-5)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD1a、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD11b、CD11c、CD15、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD28、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD37、CD38、CD41a、CD86、CD87、CD88、CD89、CDw93、CD94、CD100、CD102、CD103、CD114、CD117、CD118、CD120b、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD132、CD134、CD135、CD137、CD137配體、CD138、CD144、CD150、CD153、CD154、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD184、CD195、CD196、CD197、CD205、CD206、CD210、CD212、CD220、CD226、CD229、CD231、CD235a、CD244、CD255、CD267、CD268、CD278、CD279、CD282、CD294、CD305、CD309、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、CD337、BLTR-1、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R、SSEA-1、TRA-1-60、CLA、整聯蛋白β7、及不變性NKT的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為5%以下，再佳為2%以下，又再佳為僅1%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，
(d-6)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD1b、CD6、CD27、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD45、CD45RB、CD48、CD50、CD53、CD57、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD66b、CD66f、CD69、CD70、CD72、CD75、CD84、CD85、CD97、CD99R、CD183、CD193、SSEA-3、及γδTCR的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為5%以下，再佳為僅2%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，
(d-7)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD4v4、CD14、CD36、CD45RA、CD45RO、CD66(a、c、d、e)、CD79b、CD83、CD106、CD152、CD209、CD271、CD275、CD326、MIC A/B、及αβTCR的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為10%以下，更佳為僅5%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，
(d-8)在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD26、CD40、CD56、CD80、CD146、及第二類MHC抗原的至少一個，較佳為此等全部為陰性。於此，此等抗原，在觀察整體所含之各個細胞時，所觀察之細胞的較佳為20%以下，更佳為僅10%以下的細胞為陽性。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，較佳為，具有上述的(d-1)、(d-2)、(d-3)、(d-4)、(d-5)、(d-6)、(d-7)、及(d-8)所示之特徵之2個以上，更佳為3個以上，再佳為此等全部的特徵者。例如，具有上述的(d-1)及(d-5)所示之特徵之細胞為本發明的較佳的一實施形態。
又，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係在進行整體觀察時，在剛解凍後或者解凍後的培養中，表現前列腺素E2
(PGE2
)及/或血管內皮增殖因子(VEGF)者，在為前列腺素E2
(PGE2
)時，藉由以TNFα刺激細胞，其表現量會增加。
又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係在IFN-γ的存在下進行培養時，使犬尿胺酸的分泌量增加者。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD34、及CD206的至少一個或全部為陰性。又，在本發明的一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個或全部為陰性。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，CD19、CD26、CD34、CD56、CD106、CD117、CD146、及CD271的至少一個為陰性，例如此等全部為陰性。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD140b及HLA-A、B、C的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD10、CD49e及CD95的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
在本發明的一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD46、CD47、CD55、CD58、及CD59的至少一個，例如此等全部為陽性。
在本發明的一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45的至少一個為陰性。
又，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在剛解凍後或者進行解凍而培養時，在進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性。又，在以IFN-γ刺激細胞時，例如，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性。又，表現前列腺素E2
(PGE2
)及/或血管內皮增殖因子(VEGF)，在為前列腺素E2
(PGE2
)時，藉由以TNFα刺激細胞，其分泌量會增加。
源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在培養此時，係分泌各種液性因子者。
(d-9)在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係在培養此時，表現MMP-2、IGFBP-4、及胱抑素C的至少一個，較佳為表現此等全部者。
(d-10)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係在培養此時，表現IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、GROα、HGF、VEGF、VCAM-1、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1的至少一個，較佳為表現此等全部者。
(d-11)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係在培養此時，表現IL-23、IFN-α、TNF-α、IL-18、IL-27、TARC、ENA-78、MIP-3α、MIP-1β、IP-10(CXCL10)、SCF、及ICAM-1的至少一個，較佳為表現此等全部者。
(d-12)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係在培養此時，不表現IL-21、Eotaxin、MIP-1α、MIG、I-TAC、IP-10(CXCL10)、及GM-CSF的至少一個，較佳為不表現此等全部，或幾乎不表現者。
(d-13)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係在培養此時，IL-6、IL-23、IL-11、MCP-1、ENA-78、HGF、VEGF、MMP-2、IGFBP-4、胱抑素C、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1的表現量的至少一個相較於中間體細胞的表現量為增加者。例如，IL-6、IL-11、HGF、TIMP-3、及TIMP-1的表現量相較於中間體細胞的表現量為增加者。
(d-14)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，將此在TNF-α存在下或IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，IL-6的表現量會增加者。
(d-15)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，將此在TNF-α存在下或IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，IL-11的表現量會增加者。
(d-16)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，將此在TNF-α存在下或IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，IP-10(CXCL10)的表現量會增加者。
(d-17)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，將此在TNF-α存在下或IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此等下進行培養時，MCP-1的表現量會增加者。
(d-18)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係將此在TNF-α存在下進行培養時，誘導GM-CSF的表現，但在IFN-γ存在下進行培養時，不誘導GM-CSF的表現者。
(d-19)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係將此在TNF-α存在下進行培養時，相較於在不存在此下進行培養時，HGF的表現量會減少，另一方面，將此在IFN-γ存在下進行培養時，相較於在不存在此下進行培養時，HGF的表現量會增加者。
(d-20)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係將此在TNF-α存在下進行培養時，相較於在不存在此下進行培養時，IL-8的表現量會增加者。
(d-21)又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係將此在TNF-α存在下進行培養時，誘導G-CSF的表現，但在IFN-γ存在下進行培養時，不誘導G-CSF的表現者。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，較佳為，具有上述的(d-9)～(d-21)所示之特徵之2個以上，更佳為3個以上，再佳為4個以上，又再佳為此等全部的特徵者。例如，具有上述的(d-9)、(d-16)及(d-21)所示之特徵之細胞、具有上述的(d-9)、(d-15)、(d-16)及(d-21)所示之特徵之細胞為本發明的較佳的一實施形態。
又，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在剛解凍後或者進行解凍而培養時，在進行整體觀察時，在利用含有已知會誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基進行培養之情形中，聚蛋白多醣的表現量會增加。又，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在利用含有已知會誘導分化成骨細胞之物質的培養基進行培養之情形，在進行整體觀察時，細胞中之鈣的累積量會增加。亦即，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞具有分化成軟骨細胞及骨細胞的能力。源自牙髓的細胞製劑所含之細胞具有分化成軟骨細胞的能力及分化成骨細胞的能力一事，可分別以實施例20及實施例19所記載之方法進行調查。可僅將藉由此等方法確認具有分化成軟骨細胞的能力與分化成骨細胞的能力之細胞群作為產品而供給至醫療機構等。
藉由適當設定的基準，可僅將顯示指定的表面抗原標記的表現型及/或基因表現型之細胞作為源自牙髓的細胞製劑而保存。
又，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在剛解凍後或者進行解凍而培養時，在進行整體觀察時，幾乎被源自牙髓的多潛能幹細胞佔據。平面培養中之源自牙髓的多潛能幹細胞，在光學顯微鏡下以略紡錘形的固著細胞的形式被觀察。在光學顯微鏡下進行觀察時，平面培養中之略紡錘形的細胞佔細胞整體的比例，較佳為99%以上，更佳為99.5%以上，再佳為99.9%以上，又再佳為99.95%以上。藉由適當設定的基準，可僅將略紡錘形的細胞的比例為某一定以上之源自牙髓的細胞製劑作為產品而供給至醫療機構等。
又，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞係在將此進行解凍而培養時，具有3次以上的細胞分裂能力者，較佳為具有4次以上，更佳為5次以上，再佳為10次以上的細胞分裂能力者。又，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，係在將此進行解凍而在細胞培養盤上進行培養時的平均倍化時間，較佳為96小時以內者，更佳為84小時以內者，再佳為72小時以內者，再佳為48小時以內者，再佳為36小時以內者。此時的細胞的培養條件，能使用與上述的多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞相同或者同等者，例如實施例5所記載之條件。藉由適當設定的基準，可僅將細胞分裂能力為某一定以上之源自牙髓的細胞製劑作為產品而供給至醫療機構等。又，藉由適當設定的基準，亦可僅將平均倍化時間為某一定的時間內之源自牙髓的細胞製劑作為產品而供給至醫療機構等。作為此基準，例如為具有3次以上的細胞分裂能力且平均倍化時間為72小時以內者、具有4次以上的細胞分裂能力且平均倍化時間為72小時以內者、具有5次以上的細胞分裂能力且平均倍化時間為72小時以內者。
亦即，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞係保持所謂具有高分裂能力且可分化成二種以上的細胞之幹細胞的性質者。源自牙髓的細胞製劑所含之細胞亦可為具有高群落形成能力之細胞。
源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在活體外的環境下，較佳為經過16次以上的細胞分裂者，例如經過21次以上、22次以上、或23次以上的細胞分裂者。
源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行解凍時，在溶液中，例如在培養基中浮游的狀態下其直徑的平均為20μm以下、18μm以下，例如，10～20μm、10～18μm、12～20μm、14～20μm、16～20μm。
以下，將源自牙髓的細胞製劑所含之細胞之品質檢查的項目，例示作為品質檢查a’～k’。品質檢查係針對此等項目的1或2個以上而進行。亦可將此等項目全部實施。此時供於品質檢查之細胞，可為以下任一者：(1)將作為源自牙髓的細胞製劑而懸浮於冷凍保存液前的細胞之一部分進行分取而得的細胞；(2)將作為源自牙髓的細胞製劑而懸浮於冷凍保存液前的細胞之一部分進行分取，使其進一步繼代而得的細胞；(3)為了作為源自牙髓的細胞製劑而冷凍之懸浮於冷凍保存液的冷凍前的細胞；(4)將作為源自牙髓的細胞製劑而冷凍者剛解凍後的細胞；或(5)將作為源自牙髓的細胞製劑而冷凍者進行解凍並進一步培養而得的細胞。只要無特別指定，則可針對此等(1)～(5)的細胞的二種以上進行相同的品質檢查。
(品質檢查a’)在光學顯微鏡下進行觀察時，細胞整體中，表現略紡錘形的形態所佔之細胞數的比例為99%以上、99.5%以上、99.9%以上、或99.95%以上之驗證。
(品質檢查b’)細胞的生存率為50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、或95%以上之驗證。
(品質檢查c’)在細胞的表面抗原標記的表現型中，CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34及CD45為陰性之驗證、或
在細胞的表面抗原標記的表現型中，CD73及CD90的至少一個為陽性，且CD34為陰性之驗證。
(品質檢查d’)在細胞的表面抗原標記的表現型中，CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性之驗證、或
在細胞的表面抗原標記的表現型中，CD40、CD80、CD86、及第二類MHC抗原的至少一個為陰性之驗證。
(品質檢查e’)在細胞的表面抗原標記的表現型中，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40、CD80、及CD86保持陰性，第二類MHC抗原成為陽性之驗證、或
在細胞的表面抗原標記的表現型中，在以IFN-γ刺激細胞時，CD40為陰性、CD80為陰性、CD86為陰性、及第二類MHC抗原為陽性的至少一個之驗證。
(品質檢查f’)細胞為表現前列腺素E2
(PGE2
)及/或血管內皮增殖因子(VEGF)者，且在為前列腺素E2
(PGE2
)時，藉由以TNFα刺激細胞，其表現量會增加之驗證。
(品質檢查g’)在利用含有已知會誘導往軟骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，聚蛋白多醣的表現量會增加之驗證。
(品質檢查h’)在利用含有已知會誘導往骨細胞的分化之物質的培養基進行培養時，細胞中之鈣的累積量會增加之驗證。
(品質檢查i’)在細胞培養盤上，細胞具有3次以上、4次以上、或5次以上的細胞分裂能力之驗證。
(品質檢查j’)在細胞培養盤上的細胞的平均倍化時間，在該品質檢查i’的實施期間中，為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內之驗證。
(品質檢查k’)在使細胞在培養基中浮游的狀態下的平均的直徑為20μm以下、18μm以下、10～20μm、10～18μm、12～20μm、14～20μm、或16～20μm之驗證。
上述品質檢查，可針對(品質檢查a’)～(品質檢查j’)之任意的10項目進行實施。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意9項目進行實施。選擇9項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a’、b’、c’、d’、e’、f’、g’、i’、及j’，但不受限。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意8項目進行實施。選擇8項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a’、b’、c’、d’、e’、f’、i’、及j’，但不受限。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意7項目進行實施。選擇7項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a’、b’、c’、d’、e’、i’、及j’，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意6項目進行實施。選擇6項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a’、b’、c’、d’、i’、及j’，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意5項目進行實施。選擇5項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a’、b’、c’、i’、及j’，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意4項目進行實施。選擇4項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a’、b’、c’、及j’，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意3項目進行實施。選擇3項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a’、b’、及c’，但不受限於此。又，品質檢查亦可從此等10項目之中選擇任意2項目進行實施。選擇2項目而實施品質檢查之情形，例如選擇品質檢查a’及b’、品質檢查a’及c’、品質檢查a’及d’、品質檢查a’及e’、品質檢查a’及f’、品質檢查a’及g’、品質檢查a’及h’、品質檢查a’及i’、品質檢查a’及j’、品質檢查b’及c’、品質檢查b’及d’、品質檢查b’及e’、品質檢查b’及f’、品質檢查b’及g’、品質檢查b’及h’、品質檢查b’及i’、品質檢查b’及j’、品質檢查c’及d’、品質檢查c’及e’、品質檢查c’及f’、品質檢查c’及g’、品質檢查c’及h’、品質檢查c’及i’、品質檢查c’及j’、品質檢查d’及e’、品質檢查d’及f’、品質檢查d’及g’、品質檢查d’及h’、品質檢查d’及i’、品質檢查d’及j’、品質檢查e’及f’、品質檢查e’及g’、品質檢查e’及h’、品質檢查e’及i’、品質檢查e’及j’、品質檢查f’及i’、品質檢查f’及j’、或品質檢查i’及j’，但不受限於此等。
本發明的富集多潛能幹細胞之源自牙髓的細胞之製造方法，係藉由將牙髓所含之多潛能幹細胞進行培養，將已增殖之多潛能幹細胞以中間體細胞的形式進行冷凍保存後，將此進行解凍並進一步進行培養而使其增殖而製造源自牙髓的細胞製劑者。從中間體細胞起至製備源自牙髓的細胞製劑為止之步驟，包含將多潛能幹細胞以已接著粒子的表面之狀態進行培養之步驟。藉由包含此步驟，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞成為具有與中間體細胞不同的性質者。
源自牙髓的細胞製劑所含之細胞係分泌各種液性因子者。在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞係以86～161pg/104
個細胞的量表現血管生成素-1者，相較於在為多能性細胞之點上為共通之源自人類骨髓的間葉系幹細胞，較佳為將此表現3倍以上，更佳為5倍以上，再佳為6倍以上，再佳為8倍以上。於此，血管生成素-1的表現量，例如為以實施例30所記載之方法所測定者。
又，在本發明的一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，此等所產生之血管生成素-1的量，在分別培養該源自牙髓的細胞及源自人類骨髓的間葉系幹細胞時，相較於源自人類骨髓的間葉系幹細胞所產生之血管生成素-1的量，較佳為3倍以上，更佳為5倍以上，再佳為8倍以上。於此，能使用之細胞的培養法，例如為實施例30所記載者。
本發明中之醫藥組成物，較佳為具有以下所示之(1)～(8)的至少一個特性。
(1)在對於使用人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)之血管穿透性的作用中，與HUVEC進行共培養之該源自牙髓的細胞的混合比為50%時，僅利用所得之培養上清液與HUVEC之培養上清液而進行，在螢光物質(FITC-聚葡萄糖)對於HUVEC單層細胞層之穿透率中，較佳為產生有意義差異，更佳為穿透率為70%以下。
(2)關於在脂多醣(LPS)誘導性急性肺障礙小鼠模式中，對於嗜中性球往肺的浸潤之作用，較佳為在該源自牙髓的細胞1.5×103
個的投予量中，相對於介質(包含人類血清白蛋白及DMSO之重碳酸林格氏液)投予，為有意義差異地抑制者。
(3)關於在脂多醣(LPS)誘導性急性肺障礙小鼠模式的肺中，對於VCAM-1蛋白表現之作用，在該源自牙髓的細胞1.5×104
個的投予量中，相對於介質(包含人類血清白蛋白及DMSO之重碳酸林格氏液)投予，將非病態組的平均值設為1時，源自VCAM-1的訊號強度的相對值較佳為有意義地減少，更佳為與非病態組同等。
(4)在投予至腦梗塞模式大鼠時，在梗塞區域所觀測之MPO陽性細胞數，相對於介質投予組，為有意義地減少。
(5)在投予至血中之血管生成素-1的濃度為10 ng/ml以下之腦梗塞等的患者時，發揮治療性效果。
(6)在投予至腦梗塞的患者，尤其小間隙梗塞的患者時，發揮預防性及治療性效果。
(7)在投予至腦梗塞的患者，尤其出血性腦梗塞的患者時，發揮預防性及治療性效果。
(8)在投予至敗血症的患者，尤其併發急性肺障礙且血中之血管生成素-1的濃度為10 ng/ml以下的患者時，發揮治療性效果。
例如，若針對表面抗原的陽性率，則源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，相較於中間體細胞，CD39、CD49a、CD61、CD107a、CD107b、及CD143之任一個或此等全部的陽性率為高。例如，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，相較於中間體細胞，CD107b的陽性率為高。源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，此等的表面抗原的陽性率，相較於中間體細胞，較佳為高10%以上，更佳為高20%以上。又，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，相較於中間體細胞，CD146的陽性率為低。源自牙髓的細胞製劑所含之細胞的CD146的陽性率，相較於中間體細胞，低20%以上，或低50%以上。
又，例如，若針對液性因子的表現量，則源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，相較於中間體細胞，IL-6、IL-23、IL-11、MCP-1、ENA-78、HGF、VEGF、MMP-2、IGFBP-4、胱抑素C、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1之任一個或此等全部的表現量為多。尤其，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，相較於中間體細胞，IL-6、IL-11、HGF、IGFBP-4、TIMP-3、及TIMP-1之任一個或此等全部的表現量為多。尤其，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，相較於中間體細胞，IL-6及HGF之任一個或此等全部的表現量為多。
中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞係保持所謂具有高分裂能力且可分化成二種以上的細胞之幹細胞的性質者。此等細胞亦可為具有高群落形成能力之細胞。
中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，例如，CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45的至少一個為陰性。又，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在表面抗原標記的表現型中，例如，CD73及CD90為陽性，且CD34為陰性。此表現型係與間葉系幹細胞共通。但是，亦具有特徵性的性質。
在本發明的一實施形態中，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD34、及CD206的至少一個或全部為陰性。又，在本發明的一實施形態中，此等細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47、CD81、及CD147的至少一個或全部為陽性，且CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個或全部為陰性。
在一實施形態中，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD19、CD26、CD34、CD106、CD117、及CD271的至少一個為陰性，例如此等全部為陰性。又，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，CD19、CD26、CD34、CD56、CD106、CD117、CD146、及CD271的至少一個為陰性，例如此等全部為陰性。此等之中，CD106的功能雖尚未被充分解釋清楚，但因在發炎部位的血管內皮細胞表現，故被認為參與發炎性訊號的活化。此等表面抗原的表現型，與一般已知具有高群落形成能力之幹細胞者不同，但即使如此，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞具有高群落形成能力一事仍令人吃驚。
在一實施形態中，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD140b及HLA-A、B、C的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD49e及CD95的至少一個為陽性，例如此等全部為陽性。
在一實施形態中，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD10為陽性。CD10的功能雖尚未被充分解釋清楚，但因會分解腦啡肽及P物質等發炎相關物質及發炎相關肽，故有可能參與發炎反應的平息。
又，在一實施形態中，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，相較於中間體細胞，CD39的陽性率為高。又，此等細胞的CD73皆為陽性。CD39係藉由與CD73協作將ATP轉換成腺苷而使細胞外腺苷濃度上升。腺苷具有負控制免疫反應而抑制發炎的功能。此功能被認為在CD39的陽性率高之源自牙髓的細胞製劑中，比中間體細胞更高。
又，在一實施形態中，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD46為陽性。CD46被認為係藉由抑制補體(C3)的活性，而參與補體依賴性細胞毒性的避免。
又，在一實施形態中，此等細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD47為陽性。CD47賦予細胞對於由巨噬細胞所致之吞噬的抵抗性。
又，在一實施形態中，此等細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD55為陽性。CD55具有調節補體的古典的路徑或第二路徑之功能，被認為參與由補體所致之細胞毒性的避免。
又，在一實施形態中，此等細胞，在將此進行整體觀察時，在表面抗原標記的表現型中，CD58為陽性。CD58的功能雖尚未被充分解釋清楚，但被暗示藉由誘導控制性T細胞(Treg細胞)而有助於發炎反應的平息。
又，在一實施形態中，此等細胞的CD59為陽性。CD59被認為係藉由與補體(C9)進行作用以阻礙透膜攻擊複合體的形成，而參與由補體所致之細胞毒性的避免。
中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞係分泌各種液性因子者。在一實施形態中，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞分泌MMP-2、IGFBP-4、胱抑素C、IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、HGF、VEGF(血管內皮細胞增殖因子)、TIMP-1、TIMP-2、及TIMP-3的至少一個，例如分泌此等全部。除此等以外，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞分泌GROα、VCAM-I、及IP-10(CXCL10)的至少一個，例如分泌此等全部。
在一實施形態中，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞分泌IL-6。IL-6的分泌量係藉由TNF-α刺激、及IFN-γ刺激而增加。IL-6雖亦已知為發炎性細胞激素，但已知在IL-6缺損小鼠的肝臟中之發炎反應會惡化等，被認為具有抗發炎作用。
中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞係分泌各種液性因子者。在一實施形態中，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞分泌IL-11。IL-11的分泌量係藉由TNF-α刺激、及IFN-γ刺激而增加。IL-11被認為係藉由抑制發炎性細胞激素的分泌，而顯示抗發炎作用。
中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞係分泌各種液性因子者。在一實施形態中，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞分泌IP-10(CXCL10)。IP-10的分泌量係藉由TNF-α刺激、及IFN-γ刺激而增加。IP-10被認為係藉由抑制發炎性細胞激素的分泌，而顯示抗發炎作用。
源自牙髓的細胞具有抗發炎作用等功能。上述的表面抗原、液性因子、及其他要素之一部份或全部係進行協作而發揮其功能。例如，藉由源自牙髓的細胞所表現之血管生成素-1，而抑制表現於血管內皮細胞的表面之VCAM-1等黏附因子的表現，藉此抑制嗜中性球、淋巴球、及/或單核球聚集及浸潤。尤其抑制嗜中性球的聚集及浸潤。
包含具有上述般的抗發炎作用等功能之本發明的源自牙髓的細胞製劑作為有效成分之醫藥組成物，可使用作為各種疾病的治療藥。例如，源自牙髓的細胞製劑可使用於選自包含自體免疫疾病、發炎性疾病、類風濕性關節炎、克隆氏病(Crohn’s disease)、慢性發炎性腸疾病、心肌梗塞、慢性的發炎性肺疾病、腦梗塞(包含慢性期腦梗塞、急性期腦梗塞)、慢性發炎脫髓鞘性多發神經病變、多發性硬化症、全身性紅斑性狼瘡、肝硬化(包含非代償性肝硬化)、敗血症、骨關節炎、乾癬、及器官移植片排斥之群組的疾病或障礙的治療或預防。慢性的發炎性肺疾病中，包含囊腫纖化症(亦被標記為CF)、慢性阻塞性肺病(亦被標記為COPD)、肺發育不全症、病因不明性肺纖維化(亦被標記為IPF)、及新生兒慢性肺疾病。該醫藥品，在此等慢性肺疾病之中，尤其可使用作為新生兒及早產兒的慢性肺疾病(例如，新生兒及早產兒的支氣管肺發育不全症)的治療藥或預防藥。新生兒及早產兒的慢性肺疾病，例如係由人工呼吸器的使用而引起。因此，該醫藥品，例如可使用作為因人工呼吸器的使用而成為慢性肺疾病之新生兒及早產兒的治療藥或預防藥。作為可使用作為自體免疫疾病等的治療藥之細胞製劑，已知有包含間葉系幹細胞等幹細胞者。然而，既知的細胞製劑並非在全部的患者顯示顯著的治療效果者，其用法亦具限定性。本發明的源自牙髓的細胞製劑係在可使用作為自體免疫疾病等的治療藥之細胞製劑中添加多樣性者。例如，作為藉由既知的細胞製劑無法獲得治療效果之患者、罹患在既知的細胞製劑中未證明治療效果的疾病之患者的治療劑，藉由使用本發明的源自牙髓的細胞製劑，可提供此患者新的治療機會。
源自牙髓的細胞製劑係藉由點滴靜脈注射、局部注射等手段而投予至罹患上述疾病之患者。
源自牙髓的細胞製劑係在要使用時被解凍使用。在使用時，源自牙髓的細胞製劑被從液體氮保存容器取出，並被解凍。解凍係例如藉由在36.5～37.5℃的水浴內加溫而進行。解凍後之源自牙髓的細胞製劑，可作為醫藥品，藉由點滴靜脈注射、局部注射等手段而投予至人類。點滴靜脈注射之情形，源自牙髓的細胞製劑係在被從小瓶移至透析袋後，藉由點滴靜脈注射而被投予至患者。局部注射之情形，源自牙髓的細胞製劑係在被從小瓶移至注射器後，被注射至患者的局部。
源自牙髓的細胞製劑在使用前的解凍，被預定在醫療機構中實施。源自牙髓的細胞製劑對於醫療機構的供給，例如如以下般進行，但不特別受限於此。源自牙髓的細胞製劑係被其製造業者、販售業者等的保管庫所冷凍保存者，但因應醫療機構的需求而以冷凍狀態出貨，並被輸送至醫療機構。在以被冷凍的狀態送入醫療機構之製劑，在即將投予至患者前被解凍，然後藉由靜脈注射等而被投予至患者。作為將源自牙髓的細胞製劑直接以冷凍狀態進行處理的裝置，可較佳地使用移動式低溫作業台(WO2017/099105)。
[實施例]
以下，參照實施例而更詳細地說明本發明，但並非意圖將本發明限定於實施例。
[實施例1：培養基及試藥的製備]
DMEM(10%FBS)培養基：將FBS(GE healthcare公司)以最終濃度成為10%之方式添加至DMEM Low Glucose(葡萄糖濃度5.56mM，GE healthcare公司)者。
DMEM(20%FBS)培養基：將FBS(GE healthcare公司)以最終濃度成為20%之方式添加至DMEM Low Glucose(葡萄糖濃度5.56mM，GE healthcare公司)者。
鏈黴素水溶液：將硫酸鏈黴素以最終濃度成為0.01g/mL之方式溶解於純水者。
蛋白酶溶液：在Liberase 5 mg(Roche公司)中添加DMEM Low Glucose並以最終濃度成為2.5mg/mL之方式進行製備者。作為蛋白酶，係含有膠原蛋白酶I、膠原蛋白酶II及嗜熱菌蛋白酶的溶液。
DMEM(20%FBS)鏈黴素培養基：將DMEM(20%FBS)培養基與鏈黴素溶液以體積比100:1所混合者。
胰蛋白酶-EDTA溶液：0.25% 胰蛋白酶-EDTA溶液(Thermo Fisher Scientific公司)。
1% 葡萄糖酸洛赫西定溶液：將5%(w/v)Fermajin溶液(SIOE PHARMACEUTICAL公司)以注射用水稀釋5倍者。
重碳酸林格氏液：具有下述的表7及表8所示之組成的BICARBON輸液(AY Pharmaceuticals公司)
[表7]
| 表7 重碳酸林格氏液的成分組成 | ||
| 成分 | 濃度(g/L) | 濃度(mM) |
| 氯化鈉 | 6.14 | 105 |
| 氯化鉀 | 0.3 | 4.02 |
| 氯化鈣二水合物 | 0.22 | 1.5 |
| 氯化鎂六水合物 | 0.102 | 0.501 |
| 碳酸氫鈉 | 2.1 | 25 |
| 檸檬酸鈉二水合物 | 0.49 | 1.67 |
| pH 6.8～7.8，相對於生理食鹽水之滲透壓比0.9～1.0 |
[表8]
表8 重碳酸林格氏液所含之電解質濃度
| 電解質 | 濃度(mEq/L) |
| Na+ | 135 |
| K+ | 4 |
| Ca2+ | 3 |
| Mg2+ | 1 |
| Cl- | 113 |
| HCO3 - | 25 |
| 檸檬酸根3- | 5 |
人類血清白蛋白溶液：具有下述的表9所示之組成的KENKETU ALBUMIN25-NICHIYAKU(日本製藥公司)
[表9]
| 表9 人類血清白蛋白溶液的成分組成 | ||
| 成分 | 濃度(mg/mL) | 濃度(mM) |
| 人類血清白蛋白 | 250 | - |
| 乙醯基色胺酸鈉 | 5.472 | 20.3 |
| 辛酸鈉 | 3.395 | 20.4 |
| (注)溶液中的鈉離子濃度：40.7 mEq/L |
清洗溶液：以人類血清白蛋白的最終濃度成為1.19%(w/v)之方式，在1000mL的重碳酸林格氏液(BICARBON輸液，AY Pharmaceuticals公司)中添加50mL之25%(w/v)人類血清白蛋白溶液(日本製藥公司)者。在表10及表11中揭示清洗溶液的組成。
[表10]
| 表10 清洗溶液的成分組成 | ||
| 成分 | 濃度(g/L) | 濃度(mM) |
| 氯化鈉 | 5.85 | 100 |
| 氯化鉀 | 0.286 | 3.83 |
| 氯化鈣二水合物 | 0.21 | 1.43 |
| 氯化鎂六水合物 | 0.097 | 0.477 |
| 碳酸氫鈉 | 2.00 | 23.8 |
| 檸檬酸鈉二水合物 | 0.467 | 1.59 |
| 人類血清白蛋白 | 11.9 | - |
| 乙醯基色胺酸鈉 | 0.261 | 0.967 |
| 辛酸鈉 | 0.162 | 0.971 |
[表11]
表11 清洗溶液所含之電解質濃度(排除白蛋白)
| 成分 | 濃度(mEq/L) |
| Na+ | 130.5 |
| K+ | 3.83 |
| Ca2+ | 2.86 |
| Mg2+ | 0.952 |
| Cl- | 107.6 |
| HCO3 - | 23.8 |
| 檸檬酸根3- | 4.76 |
| 乙醯基色胺酸離子 | 0.967 |
| 辛酸離子 | 0.971 |
細胞保護液：將重碳酸林格氏液(BICARBON輸液，AY Pharmaceuticals公司)、人類血清白蛋白25%溶液及二甲亞碸(DMSO，Mylan公司)，以體積比成為11:9:5之方式進行混合者。表12中揭示細胞保護液的組成。
[表12]
| 表12 細胞保護液的成分組成 | |
| 成分 | mM |
| 氯化鈉 | 46.2 |
| 氯化鉀 | 1.77 |
| 氯化鈣二水合物 | 0.66 |
| 氯化鎂六水合物 | 0.22 |
| 碳酸氫鈉 | 11 |
| 檸檬酸鈉二水合物 | 0.73 |
| 人類血清白蛋白 | (90) |
| 乙醯基色胺酸鈉 | 7.31 |
| 辛酸鈉 | 7.34 |
| DMSO | (20) |
| (注)人類血清白蛋白的濃度單位為g/L，DMSO的濃度單位為%(v/v) |
[實施例2：從人類拔齒體取得牙髓]
將獲得知情同意而取得之1個人類拔齒體(第3大臼齒)，以重碳酸林格氏液(BICARBON INJECTION)輕輕地進行清洗後，使用1%葡萄糖酸洛赫西定溶液，將拔齒體的表面進行殺菌。接著，使拔齒體破碎後，將牙髓從其他組織切離。
[實施例3：牙髓的酵素處理]
在由實施例2所得之牙髓中，添加已以DMEM Low Glucose稀釋約10倍的蛋白酶溶液後，在已設定成37℃的水浴內，放置直至藉由目視確認到組織充分地分解為止。
接著，將酵素處理後的細胞的全部量移至離心管，添加DMEM(20%FBS)鏈黴素培養基而使酵素反應停止後，進行離心，使組織片、細胞等沉澱。去除上清液，在所得之沉澱物中添加DMEM(20%FBS)鏈黴素培養基，使組織片、細胞等懸浮，再度進行離心，使細胞等沉澱。在沉澱物中添加DMEM(20%FBS)鏈黴素培養基，以移液器緩緩地使細胞懸浮，獲得包含組織片、源自牙髓的細胞等之牙髓懸浮物。
[實施例4：牙髓懸浮物的培養]
將由實施例3所製備之牙髓懸浮物添加至細胞培養盤，在5%CO2
存在下，以37℃開始培養。一邊每2~4日交換DMEM(20%FBS)鏈黴素培養基，一邊持續培養直至藉由目視確認到形成於該盤上之群落為止。
[實施例5：源自牙髓的細胞的培養]
從藉由目視確認到群落之細胞培養盤去除培養基，以能覆蓋細胞的表面之方式添加胰蛋白酶-EDTA溶液，在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。接著，在細胞培養盤中添加DMEM(10%FBS)培養基使反應停止，同時使細胞懸浮。將此細胞懸浮液回收至離心管。將所回收之細胞進行離心(300×g，5分鐘)並使其沉澱，去除上清液。在離心管中添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，做成細胞懸浮液。
測定細胞懸浮液所含之活細胞數後，以成為3000～20000細胞/cm2
的細胞密度之方式，將細胞接種至細胞培養盤，在5%CO2
存在下，在37℃開始培養。一邊每2～4日交換DMEM(10%FBS)培養基，一邊持續培養直至細胞在該盤上成為融合為止。
從細胞成為融合的細胞培養盤去除培養基後，在該盤中，以能覆蓋細胞的表面之方式，添加胰蛋白酶-EDTA溶液。在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。接著，將與胰蛋白酶-EDTA溶液同量的DMEM(10%FBS)培養基添加至該盤，使反應停止，同時使細胞懸浮。將此細胞懸浮液回收至離心管。將所回收之細胞進行離心(300×g，5分鐘)並使其沉澱，去除上清液，添加DMEM(10%FBS)培養基使細胞懸浮。
重複上述的細胞的回收與培養，使細胞增殖直至活細胞數成為1×108
個以上為止。此培養期間中的細胞的分裂次數(亦即在活體外環境下的分裂次數)為16～17次，細胞的平均倍化時間係通過培養期間而在2日(48小時)以內。
[實施例6：源自牙髓的細胞(中間體細胞)的回收]
從在實施例5中之最後的培養而細胞成為融合的細胞培養盤去除培養基，以能覆蓋細胞的表面之方式，添加胰蛋白酶-EDTA溶液。在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。接著，將與胰蛋白酶-EDTA溶液同量的DMEM(10%FBS)培養基添加至細胞培養盤，使反應停止，同時使細胞懸浮。將此細胞懸浮液回收至容器，進行離心使細胞沉澱，去除上清液。為了清洗細胞，添加500mL～1000mL之清洗溶液使細胞懸浮後，再度進行離心使細胞沉澱，去除上清液。重複進行此細胞的清洗操作，最終以離心後的沉澱的形態回收細胞。將如此所得之細胞作為中間體細胞。
[實施例7：源自牙髓的細胞(中間體細胞)的冷凍]
在由實施例6所製備之細胞的沉澱中添加清洗溶液與細胞保護液，以細胞濃度成為11×106
個/mL(±5%)之方式使細胞懸浮。將如此所得之細胞懸浮液填充至冷凍保存用小瓶(素材：Cyclic olefin copolymer，Sterile Closed Vial，Aseptic Technologies公司)並密封。將此細胞懸浮液作為中間體細胞懸浮液。將中間體細胞懸浮液的溶液部分(中間體細胞用冷凍保存液)所含之成分揭示於表13。使用冷凍胚胎控制儀(Program Freezer)使中間體細胞懸浮液冷凍後，移至液體氮保存容器內並保存。將此已冷凍的中間體細胞懸浮液作為中間體細胞冷凍品。
[表13]
表13 中間體細胞用冷凍保存液的成分組成
| 成分 | mM (範圍) | mM (較佳例) |
| 氯化鈉 | 65.8～80.4 | 73.1 |
| 氯化鉀 | 2.52～3.08 | 2.80 |
| 氯化鈣二水合物 | 0.95～1.16 | 1.05 |
| 氯化鎂六水合物 | 0.315～0.385 | 0.35 |
| 碳酸氫鈉 | 15.67～19.15 | 17.41 |
| 檸檬酸鈉二水合物 | 1.04～1.28 | 1.16 |
| 人類血清白蛋白 | (46～56) | (51) |
| 乙醯基色胺酸鈉 | 3.73～4.55 | 4.14 |
| 辛酸鈉 | 3.74～4.58 | 4.16 |
| DMSO | (9～11) | (10) |
| (注)人類血清白蛋白的濃度單位為g/L，DMSO的濃度單位為%(v/v) |
[實施例8：源自牙髓的細胞(中間體細胞)的解凍]
從液體氮保存容器取出已填充由實施例7所製備之源自牙髓的細胞(中間體細胞)的小瓶，在36.5～37.5℃的水浴內進行加溫並解凍。將已解凍之細胞懸浮液移至離心管，添加30mL的DMEM(10%FBS)培養基使其懸浮。進行離心(300×g，5分鐘)使細胞沉澱，去除上清液。接著，添加20mL之DMEM(10%FBS)培養基，使中間體細胞懸浮。
[實施例9：源自牙髓的細胞的生產培養(前培養)]
測定由實施例8所製備之細胞懸浮液所含之中間體細胞的活細胞數後，以成為20000 細胞/cm2
以下的密度之方式，將細胞接種至細胞培養盤，在5%CO2
存在下，在37℃開始培養。一邊每2～4日交換DMEM (10%FBS)培養基，一邊持續培養直至細胞在細胞培養盤上成為融合為止。此外，由活細胞數所算出之解凍後的中間體細胞所含之細胞的生存率(活細胞數/全部細胞數×100%)大約為85～95%。
去除細胞已成為融合的細胞培養盤的培養基，以能覆蓋細胞的表面之方式，添加胰蛋白酶-EDTA溶液，在37℃靜置5～60分鐘，使細胞剝離。接著，將同量的DMEM(10%FBS)培養基添加至細胞培養盤，使反應停止，同時使細胞懸浮。將細胞懸浮液回收至容器，進行離心使細胞沉澱，去除上清液。添加DMEM(10%FBS)培養基使細胞懸浮後，再度進行離心使細胞沉澱，去除上清液。添加DMEM(10%FBS)培養基使細胞再度懸浮。
測定細胞懸浮液所含之活細胞數後，以成為20000 細胞/cm2
以下的密度之方式，將細胞接種至細胞培養盤，在5%CO2
存在下，在37℃開始培養。一邊每2～4日交換DMEM(10%FBS)培養基，一邊持續培養直至細胞在該盤上成為融合為止。
重複上述的細胞的回收與培養，使細胞增殖直至活細胞數成為1×109
個以上為止。此中間體細胞的細胞培養盤上的培養期間中的細胞的分裂次數為5～6次，細胞的平均倍化時間係通過培養期間而在2日(48小時)以內。
去除細胞已成為融合的細胞培養盤的培養基，添加胰蛋白酶-EDTA溶液。在37℃靜置5～60分鐘，使細胞剝離。接著，將DMEM(10%FBS)培養基添加至細胞培養盤，使反應停止，同時使細胞懸浮。將此細胞懸浮液回收至容器。將已回收的細胞進行離心，使其沉澱，去除上清液。添加500mL～600mL之DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮後，再度進行離心使細胞沉澱，去除上清液。添加500mL～600mL之DMEM(10%FBS)培養基，使細胞再度懸浮。
[實施例10：源自牙髓的細胞的生產培養(生物反應器的準備)]
以電子天秤秤取50g(±1.0g)的微載體並置入試藥瓶，添加2000mL之PBS後，以高壓釜進行滅菌。此外，微載體係使用粒徑為130～180μm(水合時)，且為細胞培養用的明膠素材的微載體，且具有能以高壓釜進行滅菌處理之耐熱性者。
在生物反應器中安裝反應器用50L袋、通氣過濾器、及感測器環圈，再設置溫度感測器、pH計與溶存氧計。在生物反應器內(的袋)中添加10 L之DMEM(10%FBS)培養基與50g(乾重量)之微載體，一邊攪拌一邊以37℃進行加溫。此外，攪拌係使用設置於同裝置之葉輪而進行。
[實施例11：源自牙髓的細胞的生產培養(細胞往微載體的接著步驟)]
測定由實施例9所製備之細胞懸浮液所含之活細胞數後，以成為1000～5000細胞/cm3
的密度之方式，添加至生物反應器內。將反應器內攪拌數分鐘後，使攪拌停止，靜置1小時以上。重複進行此攪拌，使細胞往微載體接著。
[實施例12：源自牙髓的細胞的生產培養(細胞培養步驟)]
在接著步驟結束後，將生物反應器內進行攪拌並開始培養。在培養中，定期地觀察生物反應器內，在反應器的底部沉澱有微載體之情形中，提高反應器內的攪拌旋轉數，以使微載體在培養基中成為浮游狀態。
生產培養係藉由實施例13所記載之測定，進行細胞增殖直至活細胞數成為5×109
個以上為止。在微載體的培養期間中的細胞的分裂次數為2～3次，細胞的平均倍化時間大約為3～6日。經過生產培養的細胞，係在活體外環境下至少進行23次的細胞分裂者，且係進行23～27次的細胞分裂者。
[實施例13：源自牙髓的細胞的生產培養(細胞數的測定)]
從反應器內採取30～40mL之包含微載體的培養液並移至離心管，靜置5分鐘以上，使微載體沉澱後，去除上清液。添加25mL之PBS，使細胞懸浮，在靜置5分鐘以上後，去除上清液。將此操作再進行1次。去除上清液後，在微載體中添加胰蛋白酶-EDTA溶液。在37℃的水浴內振盪5～10分鐘後，添加與胰蛋白酶-EDTA溶液同量的DMEM(10%FBS)培養基，使反應停止，同時使細胞懸浮。將此細胞懸浮液進行離心(300×g，5分鐘)，使細胞沉澱，去除上清液。添加1～5mL之DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮後，測定細胞懸浮液所含之活細胞數。
[實施例14：源自牙髓的細胞的生產培養(葡萄糖濃度及乳酸濃度的測定)]
從反應器內採取5～40mL之培養中的細胞懸浮液並移至離心管，將細胞懸浮液靜置5分鐘以上，使微載體沉澱後，將上清液的一部分移至新的1.5mL管。使用微量注射器採取50μL的上清液，使用生物感測器(BF-7D，Oji Scientific Instruments公司)，測定上清液中的葡萄糖濃度及乳酸濃度。在葡萄糖濃度降低之情形中，以葡萄糖不會成為小於0.1mM的濃度之方式補充葡萄糖，或交換培養基的全部或一部分。又，在乳酸濃度上升之情形中，以乳酸不會成為20mM以上的濃度之方式交換培養基的全部或一部分。
[實施例15：由生產培養所得之源自牙髓的細胞的回收]
確認細胞增殖至指定的細胞數後，停止反應器及感測器環圈的攪拌，靜置10分鐘以上，使微載體沉澱。盡可能地去除上清液後，在殘留的培養基中使細胞懸浮。將細胞懸浮液回收至10 L袋(Thermo Fisher Scientific公司)內，靜置5分鐘以上，使微載體沉澱後，去除上清液。
添加DMEM Low Glucose，使微載體懸浮，靜置5分鐘以上，使微載體沉澱後，去除上清液。重複進行此操作數次。接著，在去除上清液後的微載體中添加胰蛋白酶-EDTA溶液。添加胰蛋白酶-EDTA溶液後，在37℃的水浴內振盪30～60分鐘，藉此使細胞從微載體剝離，同時分解微載體。
為了去除細胞懸浮液中殘留之微載體的片段、細胞塊等，使已回收的濾液通過孔徑20～35μm的過濾器，將細胞回收至過濾器的濾液中。將已回收的濾液進行離心，使細胞沉澱，去除上清液。為了清洗細胞，添加由實施例1所製備之清洗溶液，使細胞懸浮，再度進行離心，使細胞沉澱，去除上清液。重複進行此清洗操作，最終以離心後的沉澱的形態回收細胞。
[實施例16：源自牙髓的細胞的製劑化及冷凍保存]
在由實施例15所回收之細胞的沉澱中，添加清洗溶液與細胞保護液，以細胞濃度成為25～31×106
個/mL之方式使細胞懸浮。將如此所得之細胞懸浮液填充至冷凍保存用小瓶(素材：Cyclic olefin copolymer，Sterile Closed Vial，Aseptic Technologies公司)並密封。將此細胞懸浮液作為冷凍前源自牙髓的細胞製劑。將冷凍前源自牙髓的細胞製劑之溶液部分(製劑細胞用冷凍保存液)所含之成分揭示於表14。
[表14]
表14 製劑細胞用冷凍保存液的成分組成
| 成分 | mM (範圍) | mM (較佳例) |
| 氯化鈉 | 65.8～80.4 | 70.8 |
| 氯化鉀 | 2.52～3.08 | 2.71 |
| 氯化鈣二水合物 | 0.95～1.16 | 1.01 |
| 氯化鎂六水合物 | 0.315～0.385 | 0.34 |
| 碳酸氫鈉 | 15.67～19.15 | 16.9 |
| 檸檬酸鈉二水合物 | 1.04～1.28 | 1.13 |
| 人類血清白蛋白 | (46～56) | (53.6) |
| 乙醯基色胺酸鈉 | 3.73～4.55 | 4.36 |
| 辛酸鈉 | 3.74～4.58 | 4.37 |
| DMSO | (9～11) | (10.7) |
| (注)人類血清白蛋白的濃度單位為g/L，DMSO的濃度單位為%(v/v)。 |
將已填充至小瓶之冷凍前源自牙髓的細胞製劑，藉由常法，使用冷凍胚胎控制儀進行冷凍後，移至液體氮保存容器內並保存。將此已冷凍的細胞懸浮液作為包含源自牙髓的細胞作為有效成分之製劑(源自牙髓的細胞製劑)。
[實施例17：源自牙髓的細胞的特性(細胞的形態等)]
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，添加10mL的DMEM(10%FBS)培養基並輕輕地振動混合後，進行離心(1500rpm，5分鐘)而使細胞沉澱。去除上清液，使10mL的添加DMEM(10%FBS)培養基細胞懸浮，再度進行離心(1500rpm，5分鐘)，使細胞沉澱。接著，使細胞懸浮於DMEM(10%FBS)培養基，以成為5000～10000 細胞/cm2
的密度之方式，接種至細胞培養盤，進行培養直到細胞成為90～100%融合為止。藉由相位差顯微鏡，觀察在細胞培養盤上的細胞的形態。已培養中間體細胞冷凍品及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞者，全部為略紡錘形的固著細胞，未包含其他形狀的細胞。此外，由活細胞數所算出之解凍後的中間體細胞冷凍品及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞的生存率(活細胞數/全部細胞數×100%)大約為85～95%。
[實施例18：源自牙髓的細胞製劑的特性(粒徑)]
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，分別以D-PBS(-)溶液進行稀釋，製備約5×106
個/mL的細胞稀釋液。細胞粒徑係藉由使用活死細胞自動分析儀(Vi-CellXR，Beckman Coulter公司)的影像解析法進行計測。針對使用活死細胞自動分析儀的影像解析法，以下進行概略說明。在細胞稀釋液中添加錐蟲藍，將細胞進行染色，將此細胞稀釋液進行送液，使其通過細長的流路，拍攝複數張流路的顯微鏡放大影像。在死細胞中，為了使錐蟲藍穿透細胞膜而進行染色，在各影像中，將以著色的粒子的形態被觀察之細胞計測作為死細胞，將以透明的粒子的形態被觀察之細胞計測作為活細胞。細胞粒徑係使用在其影像上所計測之一個粒子的直徑與顯微鏡的放大倍率而算出。由所拍攝之全部的影像中之粒徑的值求取平均值。
(結果)
細胞粒徑(細胞的直徑)的平均值，在已解凍中間體細胞冷凍細胞者中為17.36μm±1.40μm(平均值±SD，n=3)，在已解凍源自牙髓的細胞製劑者中為16.98±1.23μm(平均值±SD，n=3)(圖1)。
[實施例19：源自牙髓的細胞的特性(骨細胞分化能)])
骨細胞分化能係參考Pittenger MF., et al., Science. 284, 143-7(1999)，Colter DC., et al., Proc Natl Acad Sci USA. 98, 7841-5(2001)的記載等，利用下述的方法進行調查。
分別將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，進行離心(1500rpm，5分鐘)，使細胞沉澱。接著，使細胞懸浮於DMEM(10%FBS)培養基，以成為5000～15000 細胞/cm2
的密度之方式，接種至細胞培養盤，進行培養直至細胞成為90～100%融合為止。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，測定活細胞數。在已塗布膠原蛋白I的24孔細胞培養盤中，以DMEM(10%FBS)培養基中的細胞密度(15000～25000 細胞/cm2
)接種細胞，培養3日。將細胞分成2組，將其中一組的培養基置換成在骨細胞分化用基礎培養基(Lonza公司)中添加包含地塞米松、L-麩醯胺酸、抗壞血酸鹽、青黴素/鏈黴素，mesenchymal cell growth supplement(MCGS)、β-甘油磷酸的骨細胞分化用添加因子套組(Lonza公司)者亦即骨細胞分化誘導培養基，一邊每3～4日交換培養基一邊進行2～3週的分化培養。將此組作為骨細胞分化誘導組。針對另一組，將培養基置換成新的DMEM(10%FBS)培養基，一邊每3～4日交換培養基一邊進行2～3週培養。將此組作為控制組。將骨細胞分化誘導組及控制組的細胞分別培養後，以PBS清洗1次，在各孔中添加0.4mL的10%甲酸，在室溫靜置1小時，使累積於細胞中的鈣從細胞游離。使用鈣E-Test wako(Wako Pure Chemical公司)，定量已游離的鈣濃度。
在圖2中揭示測定結果。中間體細胞冷凍品、源自牙髓的細胞製劑所含之細胞之任一者，皆在骨細胞分化誘導組中，相較於控制組，確認到細胞的鈣濃度的上升。此結果顯示，中間體細胞冷凍品及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞皆分化成骨細胞，表示本發明的源自牙髓的細胞具有分化成骨細胞的能力。
[實施例20：源自牙髓的細胞的特性(軟骨細胞分化能)]
軟骨細胞分化能係參考Kiani C., et al. Cell Res. 12 19-32(2002), Aung A., et al. Arthritis Rheum. 63 148-58(2011)的記載等，並利用下述的方法進行調查。
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，進行離心(1500rpm，5分鐘)，使細胞沉澱。接著，使細胞懸浮於DMEM(10%FBS)培養基，以成為5000～10000 細胞/cm2
的密度之方式，接種至細胞培養盤，進行培養直至細胞成為90～100%融合為止。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，測定活細胞數。將細胞分成2組，使其中一組的細胞，以1×106
個/mL的濃度懸浮於為軟骨細胞分化誘導培養基之Stem MACS(註冊商標)ChondroDiff Medium(Miltenyi Biotec公司)，將此各1mL地接種至低吸附性容器(STEMFULL(註冊商標)，Sumitomo Bakelite公司)，使球體形成。一邊每3～4日交換培養基一邊進行2～3週的分化培養。將此作為軟骨細胞分化誘導組。針對另一組，使用DMEM(10%FBS)培養基，將細胞進行繼代培養，將此作為控制組。
培養後，回收細胞，在55℃溫浴中，以30分鐘蛋白酶K進行處理，使細胞溶解。從已溶解的細胞，藉由RNeasy(註冊商標)Plus Mini Kit(QIAGEN公司)，萃取全RNA，製備全RNA萃取液，接著使用吸光光度計(Denovix公司)，測定全RNA萃取液所含之RNA濃度。RNA濃度測定後，使用QuantiTect(註冊商標) Reverse Transcription套組(QIAGEN公司)，合成cDNA。進一步製備PCR反應液，將各組的cDNA 25ng作為模板，在[(50℃/2分鐘)×1循環，(95℃/10分鐘)×1循環，(95℃/15秒鐘，60℃/1分鐘)×40循環]的PCR條件下，進行即時RT-PCR，使聚蛋白多醣基因與β肌動蛋白基因放大。在PCR引子中，分別使用聚蛋白多醣探針(Applied Biosystems公司/Assay ID：Hs00153936_m1)及β肌動蛋白探針(Applied Biosystems公司/4310881E)。
在圖3中揭示測定結果。得知中間體細胞冷凍品、源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中任一者，皆在軟骨細胞分化誘導組中，相較於控制組，聚蛋白多醣的Ct值(Threshold cycle)低。此結果顯示，在軟骨細胞分化誘導組中，為構成軟骨的細胞外基質之主要分子的聚蛋白多醣的表現量增加，且表示中間體細胞冷凍品及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞皆具有分化成軟骨細胞的分化能力。
[實施例21：源自牙髓的細胞的特性(表面抗原的測定-1)]
源自牙髓的細胞顯示與人類間葉系幹細胞相同的略紡錘狀的形狀。於是，使用流式細胞儀，調查已知在人類間葉系幹細胞為陽性之表面抗原標記亦即CD73、CD90、CD105及CD166、以及已知在間葉系幹細胞為陰性之表面抗原標記亦即CD34與CD45的表現的有無。
將包含BSA粉末(SIGMA公司)的磷酸緩衝液生理食鹽水pH 7.4溶解於純水，通過0.45μm過濾器，製備PBS-B[含有0.138M氯化鈉、0.0027M氯化鉀、1%(w/v)牛血清白蛋白之0.01 M 磷酸緩衝生理食鹽水(pH 7.4)]。將源自人類的IgG(SIGMA公司)溶解於PBS(Life technologies公司)，通過0.45μm過濾器，製備20mg/mL IgG溶液。在18mL的PBS-B中，添加2mL的20mg/mL IgG溶液，製備阻斷溶液。
又，作為抗CD34抗體，使用FITC標識抗人類CD34抗體(anti-CD34-FITC，BD公司)，作為抗CD45抗體，使用FITC標識抗人類CD45抗體(anti-CD45-FITC，Beckman Coulter公司)，作為抗CD73抗體，使用FITC標識抗人類CD73抗體(anti-CD73-FITC，BD公司)，作為抗CD90抗體，使用FITC標識抗人類CD90抗體(anti-CD90-FITC，BD公司)，作為抗CD105抗體，使用PE標識抗人類CD105抗體(anti-CD105-R-PE，BD公司)，作為抗CD166抗體，使用PE標識抗人類CD166抗體(anti-CD166-PE，Ancell公司)、及作為控制組抗體，使用FITC標識小鼠IgG1同型控制組(anti-IgG1-FITC，Beckman Coulter公司)與PE標識小鼠IgG1同型控制組(IgG1-PE，Beckman Coulter公司)。
(細胞的染色方法)
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，進行離心(1500rpm，5分鐘)，使細胞沉澱。去除上清液，添加10mL的DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，測定活細胞數。將細胞(1×107
個)採取至50mL離心管，進行離心(1500rpm，5分鐘)使其沉澱，去除上清液。添加PBS-B，使全部量為10mL，使細胞懸浮後，再度將細胞進行離心(1500rpm，5分鐘)並使其沉澱，去除上清液。接著，使細胞懸浮於1mL的阻斷溶液，在冰上靜置1小時。在9根5mL反應管(編號(1)～(9))中，如同表15所示，添加各抗體溶液。接著，在各管中，各100μL地添加細胞已懸浮在阻斷溶液中的懸浮液，輕輕地振動混合，在冰上靜置20分鐘，使各抗體溶液所含之抗體與表現於細胞表面之表面抗原標記進行結合。接著，在各管中各3mL地添加PBS-B並混合後，將細胞進行離心(1500rpm，5分鐘)，使其沉澱，去除上清液，去除未與細胞結合的抗體。將此抗體的去除操作重複3次。在各管中添加400μL之PBS-B，使細胞懸浮。
[表15]
表15 添加至各反應管之抗體溶液的種類與量
| 管編號 | 抗體溶液 | 添加量(μL) |
| (1) | PBS-B | - |
| (2) | IgG1-FITC | 20 |
| (3) | anti-CD34-FITC | 20 |
| (4) | anti-CD45-FITC | 20 |
| (5) | anti-CD73-FITC | 5 |
| (6) | anti-CD90-FITC | 2 |
| (7) | IgG1-PE | 20 |
| (8) | anti-CD105-FITC | 2 |
| (9) | anti-CD166-FITC | 20 |
(測定及解析)
針對管編號(1)～(9)的細胞，以BD FACSVerse(註冊商標)(BD公司)測定FITC及PE的各螢光色素的量，藉由與陰性控制組的比較，透過與表面抗原特異性結合的抗體，求取與細胞表面結合之螢光色素的量。此外，管(2)為管(3)～(6)的陰性控制組，管(7)為(8)及(9)的陰性控制組。管(1)為非染色細胞。
在圖4中揭示測定結果。若針對管編號(5)、(6)、及(8)、(9)的細胞(分別為CD73、CD90、CD105、及CD166染色細胞)，則中間體細胞冷凍品、源自牙髓的細胞製劑所含之細胞之任一者，針對此等的表面抗原皆85%以上的細胞為陽性。若針對管編號(3)與(4)的細胞(分別為CD34及CD45染色細胞)，則中間體細胞冷凍品，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞之任一者，針對此等的表面抗原皆幾乎所有的細胞為陰性。此等結果表示，源自牙髓的細胞的CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，CD34與CD45為陰性。
[實施例22：源自牙髓的細胞的特性(表面抗原的測定-2)]
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，將細胞懸浮液全部量添加至DMEM培養基。進行離心(300 × g，5分鐘，室溫)，去除上清液後，添加DMEM培養基並懸浮。接著，使用BD Lyoplate(Human Cell Screening Marker Screening Panel，BD公司)，使用針對表面抗原的抗體，將細胞進行抗體染色。抗體染色係遵循Human cell screening panel(BD公司)的程序而實施。以下說明使用Human cell screening panel之表面抗原的測定方法的概略內容。在96孔盤的各孔中，分注細胞懸浮液。在各孔中，添加針對各種表面抗原之抗體作為一級抗體，靜置30分鐘，使表面抗原與抗體結合。進行離心，使細胞沉澱，去除上清液。清洗細胞後，在各孔中，添加針對一級抗體之抗體作為二級抗體，靜置30分鐘，使表面抗原與抗體結合。二級抗體係藉由Alexa Fluor 647而被螢光標識者。進行離心，使細胞沉澱，去除上清液。將細胞進行再懸浮，針對此細胞懸浮液，使用流動式細胞測量術，將二級抗體所結合之細胞作為陽性細胞並進行螢光檢測，求取各表面抗原的陽性細胞的存在比例。測定係針對中間體細胞進行9批次，針對源自牙髓的細胞製劑所含之細胞進行7批次，而針對各抗原求取陽性比例。
(結果)
在中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中，將為陽性的表面抗原分別揭示於圖5、圖6。
在中間體細胞中，針對CD47、CD81、CD90、CD147、及HLA-A、B、C，在全部批次顯示95%以上的陽性率。又，針對CD29、CD46、CD55、CD59、CD73、及CD140b，在全部批次顯示90%以上的陽性率。又，針對CD9、CD44、CD49b、CD49c、CD98、及EGF-R，在全部批次顯示80%以上的陽性率，顯示大約90%以上的陽性率。又、針對CD49f及CD166，在全部的細胞顯示70%以上的陽性率，顯示大約90%以上的陽性率。又，針對CD10、CD13、CD58、CD63、CD151、及CD164，在全部的細胞顯示60%以上的陽性率，顯示大約90%以上的陽性率(圖5)。除此等之外，在中間體細胞中，CD105亦為陽性(圖4)。
另一方面，在源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中，針對CD29、CD59、CD44、及CD164，在全部批次顯示95%以上的陽性率，顯示大約98%以上的陽性率。又，針對CD9、CD13、CD46、CD47、CD58、CD63、CD73、CD81、CD90、CD98、CD147、EGF-R、及HLA-A、B、C，在全部批次顯示90%以上的陽性率，顯示大約95%以上的陽性率。又，針對CD49b、CD49c、CD49e、CD55、CD95、CD151、及CD166，在全部批次顯示80%以上的陽性率，除了CD95、CD151、及CD166之外，顯示大約90%以上的陽性率。又，在CD10、CD49f、及CD140b中，在全部批次顯示70%以上的陽性率，顯示大約80%以上的陽性率(圖6)。除此等之外，在源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中，CD105亦為陽性(圖4)。
接著，將在中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中為陰性的表面抗原分別揭示於表16、表17。
在中間體細胞中，針對CD120b、CD132、CD158a、CD161、CD184、CD195、CD206、CD210、CD212、CD226、CD244、CD267、CD278、CD279、CD282、CD294、NKB1、SSEA-1、TRA-1-60、TRA-1-81、Vβ23、SSEA-3、CLA、及整聯蛋白β7，在全部批次顯示1%以下的陽性率。又，針對CD8b、CD11b、CD15s、CD16、CD19、CD24、CD31、CD32、CD62E、CD62P、CD66f、CD86、CD88、CD94、CD100、CD103、CD104、CD114、CD117、CD118、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD135、CD137、CD137配體、CD150、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD197、CD220、CD229、CD231、CD255、CD268、CD305、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、BLTR-1、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R、Vβ8、不變性NKT、及γδTCR，在全部批次顯示2%以下的陽性率，大約陽性率為1%以下。又，針對CD1a、CD1b、CD1d、CD2、CD3、CD5、CD6、CD7、CD8a、CD11c、CD15、CD18、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD35、CD37、CD38、CD41a、CD41b、CD42b、CD45、CD45RB、CD45RO、CD48、CD50、CD53、CD62L、CD64、CD66(a、c、d、e)、CD69、CD70、CD72、CD74、CD84、CD85、CD87、CD89、CDw93、CD97、CD134、CD138、CD141、CD144、CD154、CD158b、CD162、CD183、CD205、CD235a、CD309、CD326、CD337、及αβTCR，在全部的細胞顯示5%以下的陽性率。又，針對CD26、CD106、及CD271，在一部分的批次顯示大於5%的陽性率，但陽性率的平均值為5%以下(表16A～表16D)。除此等以外，在中間體細胞中，CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原亦為陰性(圖4、圖11A)。
在源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中，針對CD1a、CD1d、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD11b、CD11c、CD15、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD28、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD37、CD38、CD41a、CD86、CD87、CD88、CD89、CDw93、CD94、CD100、CD102、CD103、CD114、CD117、CD118、CD120b、CD121b、CD122、CD123、CD124、CD126、CD127、CD128b、CD132、CD134、CD135、CD137、CD137配體、CD138、CD144、CD150、CD153、CD154、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD172b、CD177、CD178、CD180、CD184、CD195、CD196、CD197、CD205、CD206、CD210、CD212、CD220、CD226、CD229、CD231、CD235a、CD244、CD255、CD267、CD268、CD278、CD279、CD282、CD294、CD305、CD309、CD314、CD321、CDw327、CDw328、CD329、CD335、CD336、CD337、BLTR-1、CLIP、CMRF-44、CMRF-56、fMLP-R、SSEA-1、TRA-1-60、CLA、整聯蛋白β7、及不變性NKT，在全部批次顯示1%以下的陽性率。又，針對CD1b、CD6、CD27、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD45、CD45RB、CD48、CD50、CD53、CD57、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD66b、CD66f、CD69、CD70、CD72、CD75、CD84、CD85、CD97、CD99R、CD183、CD193、SSEA-3、及γδTCR，在全部批次顯示2%以下的陽性率，大約陽性率為1%以下。又，針對CD4v4、CD14、CD36、CD45RA、CD45RO、CD66(a、c、d、e)、CD79b、CD83、CD152、CD209、CD275、CD326，MIC A/B、及αβTCR，在全部批次顯示5%以下的陽性率，大約陽性率為2%以下。又，針對CD106及CD271，在一部分的批次顯示大於5%的陽性率，但陽性率的平均值為5%以下(表17A～表17E)。除此等以外，在源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中，CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原亦為陰性(圖4、圖11B)。
[表16A]
表16A 在中間體細胞為陰性之表面抗原
| 表面抗原 | 中間體 平均 | SE |
| CD1a | 0.49 | 0.32 |
| CD1b | 1.61 | 0.57 |
| CD1d | 0.89 | 0.32 |
| CD2 | 0.79 | 0.33 |
| CD3 | 0.00 | 0.47 |
| CD5 | 0.00 | 0.49 |
| CD6 | 1.15 | 0.44 |
| CD7 | 0.64 | 0.30 |
| CD8a | 0.74 | 0.34 |
| CD8b | 0.00 | 0.55 |
| CD11b | 0.00 | 0.32 |
| CD11c | 0.81 | 0.29 |
| CD15 | 1.04 | 0.46 |
| CD15s | 0.58 | 0.18 |
| CD16 | 0.44 | 0.25 |
| CD18 | 0.67 | 0.37 |
| CD19 | 0.25 | 0.32 |
| CD21 | 0.65 | 0.38 |
| CD22 | 0.67 | 0.32 |
| CD23 | 0.70 | 0.29 |
| CD24 | 0.00 | 0.36 |
| CD25 | 0.86 | 0.33 |
| CD26 | 3.49 | 1.18 |
| CD27 | 0.90 | 0.48 |
| CD28 | 0.88 | 0.44 |
| CD31 | 0.25 | 0.32 |
| CD32 | 0.17 | 0.37 |
| CD33 | 0.57 | 0.37 |
| CD35 | 0.61 | 0.39 |
| CD37 | 0.58 | 0.32 |
| CD38 | 0.91 | 0.41 |
| CD41a | 0.40 | 0.35 |
| CD41b | 0.44 | 0.32 |
| CD42b | 0.39 | 0.32 |
| CD45 | 0.67 | 0.34 |
| CD45RB | 0.59 | 0.29 |
[表16B]
表16B 在中間體細胞為陰性之表面抗原
| 表面抗原 | 中間體 平均 | SE |
| CD45RO | 0.94 | 0.37 |
| CD48 | 0.64 | 0.30 |
| CD50 | 0.84 | 0.50 |
| CD53 | 0.56 | 0.33 |
| CD62E | 0.14 | 0.33 |
| CD62L | 0.33 | 0.31 |
| CD62P | 0.14 | 0.19 |
| CD64 | 0.27 | 0.33 |
| CD66(a、c、d、e) | 0.06 | 0.40 |
| CD66f | 0.17 | 0.32 |
| CD69 | 0.40 | 0.45 |
| CD70 | 0.17 | 0.33 |
| CD72 | 0.17 | 0.38 |
| CD74 | 0.00 | 0.66 |
| CD84 | 0.42 | 0.39 |
| CD85 | 0.02 | 0.45 |
| CD86 | 0.23 | 0.21 |
| CD87 | 0.66 | 0.46 |
| CD88 | 0.30 | 0.19 |
| CD89 | 0.56 | 0.32 |
| CDw93 | 0.42 | 0.40 |
| CD94 | 0.38 | 0.23 |
| CD97 | 0.67 | 0.27 |
| CD100 | 0.28 | 0.24 |
| CD103 | 0.24 | 0.19 |
| CD104 | 0.22 | 0.19 |
| CD106 | 4.82 | 1.68 |
| CD114 | 0.12 | 0.18 |
| CD117 | 0.38 | 0.23 |
| CD118 | 0.25 | 0.17 |
| CD120b | 0.04 | 0.05 |
| CD121b | 0.13 | 0.19 |
| CD122 | 0.20 | 0.27 |
| CD123 | 0.21 | 0.18 |
| CD124 | 0.21 | 0.25 |
| CD126 | 0.12 | 0.20 |
[表16C]
表16C 在中間體細胞為陰性之表面抗原
| 表面抗原 | 中間體 平均 | SE |
| CD127 | 0.23 | 0.26 |
| CD128b | 0.09 | 0.19 |
| CD132 | 0.19 | 0.05 |
| CD134 | 0.26 | 0.33 |
| CD135 | 0.38 | 0.23 |
| CD137 | 0.22 | 0.26 |
| CD137配體 | 0.34 | 0.25 |
| CD138 | 0.54 | 0.38 |
| CD141 | 0.81 | 0.37 |
| CD144 | 0.29 | 0.42 |
| CD150 | 0.18 | 0.18 |
| CD154 | 0.26 | 0.26 |
| CD158a | 0.00 | 0.09 |
| CD158b | 0.02 | 0.32 |
| CD161 | 0.02 | 0.20 |
| CD162 | 0.20 | 0.32 |
| CD163 | 0.00 | 0.19 |
| CD172b | 0.21 | 0.25 |
| CD177 | 0.03 | 0.21 |
| CD178 | 0.06 | 0.23 |
| CD180 | 0.16 | 0.27 |
| CD183 | 1.24 | 0.51 |
| CD184 | 0.00 | 0.27 |
| CD195 | 0.00 | 0.27 |
| CD197 | 0.36 | 0.17 |
| CD205 | 0.76 | 0.53 |
| CD206 | 0.00 | 0.17 |
| CD210 | 0.18 | 0.03 |
| CD212 | 0.31 | 0.08 |
| CD220 | 0.03 | 0.19 |
| CD226 | 0.00 | 0.16 |
| CD229 | 0.12 | 0.20 |
| CD231 | 0.00 | 0.20 |
| CD235a | 0.77 | 0.50 |
| CD244 | 0.00 | 0.43 |
| CD255 | 0.16 | 0.18 |
[表16D]
表16D 在中間體細胞為陰性之表面抗原
| 表面抗原 | 中間體 平均 | SE |
| CD267 | 0.20 | 0.05 |
| CD268 | 0.19 | 0.18 |
| CD271 | 3.62 | 0.74 |
| CD278 | 0.00 | 0.10 |
| CD279 | 0.17 | 0.17 |
| CD282 | 0.19 | 0.15 |
| CD294 | 0.06 | 0.05 |
| CD305 | 0.33 | 0.21 |
| CD309 | 0.39 | 0.26 |
| CD314 | 0.35 | 0.21 |
| CD321 | 0.40 | 0.25 |
| CD326 | 2.37 | 0.41 |
| CDw327 | 0.34 | 0.22 |
| CDw328 | 0.42 | 0.22 |
| CD329 | 0.37 | 0.18 |
| CD335 | 0.31 | 0.18 |
| CD336 | 0.20 | 0.18 |
| CD337 | 0.84 | 0.42 |
| αβTCR | 1.44 | 0.27 |
| BLTR-1 | 0.33 | 0.22 |
| CLIP | 0.25 | 0.23 |
| CMRF-44 | 0.48 | 0.23 |
| CMRF-56 | 0.26 | 0.23 |
| fMLP-R | 0.44 | 0.20 |
| γδTCR | 0.48 | 0.19 |
| 不變性NKT | 0.08 | 0.15 |
| NKB1 | 0.22 | 0.12 |
| SSEA-1 | 0.00 | 0.15 |
| TRA-1-60 | 0.00 | 0.12 |
| TRA-1-81 | 0.00 | 0.10 |
| Vβ23 | 0.21 | 0.13 |
| Vβ8 | 0.44 | 0.15 |
| SSEA-3 | 0.11 | 0.05 |
| CLA | 0.07 | 0.05 |
| 整聯蛋白β7 | 0.06 | 0.04 |
[表17A]
表17A 在製劑所含之細胞為陰性之表面抗原
| 表面抗原 | 產品 平均 | SE |
| CD1a | 0.00 | 0.85 |
| CD1b | 0.00 | 0.80 |
| CD1d | 0.00 | 0.83 |
| CD2 | 0.00 | 0.73 |
| CD3 | 0.00 | 0.22 |
| CD4 | 0.00 | 0.76 |
| CD4v4 | 0.52 | 0.84 |
| CD5 | 0.00 | 0.24 |
| CD6 | 0.00 | 0.78 |
| CD7 | 0.00 | 0.77 |
| CD8a | 0.00 | 0.85 |
| CD8b | 0.00 | 0.17 |
| CD11b | 0.00 | 0.23 |
| CD11c | 0.00 | 0.80 |
| CD14 | 0.71 | 0.36 |
| CD15 | 0.05 | 0.21 |
| CD15s | 0.00 | 0.21 |
| CD16 | 0.00 | 0.84 |
| CD18 | 0.00 | 0.82 |
| CD19 | 0.00 | 0.75 |
| CD20 | 0.00 | 0.22 |
| CD21 | 0.00 | 0.75 |
| CD22 | 0.00 | 0.76 |
| CD23 | 0.00 | 0.80 |
| CD24 | 0.00 | 0.24 |
| CD25 | 0.00 | 0.78 |
| CD26 | 9.03 | 1.86 |
| CD27 | 0.00 | 0.78 |
| CD28 | 0.00 | 0.81 |
| CD30 | 0.00 | 0.74 |
| CD31 | 0.00 | 0.69 |
| CD32 | 0.00 | 0.21 |
| CD33 | 0.00 | 0.71 |
[表17B]
表17B 在製劑所含之細胞為陰性之表面抗原
| 表面抗原 | 產品 平均 | SE |
| CD34 | 0.00 | 0.58 |
| CD35 | 0.00 | 0.75 |
| CD36 | 0.71 | 0.28 |
| CD37 | 0.00 | 0.75 |
| CD38 | 0.00 | 0.74 |
| CD41a | 0.00 | 0.75 |
| CD41b | 0.00 | 0.29 |
| CD42a | 0.00 | 0.69 |
| CD42b | 0.00 | 0.83 |
| CD43 | 0.00 | 0.78 |
| CD45 | 0.00 | 0.83 |
| CD45RA | 1.10 | 0.44 |
| CD45RB | 0.00 | 0.84 |
| CD45RO | 0.74 | 0.43 |
| CD48 | 0.19 | 0.29 |
| CD50 | 0.29 | 0.38 |
| CD53 | 0.00 | 0.73 |
| CD56 | 2.67 | 1.53 |
| CD57 | 0.13 | 0.29 |
| CD62E | 0.00 | 0.75 |
| CD62L | 0.00 | 0.74 |
| CD62P | 0.00 | 0.79 |
| CD64 | 0.00 | 0.85 |
| CD66(a、c、d、e) | 0.14 | 0.37 |
| CD66b | 0.43 | 0.33 |
| CD66f | 0.00 | 0.84 |
| CD69 | 0.00 | 0.84 |
| CD70 | 0.00 | 0.31 |
| CD72 | 0.00 | 0.29 |
| CD75 | 0.01 | 0.33 |
| CD79b | 0.91 | 0.93 |
| CD83 | 0.51 | 0.86 |
| CD84 | 0.00 | 0.73 |
[表17C]
表17C 在製劑所含之細胞為陰性之表面抗原
| CD85 | 0.00 | 0.35 |
| CD86 | 0.00 | 0.77 |
| CD87 | 0.00 | 0.79 |
| CD88 | 0.00 | 0.82 |
| CD89 | 0.00 | 0.78 |
| CDw93 | 0.00 | 0.24 |
| CD94 | 0.00 | 0.76 |
| CD97 | 0.00 | 0.90 |
| CD99R | 0.00 | 0.30 |
| CD100 | 0.00 | 0.77 |
| CD102 | 0.00 | 0.20 |
| CD103 | 0.00 | 0.80 |
| CD106 | 4.43 | 0.79 |
| CD114 | 0.00 | 0.77 |
| CD117 | 0.00 | 0.72 |
| CD118 | 0.00 | 0.82 |
| CD120b | 0.00 | 0.07 |
| CD121b | 0.00 | 0.78 |
| CD122 | 0.00 | 0.79 |
| CD123 | 0.00 | 0.78 |
| CD124 | 0.00 | 0.77 |
| CD126 | 0.00 | 0.77 |
| CD127 | 0.00 | 0.78 |
| CD128b | 0.00 | 0.81 |
| CD132 | 0.26 | 0.06 |
| CD134 | 0.00 | 0.80 |
| CD135 | 0.00 | 0.76 |
| CD137 | 0.00 | 0.76 |
| CD137配體 | 0.00 | 0.79 |
| CD138 | 0.00 | 0.76 |
| CD144 | 0.00 | 0.79 |
| CD146 | 9.80 | 3.52 |
| CD150 | 0.00 | 0.80 |
[表17D]
表17D 在製劑所含之細胞為陰性之表面抗原
| 表面抗原 | 產品 平均 | SE |
| CD152 | 0.35 | 0.50 |
| CD153 | 0.00 | 0.74 |
| CD154 | 0.00 | 0.73 |
| CD158a | 0.00 | 0.14 |
| CD158b | 0.00 | 0.23 |
| CD161 | 0.00 | 0.77 |
| CD162 | 0.00 | 0.74 |
| CD163 | 0.00 | 0.78 |
| CD172b | 0.00 | 0.63 |
| CD177 | 0.00 | 0.77 |
| CD178 | 0.00 | 0.77 |
| CD180 | 0.00 | 0.79 |
| CD183 | 0.00 | 0.79 |
| CD184 | 0.00 | 0.14 |
| CD193 | 0.12 | 0.33 |
| CD195 | 0.00 | 0.16 |
| CD196 | 0.00 | 0.71 |
| CD197 | 0.00 | 0.18 |
| CD205 | 0.00 | 0.22 |
| CD206 | 0.00 | 0.79 |
| CD209 | 1.62 | 0.47 |
| CD210 | 0.00 | 2.02 |
| CD212 | 0.00 | 2.09 |
| CD220 | 0.00 | 0.80 |
| CD226 | 0.00 | 0.78 |
| CD229 | 0.00 | 0.79 |
| CD231 | 0.00 | 0.78 |
| CD235a | 0.00 | 0.22 |
| CD244 | 0.00 | 0.11 |
| CD255 | 0.00 | 0.19 |
| CD267 | 0.00 | 2.11 |
| CD268 | 0.00 | 0.67 |
| CD271 | 4.62 | 0.78 |
[表17E]
表17E 在製劑所含之細胞為陰性之表面抗原
| CD275 | 0.74 | 0.44 |
| CD278 | 0.00 | 0.76 |
| CD279 | 0.00 | 0.73 |
| CD282 | 0.00 | 0.82 |
| CD294 | 0.00 | 2.05 |
| CD305 | 0.00 | 0.78 |
| CD309 | 0.00 | 0.83 |
| CD314 | 0.00 | 0.81 |
| CD321 | 0.00 | 0.75 |
| CD326 | 0.99 | 0.74 |
| CDw327 | 0.00 | 0.77 |
| CDw328 | 0.00 | 0.82 |
| CD329 | 0.00 | 0.83 |
| CD335 | 0.00 | 0.81 |
| CD336 | 0.00 | 0.81 |
| CD337 | 0.00 | 0.74 |
| αβTCR | 0.95 | 0.27 |
| BLTR-1 | 0.00 | 0.79 |
| CLIP | 0.00 | 0.74 |
| CMRF-44 | 0.27 | 0.18 |
| CMRF-56 | 0.00 | 0.85 |
| fMLP-R | 0.00 | 0.82 |
| γδTCR | 0.00 | 0.80 |
| 不變性NKT | 0.00 | 0.79 |
| SSEA-1 | 0.00 | 0.12 |
| TRA-1-60 | 0.00 | 0.13 |
| SSEA-3 | 0.96 | 0.21 |
| CLA | 0.14 | 0.13 |
| 整聯蛋白β7 | 0.00 | 2.03 |
| MIC A/B | 0.45 | 0.41 |
在中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中，將在陽性率有10%以上的差者揭示於圖7。在利用實施例9～15所記載之方法進一步培養中間體細胞而得之源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中，相較於中間體細胞，CD39、CD49a、CD61、CD107a、CD107b及CD143的陽性率增加20%以上，另一方面，CD146的陽性率降低60%。此等結果表示，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞具有與中間體細胞不同的性質。亦即，顯示藉由實施例9～15所記載之方法進行培養，藉此可獲得源自牙髓的細胞製劑所含之細胞以作為與中間體細胞不同的新細胞。
[實施例23：源自牙髓的細胞的特性((血管內皮細胞增殖因子(VEGF)分泌能力試驗)]
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，進行離心(1500rpm，5分鐘)，使細胞沉澱。接著，使細胞懸浮於DMEM(10%FBS)培養基，以成為5000～15000細胞/cm2
的密度之方式，接種至細胞培養盤，進行培養直至細胞成為90～100%融合為止。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，測定活細胞數。使細胞在DMEM(10%FBS)培養基中以0.7×105
個/mL的濃度懸浮後，將其10mL接種至T25細胞培養盤，培養5日。培養後，回收培養上清液的全部量，以電子天秤(島津製作所公司)計測所回收之培養上清液的重量，在-80℃進行冷凍保存直至測定時。回收、去除上清液後，以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，在37℃靜置5～10分鐘使其剝離。添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，測定活細胞數。
將上述冷凍保存之培養上清液進行解凍，使用Quantikine ELISA Human VEGF 套組(R&D Systems公司)將培養上清液中所含之VEGF進行標識後，使用微量盤讀數器(Molecular Devices公司)進行檢測。在以既知濃度的VEGF所作成之校正曲線中，內插所得之檢測值，求取培養上清液中所含之VEGF濃度。VEGF的分泌量係藉由下述式，以每細胞數的分泌量的形態算出。
[VEGF的分泌量=VEGF濃度測定值×培養上清液的體積/活細胞數(1×105
個)]
在圖8中揭示測定結果的一例。此結果顯示，中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞皆具有VEGF的分泌能力，但其能力在從中間體細胞經過進一步培養而成為源自牙髓的細胞製劑為止的過程中會增強。VEGF因係具有血管新生作用的物質，故源自牙髓的細胞製劑，藉由將此投予至人類，而可透過VEGF而在體內促進血管的形成。又，在經過中間體細胞所製造之源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中，因增強VEGF的分泌能力，故藉由此製造方法所製造之源自牙髓的細胞製劑，能被認為係更有效地作為應發揮血管新生作用之疾病的治療藥。
[實施例24：源自牙髓的細胞的特性(前列腺素E2
(PGE2
)分泌能力試驗)]
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，進行離心(1500rpm，5分鐘)，使細胞沉澱。接著，使細胞懸浮於DMEM(10%FBS)培養基，以成為5000～15000細胞/cm2
的密度之方式，接種至細胞培養盤，進行培養直至細胞成為90～100%融合為止。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，測定活細胞數。使細胞在DMEM(10%FBS)培養基以1×105
個/mL的濃度懸浮後，在12孔細胞培養盤中的6孔份中分別接種1mL的細胞稀釋液。再者，在3孔中各添加1mL之含有40 ng/mL的TNFα(R&D Systems公司)的DMEM(10%FBS)培養基，在剩下的3孔中，各添加1mL之DMEM(10%FBS)培養基，將前者作為TNFα刺激組，將後者作為無刺激組(控制組)，培養約24小時。培養後，回收培養上清液的全部量，以電子天秤(島津製作所公司)計測所回收之上清液的重量，在-80℃進行冷凍保存直至測定時。回收、去除上清液後，以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，測定活細胞數。
將上述冷凍保存之培養上清液進行解凍，使用Prostaglandin E2 Express EIA Kit(Cayman Chemical公司)將培養上清液中所含之前列腺素E2
(PGE2
)進行標識後，使用微量盤讀數器(Molecular Devices公司)進行檢測。在以既知濃度的PGE2
所作成之校正曲線中，內插所得之檢測值，求取培養上清液中所含之PGE2
濃度。PGE2
的分泌量係藉由下述式，以每1×105
個細胞數的分泌量的形態算出。
[PGE2
的分泌量=PGE2
濃度測定值×培養上清液的體積/活細胞數(1×105
個)]
在圖9中揭示測定結果。此結果顯示，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞皆具有TNFα反應性的PGE2
的分泌能力，但其能力在從中間體細胞經過進一步培養而成為源自牙髓的細胞製劑為止的過程中會增加。PGE2
因具有強力的抗發炎作用，故源自牙髓的細胞製劑，藉由將此投予至人類，而透過PGE2
在體內作用於發炎部位，可抑制伴隨發炎之組織破壞。又，在經過中間體細胞所製造之源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中，因增強PGE2
的分泌能力，故藉由此製造方法所製造之源自牙髓的細胞製劑，能被認為係更有效地作為應發揮抗發炎作用之疾病的治療藥。
[實施例25：犬尿胺酸分泌試驗]
(試驗方法)
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，進行離心使其沉澱，使細胞懸浮於DMEM(10%FBS)培養基後，以成為5000～15000細胞/cm2
的密度之方式接種至細胞培養燒瓶，直至細胞成為90～100%融合為止，培養4天。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA(Thermo Fisher Scientific公司)，在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，測定活細胞數。以成為15000～25000細胞/cm2
的密度之方式，將細胞接種至2個細胞培養燒瓶。在其中一個細胞培養燒瓶中，添加含有100 U/mL的IFNγ(鹽野義製藥公司)之DMEM(10%FBS)培養基，在另一個細胞培養燒瓶中，添加DMEM(10%FBS)培養基，將前者作為IFNγ刺激組，將後者作為無刺激組(控制組)，培養3日。培養後，將全部量的細胞培養上清液進行回收。以電子天秤(島津製作所公司)計測所回收之細胞培養上清液的重量，在-80℃進行冷凍保存直至測定時。回收、去除上清液後，以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，分別測定IFNγ刺激組及無刺激組的活細胞數。將上述冷凍保存之培養上清液進行解凍，添加30%三氯乙酸(Nacalai Tesque公司)，進行離心(10000×g，10分鐘)後，使用HPLC(島津製作所公司)檢測培養上清液中所含之犬尿胺酸。在以既知濃度的犬尿胺酸所作成之校正曲線中，內插所得之檢測值，求取培養上清液中所含之犬尿胺酸濃度(莫耳濃度)。犬尿胺酸的分泌量係藉由下述式，以每細胞數的分泌量的形態算出。
[犬尿胺酸的分泌量=犬尿胺酸濃度測定值×208.21×培養上清液的體積/活細胞數(1×105
個)]
(結果)
將結果揭示於圖10。藉由在IFNγ存在下進行培養，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑的犬尿胺酸的分泌量皆顯著地增加。犬尿胺酸抑制T細胞的增殖，同時可使單核球分化成抗發炎性的M2巨噬細胞。因此，多潛能幹細胞富集之源自牙髓的細胞能被認為，藉由將此投予至人類，可透過犬尿胺酸發揮抗發炎作用。
[實施例26：源自牙髓的細胞的特性(低免疫原性試驗)]
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，進行離心(1500rpm，5分鐘)，使細胞沉澱。接著，使細胞懸浮於DMEM(10%FBS)培養基，以成為5000～15000細胞/cm2
的密度之方式接種至細胞培養盤，進行培養直至細胞成為90～100%融合為止。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，測定活細胞數。以15000～25000細胞/cm2
的密度之方式，將細胞接種至2個細胞培養盤。在其中一個細胞培養盤中，添加含有100U/mL的IFNγ(鹽野義製藥公司)之DMEM(10%FBS)培養基，在另一個細胞培養盤中，添加DMEM(10%FBS)培養基，將前者作為IFNγ刺激組，將後者作為無刺激組(控制組)，培養3日。培養後，以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，分別測定IFNγ刺激組及無刺激組的活細胞數。接著，將各組的細胞懸浮液進行離心(1500rpm，5分鐘)，去除上清液後，添加阻斷溶液(實施例21所記載)，以細胞濃度成為1×107
細胞/mL之方式進行調整，在冰上靜置1小時。
作為對於第一類MHC抗原、第二類MHC抗原、CD40、CD80、CD86之抗體，分別使用FITC標識抗人類第一類MHC抗原抗體(Ancell公司)、FITC標識抗人類第二類MHC抗原抗體(Ancell公司)、FITC標識抗人類CD40抗體(BD Biosciences公司)、FITC標識抗人類CD80抗體(BD Biosciences公司)、FITC標識抗人類CD86抗體(BD Biosciences公司)。又，作為控制組抗體，使用FITC標識小鼠IgG1同型控制組(Beckman Coulter公司)、及FITC標識小鼠IgG2a同型控制組(BD Biosciences公司)。
在5mL反應管(編號(1)～(16))中，如同表18所示，添加各抗體溶液。接著，在5mL反應管(1)～(8)中，各添加100μL之IFNγ刺激組的細胞懸浮液，又，在5mL反應管(9)～(16)中各添加100μL之IFNγ無刺激組的細胞懸浮液，並輕輕地振動並混合，使其在冰上靜置20分鐘，使各抗體溶液所含之抗體與表現於細胞表面之表面抗原標記進行結合。接著，各3mL地添加PBS-B並混合後，將細胞進行離心(1500rpm，5分鐘)，使其沉澱，去除上清液，去除未與細胞結合之抗體。將此抗體的去除操作重複3次。接著，在各管中添加400μL之PBS-B，使細胞懸浮。
[表18]
表18 添加於各反應管之抗體溶液的種類與量
| 管編號 | 抗體溶液 | 添加量 |
| (1)、(9) | - | - |
| (2)、(10) | IgG1-FITC | 20 |
| (3)、(11) | IgG2a-FITC | 20 |
| (4)、(12) | anti-MHC-Class I | 2 |
| (5)、(13) | anti-MHC-Class II | 2 |
| (6)、(14) | anti-CD40-FITC | 20 |
| (7)、(15) | anti-CD80-FITC | 20 |
| (8)、(16) | anti-CD86-FITC | 20 |
針對管編號(1)～(16)的細胞，以BD FACSVerse(BD公司)測定FITC的螢光色素的量，藉由與陰性控制組的比較，求取透過與表面抗原特異性結合的抗體而與細胞表面結合之螢光色素的量。此外，管(2)為管(4)及(6)～(8)的陰性控制組，管(3)為管(5)的陰性控制組，管(10)為管(12)及(14)～(16)的陰性控制組，管(11)為(13)的陰性控制組。管(1)及(9)為非染色細胞。
(結果)
圖11A及圖11B中揭示測定結果。若由第一類MHC抗原的測定結果來看，則不論有無IFNγ刺激，中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑皆幾乎全部的細胞為陽性。若由第二類MHC抗原的測定結果來看，則中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑，在IFNγ無刺激中，皆實質上全部的細胞為陰性，但藉由IFNγ刺激，大多數細胞成為陽性。若由CD40、CD80、及CD86的測定結果來看，則不論有無IFNγ刺激，中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑皆幾乎全部的細胞為陰性。
第一類MHC抗原及第二類MHC抗原係具有將抗原提示於免疫細胞的功能之細胞表面抗原。又，第一類MHC抗原已知在幾乎全部的細胞表現，又，第二類MHC抗原已知在多數的細胞中藉由IFNγ刺激而誘導其表現。另一方面，CD40、CD80、及CD86係參與免疫系統細胞的活化之表面抗原。亦即，中間體細胞冷凍品及源自牙髓的細胞製劑因皆未表現CD40、CD80、及CD86，故能被認為未積極地活化免疫細胞。亦即，此等結果顯示，中間體細胞冷凍品及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞皆不具有免疫原性，具有即使在經IFNγ刺激之情形中，亦不引起免疫原性的性質。
[實施例27：中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞的包含細胞激素之各種因子的分泌能力之測定]
(前培養)
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，將已融解的細胞懸浮液的全部量添加至DMEM培養基。進行離心(300×g，5分鐘，室溫)，去除上清液後，添加DMEM培養基進行懸浮，使用Muse Cell Analyzer(Millipore Sigma公司)，計測細胞懸浮液中的活細胞數與全部細胞數，算出生存率。以活細胞在中間體細胞冷凍品中的細胞中成為7000個/cm2
，且在源自牙髓的細胞製劑中的細胞中成為12000個/cm2
之方式，將細胞接種至T225燒瓶，在CO2
培養箱(incubator)內(37℃，5% CO2
)培養4日。培養後，從T225燒瓶去除培養基後，以D-PBS進行清洗，添加0.25% Trypsin-EDTA，在CO2
培養箱內靜置5分鐘。確認細胞的剝離後，添加DMEM培養基，使細胞懸浮，回收全部量。進行離心(300×g，5分鐘，室溫)，使細胞沉澱。去除上清液後，添加DMEM培養基進行懸浮，使用Muse Cell Analyzer(Millipore Sigma公司)，計測細胞懸浮液中的活細胞數與全部細胞數，算出生存率。
(培養上清液的回收)
以活細胞的個數成為28000個/燒瓶之方式，將前培養所回收之細胞接種至T25燒瓶，分成無刺激組、TNFα及IFNγ刺激組，開始培養。各組的培養基量係每1個燒瓶為10mL，TNFα的最終濃度調整成10 ng/mL(原液2µg/mL)，IFNγ的最終濃度調整成100U/mL(原液1×106
U/mL)。在開始培養後第3日，將培養上清液各0.5mL地回收至冷凍管，進行冷凍保存。在培養上清液回收後，以D-PBS進行清洗，添加0.25% Trypsin-EDTA，在CO2
培養箱內靜置5分鐘。確認細胞的剝離後，添加DMEM培養基，回收全部量。進行離心(300×g，5分鐘，室溫)，去除上清液後，添加DMEM培養基進行懸浮，使用Muse Cell Analyzer(Millipore Sigma公司)，計測細胞懸浮液中的活細胞數與全部細胞數，算出生存率。
(細胞激素測定)
將所回收之培養上清液所含之包含細胞激素的各種因子的濃度，使用LEGENDplex(BioLegend公司)進行測定。以下說明LEGENDplex的測定原理的概略內容。將已與珠粒結合之每個抗原(細胞激素的種類)不同之一級抗體，添加至包含成為測定對象之物質的樣本，使一級抗體與該物質進行結合。接著，添加已生物素化的二級抗體，使其與已與一級抗體結合之該物質進行結合，再進一步，使其與藻紅素(PE)標識鏈親和素(Streptavidin)。抗生物素蛋白因與生物素特異性結合，故藉由將此以流動式細胞測量術進行測定，可因應其螢光強度，定量已與珠粒結合之藻紅素(PE)標識鏈親和素。此定量值因與樣本所含之成為測定對象之物質的量成比例，故可定量該物質。
(結果：在無刺激組中之各種因子的表現量)
將在無刺激組中之培養上清液所含之各種因子的濃度揭示於圖12。中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞皆高水平地表現MMP-2、IGFBP-4、及胱抑素C(圖12)。
又，中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞皆發現IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、GROα、HGF、VEGF、VCAM-1、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1(圖13)。
再者，中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，雖為微量但皆表現IL-23、TNF-α、IL-18、IL-33、IL-27、TARC、ENA-78、MIP-3α、MIP-1β、IP-10(CXCL10)、SCF、及ICAM-1(圖14)。又，中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞皆不表現IL-21、Exotaxin、MIP-1α、MIG、I-TAC、及GM-CSF，或幾乎不表現。IFN-α在中間體細胞中未被檢測到表現，但在源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中微量地表現。又，表中雖未揭示，但在中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞中，皆不表現為發炎性細胞激素之IL-2、IL-4、IL-5、IL-9、及IL-13，或幾乎不表現。
(結果：在無刺激組中之各種因子的表現量之在中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞之間的差異)
在中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞之間，針對表現量比較不同的因子，將培養上清液所含之各種因子的濃度比揭示於圖15。此等因子，相較於中間體細胞，在源自牙髓的細胞製劑所含之細胞的表現量多。尤其，IL-6、IL-11、HGF、IGFBP-4、TIMP-3、及TIMP-1在源自牙髓的細胞製劑所含之細胞的表現量為中間體細胞的1.5倍以上。
(結果：由TNF-α及IFN-γ刺激所致之IL-6的表現量的變化)
將以TNF-α及IFN-γ刺激時之培養上清液所含之IL-6的濃度揭示於圖16。在中間體細胞中，在TNF-α及IFN-γ刺激之任一者中，相較於無刺激之情形，IL-6的表現量皆增加。針對源自牙髓的細胞製劑所含之細胞亦同樣。
(結果：由TNF-α及IFN-γ刺激所致之IL-11的表現量的變化)
將以TNF-α及IFN-γ刺激時之培養上清液所含之IL-11的濃度揭示於圖17。在中間體細胞中，在TNF-α及IFN-γ刺激之任一者中，相較於無刺激之情形，IL-11的表現量皆增加。針對源自牙髓的細胞製劑所含之細胞亦同樣。
(結果：由TNF-α及IFN-γ刺激所致之IP-10(CXCL10)的表現量的變化)
將以TNF-α及IFN-γ刺激時之培養上清液所含之IP-10的濃度揭示於圖18。在中間體細胞中，在TNF-α及IFN-γ刺激之任一者中，雖在圖中未顯示IP-10的濃度，但係因IP-10的濃度低，如圖14所示，中間體細胞即使在無刺激之情形中亦表現。針對源自牙髓的細胞製劑所含之細胞亦同樣。
(結果：由TNF-α及IFN-γ刺激所致之MCP-1的表現量的變化)
將以TNF-α及IFN-γ刺激時之培養上清液所含之MCP-1的濃度揭示於圖19。在中間體細胞中，在TNF-α及IFN-γ刺激之任一者中，相較於無刺激之情形，MCP-1的表現量皆增加。針對源自牙髓的細胞製劑所含之細胞亦同樣。
(結果：由TNF-α及IFN-γ刺激所致之GM-CSF的表現量的變化)
將以TNF-α及IFN-γ刺激時之培養上清液所含之GM-CSF的濃度揭示於圖20。無刺激之情形，GM-CSF在中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞之任一者中皆幾乎未確認到表現。在中間體細胞中，雖藉由TNF-α刺激而誘導GM-CSF的表現，但在IFN-γ刺激中未誘導表現。針對源自牙髓的細胞製劑所含之細胞亦同樣。
(結果：由TNF-α及IFN-γ刺激所致之HGF的表現量的變化)
將以TNF-α及IFN-γ刺激時之培養上清液所含之HGF的濃度揭示於圖21。在中間體細胞中，相較於無刺激之情形，HGF的表現量藉由TNF-α刺激而減少，另一方面藉由IFN-γ刺激而增加。針對源自牙髓的細胞製劑所含之細胞亦同樣。
(結果：由TNF-α及IFN-γ刺激所致之IL-8的表現量的變化)
將以TNF-α及IFN-γ刺激時之培養上清液所含之IL-8的濃度揭示於圖22。在中間體細胞中，相較於無刺激之情形，IL-8的表現量藉由TNF-α刺激而增加，但在IFN-γ刺激中無變化。針對源自牙髓的細胞製劑所含之細胞亦同樣。
[實施例28：源自牙髓的細胞的特性(細胞分裂能力)]
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，進行離心(1500rpm，5分鐘)，使細胞沉澱。接著，使細胞懸浮於DMEM(10%FBS)培養基，以成為5000～15000細胞/cm2
的密度之方式接種至細胞培養盤，進行培養直至細胞成為90～100%融合為止。以PBS清洗細胞，添加胰蛋白酶-EDTA，在37℃靜置5～10分鐘，使細胞剝離。添加DMEM(10%FBS)培養基，使細胞懸浮，測定活細胞數。再次，以成為5000～15000細胞/cm2
的密度之方式，將細胞接種至細胞培養盤，進行培養直至細胞成為90～100%融合為止。重複細胞的繼代培養，在每次繼代培養結束時，測定活細胞數，算出細胞的分裂次數。細胞的分裂次數係藉由下述式，從各繼代培養的開始時的活細胞數與培養結束時的活細胞數算出。
細胞的分裂次數＝log2
(培養結束時的活細胞數/培養開始時的活細胞數)
(結果)
中間體細胞冷凍品所含之細胞，在解凍後亦具有14次以上的分裂能力，又，該時的倍化時間為3日以內(72小時以內)。又，源自牙髓的細胞製劑所含之細胞，在解凍後亦具有4次以上的分裂能力，又，該時的倍化時間為3日以內(72小時以內)。
[實施例29：中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)的分泌能力試驗]
(前培養)
將由實施例7所製備之中間體細胞冷凍品及由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，將已融解的細胞懸浮液的全部量添加至DMEM培養基。進行離心(300×g，5分鐘，室溫)，去除上清液後，添加DMEM培養基進行懸浮，使用Muse Cell Analyzer(Millipore Sigma公司)，計測細胞懸浮液中的活細胞數與全部細胞數，算出生存率。以活細胞在中間體細胞冷凍品中的細胞中成為7000個/cm2
，且在源自牙髓的細胞製劑中的細胞中成為12000個/cm2
之方式，將細胞接種至T225燒瓶，在CO2
培養箱內(37℃，5%CO2
)培養4日。培養後，從T225燒瓶去除培養基後，以D-PBS進行清洗，添加0.25% Trypsin-EDTA，在CO2
培養箱內靜置5分鐘。確認細胞的剝離後，添加DMEM培養基，使細胞懸浮，回收全部量。進行離心(300×g，5分鐘，室溫)，使細胞沉澱。去除上清液後，添加DMEM培養基進行懸浮，使用Muse Cell Analyzer(Millipore Sigma公司)，計測細胞懸浮液中的活細胞數與全部細胞數，算出生存率。
(培養上清液的回收)
以活細胞的個數成為28000個/燒瓶之方式，將前培養所回收之細胞接種至T25燒瓶，分成無刺激組、TNFα及IFNγ刺激組，開始培養。各組的培養基量係每1個燒瓶為10mL，TNFα的最終濃度調整成10ng/mL(原液2µg/mL)，IFNγ的最終濃度調整成100U/mL(原液1×106
U/mL)。在開始培養後第3日，將培養上清液各0.5mL地回收至冷凍管，進行冷凍保存。在培養上清液回收後，以D-PBS進行清洗，添加0.25% Trypsin-EDTA，在CO2
培養箱內靜置5分鐘。確認細胞的剝離後，添加DMEM培養基，回收全部量。進行離心(300×g，5分鐘，室溫)，去除上清液後，添加DMEM培養基進行懸浮，使用Muse Cell Analyzer(Millipore Sigma公司)，計測細胞懸浮液中的活細胞數與全部細胞數，算出生存率。
(顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)測定)
將所回收之培養上清液所含之顆粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)的濃度，使用LEGENDplex(BioLegend公司)進行測定。
(結果：由TNF-α及IFN-γ刺激所致之G-CSF的表現量的變化)
將以TNF-α及IFN-γ刺激時之培養上清液所含之G-CSF的濃度揭示於圖23。無刺激之情形，G-CSF在中間體細胞與源自牙髓的細胞製劑所含之細胞之任一者中皆幾乎未確認到表現。在中間體細胞中，雖藉由TNF-α刺激而誘導G-CSF的表現，但在IFN-γ刺激中未誘導表現。針對源自牙髓的細胞製劑所含之細胞亦同樣。在腦及脊椎的神經細胞中，G-CSF受體會表現，G-CSF被報導具有神經保護作用，亦已對於腦梗塞進行臨床研究(Shyu WC.CMAJ.174.927-33(2006))。G-CSF被暗示對於脊椎損傷亦具有治療的效果(Nishio Y.J Neuropathol Exp Neurol.66.724-31)。再者，G-CSF亦被報導抑制為發炎性細胞激素之TNF-α、IL-1β的表現(國府田正雄.整形外科.58.1464(2007)。因此，例如，中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑被預測透過G-CSF而對於腦及脊椎等神經細胞的損傷發揮治療效果。
[比較例1：源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)的培養]
使用從健康正常人類的骨髓所分離之間葉系幹細胞(Takara Bio、PromoCell公司製，Lot:413Z021.4或429Z022)。以包含10%胎牛血清(FBS，Hyclone Lavoratories公司，Cat. No.: SH30396)之DMEM(Thermo Fisher Sicentific公司，Cat. No.: 10567)或製造商指定的專用培養基(PromoCell公司，Cat. No.:C-28009)，在培養皿中進行平板培養，使細胞增殖至3～6×107
個為止，進行回收，在幹細胞倉(stem cell bunker)(Takara Bio公司，Cat. No.:11922)中懸浮，進行冷凍保存。
[實施例30：源自牙髓的細胞的特性((血管生成素-1(Ang-1)分泌能力試驗)]
將由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，在12孔盤中以1×105
個/孔進行接種，在DMEM(10%FBS)培養基中培養1日。之後，將培養基交換成500μL之不包含FBS的DMEM，培養24小時，回收培養上清液，同時從盤剝離細胞，計測細胞數。將培養上清液中的人類Ang-1濃度，以ELISA法(R&D systems公司，cat. No.: DANG10)進行測定。將培養上清液中的Ang-1濃度乘以培養上清液量(500μL)，除以細胞數，算出Ang-1分泌量。試驗係以例數3進行，算出平均值與標準誤差。又，Ang-1分泌量係以1×104
個細胞所分泌的Ang-1分泌量之形態求取。Ang-1分泌量為132±23(pg/104
個，平均值±標準誤差)。
[比較例2：源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)的血管生成素-1(Ang-1)的分泌能力試驗]
針對由比較例1所得之源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)，以與實施例30同樣的方法，進行血管生成素-1的分泌量的測定。hMSC-BM的Ang-1分泌量為16±2(pg/104
個，平均值±標準誤差)。
(結果)
將源自牙髓的細胞與hMSC-BM的血管生成素-1(Ang-1)的分泌量之測定結果統整於圖24。此等結果顯示，相較於hMSC-BM，源自牙髓的細胞分泌約8.25倍的血管生成素-1(圖24)。
[實施例31 使用人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)之對於血管穿透性的作用的比較]
(培養上清液的製備)
將由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，將此與HUVEC(PromoCell公司，Cat. No.: C12200)以各種混合比例進行混合，製作細胞混合溶液。混合比例係以[混合比例＝源自牙髓的細胞數/全部細胞數×100%]所求得之數值。在24孔盤中，作為總細胞數，各0.5×105
個/孔地接種此細胞混合溶液，在DMEM培養基(10%FBS)培養3日。之後，交換成0.5mL的內皮細胞基本培養基(ScienCell公司，Cat. No.: 1001)，培養24小時，回收培養上清液。將離心分離後的上清液使用於對於血管穿透性之作用的探討。
(對於血管穿透性之作用的探討)
在已塗布膠原蛋白之24孔盤用導管(insert)中，以1×104
個/孔接種已懸浮於內皮細胞基本培養基之HUVEC，在已添加內皮細胞基本培養基之24孔盤內靜置，培養3～4日，藉此在導管的膜上形成HUVEC單層。培養後，將導管內及盤內的培養基全部去除。接著，在各導管中，添加已以100ng/mL的濃度添加上述的培養上清液或人類重組血管生成素-1溶液(Merck公司，Cat. No.:GF164)之內皮細胞基本培養基)，在已添加內皮細胞基本培養基之24孔盤內靜置1小時。再次，將導管內及盤內的培養基全部去除。接著，在各導管中，添加25μg/ml之包含FITC-dextran(Sigma-Aldrich公司，Cat. No.: FD70S-100MG)的內皮基本培養基，在已添加內皮細胞基本培養基之24孔盤內靜置30分鐘。
接著，回收盤孔內的培養基，將從導管側透過HUVEC單層穿透至盤孔側之源自FITC-dextran的螢光(Ex 485nm/Em 535nm)，使用螢光光度計進行測定。將在培養混合比例0%(亦即，僅HUVEC)的細胞培養液所得之培養上清液的螢光強度作為100%，將在各培養上清液的螢光強度以相對穿透率(%)的形態算出。將同樣的實驗獨立進行3～4次，算出各組的平均值與標準誤差。
[比較例3]使用由比較例1所得之源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)，以與實施例31同樣的手法，求取相對穿透率(%)。此外，此情形的混合比例係以[混合比例＝源自人類骨髓的間葉系幹細胞數/全部細胞數×100%]所求得之數值。
(結果)
將結果揭示於圖25。將源自牙髓的細胞以10、50、100%的混合比例與HUVEC混合者進行培養，使所得之培養上清液與HUVEC單層進行作用之相對穿透率，分別為79.0±10.4、65.9±9.7、63.4±6.5(%，平均值±標準誤差)，藉由使以10%的混合比例所製備之培養上清液進行作用，可見相對穿透率的減少，藉由使以50%以上的混合比例所製備之培養上清液進行作用，可見具有統計學上有意義差異的相對穿透率的減少。另一方面，將hMSC-BM以10、50、100%的混合比例與HUVEC混合者進行培養，使所得之培養上清液與HUVEC單層進行之相對穿透率，分別為99.6±5.6、81.4±4.0、62.8±14.4(%)。又，取代培養上清液，使已添加rhAng-1之培養基進行作用之際的相對穿透率為67.7±6.7(%)，可見統計學上有意義差異的抑制。此等結果顯示，相較於hMSC-BM，源自牙髓的細胞具有強的血管內皮的穿透性抑制作用。又，若與實施例30的結果一起考慮，則由源自牙髓的幹細胞的投予所致之血管內皮的穿透性抑制作用，係暗示透過源自牙髓的幹細胞所分泌之血管生成素-1(Ang-1)而發揮。
[實施例32：在脂多醣(LPS)誘導性急性肺損傷小鼠模式中，源自牙髓的幹細胞與源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)對於嗜中性球浸潤的效果比較]
(投予)
將由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，使用在富有微小血管的肺中產生急性障害之LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式，比較源自牙髓的細胞與hMSC-BM對於嗜中性球往組織障害部位的浸潤之作用。將由實施例16所製備之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，對於雄、10週齡的C57BL/6J小鼠(Japan Charles River)，以細胞數成為1.5×103
、1.5×104
個/個體之方式，將源自牙髓的細胞進行尾靜脈內投予。在陰性對照中，投予介質(製劑細胞用冷凍保存液)。
(引起病態)
將已投予源自牙髓的細胞或介質之小鼠，在投予後24小時後，在充滿已以霧化器(OMRON公司，型號:NE-U780)霧化之0.5mg/mL LPS溶液(Sigma-Aldrich公司，Cat. No.:L4130)之腔室內，飼育1小時，藉此使其吸入LPS，引起急性肺損傷。
(肺泡清洗液中的細胞數的計測)
在結束LPS的吸入後24小時後，將小鼠進行放血安樂死。將套管插入氣管分支，送入1mL的磷酸緩衝生理食鹽水(PBS，Sigma-Aldrich公司，Cat.No.: D8537-1L)，清洗肺泡內。回收肺泡清洗液，將肺泡清洗液中所含之細胞的總數，在顯微鏡下使用細胞計數盤進行測定。
[比較例4]
使用由比較例1所得之源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)，進行與實施例32同樣的實驗。
(結果)
將結果揭示於圖26。陰性對照組的肺泡清洗液中的總細胞數，相較於非病態組，顯示顯著的高值，確認到由引起病態所致之細胞往肺泡的浸潤。在已投予源自牙髓的細胞之組中，肺泡清洗液中的總細胞數係依賴投予細胞數地減少，在1.5×103
個/個體以上的投予量中，總細胞數具有統計學上有意義差異的減少。另一方面，在投予hMSC-BM之組中，在1.5×104
個/個體的投予量顯示減少傾向，但在任一用量中皆未確認到統計學上有意義差異。此外，於此所使用之小鼠模式的肺泡中，已知嗜中性球浸潤。此等結果顯示，相較於hMSC-BM，源自牙髓的細胞對於嗜中性球往組織障害部位的浸潤之抑制作用強。
[實施例33：在脂多醣(LPS)誘導性急性肺損傷小鼠模式中，源自牙髓的幹細胞與源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)對於VCAM(vascular cell adhesion molecule)-1表現之作用的效果比較]
(引起病態)
以實施例32所記載之方法，進行LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式的製作、源自牙髓的細胞的投予、及肺泡清洗液的採取。
(西方墨點法)
將採取肺泡清洗液後的肺進行摘出，將其一部分利用為組織溶解液之RIPA緩衝液(組成100mM Tris-HCl(pH7.4)、150mM NaCl、1% NonidetP40、0.5%去氧膽酸鈉、0.1% SDS)進行均勻化，藉此製備組織萃取溶液。供應作為每1道(lane)的總蛋白質量各10μg的樣本，利用SDS-PAGE展開後，往膜進行轉印。以抗VCAM-1抗體(R&D Systems公司， Cat. No.: AF643-SP)進行免疫染色，利用增強化學發光法，檢測源自目標蛋白質的帶(band)，利用影像分析軟體將訊號強度進行定量化。將非病態組之源自VCAM-1的訊號強度的平均值設為1之際的相對值作為VCAM-1蛋白表現量而算出。
[比較例5]
使用由比較例1所得之源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)，進行與實施例33同樣的實驗。
(結果)
將結果揭示於圖27。陰性對照組的VCAM-1蛋白表現量，相較於非病態組，顯示具有統計學上有意義差異的高值。以1.5×104
個/個體投予源自牙髓的細胞之組中，VCAM-1蛋白表現量，相較於陰性對照組，顯示具有統計學上有意義差異的低值，抑制至與非病態組同程度。另一方面，以1.5×104
個/個體投予hMSC-BM之組中，與介質組在VCAM-1蛋白表現量未確認到大的差異。VCAM-1係表現於血管內皮細胞的表面之黏附因子，嗜中性球可透過VCAM-1而與血管內皮細胞接著。如此嗜中性球往血管內皮細胞的接著係嗜中性球為了往組織進行浸潤的重要步驟。若與實施例32的結果一起考慮，則在由源自牙髓的細胞的投予所致之嗜中性球往組織障害部位的浸潤的抑制中，暗示參與由源自牙髓的細胞所致之組織障害部位中的VCAM-1的表現量的抑制。又，除了嗜中性球，淋巴球及單核球亦可透過VCAM-1而與血管內皮細胞接著。因此，被認為藉由投予源自牙髓的細胞，不僅嗜中性球，亦可抑制淋巴球及單核球往傷害部位的浸潤。
[實施例34：由源自牙髓的細胞製劑投予所致之神經症狀回復效果(大鼠腦梗塞模式)]
(腦梗塞模式大鼠(SD大鼠)的製作)
將雄、8週齡的Sprague-Dawley大鼠(CHARLES RIVER LABORATORIES JAPAN)，在2%異氟醚(Lot:165AMM，Mylan Seiyaku股份有限公司)的吸入麻醉下(麻醉背景為笑氣：氧=7:3)，固定成仰臥位。將大鼠的右總頸動脈、右外頸動脈及右內頸動脈露出，以縫合線結紮右總頸動脈及右外頸動脈。將預先以矽(Heraeus Kulzer Japan股份有限公司)進行塗布並剪切成19mm的長度之尼龍線(栓子)從右外頸動脈與右內頸動脈的分支部插入，阻塞右中大腦動脈(MCA)。右MCA阻塞後，進行頸部皮膚的縫合後，使其從麻醉甦醒。確認在使MCA阻塞後30分鐘後，在阻塞側的對側前肢(左前肢)有彎曲。在2%異氟醚的吸入麻醉下，再次將右總頸動脈、右內頸動脈露出，在使MCA阻塞後2小時後，拔去栓子，使右MCA的血流再次開始流動，藉此引起腦梗塞。在右MCA的血流再次開始流動後，進行右內頸動脈的結紮及頭部皮膚的縫合後，使其從麻醉甦醒。將此小鼠作為腦梗塞模式大鼠，使用於以下的實驗。此外，在MCA阻塞手術前，以20000 units/kg的用量，將苄青黴素鉀(Lot：PGSD804，Meiji Seika Pharmacia股份有限公司)進行肌肉內投予。
(源自牙髓的細胞的投予)
將由實施例16所得之源自牙髓的細胞製劑進行解凍，在使MCA阻塞後經過24小時後的腦梗塞模式小鼠中，以細胞數成為1.0×106
個/個體之方式，將源自牙髓的細胞進行尾靜脈內投予。在陰性對照中，投予介質。
(旋轉桿試驗)
在引起腦梗塞前，使用將旋轉速度設定成8次/分鐘之直徑9cm、寬8cm的旋轉桿(KN-75，夏目製作所股份有限公司)進行訓練。訓練期間最長為2日，以可在桿上滯留120秒鐘之方式進行訓練，將此值作為MCA阻塞手術前的測定值(預值)。在引起腦梗塞後3、7、14、28日，使用將旋轉速度設定成8次/分鐘之旋轉桿，測定在桿上的滯留時間(秒鐘)。最長測定時間為120秒鐘。
(結果)
將結果揭示於圖28。在旋轉桿試驗中，源自牙髓的細胞投予組在桿上的滯留時間，相較於介質組，係以高值進行推移，尤其，在手術後14日以後，在兩組間之值確認到統計學上有意義差異。此等結果顯示，源自牙髓的細胞具有改善腦梗塞大鼠的神經功能之效果。
[實施例35：在大鼠腦梗塞模式中，嗜中性球往梗塞區域的浸潤]
以在藉由實施例34所記載之方法所製作之腦梗塞模式大鼠中細胞數成為1.0×106
個/個體之方式，將源自牙髓的細胞進行尾靜脈內投予。在投予24小時後或48小時後，使其放血安樂死，採取腦組織，使用福馬林固定後的石蠟包埋切片，進行免疫組織化學的解析。免疫染色係使用抗血管生成素-1抗體(Abcam公司，Cat.# Ab133425)或抗髓過氧化酶(MPO)抗體(Abcam公司，Cat.# Ab208670)而進行。於此，髓過氧化酶係在嗜中性球強表現的酵素，使用作為嗜中性球的標記。
(結果)
將使用抗血管生成素-1抗體之免疫組織化學的解析的結果揭示於圖29。在介質投予組中，在非梗塞側未觀察到血管生成素-1(Ang-1)陽性細胞(圖29(a))，在腦梗塞側的血管周圍及腦實質觀察到弱陽性的細胞(圖29(b))。另一方面，在源自牙髓的細胞投予組中，在包含非梗塞側的腦組織整體，觀察到由抗Ang-1抗體所致之染色(圖29(c))，尤其在血管周圍觀察到多數的Ang-1強陽性的細胞(圖29(d))。此等結果顯示，藉由投予源自牙髓的細胞，腦整體，尤其腦梗塞部位的血管生成素-1濃度會上升，暗示由源自牙髓的細胞的投予所致之神經症狀回復效果等係透過血管生成素-1而發揮。
接著，將使用抗髓過氧化酶抗體之免疫組織化學的解析的結果揭示於圖30及圖31。在介質投予組中，在非梗塞側未確認到MPO陽性細胞，但在腦梗塞區域的周邊部位觀察到多數的MPO陽性細胞(圖30(a))。在源自牙髓的細胞投予組中，亦在腦梗塞區域的周邊部位觀察到陽性細胞(圖30(b))。但是，在每一視野的陽性細胞數，相對於在介質投予組為157.9±11.5(個，平均值±標準誤差)，在源自牙髓的細胞投予組中為66.0±18.8(個，平均值±標準誤差)，係具有統計學上有意義差異的低值(圖31)。此等結果顯示，藉由投予源自牙髓的細胞，而抑制嗜中性球往梗塞區域的浸潤。若與實施例33的結果一起考慮，則由源自牙髓的細胞的投予所致之神經症狀回復效果，係藉由源自牙髓的細胞而抑制嗜中性球往梗塞區域的浸潤，被認為藉此緩解梗塞區域中之發炎症狀。
[產業上利用之可能性]
本發明係有用於提供一種醫藥品，其例如係包含可投予至人類之源自牙髓的細胞作為有效成分而成，且用於抑制血管內皮的穿透性亢進、或嗜中性球等免疫細胞的浸潤。
1:血管生成素-1強陽性細胞
2:血管
3:腦實質
4:髓過氧化酶陽性細胞
圖1係顯示由實施例7及實施例16所得之中間體及源自牙髓的細胞製劑分別所含之源自牙髓的細胞(中間體細胞、及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞)中之細胞粒徑的測定結果的平均之圖表。縱軸表示平均粒徑(μm)。由左依序表示中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑所含之細胞的平均粒徑。誤差槓表示標準偏差(n＝3)。
圖2係顯示由實施例7及實施例16所得之源自牙髓的細胞的骨細胞分化能試驗的結果之圖表。縱軸表示鈣濃度(μg/mL)。針對中間體細胞(實施例7)及源自牙髓的細胞製劑中的細胞(實施例16)，各別的黑柱表示骨細胞分化誘導組，白柱表示控制組之由細胞所游離之鈣濃度。
圖3係顯示由實施例7及實施例16所得之源自牙髓的細胞的軟骨細胞分化能試驗的結果之圖表。縱軸表示聚蛋白多醣(aggrecan，ACAN)的Ct值。針對中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑中的細胞，各別的黑柱表示軟骨細胞分化誘導組，白柱表示控制組之細胞的聚蛋白多醣(ACAN)的Ct值。
圖4係顯示由實施例7及實施例16所得之源自牙髓的細胞的表面抗原的測定結果之圖表。縱軸表示陽性細胞的比例(%)。針對中間體細胞(黑柱)及源自牙髓的細胞製劑中的細胞(白柱)，各別由左依序表示CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、及CD166的陽性細胞的比例。
圖5係顯示由實施例7所得之中間體所含之源自牙髓的細胞(中間體細胞)的表面抗原的測定結果之圖表。縱軸表示陽性細胞的比例(%)。由左依序分別表示CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD46、CD47、CD49b、CD49c、CD49f、CD55、CD58、CD59、CD63、CD73、CD81、CD90、CD98、CD140b、CD147、CD151、CD164、CD166，EGF-R(上皮成長因子受體)、及HLA-A、B、C(人類白血球抗原-A、B、C)的陽性細胞的比例。值係使用平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝9)。
圖6係顯示由實施例16之源自牙髓的細胞製劑所含之細胞的表面抗原的測定結果之圖表。縱軸表示陽性細胞的比例(%)。由左依序表示CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD46、CD47、CD49b、CD49c、CD49e、CD49f、CD55、CD58、CD59、CD63、CD73、CD81、CD90、CD95、CD98、CD140b、CD147、CD151、CD164、CD166，EGF-R、及HLA-A、B、C的陽性細胞的比例。值係使用平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝7)。
圖7係顯示在由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑之間，基於其等所含之源自牙髓的細胞中之陽性率的差為10%以上的表面抗原，其等之差(在製劑的陽性率(%)-在中間體的陽性率(%))之圖表。由左依序表示在CD39、CD49a、CD61、CD107a、CD107b、CD143、及CD146的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝7)。
圖8係顯示由實施例7及實施例16所得之中間體及製劑中之源自牙髓的細胞的VEGF分泌能力試驗的結果之圖表。縱軸表示血管內皮增殖因子(VEGF)的分泌量(pg/1×105
細胞)。
圖9係顯示由實施例7及實施例16所得之中間體及製劑中之源自牙髓的細胞的前列腺素E2
(PGE2
)分泌能力試驗的結果之圖表。縱軸表示PGE2
的分泌量(pg/1×105
細胞)。黑柱表示TNFα(腫瘤壞死因子α)刺激組，白柱表示在TNFα無刺激組的結果。
圖10係顯示由實施例7及實施例16所得之中間體及製劑中之源自牙髓的細胞的犬尿胺酸分泌能力試驗的結果之圖表。縱軸表示中間體細胞及源自牙髓的細胞製劑中之細胞的各自的犬尿胺酸的分泌量(ng/1×105
細胞)。
圖11A係顯示由實施例7所得之中間體源自牙髓的細胞的低免疫原性試驗的結果之圖表。縱軸表示陽性細胞的比例(%)。黑柱表示在IFNγ(干擾素γ)無刺激組的結果，白柱表示在IFNγ刺激組的結果。由左依序表示第一類MHC(主要組織相容性)抗原、第二類MHC(主要組織相容性)抗原、CD40、CD80、及CD86的陽性細胞的比例。
圖11B係顯示由實施例16所得之製劑中的源自牙髓的細胞之低免疫原性試驗的結果之圖表。縱軸表示陽性細胞的比例(%)。黑柱表示在IFNγ無刺激組的結果，白柱表示在IFNγ刺激組的結果。由左依序表示第一類MHC抗原、第二類MHC抗原、CD40、CD80、及CD86的陽性細胞的比例。
圖12係顯示由實施例7及實施例16所得之中間體及製劑各自所含之源自牙髓的細胞在無刺激時之培養上清液中的細胞激素等各種因子的濃度的測定結果之圖表。縱軸表示各種因子的濃度(pg/1×105
細胞)。針對中間體細胞(黑柱)及源自牙髓的細胞製劑中的細胞(白柱)，各別由左依序表示MMP-2(基質金屬蛋白酶-2)，IGFBP-4(類胰島素成長因子結合蛋白-4)、及胱抑素C(cystatin C)的濃度。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖13係顯示由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑各自所含之源自牙髓的細胞在無刺激時之培養上清液中的細胞激素等各種因子的濃度的測定結果之圖表。縱軸表示各種因子的濃度(pg/1×105
細胞)。針對中間體細胞(黑柱)及源自牙髓的細胞製劑中的細胞(白柱)，各別由左依序表示IL-6(介白素-6)、IL-11(介白素-11)、MCP-1(Monocyte Chemotactic Protein-1，單核球趨化因子蛋白-1)、IL-8(介白素-8)、GROα(Human Growth Regulated Protein alpha，人類生長調節蛋白α)、HGF(肝細胞增殖因子)、VEGF(血管內皮增殖因子)、VCAM-1(Vascular Cell Adhesion Molecule-1，血管細胞黏附分子-1)、TIMP-3(Tissue inhibitor of Metalloproteinase-3，基質金屬蛋白酶之組織抑制因子-3)、TIMP-2(Tissue inhibitor of Metalloproteinase-2，基質金屬蛋白酶之組織抑制因子-2)、及TIMP-1(Tissue inhibitor of Metalloproteinase-1，基質金屬蛋白酶之組織抑制因子-1)的濃度。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖14係顯示由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑各自所含之源自牙髓的細胞在無刺激時之培養上清液中的細胞激素等各種因子的濃度的測定結果之圖。縱軸表示各種因子的濃度(pg/1×105
細胞)。針對中間體(黑柱)及製劑(白柱)，各別由左依序表示IL-23(介白素-23)、IL-21(介白素-21)、IFN-α(干擾素-α)、TNF-α、IL-18(介白素-18)、IL-33(介白素-33)、IL-27(介白素-27)、TARC(Thymus and activation-regluated chemokine，胸線及活化調控趨化激素)、ENA-78(Epithelial neutrophil-activating protein-78，上皮細胞來源中性粒細胞活化蛋白-78)、MIP-3α(巨噬細胞發炎性蛋白質-3α)、MIP-1β(巨噬細胞發炎性蛋白質-1β)、Eotaxin、IP-10(干擾素γ誘導蛋白質-10)、MIP-1α(巨噬細胞發炎性蛋白質-1α)、MIG(Monokine induced by gamma interferon，干擾素伽瑪誘導的單核球因子)、I-TAC(Interferon-inducible T-cell alpha chemoattractant，干擾素誘導的T細胞α趨化因子)、SCF(幹細胞因子)、GM-CSF(顆粒球單核球群落刺激因子)、及ICAM-1(Intercellular adhesion molecule-1，細胞間附著分子-1)的濃度。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖15係顯示針對在由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑之間，其等所含之源自牙髓的細胞在無刺激時之培養上清液中的細胞激素等各種因子之中，在製劑的濃度高於中間體者，其等之比(在製劑的濃度/在中間體的濃度)之圖表。由左依序表示IL-6、IL-23、IL-11、MCP-1、ENA-78、HGF、VEGF、MMP-2、IGFBP-4、胱抑素C、TIMP-3、TIMP-2、及TIMP-1的濃度比。值係使用平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖16係顯示針對由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑各自所含之源自牙髓的細胞，在無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激各自的組中之培養上清液中的IL-6的濃度之圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105
細胞)。針對中間體(黑柱)及製劑(白柱)，各別由左依序表示在無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的濃度。值係使用平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖17係顯示針對由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑各自所含之源自牙髓的細胞，在無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激各自的組中之培養上清液中的IL-11的濃度之圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105
細胞)。針對中間體(黑柱)及製劑(白柱)，各別由左依序表示無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖18係顯示針對由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑各自所含之源自牙髓的細胞，在無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激各自的組中之培養上清液中的IP-10(CXCL10)的濃度之圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105
細胞)。針對中間體(黑柱)及製劑(白柱)，各別由左依序表示無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖19係顯示針對由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑各自所含之源自牙髓的細胞，在無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激各自的組中之培養上清液中的MCP-1的濃度之圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105
細胞)。針對中間體(黑柱)及製劑(白柱)，各別由左依序表示無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖20係顯示針對由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑各自所含之源自牙髓的細胞，在無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激各自的組中之培養上清液中的GM-CSF的濃度之圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105
細胞)。針對中間體(黑柱)及製劑(白柱)，各別由左依序表示在無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖21係顯示針對由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑各自所含之源自牙髓的細胞，在無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激各自的組中之培養上清液中的HGF的濃度之圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105
細胞)。針對中間體(黑柱)及製劑(白柱)，各別由左依序表示在無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖22係顯示針對由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑各自所含之源自牙髓的細胞，在無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激各自的組中之培養上清液中的IL-8的濃度之圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105
細胞)。針對中間體(黑柱)及製劑(白柱)，各別由左依序表示在無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖23係顯示針對由實施例7及實施例16所得之中間體與製劑各自所含之源自牙髓的細胞，在無刺激、TNF-α刺激、及IFN-γ刺激各自的組中之培養上清液中的G-CSF的濃度之圖表。縱軸表示濃度(pg/1×105
細胞)。針對中間體(黑柱)及製劑(白柱)，各別由左依序表示在無刺激組、TNF-α刺激組、及IFN-γ刺激組的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖24係顯示由實施例16所得之源自牙髓的細胞、由比較例1所得之源自人類骨髓的間葉系幹細胞的血管生成素-1(Ang-1)的分泌能力試驗的結果之圖表。縱軸表示血管生成素-1(Ang-1)的分泌量(pg/1×104
細胞)。黑柱表示源自牙髓的細胞的結果，陰影柱表示源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3)。
圖25係顯示由實施例16所得之源自牙髓的細胞及由比較例1所得之源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)之關於使用人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)的血管穿透性之效果比較的結果之圖表。縱軸表示相對穿透率(%)。針對源自牙髓的細胞(黑柱)及hMSC-BM(陰影柱)，各別由左依序表示受驗細胞(源自牙髓的細胞或hMSC-BM)之由與HUVEC的混合比例10%、50%、100%之培養上清液的添加所致之結果，白柱表示使用人類重組血管生成素-1(rhAng-1)的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝3～4)。將在混合比例0%中之結果設為控制組，＊表示藉由Dunnett檢定而相對於控制組為p＜0.05，★表示藉由Dunnett檢定而相對於控制組為p＜0.05，◎表示藉由Student的t檢定而相對於控制組為p＜0.01。
圖26係顯示由實施例16所得之源自牙髓的細胞及由比較例1所得之源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)之關於在LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式中之嗜中性球往肺的浸潤之效果比較的結果之圖表。縱軸表示肺泡清洗液中的總細胞數(×104
個/mL)。針對源自牙髓的細胞(黑柱)及hMSC-BM(陰影柱)，各別由左依序表示在投予細胞數1.5×103
個、1.5×104
個的結果，斜線柱(左端)表示在非病態小鼠的結果，白柱表示在已投予介質之LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝5～6)。＊表示藉由Dunnett檢定而相對於非病態小鼠的結果為p＜0.001，★表示藉由Dunnett檢定而相對於在已投予介質的LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式的結果為p＜0.05，◎表示藉由Dunnett檢定而相對於在已投予介質的LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式的結果為p＜0.0001，▽▽表示藉由Dunnett檢定而相對於在已投予介質的LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式的結果為無意義。
圖27係顯示由實施例16所得之源自牙髓的細胞及由比較例1所得之源自人類骨髓的間葉系幹細胞(hMSC-BM)之關於在LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式中之在肺的VCAM(Vascular cell adhesion molecule，血管細胞黏附分子)-1蛋白質表現之效果比較的結果之圖表。縱軸表示VCAM-1蛋白表現量。黑柱表示在已投予源自牙髓的細胞之LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式的結果，陰影柱表示在已投予hMSC-BM之LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式的結果，斜線柱表示非病態小鼠的結果，白柱表示在已投予介質的LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝5～6)。＊表示藉由Student的t檢定而相對於在已投予介質的LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式的結果，在已投予源自牙髓的細胞之LPS誘導性急性肺損傷小鼠模式的結果為p＜0.05。
圖28係顯示由實施例16所得之源自牙髓的細胞在大鼠腦梗塞模式中之神經功能的回復評價(旋轉桿測試)的結果之圖表。縱軸表示桿上的滯留時間(秒鐘)，橫軸表示從病態引起起的日數(日)。黑點表示在已投予源自牙髓的細胞之大鼠腦梗塞模式的結果，白點表示在已投予介質之大鼠腦梗塞模式的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝10)。＊表示藉由Student的t檢定而相對於在已投予介質之大鼠腦梗塞模式的結果為p＜0.05。
圖29係顯示藉由使用抗血管生成素-1抗體的免疫染色，比較由實施例16所得之源自牙髓的細胞在大鼠腦梗塞模式的腦組織中之血管生成素-1的存在量的結果之圖。針對已投予介質之大鼠腦梗塞模式及已投予源自牙髓的細胞之大鼠腦梗塞模式，各別表示腦組織整體的染色影像及放大梗塞區域(infarct area)周邊的染色影像。經染色之細胞表示血管生成素-1(Ang-1)陽性細胞。
圖30係顯示藉由使用抗髓過氧化酶(MPO)抗體的免疫染色，探討由實施例16所得之源自牙髓的細胞在大鼠腦梗塞模式中之對於嗜中性球往腦梗塞周邊部位的浸潤的效果之圖。針對已投予介質的大鼠腦梗塞模式及已投予源自牙髓的細胞之大鼠腦梗塞模式的各自的代表例，表示放大梗塞區域周邊的染色影像。經染色之細胞表示MPO陽性細胞。
圖31係顯示藉由使用抗髓過氧化酶(MPO)抗體的免疫染色，將顯示為陽性的細胞數進行定量化，比較由實施例16所得之源自牙髓的細胞在大鼠腦梗塞模式之對於嗜中性球往腦梗塞周邊部位的浸潤的效果之圖表。縱軸表示每一視野的陽性細胞數(個)。黑柱表示在已投予源自牙髓的細胞之大鼠腦梗塞模式的結果，白柱表示在已投予介質的大鼠腦梗塞模式的結果。值為平均值，誤差槓表示標準誤差(n＝6～7)。＊＊表示藉由Student的t檢定而相對於在已投予介質之大鼠腦梗塞模式的結果為p＜0.01。
無。
Claims (53)
- 一種抑制嗜中性球、單核球、淋巴球之至少任一者向組織的浸潤用之醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成。
- 如請求項1之醫藥組成物，其抑制黏附因子(adhesion factor)的表現。
- 如請求項2之醫藥組成物，其中該黏附因子表現於該組織中的血管內皮細胞的表面。
- 如請求項2或3之醫藥組成物，其中該黏附因子為VCAM-1。
- 如請求項2至4中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞提高抑制黏附因子的表現之因子在該組織中之濃度。
- 如請求項5之醫藥組成物，其中該因子包含血管生成素-1(Angiopoietin-1)。
- 如請求項1至6中任一項之醫藥組成物，其抑制該組織中之血管穿透性的亢進。
- 如請求項1至7中任一項之醫藥組成物，其係伴隨發炎之疾病的治療及/或預防用。
- 如請求項8之醫藥組成物，其中該伴隨發炎之疾病係選自包含腦梗塞、腦出血、包含黃斑點退化之視網膜病變、急性肺損傷、慢性的發炎性肺疾病、氣喘、急性胰臟炎、心肌梗塞、心臟衰竭、皮膚炎、及敗血症之群組。
- 如請求項9之醫藥組成物，其中該伴隨發炎之疾病為急性肺損傷，該急性肺損傷係選自包含吸入性肺炎、細菌性肺炎、病毒性肺炎、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、及間質性肺炎(interstitial pneumonitis)之群組者。
- 如請求項10之醫藥組成物，其中該急性肺損傷為病毒性肺炎，該病毒性肺炎的原因係感染冠狀病毒、流行性感冒病毒、或RS病毒。
- 如請求項11之醫藥組成物，其中該病毒性肺炎的原因係感染冠狀病毒，該冠狀病毒為SARS-CoV、MARS-CoV、或SARS-CoV-2。
- 如請求項9之醫藥組成物，其中該伴隨發炎之疾病為慢性的發炎性肺疾病，該慢性的發炎性肺疾病係選自包含囊腫纖化症(CF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺發育不全症、慢性肺疾病、及病因不明性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)之群組者。
- 如請求項1至7中任一項之醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成，且係SARS-CoV、MARS-CoV、或SARS-CoV-2感染症的治療用。
- 如請求項1至14中任一項之醫藥組成物，其被投予至人類。
- 如請求項1至15中任一項之醫藥組成物，其中源自牙髓的幹細胞係源自人類。
- 如請求項1至16中任一項之醫藥組成物，其係利用由選自包含靜脈內投予、動脈內投予、門靜脈內投予、皮內投予、皮下投予、肌肉內投予、腦室內投予、心內膜內投予、氣管內投予、眼內投予、耳腔內投予、鼻腔內投予、及關節內投予之群組的方法之投予用。
- 如請求項1至17中任一項之醫藥組成物，其被單次或重複投予。
- 如請求項1至18中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞具有以下的(1)～(4)的至少一個所示之特徵： (1)CD73、CD90、CD105、及CD166為陽性，且CD34、CD40、CD45、CD80、CD86、及第二類MHC抗原為陰性，被干擾素γ刺激時第二類MHC抗原成為陽性，表現前列腺素E2 及/或血管內皮增殖因子，在為前列腺素E2 的情況下，被TNFα刺激時表現量增加； (2)CD73、CD90、CD105、及CD166的至少一個為陽性，且CD34及CD45為陰性； (3)CD47、CD81、及CD147的至少一個為陽性，CD19、CD34、及CD206的至少一個為陰性； (4)CD47、CD81、及CD147的至少一個為陽性，CD19、CD31、CD33、CD34、CD38、CD45、CD206、CD235a、及SSEA-1的至少一個為陰性。
- 如請求項1至19中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞具有分化成骨細胞及軟骨細胞的能力。
- 如請求項1至20中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞在使細胞懸浮於培養基中的狀態下，其平均直徑為16～20μm。
- 如請求項1至21中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞在活體外的環境下具有3次以上的細胞分裂能力，且平均倍化時間為96小時以內。
- 如請求項1至21中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞具有以下的特徵： 在活體外的環境下，經過10次以上、15次以上、16次以上、或17次以上的細胞分裂，且其細胞分裂的平均時間為48小時以內； 在活體外的環境下，具有進行10次以上、14次以上、或15次以上的細胞分裂的能力，且其細胞分裂的平均時間為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內。
- 如請求項1至21中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞具有以下的特徵： 在活體外的環境下，經過16次以上、21次以上、22次以上、或23次以上的細胞分裂； 在活體外的環境下，具有進行3次以上、4次以上、或5次以上的細胞分裂的能力，且其細胞分裂的平均時間為96小時以內、84小時以內、72小時以內、48小時以內、或36小時以內。
- 如請求項1至24中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係CD19、CD26、CD106、CD117、及CD271的至少一個為陰性者。
- 如請求項1至25中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係CD140b及HLA-A、B、C的至少一個為陽性者。
- 如請求項1至26中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係CD56及CD146的至少一個為陰性者。
- 如請求項1至27中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係CD49e及CD95的至少一個為陽性者。
- 如請求項1至28中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係CD10、CD46、CD47、CD55、CD58、及CD59的至少一個為陽性者。
- 如請求項1至29中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現MMP-2、IGFBP-4、胱抑素C(cystatin C)、IL-6、IL-11、MCP-1、IL-8、HGF、VEGF、TIMP-1、TIMP-2、及TIMP-3的至少一個。
- 如請求項1至30中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現GROα、VCAM-I、及IP-10的至少一個。
- 如請求項1至31中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現IL-6，且其表現量係藉由TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加。
- 如請求項1至32中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現IL-11，且其表現量係藉由TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加。
- 如請求項1至33中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現IP-10，且其表現量係藉由TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加。
- 如請求項1至34中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現MCP-1，且其表現量係藉由TNF-α刺激、及干擾素γ刺激而增加。
- 如請求項1至35中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係藉由TNF-α刺激而誘導GM-CSF的表現者。
- 如請求項1至36中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現HGF，且其表現量係藉由TNF-α刺激而減少，及藉由干擾素γ刺激而增加。
- 如請求項1至37中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現IL-8，且其表現量係藉由TNF-α刺激而增加。
- 如請求項1至38中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞表現G-CSF，且其表現量係藉由TNF-α刺激而增加。
- 如請求項1至39中任一項之醫藥組成物，其中以同一條件分別培養該源自牙髓的幹細胞及源自人類骨髓的間葉系幹細胞時，相較於該源自人類骨髓的間葉系幹細胞所產生之血管生成素-1的量，該源自牙髓的幹細胞所產生之血管生成素-1的量為3倍以上。
- 如請求項1至40中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係藉由TNF-α刺激而誘導G-CSF的表現者。
- 如請求項1至41中任一項之醫藥組成物，其中該源自牙髓的幹細胞係該牙髓獲自人類的永久齒或乳齒者。
- 如請求項1至42中任一項之醫藥組成物，其係在包含鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、碳酸氫離子、檸檬酸離子、人類血清白蛋白、及二甲亞碸的溶液中，以懸浮狀態包含該源自牙髓的幹細胞者。
- 如請求項1至42中任一項之醫藥組成物，其係在含有人類血清白蛋白與二甲亞碸之重碳酸林格氏液中，以懸浮狀態包含該源自牙髓的幹細胞者。
- 如請求項43之醫藥組成物，其係分別以91～113mM的濃度包含鈉離子、以2.52～3.08mM的濃度包含鉀離子、以0.95～1.16mM的濃度包含鈣離子、以0.315～0.385mM的濃度包含鎂離子、以15.6～19.2mM的濃度包含碳酸氫離子、以1.04～1.28mM的濃度包含檸檬酸離子、以46～56g/L的濃度包含人類血清白蛋白、及以9～11%(v/v)的濃度包含二甲亞碸者。
- 如請求項43至45中任一項之醫藥組成物，其係更包含乙醯基色胺酸或其鹽及辛酸或其鹽者。
- 如請求項43至46中任一項之醫藥組成物，其係以5×106 ～8×107 個/mL的密度包含該源自牙髓的幹細胞者。
- 如請求項43至47中任一項之醫藥組成物，其以1～20mL的量被封入容器。
- 如請求項48之醫藥組成物，其中該容器為玻璃或塑膠製。
- 如請求項43至49中任一項之醫藥組成物，其為冷凍狀態。
- 一種醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成，且提高組織中之血管生成素-1的濃度。
- 一種醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成，且抑制組織中之黏附因子的表現。
- 一種醫藥組成物，其係包含源自牙髓的幹細胞作為有效成分而成，且用於治療或預防伴隨發炎之疾病。
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