ITNA20060017A1 - Tecnica di prelievo e selezione di un una popolazione di cellule staminali di tipo embrionale da tessuti follicolari peridentari di uomo adulto. - Google Patents

Tecnica di prelievo e selezione di un una popolazione di cellule staminali di tipo embrionale da tessuti follicolari peridentari di uomo adulto. Download PDF

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Description

DESCRIZIONE
Stato dell’arte
La possibilità di isolare cellule staminali da tessuti umani è oggi dibattuta e controversa. La definizione stessa di cellula staminale, cioè di una cellula capace di autorinnovamento o “self-renewing” e di differenziarsi verso tutti i citotipi presenti nell’organismo da cui è stata prelevata, non è compatibile con le caratteristiche antigenico-fimzionali delle cellule staminali adulte, che fino ad ora era possibile reperire in organismi umani dopo la nascita. Dal punto di vista dell’ autorinnovamento o “selfrenewing”, infatti, le staminali adulte fino ad oggi isolate, non hanno capacità proliferative illimitate e, per quanto riguarda le potenzialità differenziative, difficilmente si va oltre la multipotenza (che consiste nella capacità di differenziarsi in più citotipi aventi derivazione dallo stesso foglietto germinativo) o pluripotenza (che consiste nella capacità di differenziarsi verso più citotipi aventi origine da diversi foglietti germinativi), senza mai raggiungere la totipotenza (che è la capacità da parte delle cellule staminali di differenziarsi verso ogni tipo cellulare), una caratteristica quest’ultima che è propria della cellula staminale per antonomasia, lo zigote, ed in generale delle cellule della blastocisti, protagoniste delle primissime fasi di sviluppo dell’ organismo umano. La possibilità, però, di utilizzare cellule prelevate da un embrione per fini terapeutici e di ricerca si scontra spesso con difficoltà di ordine tecni .co, etico e legale. La possibilità, pertanto, di isolare dalluomo adulto citotipi in uno stadio indifferenziato, rappresenterebbe non solo un interessante modello di studio sul differenziamento cellulare e sulle problematiche oncologiche relazionate, ma anche una importante potenzialità terapeutica per la cura di patologie degenerative tissutali, caratterizzate da un deficit quantitativo e/o qualitativo cellulare.
Le cellule staminali sono tipi cellulari caratterizzati da: 1) capacità di andare incontro a un numero teoricamente infinito di divisioni cellulari o auto-rinnovamento; 2) potenzialità differenziativa verso linee cellulari diverse.
Rispetto alla prior art, rappresentata dal brevetto W003066840 “Cellule staminali pluripotenti derivate da denti e loro uso”, comprendente, fra le altre, citotipi a derivazione follicolare, la presente invenzione è innovativa ed inventiva perché sono differenti: 1) la formula antigenica e la metodica di selezione delle cellule sono diverse. Mentre, infatti, nel brevetto WO03 066840 non viene espletata una vera e propria selezione, in quanto le cellule vengono semplicemente ed insufficientemente testate per valutarne l’eventuale staminalità, il presente brevetto rivendica una metodica che prevede la selezione citofluorimetrica di cellule staminali embrionali, mediante il reperimento di antigeni presenti esclusivamente su citotipi embrionali, quali SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81, CD133 CD90, flk-1. In tal modo si ottiene una popolazione omogenea di cellule di tipo esclusivamente embrionale; 2) le metodiche di coltura, proliferazione e differenziamento cellulare sono sostanzialmente differenti, infatti mentre il brevetto WO03 066840 descrive tecniche che portano ad ottenere un pool cellulare che contiene solo in piccola parte elementi staminali di tipo adulto, laddove il presente brevetto rivendica metodiche di coltura, proliferazione e differenziamento cellulare che portano ad una popolazione omogenea di cellule staminali di tipo embrionale, proprio grazie al tipo di selezione effettuato.
Sommario dell invenzione
L’invenzione descrive: 1) la metodica di isolamento da sacco follicolare di un nuovo stipite di cellule staminali di origine mesenchimale non ematopoietica, denominate FENC (Follicle-derived Embryonic Neural Crest stem cells), otenute per selezione al citofluorimetro con FAC sorter (citofluorimetro con selezione di cellule), dopo adeguata marcatura mediante anticorpi specifici; 2) il mantenimento in coltura e la proliferazione delle stesse; 3) la capacità di differenziamento in tessuti provenienti da tuti e tre i foglieti embrionali, che configura le FENC come una popolazione cellulare totipotente/multipotente 4) la conservazione delle cellule FENC in condizioni di elevata vitalità cellulare; 5) la creazione di una banca di cellule staminali embrionali prelevate dall’adulto; 6) una nuova metodologia per la terapia cellulare e/o genica di malatie ritenute inguaribili al giorno d’oggi, basata sull’impiego di FENC; 7) l’impiego terapeutico di tipi cellulari e tessuti otenuti per differenziazione di cellule FENC.
Descrizione dettagliata dell’invenzione
Il presente breveto rivendica la possibilità di otenere un nuovo citotipo di cellule staminali con caratteristiche embrionali prelevate dall’adulto, in particolare una nuova metodologia per l’isolamento di queste cellule, basata sul prelievo delle stesse da sacco follicolare.
Il follicolo dentario, inteso come il complesso di tessuti che avvolgono l’elemento dentario in via di formazione prima della sua eruzione, rappresenta una fonte privilegiata di elementi cellulari indifferenziati per due motivi:
1 ) ciascun elemento dentario, sia esso appartenente alla serie decidua o a quella permanente, rappresenta un organo incompiuto al momento della nascita dell’individuo. Questo fa sì che nella sua sede di sviluppo si trovino elementi ancora indifferenziati che, dopo proliferazione, tenderanno a differenziare negli elementi cellulari odontogenici. Tuttavia la comune origine embrionale di questi progenitori, le creste neurali, cui corrisponde una sostanziale diversità differenziativa terminale, spiega la loro immaturità. Anche al termine dell’ odontogenesi, detti elementi indifferenziati rimangono in loco fino all’eruzione, all’interno del follicolo, perché saranno i futuri costituenti del parodonto, l’apparato di; supporto del dente nella sua sede anatomica, e degli apici radicolari, che si sviluppano dopo l’eruzione del dente in cavità orale. E’, infatti, oggi accertata la presenza di cellule staminali adulte all’ interno del legamento parodontale (Gronthos, Lancet 2004), come della polpa dentaria (Gronthos, PNAS 2000; Miura, PNAS 2003; Laino, JBMR 2005);
2) il follicolo dentario rappresenta una nicchia biologica facilmente accessibile da un punto di vista chirurgico, caratterizzata da un altissimo rapporto fra cellule staminali indifferenziate isolabili e massa di tessuto prelevato. Il sacrificio di tessuto nobile ai fini del prelievo di dette cellule è, infatti, minimizzato, in quanto l’avulsione del dente del giudizio in disodontiasi, evenienza estremamente frequente, rappresenta di per sé un’indicazione al prelievo dell’elemento con i corrispondenti tessuti peridentari. Anche nel caso in cui si rendesse necessaria una germectomìa precoce dell’elemento del giudizio, il sacrifìcio tissutale è accettabile, comportando complicanze anatomico-funzionali irrilevanti Le cellule staminali con “caratteristiche embrionali” ottenute da questo tipo di reperti biologici possono essere conservate per fini sperimentali o per impieghi in terapie cellulari e tissutali autologhe.
Tali cellule derivano dal neuro-ectoderma e presentano pertanto caratteristiche di tale foglietto primitivo ed, in aggiunta, poiché vanno a rinforzare il mesenchima del distretto cervico-facciale, presentano le potenzialità differenziative anche di questo foglietto primitivo.
Nel dettaglio il brevetto rivendica una nuova metodica per: 1) l’isolamento di cellule staminali da sacco follicolare, denominate FENC; 2) la loro amplificazione numerica (formazione di cloni); 3) il loro differenziamento in tessuti provenienti da tutti e tre i foglietti embrionali, cosa che configura le FENC come una popolazione cellulare totipotente/multipotente 4) la conservazione delle cellule FENC in condizioni di elevata vitalità cellulare; 5) la creazione di una banca di cellule staminali embrionali prelevate dall’adulto; 6) lo sviluppo di terapie cellulari e/o geniche basata sull’impiego di FENC per il trattamento di malattie ritenute oggi inguaribili; 7) l’impiego terapeutico di tipi cellulari e tessuti ottenuti per differenziazione di cellule FENC. La metodica rivendicata è innovativa rispetto alla prior art in quanto dimostra, per la prima volta, l’isolamento di una popolazione cellulare omogenea di cellule staminali, con caratteristiche embrionali, da un organismo adulto. La strategia proposta presenta i seguenti vantaggi: 1) intervento poco invasivo e praticabile in anestesia locale e regime ambulatoriale; 2) una maggiore sicurezza, in quanto l’intervento viene effettuato a cielo aperto rispetto al puntato sternale o al prelievo dalla cresta iliaca; 3) l’ottenimento in coltura primaria di un numero elevato di colonie, in quanto il prelievo non è contaminato da molte cellule ematopoietiche; 4) isolamento di cellule da adulto, ma con caratteristiche antigeniche, morfologiche e funzionali di tipo embrionale.
Ottenimento di cellule FENC - Le cellule staminali isolate dal sacco follicolare derivano direttamente dalle cellule mesenchimali, originate dalle creste neurali che migrano durante l’organogenesi. A questa origine va ascritta la loro notevole capacità plastica. Per isolare cellule staminali dal sacco follicolare, lo stesso deve essere sano, ossia non deve presentare comunicazioni di qualsiasi tipo con l’esterno. Il paziente, a partire dalla settimana che precede il prelievo è sottoposto ad una seduta di igiene professionale e durante la settimana precedente il prelievo deve effettuare 2 sciacqui/die, adoperando un colluttorio .
Per quanto riguarda il prelievo del sacco follicolare, si procede, dopo anestesia locale, al disegno del lembo con bisturi, all’apertura di una breccia ossea che permette di raggiungere l’elemento dentario, incluso o non erotto, avvolto dal sacco follicolare. Una volta prelevato in condizioni di buona sterilità, si immette il reperto nella soluzione digestiva per 1 ora a 37°C, con una lieve agitazione per facilitare la dissociazione del tessuto. Al termine della prima ora la soluzione digestiva viene filtrata per allontanare particelle di materiale extracellulare e cellule, o aggregati, di grosse dimensioni. Quindi il processo digestivo viene bloccato e le cellule messe in coltura (in mezzo Mega Cell della SIGMA-Milano, Italy). In alternativa si utilizza il mezzo di coltura proprio delle staminali embrionali (ES). Le osservazioni al microscopio evidenziano che, dal primo giorno di coltura, si ha un discreto numero di cellule aderenti al fondo della flask che, successivamente, danno luogo a veri e propri cloni. Dopo circa 5 giorni in una flask da 75mL si contano fino a circa 60 cloni.
Verso il 9°-10° giorno, dopo aver asportato il mezzo di coltura si effettua un FACsorting, prelevando i cloni cellulari positivi per i markers di staminalità.
Le FENC così isolate, differenziano, spontaneamente o dopo stimolazione, in vari citotipi. Se si vuole ottenere la proliferazione senza il loro differenziamento, questo può essere inibito aggiungendo al mezzo di coltura βFGF.
Una volta ottenuto un numero adeguato di cellule, si procedere al loro ongelamento ed allo stoccaggio in azoto liquido o a -80°C.
Tutti i tipi cellulari verso cui le FENC si differenziano, non solo possono costituire ciascuno di essi una terapia di tipo cellulare, ma possono essere utilizzati al fine di costituire i vari tessuti di cui ciascun citotipo fa parte. Pertanto numerose malattie potranno essere curate mediante l’uso di tali cellule o di quelle da esse differenziatesi.
In sintesi il procedimento per ottenere le FENC può essere così sintetizzato:
1) prelievo del sacco follicolare in maniera sterile, digestione e messa in coltura;
2) tripsinizzazione ed amplificazione delle colture primarie, ove necessario;
3) FACsorting e ripresa delle colture;
4) amplificazione, congelamento e/o differenziamento cellulare;
5) ulteriore analisi citofluorimetrica;
6) eventuale mantenimento in stato indifferenziato;
7) produzione di tessuti dalle cellule differenziate.
Prove di cancerogenicità - Al fine di assicurare che le cellule follicolari e quelle da esse differenziate non avessero caratteri di cancerogenicità, le stesse sono state iniettate in topi nudi, dopo essere state infettate con lentivirus di terza generazione (genoma suddiviso in 4 costrutti diversi per la transfezione) (Invitrogen, Milano, Italia), includendo nel vettore il cDNA della GFP (green fluorescence protein).
Dopo trapianto gli animali sono stati seguiti per 30 giorni e quindi sacrificati. Osservazioni istologiche sia sul sito di impianto che a livello dei principali organi hanno evidenziato che nessun tipo di tumore maligno si era sviluppato.
In aggiunta, le cellule sono state selezionate al citofluorimetro per i principali markers tumorali e ne è stato osservato il ciclo cellulare: le cellule sono risultate essere tutte euploidi e senza alcuna espressione di cancerogenicità.
Senza intenti limitativi, qui di seguito si riportano alcuni esempi che meglio descrivono il campo di applicazione dell’invenzione.
Esempio 1. Isolamento delle cellule e messa in coltura
Ciascun paziente sano, a partire dalla settimana che precede il prelievo è sottoposto ad una seduta di igiene professionale e durante la settimana precedente il prelievo deve effettuare 2 sciacqui/die, adoperando un collutorio contenente clorexidina allo 0.12% p/v. Per quanto riguarda il prelievo del sacco follicolare, si procede, dopo anestesia locale, al disegno del lembo con bisturi, all’apertura di una breccia ossea che permette di raggiungere l’elemento dentario, incluso o non erotto, avvolto dal sacco follicolare. Una volta prelevato in condizioni di buona sterilità, con cucchiaio alveolare o curette, si immette il reperto nella soluzione digestiva. La soluzione di digestione è costituita da una soluzione in PBS (tampone fosfato pH 7,4 1M) contenente 3mg/mL di collagenasi di tipo I, 4 mg/mL di Dispasi, lOOU/mL di penicillina, 100 Mg/mL di streptomicina e 500 Mg/mL di claritromicina. Il volume della soluzione impiegato dipende dal volume del sacco follicolare prelevato, in genere il volume della soluzione di digestione può variare tra 8 e 15 mL. Il sacco follicolare immerso nella soluzione è mantenuto per 1 ora a 37°C, con una lieve agitazione per facilitare la dissociazione del tessuto. Al termine della prima ora la soluzione digestiva viene filtrata con Falcon® strainer da 70μm per allontanare frammenti di materiale extracellulare e cellule, o aggregati, di grosse dimensioni. Se residua molto materiale di prelievo, lo stesso viene reinmesso in nuova soluzione digestiva per circa 30 minuti. Successivamente, con la stessa metodica descritta in precedenza, la soluzione viene filtrata ed aggiunta a quella ottenuta precedentemente. Per bloccare il processo digestivo, viene aggiunto un volume di mezzo di coltura, pari a 10 volte il volume totale della soluzione digestiva, centrifugando per 10 minuti a 1000-1200 giri/min (140xg). Il mezzo di coltura è così composto: terreno di coltura tipo Mega Celi (SIGMA, Milano, Italy), addizionato di siero fetale bovino al 10% p/v, acido 2P-ascorbico 100μΜ, L-glutamina 2mM, penicillina lOOU/mL, streptomicina 100μg/mL. Al termine della centrifugazione sono prelevati dal fondo della provetta, dove è sedimentato il materiale cellulare, circa 25mL della sospensione. Il filtrato contenente le cellule è, quindi, posto all’ interno di una flask da 50mL che viene messa in incubatore a 37°C e 5% C02, effettuando cambi del mezzo di coltura due volte per settimana. Le osservazioni microscopiche evidenziano che dal primo giorno di coltura si ha un discreto numero di cellule aderenti al fondo della flask che, successivamente, danno luogo a veri e propri cloni.
Esempio 2. Crescita e caratterizzazione
Dopo circa 5 giorni di coltura nel mezzo descritto nell’esempio 1 ovvero in mezzo di coltura per cellule staminali Embrionali (ES medium della Invitrogen, Milano, Italia) in flasks da 75mL si contano fino a circa 60 cloni.
Verso il 9°-10° giorno, dopo aver asportato il mezzo di coltura ed aver effettuato due lavaggi con PBS sterile, si procede a staccare le cellule dal fondo di ciascuna flask, adoperando 4mL di EDTA 0,02%, disciolto in PBS Mg/Ca ffee, per 10 minuti a 37°C e si effettua un FACsorting, prelevando i cloni cellulari positivi per i markers di staminalità. Le cellule vengono pellettate (10 minuti a 140 x g), lavate in BSA 0.01% in PBS a 4°C ed infine incubate per 30 min a 4°C per la tipizzazione anticorpale con una soluzione contenente 10μL di soluzione assoluta di anticorpo. Dopo l’incubazione le cellule sono lavate una volta con lmL di BSA 0.1% in PBS, per allontanare gli anticorpi che non hanno reagito o lo hanno fatto in maniera aspecifica, ed analizzate per la positività ai seguenti anticorpi: SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81, CD133, CD90, flk-1 (Santa Cruz, CA, USA). Le cellule mediamente sono positive per SSEA-4 in una percentuale del 70% e dell’ 80% circa per TRA 1-60 e TRA 1-81 . In particolare le SSEA-4 sono positive sia per TRA 1-60 che per TRA 1-8 1 SSEA-4, TRA 1-60 e TRA 1-81 sono molecole di superficie presenti solo su cellule indifferenziate, ovvero presenti solo su Embryonic Stem Cell (ES totipotenti) ed Embryonic Germ Cells (EG pluripotenti). Ciò chiaramente fa dedurre che queste cellule sono indifferenziate e con caratteri embrionali. Dopo aver sortato cellule con la precedente formula antigenica, una piccola quota viene analizzata per 3 fattori di trascrizio: Nanog, OCT-4 e Rex1 , presenti solo in cellule embrionali indifferenzi che, in associazione con i tre antigeni precedentemente menziona ti chiaramente indicano e confermano che si tratta di cellule staminali embrionali (ES) (ZHANG Nature 2003). In particolare, OCT-4 viene valutato con analisi citofluorimetrica utilizzando un anticorpo intracellulare (Santa Cruz). Le cellule vengono pre-trattate con tecniche di fissazione e di saponificazione, in modo da fare entrare all’ interno Γ anticorpo marcato. La positività per OCT-4 è al 100% in tutte le cellule sortate. Per la valutazione di Nanog e Rex1, dopo aver ottenuto un numero cospicuo di cellule, si procede all’isolamento dell’RNA ed al processamento dello stesso mediante analisi RT-PCR. Anche in questo caso, l’RNA prelevato da cellule sortate ha dato buon esito mostrando una costante positività per ambedue i fattori di trascrizione.
Esempio 3. Differenziazione di tipo a (osso, muscolo liscio e cartilagine)
Le FENC, isolate e caratterizzate come riportato negli esempi 1 e 2, possono differenziarsi, spontaneamente o dopo stimolazione, o in o alternativa proliferare inibendo il differenziamento, mediante aggiunta al mezzo di coltura di PFGF in concentrazione pari ad 8ng/mL.
Per il differenziamento osteogenico basta far proliferare le cellule con mezzo di coltura costituito da α-MEM, addizionato di siero fetale bovino al 20% p/v, acido 2P-ascorbico 100μΜ, L-glutamina 2mM, penicillina lOOU/mL, streptomicina 100μg/mL. Le cellule differenziano in osteoblasti in circa 25 giorni, formando tessuto osteoide ed osso di tipo fibroso (con positività per gli anticorpi anti-collageno di tipo I e III, osteocalcina, osteonectina, BAP).
Per il differenziamento in cellule del tessuto muscolare liscio basta coltivare le cellule FENC con Mega Celi (SIGMA) al 2% FBS p/v, acido 2P-ascorbico 100μΜ, L-glutamina 2mM, penicillina 100U/mL, streptomicina 100μg/mL addizionato di 10ng/ml ΤϋΕβ. In queste condizioni le cellule differenziano in circa 4-5 giorni in un tipo cellulare che presenta positività per Γ anticorpo anti-SMA, indice della differenziazione nelle cellule del tessuto muscolare liscio.
Per il differenziamento in cellule della cartilagine le cellule FENC sono cresciute in mezzo a-MEM, addizionato di siero fetale bovino al 20% p/v, acido 2P-ascorbico 100μΜ[, L-glutamina 2mM, penicillina 100U/mL, streptomicina 100μg/mL riducendo la tensione di ossigeno (p02< 40 mmHg ) e poste in coltura in incubatore al 5% di C02. La formazione di cartilagine, grazie alla concentrazione delle cellule (500.000 in 15 mL) si realizza in circa 30 giorni ed è verificata grazie alla positività per l’anticorpo direto contro il collageno di tipo II, che è presente nella cartilagine umana
Esempio 4. Differenziazione di tipo b (neuroni e glia)
Le cellule follicolari possono differenziare sia spontaneamente sia adoperando il terreno Neurobasal A (Invitrogen, Milano), addizionato con la proteina B27 (Invitrogen, Milano). La coltura va protrata in questo modo per 5-7 giorni. Con ambedue le modalità si otiene il differenziamento con formazione di un cospicuo numero di neuroni e glia utilizzabili per una terapia di tipo cellulare. Una successiva selezione citofluorimetrica con un anticorpo anti-GFAP può essere effetuata al fine di selezionare e separare i due citotipi. Le cellule differenziate difati sono di tipo gliale se positive per Fanti corpo direto contro la GFAP, sono neuroni del sistema nervoso centrale se positive per gli anticorpi anti-TuJ1, neurofilament, Brn3A (fatore di trascrizione), neuroni di tipo periferico se positivi per gli anticorpi anti-peripherin e p75.
Esempio 5. Differenziazione di tipo c (muscolo striato, adipociti)
Il differenziamento delle cellule FENC in muscolo striato può essere otenuto mediante cocultura con miotubi murini C2C12. La cocultura è effettuata nella percentuale di 1:1 0, secondo metodiche già da noi utilizzate (Laino et al., 2006) ed adoperate da numerosi gruppi di ricerca, in un mezzo di coltura così composto: Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Invitrogen), con 4 mM L-glutamina, 1.5 g/L di bicarbonato di sodio, 4.5 g/L di glucosio e 1.0 mM piruvato di sodio con l’aggiunta del 10% di FBS, per una settimana. Dopo cocultura si valuta la percentuale di cellule FENC che si sono fuse con i miotubi murini, mediante l’uso di anticorpi antilamìna nucleare umana. In genere una percentuale di fusione pari a circa il 15-20% è da considerarsi di buon livello. A questo punto miotubi fusi possono essere adoperati per il trapianto in parti deficitarie di muscolo o in soggetti malati per distrofie muscolari.
Il differenziamento in adipociti è realizzato mediante aggiunta di desametazone 10<-8>M, per 30 giorni, nel mezzo di coltura così costituito: a-MEM, addizionato di siero fetale bovino al 20% p/v, acido 2P-ascorbico 100μΜ, L-glutamina 2mM, penicillina 100U/mL, streptomicina 100μg/mL. Al termine del periodo numerosi adipociti sono osservabili. Gli stessi sono colorabili sia con Sudan black che, a fresco o dopo congelamento, con Oil red-0 che evidenzia la presenza di gocciole lipidiche nel citoplasma. A questo punto le cellule adipocitarie così ottenute possono essere adoperate in siti ove occorrano, per “riempimento” in chirurgia plastica.
Esempio 6. Ingegnerizzazione ed applicazione clinica
Le FENC, una volta differenziate possono essere adoperate per la ricostruzione tissutale anche a mezzo di colture rotanti in apparato tipo Roller. Ad esempio le cellule differenziate in osteoblasti sono piastrate su scaffold precostituiti di acido lattico co-glicolico 85:15, riassorbibile in 15 giorni dopo trapianto. Le colture rotanti (1 giro/5sec.) sono protratte in incubatore a C02al 5% per 30 giorni. Una volta raggiunto lo spessore di circa lem si valuta, grazie a tecniche istologiche, di immunolocalizzazione e di microscopia a scansione sia la morfologia che l’organizzazione e la strutturazione tridimensionale del tessuto siano normali.
Il tessuto osseo così formato è utilizzato per la rigenerazione di grossi difetti ossei di interesse oro-maxillo-facciale e ortopedico che difficilmente sarebbero guaribili con le convenzionali tecniche rigenerative. Intercettato il difetto osseo da trattare si effettuano tutti i rilevamenti del caso come T.C., radiografie, impronte in gesso in modo da avere la maggiore quantità di dati per poter impostare l’iter terapeutico. Una volta ottenute le cellule staminali del paziente, si modella uno scaffold della forma del difetto da trattare. Lo scaffold può essere, a seconda del difetto, riassorbibile o meno. A secondo del tipo di scaffold da utilizzare si effettuerà una modellazione diversa ovvero si potrà modellare lo scaffold con tecniche cad-cam, con tecniche di pressofusione, tramite frenaggio, tramite stampaggio e così via. Ottenuto lo scaffold della forma prestabilita si effettua una coltura tridimensionale di cellule sullo stesso tramite apparato rotante (roller apparatus). Dopo circa 20-30 giorni, il complesso scaffold-cellule staminali è pronto per essere impiantato nella sede del difetto.
L’innesto viene eseguito secondo le normali tecniche chirurgiche per gli innesti ossei. Si effettua anestesia, locale o totale, a secondo dei casi. Si procede alla preparazione del sito ricevente aprendo un lembo con bisturi che permetta l’acceso diretto sul difetto. Una volta raggiunto il sito di innesto si procede a preparare il letto chirurgico osseo del paziente con frese da osso montato su micromotore chirurgico. La preparazione nel produrre un copioso sanguinament del sito ricevente e nel ridurre gli strati della corticale del sito accettore. In questo modo si agevola l’integrazione del complesso scaffold-cellule con il tessuto ospite. Si procede a questo punto all’ inserimento dell’innesto che verrà fissato, sul letto ricevente, con strutture riassorbibili come viti e suture in acido polilattico-glicolico. Si procederà alla sutura del lembo ed alla gestione della ferita chirurgica.
In circa 40-60 giorni, a seconda della grandezza dell’innesto, si avrà la perfetta integrazione dello stesso.
La riparazione tessutale da difetto tissutale è oggi molto richiesta e può venire effettuata in modo autologo grazie alle metodiche descritte e mediante il reimpianto di osteoblasti o di tessuto osseo formato in vitro.
GLOSSARIO
Mega cell = terreno di coltura per cellule venduto in Italia dalla Sigma-Aldrich, Milano
ES = Terreno di coltura per cellule venduto in Italia dalla Invitrogen Milano
βFGF = beta fibroblast growth factor
α-MEM = alfa Medium Essential Medium. Mezzo di coltura per cellule venduto in Italia dalla Invitrogen
anti-GFAP = anticorpo diretto contro la proteina gliale fibrillare acida
FBS = Foetal Bovine Serum
GFAP = Glial Fibrillar Acid Protein
SMA = Smooth Actin
TGFβ = Tumor Growth Factor β
BAP = Bona Alkaline Phosphatase
βFGF = Fibroblasts Growth Factor β
RT-PCR = Reverse Transcripate Polimerase Chain Reaction
RNA = RiboNucleic Acid
Nanog = fattore di trascrizione di cellule embrionali durante I primi stadi di sviluppo
Rex1 = fattore di trascrizione di cellule embrionali durante I primi stadi di sviluppo
T-4 = Octamer 4
SSEA-4 = Stage-specific embryonic antigen TRA l=Tumor rejection antigen- 1
CD = Cluster of differentiation
flk-1 = Foetal Liver Kinase -1
BSA - Bovine Serum Albumin
PBS = Phosphate buffer solution
GFP = green fluorescence protein
cDNA = complementary DesossiriboNucleic Acid HA = idrossiapatite
TCP = tricalcio fosfato Sigma- Aldrich, Milano

Claims (1)

  1. Rivendicazioni 1. Metodo per l’isolamento, l’espansione e la conservazione di una popolazione di cellule staminali da follicoli dentari umani, denominata FENC (Follicle-derived Embryonic Neural Crest stem cells) 2. Metodo per l'isolamento di cellule staminali FENC, secondo la rivendicazione 1, caratterizzato da una prima fase di espianto del follicolo e da una seconda di isolamento. 3. Metodo per l'isolamento di cellule staminali FENC, secondo la rivendicazione 2, in cui la fase di espianto è caratterizzata da un pretrattamento del cavo orale finalizzato a minimizzare la carica microbica. 4. Metodo per l'isolamento di cellule staminali FENC, secondo la rivendicazione 2, in cui la fase di isolamento è caratterizzata da: digestione enzimatica del follicolo e recupero della frazione cellulare; ottenimento di colture primarie e loro espansione; selezione con FACSorting; espansione delle FENC. 5. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui la digestione enzimatica della polpa è effettuata utilizzando una miscela di enzimi proteolitici e antibiotici e il recupero della frazione cellulare è ottenuto per centrifugazione e/o filtrazione del digerito enzimatico. 6. Metodo secondo la rivendicazione 5, in cui la digestione enzimatica è ottenuta impiegando una soluzione acquosa contenente: collagenasi di tipo I 3mg/mL, dispasi 4 mg/mL, penicillina 100 U/mL, streptomicina 100 μg/mL, claritromicina 500 pg/mL in PBS. 7. Metodo secondo le rivendicazioni 5 e 6, in cui la digestione enzimatica è realizzata mantenendo la soluzione per 1 ora a 37°C, sotto agitazione. 8. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui la crescita di colture primarie e la loro espansione è ottenuta utilizzando terreni di coltura specifici per la crescita di cellule staminali. 9. Metodo secondo la rivendicazione 8, in cui il terreno di colpirà è costituito da: MEGA Celi, addizionato di siero fetale bovino al 10% p/v, acido 2P-ascorbico 100μM, L-glutamina 2mM, penicillina 100U/mL, streptomicina 100μg/mL. 10. Metodo secondo le rivendicazioni 8 e 9, in cui l'incubazione è realizzata in flask e 37°C e 5% C02per 15-20 giorni, effettuando cambi del mezzo ogni 3 giorni. 11. Metodo secondo la rivendicazione 4, in cui la selezione delle cellule staminali FENC è realizzata con FACSorting, utilizzando come marcatori di staminalità SSEA-4, TRA 1-60, TRA 1-81, CD133, CD90, flk-1. 12. Metodo per l’espansione e la conservazione delle cellule staminali FENC in cui il processo di espansione è realizzato a 37 °C al 5% di C02utilizzando come mezzo di coltura MEGA Celi, addizionato di siero fetale bovino al 10% p/v, acido 2P-ascorbico ΙΟΟμΜ, L-glutamina 2mM, penicillina lOOU/mL, streptomicina 100μg/mL. Le cellule staminali FENC, così ottenute, possono essere conservate, mantenendo la loro vitalità, a 4°C o a temperature inferiori a 0°C, utilizzando le tecniche convenzionalmente impiegate per la conservazione di materiale cellulare. 13. Metodo di differenziamento in vitro, in assenza di fattori specifici come BMP-2 o 4, di cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12, per formare progenitori osteogenici, esprimenti RUNX-2, da cui derivano successivamente osteoblasti esprimenti HLA-1, CD44, RUNX-2 e CD54 ed osteocalcina. 14. Metodo per la differenziazione di cellule staminali FENC in osteoblasti, secondo la rivendicazione 13, in cui la differenziazione è ottenuta lasciando le cellule a proliferare 5-10 giorni in a-MEM, addizionato di siero fetale bovino al 20% p/v, acido 2P-ascorbico 100μΜ, L-glutamina 2mM, penicillina lOOU/mL, streptomicina 100μg/mL, sino alla confluenza nelle flask. 15. Metodo per l’espansione in vitro e la conservazione di matrice osteoide, detta LAB (Living Autologuous Bone), ottenuta da osteoblasti secondo le rivendicazioni 13 e 14. Il LAB è costituito da frammenti di tessuto osseo con uno spessore anche superiore a lem e con un volume anche superiore a lem . La formazione del LAB, contenente osteoblasti vitali che attivamente producono tessuto osseo, è caratterizzata dalla seguente successione di eventi: 1) formazione di clusters che depongono in una zona centrale emisferoidale cristalli di materiale inorganico, fibre di collagene e glicoproteine; 2) organizzazione tridimensionale di questa struttura per nuova apposizione di matrice ossea mineralizzata. 16. Metodo per la formazione di LAB, secondo la rivendicazione 15, in cui la crescita è condotta a 37 °C in un’atmosfera al 5% di C02utilizzando come mezzo di coltura α-MEM, addizionato di siero fetale bovino al 20% p/v, acido 2P-ascorbico ΙΟΟμΜ, L-glutamina 2mM, penicillina lOOU/mL, streptomicina 100μg/mL. La frmazione del LAB si arresta solo in mancanza di superficie e nutrienti. 17. Metodo per la espansione e la conservazione di LAB secondo le rivendicazioni 15 e 16, in cui la produzione del LAB avviene in maniera continua per successivi passaggi colturali e il tessuto osteoide formato è conservato, mantenendo la vitalità degli osteoblasti, a 4°C o a temperature inferiori a 0°C, utilizzando le tecniche convenzionalmente impiegate per la conservazione di materiale cellulare. 18. Metodo per la produzione e conservazione di matrici tridimensionali contenenti LAB secondo le rivendicazioni da 15 a 17, in cui gli osteoblasti, secondo le rivendicazioni 13 e 14, sono cresciuti in presenza di una matrice biocompatibile 3D che viene colonizzata. 19. Metodo secondo la rivendicazione 18, in cui la matrice biocompatibile è di tipo riassorbibile o non riassorbibile in vivo. 20. Metodo secondo le rivendicazioni 18 e 19, in cui la matrice biocompatibile riassorbibile è rappresentata sostanzialmente da acido lattico coglicolico nelle diverse formulazioni, da strutture collageniche di sintesi, da idrossiapatite porosa ad alto gradò riassorbibilità, biocoralli, solfato di calcio, biovetri, mentre per quelle non riassorbibili è rappresentata da polimetacrilati, PTFe, titanio, idrossiapatite compatta, idrossiapatite bifasica (50% HA e 50% di β-TCP), ceramica. 21. Metodo di differenziamento in vitro, in senso mioblastico delle cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12, per la formazione di muscolo liscio che prevede l’incubazione a 37 °C in atmosfera al 5% C02per 5-10 giorni, utilizzando come mezzo di coltura Mega Cell al 2% FBS p/v, acido 2P-ascorbico 100μΜ, L-glutamina 2mM, penicillina 100U/mL, streptomicina 100μg/mL addizionato di 10ng/ml TGFp. 22. Metodo di differenziamento in vitro, in senso mioblastico delle cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12, per la formazione di muscolo striato, che prevede una co-cultura con miotubi murini C2C12. La co-cultura, effettuata impiegando un rapporto tra i due tipi cellulari di 1:10 (1 cellula staminale per 10 cellule murine), prevede l’incubazione a 37°C in atmosfera al 5 % C02per 7 giorni, impiegando un mezzo di coltura così composto: Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Invitrogen), con 4 mM L-glutamina, 1.5 g/L di bicarbonato di sodio, 4.5 g/L di glucosio e 1.0 mM piruvato di sodio con l’aggiunta del 10% di FBS, 23. Metodo di differenziamento in vitro in senso neuronale e gliale delle cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12, per la formazione di neuroni e/o di glia, che prevede l’incubazione a 37°C in atmosfera al 5% C02per 5-7 giorni, impiegando un mezzo di coltura così composto: Neurobasal A (Invitrogen, Milano, Italia), addizionato con la proteina B27 (Invitrogen, Milano). 24. Metodo per la separazione citofluorimetrica delle cellule gliali dalle cellule neuronali prodotte dal differenziamento delle cellule staminali FENC, secondo la rivendicazione 23, tramite l’utilizzo di anticorpo anti-GFAP, che lega selettivamente le cellule gliali. 25. Metodo di differenziamento in senso adipocitario delle cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12, per la formazione di adipociti, che prevede la coltivazione delle cellule per 30 giorni, a 37°C in atmosfera al 5% C02,utilizzando come terreno di coltura α-MEM, addizionato di siero fetale bovino al 20% p/v, acido 2P-ascorbico 100μΜ, L-glutamina 2mM, penicillina 100U/mL, streptomicina 100μg/mL, desametazone 10 M . 26. Metodo per il differenziamento in senso condrocitano delle cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12, per la produzione di cartilagine, che prevede la coltivazione delle cellule per 30 giorni a 37°C in atmosfera al 5% C02, utilizzando come, terreno di coltura iα-MEM, addizionato di siero fetale bovino al 20% p/v, acido 2P-ascorbico 100μΜ, L-glutamina 2mM, penicillina 100U/mL, streptomicina 100μg/mL riducendo la tensione di ossigeno (pO2< 40 mmHg). 27. Uso in maniera autoioga di cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12 per lo sviluppo di terapie cellulari. 28. Uso in maniera autoioga di osteoblasti e LAB ottenuti da cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 20 nella risoluzione di patologie dell’apparato scheletrico come difetti ossei connessi con problematiche odontoiatriche, maxillo-facciali ed ortopediche. 29. Uso in maniera autoioga di mioblasti ottenuti da cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12 e da 21 a 22 per la risoluzione di problematiche e patologie che si estrinsecano con degenerazione di tessuto muscolare come la distrofia dei cingoli, la distrofia di Duchenne, la dermatomiosite. 30. Uso in maniera autoioga di mioblasti ottenuti da cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12 e da 21 a 22 per la formazione di tessuto muscolare liscio e striato per la risoluzione di problematiche e patologie che si estrinsecano con degenerazione di tessuto muscolare come la distrofia dei cingoli, la distrofia di Duchenne, la dermatomiosite. 31. Uso in maniera autoioga di neuroni ottenuti da cellule stami FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12, 23 e 24 per formazione di neuroni utilizzabili in terapie cellulari per la risoluzione di problematiche e patologie che interessano il sistema nervoso centrale, come nel caso della sindrome di Parkinson, e il sistema nervoso periferico, come nel caso della malattia dei motoneuroni. 32. Uso in maniera autoioga di cellule gliali ottenuti da cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12, 23 e 24 per la formazione di cellule gliali utilizzabili in terapie cellulari per la risoluzione di problematiche e patologie che interessano il sistema nervoso centrale ed il sistema nervoso periferico, estrinsecandosi con degenerazione mielinica, come nei casi della sclerosi laterale amiotrofica e della sclerosi a placche. 33. Uso in maniera autoioga di adipociti ottenuti da cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12 e 25 per la risoluzione di problematiche connesse con la chimrgia plastica. 34. Uso in maniera autoioga di adipociti ottenuti da cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12 e 25 per la formazione di tessuto adiposo per la risoluzione di problematiche connesse con la chirurgia plastica. 35. Uso in maniera autoioga di condrociti ottenuti da cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12 e 26 per la risoluzione di problematiche connesse con la chirurgia plastica ed oncologica. 36. Uso in maniera autoioga di condrociti ottenuti da cellule staminali FENC, secondo le rivendicazioni da 1 a 12 e 26 per la formazione di cartilagine per la risoluzione di problematiche connesse con la chirurgia plastica ed oncologica.
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