JP2009527223A - ヒト成人歯嚢組織からの胚様幹細胞塊の収集及び選択方法 - Google Patents
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Abstract
a)無菌状態での小嚢の収集、消化、並びに初代培養及び拡大
b)選択的な増幅
c)FAC分類
Description
幹細胞は、
1)無限自己再生能;
2)多数の細胞型への分化能
という特徴を有する。
1)抗原パターン及び細胞の選択方法。WO 03/066840は、選択方法については何ら開示していないが、本発明の方法は、SSEA‐4、TRA1‐60、TRA1‐81、CD133、CD90、flk‐1等の抗原検出による、サイトフルオロメトリーによる胚性幹細胞の選択を用いる。こうして、本発明では均一な胚性細胞集団を得ることが可能となる。
2)培養方法、細胞増殖、及び分化。実際、WO 03/066840は、成体幹要素のわずかな部分にしか含まれない細胞集団を収集する技術について述べているが、本発明の選択情報によると、均一な胚性様幹細胞集団を調製することができる。
本発明は、ヒトの歯小嚢から得られ、胚性様の抗原性状を有する新たな幹細胞の亜集団を単離する新たな方法に関し、また、その培養の拡大方法に関する。単離された細胞は、実験的及び治療的使用のために、集合体として特徴付けられると共に、保存可能である。
本発明は、成人から収集される胚性幹細胞の新たな細胞型の単離方法に関し、特に、小胞からのこれらの選択を含むこれらの細胞の単離方法に関する。
歯小嚢は、萌出の前の歯の形成の間に歯を包む組織複合体であり、下記の2つの理由のために、未分化細胞の有用な採取源の代表的なものである。
これらの細胞は、神経外胚葉に由来し、この層を起源とする細胞型における分化能を発現する。
この方法は、以下のような利点を有する:1)局部麻酔を用いた低侵襲手術、2)その部位の低罹患率、3)造血画分の欠如に起因した間葉細胞培養の高クローン形成、4)成人からの胚性細胞の単離。
幹細胞は、器官形成中の神経堤を起源とする間葉細胞に直接由来する小胞から取得される。この起源は、これらの細胞の可塑性を説明する。幹細胞を小胞から単離するために、後者は、口腔との接触によって損なわれていないことが必要とされる。
単離されたFENCは、刺激を与えられ又は刺激無しに、異なる細胞型に分化する。培地にβFGFを添加することで、分化を起こさずに増殖させることが可能である。
細胞が適切な数になった後は、凍結し、−80℃の液体窒素中で保存可能である。
手順は、以下のようにまとめることができる:
1)無菌状態での小胞の収集、消化、及び培養;
2)必要に応じた初代培養の増幅;
3)FAC分類;
4)増幅、凍結、及び/又は細胞分化;
5)FAC解析;
6)未分化状態の維持;
7)分化した細胞を用いた組織工学。
例えば、FENCは、造骨細胞の前駆細胞を得るのに使用可能である。前駆細胞はRUNX‐2を発現し、HLA‐1、CD44、RUNX‐2、CD54、及びオステオカルシンを発現する.骨芽細胞は、この前駆細胞に由来する。
LABを含む三次元マトリックスは、細胞が定着した三次元の生体適合基質の存在下で骨芽細胞を培養することによっても、同様に得ることができる。上記生体適合基質は、再吸収性を有するか、又はin vivoでないものである。好適な基質としては、ラクチド コ−グリコール酸、合成コラーゲン、HA,バイオサンゴ、硫酸カルシウム等が挙げられ、また、ポリメタクリレート、PTFe、チタン、小型HA、二相性HA(50%HA及び50%β‐TCP)、セラミックによって再吸収性を持たないものが挙げられる。
共培養は、1:10の比率で、7日間行われる。用いる培地は、4mM L‐グルタミン、1.5g/L 重炭酸ナトリウム、4.5g/L グルコース、及び1.0mM ピルビン酸ナトリウムを添加した10%FBS添加のDulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM,Invitrogen)である。
FENCは、同様に、20% p/v FBS、100μM 2P‐アスコルビン酸、2mM L‐グルタミン、100U/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシン、10‐8M デキサメタゾンを添加したα‐MEMにおける30日間の培養によって、含脂肪細胞に分化可能である。
特に、FENCの自家移植使用及びこれに由来する細胞は、以下の用途に応用可能である。
・FENC由来の筋芽細胞を用いた骨格組織病理学、平滑及び横紋組織の双方
・FENC由来のニューロンを用いたCNS病理学
・FENC由来のグリア細胞を用いたミエリン分化
・形成外科手術において、脂肪組織の形成が望まれるときの手段としてのFENC由来の含脂肪細胞
・腫瘍及び形成外科手術の分野における、FENC由来の軟骨細胞の使用。
発がん性を排除するために、ヌードマウスにレンチウイルスIII(Invitrogen, Milano, Italia)を感染させた後、GFP(green fluorescence protein)cDNAを含むベクターを用いて、FENCs及び分化細胞をヌードマウスに注入した。移植の後、30日間経過後にこの動物を処理した。移植箇所及び主要器官の双方について、組織学的観察を行ったところ、がんの発生は見られなかった。
FENCsのいくつかの例については、以下に述べる。
健康な被験者に、手術の1週間前から、1日2回、CHX 0.12 w/v により口をゆすぐ処置を行ってもらった。小胞を収集するために、局所麻酔後、蓋となる組織を切り、骨の扉を開けて、小胞に包まれた状態で歯茎内に埋伏している歯に到達した。グレーシーキュレット又は歯槽匙によって、無菌状態で収集すると、試料を消化溶液に37℃で1時間浸した。消化溶液は、3mg/mL I型コラゲナーゼ、4mg/mL ディスパーゼ(Dispase)、100U/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシン、及び500μg/mL クラリトロマイシンを添加したPBS(リン酸緩衝液、pH7.4、1M)であった。溶液の体積は、収集した小胞の体積によって決められ、8〜15mLの範囲で変更された。試料を溶液中に37℃で1時間保持した。1時間経過時に、溶液をFalcon(登録商標)ろ過器70μmによりろ過し、ECM、細胞、又は大きな凝集体を除去した。組織片が残存しているようであれば、試料にさらに30分の消化処理を行った。消化物の体積の10倍の体積を消化溶液に加え、140gで10分間遠心分離を行って、消化を停止させた。培地としては、10%w/v 牛胎児血清(FBS)、100μM 2P‐アスコルビン酸、2mM L‐グルタミン、100U/mLペニシリン、100 μg/mLストレプトマイシンを添加したMega Cell(SIGMA,ミラノ,イタリア)を用いた。遠心分離の終了時に、チューブの底から、25mlの懸濁液を回収し、50mlのフラスコで、37℃、5%CO2下で、1週間に2回培地を交換しながら培養した。培養の初日から開始した顕微鏡観察によると、接着細胞が細胞クローンの起源となっていた。
75個のフラスコ中の上記培地又は胚用培地(ES培地、Invitrogen、ミラノ、イタリア)における培養から5日後、60個のクローンが認められた。
実施例1及び2で単離し、解析したFENCsは、刺激を受けて又は刺激無しに分化可能であるか、又は8ng/mLのβFGFを加えることによって、分化を抑制しつつ増殖可能である。
骨分化のために、細胞は、20% w/v FBS、100μM 2P‐アスコルビン酸、2mM L‐グルタミン、100U/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシンを添加したα−MEMにより培養可能である。細胞は、約25日で骨芽細胞に分化し、I型及びIII型コラーゲン、オステオカルシン、オステオネクチン、BAPに対する抗体に陽性である線維性骨を形成する。
濾胞細胞は、自然発生的に、又はB27タンパク質(Invitrogen,ミラノ)を添加したNeurobasal A培地(Invitrogen,ミラノ,イタリア)を用いることで、分化可能である。培養は、5‐7日間行った。どちらの場合も分化したニューロン及びグリア細胞を多数取得できた。抗‐GFAP抗体を用いたサイトフルオロメトリーアッセイにより、2つの細胞型を選別し、単離することができる。実際、分化した細胞は、
・GFAP抗体に陽性であればグリア細胞;
・抗TuJ1、抗‐神経フィラメント、抗Brn3A(転写因子)抗体に陽性であればニューロン;
・抗‐ペリフェリン及び抗‐p75抗体に陽性であれば末梢ニューロン
である。
ネズミの筋管であるC2C12と共培養することによって、FENCを横紋筋細胞へ分化させることができる。共培養は、1:10の割合で、既知の手法(例えばLaino et al., 2006)を用いて、4mM L‐グルタミン、1.5g/L 重炭酸ナトリウム、4.5g/L グルコース、及び1.0mM ピルビン酸ナトリウムを添加した10%FBSのDulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Invitrogen)中で、1週間行った。共培養の後、ネズミの筋管と融合したFENCの割合を、抗‐ヒト核ラミニンを用いて算出した。通常、融合した細胞の割合は、15‐20%であった。融合した筋管は、移植に使用できる。
脂肪細胞は、形成手術に用いることができる。
FENCは、一旦分化すると、ローラ装置における回転培養によって組織の再構築に使用可能である。例えば、骨芽細胞へ分化した細胞は、足場(15日以内に再吸収される)であるコグリコール酸ラクチド(85:15)上に蒔けばよい。回転培養(1/5秒)は、5%CO2下で30日間行う。厚さが1cmに達すると、組織学的、免疫組織学的、及びSEM技術を用いて、三次元組織構造を観察及び評価できる。
移植は、標準的な外科的手技を用いて行うことができる。移植を受ける箇所は、顕著な溢血及び皮質層の減少を伴う。従って、ホストと足場‐細胞との融合は、容易に形成可能であり、移植の実行が可能である。
完全な融合は、40‐60日で形成された。
組織の修復は、幹細胞を用いた自家移植技術によって、実現可能である。
Mega Cell=細胞培養用培地(Sigma‐Aldrich,ミラノ,イタリア)
ES=培地(Invitrogen,ミラノ,イタリア)
βFGF=ベータ線維芽細胞成長因子
α‐MEM=alpha Medium Essential Medium(Invitrogen)
抗‐GFAP=グリア線維性酸性蛋白質を検出する抗体
GFAP=グリア線維性酸性蛋白質
SMA=平滑筋アクチン
TGFβ=Tumor Growth Factor β:腫瘍成長因子ベータ
BAP=Bone Alkaline Phosphatase:骨型アルカリフォスファターゼ
βFGF=Fibroblast Growth Factor β:線維芽細胞成長因子ベータ
RT−PCR=Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction :逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
Nanog=初期発生で見られる胚細胞の転写因子
Rex1=初期発生で見られる胚細胞の転写因子
OCT‐4=Octamer 4
SSEA‐4=Stage-specific embryonic antigen:ステージ特異的胚性抗体
TRA 1=Tumor rejection antigen-1:腫瘍退縮抗原‐1
CD=Cluster of differentiation:白血球分化抗原
flk‐1=Foetal Liver Kinase -1:胎児肝キナーゼ‐1
HA=ハイドロキシアパタイト
TCP=リン酸3カルシウム
Claims (10)
- 下記a)〜c)を含み、ヒトの歯小嚢に属し、FENC(Follicle-derived Embryonic Neural crest stem cell)と呼ばれる幹細胞を単離、拡大、及び保存する方法。
a)無菌状態での小嚢の収集、消化、並びに初代培養及び拡大
b)選択的な増幅
c)FAC分類 - タンパク質分解酵素及び抗体を用いて、上記消化を行う
請求項1に記載の方法。 - 上記酵素消化を、3mg/mL I型コラゲナーゼ、4mg/mL ディスパーゼ、100U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、及び500μg/mL クラリトロマイシンを添加したPBSを含む水溶液を用いて行う、
請求項2に記載の方法。 - 上記酵素消化を、37℃で1時間、振盪下で行う
請求項2又は3に記載の方法。 - 初代培養及び拡大を、幹細胞に特異的な培地を用いて行う
請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。 - 培地は、10% p/v FBS、100μM 2P‐アスコルビン酸、2mM L‐グルタミン、100U/mL ペニシリン、100μg/mL ストレプトマイシンを添加したMega Cellからなる培地である
請求項5に記載の方法。 - 37℃、5%CO2下で15‐20日、3日毎に培地を換えつつ培養を行う
請求項5又は6に記載の方法。 - FAC分類を、幹細胞マーカーとして、SSEA‐4,TRA 1−60,TRA 1‐81,CD133,CD90,flk‐1を用いて行う
請求項1から7のいずれか1項に記載の方法。 - 造骨細胞の前駆細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、含脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞を取得するための、請求項1から8のいずれか1項の方法によって得られたFENCの使用。
- 骨格組織病理学、筋組織変性、CNS病理学、ミエリン変性、腫瘍疾患の治療のための細胞治療プロトコルで使用するための、及び形成外科手術において使用するための自家移植物の調製への、造骨細胞の前駆細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、軟骨細胞、含脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞の使用。
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