JP2003111588A - ヒト多能性幹細胞の増殖および分化のための技術 - Google Patents

ヒト多能性幹細胞の増殖および分化のための技術

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、ヒト多能性幹細胞の増殖、増殖を
促進する培養条件、ならびに遺伝的改変、ｃＤＮＡライ
ブラリーの産生、および組織再生を目的とする分化した
細胞の産生を提供することを課題とする。 【解決手段】 本発明は、ヒト多能性幹細胞の増殖、増
殖を促進する培養条件、ならびに遺伝的改変、ｃＤＮＡ
ライブラリーの産生、および組織再生を目的とする分化
した細胞の産生を提供する。１つの実施形態において、
本発明は、フィーダー細胞を本質的に含まない、増殖中
の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を含有する組成物であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】（技術分野）本発明は、胚細
胞の細胞生物学の分野に一般的に関与する。より詳細に
は、本発明は、ヒト多能性幹細胞の増殖、増殖を促進す
る培養条件、ならびに遺伝的改変、ｃＤＮＡライブラリ
ーの産生、および組織再生を目的とする分化した細胞の
産生のための使用に関与する。
【０００２】（関連申請書の参考）本願は、以下の係属
中の米国特許出願（ＵＳＳＮ６０／１７５，５８１，２
０００年１月１１日提出；ＵＳＳＮ６０／２１３，７４
０、２０００年６月２２日提出；ＵＳＳＮ６０／２１
３，７３９、２０００年６月２２日提出；ＵＳＳＮ６０
／２１６，３８７、２０００年７月７日提出；ＵＳＳＮ
６０／２２０，０６４、２０００年７月２１日提出；お
よび０９／６８８／０３１、２０００年１０月１０日提
出）に対して優先権を主張する。
【０００３】米国における手続き上の目的に対して、こ
れらの優先権出願は、本明細書中によって、それら全体
が参考として本明細書中に援用される。
【０００４】
【従来の技術】（背景）最近の発見は、幹細胞が、疾
患、感染の過程で、または先天性異常のために損傷した
細胞および組織の置換源であり得るという期待を生じ
た。推定される幹細胞の種々の型は、それらが分裂する
場合に、分化して、心臓、肝臓、または脳のような特定
の組織の独特の機能を実行し得る細胞へ成熟する。特に
重要な開示は、ほとんどいずれの細胞型へ分化する能力
を有すると考えられる、多能性幹細胞の発生である。
【０００５】多能性幹細胞の初期の研究は、マウスにお
いて実施された（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍｅｔｈ． Ｃ
ｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：１７３，１９９７；およびＰ
ｅｄｅｒｓｅｎ，Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅ
ｖ．６：５４３，１９９４に総説される）。マウス幹細
胞は、早期胚細胞および胚組織の両方から単離され得
る。多能性幹細胞の所望される特徴は、それらが、未分
化状態におけるインビトロでの不明確な増殖を可能に
し、正常な核型を保持し、そしてすべての三つの胚性胚
葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）の派生物に分化する
能力を保持することである。
【０００６】ヒト多能性幹細胞の調製の開発は、多くの
技術的な困難を克服する工程を含み、マウス細胞におけ
る研究に比べてほとんど進歩していない。
【０００７】Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許第５，８４
３，７８０号； Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４，１９９５）は、初めて霊
長類から多能性幹細胞を首尾よく単離し、そして増殖さ
せた。彼らは、それに続いてヒト胚盤胞からヒト胚性幹
（ｈＥＳ）細胞株を誘導した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８
２：１１４，１９９８）。Ｇｅａｒｈａｒｔおよび共同
研究者らは、胎児性腺組織からヒト胚性生殖（ｈＥＧ）
細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２
６，１９９８；および米国特許第６，０９０，６２２
号）。
【０００８】ｈＥＳ細胞およびｈＥＧ細胞の両方が、長
い期間探求された以下の多能性胚細胞の特徴を有するこ
とが報告された：それらが、分化することなくインビト
ロにおいて長期増殖し得ること、それらが、通常の核質
を有すること、そしてそれらが、多くの異なる細胞型を
産生し得るままであること。このことによって、これら
は、遺伝的な異常、外傷または疾患状態によって損なわ
れたほとんどすべての組織の再生のための貯蔵器として
作用する、ヒトの治療における使用に関してかなりの見
込みを保有する。
【０００９】治療のための多能性幹細胞の使用への重要
な問題は、多能性幹細胞が、分化を防ぐためにフィーダ
ー細胞の層の上に伝統的に培養されることである（米国
特許第５，８４３，７８０号；米国特許第６，０９０，
６２２号）。培養環境においてフィーダー細胞が存在し
ないとき、ｈＰＳ細胞は、まもなく死ぬか、または約束
される細胞の異種の集団に分化する。白血病阻害因子
（ＬＩＦ）は、マウスＰＳ細胞の分化を阻害するが、こ
れは、ヒトＰＳ細胞の分化の防止において、フィーダー
細胞の役割を置き換えるのではない。不幸にも、フィー
ダー細胞の使用は、生産コスト、損傷、スケールアップ
を増加させ、そして多能性幹細胞をフィーダー細胞成分
から分離させることを必要とする、混合した細胞集団を
産生させる。
【００１０】別の問題は、幹細胞の各々の患者の処置に
必要な特定の型の組織への分化を制御することである。
分化の過程のよりよい理解が、多能性幹細胞の増殖およ
び分化の間の遺伝子発現を観察することによって獲得さ
れるということが本発明の仮説である。
【００１１】国際特許公開ＷＯ９９／２０７４１（Ｇｅ
ｒｏｎ Ｃｏｒｐ．）は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｍ
ａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ ｏ
ｆＰｒｉｍａｔｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｐｒｉｍｏｒｄｉ
ａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓという表題である。低浸透
圧および低エンドトキシンレベルである、実質的に未分
化状態である霊長類由来の始原幹細胞を増殖するための
細胞培養培地が、提供される。基本培地は、フィーダー
細胞の基質またはフィーダー細胞マトリックス上の霊長
類由来の始原幹細胞の増殖を支持するのに有効な血清と
組み合せる。培地は、非必須アミノ酸、抗酸化剤、およ
びヌクレオシドまたはピルビン酸塩のいずれかである成
長因子をさらに含む。
【００１２】初期ヒト発生についての配列に基づく研究
は、胎児の器官および組織から産生されたライブラリー
（例えばＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ協会（ｈｔｔｐ：／／ｉｍ
ａｇｅ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／）から供給される胎児ライ
ブラリーの）に焦点が置かれた。国際特許公開ＷＯ９８
／００５４０（Ｉｎｃｙｔｅ）は、ＴＨＰ−１細胞およ
び膀胱腫瘍由来のｃＤＮＡライブラリーから単離された
幹細胞抗原の部分配列を報告する。
【００１３】未分化の多能性幹細胞の増殖および操作を
容易にする新たな技術は、胚性細胞療法の完全な可能性
の理解への主要な業績である。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、ヒ
ト多能性幹細胞の増殖、増殖を促進する培養条件、なら
びに遺伝的改変、ｃＤＮＡライブラリーの産生、および
組織再生を目的とする分化した細胞の産生を提供するこ
とを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】（発明の要旨）本開示
は、フィーダー細胞の非存在下において、霊長類多能性
幹（ｐＰＳ）細胞を培養するための改良された系を提供
する。フィーダー細胞の役割は、細胞外マトリックス上
における培養を支持し、そして馴化培地において細胞を
培養する工程によって置き換えられる。商業的スケール
で馴化培地を産生し得る永久的な細胞株が、提供され
る。ウイルスベクターまたはＤＮＡ／脂質複合体を用い
て細胞に導入することによって、ｐＰＳ細胞を遺伝的に
変更する方法もまた、発見された。本開示において記載
される系は、ｐＰＳ細胞分化の生物学の研究における使
用の目的に、ｐＰＳ細胞の大量の増殖を可能にし、ヒト
治療における使用の目的に重要な生成物の産生を可能に
する。
【００１６】本質的にフィーダー細胞を含まない増殖中
のｐＰＳ細胞を含む組成物が、本開示において記載され
る。この組成物は、フィーダー細胞の培養物から培地を
収集することによって産生された馴化培地、および細胞
外マトリックス成分によってコートされた基質もまた含
み得る。ｐＰＳ細胞は、未分化状態においてこの増殖条
件下に継代され、そして拡大され得る。
【００１７】本開示は、培地中において細胞を培養する
ことによって培地を馴化する工程、および馴化培地を収
集する工程を含む、本質的にフィーダー細胞を含まない
増殖環境下において、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を
培養するために適切な馴化培地を産生するための方法も
また提供する。培地を馴化するために用いられる細胞
は、非悪性供給源由来であり、そして通常の核型を有す
るような、大規模な培養が可能である（６０日またはそ
れ以上のような）ような一つ以上の所望される特徴を有
し得、線維芽細胞に特徴的な形態的な特徴または細胞マ
ーカーを有し得、そして不死化される（例えば、テロメ
ラーゼ逆転写酵素を発現するように遺伝的に改変される
ことによって）。ヒト胚性幹細胞から適切なヒトフィー
ダー細胞株を産生するための方法を記載する本開示は、
フィーダー細胞を含まない培養物においてｐＰＳ細胞が
分化することを引き起こす工程または可能にする工程を
含む、分化した細胞集団を産生する方法を提供する。
【００１８】本開示はまた、直接分化によって（フィー
ダー細胞の存在または非存在下において培養された）ｐ
ＰＳ細胞から分化した細胞を産生するための方法を提供
する。細胞懸濁液が、過増殖、コロニーの形成、胚様体
の形成、または他の凝集体の形成が存在する前に未分化
のドナー培養物から調製され、次いで固体表面上へ直接
的にプレートする。表面は、（ポリリシンまたはポリオ
ルニチンのような）ポリカチオンを帯び得る。特定の細
胞系統への分化はまた、フィーダー細胞のない培養にお
いてまたはリプレーティング後のいずれかにおいて、分
化を阻害する血清または因子を除去すること、および／
または分化を促進する因子を添加することによって促進
され得る。
【００１９】本開示は、細胞毒性または細胞の調節につ
いての化合物のスクリーニングの方法もまた提供し、こ
の方法は、化合物に本発明の分化した細胞を接触させる
工程、化合物との接触に起因する、任意の細胞における
表現型または代謝の変化を決定する工程、およびこの変
化を細胞毒性あるいは細胞機能または生化学における他
のすべての変化と相関させる工程を含む。
【００２０】遺伝子およびタンパク質の発現は、ｐＰＳ
細胞から得られる異なる細胞集団の間で比較され得、そ
して分化の過程において上方制御または下方制御される
因子を同定および特徴付けするために使用され得、そし
て変質した遺伝子のヌクレオチドコピーを産生する。
【００２１】本開示は、遺伝的に変更された霊長類の多
能性幹（ｐＰＳ）細胞を産生するための方法もまた提供
する。一つのバリエーションにおいて、ｐＰＳ細胞は、
フィーダー細胞のない培養においてトランスフェクトさ
れる。別のバリエーションにおいて、ｐＰＳ細胞は、薬
剤耐性であり、そして首尾よくトランスフェクトされた
ｐＰＳ細胞の薬剤選択に耐えるフィーダー細胞を含む培
養においてトランスフェクトされる。トランスフェクシ
ョンに用いるベクターは、未分化のｐＰＳ細胞において
転写を促進するプロモーターに作動可能に連結されたタ
ンパク質コード領域をしばしば含む。霊長類の多能性幹
（ｐＰＳ）細胞またはそれから分化した細胞の集団もま
た、提供され、ここで実質的な比率の細胞が、ポリヌク
レオチドを用いて安定にトランスフェクトされている
か、またはこのポリヌクレオチドを遺伝的に受け継いだ
このような細胞の子孫である。
【００２２】本開示は、分化前または後の霊長類の多能
性幹（ｐＰＳ）細胞からのｍＲＮＡ調製物またはｃＤＮ
Ａライブラリーを産生するための方法もまた提供し、こ
の方法は、本質的にフィーダー細胞のない、未分化のｐ
ＰＳ細胞の培養物を提供する工程、必要に応じてｐＰＳ
細胞を分化させる工程、そして未分化または分化した細
胞からのｍＲＮＡを単離する工程を含む。これらの技術
は、ｃＤＮＡ発現またはサブトラクションライブラリー
の調製に用いられ得る。ｍＲＮＡを、フィーダー細胞の
ないｐＰＳ培養物から得る場合、ｃＤＮＡライブラリー
は、未分化のｐＰＳ細胞、またはｐＰＳ細胞から分化し
た細胞のいずれかにおいて、ｍＲＮＡレベルで発現され
た少なくとも１，０００の遺伝子を含み得、本質的に他
の脊椎動物のｃＤＮＡを含まない。未分化のｐＰＳ細
胞、およびその分化した子孫において発現する遺伝子に
対する配列情報は、ｃＤＮＡおよび発現した遺伝子のタ
ンパク質誘導体、ならびにその遺伝子産物に対する特異
的な抗体の調製に用いられ得る。
【００２３】本発明は、フィーダー細胞を本質的に含ま
ない、増殖中の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を含有す
る組成物を提供する。本発明はまた、この組成物の細胞
の分化を引き起こすか、または分化を可能にすることに
よって調製される、分化した細胞集団を提供する。
【００２４】本発明はまた、フィーダー細胞を本質的に
含まない増殖環境において、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）
細胞を培養するために適切な馴化培地を産生するための
細胞株を提供する。
【００２５】本発明はまた、未分化の霊長類多能性幹
（ｐＰＳ）細胞のドナー培養物から、以下の工程を包含
する方法によって産生される分化した細胞を提供する：
ａ）この未分化のドナー培養物から細胞の懸濁液を調製
する工程；ｂ）この懸濁された細胞を、それらが胚様体
を形成せずに分化するように、固相表面上に再播種し、
そして培養する工程；およびｃ）分化した細胞をこの固
相表面から収集する工程。
【００２６】本発明はまた、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）
細胞の集団を提供し、この未分化のｐＰＳ細胞の少なく
とも２５％が、ポリヌクレオチドで安定にトランスフェ
クトされているか、またはこのポリヌクレオチドを遺伝
したそのような細胞の子孫である、霊長類多能性幹（ｐ
ＰＳ）細胞の集団である。
【００２７】本発明はまた、未分化のｐＰＳ細胞または
ｐＰＳ細胞から分化した細胞のいずれかにおいてｍＲＮ
Ａレベルで発現される少なくとも１，０００遺伝子のｃ
ＤＮＡライブラリーであって、他の脊椎動物のｃＤＮＡ
を本質的に含まない、ｃＤＮＡライブラリーである。
【００２８】本発明はまた、細胞傷害性または細胞調節
について化合物をスクリーニングする方法を提供し、こ
の方法は、本発明の分化した細胞を、この化合物と接触
させる工程、この化合物との接触から生じるこの細胞に
おける任意の表現型または代謝変化を決定する工程、お
よびこの変化を細胞傷害性または細胞調節と相関させる
工程を包含する。
【００２９】１つの実施形態において、本発明のｐＰＳ
細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞である。
【００３０】本発明は、フィーダー細胞を本質的に含ま
ない、増殖中の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を含む、
組成物を提供する。１つの実施形態において、この組成
物は、フィーダー細胞の培養物から培地を収集すること
によって産生された馴化培地をさらに含む。さらに別の
実施形態において、これらの組成物は、細胞外マトリク
ス成分（例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミ
ニンまたはコラーゲン）をさらに含む。
【００３１】本発明はまた、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）
細胞を培養するための方法を提供し、この方法は、フィ
ーダー細胞を本質的に含まないが、フィーダー細胞の培
養物から培地を収集することによって産生された馴化培
地を含む増殖環境において、ｐＰＳ細胞を培養する工程
を包含する。
【００３２】本発明はまた、フィーダー細胞を本質的に
含まない増殖環境において、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）
細胞を培養するために適切な馴化培地を産生するための
方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
ａ）この培地中で細胞を培養することによって培地を馴
化する工程であって、ここで、この細胞は、少なくとも
６０日間培養中で増殖し得る正倍数体細胞である、工
程；およびｂ）この馴化培地を収集する工程。別の実施
形態において、本発明は、この方法によって産生され
た、フィーダー細胞を本質的に含まない増殖環境におけ
る、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞の培養を支持するた
めの馴化培地を提供する。
【００３３】１つの実施形態において、馴化培地を産生
するために使用される本発明の細胞株は、１つ以上の以
下の特性を有する： ｉ）正倍数体である； ｉｉ）不死化マウス細胞株である； ｉｉｉ）ヒト細胞株である； ｉｖ）線維芽細胞株である；または ｖ）少なくとも６０日間培養中で増殖し得る。
【００３４】本発明はまた、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞
の培養物を、線維芽様細胞を含む分化した細胞の集団へ
と分化させ、次いで、線維芽様細胞をこの培養物から選
択することによって得られた、ヒト細胞株を提供し、こ
こで、この線維芽様細胞の培養物から培地を収集するこ
とによって産生された馴化培地は、フィーダー細胞を本
質的に含まない培養環境においてｐＰＳ細胞の増殖を支
持する。
【００３５】１つの実施形態において、馴化培地を産生
するために使用される本発明の細胞株は、テロメラーゼ
逆転写酵素（ＴＥＲＴ）を上昇したレベルで発現するよ
うに遺伝的に変更されている。
【００３６】本発明はまた、分化した細胞集団を産生す
る方法を提供し、この方法は、本発明の組成物の細胞の
分化を引き起こすか、または可能にさせる工程を包含す
る。
【００３７】本発明はまた、未分化の霊長類多能性幹
（ｐＰＳ）細胞のドナー培養物から分化した細胞を産生
するための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包
含する：ａ）この未分化のドナー培養物由来の細胞の懸
濁液を調製する工程；ｂ）この懸濁した細胞を、それら
が胚様体を形成せずに分化するように、固相表面上に再
播種する工程；およびｃ）この固相表面から分化した細
胞を収集する工程。本発明はまた、霊長類多能性幹（ｐ
ＰＳ）細胞のドナー培養物から分化した細胞を産生する
ための方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含す
る：ａ）フィーダー細胞を本質的に含まない、霊長類多
能性幹（ｐＰＳ）細胞の培養物を提供する工程；ｂ）こ
の細胞が培養される培地を変更する工程；およびｃ）こ
の変更した培地中での一定時間の培養後に、分化した細
胞を収集する工程。１つの実施形態において、これらの
ｐＰＳ細胞のドナー培養物は、本発明の、フィーダー細
胞を本質的に含まない培養物である。別の実施形態にお
いて、これらの方法は、以下の少なくとも１つの特徴を
有する：ｉ）固相表面が、ポリカチオン（例えば、ポリ
リジンまたはポリオルニチン）を保有する；ｉｉ）細胞
が再播種後に培養される培地からの分化を阻害する、血
清、血清置換物、または因子を取り除くことによって、
分化が促進される；またはｉｉｉ）細胞が再播種後に培
養される培地において、分化を促進する因子（例えば、
脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）またはニュートロフ
ィン−３（ＮＴ−３））を添加することによって、分化
が促進される。本発明はまた、上記の方法によって産生
される、分化した細胞集団を提供する。本発明はまた、
細胞毒性または細胞の調節について化合物をスクリーニ
ングする方法であり、この方法は、これらの化合物に、
この分化した細胞を接触させる工程、化合物との接触に
起因する任意の細胞における表現型または代謝の変化を
決定する工程、およびこの変化を細胞毒性または細胞機
能と相関させる工程を含む。
【００３８】本発明は、未分化の霊長類多能性幹（ｐＰ
Ｓ）細胞と比較して、方向付けられた（ｃｏｍｍｉｔｔ
ｅｄ）細胞、または分化した細胞において異なるレベル
で発現されるｍＲＮＡに含まれるヌクレオチド配列を含
むポリヌクレオチドを産生するための方法を提供し、こ
の方法は、以下の工程を包含する：ａ）方向付けられた
細胞または分化した細胞における複数のｍＲＮＡの発現
レベルを、未分化のｐＰＳ細胞における同じｍＲＮＡの
発現レベルと比較して、測定する工程。ｂ）この未分化
のｐＰＳ細胞と比較して、方向付けられた細胞または分
化した細胞において異なるレベルで発現されるｍＲＮＡ
を同定する工程；およびｃ）この同定したｍＲＮＡに含
まれる少なくとも３０の連続するヌクレオチドのヌクレ
オチド配列を含む、ポリヌクレオチドを調製する工程。
【００３９】本発明は、遺伝的に改変された霊長類多能
性幹（ｐＰＳ）細胞を産生する方法を提供し、この方法
は、以下の工程を包含する：ａ）本発明の本質的にフィ
ーダー細胞を含まないｐＰＳ細胞の組成物を、提供する
工程；ｂ）この組成物中のｐＰＳ細胞中にポリヌクレオ
チドを移入する工程；および、次いで、必要に応じて、
ｃ）このポリヌクレオチドで遺伝的に改変されている細
胞を優先的に選択する工程。本発明はまた、遺伝的に改
変された霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を産生する方法
を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：ａ）薬
剤耐性のフィーダー細胞の層上にｐＰＳ細胞の組成物を
提供する工程；ｂ）この組成物中のｐＰＳ細胞中にポリ
ヌクレオチドを移入する工程；および、次いで、必要に
応じて、ｃ）このフィーダー細胞が耐性である薬剤を使
用して、この組成物において遺伝的に改変されている細
胞を優先的に選択する工程。１つの実施形態において、
これらのポリヌクレオチドは、未分化のｐＰＳ細胞にお
いてコード領域の転写を促進するプロモーターに作動可
能に連結されたタンパク質コード領域を含む。
【００４０】本発明はまた、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）
細胞の集団を提供し、ここで、未分化のｐＰＳ細胞の少
なくとも２５％が、ポリヌクレオチドで安定にトランス
フェクトされているか、またはこのポリヌクレオチドを
遺伝している細胞の子孫である。本発明はまた、この細
胞を分化することによって得られる、遺伝的に改変され
た分化した細胞の集団を提供する。
【００４１】本発明は、分化前または後の霊長類多能性
幹（ｐＰＳ）細胞から、ｍＲＮＡ調製物またはｃＤＮＡ
発現ライブラリーを産生する方法を提供し、この方法
は、本質的にフィーダー細胞を含まない未分化のｐＰＳ
細胞の培養物を提供する工程、必要に応じてこのｐＰＳ
細胞を分化させる工程、およびこの未分化または分化し
た細胞から、ｍＲＮＡを単離する工程を包含する。１つ
の実施形態において、この方法は、本質的にフィーダー
細胞を含まないｐＰＳ細胞からｍＲＮＡを単離する工
程、およびこのｍＲＮＡのｃＤＮＡのコピーをクローニ
ングベクターに組換える工程を包含し、ここで、このｃ
ＤＮＡのコピーは、未分化のｐＰＳ細胞においてこのｃ
ＤＮＡの転写を促進する、転写調節制御エレメント（例
えば、ＰＧＫプロモーター）に作動可能に連結される。
別の実施形態において、これらの方法は、第１の細胞集
団において、第２の細胞集団と比較して差示的に発現さ
れる転写物について富化されたｃＤＮＡサブトラクショ
ンライブラリーを生成するための方法であって、第１の
細胞集団および第２の細胞集団から得られたｍＲＮＡ
（または、そのｃＤＮＡコピー）の調製物を、その両方
の調製物に存在するポリヌクレオチドをクロスハイブリ
ダイズさせる条件下で、共にインキュベートする工程；
および、次いで、クロスハイブリダイズされなかったポ
リヌクレオチドを、クローニングベクターに組換える工
程を包含する。本発明はまた、これらの方法に従って産
生されたｃＤＮＡライブラリーを提供する。本発明はま
た、未分化のｐＰＳ細胞、またはｐＰＳ細胞から分化し
た細胞のいずれかにおいてｍＲＮＡレベルで発現された
少なくとも１，０００遺伝子のｃＤＮＡライブラリーを
提供し、これは、本質的に他の脊椎動物のｃＤＮＡを含
まない。１つの実施形態において、これらのライブラリ
ーのｃＤＮＡセグメントの少なくとも３０％は、その対
応するｍＲＮＡのコード領域全体を含む。
【００４２】本発明はまた、未分化または分化したｐＰ
Ｓ細胞において発現されるｍＲＮＡの配列を含むポリヌ
クレオチドを産生するための方法を提供し、この方法
は、これらの方法に従って得られたｍＲＮＡまたはｃＤ
ＮＡ由来のヌクレオチド配列を決定する工程、およびそ
の決定した配列を含むポリヌクレオチドを製造する工程
を包含する。
【００４３】本発明はまた、未分化または分化したｐＰ
Ｓ細胞において発現されるポリペプチドの配列を含むア
ミノ酸を産生するための方法を提供し、この方法は、こ
れらの方法に従って得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの
タンパク質コード領域由来のアミノ酸配列を決定する工
程、およびその決定した配列を含むタンパク質を製造す
る工程を包含する。
【００４４】本発明はまた、未分化または分化したｐＰ
Ｓ細胞において発現されるポリペプチドに特異的な抗体
を産生するための方法を提供し、この方法は、これらの
方法に従って得られたｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのタンパ
ク質コード領域由来のアミノ酸配列を決定する工程、お
よびその決定した配列を含むタンパク質を用いて、動物
を免疫化するか、または免疫応答性の細胞または粒子に
接触させる工程を包含する。
【００４５】１つの実施形態において、本発明のｐＰＳ
細胞は、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞である。
【００４６】本発明のこれらおよび他の局面は、以下に
続く記載から明らかである。
【００４７】
【発明の実施の形態】（詳細な説明）本開示は、分化を
抑制するためにフィーダー細胞の層を必要とすることな
く、インビトロにおける霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞
を増殖させるための系を提供する。
【００４８】フィーダー細胞の役割は、分化なしに細胞
の増殖を支持する培養環境における特徴によって置き換
え得ることが発見された。その特徴の一つは、Ｍａｔｒ
ｉｇｅｌ（登録商標）およびラミニンによって例示され
る細胞外マトリックスのような、培養表面上の適切な基
質である。別の特徴は、馴化培地に例示される、いくつ
かの方法において効果的に分化を抑制する因子を含む培
養培地の使用である。ｐＰＳ細胞を支持するように培地
を馴化するための細胞は、初代胚性線維芽細胞、テロメ
ア化した線維芽細胞、および培養されたｐＰＳ細胞から
分化し、そして選択された線維芽様細胞を含む。
【００４９】例示的な調製において、未分化のｈＥＳコ
ロニーを、フィーダー細胞上のｈＥＳ培養物から回収
し、次いで各９．６ｃｍ2ウエルに約１５コロニーで、
馴化培地中の各Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基質の上
に播種した。播種の次の日、未分化のｈＥＳ細胞は、約
１００〜２０００個の細胞の小さなコロニーとして可視
であり、そして単一の細胞が、分化しているか、または
死んでいるようにみえるコロニーの中間に存在する。ｈ
ＥＳ細胞が増殖されるにつれて、コロニーは、大きくそ
してコンパクトになり、これは、培養皿の表面領域の大
部分を提案する。コンフルエント近くになると、細胞の
ほとんどが、未分化細胞の形態的な特徴を有し、コロニ
ーの間にある分化細胞は、培養物中の細胞の１０％未満
に相当した。
【００５０】倍化速度は、ほぼ２０〜４０時間程度であ
り、フィーダー細胞上に増殖されるｈＥＳ細胞と比較し
得る。培地は、毎日換えられ、そして細胞は、６日また
は７日ごとに分割および継代された。最初の播種の１９
日後、細胞は免疫蛍光法によって細胞表面の表現型に関
して試験された。９０％以上を超える細胞が、ＳＳＥＡ
−４およびＴｒａ−１−６０に関して陽性に染色され；
８０％以上を超える細胞が、Ｔｒａ−１−８１に関して
陽性に染色されたが、１５％未満が、ＳＳＥＡ−１に関
して陽性に染色された。このことは、調製物中の細胞の
少なくとも約８０％は、未分化ｈＥＳ細胞として予測さ
れる表現型を有したことを示す。
【００５１】フィーダー細胞が、高品質の馴化培地を産
生する能力を失わせることなく、長期間の培養において
不死化および維持され得ることもまた発見された。例え
ば、初代マウス胚性線維芽細胞は、これらテロメラーゼ
逆転写酵素を発現するように遺伝的に改変することによ
って、不死化され得る（実施例８）。培地を馴化するの
に適切なヒト細胞が、インビトロにおいて胚性幹細胞を
分化することによって得られ得ることもまた発見され
た。ｈＥＳ細胞は、懸濁液中における胚様体の形成、そ
して次いで線維芽様細胞の同種の集団が得られるような
様式での培養によって分化された(実施例１２および１
３）。
【００５２】形質導入されていないｈＥＦ細胞株および
テロメア化されたｈＥＦ細胞株の両方は、連続細胞培養
物中で増殖し、そして馴化培地を産生するために用いら
れた。この培地中において増殖されるｈＥＳ細胞の培養
は、初代ｍＥＦフィーダー細胞の層の上に直接的に増殖
されたｈＥＳ細胞と区別できない未分化ｈＥＳ細胞の形
態的な特徴を有するコロニーを形成することが発見され
た（図１４、パネルＡ）。このことは、培養を続けるた
めに、反復的に初代フィーダー細胞の培養物を調製する
必要性を除去し、一貫して高品質な商業的スケールにお
いてｐＰＳ細胞を産生させることを可能にするという理
由で、重要である。
【００５３】フィーダー細胞を含まない環境においてｐ
ＰＳ細胞を培養することは、多数の重要な利点を有す
る。例えば： ・ｐＰＳ細胞およびその誘導体の産生は、商業的産生に
まで、より容易に拡大縮小可能である。培養を支持する
ために、継続中の基準でフィーダー細胞を産生する必要
がなく、そして細胞の継代が機械的に行われ得る。 ・細胞の方向付けられた前駆体への分化または最終的に
分化した細胞への分化が、フィーダーを含まない培養物
中で促進される。フィーダーを含まない培養物から形成
される胚様体は、より一貫した細胞集団を産生する。あ
るいは、直接的な分化が、フィーダーを含まない幹細胞
を、適切な固相支持体上に直接プレーティングすること
によって、行われ得る。条件に依存して、顕著に均一な
細胞集団が、得られ得る。 ・フィーダーを含まずにｐＰＳ細胞を生成し得ること、
そして培地を馴化するためにヒト細胞を使用すること
は、規制の調査の展望から魅力的である−ｐＰＳ細胞
は、培養物中に、異種成分および他の細胞由来の癌性起
源の成分を含まない。 ・薬剤、毒素または可能性のある分化モジュレーターの
スクリーニングもまた促進される。物質が、培養物を支
持するために使用されるフィーダー細胞に対する二次的
な効果を伴わずに、培養培地に添加され得る。 ・高い質のｍＲＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーが、フ
ィーダーを含まないｐＰＳ細胞培養物を使用して容易に
産生され得る。培養物面積１ｃｍ2あたりのｍＲＮＡの
収量が、より高い。このライブラリーは、フィーダー細
胞からの転写物（異なる種または異なるヒト遺伝子型の
ｃＤＮＡ）の混入がなく、そして発現パターンは、９０
％程度の高い未分化ｐＰＳ細胞表現型を反映し得る。発
生の間に調節される遺伝子の全長ｃＤＮＡが富化された
サブトラクションライブラリーもまた、得られ得る。 ・フィーダー細胞を含まない培養物の遺伝子トランスフ
ェクションは、トランスフェクションされた細胞の薬物
耐性マーカーによる選択を促進し、そしてかなりより高
いレベルの一過性発現を生じる。薬物耐性フィーダー
上、またはフィーダーを含まない培養物上のいずれにお
いても、ｐＰＳ細胞を分化させることなくｐＰＳ細胞を
遺伝的に改変する方法が見出された。フィーダーを含ま
ない系は、トランスフェクションの効率を改善するとい
うさらなる利点を有する。モデル実験において、フィー
ダーを含まない培養物中の約１５％の細胞がマーカー遺
伝子でトランスフェクションされ、一方、初代フィーダ
ー層におけるトランスフェクション効率は、代表的に
は、ポジィティブであった初代フィーダー層上でトラン
スフェクトされた未分化ｈＥＳ細胞のほんの５％のみで
あり、このことは、トランスフェクション効率が、フィ
ーダーを含まない培養条件を用いて有意に増強されるこ
とを示す。
【００５４】本発明において提供される技術は、研究お
よび治療使用のための、多能性幹細胞の可能性のある使
用における重要な進歩を示す。本発明のさらなる進歩
が、以下の節から理解される。
【００５５】（定義）プロトタイプの「霊長類多能性幹
細胞」（ｐＰＳ細胞）は、受精後の任意の時点の前胚性
組織、胚性組織、または胎児組織由来の多能性細胞であ
り、正常な条件下で、いくつかの異なる細胞型の子孫を
産生し得る特徴を有する。ｐＰＳ細胞は、当該分野で受
け入れられている標準的試験（例えば、適切な宿主内で
奇形腫を形成する能力）に従って、３つの胚層（内胚
葉、中胚葉、および外胚葉）の各々の誘導体である子孫
を生成し得る。
【００５６】ｐＰＳ細胞の定義に含まれるものは、Ｔｈ
ｏｍｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１
９９８）によって記載されるようなヒト胚性幹（ｈＥ
Ｓ）細胞；Ｔｈｏｍｓｏｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７８４４、１９９５；
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３８：
１３３、１９９８）によって記載されるアカゲザルまた
はマーモセットの幹細胞のような他の霊長類の由来の胚
性幹細胞；およびＳｈａｍｂｌｏｔｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２
６、１９９８）において記載されるヒト胚性生殖（ｈＥ
Ｇ）細胞によって例示される種々の型の胚細胞である。
多能性細胞の他の型もまた、この用語に含まれる。胚性
組織由来であるか、胎児組織由来であるかまたは他の供
給源由来であるかにかかわらず、３つの生殖層の全ての
誘導体である子孫を産生し得る霊長類起源の任意の細胞
が含まれる。本発明の多くの実施形態について、核型が
正常であり、悪性供給源由来でないｐＰＳ細胞を使用す
ることが、有利である。
【００５７】ｐＰＳ細胞培養物は、集団中の幹細胞およ
びその誘導体のかなりの割合が、それらを胚起源または
成体起源の分化した細胞と明らかに区別する、未分化細
胞の形態学的特徴を示す、「未分化」または「実質的に
未分化」として記載される。未分化のｐＰＳ細胞は、当
業者によって容易に認識され、そして高い核／細胞質の
比および目立った核小体を有し、顕微鏡視野において２
次元で代表的に現れる。集団内の未分化細胞のコロニー
が、分化した隣接細胞によってしばしば囲まれることが
理解される。それにもかかわらず、その集団が適切な条
件下において培養または継代される場合、未分化のコロ
ニーが存続し、そして、個々の未分化細胞は、細胞集団
のかなりの割合を構成する。実質的に未分化である培養
物は、少なくとも２０％の未分化ｐＰＳ細胞を含み、そ
して（未分化である同一の遺伝子型を有する細胞の百分
率に関する）優先性を増加するために、少なくとも４０
％、６０％または８０％を含み得る。本開示において記
載される方法を使用して、実質的に未分化である培養物
中に、比較的低い割合（５％または１０％程度の低さで
さえある）の分化したｐＰＳ細胞を含む培養物を生じる
か、または継代することが、時として可能である。
【００５８】本開示において、培養物または細胞集団が
「分化することなく」増殖するといわれる場合は常に、
増殖後に、組成物が上記の定義に従って実質的に未分化
であることを意味する。分化することなく少なくとも４
回の継代（約２０回の倍増）を通じて増殖する集団は、
起源の培養物と同程度のコンフルエンスにおいて評価し
た場合、実質的に同じ割合（または、可能性として、よ
り高い割合の未分化細胞）の未分化細胞を含む。
【００５９】「フィーダー細胞」または「フィーダー」
は、別の型の細胞と同時培養され、第二の型の細胞が増
殖し得る環境を提供する１つの型の細胞である。フィー
ダー細胞は、必要に応じて、支持する細胞と異なる種由
来である。例えば、ｐＰＳ細胞の特定の型が、本開示に
おいて以下に記載されるように、マウス胚性線維芽細
胞、不死化マウス胚性線維芽細胞、またはｈＥＳ細胞か
ら分化したヒト線維芽細胞様細胞の初代培養物によって
支持され得る。ｐＰＳ細胞との同時培養において、フィ
ーダー細胞は、照射または抗有糸分裂薬剤（例えば、マ
イトマイシンｃ）での処理によって代表的に不活化さ
れ、フィーダー細胞が支持する細胞よりも増殖すること
を防ぐ。馴化培地の生成における使用のために、細胞の
不活化は任意であり得、そして部分的に培地産生の機械
的な局面に依存する。
【００６０】ｐＰＳ細胞集団は、ｐＰＳ細胞がｐＰＳの
増殖を支持するための新鮮なフィーダー細胞が添加され
ない分割の後に少なくとも１回増殖した場合、フィーダ
ー細胞を「実質的に含まない」といわれる。フィーダー
細胞を含有する以前の培養物が、新鮮なフィーダーが添
加されない培養物についてのｐＰＳの供給源として使用
される場合、継代を生き残るいくつかのフィーダー細胞
が存在することが、認識される。例えば、ｈＥＳ細胞
が、ほぼコンフルエンスの約３７５，０００個の照射さ
れた初代胚性線維芽細胞の表面上の９．６ｃｍ2ウェル
中に、しばしば培養される。培養の終了までに、おそら
く１５０，０００個のフィーダー細胞が、なお生存可能
であり、そして分割され、そして約１００万〜１５０万
の数に増殖したｈＥＳとともに継代される。１：６分割
の後、ｈＥＳ細胞は、一般に増殖を再開するが、線維芽
細胞は増殖せず、そして培養の約６日の終了までに、ほ
んの少しの割合のみが生存可能である。この培養物は、
フィーダー細胞を本質的に含まず、組成物は、約５％未
満のフィーダー細胞を含む。１％、０．２％、０．０５
％、または０．０１％未満（培養物中の総細胞の％とし
て示す）のフィーダー細胞を含む組成物が、ますますよ
り好ましい。
【００６１】本開示において、培養物または細胞集団
が、「フィーダーを含まない」といわれる場合は常に、
上記の定義に従って（明示的に必要とされる場合、さら
なる拘束にのみ供される）、組成物が、フィーダー細胞
を本質的に含まないことを意味する。
【００６２】「増殖環境」は、目的の細胞がインビトロ
において増殖する環境である。環境の特徴としては、細
胞が培養される培地、温度、Ｏ2分圧およびＯ2、ならび
に存在する場合、支持する構造（例えば、固体表面上の
基板）が挙げられる。
【００６３】「栄養培地」は、増殖を促進する栄養を含
有する、細胞培養のための培地である。栄養培地は、適
切な組み合わせにおいて以下の任意のものを含有し得
る：等張生理食塩水、緩衝液、アミノ酸、抗生物質、血
清または血清置換物、および外来的に添加された因子。
「馴化培地」は、培地中に第１の集団の細胞を培養し、
次に培地を回収することによって調製される。次に、馴
化培地（細胞によって培地中に分泌される任意のものと
ともに）を使用して、第２の集団の細胞の増殖を支持し
得る。
【００６４】「制限された発生系列細胞」は、胚組織に
由来する（代表的には、ｐＰＳ細胞の分化または部分的
分化による）細胞である。これらの細胞は、増殖し得、
そしていくつかの異なる細胞型に分化し得るが、そのレ
パートリーの範囲は制限されている。例は、血球型につ
いて多能性である造血細胞、ならびに類洞内皮細胞、肝
細胞、および可能性のある他の肝細胞について多能性で
ある肝細胞前駆体である。別の例は、オリゴデンドロサ
イトおよびアストロサイトへと発達するグリア細胞前駆
体、ならびにニューロンへと発達するニューロン前駆体
を生成し得る神経制限細胞である。
【００６５】用語「ポリヌクレオチド」とは、任意の長
さのヌクレオチドのポリマー性形態をいう。含まれるも
のは、遺伝子および遺伝子フラグメント、ｍＲＮＡ、ｔ
ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリ
ヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベ
クター、単離されたＤＮＡおよびＲＮＡ、核酸プロー
ブ、ならびにプライマーである。本開示において使用さ
れる場合、用語ポリヌクレオチドとは、互換可能に、二
本鎖分子および一本鎖分子をいう。他に特定されるか、
または必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本
発明の任意の実施形態は、二本鎖形態、ならびに二本鎖
形態を作製することが公知であるかまたは予測される２
つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を含む。同一性の
程度について、ポリヌクレオチド間で比較がなされる場
合、相補的鎖が容易に生成され、比較されるポリヌクレ
オチド間での同一性の程度を最大化するセンス鎖または
アンチセンス鎖が選択されるか、または予測されること
が、無条件に理解される。配列同一性の百分率は、第１
に、試験されるポリヌクレオチドを参照対応物と整列
し、次に、明らかな挿入または欠失の存在についてのペ
ナルティーを用いずに、比較される配列間で共有される
残基の数を、試験をする領域の百分率として計数するこ
とによって計算される。
【００６６】「制御エレメント」または「制御配列」
は、ポリヌクレオチドの機能的調節（例えば、複製（ｒ
ｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、複製（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎ）、転写、スプライシング、翻訳、またはポリヌクレ
オチドの分解）に寄与する分子の相互作用に関与するヌ
クレオチド配列である。転写制御エレメントとしては、
プロモーターおよびエンハンサーが挙げられる。
【００６７】遺伝子エレメントは、その遺伝子エレメン
トがその予測された機能に従った様式において作動する
ことを許容する構造的関係にその遺伝子エレメントがあ
る場合、「作動可能に連結」される。例えば、プロモー
ターは、そのプロモーターがコード配列の転写の開始を
補助する場合、コード領域に作動可能に連結される。こ
の機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード
配列との間に介在配列が存在し得る。
【００６８】「クローニングベクター」は、宿主細胞に
おいて、ビヒクル中に挿入された配列の複製を許容する
ポリヌクレオチドビヒクル（例えば、プラスミド、バク
テリオファージ、または植物ウイルスもしくは動物ウイ
ルス）である。ｃＤＮＡライブラリーの場合、複製した
ベクターは、複数の遺伝子から転写された不均一のｍＲ
ＮＡ調製物からコピーされた異種ポリヌクレオチド挿入
物を含む。挿入物が、宿主細胞において、タンパク質レ
ベルまたはｍＲＮＡレベルにおいて挿入物の発現を許容
する転写調節制御エレメントに作動可能に連結される場
合、ビヒクルはまた、「発現ベクター」といわれ得る。
【００６９】用語「ポリペプチド」、「ペプチド」およ
び「タンパク質」は、本開示において互換可能に使用さ
れ、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリ
マーは、改変されたアミノ酸を含み得、直鎖状であって
も分岐していてもよく、そして非アミノ酸によって中断
され得る。配列同一性の百分率は、第１に、試験される
ポリペプチドを参照対応物とまたはプロトタイプと整列
し、次に、挿入または欠失の存在についてのペナルティ
ーを用いずに、比較される配列間で共有される残基の数
を、試験をする領域の百分率として計数することによっ
てポリペプチドについて計算される。置換がなされる場
合、保存的置換（１つのアミノ酸が、類似の電荷、サイ
ズ、疎水性、または芳香族性を有する別のアミノ酸によ
って置換される）が代表的により良好に許容される。所
望の配列は、プロトタイプの機能を保つ：例えば、酵素
活性、特異的基質の結合、および標準的な競合的阻害イ
ムノアッセイにおいて検出可能なような特異的抗体の結
合。
【００７０】ポリヌクレオチドが、人工的操作の任意の
適切な手段によって細胞中に移入された場合、または細
胞が、そのポリヌクレオチドを遺伝によって受け継い
だ、初めに改変された細胞の子孫である場合、その細胞
は、「遺伝子改変された」、「トランスフェクトされ
た」、または「遺伝子形質転換された」といわれる。ポ
リヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする転写
可能な配列（細胞が、上昇したレベルのタンパク質を発
現するのを可能にする）をしばしば含む。内在的遺伝子
の作用を、機能的に改変するか、または廃止することを
生じる任意の手段による遺伝子改変がまた、含まれる。
【００７１】遺伝子改変は、改変された細胞の子孫が、
同一の改変を有する場合、「遺伝性」といわれる。遺伝
子改変が遺伝性であるか否かの決定は、ポリヌクレオチ
ド鋳型の存在の検出（例えば、ＰＣＲ増幅による）によ
るか、または現れる遺伝的改変に依存する表現型の特徴
（例えば、遺伝子産物の発現、もしくはその効果）の検
出によって、なされ得る。
【００７２】遺伝子改変は、少なくとも４回の細胞複製
を通して遺伝可能である場合（第７世代の細胞において
ポリヌクレオチド鋳型の存在として検出可能）、「安
定」だといわれる。表現型の発現（ｍＲＮＡレベル、タ
ンパク質レベル、または機能的レベルにおいて）は、第
７世代の細胞における表現型の特徴が、親の遺伝子改変
細胞における表現型の特徴の少なくとも１０％（そして
しばしば少なくとも５０％）の場合、「安定」だといわ
れる。安定な発現は、遺伝子改変もまた、安定であるこ
とを示す。遺伝子改変は、ポリヌクレオチド鋳型が、７
回目の細胞分裂によって、最初の遺伝子改変された細胞
の子孫に存在しない場合、「一過性」だといわれる。表
現型の発現は、第７世代細胞における表現型の特徴が、
最初に遺伝子改変された細胞における表現型の特徴の５
％以下である場合に（鋳型の損失に起因しようと、また
はその鋳型の発現を阻害するある機構のためであろう
と）、「一過性」だといわれる。
【００７３】「細胞株」は、少なくとも１０回の継代を
通じて培養物中で増殖し得る細胞の集団である。この集
団は、表現型において均一であり得るか、またはその集
団は、測定可能に異なる表現型の混合物であり得る。細
胞株の特徴は、全体として１０回の継代の後に本質的に
不変である、集団の特徴である。
【００７４】細胞は、細胞が、細胞中でＴＥＲＴが転写
されそして翻訳されるような様式において、任意の種の
テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）をコードする核酸
を用いて遺伝子改変される場合、「テロメラーゼ化され
た」と記載される。この用語はまた、ＴＥＲＴのコード
領域を上昇したレベルで発現する能力を遺伝によって受
け継いだ、最初に遺伝子改変された細胞の子孫に適用さ
れる。ＴＥＲＴコード配列は、代表的には、哺乳動物Ｔ
ＥＲＴ遺伝子（以下に記載されるように、ヒトおよびマ
ウスのＴＥＲＴによって例示される）から取り出される
か、または適用される。
【００７５】細胞株は、細胞株が以下の性質の少なくと
も１つを有する場合、「永久」または「不死化」と記載
される：１）（例えば、ＴＲＡＰアッセイにおける増加
したテロメラーゼ活性として）検出可能な、テロメラー
ゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の上昇した発現について、遺
伝子改変されている；２）別の状態では１５回以下の集
団の複製を行い得ない細胞株について、適切な培養条件
下で、少なくとも２０回の集団の複製にまで、その複製
能力を伸ばすように遺伝子改変されている；または３）
別の状態では１５回を超えた集団の複製を行い得る細胞
株について、代表的な培養条件下で、細胞株の複製能力
を有意に伸ばすように遺伝子改変されている。この定義
を満たす細胞として、初めに遺伝子改変された細胞のみ
ではなく、列挙された判定基準を満たすような細胞の全
ての子孫も挙げられることが理解される。
【００７６】本開示において使用される場合、用語「抗
体」とは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体の両方をいう。この用語の境界は、意図的に、インタ
クトな免疫グロブリン分子のみならず、免疫グロブリン
分子のフラグメントおよび誘導体（例えば、単鎖Ｆｖ構
築物）、ならびに当該分野において公知の技術によって
調製され得、そして所望の抗原結合特異性を保持する、
Ｔ細胞レセプターのような免疫グロブリンの等価物のフ
ラグメントおよび誘導体を包含する。
【００７７】（一般的技術）本発明の実施において有用
な一般的技術をさらに精巧にするために、実施者は、細
胞生物学、組織培養、および発生学の標準的な教科書お
よび総説を参照し得る。これらには、Ｔｅｒａｔｏｃａ
ｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔ
ｅｍ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒ
ｏａｃｈ（Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編、ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ Ｌｔｄ．１９８７）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｔ
ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ Ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎら編、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎ
ｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔ
ｉｏｎ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ、Ｍｅ
ｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００、１９９３）；
Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｕｓｅｓ ｏｆＥｍｂ
ｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｐｒｏｓｐｅｃ
ｔｓ ｆｏｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｕｍａ
ｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎら、１９９３）が含まれ
る。幹細胞の分化は、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｍｅｔｈ．
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７５：１７３、１９９７；および
Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅ
ｖ．１０：３１、１９９８に概説される。
【００７８】分子遺伝学および遺伝子操作の方法は、一
般に、現在の版のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋら）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）；Ａｎｉｍａ
ｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎ
ｅｙ編）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ
ｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌ
ｌｅｒおよびＣａｌｏｓ編）；ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙおよびＳｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第三版（Ｆ．Ｍ．Ａ
ｕｓｕｂｅｌら編）；およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ＤＮＡＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｒ．Ｗｕ編、Ａｃａｄ
ｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）に記載される。本開示において
参照される遺伝子操作のための試薬、クローニングベク
ター、およびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびＣｌｏｎＴｅｃ
ｈのような市販業者から入手可能である。
【００７９】ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーの調
製およびそれらの分析に関与する一般的な技術につい
て、当業者は、ＲＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ：
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｉｓ
ｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ
ｉｏｎ（Ｒ．Ｅ．Ｆａｒｒｅｌｌ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰ
ｒｅｓｓ、１９８８）；ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＣｏｗｅｌｌおよびＡｕｓｔｉｎ
編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）；Ｆｕｎｃｔｉｏｎａ
ｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（ＨｕｎｔおよびＬｉｖｅｓｅｙ
編、２０００）；ならびにＡｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ
ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ（Ｅ Ｌａｎｄｅｒ編、Ａｎｎｕａｌ Ｒ
ｅｖｉｅｗによって毎年刊行）を利用できる。技術はま
た、他の発現ライブラリーの記載から推論され得る。例
えば、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｅｍｂｒｙｏｎｉ
ｃＭｏｕｓｅ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（米国特許第５，７
８９，１５８号）；Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒ
ａｔｉｎｇ ａ Ｓｕｂｔｒａｃｔｅｄ ｃＤＮＡＬｉ
ｂｒａｒｙ（米国特許第５，６４３，７６１号）；Ｃｏ
ｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＷＯ９５／２０６８１、Ｉｎｃｙ
ｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；Ａ Ｇｅｎ
ｅ Ｔｒａｐ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｉｎ Ｍｏｕｓｅ
Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（Ｓｋａｒ
ｎｅｓら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：９０３、１９９
２）；Ｓａｓａｋｉら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４９：１６
７、１９９８；Ａｄｊａｙｅら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４
６：３３７、１９９７；Ｎｉｓｈｉｇｕｃｈｉら、Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１９：７４９、１９９６；および
Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１６３
５、２０００。
【００８０】抗体を、惹起、精製および改変するために
用いられる一般的な技術、ならびに免疫細胞化学を含む
免疫アッセイの設計および実行について、読者は、Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＷｅｉｒおよびＢｌａｃｋｗｅｌｌ
編）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＩｍ
ｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｃｏｌｉｇａｎら編）；ならびにＭ
ｅｔｈｏｄｓ ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ（Ｍａｓｓｅｙｅｆｆら編、Ｗｅｉｎｈｅ
ｉｍ：ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓ ＧｍｂＨ）を参照す
る。
【００８１】細胞培養および培地収集における一般技術
は、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃ
ｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉ
ｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：１４８、１９９７）；
Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ Ｍｅｄｉａ（Ｋ．Ｋｉｔａｎ
ｏ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：７３、１９９
１）；Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ
Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：３７５、１９９１）；およびＳ
ｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｍａｍｍ
ａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈら、Ｂｉｏｐｒｏ
ｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９：２５１、１９９０）
において要点が述べられる。他の興味深い読み物として
は、Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｍｅｄｉａ．（Ｍ．
ＭｃＬｕｈａｎ、Ｍｅｎｔｏｒ ＮＹ、１９６４）およ
びＴｈｅ Ｍｅｄｉｕｍ ｉｓ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇ
ｅ（Ｍ．ＭｃＬｕｈａｎおよびＱ．Ｆｉｏｒｅ、Ｂａｎ
ｔａｍ ＮＹ、１９６７）が挙げられる。
【００８２】（多能性幹細胞の供給源）本発明に従う培
養および分化のために適切な供給源細胞としては、妊娠
の後に形成された組織由来の多能性細胞の樹立株が挙げ
られる。例示的な初代組織供給源は、胚性組織（例え
ば、胚盤胞）、または妊娠の間の任意の時間に採取され
た胎児組織（代表的には妊娠１０週前であるが、その必
要はない）である。非限定的な例は、霊長類胚性幹（Ｅ
Ｓ）細胞および胚性生殖（ＥＧ）細胞の樹立株である。
そのような細胞の最初の樹立または安定化の間の本開示
の技術の使用もまた意図される。この場合、供給源細胞
は、列挙された組織から直接採取された初代多能性細胞
である。
【００８３】（培地およびフィーダー細胞）ｐＰＳ細胞
を単離し、そして増殖するための培地は、得られる細胞
が所望の特徴を有し、そしてさらに増殖し得る限り、任
意のいくつかの異なる処方を有し得る。適切な供給源
は、以下のとおりである：ダルベッコ改変イーグル培地
（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１１９６５−０９２；ノ
ックアウトダルベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥ
Ｍ）、Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２９−０１８；２００ｍＭ
Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ ＃１５０３９−０２７；
非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ ＃１１１４０−０５
０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５２
２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。例示的な血清
含有ＥＳ培地は、８０％ ＤＭＥＭ（代表的にはＫＯ
ＤＭＥＭ）、２０％ 非熱非働化規定ウシ胎仔血清（Ｆ
ＢＳ）、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グ
ルタミン、および０．１ｍＭ β−メルカプトエタノー
ルを用いて作製される。この培地を濾過して、２週間以
内４℃で保存する。血清を含まないＥＳ培地を、８０％
ＫＯ ＤＭＥＭ、２０％血清置換物、０．１ｍＭ 非
必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、および０．１
ｍＭ β−メルカプトエタノールを用いて作製する。全
ての血清置換物が作用するわけではない；効果的な血清
置換物は、Ｇｉｂｃｏ ＃１０８２８−０２８（専売特
許の処方；製品は、製造業者より入手可能）である。培
地を濾過して、２週間以内４℃で保存する。使用直前
に、ヒトｂＦＧＦを、最終濃度４ｎｇ／ｍＬで添加す
る。
【００８４】ｐＰＳ細胞は、代表的には、種々の方法に
おいてｐＰＳ細胞を支持する（例えば、ｐＰＳ細胞の生
存もしくは増殖を促進するかまたは分化を阻害する可溶
性因子の産生）フィーダー細胞の層上で培養する。フィ
ーダー細胞は、代表的には線維芽細胞型細胞であり、し
ばしば、胚組織または胎児組織由来である。頻繁に使用
される供給源は、マウス胚である。有用なフィーダー細
胞株は、胚性線維芽細胞を得て、それらをトランスフェ
クトしてテロメラーゼを発現させ、次にそれらを継代す
るかまたは将来の使用のために冷凍することによって得
られた。細胞株をほぼコンフルエントにまでプレーティ
ングし、照射して増殖を防ぎ、ｐＰＳ細胞培養を支持す
るために使用する。
【００８５】１つの例において、ｐＰＳ細胞を、最初に
誘導し、そして初代胚性線維芽細胞上で支持する。マウ
ス胚性線維芽（ｍＥＦ）細胞は、異系交配ＣＦ１マウス
（ＳＡＳＣＯ）または他の適切な株から得られ得る。妊
娠１３日目のマウスの腹部を、７０％エタノールでふき
取り、そして脱落膜をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）中に取り除く。胚を回収し；胎盤、膜、および軟組
織を取り除く；そして死体をＰＢＳで二回洗浄する。次
に、これらを、２ｍＬ トリプシン／ＥＤＴＡを含む新
鮮な１０ｃｍの細菌ディッシュに移し、微細に細分化す
る。５分間３７℃でのインキュベートの後、トリプシン
を、１０％のＦＢＳを含有する５ｍＬのＤＭＥＭで不活
化し、そして混合物を１５ｍＬの円錐チューブに移す。
砕片を２分間沈降させ、上清を１０ｍＬの最終容量と
し、そして１０ｃｍの組織培養プレート上またはＴ７５
フラスコ上にプレーティングする。このフラスコを、攪
拌せずに２４時間インキュベートし、その後、培地を置
きかえる。フラスコがコンフルエントである時に（約２
〜３日）、細胞を、新しいフラスコに１：２に分割す
る。
【００８６】フィーダー細胞をｍＥＦ培地（９０％ Ｄ
ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＃１１９６５−０９２）、１０％
ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ ＃３００７１−０３）、お
よび２ｍＭ グルタミンを含む）中で増殖させる。ｍＥ
ＦをＴ１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ ＃４３０８２
５）において増殖させ、一日おきに細胞をトリプシンで
１：２に分割し、細胞をコンフルエント以下に保つ。フ
ィーダー細胞層を調製するために、細胞を、増殖を阻害
するが、ｈＥＳ細胞を支持する重要な因子の合成を許容
する線量（約４０００ラドのγ線照射）で照射する。６
ウェルの培養プレート（例えば、Ｆａｌｃｏｎ ＃３０
４）を、１ウェルあたり１ｍＬの０．５％ゼラチンを用
いて一晩３７℃でインキュベーションすることによって
コートし、そして１ウェルあたり３７５，０００個の照
射されたｍＥＦをプレーティングする。フィーダー細胞
層を、プレーティングの５時間〜４日後に使用する。ｐ
ＰＳ細胞を播種する直前に、培地を、新鮮なｈＥＳ培地
で置換する。
【００８７】（ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞の調製）ヒト
胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、Ｔｈｏｍｓｏｎら（米国特許
第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１
１４５、１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏ
ｌ．３８：１３３頁以降、１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、 ９２：７８４４、１
９９５）によって記載されるように調製し得る。
【００８８】手短には、ヒト胚盤胞を、ヒトのインビボ
着床前胚から得る。あるいは、インビトロで受精した
（ＩＶＦ）胚を使用し得るか、または１細胞期のヒト胚
を、胚盤胞段階まで増殖させ得る（Ｂｏｎｇｓｏら、Ｈ
ｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ４：７０６、１９８９）。ヒト胚
を、Ｇ１．２培地およびＧ２．２培地中で胚盤胞段階ま
で培養する（Ｇａｒｄｎｅｒら、Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅ
ｒｉｌ．６９：８４、１９９８）。発生した胚盤胞を、
ＥＳ細胞単離のために選択する。透明帯を、プロナーゼ
（Ｓｉｇｍａ）への手短な曝露によって胚盤胞から取り
除く。内部細胞塊を、免疫手術（ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｇ
ｅｒｙ）（胚盤胞を、１：５０希釈のウサギ抗ヒト脾臓
細胞抗血清に対して３０分間曝露し、次にＤＭＥＭ中で
５分間３回洗浄し、そして１：５希釈のモルモットの補
体（Ｇｉｂｃｏ）に３分間曝露する（Ｓｏｌｔｅｒら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
２：５０９９、１９７５を参照のこと））によって単離
する。ＤＭＥＭでの２回のさらなる洗浄後、溶解した栄
養外胚葉細胞をインタクトな内部細胞塊（ＩＣＭ）か
ら、緩やかなピペッティングによって取り除き、そして
ＩＣＭをｍＥＦフィーダー層上にプレーティングする。
【００８９】９〜１５日後、内部細胞塊誘導増殖は、１
ｍＭ ＥＤＴＡを伴うカルシウムおよびマグネシウムを
含まないリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に曝露する
ことによって、ディスパーゼまたはトリプシンに曝露す
ることによって、またはマイクロピペットを用いる機械
的解離のいずれかによって、凝集塊に解離され、次い
で、新鮮培地中のｍＥＦ上に再移植される。解離された
細胞は、新鮮なＥＳ培地におけるｍＥＦフィーダー層上
に再移植され、そしてコロニー形成について観察され
る。未分化な形態を示すコロニーは、個々にマイクロピ
ペットにより選択され、機械的に凝集塊に解離され、そ
して再移植される。ＥＳ様形態は、明らかに高い核対細
胞質比および顕著な仁を有する緻密なコロニーとして特
徴付けられる。次いで、生じたＥＳ細胞は、短時間のト
リプシン処理、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰＢＳ（カルシウ
ムもマグネシウムも伴わず、２ｍＭ ＥＤＴＡを伴う）
への曝露、ＩＶ型コラゲナーゼ（約２００Ｕ／ｍＬ；Ｇ
ｉｂｃｏ）への曝露またはマイクロピペットによる個々
のコロニーの選択により１〜２週間毎に慣用的に分割さ
れる。凝集塊の大きさは、約５０〜１００細胞が最適で
ある。
【００９０】（ヒト胎児生殖（ｈＥＧ）細胞の調製）ヒ
ト胎児生殖細胞は、最後の月経期後、約８〜１１週目に
取得されたヒト胎児物質中に存在する始原生殖細胞から
調製され得る。適切な調製方法は、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９５：１３７２６、１９９８および米国特許第６，０９
０，６２２号において記載される。
【００９１】手短に言うと、生殖隆起を等張緩衝液でリ
ンスし、次いで、０．１ｍＬ ０．０５％トリプシン／
０．５３ｍＭナトリウムＥＤＴＡ溶液（ＢＲＬ）中に置
き、＜１ｍｍ3の厚切りにする。次いで、この組織を１
００μＬチップを介してピペッティングし、さらに細胞
をばらばらにする。それを３７℃で約５分間インキュベ
ートし、次いで、約３．５ｍＬ ＥＧ増殖培地を添加す
る。ＥＧ増殖培地は、ＤＭＥＭ、４５００ｍｇ／Ｌ Ｄ
−グルコース、２２００ｍｇ／Ｌ ｍＭ 炭酸水素ナト
リウム；１５％ＥＳ条件付きウシ胎児血清（ＢＲＬ）；
２ｍＭグルタミン（ＢＲＬ）；１ｍＭピルビン酸ナトリ
ウム（ＢＲＬ）；１０００〜２０００Ｕ／ｍＬ ヒト組
換え白血病阻害因子（ＬＩＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；１〜
２ｎｇ／ｍｌヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ
ＦＧＦ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）；および１０μＭフォルスコ
リン（１０％ ＤＭＳＯ中）である。代替的アプローチ
において、ＥＧ細胞は、ヒアルロニダーゼ／コラゲナー
ゼ／デオキシリボヌクレアーゼを使用して単離される。
腸間膜を伴う生殖腺原基または生殖隆起が、胎児物質か
ら切り出され、この生殖隆起をＰＢＳにてリンスし、次
いで、０．１ｍｌＨＣＤ消化溶液（０．０１％ヒアルロ
ニダーゼＶ型、０．００２％デオキシリボヌクレアーゼ
Ｉ、０．１％コラゲナーゼＩＶ型、すべてはＥＧ増殖培
地において調製されるＳｉｇｍａ由来である）中に置
く。組織をみじん切りにし、そして３７℃において１時
間または一晩インキュベートし、１〜３ｍＬのＥＧ増殖
培地中に再懸濁し、そしてフィーダー層にプレートす
る。
【００９２】９６ウェル組織培養プレートが、ＬＩＦ、
ｂＦＧＦまたはフォルスコリンを含まない改変されたＥ
Ｇ増殖培地において３日間培養されたフィーダー細胞の
コンフルエント未満の層とともに調製され、５０００ｒ
ａｄ γ−照射で不活性化される。適切なフィーダーは
ＳＴＯ細胞である（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５０
３）。約０．２ｍＬの１次生殖細胞（ＰＧＣ）懸濁液を
各ウエルに添加する。第１の継代は、ＥＧ増殖培地にお
いて７〜１０日後行われ、各ウエルを、照射されたＳＴ
Ｏマウス線維芽細胞を用いて以前に調製された２４ウェ
ル培養皿の１ウェルに移す。この細胞を、形態学的にＥ
Ｇ細胞と一致する細胞が観察されるまで毎日培地を交換
して培養する（代表的には７〜３０日後または１〜４継
代後）。
【００９３】（フィーダー細胞の非存在下におけるｐＰ
Ｓ細胞の増殖）ｐＰＳ細胞は、分化を促進することを伴
わずに増殖を支持する培養条件の組み合わせを使用し
て、培養において連続的に増殖され得る。ｈＥＳ細胞
は、フィーダー細胞の非存在下においてさえも、分化を
伴わずに増殖され得ることが決定されてきた。フィーダ
ーを含まない培養に関して、適合性の培養表面（基質）
およびフィーダー細胞により提供される影響のいくつか
を与える栄養培地を提供することは有益である。
【００９４】フィーダーを含まないｐＰＳ培養のための
基質として特に適切なものは、細胞外マトリックス成分
である（基底膜由来か、または接着分子レセプターリガ
ンドカップリングの一部を形成する）。市販の調製物
は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）という名前でＢｅｃ
ｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎより入手可能であり、そし
て通常の、または増殖因子を減少させた（Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｅｒ Ｒｅｄｕｃｅｄ）処方物において得ら
れ得る。両方の処方物は、効果的である。Ｍａｔｒｉｇ
ｅｌ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ
−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞由来の可溶性の調製物であり、再
構成された基底膜を室温にて形成するゲルである。
【００９５】他の細胞外マトリックス成分および成分の
混合物は、代替物として適切である。増殖される細胞型
に依存して、細胞外マトリックスは、ラミニン、フィブ
ロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラ
ン硫酸塩など、単独で、または種々に組み合わせたもの
を含む。ラミニンは、脊椎動物におけるすべての基底膜
の主要成分であり、これはインテグリンのヘテロダイマ
ー(例えば、α６β１およびα６β４（ラミニンに対し
て特異的である））および他のヘテロダイマー（他のマ
トリックスと交叉反応する）と相互作用する。実施例に
おいて例示される培養条件を使用すると、コラーゲンＩ
Ｖは、ｈＥＳ細胞増殖を支持するが、コラーゲンＩは支
持しない。本明細書中に記載される実験手順を使用して
試験され得る基質としては、他の細胞外マトリックス成
分だけでなく、ポリアミン（例えば、ポリオルニチン、
ポリリジン）および他の市販の被覆剤が挙げられる。
【００９６】多能性細胞を、適切な分布ならびに細胞の
生存、増殖、および所望の特徴の保持を促進する培地の
存在下において基質上にプレートする。これらの特徴
は、接種分布に対する慎重な注意から利益を得る。この
分布の１つの特徴は、プレーティング密度である。少な
くとも、約１５，０００細胞ｃｍ-2のプレーティング密
度は、生存を促進し、かつ分化を制限することが見出さ
れてきた。代表的に、約９０,０００ｃｍ-2と約１７０,
０００ｃｍ-2との間のプレーティング密度が使用され
る。
【００９７】別の特徴は、細胞の分散である。マウス幹
細胞増殖は、細胞を単一細胞懸濁液に分散させることを
含む（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．７５：１７３，１９９７ １７７頁にて）。対照的
に、霊長類のＰＳ細胞を継代することは、以前は小さな
クラスターにおいて、その細胞をともに維持する必要が
あると思われていた。細胞が完全に分散する前に、酵素
消化を停止する（例えば、約５分、コラゲナーゼＩＶを
使用する）。次いで、そのプレートをピペットを用い
て、穏やかにはがし、そして、接着細胞の凝集塊（約１
０〜２０００細胞の大きさ）のように懸濁されるまでピ
ペットを用いて細胞を粉砕する。次いで、凝集塊をさら
なる分散を伴わずに直接基質の上にプレートする。
【００９８】適切な酵素および培地が選択され、そして
プレーティング密度が十分に高い場合、霊長類のＰＳ細
胞は、さらに細かい細胞の懸濁液としてフィーダーを含
まない培養をする傍ら、継代され得ることが現在発見さ
れている。説明の目的で、フィーダーの非存在下におい
て培養されたコンフルエントなヒト胚性幹細胞は、０．
０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）トリプシン（Ｇｉｂｃｏ）およ
び０．０５３ｍＭ ＥＤＴＡの溶液とともに５〜１５分
間３７℃にてインキュベートすることによってプレート
から除去される。ピペットを使用して、プレート内の残
りの細胞を取り出し、そしてその細胞を、単一細胞およ
びいくつかの小さなクラスターを含む懸濁液に分散され
るまでピペットを用いて粉砕する。次いで、この細胞を
５０，０００〜２００，０００細胞／ｃｍ2の密度にて
プレートして、生存を促進させ、かつ分化を制限する。
この技術により継代されたＥＳ細胞の表現型は、細胞が
コラーゲン消化によりクラスターとして収集される場合
に観察されるものと類似している。別の選択肢として、
この細胞は、そのプレートがコンフルエントになる前
に、酵素を伴わずに収集され得る。この細胞をＰＢＳ中
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ単独の溶液において約５分間イン
キュベートし、培養容器から洗浄し、次いで、さらなる
分散を伴わずに新しい培地にプレートする。
【００９９】新鮮なフィーダー細胞の非存在下において
プレートされたｐＰＳ細胞は、栄養培地において培養さ
れることから利益を得る。一般的に、この培地は、細胞
の生存を増強させる通常成分（等張緩衝液、必須無機
質、および血清または血清に代わる何かのいずれか）を
含む。フィーダー細胞により提供されるいくつかのエレ
メントを供給するように馴化された培地が特に有益であ
る。
【０１００】馴化培地は、血清を含まない培地（例え
ば、血清の代わりに２０％で追加されたＫＯ ＤＥＭＥ
および４ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ））において約５〜６×１０4ｃｍ-2の密度におい
て、照射された１次マウス胚性線維芽細胞（または別の
適切な細胞調製）を培養することにより調製され得る。
培養上清を約１日後に３７℃にて収集する。付着依存性
細胞を増殖するためのデバイスには、Ｔフラスコ、ロー
ラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ ｂｏｔｔｌｅ）、ガス透過
性バッグ（ｇａｓ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｂａｇ）、ホ
ローファイバーバイオリアクター（ｈｏｌｌｏｗ ｆｉ
ｂｅｒ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）、フラットベッドバイ
オリアクター（ｆｌａｔ−ｂｅｄ ｂｉｏｒｅａｃｔｏ
ｒ）、およびパラレルプレートバイオリアクター（ｐａ
ｒａｌｌｅｌ ｐｌａｔｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）が
挙げられる。この細胞が、３次元マトリクスに移される
場合、この細胞は、連続攪拌タンクバイオリアクターま
たはエアリフトバイオリアクターにおいて培養され得
る。
【０１０１】以下の実施例において例示されるように、
代表的に、１〜２日間馴化された培地を使用して、ｐＰ
Ｓ細胞培養を１〜２日間支持し、次いで、培地を交換す
る。この培地は、馴化された後、直接使用され得、それ
はそのまま、または抽出物として保存され得る（例え
ば、４℃にて、２、６、もしくは１４日間または−２０
℃にて凍結）。この培地をろ過する際には、注意が払わ
れるべきである。他のフィルターが活性を除去するよう
な場合、いくつかのフィルター（例えば、セルロースア
セテート２０μ非タンパク結合膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃４
３０７６９）が適切であり得る。初期の研究において、
代表的に培地は希釈されずに使用され得る。希釈の有効
性および他の操作が、この培地を用いて７日間以上ｐＰ
Ｓ細胞を維持すること、そしてこの培養物が未分化ｐＰ
Ｓ細胞に特有な特徴を維持するか否かを決定することに
より評価され得る。
【０１０２】所望される場合、馴化培地が、ｐＰＳ細胞
培養に利益を与えるさらなる増殖因子ともに使用する前
に追加され得る。ｈＥＳのために、増殖因子様ｂＦＧＦ
またはＦＧＦ−４がしばしば使用される。ｈＥＧのため
に、増殖因子様ｂＦＧＦ、ｇｐ１３０のインデューサー
（例えばＬＩＦまたはオンコスタチン−Ｍ）およびおそ
らく環状ＡＭＰレベルを上昇させる因子（例えば、フォ
ルスコリン）が増殖培地に追加され得る。他の型のｐＰ
Ｓ細胞は、培地中の他の因子（例えば、幹細胞因子（Ｓ
ｔｅｅｌ因子、ｃ−ｋｉｔリガンド）またはＩＬ−６）
から利益を獲得し得る。馴化する前にｂＦＧＦまたはＦ
ＧＦ−４のような増殖因子の両方をこの培地に添加し、
次いで、ｐＰＳ細胞の増殖を支持するためにこの培地を
使用する前に再びｂＦＧＦまたはＦＧＦ−４のような増
殖因子の両方をこの培地に添加することはしばしば有益
である。
【０１０３】本明細書中に記載される各条件が、独立し
て最適化され得、そして特定の条件の組み合わせが、さ
らなる試験に対して有効であると証明されることが認識
されるべきである。このような最適化は、慣用的な実験
の問題であり、この開示において提供される本発明の趣
旨から逸脱しない。
【０１０４】（馴化培地のために適切な細胞株）マウス
線維芽細胞の初代培養に対する代替物として、馴化培地
が、他の細胞型から調製され得る。テロメア化された胚
性線維芽細胞株および線維芽細胞の形態学的特徴を有す
る分化したｐＰＳ細胞が例示的である。
【０１０５】（馴化培地のための例示的な非ヒト細胞
株）代表的に、フィーダー細胞は、線維芽細胞型の細胞
を含む。１次胚細胞または胎性フィーダー細胞培養は、
細胞の混合された集団であり、線維芽細胞ならびに初期
の筋肉細胞および神経細胞の形態を有する細胞を含む。
その集団において異なる細胞は、ｐＰＳ培養を支持する
際に異なる役割を果たし得、そしてその培養の分布およ
び特徴が変化し得る。
【０１０６】より持続性のフィーダー細胞株が、非ヒト
種由来（例えば、マウス（先に記載されたように調製さ
れた））の胚性線維芽細胞を使用して本発明に従って培
地を産生するために開発され得る。この細胞は、遺伝的
に不死化遺伝子（例えば、テロメラーゼを発現する遺伝
子）で改変される。細胞をテロメア化し、そしてテロメ
ラーゼ活性を試験するための手順は、この開示において
後ほど見出され得る。
【０１０７】さらに、馴化培地のために使用される細胞
は、遺伝的に改変され、１つ以上のさらなる特徴を提供
する。例えば、スクリーニングの目的のために、１つ以
上の抗生物質（例えば、ネオマイシン、ハイグロマイシ
ン、またはピューロマイシン）に対する薬剤耐性遺伝子
とともに細胞が提供され得る（実施例８）。細胞は、マ
ーカー遺伝子（例えば、緑蛍光タンパク質（実施例
８）、βガラクトシダーゼまたは免疫単離のためにタグ
を提供する特定の細胞表面抗原（例えば、短縮型ＮＧＦ
レセプター）とともに提供され得る。細胞はまた、ｐＰ
Ｓ培養を支持するための培地の効力を提供する因子の生
合成および分泌のための遺伝子とともに提供され得る。
ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および本開
示において列挙される他の栄養補給剤が例示的である。
【０１０８】培地を馴化するために使用される細胞株の
複製能力を増加させるために、本開示の他のところで記
載されるように細胞株はテロメア化（さもなくば不死
化）され得る。
【０１０９】（馴化培地のための例示的なヒト細胞株）
ヒト胚由来細胞から分化した特定の特徴を有する細胞を
使用して、未分化ｐＰＳ細胞の培養を支持し得ることが
発見された。ヒト胚細胞由来の特定の線維芽細胞様細胞
（または間葉細胞）は、この特性を有し、そして先に記
載されたアッセイに従って同定され得る。
【０１１０】適切な細胞を得るための例示的な方法は、
ｐＰＳ細胞（例えば、ｈＥＳ細胞）の培養物を分化させ
ることを含む。特定の表現型を有する分化した細胞は、
混合された分化細胞の集団の中から選択され、そして選
択された細胞を用いて培養することにより馴化された培
地が、実質的にフィーダー細胞を含まない培養環境下に
おいてｐＰＳ細胞の増殖を支持するその能力について試
験される。
【０１１１】ｐＰＳの分化は、例えば、ドナーｐＰＳ細
胞培養物の過増殖によって、または胚様体（ＥＢ）を形
成させる低い接着特性を有する基質を有する培養容器内
でｐＰＳ細胞を培養することによって、最初に凝集体を
形成することにより開始され得る。胚様体は、懸濁培養
において作製され得る；未分化ｐＰＳ細胞は、短時間の
コラゲナーゼ消化によって収集され、クラスターに解離
され、そして非接着性細胞培養プレートにプレートされ
る。その凝集体は数日毎に培地が与えられ、次いで、適
切な期間の後、収集される（代表的に４〜８日間）。次
いで、この細胞は、培地馴化細胞の濃縮を促進する培地
において、および／または基質上で培養される。あるい
は、未分化ｐＰＳ細胞の懸濁液を調製し、次いで、培地
馴化細胞への調節された分化を促進する基板上に直接プ
レーティングすることにより、直接ｐＰＳ細胞を区別す
ることによって得られ得る。適切な基材は、ポリ陽イオ
ン性基質（例えば、ポリオルニチン、または細胞外マト
リックス）で被膜されたガラスまたはプラスチックのカ
バースリップを含む。
【０１１２】一旦、分化されると、その集団は、細胞が
発現するいずれかのマーカー（例えば、免疫標識および
蛍光分類によって、磁気ビーズによる分類によって、ま
たは夾雑細胞の免疫特異的溶解によって）に従って培地
馴化細胞について濃縮され得る。
【０１１３】ｈＥＳ細胞から分化した線維芽細胞様細胞
は、本発明に従う馴化培地について特に適切であること
が発見された。線維芽細胞様細胞が形態学的基準（特
に、結合組織において見出される線維芽細胞のものと類
似する細胞質プロセスを有する細胞の星状形態または紡
錘形態）によって認識され得る。細胞の線維芽細胞性質
のさらなる確認が、マーカーおよびその細胞の分泌産物
（例えば、コラーゲンマトリクス、コラゲナーゼ、およ
び線維芽細胞増殖因子の種々のアイソタイプ（特にｂＦ
ＧＦ））によって得られ得る。これらのマーカーは、転
写または翻訳レベルにおいて検出される。
【０１１４】次いで、分化したｐＰＳ細胞は、上記で概
要を述べられたアッセイに従って試験され得、分化した
ｐＰＳ細胞は、培地がフィーダーを含まない培養におけ
るｐＰＳ細胞増殖を支持するという様式において馴化培
地に適切であるか否かを決定する。
【０１１５】この様式においてｈＥＳから分化し、かつ
選択された細胞株は、代表的に、細胞培養において少な
くとも約３０日間複製し得る（実施例１２および１３；
図１２）。いくつかの実施形態において、その細胞は６
０日間または１２０日間複製する（約１０倍増、２５倍
増、または５０倍増）。高い複製能力は部分的である。
なぜなら、これらの細胞は、実質的に不死である幹細胞
から分化され、そして一次胚細胞と矛盾のない長さのテ
ロメアを有するためである。これらの細胞は、しばし
ば、さらなる適応を伴わずに馴化培地に適切である。所
望される場合、その細胞はまた、遺伝的に改変されて、
テロメラーゼ逆転写酵素を発現し得るか、さもなくば、
先に記載されるように不死化される。これは、老化を未
然に防ぎ、そして非改変化細胞の複製能力を超えて複製
能力を増加させ、これは、この培地の商業生産を促進
し、かつバッチ間の再現性を改善する。
【０１１６】必要に応じて、馴化培地に適した分化した
ヒトＰＳ細胞はさらに適応され得、例えば、前節におい
て記載されるように、遺伝的に細胞を改変して、増殖因
子様ｂＦＧＦを発現させるか、もしくはＴＥＲＴを発現
させるか、もしくはその細胞を不死化させることによっ
て適応され得る。
【０１１７】（それを産生するために馴化培地および細
胞を試験する工程）馴化培地は、ｐＰＳ細胞を初代マウ
ス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）（証明された標準）により
馴化された培地の代わりにフィーダーを含まない培養系
にスワップすることにより、ｐＰＳ細胞を支持する能力
について試験され得る。ｐＰＳ細胞が、実質的に未分化
な状態で増殖する場合、その馴化培地は、フィーダーを
含まない培養においてｐＰＳ細胞を支持するものとして
特徴づけられ得る。
【０１１８】ｐＰＳ細胞が分化するか否かを決定するた
めの都合良い方法は、そのコロニーの形態的特徴を理解
することである（以下に記載される）。このアッセイ方
法に従って、コンフルエント未満の培養物（代表的に、
継代約５日間後）における未分化ｐＰＳ細胞の割合が、
少なくとも、その馴化培地（必要に応じて、さらなる増
殖因子を追加されるか、そうでなければ適切な場合には
処理される）における４回の継代の間に実質的に減少し
ない場合、馴化培地はｐＰＳ細胞の増殖を支持し得ると
見なされる。
【０１１９】所望される場合、このアッセイの定量的読
み出しが得られ、この培地中のｐＰＳ細胞支持因子の質
または濃度を評価し得る。１つの例において、基礎培地
が、種々の期間（例えば、６時間、１２時間、２４時間
および４８時間）の間馴化され、そしてその馴化培地
は、連続２４時間の期間の間、フィーダーを含まないｐ
ＰＳ細胞培養物を支持するそれらの能力についてそれぞ
れ試験される。短い処理時間という理由のため、短い馴
化期間により有効性を与えられた培地が所望され得る。
別の例において、２４時間馴化された基礎培地が、ｐＰ
Ｓ培養を支持する能力について希釈分析により試験され
る（基礎培地における希釈工程、必要に応じて他の栄養
剤が追加される）。より大きな希釈の後に有効である培
地（例えば、１：１、１：２および１：４の馴化培地：
希釈培地）が、保存の容易性のために所望され得る。特
定の特徴の選択は、この適用に依存する。
【０１２０】細胞株は、適切な時間で基礎培地において
細胞を培養することにより、馴化培地を産生する能力に
ついて試験され得、次いで、上記のように、フィーダー
を含まないｐＰＳ細胞培養を支持する能力についてその
培地を試験する。馴化培地が、フィーダーを含まないｐ
ＰＳ培養物を支持しない場合、その馴化の方法は、種々
にパラメーター（例えば、培養時間、使用される基礎培
地、細胞密度および培養後の培地の可能な処理またはさ
らなる添加剤の追加）において調節され得る。これらお
よび他のパラメーターの調節は、経験的に、および慣用
的な実験の問題として実行され得る。細胞株が、馴化の
間の任意の培養パラメーターの慣用的な最適化後に、フ
ィーダーを含まないｐＰＳ培養を支持する馴化培地を産
生する場合、細胞株はその試験を通過したと見なされ
る。
【０１２１】所望される場合、馴化培地およびこの培地
を産生する細胞は、以下に記載されるように、それらが
支持するｐＰＳ細胞の他の特徴に基づいて、さらに評価
され得る。
【０１２２】（馴化培地のバッチ産生）本発明の馴化培
地は、この培地において細胞を培養することにより産生
され、次いで、その細胞培養物から馴化培地を収集す
る。
【０１２３】馴化のために使用される細胞は、すでに記
載されるように、フィーダーを含まない形態においてｐ
ＰＳ細胞を支持する能力を馴化培地に与える様式におい
て培地を馴化する能力を有する。馴化のために使用され
る基礎培地は、任意の異なるいくつかの製法を有し得、
その製法は、使用される細胞の型に部分的に依存する。
その培地は、少なくとも培地の馴化のために使用される
細胞株の培養を支持することが可能でなくてはならな
い。馴化後、その培地はまたｐＰＳの培養を支持するこ
とが都合が良い。しかし、代替物として、この培地は、
他の因子を追加され得るか、さもなくば馴化後、ｐＰＳ
細胞の培養について培地を適合するために処理され得
る。
【０１２４】フィーダーを含まない培養においてｐＰＳ
細胞を支持するために、適切な基礎培地が、以下の成分
から作製され得る；ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭ
ＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１１９６５−０９２；ノックアウ
ト（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ）ダルベッコ改変イーグル培地
（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ＃１０８２９−０１
８；Ｈａｍ’ｓＦ１２／５０％ＤＥＭＥ基礎培地；２０
０ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ＃１５０３９−０
２７；非必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ １１１４０−
０５０；βメルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ＃Ｍ７５
２２；ヒト組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧ
Ｆ）、Ｇｉｂｃｏ＃１３２５６−０２９。例示的な血清
含有ＥＳ培地は、８０％ＤＥＭＥ（代表的にＫＯ ＤＥ
ＭＥ）、２０％限定されたウシ胎児血清（ＦＢＳ）（熱
非働化していない）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１ｍ
Ｍ Ｌ−グルタミン、および０．１ｍＭ β−メルカプ
トエタノールとともに作製される。この培地をろ過し、
そして４℃にて２週間を超えないように保存する。血清
を含まないＥＳ培地は、８０％ＫＯ ＤＥＭＥ、２０％
血清置換、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸、１ｍＭ Ｌ−
グルタミン、および０．１ｍＭ β−メルカプトエタノ
ールとともに作製される。すべての血清置換が役に立つ
わけではない；有効な血清置換は、Ｇｉｂｃｏ＃１０８
２８−０２８（特許製法；その製造業者から入手可能な
製品）である。この培地をろ過し、そして４℃にて２週
間を超えないように保存する。馴化のために使用される
細胞を組み合わせる直前に、ヒトｂＦＧＦが、４ｎｇ／
ｍＬの最終濃度まで添加され得る。
【０１２５】次いで、細胞にｐＰＳ細胞を支持する成分
を培地に放出させるような環境下において、この選択培
地を馴化のために使用される細胞と組み合わせる。必要
に応じて、この細胞は、照射（例えば、約４，０００ｒ
ａｄ）により、マイトマイシンＣのような化学的失活剤
を用いる処置により、または任意の他の有効な方法によ
って、不活性化され得る（すなわち、実質的な複製の不
能を与えられる）。ｐＰＳ細胞培養物を支持する際に使
用する前に、培地が馴化細胞から分離される場合、細胞
の不活性化は、必ずしも必要ではない。
【０１２６】この細胞は、ｐＰＳ細胞培養を支持する放
出された因子の適切な濃度を可能にするための十分な時
間で培地において培養される。代表的に、２４時間３７
℃において培養することにより馴化された培地は、ｐＰ
Ｓ細胞培養物を２４時間支持する因子の濃度を含む。し
かし、培養期間は、より長くまたはより短く調節され
得、経験的に（または必須因子の濃度をアッセイするこ
とにより）適切な期間を構成するものを決定する。馴化
培地のバッチを収集した後、この細胞を使用して、さら
なる培養期間（細胞が、適切な方法において培地を馴化
する能力を保持する限り、所望される場合と同じくらい
多くのサイクルの間）にわたって、さらなるバッチの培
地を馴化し得る。例えば、胚性幹細胞の分化に由来する
線維芽細胞様細胞を使用して、１日周期で１〜２週間に
わたって培地を馴化し得る（実施例１２および１３）。
【０１２７】培地を馴化するための培養装置の選択は、
培地収集の規模および目的に基づいてなされ得る。初期
の研究において、そしてスクリーニングする目的のため
に、標準的な培養フラスコまたは複数のウェルプレート
において培養培地を産生することは、しばしば都合が良
い。初期のスケールアップが、多数の面を有するより大
きな容器においてなされ得る（例えば、Ｎｕｎｃ ｃｅ
ｌｌ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ）。ラージスケール、自動
化、またはＧＭＰに従う産生は、より特殊化されたデバ
イスの使用を含み得る。
【０１２８】連続的細胞培養系は、Ｊ．Ｆｕｒｅｙ（Ｇ
ｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇ．Ｎｅｗｓ２０：１０、２０００
年５月１５日）により概説されている。灌流培養は、培
養チャンバーからの培地の除去を含み、そして新鮮な培
地を補填する。スピンバスケット系において、バスケッ
ト様デバイスをドライブシャフトに接続し、そして培地
が交換され得る多孔性スクリーンにより覆われる。外部
フィルター灌流系において、培養液は、中空繊維フィル
ターモジュールを介して容器から循環され、そしてその
循環を提供するためのループに接続されたポンプを用い
て、容器にもどす。特定の灌流系、ＡＴＦ Ｓｙｓｔｅ
ｍ（Ｒｅｆｉｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｓｏ
ｎ ＮＪから市販）は、中空繊維ハウジングの一方の末
端にある膜ポンプ、バイオリアクターと接続される中空
繊維ハウジングのもう一方の末端から構成される。その
ファイバーを介する、交流する接線方向の流れは、低い
剪断層流を産生し、これは高流速、拡張性、および異な
るバイオリアクターに対する適応性を提供する。
【０１２９】ラージスケール培養系はまた、Ａａｓｔｒ
ｏｍ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏ
ｒ ＭＩから入手可能である。Ａａｓｔｒｏｍ Ｒｅｐ
ｌｉｃｅｌｌTM系は、小さな開始細胞集団からの拡張を
提供する（Ｋｏｌｌｅｒら、Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ
Ｔｒａｎｓｐｌ．２１：６５３、１００９；Ｋｏｌｌｅ
ｒら、Ｂｌｏｏｄ ８６：１７８４、１９９５）。Ｃｅ
ｌｌｓｔａｓｉｓ（登録商標）培養技術は、Ｇｅｎｅｓ
ｐａｎ Ｃｏｒｐ．、Ｂｏｔｈｅｌｌ ＷＡにより市販
される。細胞は、キャピラリー外空間に存在し、そして
中空線維は、培養環境に新鮮な培地および酸素をもたら
す（Ｒ．Ｌｅｗｉｓ、ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇ．Ｎｅｗｓ
１８（９）、１９９８年５月１日）。任意の他の適切な
デバイスが、本発明とともに使用され得る。米国特許第
４，５０１，８１５号は、分化細胞を培養するためのデ
バイスを記載する。米国特許第４，２９６，２０５号
は、細胞培養および連続透析フラスコならびにそれらの
用途を記載する。米国特許第５，９９４，１２９号は、
生物学的細胞を維持する際に使用する移動式カセットを
記載する。米国特許第５，３６２，６４２号は、細胞培
養培地の貯蔵、再構成、分配、および収集についての閉
じ込め系（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ）を
記載する。米国特許第６，０２２，７４２号は、培養デ
バイスおよび方法を記載する。
【０１３０】本発明の特定の実施形態は、馴化培地を調
製するための適合するデバイスであり、このデバイス
は、培地を馴化し得る本発明の細胞を含む培養チャンバ
ーおよび細胞による馴化の後、培養チャンバーから培地
を回収するために必要に応じて閉鎖し得る排出ポートを
有する。そのデバイスはまた、馴化された培地から培養
細胞を分離させるプレート、中空線維、または他の構造
の形態において大量移行ミクロ細孔表面を有し得、これ
は培地の自由な通過を可能にし、排出ポートへの通過を
提供する。このデバイスはまた、新鮮な培地を導入する
か、さらなる細胞を導入するか、または死細胞および細
胞破片を除去するための１つ以上のポートを有し得る。
連続フロー系について、ポンプは、循環を提供するため
に培地入口ポートまたは培地排出ポートに接続され得
る。
【０１３１】馴化培地の収集の後、適切である場合、馴
化培地はｐＰＳ細胞増殖を支持するために直接使用され
得る。この培地が、ろ過され、凍結され、さもなくば初
めて新しい技術を使用して処理された場合、小さなバッ
チを試験して、再構成された培地においてなおも活性が
存在するか否かを決定することは、価値がある。
【０１３２】ある実施形態において、馴化培地に、ｐＰ
Ｓ細胞培養のためになる付加的な増殖因子を使用前に補
充した。ｈＥＳに対して、ｂＦＧＦ様の増殖因子が、し
ばしば用いられる。フィーダー細胞なしの培養において
ｈＥＳ細胞を支持する培地の能力は、培地の馴化の前お
よび後の両方においてｂＦＧＦを加えることによって利
益を得うることが見出された(実施例１１)。ｈＥＧに対
して、培養培地に、ｂＦＧＦ様の増殖因子、ＬＩＦ、Ｉ
Ｌ−６またはオンコスタチン−Ｍのようなｇｐ１３０の
アクチベーター、およびフォルスコリンまたはコレラ毒
素のようなおそらくは環状ＡＭＰレベルを上昇させる因
子を補充し得る、ｐＰＳ細胞の他の型は、（ｃ−ｋｉｔ
のリガンドである、Ｓｔｅｅｌ ｆａｃｔｏｒとしても
公知の）幹細胞因子のような培地中の他の因子によって
利益を得うる。
【０１３３】特定の実施形態において、馴化培地が、さ
らに処理される。例えば、塩析または選択的な濾過によ
って濃縮され得るし、また有効な成分を分離または保管
するために抽出され得る。次いで培地抽出物は、ｐＰＳ
培養物を支持するために、使用前に新鮮な培養培地によ
って再構成されるか、またはこれを補充され得る。
【０１３４】調製後、培地は、上述のように、フィーダ
ー細胞なしの培養においてｐＰＳ細胞を支持するために
用いられ得る。それはまた、他の目的に適切であり、そ
して制限なくそのような目的に用いられ得る。例えば、
培地は、さらに細胞の増殖を支持するが、または分化の
制限するために、フィーダー細胞の存在下で培養された
ｐＰＳに添加され得る。培地はまた、経験的に決定され
得るように、培養前駆細胞、または終末分化した細胞の
他の型の増殖の維持または促進に用いられ得る。
【０１３５】（フィーダー細胞非存在下において成長し
たｐＰＳ細胞の特徴付け）ヒトＥＳ細胞は、未分化の幹
細胞の特徴的な形態的な特色を有する。二次元の標準的
な顕微鏡画像において、ｈＥＳ細胞は、その画像の平
面、突出した核小体、およびほとんど識別できない細胞
接合部を伴う緻密なコロニー形成において核／細胞質の
高い比を有する。細胞株は、標準的なＧバンド技術（日
常的な核型決定サービスを提供する、オークランドＣＡ
の細胞遺伝学研究室のような多くの臨床診断研究室にお
いて利用可能な技術）を用いて核型決定され得、そして
公開されヒト核型と比較され得る。「正常な核型」を有
する細胞（その細胞が正倍数性であり、その中にすべて
のヒト染色体が存在し、そして目立って変質されていな
いことを意味する）を獲得することが所望される。
【０１３６】ｈＥＳ細胞およびｈＥＧ細胞はまた、発現
する細胞マーカーの特徴付けられ得る。一般的に、本開
示において記述される組織特異的なマーカーは、膜結合
型マーカーに対するフローサイトメトリー、細胞内マー
カーに対する免疫組織化学、および培地中に分泌された
マーカーに対する酵素結合イムノアッセイのような、適
切な免疫学的技術を用いて検出され得る。タンパク質マ
ーカーの発現はまた、マーカー特異的なプライマーを用
いた逆転写酵素ＰＣＲによって、ｍＲＮＡレベルで検出
され得る。さらなる詳細は、米国特許番号５，８４３，
７８０を参照のこと。
【０１３７】発生段階特異的胎児性抗原（ＳＳＥＡ）
は、特定の胚性細胞型に特徴的である。ＳＳＥＡ−１，
ＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４に対する抗体は、Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ Ｂａｎｋ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔ
ｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｂ
ｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）より入手可能である。他の有用
なマーカーは、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８
１と命名された抗体（Ａｎｄｒｅｗｓら Ｃｅｌｌ Ｌ
ｉｎｅｓ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｒｍ Ｃｅｌｌ
Ｔｕｍｏｒｓ、Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９８
７、前出）を用いて検出可能である。マウスＥＳ細胞
は、ＳＳＥＡ−１に対する陽性コントロールとして、そ
してＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１
−８１に対する陰性コントロールとして使用され得る。
ＳＳＥＡ−４は、ヒト胚性癌（ｈＥＣ）細胞に一貫して
存在する。インビトロにおけるｐＰＳ細胞の分化は、結
果としてＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒ
ａ−１−８１の発現の減少ならびにＳＳＥＡ−１の発現
の増加を導く。ＳＳＥＡ−１はまた、ｈＥＧ細胞におい
て見出される。ｐＰＳ細胞はまた、製造者（Ｖｅｃｔｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ
ＣＡ）によって記載されたように、細胞を４％パラホ
ルムアルデヒドで固定する工程、および次いでベクター
レッドを基質として発色させる工程によって検出され得
るアルカリフォスファターゼ活性の存在によって特徴付
けられ得る。ｈＴＥＲＴおよびＯＣＴ−４の発現（ＲＴ
−ＰＣＲによって検出可能)ならびにテロメアーゼ活性
（ＴＲＡＰアッセイによって検出可能）はまた、多くの
型の未分化のｐＰＳ細胞に特徴的である（実施例３）。
【０１３８】増殖したｐＰＳ細胞の所望される他の特色
は、三つすべての胚葉（内胚葉組織、中胚葉組織および
外胚葉組織）の細胞へ分化する能力である。ｈＥＳ細胞
の多能性は、約３．０Ｘ１０6の細胞を８〜１２週齢の
雄性ＳＣＩＤマウスの後脚筋へ注入することによって確
認し得る。結果生じる腫瘍は、発生８〜１６週目におい
て４％パラホルムアルデヒドで固定され得、そしてパラ
フィン包埋後に組織学的に検査され得る。三つすべての
胚葉の組織（例えば、軟骨、平滑筋、または横門筋（中
胚葉)；毛嚢を伴った重層扁平上皮、心室層、中間層、
または外套層を伴う神経管 (外胚葉）；そして、繊毛円
柱上皮、および吸収性の腸細胞または粘液分泌杯細胞に
よって裏打ちされた繊毛(内胚葉)）を示す奇形腫が、発
育する。ｐＰＳ細胞の多能性は、本開示の下記の手順に
従って、特定の細胞株への分化に関してさらに試験され
得る。
【０１３９】フィーダー細胞非存在下で成長するｈＥＳ
細胞の模範的な調製を、実施例１に下述する。培養１９
日において、細胞の８０％より多くが、ＳＳＥＡ−４、
Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１について陽性
に染色されたが、細胞の１５％未満が、ＳＳＥＡ−１に
ついて陽性に染色された。
【０１４０】本開示に記載の特定の細胞集団は、実質的
に未分化であり、そして新たなフィーダー細胞を加える
ことなく多岐の培養間で継代し得る。特定の継代中に、
いくつかの細胞が、分化し得ることが確認された（特に
低密度で単一細胞をリプレートした場合、または大きな
クラスターが形成され得る場合）。しかし、培養物は、
培養期間の間により大きな割合の未分化細胞を代表的に
は再樹立する。特に目的であるのは、フィーダー細胞な
しの系において少なくとも３ヶ月の間増殖され得る細胞
である。最適なことに、増殖した細胞が、約２０〜４０
時間にすぎない倍化時間を有し得る。
【０１４１】ｐＰＳ細胞、またはｐＰＳ細胞から分化し
た細胞の複製能力が増加することが所望される場合、以
下に記載の方法を用いて、それらは不死化またはテロメ
ア化（分化前または後のどちらかに）され得る。
【０１４２】（増殖されるｐＰＳ細胞の直接的な分化)
本発明はまた、ｐＰＳ細胞が、中間段階として胚様体を
形成せずに、方向付けられた前駆細胞または十分に分化
した細胞へ分化するための新しい系を提供する。
【０１４３】胚様体の培養における一般的原理は、Ｏ’
Ｓｈｅａ，Ａｎａｔ．Ｒｅｃ（Ｎｅｗ Ａｎａｔ．２５
７：３２３，１９９９）に報告されている。ｐＰＳ細胞
は、凝集が形成するのを許容する様式においてに培養さ
れる。多くの選択肢（例えば、ドナーｐＰＳ細胞培養の
過成長によるか、またはＥＢ形成を許容する低い接着性
質を伴う基質を含む培養容器中でｐＰＳ細胞を培養する
ことによる）が、この様式のために利用可能である。胚
様体はまた、懸濁培養においても形成され得る。ｐＰＳ
細胞は、短いコラゲナーゼ分解によって収集され、クラ
スターへ解離され、そして非接着性細胞培養プレートへ
プレーティングされる。この凝集体は、２〜３日ごとに
播かれ、次いで代表的には４〜８日の、適切な期間の後
に収集される。この細胞は、次いで、特定の系統の細胞
の濃縮を促進する培地および／または基質中で培養され
得る。この基質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ(登録商標）（Ｂ
ｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）、ラミニン、コラー
ゲン、ゼラチン、または最初にマトリックス産生細胞株
を培養し、次いでそのマトリックスが容器の表面に付着
し続けるような方法で溶解および洗浄することによって
産生されるマトリックスのようなマトリックス構成成分
を含み得る。胚様体は、潜在的には内胚葉外面、そして
中胚葉外面および外胚葉内面を有する、異種細胞集団を
含む。
【０１４４】ｐＰＳ細胞が、中間の段階として胚様体ま
たは凝集体を形成することなく、方向付けられた前駆細
胞または終末分化細胞へ分化し得ることが、現在までに
発見されている。簡単には、未分化なｐＰＳ細胞の懸濁
液が、調製され、次いで分化を促進する固体表面上にプ
レートされる。代表的には、ｐＰＳ細胞は、過成長が許
容される場合、コントロールされない様式において分化
するので、このｐＰＳ細胞の培養物は、過密度時におい
てではなく、十分な密度にまで増殖した場合に、代表的
には回収される。適切な懸濁液は、コラーゲナーゼＩＶ
とともに培養皿を約５〜２０分間インキュベートし、次
いで皿から細胞をかき集めることによって調製され得
る。この細胞は、例えば、ピペット中で粉砕することに
よって分離され得る。分化の多くの型について、その細
胞が完全には分離していないことが推奨され、ゆえにｐ
ＰＳの大多数は、約１０〜２００の細胞の凝集塊であ
る。
【０１４５】この懸濁液は、次いで、方向付けられた前
駆細胞への調節された分化を促進する基質上にプレート
される。適切な基質は、接着性のガラス表面またはプラ
スチック表面を含む。例えば、ガラスカバーグラスは、
ポリカチオン性基質（ポリリシン、ポリオルニチンのよ
うなポリアミン、または他の同種のポリペプチドもしく
は混合されたポリペプチド、または優勢な陽性電荷を伴
う他のポリマー）によってコートされ得る。この細胞
は、次いで、所望される細胞株への分化を促進するのに
適応した、適切な栄養性培地中で培養される。
【０１４６】いくつかの場合において、分化は、この培
養培地から血清および血清置換体を除去することによっ
て促進される。このことは、血清または血清置換体のな
い培地に置き換えることによって（例えば、再プレーテ
ィング時に、未分化細胞の成長を促進するかまたは分化
を阻害するこの培地の一つ以上の構成成分を除去するこ
とによって）達成し得る。例は、特定の増殖因子、マイ
トジェン、白血球阻害因子（ＬＩＦ）、塩基性繊維芽細
胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および馴化培地中の他の構成
成分を含む。
【０１４７】いくつかの場合において、分化は、所望さ
れる細胞株への分化を促進する培地構成成分、または所
望されない特徴を伴う細胞の成長を阻害する培地構成成
分を加えることによって促進される。例えば、神経系統
またはグリア系統へと方向付けられた細胞を産生するた
めに、この培地は、効果的な組み合わせで、以下に示す
任意の因子または培地成分を含み得る：脳由来神経栄養
因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン３（ＮＴ−
３）、ＮＴ−４、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、毛様体神
経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、レ
チノイン酸（ＲＡ）、ソニックヘッジホッグ、ＦＧＦ−
８，アスコルビン酸、フォルスコリン、胎仔ウシ血清
（ＦＢＳ）、および骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）。
【０１４８】多能性幹細胞由来の組織細胞を得るための
一般的な原理は、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆ
ｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．６：５４３，１９９４）、および
米国特許第６，０９０，６２２号に論評される。神経性
前駆体、神経系限定（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｎｇ）の細胞
前駆体およびグリア細胞前駆体に関しては、Ｂａｉｎ
ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ
ｍｕｎ．２００：１２５２，１９９４；Ｔｒｏｊａｎｏ
ｗｓｋｉら、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４４：９２，１
９９７；Ｗｏｊｃｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１３０５−１３０；Ｍｕｊ
ｔａｂａら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２１４：１１３，１９
９９；および米国特許第５，８５１，８３２号、同第
５，９２８，９４７号、同第５，７６６，９４８号、お
よび同第５，８４９，５５３号を参照のこと。心筋およ
び心筋細胞に関しては、Ｃｈｅｎら、Ｄｅｖ．Ｄｙｎａ
ｍｉｃｓ １９７：２１７，１９９３およびＷｏｂｕｓ
ら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４８：１７３，
１９９１を参照のこと。造血性の前駆体に関しては、Ｂ
ｕｒｋｅｒｔら、Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．３：６９８，１９
９１およびＢｉｅｓｅｃｋｅｒら、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ
ｏｌ．２１：７７４，１９９３を参照のこと。米国特許
第５，７７３，２５５号は、グルコース反応性インシュ
リン分泌膵β細胞株に関する。米国特許番号第５，７８
９，２４６号は、肝細胞前駆細胞に関する。目的の他の
前駆体は、軟骨細胞、骨芽細胞、網膜色素上皮細胞、繊
維芽細胞、皮膚細胞(例えば、ケラチンノサイト、樹状
細胞、毛胞細胞、腎管上皮細胞、平滑筋細胞および骨格
筋細胞）、精巣前駆体、および血管上皮細胞にを含む
が、これらに制限されない。
【０１４９】Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの研
究者は、成長因子レセプターに結合するリガンドの存在
下においてｐＰＳ細胞または胚様体細胞を培養すること
が、神経性前駆細胞の富化を促進することを発見した。
この成長環境は、フィブロネクチンのような神経細胞支
持可能な細胞外マトリックスを含み得る。適切な増殖因
子は、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ−１、そし
てこれらリガンドに対するレセプターに対する抗体を含
むが、これらに限定されない。レチノイン酸のような補
因子もまた、含まれ得る。培養された細胞は、次いで、
Ａ２Ｂ５のようなマーカーを発現するか否かを基準にし
て必要に応じて分離され得る。適当な環境下において、
Ａ２Ｂ５マーカーの発現が豊富な細胞の集団は、神経細
胞（成熟したニューロンを含む)、およびグリア細胞(星
状細胞および稀突起膠細胞を含む)の両方を産生する能
力を有し得る。必要に応じて、例えば、ｃＡＭＰのアク
チベータ−を含む培地中での培養によって、この細胞集
団は、さらに分化する。目的のマーカーは、以下を含む
が、それに限定されない：ニューロン特異的βチューブ
リンＩＩＩまたは微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ
２）；星状細胞に存在するグリア細胞繊維性酸性タンパ
ク質（ＧＦＡＰ）；稀突起膠細胞特異的ガラクトセレブ
ロシド（ＧａｌＣ）またはミエリン塩基性タンパク質
（ＭＢＰ）；未分化ｈＥＳ細胞に特徴的なＯＣＴ−４；
神経前駆体および他の細胞に特徴的なネスチン（Ｎｅｓ
ｔｉｎ）またはムサシ（Ｍｕｓａｓｈｉ）；およびにｐ
ＰＳ細胞から分化した神経性前駆体の集団に見られるＡ
２Ｂ５およびＮＣＡＭの両方。
【０１５０】Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの研
究者はまた、肝細胞分化薬剤の存在下におけるｐＰＳ細
胞または胚様体細胞の培養が肝細胞様細胞の富化を促進
することを発見した。この成長環境は、コラーゲンまた
はＭａｔｒｉｇｅｌ(登録商標)のような肝細胞支持可能
な細胞外マトリックスを含み得る。適切な分化薬剤は、
酪酸塩およびそのアナログの種々の異性体（ｎ−酪酸塩
によって例証される）を含む。培養された細胞は、ジメ
チルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）様のような有機溶媒の
ような肝細胞成熟因子；レチノイン酸のような成熟補因
子；またはサイトカインもしくはホルモン（例えば、グ
ルココルチコイド、上皮性増殖因子（ＥＧＦ）、インシ
ュリン、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−αお
よびＴＧＦ−β）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ），ヘ
パリン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン
（ＩＬ−１およびＩＬ−５）、インシュリン様増殖因子
（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、およびヘパリン結
合増殖因子（ＨＢＧＦ−１））と、必要に応じて同時
に、または連続的に培養される。ｐＰＳ細胞から分化し
た肝細胞株は、以下に示すマーカーの少なくとも三つを
代表的には示す：α１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）合
成、アルブミン合成、アシアロ糖タンパク質レセプター
（ＡＳＧＲ）発現、α−胎児性タンパク質の不在、グリ
コーゲン貯蔵の証拠、シトクロムｐ４５０活性の証拠、
およびグルコース６リン酸化酵素活性の証拠。
【０１５１】ｐＰＳ細胞由来の混合した細胞集団に存在
する細胞の型は、特徴的な形態およびそれらの発現する
マーカーによって認識され得る。骨格筋に関しては：ｍ
ｙｏＤ、ミオゲニン、およびｍｙｆ−５。内皮細胞に関
しては：ＰＥＣＡＭ（血小板内皮細胞接着分子)、Ｆｌ
ｋ−１、ｔｉｅ−１、ｔｉｅ−２、血管内皮（ＶＥ）カ
ドヘリン、ＭＥＣＡ−３２、およびＭＥＣ−１４．７。
平滑筋に関しては：特異的ミオシン重鎖。心筋細胞に関
しては：ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、心性トロポニン
Ｉ、αミオシン重鎖、およびＡＮＦ。膵細胞に関して
は：ｐｄｘおよびインシュリン分泌。造血細胞およびそ
の前駆体に関しては：ＧＡＴＡ−１、ＣＤ３４、β主要
グロブリン、およびβ主要グロブリン様遺伝子βＨ１。
【０１５２】適切な表面上への直接的なプレーティング
によって、またはフィーダー細胞なしの培養においてｐ
ＰＳ細胞を提供し、そして適切に培地を交換することに
よって分化するｐＰＳ細胞は、系統制限された細胞また
は終末分化した細胞の驚くほど同種の集団を産生し得
る。用いられる条件に依存して、５０％を十分超えて同
種性を有する細胞集団（７５％、９０％、または９８％
同種性と同程度に)は、識別する技術の使用を有する必
要なしでさえ、得られ得る。
【０１５３】治療目的に関して、分化した細胞集団が、
未分化のｐＰＳ細胞を実質的に含まないことが通常所望
される。この集団から未分化な幹細胞を除去する一つの
方法は、未分化な細胞において優先的な発現を生じるプ
ロモーターの制御下にエフェクター遺伝子を有するベク
ターでこの細胞を形質転換することである。適切なプロ
モーターは、ＴＥＲＴプロモーターおよびＯＣＴ−４プ
ロモーターを含む。エフェクター遺伝子は、この細胞を
直接溶解し得る（例えば、毒素またはアポトーシスのメ
ディエータをコードする遺伝子）。あるいは、エフェク
ター遺伝子は、仔の細胞を抗体またはプロドラッグのよ
うな外部の薬剤の毒性効果感受性にし得る。それが、ガ
ンシクロビルに感受性であるように発現される細胞を生
じる単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子が、
例である。適切なＴＥＲＴプロモーターｔｋ構築物は、
ＷＯ９８／１４５９３（Ｍｏｒｉｎら）中に提供され
る。
【０１５４】（ｃＤＮＡライブラリー)フィーダー細胞
と共に成長したかまたはフィーダー細胞なしの培養物か
ら成長した未分化なｐＰＳ細胞は、これらの細胞の遺伝
子発現パターンを反映するｍＲＮＡライブラリーおよび
ｃＤＮＡライブラリーを調製するのに用いられ得る。ｍ
ＲＮＡおよびｃＤＮＡはまた、分化した細胞から作製し
得、そして分化中に上方制御または下方制御される転写
物について濃縮されたサブトラクションライブラリーの
生成に使用し得る。
【０１５５】（ｍＲＮＡの単離および増幅されたコピー
の生成）ｃＤＮＡライブラリーの調製は、ｐＰＳ細胞ま
たはそれらの分化した子孫からｍＲＮＡを単離する工
程；このｍＲＮＡのポリヌクレオチドコピーを作製する
工程、および補充され得る形態でポリヌクレオチドコピ
ーを含むライブラリーを産生する工程を、代表的には含
む。代表的には、このポリヌクレオチドコピーは、ｍＲ
ＮＡテンプレートより逆転写酵素反応によって産生され
るｃＤＮＡであるが、本来のｍＲＮＡ集団の配列を保持
する他の任意の型のコピーは、使用され得る。さらに、
異なる供給源(例えば、ｐＰＳおよび分化した細胞)由来
のポリヌクレオチドコピーは、この二つの集団の間で差
示的発現されるコピーが豊富であるライブラリーの産生
のために差し引かれる。選択されたポリヌクレオチドコ
ピーは、クローニングベクター中ヘ代表的に操作される
が、ベクター内、宿主細胞内でのこのコピーの再生の任
意の方法、または化学的な手段は、等価なものとして理
解される。
【０１５６】例として、フィーダー細胞なしの培養にお
けるｈＥＳ細胞は、コラゲナーゼを用いてマトリックス
から分離されるか、遠心によって収集されるか、または
適切な溶媒を用いて培養中で直接的に溶解される。総Ｒ
ＮＡは、標準の技術の適切な組み合わせ(例えば、酸フ
ェノール／クロロホルム抽出、ＣｓＣｌを通した遠心、
オリゴｄＴマトリックスへの結合、など；Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら、前出を参照のこと)によってその細胞から調製
する。実施例１４に示すように、総ＲＮＡは、グアニジ
ウムイソチオシアネートの溶液中で細胞を溶解する工程
およびＲＮｅａｓｙ(登録商標)スピンカラム（Ｑｉａｇ
ｅｎ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ ＣＡ）のような適
切なマトリックスに懸濁液中のＲＮＡを結合する工程に
よって、収集されたｈＥＳ細胞から単離され得る(米国
特許第５，２３４，８０９号）。総ＲＮＡは、マトリッ
クスから溶出され、次いでポリＡ+ｍＲＮＡが、結合し
たｄＣ10Ｔ30オリゴヌクレオチドを有するＯｌｉｇｏｔ
ｅｘTMビーズへ結合されることによって得られる。この
結合画分は、低塩緩衝液中に収集され、そしてｃＤＮＡ
ライブラリーを調製するのに用いられ得る。
【０１５７】種々の方法は、ｍＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへ
変換するために利用可能である。産生物は、開始ｍＲＮ
Ａ集団をあらわすように設計された一次ライブラリーを
含む：サブトラクションライブラリー（一つの集団にお
いて優先的に発現するｍＲＮＡを濃縮するために、二つ
以上の異なるｍＲＮＡ集団に共通するｍＲＮＡ種が、最
終ｃＤＮＡ調製物において減少されるライブラリー)；
規格化された（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）ライブラリ−
(独立したｍＲＮＡの相関的存在度が、等しい表示に平
均化されるライブラリー)；および全長偏向（ｂｉａｓ
ｅｄ）ライブラリー（ｃＤＮＡの産生物が、本来のｍＲ
ＮＡのコード配列全体を含むｃＤＮＡを高頻度に産生す
るように至適化されるライブラリー）。
【０１５８】これらの方法における第一の反応は、代表
的には、オリゴｄＴプライマーまたはランダムヘキサマ
ープライマーによってプライムされた温度依存的な逆転
写反応を用いたｍＲＮＡの一本鎖ｃＤＮＡへの任意の変
換である。この反応は、商業的供給業者から容易に入手
可能な種類の酵素である、逆転写酵素によって触媒され
る。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ(登録商標)（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ）が、例であり、これは、天然の酵素のＲＮＡｓ
ｅＨ活性が減少し、それによって全長第一鎖ＤＮＡの産
生の頻度が増加する逆転写酵素の改変型である。オリゴ
ｄＴプライマーは、クローニングを容易にする制限エン
ドヌクレアーゼ認識配列を５’端に組み込むように、代
表的には改善される。しばしば、一つのヌクレオチド三
リン酸のメチル化型が、第一鎖反応に含まれる。そのた
め、最終ｃＤＮＡは、最終産物を制限するのに代表的に
用いられる制限エンドヌクレアーゼによる消化から防御
される。
【０１５９】逆転写酵素反応の一本鎖ｃＤＮＡ産物の二
本鎖ｃＤＮＡへの変換は、いくつかの手段によって達成
され得る。代表的には、第一鎖ｃＤＮＡは、適切なＤＮ
Ａポリメラーゼによる相補的な鎖合成のプライムを許容
するように適応する。ＳＭＡＲＴTM ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ（ＣｌｏｎＴｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）
は、第一鎖産物の末端の末端シトシン残基からの第二鎖
合成をプライムする鎖スイッチオリゴヌクレオチドを利
用する。第一鎖ｃＤＮＡ産物を適応させる他の技術は、
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用い
たホモポリマー尾部の導入、続いて相補的なホモポリマ
ーによる第二鎖プライミング、または適切なオリゴヌク
レオチドの連結、続いて連結したオリゴと相補的なプラ
イマーによる第二鎖プライミングを含む。この後者のア
プローチを用いて、連結したオリゴヌクレオチドおよび
その相補体は、クローニングを容易にする制限エンドヌ
クレアーゼ認識配列を含むように設計され得る。
【０１６０】一つの例において、ＲＮＡｓｅ Ｈの作用
が、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に切れ目を導入するのに用い
られ、次いでこの二重鎖は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＰｏｌ
１のようなＤＮＡポリメラーゼのプライミング部位に適
切になる。この方法は、有効であるが、配列情報が、ｃ
ＤＮＡの５’端から失われ得る。５’末端（本来のｍＲ
ＮＡのポリＡ＋部位と逆の末端）の上にあるプライミン
グＲＮＡは、引き続く二本鎖ｃＤＮＡのプロセッシング
によって失われる。あるいは、５’配列情報が保存され
た二本鎖ＤＮＡは、オリゴヌクレオチドプライマーと第
一鎖ｃＤＮＡの３’端との連合を含む。この連合反応
は、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（一本鎖オリゴヌクレオチドの
末端５’リン酸を第一鎖ｃＤＮＡ産物の３’ヒドロキシ
ルに連結し得る酵素）によって触媒される。用いられた
オリゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡへの連合を許容するた
めに５’末端リン酸を提供し、そして自己鎖状体化を防
ぐためにアミノ誘導体またはジデオキシ誘導体のような
３’ブロッキング基を提供するように合成される。この
オリゴヌクレオチドはまた、引き続くベクターへのクロ
ーニングに適切な部位を適合させる制限エンドヌクレア
ーゼ認識配列をコードする。第一鎖産物へのオリゴヌク
レオチドの連合に引き続き、第二鎖ｃＤＮＡ合成は、熱
安定性のポリメラーゼのような適切なＤＮＡポリメラー
ゼ活性を用いて、連合したオリゴと相補的なオリゴヌク
レオチドによってプライミングされる。配列例：第一鎖
ｃＤＮＡ連合オリゴ５’Ｐ−ＡＧＧＴＣ ＧＡＣＧＡ
ＧＡＧＡＧ−３’ＮＨ−Ｘ（配列番号１）、ここではＰ
＝リン酸、ＮＨ−Ｘ＝アミンブロッキング基；相補的オ
リゴ５’ＯＨ−ＣＴＣＴＣ ＴＣＧＴＣ ＧＡＣＣＴ−
ＯＨ−３’（配列番号２）、ここでは−ＯＨ＝ヒドロキ
シル基。
【０１６１】特定の手順が、サンプル中の全長ｃＤＮＡ
の比率を増加するのに用いられ得る。この目的に適切な
のは、ＲＩＫＥＮ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｊａｐａｎに
おいて開発された技術（Ｃａｒｎｉｎｃｉら、Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３：１９，１９９９；Ｉ
ｔｏｈら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．９：４６３，１９９
９；国際特許出願ＷＯ９８／２０１２２も参照のこと）
である。ｍＲＮＡは、ビオチンをそのｍＲＮＡの５’末
端の７−メチルＧキャップ構造に加えることによって適
合される。第一鎖ｃＤＮＡの産物は、すでに記載のよう
に達成され、そしてｃＤＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッド
は、一本鎖ｍＲＮＡを分解するＲＮＡｓｅＩで処理され
る。全長ｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって
保護されないｍＲＮＡは、加水分解され、一方全長ｃＤ
ＮＡ／ｍＲＮＡハイブリッドは、残存する。このハイブ
リッドは、５’キャップのビオチンと結合するストレプ
トアビジンでコートされたビーズを用いて精製され、そ
して標準的技術を用いて二本鎖ｃＤＮＡへ変換される。
サンプル中の全長ｃＤＮＡの結果的な比率は、伝統的方
法によって作製されたライブラリーに存在するものより
も、代表的に大いに高い。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）および
Ｓｅｑｗｒｉｇｈｔ Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔ
Ｘ）を含むいくつかの商業ベンダーが、全長偏向ｃＤＮ
Ａを産生するためのサービスを提供する。
【０１６２】サブトラクションライブラリーは、発現レ
ベルが二つのｍＲＮＡ集団の間で異なる遺伝子の豊富な
供給源を提供する。サブトラクションライブラリーを作
製するための方法は、以下の工程を代表的に含む：ｐＰ
Ｓ細胞由来のｍＲＮＡを (例えば、すでに記載のように
ｃＤＮＡ集団を形成することによって) 増幅する工程；
分化した細胞由来のｍＲＮＡを増幅する工程；ｐＰＳ細
胞およびその分化した細胞の両方において発現するｍＲ
ＮＡから増幅したポリヌクレオチドをクロスハイブリダ
イズさせる条件下で二つのプールを一緒にインキュベー
トする工程；次いで、クロスハイブリダイズされなかっ
た増幅したポリヌクレオチドを回収する工程。
【０１６３】同様の方法において、サブトラクションラ
イブラリーは、ｍＲＮＡ単離物の他の組み合わせ（例え
ば、（フィーダー細胞培養から得たｐＰＳ細胞）対（フ
ィーダー細胞なしの培養中のｐＰＳ細胞）；（部分的に
分化した細胞対終末分化した細胞）；（または二つ以上
の異なる系統の分化した細胞の集団））から作製され得
る。別の例において、（マトリックスもしくは分化を促
進するほかの基質上へのプレーティングによって、また
はＤＭＳＯもしくはレチノイン酸のような薬剤での処理
によって）単層培養において分化したｐＰＳ細胞由来の
ｃＤＮＡは、それぞれのコロニーの辺縁に形成する分化
した細胞の集団を補正するために、フィーダー細胞なし
の培養中で成長するｐＰＳ細胞由来のｃＤＮＡから差し
引かれる。サブトラクションライブラリーはまた、未分
化なｐＰＳ細胞での発現パターンに対する、化合物また
は培養条件の変化の効果を確証するために、作製され得
る。増幅されたｍＲＮＡは、その化合物または条件に曝
された細胞から作製され、そしてコントロール細胞から
増幅されたｍＲＮＡを差し引かれる。したがって、その
ライブラリーは、その変化の結果として上方制御または
下方制御される転写産物が濃縮される。
【０１６４】サブトラクションライブラリーの調製は、
以下のように示され得る：二つの独立したｍＲＮＡプー
ルが調製され、一つはテスター（ｔｅｓｔｅｒ）そして
他方はドライバ（ｄｒｉｖｅｒ）と称する。この例にお
いて、これらは適切な形態（しばしば一本鎖ｃＤＮＡ
（一つのプールはセンス方向、他方はアンチセンス方
向））に変換され、次いでハイブリダイゼーションさせ
るために混合される。両方のｍＲＮＡ集団に共通の転写
産物は、ハイブリッドを形成し、一方、一つのプールに
おいてのみ見出される転写産物、または一つのプールに
おいて実質的により高いレベルで発現される転写産物
は、ハイブリダイズされずに残存する。次いで、このハ
イブリッドが、代表的にはクロマトグラフィーのカラム
による分配によってか、またはストレプトアビジン／ビ
オチンのような特定の生化学的な系を用いた回収によっ
て、取り除かれる。テスターｍＲＮＡプールにおいてよ
り高度に発現する遺伝子がこのとき濃縮されている、残
存する一本鎖配列は、適切なベクターにクローン化され
る。サブトラクションライブラリー作製の多くの変化形
が、開発された。規準化（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏ
ｎ）を組み込んだ、サブトラクションハイブリダイゼー
ションの特徴を結びつけた方法は、市販されている（Ｓ
ｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＳＳＨ），ＣｌｏｎＴｅｃ
ｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）。
【０１６５】（組換え発現ライブラリーの調製）これら
の技法により作製された二本鎖ｃＤＮＡは、種々のクロ
ーニングベクター中に操作され得る。適切なベクター系
は、細菌宿主におけるクローニングのための細菌プラス
ミドおよびλバクテリオファージを含む。このｃＤＮＡ
がエンドヌクレアーゼ制限された末端とともに生成され
るとき、クローニングは、しばしば、対応して制限され
たベクターＤＮＡとの連結により達成される。配列分析
のためにプラスミドライブラリーが好適である。なぜな
ら、個々のクローンが、高スループット精製およびＰＣ
Ｒ増幅プロトコールによって容易にプロセッシングされ
得るからである。
【０１６６】本発明の特定の実施形態では、このクロー
ニングベクターはまた、単離されたプラークが、遺伝子
産物を得るために細胞中にトランスフェクトされ得るよ
うに設計された発現ベクターである。従って、増幅され
た転写物は、転写および翻訳制御要素の制御下でベクタ
ー中に配置される。例えば、プラスミドｐＣＭＶＳｐｏ
ｒｔTM６．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）は、多重クローニ
ング部位の対向する側面上にＳＰ６およびＴ７ウイルス
ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含み、クローン化さ
れたｃＤＮＡのセンスまたはアンチセンス鎖の転写を可
能にする。同様に、ＣＭＶプロモーターカセットは、哺
乳動物宿主細胞中に導入されるとき、インビボ転写を与
える。従って、このようなベクター中に挿入されたｃＤ
ＮＡは、ｐＰＳ細胞を含む種々の宿主細胞における発現
について試験され得る。このベクターはまた、多重クロ
ーニング部位に隣接するλファージ付着配列に特徴を持
ち、それらを、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｇ
ａｔｅｗａｙTMベクターに適合するようにする。このＧ
ａｔｅｗａｙTM系は、λファージの酵素カクテルおよび
Ｅ．ｃｏｌｉ組換え酵素活性の使用により、クローン化
配列のベクター間移動を可能にする配列で特異的に改変
されているベクターを含む。これは、ベクター間で配列
を移動するとき、制限酵素消化を用いる必要性を取り除
く。
【０１６７】特に重要なのは、多能性幹細胞におけるｃ
ＤＮＡの発現について最適化されたライブラリーであ
る。胚細胞におけるメチル化パターンおよびその他の調
節制御機構は、大部分のその他の真核細胞型の中で活性
である、ＣＭＶのようなプロモーターの制御下で遺伝子
の転写を抑制し得る。ｐＰＳ細胞中で活性なハウスキー
ピング遺伝子のプロモーターが、人工的に導入されたコ
ード領域の転写を制御するために有効であり得ることが
発見された。実施例１４に示されるように、適切なプロ
モーターを、試験プロモーター配列、グリーン蛍光タン
パク質またはβガラクトシダーゼのようなレポーター遺
伝子、および薬物耐性遺伝子を含むレポーター構築物を
用いて経験的に選択し得る。適切なプロモーターは、分
化に失われる細胞の比率を実質的に増加することなく、
レポーター遺伝子の発現を引き起こす特徴を有する。こ
の選択戦略を用い、ＰＧＫ、ＥＦ１α、およびＵｂｉＣ
のプロモーターが、ｐＰＳ細胞で発現可能なライブラリ
ーの構築に有効であると決定された。
【０１６８】（組換え発現ライブラリーの特徴付け）ｃ
ＤＮＡライブラリーをいくつかの規準により特徴付け得
る。ｃＤＮＡ長の単純かつ直接推定は、個々のクローン
からのプラスミド調製物を、ｃＤＮＡ挿入物を放出する
制限酵素で消化することによりなされ得る。この消化産
物は、アガロースゲルを用いる電気泳動によりサイズ分
けされ得、そして中間ｃＤＮＡ挿入物長が計算され得
る。発現ライブラリーの特定の特徴付けは、個々のｃＤ
ＮＡクローンの５’末端から生成された配列を、公開デ
ータベース中に見いだされる配列と比較することにより
達成され得る。本発明のポリヌクレオチド単離物および
クローン化挿入物は、当該分野の任意の適切な方法を用
いて配列決定され得る。例として、自動化ＤＮＡシーク
エンサーを用いて解析されるように蛍光産物を形成する
ＰＣＲを基礎にする配列決定方法である。プラスミドＤ
ＮＡおよび配列決定プライマーを、蛍光により標識され
たジデオキシヌクレオチドトリホスフェートを含むＰＣ
Ｒ反応条件下で反応させる。得られる反応産物を、ＡＢ
Ｉ ３７７（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ ＣｉｔｙＣＡ）のような、適
切なＤＮＡシークエンサー上で分離する。蛍光シグナル
が検出され、生の配列情報に変換され、そして処理され
る。これらの方法に実質的に基づくＤＮＡ配列決定サー
ビスが、Ｌａｒｋ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｏｕ
ｓｔｏｎ、ＴＸ；およびＩｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡのような会社から商業的
に利用可能である。配列をコードするｍＲＮＡのオープ
ンリーディングフレームを得ると、タンパク質遺伝子産
物のアミノ酸配列は、通常、このコード配列を遺伝子コ
ードに従って翻訳することによって、さらなる実験なく
して決定され得る。
【０１６９】配列データは、提示される独立遺伝子の数
に基づいて、ｃＤＮＡライブラリーの多様性の一般的な
推定を提供する。例えば、ＵＮＩＧＥＮＥコレクション
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔ
ｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／
ＵｎｉＧｅｎｅ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）に対してｃＤ
ＮＡ配列を比較することは、大部分の配列について特有
のクラスター同定物の割当を可能にする。評価されたｃ
ＤＮＡの総数に対して割当られたクラスター同定物の数
を比較することにより、クローン多様性の推定が達成さ
れ得る。
【０１７０】より複雑でないｍＲＮＡ供給源を提示する
ライブラリーは、より複雑なｍＲＮＡ供給源から作製さ
れたライブラリーに比較して、所定の数のｃＤＮＡで提
示される相対的により少ない独立遺伝子配列を有する。
本発明の特定の実施形態では、ｍＲＮＡ調製物、ｃＤＮ
Ａ調製物、およびクローニングベクター中のライブラリ
ーは、ｐＰＳ細胞またはその分化した子孫においてｍＲ
ＮＡレベルで発現される、少なくとも１００、１，００
０、１０，０００、または５０，０００もの遺伝子を提
示する配列を含む。
【０１７１】ライブラリーはまた、それらが単一遺伝子
型の細胞からの転写物を含むか否かにより特徴付けられ
得る。異なるプラークからの粗配列データを、ヒト配列
のデータベース、およびこれもまた存在していると疑わ
れる他の種の配列とマッチされる。ライブラリー中の約
１％未満の転写物コピーが、それらがｃＤＮＡライブラ
リーが所望する遺伝子型に由来しなかったことを確立し
て配列を有する場合、このライブラリーは、その他の
種、脊椎動物、哺乳動物、および同じ種の異なる遺伝子
型のｃＤＮＡが「本質的にない」と呼ばれる。本開示に
おいて記載される無フィーダー培養システムを用いて、
外来転写物によるｐＰＳ細胞ライブラリーの汚染の程度
は、フィーダー層上のｐＰＳ細胞の最後の培養からの継
代の数に依存して０．２％、０．０５％、０．０１％、
または０．００１％未満であり得る。
【０１７２】ｃＤＮＡからの５’配列はまた、注釈付き
完全長ｍＲＮＡ配列のコレクションと比較して完全長配
列を提示するｃＤＮＡの比率を決定し得る。この文脈で
は、完全長配列は、コードされるタンパク質の開始メチ
オニンコドンを含むものとして規定され得る。例えば、
５’配列の読みは、ＢＬＡＳＴのような適切なサーチプ
ログラムを用いてＲＥＦＳＥＱコレクション（ＧｅｎＢ
ａｎｋ）と比較され得る。ＲＥＦＳＥＱエントリーにマ
ッチさせるこれらｃＤＮＡ配列について、配列アライン
メントの評価は、ｃＤＮＡ配列が、ＲＥＦＳＥＱエント
リーによりコードされるタンパク質の開始メチオニンを
含むか否かを示し得、そしてそれ故、完全長ｃＤＮＡの
比率が推定され得る。このＲＥＦＳＥＱコレクション
は、完全長ｍＲＮＡの推定されたサイズを示すために注
釈付きであるので、この分析は、特定サイズのｍＲＮＡ
に対応する完全長ｃＤＮＡのパーセンテージをさらに決
定するために評価され得る。例えば、長さが１ｋｂより
大きいｍＲＮＡに対応する完全長ｃＤＮＡのパーセンテ
ージに対して、長さが１ｋｂより小さいｍＲＮＡに対応
する完全長ｃＤＮＡのパーセンテージを比較することが
可能である。
【０１７３】このような産物が誘導される方法に依存し
て、対応するｍＲＮＡの全長コード領域を含むｃＤＮＡ
の比率は、調製物中のポリヌクレオチドまたはベクター
の少なくとも１５％、３０％、そしてしばしば５０％で
あり得る。挿入物の中間長さは、２本鎖ｃＤＮＡ調製物
を取得かつ選択するために用いた方法に依存して、少な
くとも約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、または４ｋｂで
あり得る。
【０１７４】（発現ライブラリーからの情報の使用）一
旦、ｐＰＳ細胞またはその分化した子孫からのｍＲＮＡ
またはｃＤＮＡの配列が決定されると、それは、このよ
うな配列を含むポリヌクレオチド、それらがコードする
ポリペプチドおよびこのポリペプチドに特異的な抗体の
製造に用いられ得る。
【０１７５】ポリヌクレオチドは、研究、診断、または
治療適用における任意の適切な目的のために核酸化学の
技法により製造される。ヌクレオチド配列は改変され
て、ネイティブのコード領域のセグメントを除去し、付
加的コード配列を付加し、または任意の所望の目的のた
めに変異およびその他の改変を導入し得る。実質的に同
一のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドフラグメ
ントが、ストリンジェントな条件下で、ｐＰＳ細胞また
はその分化した子孫からの発現ライブラリー中のｃＤＮ
Ａに、ヒトゲノム中に含まれるか、またはその他の細胞
型で発現されるその他のヌクレオチド配列に優先してハ
イブリダイズする。約１００塩基対以上のプローブの結
合のための高ストリンジェンシーの代表的条件は、２×
ＳＳＣ中６５℃のハイブリダイゼーション反応、その後
の０．１×ＳＳＣにおける繰り返し洗浄である。特定の
実施形態では、製造されたポリヌクレオチドのセグメン
トは、本開示で記載されたように得たｃＤＮＡについて
決定された配列または配列の一部に少なくとも約８０
％、９０％、９５％、または１００％同一である。例示
の配列と比較された、同一または相同配列中の連続残基
の長さは、増加する優先度の順で、少なくとも約１５、
３０、５０、７５、１００、２００または５００残基で
あり得る。
【０１７６】所望の核酸配列に基づき、ポリヌクレオチ
ドは、任意の適切な技法によって製造され得る。約５０
塩基対未満のオリゴヌクレオチドが、商業的サービスに
よるか、またはトリエステル法もしくはホスファイト法
のような公知の合成方法によるかのいずれかにより、化
学合成により首尾よく調製される。適切な方法は、モノ
ヌクレオシドホスホルアミダイトカップリングユニット
（Ｈｉｒｏｓｅら、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．１９：２４
４９−２４５２、１９７８：米国特許第４，４１５，７
３２号）を用いる固相合成である。改変された骨格を持
つポリヌクレオチドは、米国特許第５，５７８，７１８
号；同第５，５４１，３０７号；同５，３７８，８２５
号に記載のように調製され得る。ペプチド核酸の調製
は、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７６６，
８５５号、第５，７８６，４６１号およびＥＰ出願第９
７９１８５４９．２号に記載されている。
【０１７７】あるいは、ポリヌクレオチドは、所望の配
列を持つテンプレートを用いてＰＣＲ増幅により製造さ
れ得る。所望の配列に亘るオリゴヌクレオチドプローブ
をこのテンプレートにアニールし、ＤＮＡポリメラーゼ
により伸長し、次いで高温で融解させ、テンプレートと
伸長したオリゴヌクレオチドを解離させる。このサイク
ルを、所望の量の増幅されたポリヌクレオチドが得られ
るまで繰り返す（米国特許第４，６８３，１９５号およ
び第４，６８３，２０２号）。適切なテンプレートは、
ｐＰＳ細胞またはその子孫から調製された発現ライブラ
リー、またはヒトにおいて対応する遺伝子が発現される
任意の組織からのライブラリーを含む。大きなポリヌク
レオチドの産生スケール量は、所望の配列を適切なクロ
ーニングベクター中に挿入すること、およびクローンを
再生することか、またはこの配列を適切な宿主細胞中に
トランスフェクトすることのいずれかによって首尾よく
得られる。ヌクレオチドクローニングのための技法は、
Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ（前述）中、および米国特許第５，５５２，５２４
号中に与えられる。ポリヌクレオチドは、供給源に従っ
て適合された、フェノール−クロロホルム抽出、アガロ
ースゲル電気泳動、および当該分野で公知のその他の技
法のような、核酸化学における標準的な技法により精製
され得る。
【０１７８】ｐＰＳ細胞からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ
の配列データはまた、コード領域に含まれる配列を含む
ペプチドを製造するために用いられ得る。アミノ酸配列
を改変して、セグメントを除去もしくは付加するか、ま
たは任意の所望の目的のために変異およびその他の改変
を導入し得る。実質的に同一のポリペプチドまたはポリ
ペプチドフラグメントは、ヒトゲノム中に含まれるか、
またはその他の細胞型で発現されるその他のヌクレオチ
ド配列に優先して、ｐＰＳ細胞またはその分化した子孫
からの発現ライブラリーのｃＤＮＡ中にコードされたタ
ンパク質に特異的な抗体によって認識されるエピトープ
を共有する。特定の実施形態では、ペプチドは、増加す
る優先度の順で、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ中にコードさ
れるペプチドまたはペプチドフラグメントに、６０％、
８０％、９０％、９５％または１００％同一である。プ
ロトタイプのポリペプチドと比較される同一または相同
配列の長さは、全長タンパク質の長さまで、増加する優
先度の順に、約７、１０、１５、２５、５０または１０
０残基であり得る。
【０１７９】ポリペプチドおよびそれらの改変体は、任
意の適切な技法により製造され得る。短ポリペプチド
は、固相化学合成により調製され得る。固相化学合成の
原理は、Ｄｕｇａｓ ＆ Ｐｅｎｎｅｙ、Ｂｉｏｏｒｇ
ａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖ
ｅｒｌａｇ ＮＹ ５４−９２頁（１９８１）、および
米国特許第４，４９３，７９５号に見いだされ得る。自
動化固相ペプチド合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙ
ｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡから市販さ
れるＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４
３０Ａペプチド合成機のようなデバイスを用いて実施さ
れ得る。
【０１８０】より長いポリペプチドは、インビトロ翻訳
系における翻訳、または適切な宿主細胞中の発現により
首尾よく製造される。発現ベクターを生成するために、
所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、
転写および翻訳のための制御要素に作動可能に連結し、
次いで、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物、酵母Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような真
核微生物、または昆虫もしくは哺乳動物細胞のような高
等真核生物を含む、適切な宿主細胞中にトランスフェク
トする。本発明のペプチドを産生するために適切な多く
の発現系は、米国特許第５，５５２，５２４号に記載さ
れている。発現クローニングが、Ｌａｒｋ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ ＴＸのような商業的
サービスから利用可能である。産生後、タンパク質は、
代表的には、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー、またはＨＰＬＣを包含し得
る、適切な組み合せのタンパク質化学の標準的な方法に
よって精製される。
【０１８１】本発明のｍＲＮＡおよびｃＤＮＡによりコ
ードされるポリペプチドに特異的なポリクローナルおよ
びモノクローナル抗体は、発現ライブラリー中のタンパ
ク質コード領域からのアミノ酸配列を決定すること、お
よび決定された配列を含むタンパク質で動物を免疫する
こと、またはそれを免疫コンピテント細胞または粒子と
接触させることにより得られ得る。モノクローナル抗体
の産生は、Ｈａｒｒｏｗ ＆ Ｌａｎｅ（１９８８）の
ような標準的な文献、米国特許第４，４９１，６３２
号、同第４，４７２，５００号および同第４，４４４，
８８７号、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ ７３Ｂ：３（１９８１）に記載されてい
る。特異的抗体分子（必要に応じて単鎖可変領域の形態
にある）を得る他の方法は、免疫コンピテント細胞また
はウイルス粒子のライブラリーを標的抗原と接触させる
こと、およびポジティブに選択されたクローンを成長さ
せることを含む。Ｍａｒｋｓら、Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．
Ｍｅｄ．３３５：７３０、１９９６、国際特許公開ＷＯ
９４／１３８０４、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９０／
０２８０９、およびＭｃＧｕｉｎｅｓｓら、Ｎａｔｕｒ
ｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：１４４９、１９９６
を参照のこと。本開示のｐＰＳを用いてポジティブ選択
すること、および（分化した胚細胞のような）より広範
に分布した抗原を持つ細胞または成体由来幹細胞を用い
てネガティブに選択することにより、所望の特異性が得
られ得る。
【０１８２】本発明のｍＲＮＡまたはｃＤＮＡから得ら
れた配列データ由来のポリヌクレオチド、ポリペプチ
ド、および抗体は、多くの重要な商業的用途を有する。
例えば、ｐＰＳ細胞で発現されるが、分化の間に減少す
る遺伝子またはタンパク質は、未分化状態の分子マーカ
ーとして用いられ得る。抗体のような、これらのマーカ
ーに対応する試薬は、免疫アフィニティー単離または補
体媒介溶解による分化細胞の集団から未分化ｐＰＳ細胞
を除くために用いられ得る。分化の間に発現レベルが増
加する遺伝子またはタンパク質は、同様の様式で、ｐＰ
Ｓ細胞由来の特定の細胞型を精製、濃縮、取り出し、ま
たは除去するために用いられ得る。これらのマーカー
は、中胚葉、内胚葉または外胚葉系列で発現される遺伝
子またはタンパク質のような、広範なクラスの細胞分化
の指標として供され得るか、または高度に分化した細胞
型の限られたスペクトルの特異的マーカーとして供され
得る。
【０１８３】発現の間にアップレギュレートされる遺伝
子はまた、ｐＰＳ細胞の特定の系列への分化に影響する
ために有用である得る。例えば、転写因子、増殖因子、
レセプターおよびシグナル伝達分子をコードする導入遺
伝子の未分化ｐＰＳ細胞における強制発現は、特定細胞
系列への分化に影響する能力について試験され得る。
【０１８４】（多能性幹細胞の遺伝的改変）本開示はま
た、一時的または安定な様式のいずれかで、遺伝子的に
改変されたｐＰＳ細胞を得るための系を提供する。これ
は多くの目的に所望される。ｐＰＳ細胞の有望な１つ
は、研究、診断、および治療目的のための異なる組織型
のリザーバーを得る能力である。特定の分化した細胞集
団の濃縮を促進するために、分化に影響するか、または
未分化細胞の除去を補助する遺伝子を導入することが可
能であり得る。遺伝子選択の方法は、例えば、米国特許
第５，６０２，３０１号、同第５，７３３，７２７号、
および同第６，０１５，６７１号；および国際特許公開
ＷＯ９８／３２８６８、ＷＯ９９／５３０２２、および
ＷＯ９９／５５８４１に記載される。
【０１８５】特定の実施形態では、本発明は、薬物耐性
であるフィーダー細胞の層上にｐＰＳ細胞の組成物を提
供すること、この組成物中のｐＰＳ細胞中にポリヌクレ
オチドを移入すること；およびフィーダー細胞が耐性で
ある薬物を用いてこの組成物中の遺伝的に改変された細
胞を選択することによって遺伝的に改変されたｐＰＳ細
胞を得る方法を提供する。特定の実施形態では、このポ
リヌクレオチドは、未分化ｐＰＳ細胞でコード領域の転
写を促進するプロモーターに作動可能に連結されたタン
パク質コード領域を含む。他の実施形態では、このポリ
ヌクレオチドは、ｐＰＳ細胞を分化させることにより産
生される１つ以上の細胞型でコード領域の転写を促進す
るプロモーターに作動可能に連結されたタンパク質コー
ド領域を含む。
【０１８６】幹細胞を遺伝子的に改変する他の理由は、
テロメラーゼの触媒成分（ＴＥＲＴ）のための発現系を
提供することによりそれらを不死化すること、またはそ
うでなければ薬物スクリーニングのようなインビトロ使
用のためにそれらを遺伝的に適合させることである。治
療適用には、治療遺伝子で細胞を改変するか、または細
胞を意図されたレシピエントと組織適合性にすることが
有益であり得る。遺伝子改変はまた、分化後のソーティ
ングのための細胞を調製するために用いられる得る。例
えば、ｈＥＳ細胞は、ＯＣＴ−４プロモーターまたはｈ
ＴＥＲＴプロモーターのような未分化細胞に特異的なプ
ロモーターの制御下（ＷＯ９８／１４５９３）で、単純
ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（細胞をガンシクロ
ビル感受性にする）のような薬物感受性遺伝子でトラン
スフェクトされる。培養物を分化させた後、残存する未
分化細胞を、ガンシクロビルを用いてこの集団から除去
し得る。
【０１８７】ｐＰＳ細胞を、一時的であるか、または安
定かつ細胞が分裂するとき遺伝可能であるかのいずれか
である遺伝子改変を可能にする様式で遺伝子的に改変し
得ることを発見した。この遺伝子的に改変された細胞
は、培養中で未分化多能性形態で維持され得るか、また
はそれは、遺伝子改変をなお保持しながら他の細胞型に
分化され得る。有効な方法は、ｈＥＳ細胞を、初代フィ
ーダー細胞上で増殖するときに遺伝子的に改変されるこ
とを可能にすることを発見した。ｈＥＳ細胞がトランス
フェクション前に無フィーダー環境中にプレートされる
方法もまた提供され、これは、多くの重要な利点を提供
する。
【０１８８】細胞中に移入されるポリヌクレオチドは、
代表的には、細胞またはその子孫の表現型を所望の様式
に変化させる機能を提供する。例えば、それは、未分化
ｈＥＳ細胞中、または特定系列の分化細胞中の転写を促
進するプロモーターの制御下にあるコード領域を含み得
る。それはまた、アンチセンス反応性、三重鎖形成、ま
たはリボザイム作用のような適切な機構により内因性遺
伝子発現に影響し得る。
【０１８９】ｈＥＳ細胞中にベクタープラスミドを移入
する適切な方法は、米国特許第５，５７８，４７５号；
同第５，６２７，１７５号；同第５，７０５，３０８
号；同第５，７４４，３３５号；同第５，９７６，５６
７号；同第６，０２０，２０２号；および同第６，０５
１，４２９号に記載されるような、脂質／ＤＮＡ複合体
を含む。適切な試薬は、膜濾過水中の、ポリカチオン性
脂質２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミン
カルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プ
ロパンアミニウム（ｐｒｏｐａｎａｍｉｎｉｕｍ）トリ
フルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）（ケミカルアブスト
ラクツレジストリー名は：Ｎ−［２−（２，５−ビス
（３−アミノプロピル）アミノ］−１−オキシペンチル
（ｏｘｐｅｎｔｙｌ）｝アミノ）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジ
メチル−２，３−ビス（９−オクタデセニルオキシ）−
１−プロパンアミニウムトリフルオロアセテート）と中
性脂質ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（Ｄ
ＯＰＥ）との３：１（ｗ／ｗ）リポソーム処方物であ
る、リポフェクタミンを含む。例示は、処方物Ｌｉｐｏ
ｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃１１６６８０１９か
ら入手可能）である。他の試薬は以下を含む：ＦｕＧＥ
ＮＥTM ６Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ
（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．＃
１８１４４４３から得られ得る、８０％エタノール中の
非リポソーム形態の脂質と他化合物のブレンド）；およ
びＬｉｐｏＴＡＸＩTMトランスフェクション試薬（Ｉｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．、＃２０４１１０からの
脂質処方物）。
【０１９０】安定な遺伝子改変を持つｈＥＳ細胞を産生
するための適切なウイルスベクター系は、アデノウイル
スおよびレトロウイルスを基礎にし、そして市販のウイ
ルス成分を用いて調製され得る。
【０１９１】多くの適用には、ｈＥＳ細胞の遺伝子改変
は、２つの異なる協議事項への注意が必要である：十分
に高い効率の遺伝子改変を達成すること、および所望さ
れない経路に沿ってｈＥＳ細胞の分化を促進しない様式
でこの改変を実施することである。種々のトランスフェ
クションおよび形質導入系のスクリーニング、ならびに
反応タイミングおよび反応条件の最適化は、検出可能な
標識をコードする領域を持つ発現ベクターを用いる実験
で首尾よく実施され得る。特に便利な標識は、ルシフェ
ラーゼ、またはグリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のよ
うな本質的蛍光である。この標識はまた、組織病理学で
検出され得るか、または酵素反応によって定量化され得
る酵素であり得る。例は、アルカリホスファターゼ、お
よびβガラクトシダーゼを含む。この標識はまた、標識
された抗体で染色され、そして例えば、蛍光活性化細胞
計数デバイス中で定量され得る細胞表面タンパク質であ
り得る。一旦、有効な系が同定され、そして最適化され
ると、次いでこの標識のコード領域は、目的の遺伝子で
置換され得る。
【０１９２】遺伝子的に改変された細胞を分化について
モニターするために、細胞は、ＳＳＥＡ−４、ＯＣＴ−
４、およびＴＥＲＴのような、ｐＰＳ細胞の特徴である
マーカーの発現について試験され得る。トランスフェク
ション効率は、それによって、未分化表現型を持つ細胞
のパーセンテージとして算出され得る。遺伝子的に改変
された細胞の多能性はまた、インビトロ（例えば、胚葉
体形成による）またはインビボ（奇形腫形成）のいずれ
かで分化を誘導すること、および産生された細胞型を、
遺伝子的に改変されないｈＥＳ細胞によって産生された
ものと比較することにより確認され得る。
【０１９３】これらの規準、ならびにＧＦＰ含有プラス
ミドベクターを用いたトランスフェクションおよびＳＳ
ＥＡ−４の表面発現を追跡することにより、ｐＰＳ細胞
が再プレートされ、そしてベクターを添加する前４８時
間の間安定化される場合、遺伝子改変の効率が一般に改
善され得ると決定された。ＧＦＰのようなマーカーのピ
ーク発現は、約２４時間後に生じる。
【０１９４】遺伝子改変の効率はまれに１００％であ
り、そして、通常、首尾よく改変された細胞について集
団を濃縮することが所望される。線維芽細胞フィーダー
細胞上でｈＥＳ培養が用いられる場合、この効率は未分
化細胞の５〜２０％であり得る。遺伝子的に改変された
細胞は、新たな遺伝子型の機能的特徴を利用することに
より濃縮され得る。例えば、ｐＰＳ細胞が、ＧＦＰのよ
うな標識で、またはＮＣＡＭのような免疫染色可能な表
面マーカーと共にトランスフェクトされる場合、ｐＰＳ
細胞は、懸濁され、蛍光活性化細胞ソーティングにより
分離され、そして再プレートされ得る。読者は、ｐＰＳ
細胞の完全な分離が、通常、分化を促進することに注意
する。
【０１９５】遺伝子的に改変された細胞を濃縮する特に
有効な方法は、ネオマイシンまたはピューロマイシンの
ような薬物に対する耐性を用いるポジティブ選択であ
る。これを達成するために、細胞は、マーカー遺伝子ま
たは目的の遺伝子のためのベクター系、および薬物耐性
遺伝子を提供するベクター系と同時に接触させることに
より遺伝子的に改変され得る。この混合物中の薬物耐性
遺伝子の比率が低い場合（例えば３：１）、大部分の薬
物耐性細胞はまた、目的の遺伝子を含む。あるいは、こ
の薬物耐性遺伝子を、目的の遺伝子と同じベクター中に
構築し得る。トランスフェクションが生じた後、培養物
を対応する薬物で処理し、そして非トランスフェクト細
胞を取り除く。不運なことに、ｈＥＳ培養中のフィーダ
ー細胞もまた、通常、この薬物に感受性である。
【０１９６】この問題を克服するために、本開示はま
た、薬物耐性であるフィーダー細胞を提供する。分化す
ることなくｐＰＳ細胞を増殖させるために適切な環境を
提供することが知られる細胞は、薬物耐性遺伝子を導入
され、次いでフィーダー細胞として作用するそれらの能
力について再評価され得る。あるいは、（原発性マウス
線維芽細胞のような）フィーダー細胞は、薬物耐性遺伝
子についてトランスジェニックとされた非ヒト哺乳動物
から作製され得る。このようなマウスは；例えばＪａｃ
ｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されてい
る。このフィーダー細胞はまた、テロメラーゼ逆転写酵
素（ＴＥＲＴ）、またはＳＶ４０ラージＴ抗原のための
発現系で遺伝子的に改変することによって不死化され得
る。
【０１９７】実施例８は、ハイグロマイシン、ネオマイ
シン、およびピューロマイシンに対する薬物耐性遺伝子
を有し、そしてテロメライズ（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅ）
されたＮＨＧ１９０と称される永久フィーダー細胞株を
例示する。驚くべきことに、すべての操作、および遺伝
子混乱にかかわらず、細胞はなお、高度に有効なフィー
ダーであり、分化なしにｈＥＳ細胞の増殖を支持するマ
トリックス基質およびコファクターを提供する。ＮＨＧ
１９０細胞はまた、無フィーダー培養中でｈＥＳ細胞を
支持する馴化培地を作製するために適切である。実施例
９は、薬物耐性遺伝子で遺伝的に改変されたｈＥＳ細胞
の長期間選択に、薬物耐性フィーダー細胞がどのように
用いられ得るかを例示する。
【０１９８】ｐＰＳ細胞は、それらが無フィーダー培養
中で増殖される場合に特に遺伝子改変を受け易いことが
発見された（実施例１０に示される）。ＤＮＡ／脂質複
合体を用いる一時的トランスフェクションは６０％程度
と高くあり得る。細胞は操作することが容易であり、そ
してベクターに対するシンクとして作用するフィーダー
細胞は周囲にない。薬物選択は、薬物耐性フィーダー細
胞の利用可能性を必要としない。トランスフェクション
後増殖する未分化ｐＰＳコロニーの数もまた改善され得
る。
【０１９９】遺伝子改変および薬物選択（薬物耐性フィ
ーダーまたは無フィーダー培養）後、改変された表現型
を示すコロニーを釣り上げ、そしてそれらを別々に培養
することが可能である。釣り上げられたコロニーは、２
５〜１００細胞の小クランプに分散され、そして適切な
環境に再プレートされる。このセクションおよび本開示
の他の箇所で概説される戦略のいくつかまたは全部を用
いて、少なくとも約２５％、５０％、７５％、または９
０％でさえある未分化細胞が、遺伝子的に改変されたｐ
ＰＳ細胞の培養を達成することが可能である。
【０２００】（テロメル化された多能性幹細胞およびそ
の誘導体）ｐＰＳ細胞、線維芽細胞、または他の細胞型
の複製する能力を増加させることが所望される場合、適
切なベクターを用いて（上記に例証するように）、これ
らの細胞を遺伝的に変化させることによってそれらはテ
ロメル化（ｔｅｌｏｍｅｒｉｚｅｄ）され得、その結
果、これらの細胞はテロメラーゼ触媒成分（ＴＥＲＴ）
を発現する。特に適切なものは、ヒトテロメラーゼの触
媒成分（ｈＴＥＲＴ）であり、国際特許公開ＷＯ９８／
１４５９２において提供される。いくつかの適用のため
に、他のＴＥＲＴ配列が使用され得る（マウスＴＥＲＴ
は、ＷＯ９９／２７１１３において提供される）。
【０２０１】代表的には、ベクターは、意図された、分
化していない細胞株または分化した細胞株において転写
を促進する異種プロモーターの制御下でＴＥＲＴコード
領域を含む。ＴＥＲＴコード領域の発現を駆動し得る配
列には、ウイルスＬＴＲ、エンハンサー、およびプロモ
ーター（例えば、ＭＰＳＶ、ＳＶ４０、ＭｏＬＶ、ＣＭ
Ｖ、ＭＳＣＶ、ＨＳＶ、ＴＫ）、真核生物プロモーター
（例えば、β−アクチン、ユビキチン、ＥＦ１α、およ
びＰＧＫ）、またはそれらの組み合わせ（例えば、β−
アクチンプロモーターと組み合わせたＣＭＶエンハンサ
ー）が含まれる。マーカー遺伝子の発現は、ＴＥＲＴ遺
伝子と同じプロモーターによって、別々の発現カセット
としてか、ポリシストロン性転写物の一部としてか（こ
こではＴＥＲＴのコード領域およびマーカー遺伝子は、
ＩＲＥＳ配列によって分離され、両方の個々のタンパク
質が、単一のプロモーターによって駆動される単一の転
写物から作られることを可能にする）、または同じカセ
ットの一部（ＴＥＲＴおよびマーカー遺伝子の両方のコ
ード領域との間の融合物、ＴＥＲＴとマーカー遺伝子の
両方の機能を提供するタンパク質を産生する）としての
いずれかで駆動され得る。ヒト細胞におけるテロメラー
ゼのトランスフェクションおよび発現は、Ｂｏｄｎａｒ
ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３４９、１９９８および
Ｊｉａｎｇら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：１１１，１
９９９において記載される。
【０２０２】テロメル化の前後で、テロメラーゼ活性お
よびｈＴＥＲＴ発現は、標準的な試薬および方法を使用
して決定され得る。例えば、ｐＰＳ細胞は、ＴＲＡＰア
ッセイ（Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：２０１
１，１９９７；Ｗｅｉｎｒｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇ
ｅｎｅｔｉｃｓ １７：４９８，１９９７）を使用して
テロメラーゼについて評価される。以下のアッセイキッ
トは、研究目的で市販されている：ＴＲＡＰｅｚｅ（登
録商標）ＸＫテロメラーゼ検出キット（カタログ番号ｓ
７７０７；Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏ．，Ｐｕｒｃｈａｓ
ｅ ＮＹ）；およびＴｅｌｏ ＴＡＧＧＧ テロメラー
ゼＰＣＲ ＥＬＩＳＡｐｌｕｓ（カタログ番号２，０１
３，８９；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎ
ｄｉａｎａｐｏｌｉｓ ＩＮ）。ｈＴＥＲＴ発現はま
た、ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡで評価され得る。以
下のアッセイキットは、研究目的で市販されている：Ｌ
ｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ ｈＴＥＲ
Ｔ定量キット（カタログ番号３，０１２，３４４；Ｒｏ
ｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。
【０２０３】細胞を不死化させる他の方法（例えば、Ｓ
Ｖ４０ラージＴ抗原をコードするＤＮＡを用いて細胞を
遺伝的に変化させること（米国特許第５，８６９，２４
３号、国際特許公開ＷＯ９７／３２９７２）、エプスタ
イン−バーウイルスを用いる感染、ｍｙｃまたはｒａｓ
のようなオンコジーンの導入、アデノウイルスＥ１ａの
ようなウイルス複製遺伝子の導入、および、所望の表現
型を有する細胞を不死化された細胞株と融合すること）
もまた、意図される。オンコジーン産物およびオンコウ
イルス産物を用いるトランスフェクションは、細胞が治
療目的のために使用される場合は、より適切ではない。
【０２０４】（増殖させたｐＰＳ細胞およびその誘導体
の他の用途）本明細書の記載は、大量の多能性細胞がフ
ィーダー細胞の必要性なしで商業的に産生され得、次い
で前駆細胞または最終分化細胞に分化する方法を提供す
る。これらの細胞集団は、多くの重要な目的のために使
用され得る。
【０２０５】（特異的抗体の調製）フィーダー細胞なし
で維持されるｐＰＳ細胞は、胚マーカー、幹細胞マーカ
ー、生殖細胞マーカー、およびその細胞で発現され得る
他の抗原に特異的である抗体を調製するために使用され
得る。本明細書の開示で記載される細胞は、このような
抗体を惹起する改善された方法を提供する。なぜなら、
これらの細胞には、フィーダー細胞由来の抗原が本質的
に夾雑していないからである。ポリクローナル抗体は、
免疫原性型の本明細書の開示の細胞を脊椎動物に注入す
ることによって調製され得る。ポリクローナル抗体およ
びモノクローナル抗体の産生方法は、上記に提供され
る。本明細書の開示のｐＰＳを使用してポジティブに選
択すること、および、より広範に分布する抗原を有する
細胞（例えば、分化した胚細胞）または成体由来幹細胞
を使用してネガティブに選択することによって、所望の
特異性が得られ得る。
【０２０６】（増殖因子、分化因子、および医薬のスク
リーニング）ｐＰＳ細胞は、培養中のｐＰＳ細胞の特徴
に影響を与える因子（例えば、低分子薬物、ペプチド、
ポリヌクレオチドなど）または状態（例えば、培養条件
または操作）をスクリーニングするために使用され得
る。この系は、試験化合物によるフィーダー細胞の摂動
によって引き起こされる二次的な効果によって複雑化さ
れない利点を有する。１つの適用において、増殖に影響
を与える物質が試験される。馴化培地は、培養から除か
れ、そしてより単純な培地（例えば、ＫＯ ＤＭＥＭ）
が代用される。次いで、異なるウェルが、馴化培地の成
分を置換するための候補である可溶性因子の異なるカク
テルで処理される。各々の混合物の効力は、処理された
細胞が、満足できる様式、最適には馴化培地と同様に、
維持および増殖されるか否かについて決定される。強力
な分化因子または条件は、試験プロトコールに従って細
胞を処置することによって試験され得、次いで処理した
細胞が、特定の系統の分化した細胞の機能的特性または
表現型特性を発現するか否かを決定する。
【０２０７】フィーダー細胞を含まないｐＰＳ培養物は
また、薬物探索において薬学的化合物の試験において使
用され得る。候補の薬学的化合物の活性の評価は、一般
的に、本発明の分化した細胞と候補化合物とを組み合わ
せること、任意の結果の変化を測定すること、および、
次いで、観察された変化を有する化合物の効果を相関付
けることを包含する。スクリーニングは、例えば、化合
物が特定の細胞型に薬理学的な効果を有するように設計
されるためにか、または他で効果を有するように設計さ
れた化合物は、意図されない副作用を有し得るためにか
のいずれかの理由のためになされ得る。２つ以上の薬物
が、可能な薬物−薬物相互作用効果を検出するために、
組み合わせて（同時にまたは連続してのいずれかで、細
胞と合わせることによって）試験され得る。いくつかの
適用において、化合物は、最初に、潜在的な毒性につい
てスクリーニングされる（Ｃａｓｔｅｌｌら、３７５−
４１０頁、「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９７）。細
胞毒性は、細胞の生存可能性、生存、形態に対する効
果、特定のマーカー、レセプター、または酵素の発現ま
たは放出に対する効果、［3Ｈ］−チミジンまたはＢｒ
ｄＵ取り込みによって測定されるＤＮＡ合成または修復
に対する効果、または分裂中期スプレッドによって決定
される姉妹染色分体交換に対する効果によって決定され
得る。読者は一般に、標準的な教科書「Ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ、１９９７、および米国特許第５，０３０，０１５
号を参照する。
【０２０８】（ゲノム研究）本明細書の開示において記
載される細胞は、前駆細胞に特徴的な転写物および新規
に合成されるタンパク質の発現パターンを同定するため
に使用され得、そして分化の経路を指図する際に、また
は細胞間の相互作用を促進する際に補助し得る。目的の
細胞集団の発現パターン（例えば、直接的に分化した、
または胚様体もしくは特定の系統の細胞を通して分化し
たヒトＰＳ細胞）は、コントロール細胞株（例えば、未
分化のｐＰＳ細胞、他の型の前駆細胞、最終分化細胞、
または別の種の分化した細胞（例えば、アカゲザルＰＳ
細胞））と比較される。
【０２０９】タンパク質レベルで発現を比較するための
適切な方法には、上記のイムノアッセイまたは免疫細胞
化学技術が含まれる。転写レベルで発現を比較するため
の適切な方法には、ｍＲＮＡのディファレンシャルディ
スプレイ法（Ｌｉａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５
２：６９６６，１９９２）およびマトリックスアレイ発
現系（Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：４６
７，１９９５；Ｅｉｓｅｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．３０３：１７９，１９９９；Ｂｒｏｗｎら、
Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１ 補遺 １：３３，１９９
９）が含まれる。
【０２１０】遺伝子発現の分析におけるマイクロアレイ
の使用は、Ｆｒｉｔｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：３
１６，２０００；「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈ
ｉｐＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」Ｍ．Ｓｃｈｅｎａ編、Ｅａ
ｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ；「Ｍ
ｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｎａｌｙｓｉｓ」、Ｇｗｙｎｎ
ｅ ＆ Ｐａｇｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９年８月６
日補遺）；Ｐｏｌｌａｃｋら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ ２
３：４１，１９９９；Ｇｅｒｈｏｌｄら、Ｔｒｅｎｄｓ
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：１６８，１９９９；
インターネットＵＲＬ ｗｗｗ．Ｇｅｎｅ−Ｃｈｉｐ
ｓ．ｃｏｍ．における「Ｇｅｎｅ Ｃｈｉｐｓ（ＤＮＡ
Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）」，Ｌ．Ｓｈｉによって一
般に概説される。マイクロアレイ分析を実行するための
システムおよび試薬は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎ
ｃ．，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ；Ｇｅｎｅ Ｌｏ
ｇｉｃ Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ ＭＤ；ＨｙＳｅ
ｑ Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ；Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖ
ａｌｅ ＣＡ；Ｎａｎｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
ＣＡ；およびＳｙｎｔｅｎｉ Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎ
ｔ ＣＡ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ ＣＡより獲得）のような会社から市販され
ている。
【０２１１】固相アレイは、所望の位置でプローブを合
成することによって、またはプローブフラグメントをプ
レ合成し、次いで固相支持体にそれを結合させることに
よってのいずれかで、特定の部位にプローブを結合させ
ることによって製造される。種々の固体支持体が使用さ
れ得、これらには、ガラス、プラスチック、セラミック
ス、金属、ゲル、メンブレン、紙、および種々の組成の
ビーズが含まれる。米国特許第５，４４５，９３４号
は、オンチップ合成の方法を開示し、ここではガラスス
ライドが、光切断性の保護基を含む化学種で誘導体化さ
れる。各部位は、マスクを通しての放射によって連続し
て脱保護され、次いで光保護基を含むＤＮＡモノマーと
反応される。プレ合成されたプローブを固体支持体に結
合させるための方法には、吸着、紫外線連結、および共
有結合が含まれる。１つの例において、固体支持体は、
プローブが結合する活性基（例えば、ヒドロキシル基、
カルボキシル基、アミン基、アルデヒド基、ヒドラジン
基、エポキシド基、ブロモアセチル基、マレイミド基、
またはチオール基）を有するように修飾される（米国特
許第５，４７４，８９５号および同第５，５１４，７８
５号）。
【０２１２】プローブアッセイは、代表的には、ハイブ
リダイゼーション条件のために適切な条件下で目的のヌ
クレオチド配列を含む可能性のある液体によってアレイ
を接触させ、次に任意のハイブリッド形成を測定するこ
とによって行われる。例えば、サンプル中のｍＲＮＡま
たはＤＮＡは、適切な標識（例えば、蛍光標識Ｃｙ３ま
たはＣｙ５）に結合されたヌクレオチドの存在下で増幅
される。条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補
性の一致または種々の程度の相同性で生じるように適切
に調整される。次いで、アレイは洗浄され、そして結合
している核酸は、固相と結合している標識の存在または
量を測定することによって決定される。異なるサンプル
は、発現の相対量についてアレイ間で比較され得、必要
に応じて目的の大部分の細胞において発現される遺伝子
（例えば、リボソーム遺伝子またはハウスキーピング遺
伝子）を使用してか、または、サンプル中の全ヌクレオ
チドの比率として標準化される。あるいは、２つ以上の
異なる供給源からのサンプルは、異なる標識を有する各
供給源から増幅されたポリヌクレオチドを調製すること
によって同じアレイ上で同時に試験され得る。
【０２１３】例示的な方法は、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃ
ｒｏｓｙｓｔｅｍｓアレイジェネレーターおよびＡｘｏ
ｎ ＧｅｎｅＰｉｘTM Ｓｃａｎｎｅｒを使用して行わ
れる。マイクロアレイは、９６または３８４ウェル様式
で分析されるマーカー配列をコードするｃＤＮＡフラグ
メントを最初に増幅することによって調製される。次い
で、ｃＤＮＡは、スライドあたり５，０００よりも高い
密度で、スライドガラス上に直接スポットされる。目的
の２つの細胞からのｍＲＮＡ調製物を比較するために、
１つの調製物は、Ｃｙ３標識されたｃＤＮＡに転換され
るが、他方は、Ｃｙ５標識されたｃＤＮＡに転換され
る。その２つのｃＤＮＡ調製物は、同時にマイクロアレ
イスライドにハイブリダイズされ、次いで、非特異性結
合を除去するために洗浄される。アレイ上の任意の所定
のスポットは、２つのもともとのｍＲＮＡ調製物中の転
写物の豊富さに比例して、ｃＤＮＡ産物の各々に結合す
る。次いで、そのスライドは、標識の各々に適切な波長
でスキャンされ、得られる蛍光が定量され、そしてその
結果は、アレイ上のそれぞれのマーカーについてのｍＲ
ＮＡの相対的な豊富さの指標を与えるように形式付けら
れる。
【０２１４】本発明の分化した細胞を特徴付けること、
およびその細胞に影響を与えることにおける使用のため
の発現産物を同定することには、第１の細胞型（例え
ば、多能性前駆細胞、または特定の経路に沿って分化し
得る細胞）におけるＲＮＡ、タンパク質、または他の遺
伝子産物の発現レベルを分析すること；次いでコントロ
ール細胞型における同じ産物の発現レベルを分析するこ
と；２つの細胞型間の相対的な発現レベルを比較するこ
と（代表的には、サンプル中の全タンパク質またはＲＮ
Ａによって標準化されるか、または両方の細胞型におい
て同様のレベルで発現されることが予想される別の遺伝
子産物（例えば、ハウスキーピング遺伝子）と比較し
て）；および、次いで比較した発現レベルに基づいて目
的の産物を同定すること、を包含する。
【０２１５】産物は、代表的には、コントロールと比較
して、本発明の分化したｐＰＳ細胞において、その相対
的発現レベルが、少なくとも約２倍、１０倍、または１
００倍上昇（または抑制）される場合に、目的の産物で
ある。この分析は、必要に応じて、独立した座標軸上で
各々の細胞型における発現レベルをマークすることによ
ってコンピューターで補助され得、ここで、各々の座標
軸に対するマークの位置は、それぞれの細胞における発
現レベルに従い、次いで、マークの位置に基づいて目的
の産物を選択する。あるいは、第１の細胞とコントロー
ル細胞との間の発現の差違は、色のスペクトル上で表さ
れ得る（例えば、黄色が等価な発現レベルを表し、赤が
増大した発現を表し、そして青が抑制された発現を表す
場合）。次いで、目的の産物は、目的の１つのマーカー
の発現を表す色に基づいて、または複数のマーカーを表
す色のパターンに基づいて選択され得る。
【０２１６】分化の間の発現レベルの変化を受ける遺伝
子およびタンパク質は、多数の目的のために興味深い。
例えば、発現がｐＰＳ細胞中で高く、そして分化の間に
減少する場合、未分化状態の分子マーカーとして使用さ
れ得る。これらのマーカーに対応する試薬（例えば、抗
体）が使用されて、例えば、免疫アフィニティー単離ま
たは補体媒介溶解によって、分化された細胞の集団から
未分化のｐＰＳ細胞を除去し得る。発現が分化の間増加
する場合に、マーカーは、類似の様式において、ｐＰＳ
細胞由来の特定の細胞型を精製、富化、除去、または排
除するために使用され得る。これらのマーカーは、細胞
分化の広範なクラス（例えば、中胚葉、内胚葉、または
外胚葉の系統において発現される遺伝子またはタンパク
質）の指標として働き得るか、または、高度に分化した
細胞型のマーカーとして働き得る。
【０２１７】発現の間に上方制御される遺伝子はまた、
ｐＰＳ細胞の特定の系統への分化に影響を与えるために
有用であり得る。例えば、転写因子、増殖因子、レセプ
ター、およびシグナル伝達分子をコードするトランスジ
ーンの未分化ｐＰＳ細胞での強制的な発現は、特定の細
胞系統への分化に影響を与える能力について試験され得
る。
【０２１８】（治療的組成物）本発明の分化した細胞は
また、その必要のあるヒト患者において組織の再構築ま
たは再生のために使用され得る。その細胞は、意図され
た組織部位にその細胞を移植することを可能にし、そし
て機能的に欠損している領域を再構成または再生する様
式で投与される。
【０２１９】１つの例において、神経幹細胞は、処置さ
れる疾患に従って、中枢神経系の実質部位またはクモ膜
下腔内の部位に直接的に移植される。移植は、１μＬあ
たり２５，０００〜５００，０００細胞の密度の単一の
細胞懸濁物または小さな凝集物を使用して行われる（米
国特許第５，９６８，８２９号）。神経細胞移植物の効
力は、ＭｃＤｏｎａｌｄら（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１４
１０，１９９９）によって記載されるように、急性的に
損傷した脊髄についてのラットモデルにおいて評価され
得る。首尾よい移植は、損傷において２〜５週間後に存
在する移植片由来の細胞（星状細胞、稀突起神経膠細
胞、および／またはニューロンに分化した）および損傷
した末端から脊髄に沿っての移動、ならびに歩行（ｇａ
ｔｅ）、協調（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ）、および重
量負荷における改善を示す。
【０２２０】心筋細胞の効力は、処置がない場合、左心
室壁組織の５５％が瘢痕組織になることを引き起こす心
臓の低温障害についての動物モデルにおいて評価され得
る（Ｌｉら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６２：
６５４，１９９６；Ｓａｋａｉら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａ
ｃ．Ｓｕｒｇ．８：２０７４，１９９９、Ｓａｋａｉ
ら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒ
ｇ．１１８：７１５，１９９９）。首尾よい処置は、瘢
痕の領域を減少し、瘢痕の拡大を制限し、そして、収縮
期の血圧、拡張期の血圧、そして生じた（ｄｅｖｅｌｏ
ｐｅｄ）血圧によって決定されるように、心機能を改善
する。心臓傷害はまた、左前空間動脈の遠位の部分にお
いて塞栓形成コイルを使用してモデル化され得（Ｗａｔ
ａｎａｂｅら、Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．７：
２３９，１９９８）、そして処置の効力は、組織学およ
び心機能によって評価され得る。本発明において具体化
される心筋細胞調製物は、心筋を再生するために、そし
て不十分な心機能を処置するために、治療において使用
され得る（米国特許第５，９１９，４４９号およびＷＯ
９９／０３９７３）。
【０２２１】肝細胞および肝細胞前駆体は、肝障害を修
復する能力についての動物モデルにおいて評価され得
る。１つのそのような例は、Ｄ−ガラクトサミンの腹腔
内注入によって引き起こされる傷害である（Ｄａｂｅｖ
ａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４３：１６０６，１
９９３）。処置の効力は、肝細胞マーカーについての免
疫組織化学的染色、増殖している組織において小管構造
が形成されるか否かの顕微鏡的決定、および肝細胞特異
的タンパク質の合成を回復させる処置の能力によって決
定され得る。肝細胞は、直接的投与によって、または劇
症肝不全の後に被験体の肝組織がそれ自体を再生する間
に一時的に肝機能を提供する生物補助（ｂｉｏａｓｓｉ
ｓｔ）デバイスの一部として、治療において使用され得
る。
【０２２２】ヒトまたは獣医学的治療のために有用であ
る本発明に従って調製される細胞は、最適には、薬学的
組成物中に供給され得、ヒト投与のために十分に滅菌し
た条件下で調製される等張性の賦形剤を含む。医薬処方
物における一般的な原理について、読者は、以下を参照
する：Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ
Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ，ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｔ
ｈｅｒａｐｙ，Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ ＆ Ｗ．Ｓｈｅｒ
ｉｄａｎ編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６；およびＨｅｍａｔｏｐｏｉ
ｅｔｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．
Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ ＆ Ｐ．Ｌａｗ，Ｃ
ｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２００
０。その組成物は、組織再生、または治療的に重要な代
謝機能を回復させることにおける細胞の使用について書
かれた説明書とともにパッケージされ得る。
【０２２３】以下の実施例は、さらなる例示のために提
供され、そして特許請求の範囲に記載される発明の実施
におけるいかなる制限も意味されない。
【０２２４】
【実施例】（実施例） （実施例１：ｈＥＣ細胞のフィーダー細胞を含まない継
代）この実験において、初代マウス胚フィーダー細胞上
で維持されてきた未分化のｈＥＳ細胞を収集し、次いで
フィーダー細胞の非存在下で維持した。培養物ウェル
を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）でコートし、細胞
を、放射した初代線維芽細胞の培養物から得られた馴化
栄養培地の存在下で培養した。
【０２２５】（初代マウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ）から
の馴化培地（ＣＭ）の調製）Ｃａ++およびＭｇ++を含ま
ないＰＢＳで一回洗浄すること、および１．５〜２ｍＬ
のトリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）中で約５分間イ
ンキュベートすることによって、Ｔ１５０フラスコから
線維芽細胞を収集した。線維芽細胞がフラスコから脱離
した後に、それらの細胞をｍＥＦ培地（ＤＭＥＭ＋１０
％ ＦＢＳ）中で収集した。細胞に、４０００ｒａｄで
照射し（１４０ｋＶで５０８秒：Ｔｏｒｒｅｘジェネレ
ーターにおいてシェルフ設定６）、計数し、そしてｍＥ
Ｆ培地中に約５５，０００細胞ｃｍ-2で播種した（５２
５，０００細胞／６ウェルプレートの１ウェル）。少な
くとも４時間後、６ウェルプレートの９．６ｃｍウェル
当たり３〜４ｍＬを使用して、培地をＥＳ培地を含むＳ
Ｒで交換した。馴化培地を、ｈＥＳ培養物の給餌のため
に毎日収集した。あるいは、培地を、培養フラスコ中に
プレートしたｍＥＦを使用して調製し、毎日、０．３〜
０．４ｍＬｃｍ-2で培地を交換した。ｈＥＳ培養物に添
加する前に、馴化培地を、４ｎｇ／ｍＬのヒトｂＦＧＦ
（Ｇｉｂｃｏ）で補充した。線維芽細胞培養物を、この
系で約１週間使用した。その後新しく調製した細胞で置
き換えた。
【０２２６】（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティ
ング：）増殖因子を減少させたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録
商標）または通常のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（Ｂ
ｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ Ｍ
Ａ）を、４℃で融解した．Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商
標）を、冷ＫＯ ＤＭＥＭ中で１：１０〜１：５００
（代表的には、１：３０）に希釈した。０．７５〜１．
０ｍＬの溶液を、各９．６ｃｍ2ウェルに添加し、そし
て室温で１時間、または４℃で少なくとも一晩インキュ
ベートした。コートしたウェルを、冷ＫＯ ＤＭＥＭで
１回洗浄し、その後細胞を添加した。コーティング後２
時間以内にプレートを使用するか、または４℃でＤＭＥ
Ｍ中に保存し、そして約１週間以内に使用した。
【０２２７】（ヒトＥＳ培養物：）非分化のｈＥＳコロ
ニーを、以下のようにフィーダー細胞上のｈＥＳ培養物
から収集した。培養物を、約２００Ｕ／ｍＬのＩＶ型コ
ラゲナーゼ中で、３７℃で５分間インキュベートした。
コロニーを、顕微鏡下で、個々のコロニーを２０μＬの
ピペットチップを使用して拾い上げることによってか、
またはかき取って馴化培地（ＣＭ）中で小さなクラスタ
ーに解離させることによって収集した。次いで、これら
の細胞を、馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）
に、各９．６ｃｍ2ウェルに対して１５コロニーで播種
した（１コロニーが約１０，０００細胞の場合、プレー
ティング密度は約１５，０００細胞ｃｍ-2）。
【０２２８】Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上の播種後
の翌日、ｈＥＳ細胞は、小さなコロニー（約１００〜
２，０００細胞）として見えた。そしてコロニー間に、
分化しているかまたは死滅している細胞に見える細胞が
存在した。ｈＥＳ細胞が増殖するにつれて、コロニー
は、非常に大きくなり、そしてぎっしり詰まるようにな
り、このことは培養ディッシュの表面領域の大部分を表
す。コロニー中のｈＥＳ細胞は、高い核対細胞質比を有
し、そしてフィーダー細胞上で維持されるｈＥＳ細胞に
類似の顕著な核小体を有した。コンフルエンスにおい
て、コロニー間で分化した細胞は、培養物中の細胞１０
％未満を表した。
【０２２９】播種の６日後、培養物はほぼコンフルエン
トになった。培養物を、ＫＯ ＤＭＥＭ中で、１ｍＬの
約２００Ｕ／ｍＬのＩＶ型コラゲナーゼ溶液とともに、
３７℃で約５分間インキュベートすることによって分割
した。このコラゲナーゼ溶液を吸引し、ウェルあたり２
ｍＬのｈＥＳ培地を添加し、そしてｈＥＳ細胞を、ピペ
ットを用いてディッシュからこすり取った。細胞懸濁物
を、１５ｍＬコニカルチューブに移し、６ｍＬの容量ま
でにし、そして、１０〜２０００細胞の小さなクラスタ
ーに細胞を解離させるために穏やかに摩砕した。次い
で、この細胞を、上記のように、ＣＭ中の、Ｍａｔｒｉ
ｇｅｌ（登録商標）コートしたプレート上に再播種し
た。細胞を、１：３または１：６の比で、およそ９０，
０００〜１７０，０００細胞ｃｍ-2で播種し、各ウェル
における容量を３ｍＬにした。培地を毎日交換し、そし
て１３日目に再度細胞を分割し、そして継代し、そして
最初の播種から１９日目に再度行う。
【０２３０】最初の播種後１９日目に、細胞を収集し、
そして細胞表面マーカーに特異的な標識された抗体を使
用して、免疫蛍光細胞サイトメトリーによって表面マー
カー発現について評価した。この実験からの結果は以下
の通りである：
【０２３１】
【表１】 フィーダー細胞の非存在下で維持されるｈＥＳ細胞につ
いて、高い割合がＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、ま
たはＴｒａ１−８１を発現する。これらの３つのマーカ
ーは、フィーダー細胞上で維持される未分化のヒトＥＳ
細胞上で発現される（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９８）。
さらに、ＳＳＥＡ−１の非常に少ない発現が存在し、こ
れは、未分化のＥＳ細胞上では発現しない（か、また
は、低いレベルで発現する）糖脂質である。ＳＳＥＡ−
４、Ｔｒａ−１−６０、およびＴｒａ−１−８１の免疫
細胞化学評価は、これらのマーカーの発現が、ＥＳコロ
ニーに局在し、コロニー間の分化した細胞には局在しな
いことを示す。
【０２３２】フィーダー細胞の非存在下で増殖するｈＥ
Ｓ細胞はさらに、核型（Ｇ−バンディング（ｂａｎｄｉ
ｎｇ）によって評価される）、ＯＣＴ−４の発現（ＰＣ
Ｒによって評価される、未分化のＥＳ細胞に付随するＰ
ＯＵ転写因子ファミリーのメンバー）、奇形腫を形成す
る能力（約５×１０6細胞でのＳＣＩＤ／ベージュマウ
スへの注射１〜４ヶ月後）、および凍結保存についての
適合性（速度制御フリーザーにおいて、１０％ＤＭＳＯ
および２０〜３０％ ＳＲを補充した標準培地中）によ
って特徴付けられ得る。
【０２３３】ｈＥＳ細胞の培養物を、最初の播種後１４
７日間にわたって、増殖能力または表現型の見かけの変
化を伴わずに、フィーダー細胞の非存在下で増殖させ
た。ｍＥＦ馴化培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）
上で維持されるヒトＥＳ細胞は、約３１〜３３時間の倍
加時間を有し、ｍＥＦフィーダー細胞上で増殖するｈＥ
Ｓ細胞についての増殖速度に類似する。フィーダー細胞
を含まない培養物の６４時間後のＨ１細胞は、正常な核
型を示した。
【０２３４】（実施例２：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商
標）およびラミニンは、ｈＥＳ細胞のフィーダー細胞を
含まない増殖を支持する）ｈＥＳ細胞の増殖は、初代マ
ウス胚線維芽細胞（ｍＥＦ）を使用して馴化された培地
中で、異なるマトリックス成分の結果として生じる。
【０２３５】ｈＥＳ培養物は、最初に、４ｎｇ／ｍＬの
組換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ；Ｇ
ｉｂｃｏ）を補充したＥＳ培地（８０％ノックアウトＤ
ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍ
Ｄ）、２０％ノックアウト血清置換物（Ｇｉｂｃｏ Ｂ
ＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、１％ 非必須アミ
ノ酸（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍ
Ｄ）、１ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、０．１
ｍＭ β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））中で維持されるフィーダー細胞培
養物から収集した。培養物を、約２００Ｕ／ｍＬのＩＶ
型コラゲナーゼ中、３７℃での約５〜１０分間のインキ
ュベーションによって継代した。次いで、コロニーを、
顕微鏡下でＰｉｐｅｔｍａｎTMを用いて個々のコロニー
を除去することによってか、または掻き取ることによっ
て収集し、続いて馴化培地中で小さなクラスターに穏や
かに解離させ、次いで、マトリックスコートしたプレー
トに播種する。
【０２３６】採取したｈＥＳ細胞を、ｍＥＦ馴化培地
中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはゼラチンに播
種した。播種の翌日、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）に
プレートした細胞をプレートに付着させ、そしてフィー
ダー層上のｈＥＳコロニーよりあまり密集しない小さな
コロニーを形成させた。次の数日後になると、コロニー
のサイズが大きくなり、そして細胞がより密集した。得
られた培養物は、分化した細胞に取り囲まれた、非常に
密な未分化のコロニーを含んでいた。
【０２３７】播種の約１週間後には培養物はコンフルエ
ントになり、そして継代し得た。対照的に、ゼラチンに
播種した細胞は、貧弱な生存を示し、そして生存した細
胞は分化したようであった。３つのｈＥＳ細胞株、Ｈ
１、Ｈ７およびＨ９を、ｍＥＦ馴化培地中、Ｍａｔｒｉ
ｇｅｌ（登録商標）において培養した。培養物を、１０
０日を超えてＥＳ様形態を提示し続けるためのこれらの
条件下で維持した。
【０２３８】Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）の主要成分
は、ラミニン、コラーゲンＩＶ型およびヘパリン硫酸プ
ロテオグリカンである。これらの成分がｈＥＳ細胞培養
を支持する能力を別々に試験した。ラミニン、コラーゲ
ンＩＶ型またはフィブロネクチン（全てＳｉｇｍａか
ら）を、ＰＢＳ中、それぞれ２０μｇ／ｍｌ、１０μｇ
／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの終濃度まで希釈した。
【０２３９】ラミニン、フィブロネクチン、またはコラ
ーゲンＩＶ型上に播種したｈＥＳ細胞は、未分化ｈＥＳ
細胞のコロニーを有したが、フィブロネクチンまたはコ
ラーゲンＩＶ型上の培養物は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録
商標）またはラミニン上の培養物ほど多くの未分化コロ
ニーを含んでいなかった。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商
標）またはラミニン上の細胞がコンフルエントに達した
とき、コロニー内の細胞は非常に密集した状態になり、
フィーダー上で維持された細胞と形態学的に非常に類似
し、そして連続的に継代された。４０日（６回継代）
後、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）およびラミニン上の
細胞は、高い割合の、長期の培養期間中にＥＳ様形態を
提示し続けたコロニーを含んでいた。しかし、フィブロ
ネクチンまたはコラーゲンＩＶ型上で維持した細胞は、
適切なＥＳ形態を提示するコロニーがより少なかった。
コントロールとして、非馴化培地中でＭａｔｒｉｇｅｌ
（登録商標）またはラミニン上で培養した細胞は、より
ゆっくりと増殖するようであり、そして数回の継代の後
に分化した形態を示した。
【０２４０】図１は、フィーダーなしの培養物における
ｈＥＳ細胞の形態を示す。パネルＡ（左側）は、非馴化
培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中のフィーダー細胞上で、ｍＥＦ
馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニ
ン、フィブロネクチン、またはコラーゲンＩＶ型上で培
養したＨ１株のｈＥＳ細胞の形態を示す。パネルＢは、
実施例１１に記載される種々の型の馴化培地中のＭａｔ
ｒｉｇｅｌ（登録商標）上で維持されたＨ９株のｈＥＳ
細胞の形態を示す。
【０２４１】ラミニンは、脊椎動物における全ての基底
層の主要成分であり、これは、細胞膜上のインテグリン
ヘテロ二量体（例えば、α１β１、α２β１、α３β
１、α６β１、およびα６β４）と相互作用し、そして
発生の間の細胞増殖および移動を媒介する。これらのイ
ンテグリンの中でも、α６β１およびα６β４は、ラミ
ニンに特異的であり；他のインテグリンはまた、他のマ
トリクスと相互作用する。ラミニンレセプターがｈＥＳ
細胞上で発現されるか否か、およびラミニンまたはＭａ
ｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養しているｈＥＳがラ
ミニンレセプターの発現を変化させるか否かを、別の実
験で試験した。α１、α２、α３、α６、β１およびβ
４を含むインテグリンの発現を、フィーダー上、馴化培
地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上
で維持した細胞に対してＦＡＣＳ分析により試験した。
インテグリン発現を分析するために、ラミニン特異的イ
ンテグリン検査キット（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，Ｃ
Ａ）によりインテグリン特異的抗体のパネルで細胞を染
色し、そして以下で記載のようにＦＡＣＳにより分析し
た。
【０２４２】図１のパネルＣは、非馴化培地（ｍＥＦ／
ＲＭ）中のフィーダー上、またはＭａｔｒｉｇｅｌ（登
録商標）上、またはｍＥＦ馴化培地（ＣＭ）中のラミニ
ン上で維持したＨ１ ｈＥＳ細胞において測定したイン
テグリン発現を示す。
【０２４３】Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）／馴化培地
中で維持した細胞およびラミニン／馴化培地中で維持し
た細胞を、以下のように低温保存した：細胞を、１０％
ＤＭＳＯおよびさらなる１０％ＳＲ（計３０％）を補充
した標準ｈＥＳ培地（馴化培地でない）中で凍結した。
細胞を馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上ま
たはラミニン上で融解した。細胞は、融解後に通常の核
型を維持した。
【０２４４】ｍＥＦ馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登
録商標）上で維持したヒトＥＳ細胞は、ｍＥＦフィーダ
ー細胞上で増殖したｈＥＳ細胞の増殖速度と類似して、
約３１〜３３時間の倍加時間（ｄｏｕｂｌｉｎｇ ｔｉ
ｍｅ）を示した。フィーダーなし培養物の６４日後のＨ
１細胞は、正常な核型を示した。
【０２４５】（実施例３：フィーダーなしの培養におけ
るｈＥＳ細胞の表現型マーカー）未分化ｈＥＳ細胞は、
ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、
ＯＣＴ−４およびｈＴＥＲＴを発現する。フィーダーな
しの条件下で維持された細胞がこれらのマーカーを維持
したか否かを評価するために、細胞を免疫染色、逆転写
酵素ＰＣＲ増幅、およびテロメラーゼ活性に関するアッ
セイにより評価した。
【０２４６】図２は、ＦＡＣＳ分析によるフィーダーな
しの細胞における表面マーカー発現を示す。パネルＡ：
非馴化培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中のフィーダー上、ｍＥＦ
馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニ
ン、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩＶ型上で維持
されたＨ１細胞におけるＳＳＥＡ−４の発現。アイソタ
イプコントロールを破線で示す。パネルＢ：異なるマト
リクス上で培養したＨ１細胞におけるＳＳＥＡ−１、Ｓ
ＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１
の平均蛍光強度。パネルＣ：異なる細胞株に由来する馴
化培地中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養した
Ｈ９細胞におけるＳＳＥＡ−１、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ
−１−６０およびＴｒａ−１−８１の平均蛍光強度。
【０２４７】蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）
による分析のために、ｈＥＳ細胞をＰＢＳ中０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ中で解離し、そしてＰＢＳ中０．１％ ＢＳ
Ａを含有する５０μＬ希釈液中、約５×１０5細胞に再
懸濁した。表面マーカー発現を分析するために、細胞
を、希釈液中に希釈した一次抗体（ＩｇＧアイソタイプ
コントロール（０．５μｇ／試験）、ＩｇＭアイソタイ
プコントロール（１：１０）、ＳＳＥＡ−１（１：１
０）、ＳＳＥＡ−４（１：２０）、Ｔｒａ−１−６０
（１：４０）およびＴｒａ−１−８１（１：８０）を含
む）中で４℃で３０分間インキュベートした。希釈液で
洗浄した後、細胞を、ＰＥを結合体化したラット抗マウ
スκ鎖抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａ
ｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とともに、４℃で３０分間インキ
ュベートした。細胞を洗浄し、そしてＦＡＣＳＣａｌｉ
ｂｕｒTMフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でＣｅｌｌＱ
ｕｅｓｔTMソフトウェアを用いて分析した。
【０２４８】フィーダー上のｈＥＳ細胞に類似して、Ｍ
ａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネク
チンまたはコラーゲンＩＶ型上の細胞は、ＳＳＥＡ−
４、Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１を発現し
た。それらは、ＳＳＥＡ−１（未分化ｈＥＳ細胞により
発現されない糖脂質）をほとんど発現しなかった。
【０２４９】図３は、組織化学により検出されたマーカ
ー発現を示す。免疫細胞化学による分析のために、細胞
を、ノックアウトＤＭＥＭ中に希釈した一次抗体（ＳＳ
ＥＡ−４（１：２０）、Ｔｒａ−１−６０（１：４０）
およびＴｒａ−１−８１（１：８０）を含む）とともに
３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、細胞を
温めたノックアウトＤＭＥＭで洗浄し、そして２％パラ
ホルムアルデヒド中で１５分間固定した。ＰＢＳで洗浄
した後、細胞を、ＰＢＳ中の５％ヤギ血清とともにＲＴ
で３０分間インキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合体
化ヤギ抗マウス抗体（１：１２５）（Ｓｉｇｍａ）とと
もにＲＴで３０分間インキュベートした。細胞を洗浄
し、ＤＡＰＩで染色し、そしてマウントした。細胞をま
たアルカリホスファターゼ（未分化ＥＳ細胞のマーカ
ー）の発現についても試験した。これは、細胞をチャン
バースライド上で培養し、４％パラホルムアルデヒドで
１５分間固定し、次いで、ＰＢＳで洗浄することにより
行った。次いで、細胞をアルカリホスファターゼ基質
（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）とともに遮光して
１時間室温でインキュベートした。スライドを、マウン
トする前に１００％エタノール中で２〜５分間リンスし
た。
【０２５０】結果は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６
０、Ｔｒａ−１−８１、およびアルカリホスファターゼ
がフィーダー上の細胞についてみられるように、Ｍａｔ
ｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上のｈＥＳコロ
ニーにより発現された（しかし、コロニー中で分化した
細胞によってではない）ことを示す。
【０２５１】図４は、逆転写酵素ＰＣＲ増幅により検出
されるように、フィーダー上およびフィーダーなしのＨ
１細胞のＯＣＴ−４およびｈＴＥＲＴ発現を示す。個々
の遺伝子産物の放射活性相対量については、Ｑｕａｎｔ
ｕｍＲＮＡTM Ａｌｔｅｒｎａｔｅ １８Ｓ Ｉｎｔｅ
ｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄプライマー（Ａｍｂｉｏ
ｎ，Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ，ＵＳＡ）を、製造業者の指示
に従って用いた。簡潔には、特定のプライマー対の増幅
の線形範囲を決定し、次いで、ａｌｔｅｒｎａｔｅ １
８Ｓプライマー：コンペティマー（ｃｏｍｐｅｔｉｍｅ
ｒ）の適切な混合物と同時増幅させて、同時に生じる線
形範囲を有するＰＣＲ産物を得た。ＰＣＲ反応物にＡｍ
ｐｌｉＴａｑTM（Ｒｏｃｈｅ）を添加する前に、この酵
素を、製造業者の指示に従って、ＴａｑＳｔａｒｔTM抗
体（ＰｒｏＭｅｇａ）とともに予めインキュベートし
た。放射活性ＰＣＲ反応物を５％非変性ポリアクリルア
ミドゲルで分析し、乾燥し、そしてホスホイメージスク
リーン（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）に１時
間曝した。スクリーンをＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａ
ｍｉｃｓ Ｓｔｏｒｍ ８６０でスキャンし、そしてバ
ンド強度をＩｍａｇｅＱｕａｎｔTMソフトウェアを用い
て定量した。結果を、ｈＴＥＲＴまたはＯＣＴ−４バン
ドに組み込まれた放射活性の割合として表し、１８Ｓバ
ンドに組み込まれた放射活性に対して標準化した。
【０２５２】特定のマーカーについてのプライマーおよ
び増幅条件は、以下のとおりである。ＯＣＴ−４：セン
ス（配列番号３）５’ＣＴＴＧＣＴＧＣＡＧ ＡＡＧＴ
ＧＧＧＴＧＧ ＡＧＧＡＡ−３’；アンチセンス（配列
番号４）５’−ＣＴＧＣＡＧＴＧＴＧ ＧＧＴＴＴＣＧ
ＧＧＣ Ａ−３’；ａｌｔｅｒｎａｔｅ １８：コンペ
ティマー１：４；１９サイクル（９４℃３０秒；６０℃
３０秒；７２℃３０秒）、ｈＴＥＲＴ：センス（配列番
号５）５’−ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧ ＴＣＴＧＧＡＧＣ
ＡＡ−３’；アンチセンス（配列番号６）５’−ＧＧＡ
ＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡ−３’；ａｌｔｅｒ
ｎａｔｅ １８：コンペティマー１：１２；３４サイク
ル（９４℃３０秒；６０℃３０秒；７２℃３０秒）。
【０２５３】転写因子ＯＣＴ−４は、通常、未分化ｈＥ
Ｓ細胞において発現され、そして分化の際にダウンレギ
ュレートされる。この実験において、馴化培地（ＣＭ）
中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上で
２１日間維持された細胞は、ＯＣＴ−４を発現したのに
対し、非馴化通常培地（ＲＭ）中のＭａｔｒｉｇｅｌ
（登録商標）中で維持された細胞は発現しなかったこと
が見出された。フィブロネクチンまたはコラーゲンＩＶ
型上で維持された細胞（これは、大きな程度の分化を示
す）は、フィーダー、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ま
たはラミニン上の細胞と比較して、より低レベルのＯＣ
Ｔ−４を発現した。
【０２５４】ｈＴＥＲＴおよびＯＣＴ−４発現は、Ｍａ
ｔｒｉｇｅｌ（登録商標）および通常培地を除く培養条
件全てにおいてみられた。さらに、細胞をレチノイン酸
（ＲＡ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（こ
れらは、細胞分化を促進する因子である）に曝した後、
ｈＴＥＲＴの発現は顕著に減少した。
【０２５５】図５は、ＴＲＡＰアッセイにより測定され
るテロメラーゼ活性を示す（Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６６：２０１１，１９９７；Ｗｅｉｎｒｉｃｈら、
Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７：４９８，１９
９７）。培養条件全てがｍＥＦ馴化培地中のＭａｔｒｉ
ｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチンまた
はコラーゲンＩＶ型上で４０日後に陽性のテロメラーゼ
活性を示した。
【０２５６】（実施例４：インビトロおよびインビボ分
化）インビトロ分化を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商
標）、ラミニン、フィブロネクチンまたはコラーゲンＩ
Ｖで馴化培地中２６日間維持したＨ１ ｈＥＳ細胞にお
いて誘導した。ｈＥＳ細胞を、約２００Ｕ／ｍｌコラゲ
ナーゼＩＶ中で３７℃で１０分間インキュベートするこ
とによって小塊に解離し、そしてＤＭＥＭ、２０％ Ｆ
ＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１ｍＭ グルタミン、０．１
ｍＭ βメルカプトエタノール、および０．１ｍＭ 可
欠アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）を含む培地中で懸濁培養し
て、胚様体（ＥＢ）を形成させた。懸濁して４日後、凝
集物をポリオルニチンコーティングプレート上に移し、
そしてさらに７日間培養した。次いで、この培養物を収
縮する細胞の存在について試験し、そして免疫細胞化学
のために処理した。
【０２５７】図６は、これらの細胞の免疫細胞化学分析
の結果を示す。染色パターンは、ニューロンおよび心筋
細胞系列（それぞれ、βチューブリンＩＩＩおよび心臓
トロポニンＩ）の細胞と一致した。分化の約８日後、収
縮する領域を全ての培養物で同定した。α−フェトプロ
テイン（内胚葉系列のマーカー）についてもまた細胞を
染色した。
【０２５８】ｈＥＳ細胞を、ＳＣＩＤマウスへの筋肉内
注射により奇形種を形成する能力についてもまた試験し
た。フィーダー上またはフィーダーなしで維持した細胞
を採取し、ＰＢＳ中に再懸濁し、そしてＳＣＩＤ／ベー
ジュマウスに筋肉内注射した（５×１０6細胞／部
位）。腫瘍を切除し、そして組織学的分析のために処理
した。フィーダーなしの培養物に由来するｈＥＳ細胞は
腫瘍を生成し、これを切除し、そして７８〜８４日後に
組織学的分析のために処理した。
【０２５９】図７は、ｍＥＦフィーダー細胞で維持した
Ｈ７細胞（Ａ）またはフィーダーなし培養物（Ｂ）に由
来する奇形種の組織病理を示す。ムチン上皮成分、軟骨
および神経組織は、フィーダー上で培養したｈＥＳ細胞
に由来する奇形種で観察された。嚢胞性上皮構造、おそ
らく歯科成分、軟骨および腺上皮または神経成分は、フ
ィーダーなしのｈＥＳ培養物に由来する奇形種において
見出された。
【０２６０】（実施例５：ｈＥＳ細胞の直接分化）凝集
物形成の標準的方法を用いる分化を、本発明の技術と比
較した。ここで、特定の条件下で固体表面に直接プレー
トすることにより細胞を分化させた。
【０２６１】凝集物分化技術のために、アカゲザルおよ
びヒトのＥＳ株の単層培養物をコラゲナーゼＩＶ中で５
〜２０分間インキュベートすることにより採取し、そし
てこれらの細胞をプレートから掻き取った。次いで、こ
れらの細胞を解離し、そして０．１ｍＭ 可欠アミノ
酸、１ｍＭ グルタミン、０．１ｍＭ βメルカプトエ
タノールを補充したＦＢＳ含有培地（２０％ 熱非働化
していないＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ））中、非接着性細
胞培養プレートにプレートした。ＥＢに、一日おきに１
ウェル（６ウェルプレート）あたり２ｍｌの培地を添加
して供給した。培地の容積が４ｍｌ／ウェルを超えたと
きに、ＥＢを採取し、そして新鮮な培地に再懸濁した。
プレートを３７℃のインキュベーター中に入れ、そして
いくつかの場合には、振盪機（ｒｏｃｋｅｒ）を用い
て、懸濁物中の凝集物の維持を容易にした。懸濁して４
〜８日後、凝集体が形成され、そしてさらに分化させる
ために基板上にプレートした。
【０２６２】直接分化技術のために、アカゲザルおよび
ヒトのＥＳ細胞の懸濁物を同様の様式で調製した。次い
で、細胞を約５０〜１００細胞の塊に砕くこと（ｔｒｉ
ｔｕｒａｔｉｏｎ）により解離し、そしてポリオルニチ
ンで処理したガラスのカバースリップ上にプレートし
た。細胞を、血清含有培地中、または分析の７〜１０日
間前に規定された培地で維持した。細胞を、ニューロ
ン、およびグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）に特
徴的であり、星状細胞に特徴的であるβチューブリンＩ
ＩＩおよびＭＡＰ−２についての免疫反応性により試験
した。
【０２６３】６つの異なるＥＳ株は、凝集物または直接
分化技術のいずれかを用いて、ニューロンおよび星状細
胞についてのマーカーを有する細胞に分化した。アカゲ
ザルＥＳ細胞に由来する培養物において、ニューロンを
含有した凝集物のパーセンテージは、４９〜９３％であ
った。ヒトＥＳ細胞に由来する培養物において、ニュー
ロンを含有した凝集物のパーセンテージは、６０〜８０
％であった。ＧＡＢＡおよびβ−チューブリンについて
の二重標識により、ニューロンの亜集団が阻害性神経伝
達物質ＧＡＢＡを発現することが示された。星状細胞お
よびオリゴ樹状細胞（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔ
ｅ）を、それぞれＧＦＡＰ免疫反応性およびＧａｌＣ免
疫反応性で同定した。従って、ヒトおよびアカゲザルの
ＥＳ細胞は、中枢神経系における３つの主要な細胞表現
型全てを形成する能力を有する。
【０２６４】ニューロトロフィン増殖因子ファミリーの
いくつかのメンバーの効果を試験した。ｈＥＳ細胞を、
コラゲナーゼを用いて採取し、解離し、そしてポリオル
ニチンコーティングしたカバースリップに再播種するこ
とにより分化させた。細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋Ｎ２
＋１０％ＦＢＳ中に一晩入れた。翌日、血清を培地から
除去し、そして試験される１０ｎｇ／ｍｌ ヒトｂＦＧ
Ｆおよび増殖因子と置換した。２４時間後、ｂＦＧＦを
培地から取り出した。これらの培養物に、一日おきに補
給した。これらを、分化の７日後に固定し、そして分析
のために免疫染色した。ニューロン数をβチューブリン
について陽性の細胞を計数することにより評価した。１
０ｎｇ／ｍＬの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）の存在
下で維持した培養物は、コントロール培養物より約３倍
多いニューロンを形成した。ニューロトロフィン−３
（１ｎｇ／ｍｌ）中で維持した培養物は、コントロール
培養物より約２倍を超えるニューロンを形成した。
【０２６５】心筋形成を評価するために、ＥＢを懸濁培
養の４日後、ゼラチンコーティングプレートまたはチャ
ンバースライドに移した。播種後に表面に接着したＥＢ
を、増殖させ、そして異なる型の細胞に分化させた。自
律的に収縮する細胞を、分化８日目に培養物の種々の領
域で観察した。そして拍動する領域の数は、約１０日目
まで増加した。いくつかの場合において、ＥＢの７５％
超が、収縮領域を有した。収縮する細胞は、形態的に、
マウスＥＳ細胞由来の拍動する心筋に類似していた。こ
れらの培養物において、収縮する領域の１００％が心臓
トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）と免疫反応性であるが、最小
限の免疫反応性が、拍動しない細胞において観察され
た。
【０２６６】分化したＥＢの培養物を、ｃＴｎＩに対す
るモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロット分析
に供した。このアッセイは、精製ネイティブヒトｃＴｎ
Ｉのサイズに対応する、強い３１ｋＤａタンパク質シグ
ナルを与えた。これは、収縮する細胞を含む分化したヒ
トＥＳ細胞においては検出されたが、未分化ＥＳ細胞で
も分化培養物でも検出されず、収縮する細胞の証拠がな
かった。コントロールとして、このブロットは、βアク
チン特異的抗体で再プローブし、全てのサンプルにおい
て同様の量のタンパク質が存在したことを確認した。
【０２６７】他の実験において、ＥＢを８〜１６日間培
養し、そしてさらに１０日間接着性培養物として維持し
た。ＲＮＡを分化したヒトＥＳ細胞から調製し、そして
半定量的なＲＴ−ＰＣＲを行って、内胚葉特異的産物で
あるα１アンチトリプシン、ＡＦＰ、およびアルブミン
の相対的発現を検出した。低レベルのα１アンチトリプ
シンおよびＡＦＰを、未分化培養物において検出した；
同じ培養物においてアルブミンはほとんどまたは全く検
出されなかった。３つのマーカー全てが、分化後に有意
に高いレベルで検出された。３つの内胚葉マーカー全て
の発現は、１６日目の胚様体よりも８日目の胚様体由来
の培養物においてより高かった。
【０２６８】（実施例６：未分化細胞および分化細胞に
よる発現のマイクロアレイ分析）異なる遺伝子発現の分
析を、未分化Ｈ９培養物由来のｍＲＮＡと、対応するＥ
Ｂ由来のｍＲＮＡとを対比することにより行った。ＥＢ
を増殖培地中で８日間維持するか、または増殖培地中で
４日間維持し、次いで、０．５μＭ レチノイン酸で４
日間処理した。ＥＢを２日後、４日後または８日後に採
取し、そして得られたｍＲＮＡを未分化培養物由来のｍ
ＲＮＡと直接比較した。この分析は、比較的均質な細胞
集団の、分化した細胞型の複雑な混合物への形質転換を
追跡し、従って、読み出しは、遺伝子発現における変化
の大きさ、および分化した細胞型に特異的な発現の変化
の場合には、培養物におけるその細胞型の再提示の両方
により影響が及ぼされる。これらの実験サンプル約１
０，０００ ｃＤＮＡにおいて使用されるアレイを選択
して、特徴付けられたヒト遺伝子の大部分を表した。
【０２６９】総ＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮＡｅａｓ
ｙTMミニプレップキットを用いて製造業者の指示に従っ
てヒトＥＳ培養物またはそれらの分化した誘導体から採
取した。２６０ｎｍでの紫外線吸収を測定することによ
りＲＮＡを定量した。ポリＡ +ｍＲＮＡを、Ｑｉａｇｅ
ｎ ＯｌｉｇｏｔｅｘTMミニプレップを用いて製造業者
の指示に従って総ＲＮＡ調製物から調製した。最終的な
ｍＲＮＡ調製物は、Ａ 260測定値により定量し、次い
で、ネイティブアガロースゲル上での電気泳動後に目視
検査した。サンプルＲＮＡを、Ｃｙ３またはＣｙ５標識
ｃＤＮＡプローブへ転換するために契約実験室（Ｉｎｃ
ｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ，ＣＡ）に送り、このプローブを、引き続きＵ
ＮＩＧＥＭ１．０アレイにハイブリダイズさせた。
【０２７０】ハイブリダイズしたアレイの処理後に、蛍
光測定値を定量し、そして結果を分析に返した。プロー
ブ対形成を、Ｃｙ３チャネルの存在下で未分化ＥＳ細胞
からのサンプルを用いて行い、そして分化したＥＳ細胞
サンプルは、Ｃｙ５チャネルの存在下で行った。発現の
変化（Ｃｙ３およびＣｙ５チャネルを比較することによ
り測定される）は、一般に、差異が少なくとも２．５倍
であったか否かを有意とみなした。
【０２７１】ｈＥＳ細胞の分化は、多くの遺伝子（公知
の機能を有さないＥＳＴを含む）の活性化および抑制に
関与する。興味深いことに、分化の最後の４日間にわた
るレチノイン酸の懸濁培養物への添加は、遺伝子発現パ
ターンに対して比較的微少な効果を有した（４ｄ−／４
ｄ＋と８ｄとを比較のこと）。
【０２７２】発現が分化の間に減少される遺伝子は、広
範な機能をサンプリングする（メタロチオネイン、増殖
因子（例えば、ＦＧＦ９）、分泌型システインリッチタ
ンパク質（例えば、オステオポンチン、ＡＧＦ−ＢＰ
５、Ｃｙｒ６１、結合組織増殖因子）、セレンドナータ
ンパク質ｓｅｌＤなどが挙げられる）。一般に、発現に
おける最も有意な改変は、懸濁培養の４日後に生じ、そ
して細胞形態の変化の発生と一致する。興味深いこと
に、Ｄ−グルコースリン酸の異化に関与する２つの遺伝
子（ＵＤＰ−グルコースホスホリラーゼおよびホスホグ
ルコムターゼ）の発現は、分化の際に劇的に減少し、こ
のことは、グルコース代謝における潜在的な改変を示唆
する。
【０２７３】これらの実験において使用したアレイは、
ｈＴＥＲＴに対応するｃＤＮＡの特徴を含んでいない；
しかし、ＴＲＦ１についてのｍＲＮＡの発現の顕著な減
少が観察された。ＴＲＦ１は、基本的なテロメア結合因
子であり、その発現は、テロメアの長さの短縮化と相関
している。従って、テロメアの長さの正のレギュレータ
ー（ｈＴＥＲＴ）および負のレギュレーター（ＴＲＦ
１）の両方の発現は、ＥＳ細胞の分化の間に減少した。
【０２７４】内臓内胚葉および初期の肝臓分化と関連す
るいくつかの遺伝子は、この分析において顕著であっ
た。これらの遺伝子は、α−フェトプロテイン、アポリ
ポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質ＡＩ調節タ
ンパク質−１、α1−アンチトリプシンならびにフィブ
リノーゲンのα、βおよびγ鎖を含む。この誘導は、分
化の２日以内に明白になり、そしてレチノイド処置によ
って実質的に影響を及ぼされない。細胞性レチノイン酸
結合タンパク質１および２（ＣＲＡＢＰ Ｉ、ＩＩ）の
発現の誘導は、レチノイドがＣＲＡＢ Ｉ遺伝子のプロ
モーターの転写を特異的に阻害する、提唱された負のフ
ィードバックループと一致して、レチノイド処理培養物
においては観察されない。
【０２７５】ＩＬ−６レセプターｇｐ１３０の発現は、
ｈＥＳ培養物において低く、そして分化の際に誘導され
る。これらの結果は、ｈＥＳ培養物におけるＬＩＦ応答
性の欠如に関する分子的基礎を提供し（Ｔｈｏｍｓｏｎ
ら、１９９９；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００）、そ
してマウスＥＳ細胞に対して、ヒトＥＳ細胞におけるｇ
ｐ１３０の実質的に異なる役割を示す。ここで、ＬＩＦ
シグナル伝達は、未分化状態の維持を直接的に意味す
る。
【０２７６】他の分化誘導性遺伝子としては、タンパク
質ホモログであるプレイオトロフィンおよびミッドカイ
ンが挙げられる。これらの分泌サイトカインは、ニュー
ロン細胞型および肝臓細胞型のマイトジェンとして、ま
たは全身的な脈管形成因子としての役割が提唱された
（Ｏｗａｄａら、１９９９；Ｓａｔｏら、１９９９）。
このようにして、ＥＳ細胞分化において類似の役割が果
たされ得る。ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ホメオボ
ックスｂ５タンパク質およびｍｅｉｓ１）の誘導は、分
化プロセスにおいて転写調節因子の中心的な役割を反映
するようである。
【０２７７】（実施例７：初代ｍＥＦフィーダー層上で
維持されたｈＥＳ細胞の遺伝子改変）この実施例は、既
に記載したように、初代ｍＥＦ上で増殖させたｈＥＳ細
胞へ遺伝子改変を導入するための条件を提供する。トラ
ンスフェクトする前に、ｈＥＳ細胞をコラゲナーゼ（約
２００ユニット／ｍＬ）を用いてフィーダー層からはず
し、１８ｍｌの最終容量で懸濁し、そしてゼラチンおよ
び初代ｍＥＦフィーダー細胞で予めコーティングした６
ウェルプレート中、３ｍｌ／ウェルでプレートした。
【０２７８】次いで、再プレートした細胞を異なるトラ
ンスフェクション系で試験した。これらのトランスフェ
クション系としては以下が挙げられる：Ｍａｍｍａｌｉ
ａｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＣａＰＯ4お
よびＤＥＡＥ試薬）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃａｔ＃
２００２８５；ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１ Ｍｉｒｕｓ
（Ｐａｎｖｅｒａ）、ｃａｔ＃ ＭＩＲ ２３１０；ポ
リブレン（Ｓｉｇｍａ）；ポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍ
ａ）；ＳｕｐｅｒｆｅｃｔTM（Ｑｉａｇｅｎ）；Ｅｆｆ
ｅｃｔｅｎｅTM（Ｑｉａｇｅｎ）；Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉ
ｎTM（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｌｉｐｏ
ｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２
０００TMとは異なる）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）；ＣｅｌｌｆｅｃｔｉｎTM（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ
ｅ ２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ）；およびＢｉｏＲａｄTMＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒを
用いたエレクトロポレーション。
【０２７９】使用した条件下で、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍ
ｉｎｅ ２０００TM（ＧｉｂｃｏＬｉｆｅ ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ ｃａｔ＃１１６６８０１９，特許係属
中）およびＦｕＧＥＮＥTM（Ｆｕｇｅｎｔ Ｌ．Ｌ．
Ｃ．の登録商標；脂質および他の成分の専売ブレンド
（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ ｂｌｅｎｄ）であり、Ｒｏ
ｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ ｃａｔ＃１ ８１４４４３から購入した）の両方
が、良好なトランスフェクション効率を生じた。この効
率は、これらの試薬を、再プレートした後、約４８時間
にわたり再プレーとしたｈＥＳ細胞と接触させた場合、
概して最良であった。
【０２８０】Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM
を用いるトランスフェクションを、以下のように行っ
た：プラスミドＤＮＡ（３〜５μｇのｐＥＧＦＰ−Ｃ
１、ＣｌｏｎＴｅｃｈ ｃａｔ．＃６０８４−１）を水
で１００μｌの最終容量に希釈した。予備実験におい
て、５〜３０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０
００ TM（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ＃１１６６８−０１９）を
ＯｐｔｉＭＥＭTM（Ｇｉｂｃｏ，ｃａｔ＃１１−５８−
０２１）で１００μｌの最終容量まで希釈した。次い
で、ＤＮＡ溶液をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２００
０TM溶液にゆっくりと添加し、そして穏やかに混合し
た。この混合物を、８００μｌのＯｐｔｉＭＥＭTMを補
充する前に、室温で２０〜３０分間インキュベートし
た。細胞を３ｍｌの予め温めておいたＯｐｔｉＭＥＭTM
で洗浄し、そしてウェルあたり（９．６ｃｍ2）、０．
５〜１ｍｌのＤＮＡ／脂質混合溶液中、３７℃で４時間
インキュベートした。いくつかの実験においては、４ｍ
ｌのｍＥＦ馴化培地を添加する前に、４時間で複合体を
取り出した；他では、十分なｍＥＦ馴化培地を、３．５
ｍｌの最終容量に達するまでウェルに添加し、そしてこ
の混合物を細胞上に一晩放置した。他の実験では、ＤＮ
Ａ：脂質混合物を、３．５ｍｌの最終容量になるよう
に、十分なｍＥＦ馴化培地を含むウェルに添加し、そし
て細胞をこの混合物中で一晩インキュベートした。
【０２８１】ＦｕＧＥＮＥTMを用いるトランスフェクシ
ョンを、以下の通りに行った。各ウェルを、ＦｕＧＥＮ
ＥTM ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏ
ｒｐ．）を用いて、製造業者の指示書に記載されるよう
にＦｕＧＥＮＥTM試薬のＤＮＡに対する比を３：２とし
て、１０μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。Ｏｐｔ
ｉＭＥＭTM無血清培地をトランスフェクションに用い
た。「古いプロトコル」では、ＦｕＧＥＮＥTM−ＤＮＡ
複合体の添加の４時間後、２．５ｍＬの標準的なｈＥＳ
培地を、各トランスフェクトしたウェルに添加した。改
定されたプロトコル（「３：２Ｌ」）では、トランスフ
ェクトしたウェルには、標準的なｈＥＳ培地を供給しな
かった。トランスフェクションの２４時間後、ＧＦＰ−
発現を、フローサイトメトリーによって評価した。
【０２８２】トランスフェクションの４８時間前に、ｈ
ＥＳ細胞を、ゼラチンおよびｍＥＦフィーダー層で上記
のようにコーティングした６ウェルプレートに播種し
た。ｈＥＳ細胞を、ＦｕＧＥＮＥTM ６（Ｒｏｃｈｅ）
またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM（Ｇｉ
ｂｃｏ）を製造業者の説明書に従って用いてトランスフ
ェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞
を、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーの下で目視
によってＧＦＰ発現について評価した。図１に示す実験
では、３つの方法（標準的なＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ
ｅ ２０００TMプロトコル、標準的なＦｕＧＥＮＥTMプ
ロトコル、およびＤＮＡ／脂質混合物を細胞とともに一
晩放置する改変ＦｕＧＥＮＥTMプロトコル）を比較し
た。この結果は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２００
０TMは高い百分率のＧＦＰ発現細胞を一貫して生じた
が、改変ＦｕＧＥＮＥTMプロトコルは、より高い平均蛍
光強度を有するＧＦＰ発現細胞を生じたことを実証し
た。
【０２８３】アデノウイルスベクターを用いる一過性の
形質導入を以下の通りに行った。ベクターＡｄ５ＣＭＶ
５−ＧＦＰ（本明細書ではＡｄ５ＧＦＰと呼ぶ）は、Ｃ
ＭＶプロモーターの制御下のグリーン蛍光タンパク質コ
ード領域を含む。このベクターを、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＤＶ０
０３０から購入した。形質導入の７２時間前に、ｈＥＳ
細胞を、ゼラチンおよびｍＥＦフィーダー層で上記の通
りにコーティングした２４ウェルプレートに播種した。
形質導入前に、３ウェルのｈＥＳ細胞を、０．０５％ト
リプシン／５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を３７°で
用いて剥離させ、５００μＬの標準的なｍＥＦ増殖培地
に再懸濁し、そして血球計算板（７５，０００個のｍＥ
Ｆフィーダー細胞を、各ウェルから差し引いた）で計数
して、トランスフェクション前の細胞数を樹立した。ア
デノウイルスのストックを、使用直前に氷上で融解し
た。
【０２８４】Ａｄ５ＧＦＰを用いた感染については、増
殖培地を、ｈＥＳ細胞を含むウェルから吸引し、そして
１ｍＬのｈＥＳ培地＋９μＬのＡｄ５ ＧＦＰストック
で置き換えた（４０のＭＯＩ）。２時間後、ウイルス含
有培地を、１ウェルあたり１ｍＬのｈＥＳ培地で置き換
えた。各形質導入したウェルに、１ｍＬの新鮮ｈＥＳ培
地を２４時間毎に再度供給した。ＧＦＰ発現を、フロー
サイトメトリーによって評価した。代表的な実験からの
結果は、発現が、形質導入の２４時間後に最も高いが、
少なくとも８日間は低レベルで維持されたことを示した
（より後の時点では、ｈＥＳ細胞の過剰増殖に起因して
大量の分化が引き起こされた）。
【０２８５】図８は、フィーダー層にプレートし、そし
てアデノウイルスベクターＡｄ５ＧＦＰ（３０のＭＯ
Ｉ）またはレトロウイルスベクターＧＲＮ３５４（４０
のＭＯＩ、実施例９）のいずれかに４８時間後に感染さ
せたｈＥＳ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。それぞれ２４時
間後または４８時間後、細胞を回収し、幹細胞マーカー
ＳＳＥＡ−４に対する抗体を用いて染色し、そしてＧＦ
Ｐ発現についてフローサイトメトリーによって評価し
た。上のパネルは、偽感染培養物におけるバックグラウ
ンド蛍光およびＳＳＥＡ−４ポジティブ染色を示す。下
のパネルは、ＧＦＰの発現から生じるグリーン蛍光のレ
ベルを示す。
【０２８６】（実施例８：不死化フィーダー細胞の調
製）初代マウス胚性線維芽細胞（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，
前出）を、遺伝子を変更してヒトテロメラーゼ逆転写酵
素（ｈＴＥＲＴ）を発現することによって不死化し得
る。この線維芽細胞（ｍＥＦ）を、ＭｏＬＶ ＬＴＲに
よって駆動されるｈＴＥＲＴコード配列およびＳＶ４０
初期プロモーターによって駆動されるピューロマイシン
耐性遺伝子を含むレトロウイルス構築物ｐＢＡＢＥ ｐ
ｕｒｏ ｈＴＥＲＴに感染させる。初代ｍＥＦの単離株
を、１０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、２ｍＭグ
ルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）、および９０％ 高グ
ルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含む増殖培
地中で培養する。ｍＥＦを、３日毎に１：２の比で分け
る。
【０２８７】このように４回分けた後、５×１０5ｍＥ
Ｆを、１００ｍＭディッシュにプレートする。翌日、細
胞を、増殖培地を、５ｍＬのレトロウイルスストック
（１×１０6ｐｆｕ／ｍＬ）および４μｇ／ｍＬポリブ
レンを含む混合物と交換することによって感染させ、そ
して３７℃でインキュベートする。８時間後、さらに５
ｍＬのレトロウイルス／ポリブレン混合物を添加し、そ
して細胞を３７℃にてインキュベートする。
【０２８８】翌日、レトロウイルス／ポリブレン混合物
を取り出し、そして新鮮な増殖培地と置き換える。４時
間後、ｍＥｆを、０．５％トリプシン／５００ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いてプレートから取
り出し、そして２５ｍＬの増殖培地／フラスコにおいて
２本のＴ１５０フラスコ中に再度プレートする。翌日、
この培地を、０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンを補充
した増殖培地で置き換ええる。
【０２８９】細胞を、１週間に１回、１：４の比で８週
間にわたって分け、そしてピューロマイシン含有培地中
で維持する。８週間後、細胞をトリプシン処理し、そし
て１５０ｍｍプレートあたり２，０００細胞の密度で再
度プレートする。個々のコロニーを、２６日後にクロー
ングシリンダーを用いて単離し、増殖させ、そしてテロ
メラーゼ活性についてスクリーニングする。
【０２９０】（マウスフィーダー細胞株ＮＨ１９０）霊
長類の多能性幹（ｐＰＳ）細胞の培養のための馴化培地
に適切である、永続的なマウス細胞株を樹立した。ＮＨ
Ｇ１９０株は、三重薬物耐性であり、グリーン蛍光タン
パク質（ＧＦＰ）を発現する、テロメラーゼを用いて不
死化されたマウス胚線維芽細胞株である。
【０２９１】２つのマウス株を、抗生物質ネオマイシン
またはハイグロマイシンに対する耐性についての導入遺
伝子を有するＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から入手した。
Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｓからのＣ５７ＢＬ／６Ｊ Ｔ
ｇＮ（ｐＰＧＫｎｅｏｂｐＡ）３ＥｍｓマウスおよびＣ
５７ＢＬ／６Ｊ−ＴｇＮ（ｐＰＷＬ５１２ｈｙｇ）１Ｅ
ｍｓマウスを交雑した。ネオマイシン耐性およびハイグ
ロマイシン耐性の両方である胚を、受胎後１３．５日
で、フィーダー層のためにマウス胚性線維芽細胞（ｍＥ
Ｆ）を調製するための標準的なプロトコル（Ｅ．Ｊ．Ｒ
ｏｂｅｒｔｓｏｎ，７１−１１２頁、Ｔｅｒａｔｏｃａ
ｒｃｉｎｏｍａ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅ
ｍ ＣｅｌｌＬｉｎｅｓ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ
編，Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８７）に
従って切開した。誘導されたｍＥＦ細胞を、凍結保存し
た。
【０２９２】ｍＥＦを、２０％ウシ胎児血清（ＨｙＣｌ
ｏｎｅ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲ
Ｌ）、８０％ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を含む
増殖培地中で融解した。この細胞を４継代の間１：２の
分割比を用いて増殖させた。約７５％コンフルエンスに
達した２本のフラスコに、エレクトロポレーションの４
時間前に新鮮な培地を供給した。０．５％トリプシン／
５００ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を有する
細胞をフラスコから取り出し、室温で４００×ｇにて５
分間によってペレット化し、そして４×１０6細胞／ｍ
Ｌの濃度で増殖培地中に再懸濁した。
【０２９３】細胞懸濁物を、２つの５００μＬアリコー
トにわけ、そして２つの０．４ｃｍのギャップエレクト
ロポレーションキュベット（ＢｉｏＲａｄ）に移した。
１つのキュベットには５μｇのコントロールプラスミド
（ｐＢＳ２１２；ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモー
ターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子）
を入れる；他方のものには、５μｇのｐＧＲＮ１９０を
入れた。ｐＧＲＮ１９０は、ＭＰＳＶプロモーターによ
って駆動されるマウステロメラーゼ逆転写酵素（ｍＴＥ
ＲＴ）コード領域＋ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモ
ーターによって駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子
を含む。細胞およびＤＮＡを、手動で混合し、そしてＢ
ｉｏＲａｄキャパシタンスエキステンダーを３００Ｖ、
９６０μＦに設定して、ＢｉｏＲａｄ ｇｅｎｅ Ｐｕ
ｌｓｅｒを用いてエレクトロポレーションした。
【０２９４】細胞の各アリコートを、２５ｍＬの増殖培
地を含む個々の１５０ｃｍのプレートに移した。このプ
レート上の培地を、翌日交換し、そしてその次の日、増
殖培地を、増殖培地＋０．５μｇ／ｍＬピューロマイシ
ンによって置換した。このプレート上の培地を、エレク
トロポレーション後２９日目になるまで４８時間毎に新
鮮なピューロマイシン含有培地に交換した。この時点
で、ピューロマイシン耐性細胞の大きな個々のコロニー
は、ｐＢＳ２１２をエレクトロポレーションしたプレー
トおよびｐＧＲＮ１９０をエレクトロポレーションした
プレートの両方において明らかであった。コントロール
プレートからの１０個のコロニーおよびｐＧＲＮ１９０
をエレクトロポレーションしたプレートからの１２個の
コロニーを、クローニングシリンダーを用いて単離し、
そして各コロニーを、４８ウェルプレートの１ウェルに
移した（１コロニーあたり１ウェル）。
【０２９５】１週間後、４８ウェルプレート中でコンフ
ルエンスに達するまで増殖させた、全ての生存コロニー
（３つのコントロールのコロニー、１個のｐＧＲＮ１９
０をエレクトロポレーションしたコロニー）を、２４ウ
ェルプレートのウェルに個々に移した。６日後、増殖し
続けた唯一のコロニーは、ｐＧＲＮ１９０をエレクトロ
ポレーションしたプレートに由来し、そして続いてＮＨ
１９０と命名した。この細胞を、増殖培地＋０．５μｇ
／ｍＬピューロマイシンにおいて維持した。ＴＲＡＰア
ッセイ（Ｋｉｍら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．２５：２５９５，１９９７）によるテロメラーゼ活
性についての分析は、ＮＨ１９０細胞が、機能的なテロ
メラーゼ活性を発現することを実証した。
【０２９６】混合した培養集団およびインビボにおける
細胞のモニタリングを促進するために、ＮＨ１９０細胞
を、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を付与す
るレトロウイルス構築物にさらに感染させた。プラスミ
ドｐＥＧＦＰ−１由来の増強されたＧＦＰ配列は、Ｃｌ
ｏｎＴｅｃｈから入手可能なＬｉｖｉｎｇ Ｃｏｌｏｒ
ｓTM蛍光タンパク質ベクターの一つである。これは、増
強されたＧＦＰコード領域を含み、制限ヌクレアーゼ切
断部位を変更する変化を伴っており、そしてコードされ
たタンパク質の励起波長および発光波長がシフトする。
ＥＧＦＰ−１配列は、ベクターｐＭＳＣＶ．ｎｅｏ、Ｃ
ｌｏｎＴｅｃｈカタログ番号Ｋ１０６２−１中にクロー
ニングされた。ＮＨ１９０細胞に、操作されたベクター
で形質導入し、そしてＧＦＰポジティブ細胞を、ＦＡＣ
Ｓソーティングによって分離した。ＧＦＰ発現細胞株
を、ＮＨＧ１９０と命名した。これらの細胞を、３ヶ月
を超えて培養で保有した。
【０２９７】（実施例９：薬物耐性ＮＨＧ１９０フィー
ダー細胞株上で維持されたｈＥＳ細胞の遺伝的変化）実
施例８に記載されたＮＨＧ１９０細胞を、ＤＭＥＭ（Ｇ
ｉｂｃｏ）＋２０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）お
よび５ｍＭグルタミン中で培養した。細胞を３日毎に
１：１０に分けた。サブコンフルエントな培養物を、ト
リプシンを用いて剥離させ、１０ｍＬ培地中に懸濁し、
そしてＴｏｒｒｅｘ １５０Ｄ Ｘ線ジェネレーターを
用いて３５００ラドの累積線量で照射した。照射した細
胞を、４００×ｇにて５分間ペレット化し、そしてＮＨ
Ｇ１９０培地または標準的なｈＥＳ培地のいずれかに１
ｍＬあたり１．２５×１０5細胞で再懸濁した。
【０２９８】ｈＥＳ細胞を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商
標）およびＮＨＧ１９０フィーダー細胞で予めコーティ
ングした６ウェルプレートに再度プレートすることによ
りトランスフェクトした。播種の４８時間後、ｈＥＳ細
胞を、製造業者のプロトコルに従ってＯｐｔｉＭＥＭTM
無血清培地中でＦｕＧＥＮＥTM ６（Ｒｏｃｈｅ）を用
いて１ウェルあたり１０μｇＤＮＡでトランスフェクト
した。ＤＮＡは、ｎｅｏrを駆動するＰＧＫプロモータ
ーを含むプラスミドであった。４時間後、３ｍＬのＮＨ
Ｇ１９０馴化培地を、各トランスフェクトしたウェルに
添加した。細胞に、毎日３ｍＬの馴化培地を再度供給し
た。トランスフェクションの４８時間後、細胞に、２０
０μｇ／ｍＬの添加されたジェネティシン（Ｓｉｇｍ
ａ）を含むＮＨＧ１９０馴化培地を重層し、これをその
後、毎日交換した。選択の３日後、さらなる照射したＮ
ＨＧ１９０フィーダー細胞を添加した（ｈＥＳ培地中、
１．２５×１０5細胞／ウェル）。２４時間後、培地
を、２００μｇ／ｍＬジェネティシンを含有するＮＨＧ
１９０馴化培地で再度置き換え、毎日置き換えた。
【０２９９】個々のコロニーを単離し、そして別の回の
選択を通して増殖させた。さらに５日後、個々のコロニ
ーは、顕微鏡によって同定され、そしてこのディッシュ
の外側にマークした。培地を除去し、そしてコラゲナー
ゼ（約２００Ｕ／ｍＬ）で置換した。個々のコロニー
を、ｐ２０ピペットのチップを用いて拾い、そして２ｍ
Ｌ ＮＨＧ１９０馴化培地（ジェネティシンなし）を含
む個々のチューブに移した。この懸濁物を、ばらばらの
コロニーになるように５回磨砕し、そして各チューブの
内容物を、ゼラチンおよび照射したＮＨＧ１９０細胞
（１．８７５×１０ 5細胞／ウェル）でコーティングし
た１２ウェルプレートのウェルに移した。細胞に、２４
時間後に２ｍＬの新鮮な馴化培地を供給した。播種の２
日後、細胞に、２００μｇ／ｍＬジェネティシンを含む
２ｍＬの馴化培地を重層し、毎日５日間置換した。各ウ
ェルが５０〜７５％コンフルエントとなったら、細胞
を、コラゲナーゼを用いて剥離し、６ｍＬ馴化培地に移
し、そして１０〜１２回磨砕した。３ｍＬの細胞懸濁物
を、ゼラチンおよび照射したＮＨＧ１９０細胞（３．７
５×１０5細胞／ウェル）でコーティングした６ウェル
プレートの２つのウェルの各々に添加した；細胞に、２
４時間の時点で３ｍＬの馴化培地を再度供給した。次い
で、細胞を、ジェネティシンを含む３ｍＬの馴化培地を
用いて５日間選択し、そして前のように１：６に分け
た。
【０３００】レトロウイルスを用いる安定な形質導入
を、以下の通りに行った。ＧＲＮ３５４と命名されたレ
トロウイルスベクターを、Ｇｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．に
て、ＣｌｏｎＴｅｃｈ（カタログ番号Ｋ１０６２−１）
から購入したＰＭＳＣＶｎｅｏベクターを用いて構築し
た。ｅＧＦＰコーディング領域を、ＭＳＣＶ ＬＴＲの
下流に挿入した。ＬＴＲはＧＦＰの発現を駆動し、そし
てこのベクターはまた、マウスＰＧＫプロモーターによ
って駆動されるｎｅｏr遺伝子を含む。プレートを、
０．５％ゼラチンおよびＮＨＧ１９０フィーダー細胞
（２４ウェルプレートについて１ｍＬのＮＨＧ１９０培
地中で７．５×１０4；６ウェルプレートについて３ｍ
Ｌの培地中で３．７５×１０5）でコーティングした。
ｈＥＳ株Ｈ７を、２４ウェルに調製したプレートに、ｈ
ＥＳ培地（１ｍＬ／ウェル）中に播種した。４８時間
後、ｈＥＳ細胞の３つのウェルを、０．０５％トリプシ
ン／５ｍＭＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を３７℃で用いて剥
離させ、５００μＬ ＮＨＧ１９０培地中に再懸濁さ
せ、そして計数した。レトロウイルス構築物ｐＧＲＮ３
５４のストックを、使用の直前に氷上で溶解した。増殖
培地をウェルから吸引し、そして４００μＬのｈＥＳ培
地＋８μＬのレトロウイルス（１０のＭＯＩ）および４
μＬの８ｍｇ／ｍＬポリブレン溶液（Ｓｉｇｍａ）で置
き換えた。２時間後、１ウェルあたり８００μＬのｈＥ
Ｓ培地を添加した。各形質導入されたウェルに、２４時
間毎に１ｍＬの新鮮なｈＥＳ培地を再度供給した。
【０３０１】形質導入の４日後、培地を、２００μｇ／
ｍＬジェネティシンを含有する１ｍＬのｈＥＳ培地で置
き換えた。ジェネティシン選択の３日後、細胞を、コラ
ゲナーゼを用いて剥離し、磨砕し、３ｍＬのｈＥＳ培地
に再懸濁し、ゼラチンおよびＮＨＧ１９０フィーダーで
コーティングした６ウェルプレートの１ウェルに再度播
種し、そして２４時間後にｈＥＳ培地を再度供給した。
次いで、この培地を、ジェネティシンを含有するｈＥＳ
培地で再度置き換え、そして２４時間毎に再度供給し
た。未分化コロニーは、この選択を生き延び、そして３
ヶ月を超えて維持された。ＦＡＣＳ分析は、５０〜６５
％の選択された細胞が、たとえ低レベルであってもＧＦ
Ｐを発現することを示した。この細胞の核型は正常であ
った。
【０３０２】次いで細胞を、懸濁培養に移して、胚様体
を形成させ、４日間分化させ、次いで２０％ ＦＢＳ培
地中に１週間プレートした。大量の分化が生じた後、こ
の培養物を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、そし
て蛍光顕微鏡のために調製した。多くの分化した細胞
は、トランスフェクトされた未分化のｈＥＳ細胞株より
も高レベルのＧＦＰを発現した。このことは、分化した
細胞型におけるＭＥＳＶ−ＬＴＲの分化活性化と一貫し
ている。
【０３０３】（実施例１０：フィーダーフリー培養物に
おけるｈＥＳ細胞のトランスフェクション）馴化培地中
でラミニン上でフィーダーフリー培養物中で維持したｈ
ＥＳ細胞を、ＣＭＶプロモーターによって駆動されるグ
リーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を保有するプラスミド
でトランスフェクトすることにより、遺伝的に改変し
た。
【０３０４】ｍＥＦ馴化培地を、先に記載の通りに調製
した。ｍＥＦに照射し、そして約５．７×１０4細胞ｃ
ｍ-2で播種した。少なくとも１６時間後、この培地を、
４ｎｇ／ｍＬになるように添加したｈｂＦＧＦを含むｈ
ＥＳ培地と交換した。馴化培地を、ｈＥＳ培養物の供給
のために毎日収集した。ｈＥＳ培養物への添加の前に、
この培地に、さらに４ｎｇ／ｍＬのｈｂＦＧＦを補充し
た。安定なトランスフェクタントの選択が必要な場合、
ｍＥＦ馴化培地に、２００μｇ／ｍＬのジェネティシン
（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ５０１３）を補充した。
【０３０５】ｍＥＦフィーダー層上で維持したＨ９ ｈ
ＥＳ細胞を、３７℃にて１０分間の約２００単位／ｍＬ
のコラゲナーゼＩＶとのインキュベーションにより培養
物から収集した。細胞を解離し、そして通常ｈＥＳ培地
またはｍＥＦ馴化培地中に再懸濁した。次いで、通常培
地中の細胞を、ｍＥＦフィーダー層上に再度播種しそし
てｍＥＦ馴化培地中の細胞をＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商
標）またはラミニン上にプレートした。全ての培養物に
ついての播種密度は、約４×１０4細胞／ｃｍ2であっ
た。フィーダー層上の細胞を通常培地中で維持し、一
方、マトリックス上の細胞をｍＥＦ馴化培地中で、トラ
ンスフェクションの前に１日間または２日間維持した。
馴化培地を、２４時間毎に置き換えた。
【０３０６】ｈＥＳ細胞培養物を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａ
ｍｉｎｅ ２０００TMで上記のようにトランスフェクト
した。ＧＦＰ発現のＦＡＣＳ分析を以下の通りに行っ
た。ｈＥＳ細胞を、ＰＢＳ中の０．５ｍＭ ＥＤＴＡを
用いて収集し、そして約１×１０6細胞／試験で再懸濁
した。細胞を、ＰＢＳおよび２％ ＦＢＳ、０．１％ア
ジ化ナトリウムおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する溶液
中で洗浄した。ＳＳＥＡ−４染色を、Ｄｅｖｅｌｏｐｍ
ｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ
Ｂａｎｋｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ，
Ｉｏｗａ Ｃｉｔｙ）から入手した抗体を１：１５希釈
で用いて同じ緩衝液中で行った。アイソタイプ適合コン
トロールを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ，Ｕ
ＳＡ）から入手した。細胞を、１００μｌの最終容量に
おいて抗体とともに４℃にて３０分間インキュベート
し、洗浄し、そしてＰＥと結合体化したラット抗マウス
κ鎖抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ，ＣＡ）とともに４℃にて３０分間インキュ
ベートした。サンプルを、先の通りに洗浄し、そしてＧ
ＦＰおよびＳＳＥＡ−４発現についてＦＡＣＳｃａｌｉ
ｂｕｒTMフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃ
ｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）でＣｅｌｌＱ
ｕｅｓｔTMソフトフェアを用いて分析した。
【０３０７】ｍＥＦ馴化培地中のラミニン上で維持した
Ｈ９株のｈＥＳ細胞を、プレーティング後２４時間また
は４８時間に、ＣＭＶプロモーターによって駆動される
ＧＦＰを保有するプラスミドでトランスフェクトした。
最初の実験は、５μｇのプラスミドおよび１２μＬのＬ
ｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TMの混合物を用い
た。細胞に１ｍＬのＤＮＡ／脂質複合体を入れ、そして
３７℃にて４時間インキュベートした後、３ｍＬのｍＥ
Ｆ馴化培地を添加し、次いでトランスフェクションの２
４時間後にＧＦＰ発現についてモニタリングした。
【０３０８】図９は、この実験の結果を示す。パネル
Ａ：ラミニン上で維持したＨ９細胞の形態。パネルＢ：
Ａに示されたのと同じコロニー中で観察されたＧＦＰポ
ジティブ細胞。パネルＣ：ＳＳＥＡ−４高集団（未分化
細胞）におけるＧＦＰポジティブ細胞の％のＦＡＣＳ分
析。細胞を、播種の２４（バー１および２）または４８
時間（バー３および４）にトランスフェクトし、そして
トランスフェクションの２４時間（バー１および３）ま
たは４８時間（バー２および４）後に分析した。明るい
緑色の細胞が、トランスフェクションの２４時間後に、
ラミニン上の未分化ＥＳコロニーの密な領域において観
察された（パネルＡおよびＢ）。最初の播種後４８時間
でのトランスフェクションは、最大効率を与えた：細胞
の３８％が、トランスフェクション後２４時間でのＦＡ
ＣＳ分析により決定したところ、ＧＦＰポジティブであ
った（パネルＣ）。
【０３０９】次の実験は、ｍＥＦフィーダー上で維持し
た細胞と、ｍＥＦ馴化培地中でＭａｔｒｉｇｅｌ（登録
商標）またはラミニンでコーティングしたプレート上で
維持したＨ９細胞とのトランスフェクション効率を比較
した。通常培地中で維持したフィーダー層上の細胞を、
コントロールとして用いた。フィーダー上の細胞と、フ
ィーダーのない細胞との間の形態学的差異は、播種後１
日または２日で観察された。フィーダー上のコロニー
は、フィーダー層なしで維持した細胞よりも密であっ
た；フィーダーのない培養物中の個々のｈＥＳ細胞は、
それほど密でなく、そしてより平らであった。ラミニン
上の細胞とＭａｔｒｉｇｅｌ上の細胞との間で細胞にも
コロニーの形態にも有意な差異は存在しなかった。これ
らの細胞を、播種後２日目に、ＣＭＶプロモーターによ
って駆動されるＧＦＰを発現するプラスミドでトランス
フェクトした。このトランスフェクションの２４時間
後、細胞を、蛍光顕微鏡下でＧＦＰ発現について調べ
た。
【０３１０】細胞を、ｍＥＦフィーダー上で通常培地中
で（ｍＥＦ／ＲＭ）、ラミニン上でｍＥＦによって馴化
された培地中で（ラミニン／ＣＭ）、またはＭａｔｒｉ
ｇｅｌ（登録商標）上で馴化培地中で（Ｍａｔｒｉｇｅ
ｌ／ＣＭ）維持した。図１０（Ａ）に示すように、明る
い緑色細胞が、フィーダーを含まない培養物の未分化の
ｈＥＳコロニー中に観察された。対照的に、極わずかな
緑色細胞が、フィーダー上のコロニーにおいて観察され
た。ＦＡＣＳ分析は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上
の１６％の細胞およびラミニン上の１４％の細胞がＳＳ
ＥＡ−４高集団中でＧＦＰポジティブであり、一方、フ
ィーダー上の細胞のほんの５％がポジティブであること
を示した。これらの結果は、トランスフェクション効率
が、フィーダーのない条件を用いることによって有意に
増加したことを示す。
【０３１１】次の実験は、１）ＤＮＡ：脂質の比；２）
ｍＥＦ馴化培地の添加の４時間前の細胞へのＤＮＡ／脂
質複合体の添加 対 ｍＥＦ馴化培地の存在下での細胞
への複合体の添加；および３）Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉ
ｎｅ ２０００TM 対 ＦｕＧＥＮＥTMの使用の効果を
評価した。
【０３１２】Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM
を用いるトランスフェクションは、上記に記載される。
ＦｕＧＥＮＥTMでのトランスフェクションを、以下の通
りに行った。プラスミドＤＮＡ（５〜１０μｇのｐＥＧ
ＦＰ−Ｃ１、ＣｌｏｎＴｅｃｈカタログ番号６０８４−
１）を水中で希釈して、１００μｌの最終容量とした。
先行実験において、５〜３０μＬのＦｕＧＥＮＥTMを、
十分なＯｐｔｉＭＥＭ TMに添加して、１００μＬの最終
容量を達成した。次いで、ＤＮＡ溶液を、ＦｕＧＥＮＥ
TM溶液にゆっくりと添加し、そして穏やかに混合した。
この混合物を８００μｌのＯｐｔｉＭＥＭTMを補充する
前に室温で３０分間インキュベートした。細胞を、３ｍ
Ｌの予め温めたＯｐｔｉＭＥＭTMで洗浄し、そして１ｍ
ＬのＤＮＡ／脂質混合溶液中で３７℃にて４時間インキ
ュベートした。いくつかの実験では、４時間で、ウェル
にさらに２ｍＬのｍＥＦ馴化培地を入れた；他の実験で
は、ＤＮＡ／脂質混合物を、２ｍＬのｍＥＦ馴化培地を
含むウェルに添加し、そして細胞をこの混合物中で一晩
インキュベートした。
【０３１３】結果を図１０（Ｂ）に示す。最大効率は、
以下の条件下で得られた：バー１＝５μｇのプラスミド
＋１２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００TM
の混合物、２．５ｍＬのｍＥＦ馴化培地を含むウェルに
１ｍＬのＤＮＡ／脂質混合物を添加し、そしてこの細胞
をこの混合物中で一晩インキュベートする。バー２およ
び３＝１０μｇのプラスミド＋１５μｌのＦｕＧＥＮＥ
TMの混合物、そして細胞を１ｍＬのＤＮＡ／脂質混合物
中で４時間インキュベートし、その後、２．５ｍＬのｍ
ＥＦ馴化培地を添加する。Ｌ＝Ｌｉｐｏｆｅａｔａｍｉ
ｎｅ２０００TM；Ｆ＝ＦｕＧＥＮＥTM。
【０３１４】別のシリーズの実験では、ｈＥＳ細胞を、
（コラゲナーゼの代わりに）滅菌ＰＢＳ中の０．５ｍＭ
ＥＤＴＡの溶液を用いてフィーダーのない培養物中で
マトリックスから剥離した後にトランスフェクトした。
細胞を、個々の細胞が丸くなり始めるまでは３７℃にて
５分間インキュベートした。次いで、ＥＤＴＡ溶液を除
去し、そして約１ｍＬの馴化培地を、ウェルにピペット
で入れ、細胞を剥離した。次いで、得られる細胞クラス
ターを、１：３または１：６の分割比で、フィーダーの
ない新たな培養物中で再度プレートした。これらの条件
下で、これらの細胞を播種後２４時間でリポフェクショ
ンした場合、最大の一過性のトランスフェクション効率
が達成された。
【０３１５】フィーダーのないｈＥＳ細胞が安定な遺伝
的改変を受けるか否かを調べるために、Ｍａｔｒｉｇｅ
ｌTM（登録商標）上で維持したＨ１ ｈＥＳ細胞を、Ｅ
Ｆ１ａプロモーターによって駆動されるβ−ガラクトシ
ダーゼを保有する７．５μｇのプラスミドと、ネオホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子を駆動するＰＧＫプロモー
ターを保有する２．５μｇのプラスミドとの混合物で同
時トランスフェクトした。この細胞を、ｍＥＦ馴化培地
中のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上へのプレート後４
８時間でトランスフェクトした。１０μｇのプラスミド
＋１５μｌのＦｕＧＥＮＥTMを、１ｍＬにおいて細胞と
ともに４時間インキュベートし、その後、２．５ｍＬの
ｍＥＦ馴化培地を添加した。４８時間後、培地を、２０
０μｇ／ｍＬジェネティシンを補充したｍＥＦ馴化培地
に交換した。培養物を、このジェネティシンを含有する
培地中で、毎日培地を交換しながら２１日間を越えて維
持した。全ての偽トランスフェクション培養物（すなわ
ち、プラスミドではなく水と混合したＦｕＧＥＮＥTMを
入れた培養物）は、４８〜７２時間以内に死んだ。薬物
耐性コロニーが、ＦｕＧＥＮＥTMおよびプラスミドの両
方でトランスフェクトしたウェルにおいて、１０5個の
元々トランスフェクトした細胞に対して約１の頻度で生
じた。このコロニーを、ジェネティシン含有ｍＥＦ馴化
培地中で維持し、そして増殖させた。
【０３１６】（実施例１１：フィーダーを含まない培養
物についての馴化培地の別の供給源）いくつかの細胞株
からの馴化培地を、フィーダーのない培養物においてｈ
ＥＳ細胞の増殖を支持するそれらの能力について試験し
た。初代マウス胚性線維芽細胞（ｍＥＦ）およびＮＨＧ
１９０テロメラーゼ化ｍＥＦ株の単離は、既に記載され
ている。ＳＴＯは、ＡＴＣＣから入手可能な形質転換さ
れたマウス線維芽細胞株である。ＢＪ ５ｔａは、テロ
メラーゼ化されたヒト包皮線維芽細胞細胞株である。ｈ
ＴＥＲＴ−ＲＰＥは、テロメラーゼ化したヒト網膜上皮
細胞株である。
【０３１７】細胞を増殖させるために用いた培地は以下
の通りであった。１．ｍＥＦ培地：９０％ ＤＭＥＭ
（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（熱非働化）（Ｈｙｃｌ
ｏｎｅ）、および２ｍＭ Ｌ−グルタミン。２．ＳＴＯ
培地：０．１ｍＭ非必須アミノ酸を補充したｍＥＦ培
地。３．ＢＪ ５ｔａ培地：９０％ ＤＭＥＭおよび１
０％ Ｃｏｓｍｉｃ仔ウシ血清（熱非働化していな
い）。４．ＮＨＧ１９０培地：さらに１０％ ＦＢＳを
補充したｍＥＦ培地。５．ＲＰＥ培地：９０％ ＤＭＥ
Ｍ／Ｆ１２、１０％ ＦＢＳ（熱非働化していない）、
１０ｍＬ Ｌ−グルタミンおよび３．４８ｇ／Ｌ炭酸水
素ナトリウム。６．分化培地：８０％ノックアウトダル
ベッコ改変イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、１ｍＭ
Ｌ−グルタミン、０．１ｍＭ β−メルカプトエタノー
ルおよび１％ 非必須アミノ酸、２０％ＦＢＳを補充し
た。
【０３１８】馴化培地を調製するために、それぞれの細
胞株を、Ｃａ++／Ｍｇ++を含まないＰＢＳで１回洗浄
し、トリプシン／ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）中で約５分間
インキュベートし、そしてｍＥＦ培地中に懸濁すること
により収集した。細胞を約４０００ラド（１４０ｋＶで
約５０８秒間；Ｔｏｒｒｅｘジェネレーター、ＥＧ＆Ｇ
Ａｓｔｒｏｐｈｙｓｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒ
ｐ．，Ｌｏｎｇ Ｂｅａｃｈ ＣＡにおける棚の設定
６）で照射した。次いで、これらを計数し、そしてｍＥ
Ｆについては約５５，０００細胞／ｃｍ2で、ＮＨＧ１
９０細胞については約３８，０００／ｃｍ2で、ＳＴＯ
細胞については約９５，０００／ｃｍ2で、ＢＪ ５ｔ
ａ細胞については約８０，０００／ｃｍ2で、ＲＰＥ細
胞については約９０，０００／ｃｍ2で播種した。少な
くとも４時間後、培地を、４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを含
有するＥＳ培地に交換した。馴化培地を、その後毎日収
集し、そしてｈＥＳ培養物への供給のために用いた。ｈ
ＥＳ培養物への添加の前に、各馴化培地に、４ｎｇ/ｍ
Ｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ；Ｇｉ
ｂｃｏ）を補充した。
【０３１９】図１、パネルＢ（右側）は、非馴化の、通
常培地（ＲＭ）と比較して、ｍＥＦ、ＮＨＧ１９０、Ｓ
ＴＯおよびＢＪ ５ｔａ細胞により馴化された培地中、
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で維持されたＨ９株の
ｈＥＳ細胞の形態を示す。ＲＰＥ馴化培地中の細胞は、
培養の最初の週のうちに分化した。他の馴化培地中の細
胞はすべて、適切なＥＳ形態を備えたｈＥＳコロニーを
有していた。形態、培養の集密度、および非分化細胞に
対する分化細胞の比率に基づき、馴化培地は、以下のよ
うに優先度が減少する順にランク付けされる：始原ｍＥ
Ｆ、ＮＨＧ１９０、ＳＴＯ、およびＢＪ５ｔａ。
【０３２０】始原ｍＥＦからの馴化培地中で維持された
細胞と同様に、ＮＨＧ１９０、ＳＴＯおよびＢＪ５ｔａ
を含む他の細胞株により馴化された培地中のＭａｔｒｉ
ｇｅｌ（登録商標）またはラミニン上の細胞は、ＦＡＣ
Ｓ分析により分析したとき、高レベルでＳＳＥＡ−４、
Ｔｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１を、しかし低
レベルのＳＳＥＡ−１を発現した（図２Ｃ）。ｍＥＦ馴
化培地またはＮＨＧ１９０馴化培地中のＭａｔｒｉｇｅ
ｌ（登録商標）またはラミニン上の細胞は、３つの胚葉
細胞型に分化し得た。この分化した培養の免疫細胞化学
的分析は、ニューロンに一致するβチューブリンＩＩＩ
（外胚葉系統）、心筋細胞に一致する心臓トロポニンＩ
（中胚葉系統）、および内胚葉系統の細胞に一致するα
フェトプロテインについて陽性の染色を示した。
【０３２１】実施例１〜３では、ｍＥＦで調整する前
に、そして次いでこの馴化培地を集めそしてｈＥＳ細胞
を養うために用いるときに再び、培地に、４ｎｇ／ｍＬ
のｈｂＦＧＦを添加することによって培地を調製した。
ｈｂＦＧＦの培地への両方の添加が、ＥＳ細胞を未分化
状態に維持するために必要である否かを決定するため
に、ｈｂＦＧＦの一方または両方の添加をなくした実験
を実施した。
【０３２２】ｈｂＦＧＦの第２が添加ないの馴化培地中
で維持された培養は、初期継代では健常には見えず、そ
して培養２９日後に分化したように見えた。ｈｂＦＧＦ
の第１の添加がない馴化培地中で維持された細胞は、大
部分が分化した形態を示したが、培養２７日後により小
さい未分化コロニーをなお形成した。ｈｂＦＧＦのいず
れの添加も行わない馴化培地中に維持された細胞は、１
８日後完全に分化した。対照的に、ｂＦＧＦの両方の添
加を行って調製した馴化培地中で培養した細胞は、長期
間培養で健常かつ未分化であるように見えた。従って、
フィーダー細胞で培養する前後の両方でｂＦＧＦを添加
することにより馴化培地を調製することは、次のフィー
ダーのない（ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ）培養におけるｈ
ＥＳ細胞の分化を防ぐ助けとなる。
【０３２３】馴化培地の貯蔵は以下のように試験した：
回分培地は、上記のようにｍＥＦ細胞培養中で１−２日
調整することにより調製し、そしてシールされた培養フ
ラスコ中４℃で貯蔵した。フィーダーのないｈＥＳ細胞
培養を、貯蔵培地を毎日交換して維持した。未分化幹細
胞の特徴的な形態特徴は、新鮮馴化培地中に維持された
ｈＥＳ細胞に匹敵して、少なくとも７日間後にもなお存
在した。
【０３２４】白血病阻害因子（ＬＩＦ）が、フィーダー
のないｈＥＳ細胞を維持することにおいて馴化培地を置
換し得るか否かを決定するために、Ｈ１およびＨ９株の
細胞を、ＬＩＦを最終濃度１５００、１，０００、また
は５００Ｕ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓからの組換え
ＬＩＦ；Ｃａｔａｌｏｇ＃２５０−Ｌ）で含むＥＳ培地
中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で培養した。細胞
は、陽性コントロールとしてのｍＥＦ馴化培地、および
陰性コントロールとしての非馴化ＥＳ培地と同時に培養
した。１週間後、ＬＩＦを含むかまたは含まない、いず
れの培地における培養も、大きな程度の分化を示した
が、ｍＥＦ馴化培地中に維持された培養は、未分化コロ
ニーを主に含んでいた。これらのデータは、ＬＩＦがフ
ィーダー細胞の不在下では未分化状態にあるｈＥＳ細胞
を維持しないことを示す。 （実施例１２：Ｈ９幹細胞株からのヒト胚線維芽細胞様
細胞によって調整された培地）細胞は、線維芽細胞およ
び間葉細胞の形態的規準を有するｈＥＳ細胞に由来し
た。それらは、フィーダーのない培養でｈＥＳ細胞を支
持し得る。
【０３２５】Ｈ９ ｈＥＳ細胞株を本開示の別の箇所に
記載のように得た。胚様体を形成するため、ｈＥＳ細胞
を、３７℃１０分間の約２００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ
ＩＶとのインキュベーションの後回収し、そして分化培
地中小クラスターに解離させ、そして非接着性細胞培養
プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中で培養し、懸濁液中に凝集
体を形成した。約２×１０6細胞を各ウェル（９．６ｃ
ｍ2）中に接種した。懸濁液中で２日後、凝集体をゼラ
チン被覆プレート中に写した。それらは、プレートに付
着し、そして異なる形態を有する細胞に分化し続けた。
線維芽細胞様細胞は、さらに１１日後、分化細胞の混合
集団中１００〜１０００細胞のクラスターで観察され
た。
【０３２６】線維芽細胞様細胞を単離するため、培養を
約２００Ｕ／ｍＬコラゲナーゼＩＶ中３分間３７℃でイ
ンキュベートした。線維芽細胞様細胞のクラスターを、
顕微鏡下でＰｉｐｅｔｍａｎTMで取り出し、そして分化
培地を含むチューブに直接移すか、またはコラゲナーゼ
溶液中に放出し、そして次に集めた。細胞を遠心分離
し、分化培地中に再懸濁し、そして６ウェルプレートの
１つのウェル上にプレートした。細胞を増殖させ、そし
て連続的に継代した．第３回目の継代で、培養をｍＥＦ
培地にスイッチした。すべての手順で、細胞は、２−３
日毎に養われた。
【０３２７】線維芽細胞様細胞中にテロメラーゼを導入
するために、これらは、以下のように、レトロウイルス
を発現するｈＴＥＲＴに感染させた。細胞を、感染の１
日前に、８．６×１０4細胞／ウェル（９．６ｃｍ2）で
６ウェルプレート上に接種し、ｍＥＦ培地に交換される
８時間前に、４μｇ／ｍＬポリブレンを補填したウイル
ス含有培地とともにインキュベートした。異なるウェル
を、ｐＢＡＢＥ−ｈＴＥＲＴまたはｐＢＡＢＥベクター
コントロールで感染した。ｐＢＡＢＥ−ｈＴＥＲＴは、
ｈＴＥＲＴコード配列（５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲは
除去、そしてＡＴＧ開始コドンから−１〜−５の位置に
あるＫｏｚａｋコンセンサス翻訳開始部位）を、市販の
ｐＢＡＢＥ．ｐｕｒｏのＥｃｏＲＩ部位中に、ｈＴＥＲ
Ｔコード領域を５’ＬＴＲと同じ配向に配置してクロー
ニングすることにより構築した（Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ
ら、Ｈｕ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．９：４０３、２０００）。
細胞をさらに６日培養し、そして最終濃度１．６μｇ／
ｍＬのピューロマイシン中でさらに８日間選択した。次
いで細胞を回収し、そしてｍＥＦ培地中に再接種した。
【０３２８】細胞を増殖させ、そして５０日間線維芽細
胞様形態を提示し続けた。細胞を、感染後２０日に、Ｔ
ＲＡＰアッセイのために集めた。細胞は、０日から２７
日までｍＥＦ培地中に維持され、そして２８日から４３
日まで分化培地にスイッチした。細胞を選択後に各継代
ごとに計数し、そしてその集団の倍化を計算した。
【０３２９】テロメラーゼ化細胞株およびコントロール
細胞株（コントロールレトロウイルスで非形質導入また
は形質導入）の両方は、５０日の培養の間約７または８
倍化する培養で増殖した。ｈＴＥＲＴ発現カセットで形
質導入した細胞は、ＴＲＡＰアッセイで陽性のテロメラ
ーゼ活性を示したが、コントロール細胞は、任意の活性
を示さなかった。ｈＴＥＲＴ−ｈＥＦ細胞は、コントロ
ール細胞の増殖速度と同様の増殖速度で連続的に継代し
た。
【０３３０】馴化培地を調製するために、ｈＴＥＲＴト
ランスフェクト細胞を、Ｃａ++／Ｍｇ++を含まないＰＢ
Ｓで１回洗浄し、そして１．５−２ｍＬトリプシン／Ｅ
ＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）中で２分間インキュベートするこ
とにより回収した。この細胞をプレートから脱離させた
後、それらをｍＥＦ培地に集めた。それらを４０００ｒ
ａｄで照射し、カウントしそして約３．７−５×１０5
細胞／ウェルで接種した。少なくとも１６時間後、培地
を、ｈＥＳ培地＋４ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦで交換した
（４ｎｇ／ｍＬの外から添加したヒト塩基性線維芽細胞
増殖因子を含む上記の血清補充培地）。６ウェルプレー
トのウェルあたり３〜４ｍＬを用いた。
【０３３１】馴化培地をｈＥＳ培養を養うために毎日集
めた。ｈＥＳ培養への添加の前に、馴化培地を４ｎｇ／
ｍＬのｈｂＦＧＦ（Ｇｉｂｃｏ）で補填した。ｈＴＥＲ
Ｔ−ｈＥＦ培養を、この系で１−２週の間用いた。
【０３３２】この培地のｈＥＳ細胞増殖を支持する能力
を、Ｈ１ ｈＥＳ細胞株に対して試験した。ｈＥＦ馴化
培地により支持されたＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上
のフィーダーのない培養中に再プレートしたｈＥＳ細胞
の培養（パネルＣ＆Ｆ）は、未分化ｈＥＳ細胞の形態特
徴を持つコロニーを形成した。この培養は、始原ｍＥＦ
フィーダー細胞の層上に直接、または始原ｍＥＦにより
調整された培地中Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上で増
殖したｈＥＳ細胞から識別不能に見えた。ｈＥＳ細胞の
健常コロニーは、サイズが増加し、そして未分化胚性幹
細胞の特徴的な特色を有していた。２〜３のコロニー
は、所定の程度の分化を示したが、分化の程度は、各々
の培養条件の下で同様であった。
【０３３３】接種後７日で、培養はほぼ集密になり、そ
して１：３または１：４の比、約１３０，０００〜１７
０，００細胞ｃｍ-2で分裂した。細胞を、３０日にわた
ってこの条件下で、ｈＥＳ細胞の形態的特徴を提示しな
がら維持した。
【０３３４】（実施例１３：Ｈ１株からのｈＥＦにより
調整された培地）第２のヒト胚線維芽細胞（ｈＥＦ）様
細胞株を、Ｈ１と称する、異なるｈＥＳ細胞株から発生
させた。胚様体が以前のように形成され、そして４日
後，懸濁液で、培養を、さらなる９日間のためにゼラチ
ン被覆プレート上にプレートした。
【０３３５】この実施例では、線維芽細胞をピペットに
より選択するよりむしろ、バルク培養から発生させた。
培養は、ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼＩＩ型に
おいて、３７℃で３０分間インキュベートした。細胞を
回収し、解離し、遠心分離し、分化培地中に再懸濁し、
そして６ウェルプレート中にプレートした。増殖細胞を
ｈＥＦ培地（９０％ＤＭＥＭ、１０％熱不活化ＦＢＳ、
０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および２ｍＭのＬ−グルタ
ミン）中で継代し、そして２−３日毎に養った。２継代
の後、この細胞集団は、線維芽細胞の形態的特徴を備え
均一であるように見えた。このｈＥＦ細胞株をＨＥＦ１
と称した。
【０３３６】亜集団を、実施例１２中のように、レトロ
ウイルステロメラーゼ発現ベクター（ｐＢＡＢＥ−ｈＴ
ＥＲＴ）、またはベクターコントロールで形質転換し
た。
【０３３７】図１１（パネルＡ）は、ＨＥＦ１細胞株の
形態を示す。パネルＢ（下）は、ＴＲＡＰアッセイで測
定したときのテロメラーゼ活性を示す。ｈＴＥＲＴ発現
カセットで形質転換した細胞は、形質導入後２０または
６５日で陽性のテロメラーゼ活性を示した。非形質導入
細胞株、またはベクターコントロールで形質導入した細
胞は、テロメラーゼ活性を示さなかった。
【０３３８】図１２は、ｈＴＥＲＴ形質導入ＨＥＦ１細
胞、およびベクターコントロールで形質導入された細胞
の増殖曲線を示す。両方の株は、コントロール細胞が分
裂することを停止した（多分それらはヘーフリック限度
に到達したためである）３８日の時点まで、ほぼ２日毎
に倍化した。ｈＴＥＲＴトランスフェクト細胞は、６０
日の時点（３０倍化）を越えて一致した増殖速度で増殖
を継続した。
【０３３９】図１３は、細胞老化の既知のバイオマーカ
ーである（Ｄｉｍｉｔｒｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９３６３、１９９
５）、老化関連βガラクトシダーゼに対する染色後の、
ｈＴＥＲＴ形質導入細胞およびコントロール細胞の顕微
鏡写真である。チャンバースライド上で増殖した細胞
を、ＰＢＳ中の０．２％のグルタルアルデヒド中で２分
間固定し、ＰＢＳで洗浄し、そして４０ｍＭのクエン酸
リン酸緩衝液ｐＨ６．０中の、１ｍｇ／ｍＬの５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリル−Ｄ−ガラクトシダー
ゼ（Ｘ−ｇａｌ）、５ｍＭのＫ4Ｆｅ（ＣＮ）6、５ｍＭ
のＫ3Ｆｅ（ＣＮ）6、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＬの
ＭｇＣｌ2で一晩インキュベートした。ＨＥＦ１コント
ロール細胞は、βガラクトシダーゼについて強く染色さ
れ、その一方、ｈＴＥＲＴ形質導入細胞は、染色されな
かった。合わせた結果は、ｈＴＥＲＴの発現が、ＨＥＦ
１細胞の寿命特徴を延長することを示す。
【０３４０】培地は、６０００ｒａｄで照射したＨＥＦ
１細胞を用いて実施例１２におけるように調整し、そし
て約４．１〜５．５×１０4細胞ｃｍ-2で接種した。こ
の培地を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基体上で培養
したＨ９ ｈＥＳ細胞株の増殖を支持するその能力につ
いて試験した。
【０３４１】図１４は、マウス胚線維芽細胞によるか、
またはＨＥＦ１細胞株のいずれかにより調整した培地中
に継代した後のｈＥＳ細胞のコロニーを示す。ｈＥＳ細
胞は、４継代の間、ＨＥＦ１馴化培地を用いて維持さ
れ、未分化ＥＳ細胞の形態を提示し続けた。このｈＥＳ
細胞は、ｈＴＥＲＴおよびＯＣＴ−４の発現を維持する
ことが見出された。パネルＢに示されるように、それら
もまた、未分化ｈＥＳ細胞の特徴である、ＴＲＡＰアッ
セイで測定されたとき、テロメラーゼ活性を示し続け
た。
【０３４２】（実施例１４：ｃＤＮＡライブラリー）ポ
リＡ＋ｍＲＮＡを、以下のように、未分化および分化ｐ
ＰＳ細胞から単離した。
【０３４３】ヒト胚性幹細胞を、本開示の他の箇所で記
載されたように、フィーダー細胞上からか、またはフィ
ーダーのない環境中のいずれかで増殖した培養から得
た．ｃＤＮＡライブラリーは両方から得た。フィーダー
のない培養を用いることは、マウスＲＮＡを汚染するこ
とのないライブラリーを生成する利点を有し、そしてｍ
ＲＮＡ単離のために多数の細胞を産生するためにより容
易に大規模化され得る。
【０３４４】総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙTMプロトコール
および試薬（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、
製造業者の指示書に従ってｈＥＳ細胞から単離された。
簡単に述べれば、細胞を、グアニジニウムイソチオシア
ネート（ＧＩＴＣ）の溶液を用いて培養皿中で直接溶解
し、そして得られる抽出物を、ＲＮＡは結合するが夾雑
物およびゲノムＤＮＡは結合しない条件下で、ＲＮｅａ
ｓｙTMマトリックスに結合させた。このマトリックス
を、製造業者により供給される定められた緩衝液で洗浄
した後、総ＲＮＡを水で溶出し、そして２６０ｎｍにお
ける吸光度により定量した。
【０３４５】次いで、ポリＡ＋ｍＲＮＡを、総ＲＮＡ調
製物から、ＯｌｉｇｏｔｅｘTMプロトコールおよび試薬
（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いることにより
精製した。簡単に述べれば、共有結合したｄＣ10Ｔ30オ
リゴヌクレオチドを含むビーズマトリックスを総ＲＮＡ
と混合し、ｍＲＮＡのポリＡ＋テイルと、ｄＣ10Ｔ30結
合ビーズとの間の相互作用を可能にした。規定した洗浄
溶液を用いた洗浄の後、結合したｍＲＮＡを、低塩緩衝
液中に放出し、そして収率を２６０ｎｍにおける吸光度
により定量した。ゲル電気泳動で、ポリＡ＋ｍＲＮＡの
全体の純度を確認した。
【０３４６】ｃＤＮＡ合成は、標準的なプロトコール
（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTM Ｌａｍｂｄａ Ｓｙｓｔ
ｅｍ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を用いて達成された。１μｇのポリ
Ａ＋ｍＲＮＡを、オリゴｄＴ−ＮｏｔＩプライマー／ア
ダプターおよびＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔTMＩＩ逆転写酵
素を用いて一本鎖ｃＤＮＡに変換した。［32Ｐ］ｄＣＴ
Ｐをこの反応中に含め、第１鎖変換効率の計算を可能に
した。次いで、一本鎖ｃＤＮＡを、ＤＮＡリガーゼおよ
びＲＮａｓｅＨの存在下、ＤＮＡポリメラーゼを用いて
二本鎖ｃＤＮＡに変換した（すべての酵素はＥ．ｃｏｌ
ｉ起源）。この二本鎖ｃＤＮＡを、ＳａｌＩアダプター
と連結し、次いでゲル排除クロマトグラフィーにより分
析した。カラムフラクションの各々の一部分を、ゲル電
気泳動により分析し、そして２ｋｂｐまたはそれより大
きい推定中間サイズをもつｃＤＮＡを含むフラクション
をプールした。次いで、サイズ選択されたｃＤＮＡプー
ルを、ＮｏｔＩエンドヌクレアーゼで制限し，そしてＮ
ｏｔＩ／ＳａｌＩ制限ｐＳｐｏｒｔ１プラスミド（Ｌｉ
ｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と連結した。連結産
物を用いて、ＵｌｔｒａＭａｘTMコンピテントＥ．ｃｏ
ｌｉ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転
換し、それを次いでアンピシリンを含む培地プレート上
にプレートした。代表的には、これらの方法により生成
されたライブラリーは、個々のコロニーからのプラスミ
ド調製物のＰＣＲにより判定したとき、−１．２ｋｂｐ
の中間ｃＤＮＡ挿入サイズをもつ、５×１０6以上の独
立クローンから構成されていた。
【０３４７】ｃＤＮＡライブラリーはまた、胚様体（Ｅ
Ｂ）細胞から調製され、これは、ｈＥＳ細胞から分化し
た細胞の混合集団を含む。ＥＢを調製するために、ｈＥ
Ｓ細胞の単層培養を、約２００Ｕ／ｍＬのコラゲナーゼ
ＩＶと、約５−２０分３７℃でインキュベートすること
により回収した。このｈＥＳ細胞を、クラスターに解離
し、そして８０％ＫＯ ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、２０
％非加熱不活化ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、０．１ｍＭ
非必須アミノ酸、１ｍＭ グルタミン、および０．１ｍ
Ｍβメルカプトエタノールを含む、分化培地中、非接着
細胞培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）中にプレートした。
【０３４８】次いで、このＥＢを、９．６ｃｍ2ウェル
あたり２ｍＬの培地中１：２の比率で接種した。このＥ
Ｂは、一日おきに、ウェルあたり２ｍＬの培地を４ｍＬ
／ウェルまで添加すること、次いで集められそして２ｍ
Ｌの新鮮培地中に再懸濁することにより養われた。総Ｒ
ＮＡは、懸濁培養中約２−８日後に調製された。あるい
は、ＥＢは、懸濁培養中に約４日間維持され、次いでゼ
ラチン被覆プレート上にプレートし、そしてさらに７日
間培養した。これは、多様な細胞集団の形成をもたら
し、そしておそらくはより高い細胞密度のためにＲＮＡ
の収率を向上させる。約２０〜５００×１０6細胞から
の総ＲＮＡの収率は、約２５〜２５００μｇであった。
【０３４９】（ｈＥＳ細胞における発現のためのプロモ
ーターの選択）種々のプロモーターを、未分化ｈＥＳ細
胞における安定な長期間遺伝子発現を駆動するそれらの
能力について試験した。構築物は、レトロウイルス形質
導入によるか、またはＦｕＧＥＮＥTM媒介リポフェクシ
ョンによるかのいずれかで導入した。
【０３５０】６ウェルプレートにプレートされたｈＥＳ
細胞は、フィーダー層から、コラゲナーゼ（約２００単
位／ｍＬ）を３７℃で７−１０分間用いて取り出した。
コロニーが脱離はじめるとき、各ウェルからのコラゲナ
ーゼを吸引し、そして２ｍＬの標準ｈＥＳ培地／ウェル
で置換した。ｈＥＳ細胞を、単一ウェルの表面を５ｍＬ
ピペットで掻き取ることにより取り出し、そして５０ｍ
Ｌのコニカルチューブに移した。さらなるｈＥＳ培地を
添加して最終容量を１０ｍＬにした。細胞懸濁液を、１
０ｍＬピペットで１０−１２回摩砕し、そしてさらなる
８ｍＬの標準ｈＥＳ培地を添加した。３ｍＬの細胞懸濁
液を、上記のようにゼラチンおよびｍＥＦフィーダー層
で予備被覆された６ウェルプレートの各ウェルに添加し
た（すなわち、６ウェルプレートの１ウェルが新たなプ
レートの６ウェルを接種するに十分であった）。
【０３５１】レトロウイルスを用いる形質導入は、以下
のように行った。ＧＲＮ３５４と称するレトロウイルス
ベクターは、ＣｌｏｎＴｅｃｈから購入したＰＭＳＣＶ
ｎｅｏベクター（カタログ番号Ｋ１０６２−１）を用い
てＧｅｒｏｎ Ｃｏｒｐ．で構築された。ｅＧＦＰコー
ド領域は、ＭＳＣＶ ＬＴＲから下流に挿入された。こ
のＬＴＲは、ＧＦＰの発現を駆動し、そしてこのベクタ
ーはまた、マウスＰＧＫプロモーターにより駆動される
ｎｅｏr遺伝子を含む。
【０３５２】プレートは、０．５％ゼラチンおよびＮＨ
Ｇ１９０フィーダー細胞（２４ウェルプレートについて
１ｍＬ ＮＨＧ１９０培地中７．５×１０4；６ウェル
プレートについて３ｍＬ培地中３．７５×１０5）で被
覆した。ｈＥＳ株Ｈ７を、ｈＥＳ培地中に、２４ウェル
調製プレート上に接種した（１ｍＬ／ウェル）。４８時
間後、３ウェルのｈＥＳ細胞を、３７℃で０．０５％ト
リプシン／５ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いた脱
離させ、５００μＬのＮＨＧ１９０培地中に再懸濁し、
そして計数した。レトロウイルス構築物ｐＧＲＮ３５４
のストックを使用の直前に氷上で融解した。増殖培地を
ウェルから吸引し、そして４００μＬｈＥＳ培地プラス
８μＬのレトロウイルス（ＭＯＩ １０）および４μＬ
の８ｍｇ／ｍＬポリブレン溶液（Ｓｉｇｍａ）で置換し
た。２時間後、８００μＬのｈＥＳ培地をウェルあたり
添加した。形質導入したウェルの各々に、１ｍＬの新鮮
ｈＥＳ培地を２４時間毎に再供給した。
【０３５３】形質導入の４日後、培地を、２００μｇ／
ｍＬゲネチシンを含む１ｍＬのｈＥＳ培地で置換した。
ゲネチシン選択の３日後、細胞をコラゲナーゼで脱離さ
せ、摩砕し、３ｍＬのｈＥＳ培地中に再懸濁し、ゼラチ
ンおよびＮＨＧ１９０フィーダーで被覆した６ウェルプ
レートの１つのウェル中に再接種し、そして２４時間
後、ｈＥＳ培地を再供給した。次いで培地を、ゲネシチ
ンを含むｈＥＳ培地で再び置換し、そして２４時間毎に
再供給した。
【０３５４】ＦｕＧＥＮＥTM６（Ｒｏｃｈｅ）を用いる
リポフェクチンを、製造業者の指示書に従って構築し
た。このプラスミドＤＮＡ（５−１０μｇのｐＥＧＦＰ
−Ｃ１、ＣｌｏｎＴｅｃｈカタログ番号６０８４−１）
を水中に最終容量１００μｌまで希釈した。パイロット
実験では、５−３０μＬのＦｕＧＥＮＥTMを、十分なＯ
ｐｔｉＭＥＭTM溶液（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１１−５
８−０２１）に添加し、１００μＬの最終容量を達成し
た。次いで、このＤＮＡ溶液をＦｕＧＥＮＥTM溶液にゆ
っくり添加し、そして穏やかに混合した。この混合物
を、８００μｌのＯｐｔｉＭＥＭTMで補填する前に、３
０分間室温でインキュベートした。
【０３５５】トランスフェクションの４８時間前、ｈＥ
Ｓ細胞を、ゼラチンおよびｍＥＦフィダー層で被覆した
６ウェルプレート上に接種した。細胞を、３ｍＬの余熱
したＯｐｔｉＭＥＭTMで洗浄し、そして３７℃で４時間
ＤＮＡ／脂質混合物中でインキュベートした。いくつか
の実験では、４時間後、ウェルに、さらなる２ｍＬのｍ
ＥＦ馴化培地を入れた；他には、ＤＮＡ／脂質混合物
を、２ｍＬのｍＥＦ馴化培地を含むウェルに添加し、そ
して細胞をこの混合物中で一晩インキュベートした。
【０３５６】次の実験では、ｈＥＳ細胞のフィーダーの
ない培養を、ＦｕＧＥＮＥTMを用いてトランスフェクト
した。これらの実験では、未分化ｈＥＳ細胞を、ｍＥＦ
馴化培地プラス付加的な４ｎｇ／ｍＬ ｈｂＦＧＦ中、
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）被覆６ウェルプレート上
に接種した（約１．５×１０4細胞ｃｍ-2の代表的密
度）。プレーティングの４８時間後、細胞を、すでに記
載したように、ＦｕＧＥＮＥTMでトランスフェクトし
た。トランスフェクションの４８時間後、細胞に、ｍＥ
Ｆ馴化培地プラス４ｎｇ／ｍＬ ｈｂＦＧＦおよび２０
０μＧ／ｍＬゲネチシンを再供給した。次いで、細胞
に、日毎のベースで２００μＧ／ｍＬゲネシチンを含む
培地を再供給した。
【０３５７】代表的実験の結果を表２に要約する。
【０３５８】
【表２】 これらの規準により、ＰＧＫ、ＥＦ１α、およびＵｂｉ
Ｃプロモーターは、未分化ｈＥＳ細胞におけるｃＤＮＡ
クローンの安定な長期間発現に適切である。
【０３５９】この開示は、フィーダー細胞の非存在下で
ヒト多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養するための改善され
たシステムを提供する。そのフィーダー細胞の役割は、
細胞外マトリックス上のその培養物を支持し、そしてそ
の細胞を馴化培地で培養することによって置き換えられ
得る。商業的規模で馴化培地を産生し得る永久的な細胞
株が提供される。ウイルスベクターまたはＤＮＡ／脂質
複合体を細胞に導入することによって、ｐＰＳ細胞を遺
伝的に変更する方法もまた見出された。本開示により記
載されるシステムは、ｐＰＳ細胞分化の生物学の研究、
およびヒト治療における使用のための重要な製品の産生
において使用するためのｐＰＳ細胞の大規模増殖を可能
にする。
【０３６０】本明細書で提供される組成物および手順
は、以下の請求項で具現化される本発明の思想から逸脱
することなく当業者によって効果的に改変され得ること
が認識される。
【０３６１】
【表３】
【０３６２】
【発明の効果】本発明は、ヒト多能性幹細胞の増殖、増
殖を促進する培養条件、ならびに遺伝的改変、ｃＤＮＡ
ライブラリーの産生、および組織再生を目的とする分化
した細胞の産生のための使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、フィーダー細胞のない培養におけるｈ
ＥＳ細胞の形態を示す顕微鏡写真のハーフトーン製版で
ある。パネルＡ（左側）は、通例の培養培地（ｍＥＦ／
ＲＭ）中においてフィーダー細胞上に培養されたｈＥＳ
細胞の形態、あるいはｍＥＦ馴化培地中においてＭａｔ
ｒｉｇｅｌ（登録商標）、ラミニン、フィブロネクチ
ン、またはコラーゲンＩＶ上に培養されたｈＥＳ細胞の
形態を示す。パネルＢ（右側）は、馴化されていない通
例の培地（ＲＭ）と比較された、ｍＥＦ細胞、ＮＨＧ１
９０細胞、ＳＴＯ細胞およびＢＪ５Ｔａ細胞によって馴
化された培地中においてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）
上に維持されたｈＥＳ細胞の形態を示す。通例の培地に
おけるｈＥＳ細胞は、培養の最初の週の間に分化した。
特定の型の馴化培地中におけるｈＥＳ細胞は、未分化の
細胞に関して適切な形態を持ったコロニーを含んだ。パ
ネルＣは、通例の培地（ｍＥＦ／ＲＭ））中においてフ
ィーダー細胞上に維持されたｈＥＳ細胞、あるいはｍＥ
Ｆ馴化培地中においてＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上
またはラミニン上に維持されたｈＥＳ細胞において測定
されたインテグリン発現を示す棒グラフである。インテ
グリン構成成分α６およびβ１は、ｈＥＳ細胞の細胞外
マトリックスへの接着における役割を演じ得る。
【図２】図２は、ＦＡＣＳ解析によるフィーダー細胞な
しの細胞における表面マーカー発現を示す。パネルＡ
は、通例の培地（ｍＥＦ／ＲＭ）中においてフィーダー
細胞上に増殖されたｈＥＳ細胞、または馴化培地を用い
て細胞外マトリックス上に増殖されたｈＥＳ細胞によっ
て発現された糖タンパク質ＳＳＥＡ−４の発現を示すＦ
ＡＣＳスキャンプロフィールである。パネルＢは、異な
るマトリックス上で培養されたｈＥＳ細胞に関する表面
マーカーの蛍光強度を示す棒グラフである。パネルＣ
は、異なる細胞株由来の馴化培地中においてＭａｔｒｉ
ｇｅｌ（登録商標）上に培養されたｈＥＳ細胞に関する
表面マーカーの蛍光強度を示す棒グラフである。
【図３】図３は、初期フィーダー細胞（ｍＥＦ）によっ
て増殖された細胞、あるいは馴化培地中において細胞外
マトリックスＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミ
ニン上に増殖された細胞に対する免疫組織化学によって
検出されたマーカー発現を示す顕微鏡写真のハーフトー
ン製版である。フィーダー細胞のない培養物において増
殖されたｈＥＳ細胞は、マウス線維芽フィーダー細胞上
に増殖されたｈＥＳ細胞に類似する表現型のマーカーを
有する。
【図４】図４は、通例の培地（ＲＭ）または馴化培地
（ＣＭ）とともに、フィーダー細胞（ｍＥＦ）あるいは
細胞外マトリックス（Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）ま
たはラミニン）とともに培養されたｈＥＳ細胞における
ＯＣＴ−４およびｈＴＥＲＴ発現の解析を提供する。上
のパネルは、ＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡレベルでのＯ
ＣＴ−４およびｈＴＥＲＴの発現を示すゲルのコピーで
ある。下のパネルは、１８ｓスタンダードに対するＯＣ
Ｔ−４またはｈＴＥＲＴの比率として表された、異なる
基質上に増殖する細胞に対する発現のレベルを比較する
棒グラフである。馴化培地中において、ラミニンおよび
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）上に生育されたｈＥＳ細
胞は、フィーダー細胞層上に増殖されたｈＥＳ細胞のパ
ターンと類似した発現パターンを有する。
【図５】図５は、ＴＲＡＰアッセイによって培養された
ｈＥＳ細胞において測定されたテロメラーゼ活性を示
す、ゲルのハーフトーン製版である。すべての培養条件
は、フィーダー細胞なしの培養物において４０日間後
に、陽性のテロメラーゼ活性を示した。
【図６】図６は、胚様体形成を通しての分化を可能にさ
れた、培養されたｈＥＳ細胞において実施された免疫組
織化学のハーフトーン製版である。ｈＥＳが、フィーダ
ー細胞上または細胞外マトリックス上において培養され
たかどうかに関わらず、染色パターンは、異なる細胞型
への分化の能力と一致する。染色パターンは、神経およ
び心筋細胞系統（βチュブリンＩＩＩおよび心臓のトロ
ポニンＩ）の細胞をそれぞれ示す。内胚葉系統のマーカ
ー、αフェトプロテインに対して染色した細胞もまた存
在する。
【図７】図７は、異なる細胞系統へ分化する能力の別の
指標として、ｈＥＳ細胞由来のテラトーマの組織病理学
のハーフトーン製版である。パネルＡ（上列）は、ｍＥ
Ｆフィーダー細胞上で増殖されるｈＥＳ由来のテラトー
マにおける異なる細胞の数を示す。パネルＢ（下列）
は、フィーダー細胞なしの培養において増殖されるｈＥ
Ｓ由来のテラトーマにおける異なる細胞を示す。
【図８】図８は、ＧＦＰ発現および未分化細胞のマーカ
ーであるＳＳＥＡ−４に関する、形質導入されたｈＥＳ
細胞のＦＡＣＳプロフィールである。ｈＥＳ細胞は、フ
ィーダー細胞層上にプレートされ、両方ともＧＦＰ発現
カセットを含むアデノウイルスベクターＡｄ５ＧＦＰま
たはレトロウイルスベクターＧＲＮ３５４のいずれかを
用いて、４８時間後に感染された。細胞は、回収され、
ＳＳＥＡ−４に対する抗体を用いて染色され、フローサ
イトメトリーによってＧＦＰ発現をアッセイした。上の
パネルは、偽感染培養物におけるバックグラウンド蛍光
およびＳＳＥＡ−４陽性染色を示す。下のパネルは、Ｇ
ＦＰの発現から生じる緑色の蛍光のレベルを示す。
【図９】図９は、ｈＥＳが、リポフェクションによって
フィーダー細胞なしの培養物中で遺伝的に変更された実
験の結果を示す。パネルＡは、ＧＦＰ発現のためにトラ
ンスフェクトされた後の、ラミニン上のｈＥＳ細胞の形
態を示す明視野顕微鏡写真のハーフトーンである。パネ
ルＢは、同一コロニーにおけるＧＦＰ発現を示す蛍光顕
微鏡写真のハーフトーンである。パネルＣは、種々の条
件下におけるＧＦＰ発現細胞の割合を示す棒グラフであ
る。
【図１０】図１０は、ＳＳＥＡ−４陽性細胞集団（未分
化ＥＳ細胞）におけるＧＦＰ陽性細胞の割合を示す棒グ
ラフである。パネルＡ：明るい緑色の細胞が、フィーダ
ー細胞なしの培養の未分化ｈＥＳコロニーにおいて観察
された。対照的に、緑色の細胞は、フィーダー上で増殖
されたｈＦＳ細胞のコロニーにおいて、ほとんど見出さ
れなかった。ＦＡＣＳ解析は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録
商標）上の細胞の１６％およびラミニン上の細胞の１４
％が、ＳＳＥＡ−４陽性（未分化）細胞集団においてＧ
ＦＰ陽性であり、一方、フィーダー細胞上の細胞のたっ
た５％が、陽性であったことを示し、これは、トランス
フェクション効率が、フィーダーを含まない条件を使用
することによって有意に増加されることを示唆する。パ
ネルＢは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００
TM（Ｌ）またはＦｕＧＥＮＥTM（Ｆ）の異なる条件を用
いたＧＦＰレポータープラスミドのトランスフェクショ
ン効率を示す。
【図１１】図１１は、フィーダー細胞なしの培養におい
て、ｈＥＳ細胞を支持する馴化培地を産生し得るヒト細
胞株の特徴を示す。パネルＡは、ＨＥＦ１細胞株が線維
芽細胞の形態的な特徴を有することを示す、位相差顕微
鏡写真のコピーである。パネルＢ（下）は、テロメラー
ゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）のレトロウイルスベクター
で形質転換されたＨＥＦ１細胞が、テロメラーゼ活性を
獲得したことを示すＴＲＡＰアッセイの結果のコピーで
ある。
【図１２】図１２は、ｈＴＥＲＴを形質導入されたＨＥ
Ｆ１細胞、およびベクターコントロールで形質転換され
た細胞の増殖を示すグラフである。両株は、最初、二日
ごとに約一度倍加した。しかし、コントロール細胞は、
３８日目において増殖を停止し、一方ｈＴＥＲＴトラン
スフェクト細胞は、一貫した増殖速度で６０日以上増殖
し続けた。
【図１３】図１３は、細胞の老化について既知の生物マ
ーカーである、老化に関連したβガラクトシダーゼに対
する染色の後の、ｈＴＥＲＴ形質導入細胞およびコント
ロール細胞の顕微鏡写真である。ｈＴＥＲＴでのトラン
スフェクションは、細胞株の寿命を伸長し、そして老化
を妨げる。
【図１４】図１４は、馴化培地への継代の後のｈＥＳ細
胞のコロニーを示す。パネルＡは、初代マウス胚性線維
芽細胞（ｍＥＦ）によって、またはヒト線維芽細胞様細
胞株ＨＥＦ１によって馴化された培地中に維持されたｈ
ＥＳ細胞の培養物中の未分化のコロニーを示す、明視野
顕微鏡写真のコピーである。パネルＢ（右）は、ＨＥＦ
１馴化培地を用いて維持されたｈＥＳ細胞が、未分化細
胞のテロメラーゼ活性の特徴を示すことを示した、ＴＲ
ＡＰの結果のコピーである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ウォルター， ディー． ファンク アメリカ合衆国 カリフォルニア， ハイ ワード (72)発明者 ジョゼフ， ディー． ゴールド アメリカ合衆国 カリフォルニア， サン フランシスコ (72)発明者 マーガレット， エス． イノクマ アメリカ合衆国 カリフォルニア， サン ノゼ (72)発明者 チュンヒュイ シュー アメリカ合衆国 カリフォルニア， クー パーチーノ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 CA04 DA02 EA04 GA11 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR69 QR72 QR78 QR80 QS24 4B065 AA91X AA91Y AA93X AA93Y AB01 AC20 BA02 BD50 CA46

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 フィーダー細胞を本質的に含まない、増
    殖中の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を含有する組成
    物。
  2. 【請求項２】 フィーダー細胞を本質的に含まない増殖
    環境において、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞を培養す
    るために適切な馴化培地を産生するための細胞株。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の組成物の細胞の分化を
    引き起こすか、または分化を可能にすることによって調
    製される、分化した細胞集団。
  4. 【請求項４】 未分化の霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞
    のドナー培養物から、以下の工程を包含する方法によっ
    て産生される分化した細胞： ａ）該未分化のドナー培養物から細胞の懸濁液を調製す
    る工程； ｂ）該懸濁された細胞を、それらが胚様体を形成せずに
    分化するように、固相表面上に再播種し、そして培養す
    る工程；および ｃ）分化した細胞を該固相表面から収集する工程。
  5. 【請求項５】 霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞の集団で
    あって、該未分化のｐＰＳ細胞の少なくとも２５％が、
    ポリヌクレオチドで安定にトランスフェクトされている
    か、または該ポリヌクレオチドを遺伝したそのような細
    胞の子孫である、霊長類多能性幹（ｐＰＳ）細胞の集
    団。
  6. 【請求項６】 未分化のｐＰＳ細胞またはｐＰＳ細胞か
    ら分化した細胞のいずれかにおいてｍＲＮＡレベルで発
    現される少なくとも１，０００遺伝子のｃＤＮＡライブ
    ラリーであって、他の脊椎動物のｃＤＮＡを本質的に含
    まない、ｃＤＮＡライブラリー。
  7. 【請求項７】 細胞傷害性または細胞調節について化合
    物をスクリーニングする方法であって、請求項３または
    ４に記載の分化した細胞を、該化合物と接触させる工
    程、該化合物との接触から生じる該細胞における任意の
    表現型または代謝変化を決定する工程、および該変化を
    細胞傷害性または細胞調節と相関させる工程、を包含す
    る、方法。
  8. 【請求項８】 請求項１〜６のいずれかに記載の組成物
    であって、前記ｐＰＳ細胞が、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細
    胞である、組成物。
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