CN102712902B - 人胚胎干细胞的分化 - Google Patents
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Abstract
本发明提供促进多能干细胞分化为胰岛素产生细胞的方法。具体而言，本发明提供一种使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6.1的表达增加的方法。
Description
技术领域
本申请要求2009年12月23日提交的美国临时申请No.61/289,692的 优先权，该申请通过引用的方式完整并入本文。
技术领域
本发明提供促进多能干细胞分化为胰岛素产生细胞的方法。具体而 言，本发明提供一种使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3 和NKX6.1的表达增加的方法。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注 意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素产生细胞或β细胞的来源上。一种 方法是从多能干细胞例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育期间，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程 中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的细胞群体。诸如甲状 腺、胸腺、胰腺、肠和肝脏之类的组织将从内胚层，经由中间阶段发育而 来。该过程中的中间阶段是形成定形内胚层。定形内胚层细胞可表达多种标 志物，如HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。
定形内胚层分化成胰腺内胚层导致形成胰腺。胰腺内胚层细胞表达胰- 十二指肠同源盒基因Pdx1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后 不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了 其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分 泌组织来自胰腺内胚层的分化。
据报道，从小鼠的胚胎细胞体外衍生出了带有胰岛细胞特征的细胞。 例如，Lumelsky等人(Science(科学)292：1389，2001)报道了小鼠胚胎干 细胞向类似于胰岛的胰岛素分泌结构的分化。Soria等人(Diabetes(糖尿 病)49：157，2000)报道，从小鼠胚胎干细胞衍生的胰岛素分泌细胞在植入 链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠时使血糖正常。
在一个实例中，Hori等人(PNAS(美国国家科学院院报)99：16105， 2002)公开了用磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂(LY294002)处理小鼠胚胎干细胞 产生了与β细胞相似的细胞。
在另一个实例中，Blyszczuk等人(PNAS(美国国家科学院院报) 100：998，2003)报道了从组成型表达Pax4的小鼠胚胎干细胞生成产生胰岛 素的细胞。
Micallef等人报道说，视黄酸可调节胚胎干细胞定向形成Pdx1阳性胰 腺内胚层。在对应于胚胎的原肠胚形成末的期间，加入胚胎干细胞分化第4 天的培养物中时视黄酸是诱导PDX1表达最有效的(Diabetes(糖尿病) 54：301，2005)。
Miyazaki等人报道了过表达Pdx1的小鼠胚胎干细胞系。他们的结果表 明，外源Pdx1表达明显增强了所得到的分化细胞中胰岛素、促生长素抑制 素、葡萄糖激酶、神经元素(neurogenin)3、p48、Pax6和HNF6的表达 (Diabetes(糖尿病)53：1030，2004)。
Skoudy等人报道说，活化素A(TGF-β超家族的成员)能上调小鼠胚 胎干细胞中的胰腺外分泌基因(p48和淀粉酶)和内分泌基因(Pdx1、胰岛 素和胰高血糖素)的表达。使用1nM活化素A时观察到了最大的效果。他 们还观察到胰岛素和Pdx1 mRNA的表达水平未受视黄酸影响；然而，3nM FGF7处理导致了Pdx1转录物的水平增加(Biochem.J.(生物化学月刊)379： 749，2004)。
Shiraki等人研究了能特征性增强胚胎干细胞分化成Pdx1阳性细胞的生 长因子的效果。他们观察到，TGF-β2可再现地产生更高比例的Pdx1阳性细 胞(GenesCells.2005Jun；10(6)：503-16.)。
Gordon等人阐明了在没有血清存在有激活素连同Wnt信号传导抑制剂 存在的情况下从小鼠胚胎干细胞诱导短尾蛋白(brachyury)[阳性]/HNF3β[阳 性]内胚层细胞(US2006/0003446A1)。
Gordon等人(PNAS(美国国家科学院院报)，Vol 103，第16806 页，2006)声称“Wnt和TGF-β/nodal/激活素信号转导同时为前原条的产 生所必需”。
然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型可能不会完全模拟高等哺乳动物 (例如人)中的发育程序。
Thomson等人从人胚泡分离了胚胎干细胞(Science(科学)282：114， 1998)。同时，Gearhart和其同事从胎儿生殖腺组织衍生了人胚胎生殖(hEG) 细胞系(Shamblott等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院 报)95：13726，1998)。与可简单通过与白血病抑制因子(LIF)一起培养来防 止分化的小鼠胚胎干细胞不一样，人胚胎干细胞必须维持在非常特殊的条件 下(美国专利No.6,200,806；WO 99/20741；WO 01/51616)。
D’Amour等人描述了在高浓度激活蛋白和低血清的存在下产生人胚胎 干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature Biotechnology (自然.生物技术) 2005)。将这些细胞移植到小鼠的肾囊下，导致分化成具有某些内胚层器官 的特性的更成熟细胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚 层细胞可进一步分化成Pdx1阳性细胞(US2005/0266554A1)。
D’Amour等人.(Nature Biotechnology(自然.生物技术)-24，1392- 1401(2006))声称：“我们研究出了一种分化方法，其可将人胚胎干(hES) 细胞转化成能够合成胰激素：胰岛素、胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多 肽和葛瑞林(ghrelin)的内分泌细胞。该方法通过引导细胞经过类似于定形内 胚层、肠管内胚层、胰腺内胚层和内分泌前体的阶段转变为表达内分泌激素 的细胞来模拟体内胰腺器官发生”。
在另一个例子中，Fisk等人报道了用于从人胚胎干细胞产生胰岛细胞 的系统(US2006/0040387A1)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。首先 用丁酸钠和活化素A的组合使人胚胎干细胞向内胚层分化。然后将细胞与 TGF-β拮抗剂(如成头蛋白(Noggin))结合EGF或β细胞素一起进行培养， 以产生Pdx1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
在一个实例中，Benvenistry等人声称：“我们得出结论：PDX1的过量 表达增强了胰腺富集基因的表达，诱导胰岛素表达可能需要仅在体内存在的 附加信号”(Benvenistry等人，Stem Cells(干细胞)2006；24：1923- 1930)。
在另一个实例中，Grapin-Botton等人声称：“Ngn3的早期活化近乎专 门地诱导胰高血糖素[阳性]细胞，同时耗尽胰祖细胞库。从E11.5开始， PDX-1祖细胞具备了分化成胰岛素[阳性]和PP[阳性]细胞的能力” (Johansson KA等人，Developmental Cell(细胞发育)12,457-465,2007 年3月)。
NGN3在表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞中的表达可降低细 胞进一步分化为胰岛素表达细胞的能力。以前的研究已表明，当经历进一步 分化时，表达NGN3的表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞更有可能 产生胰高血糖素表达细胞，而不是胰岛素表达细胞。然而，NGN3表达对于 形成胰腺内分泌细胞或胰腺内分泌前体细胞(可形成例如胰高血糖素表达细 胞或胰岛素表达细胞的细胞)是必须的。因此，对NGN3的时间调控对于引导胰腺内分泌前体细胞向胰岛素表达细胞分化的最终命运是重要的。
因此，仍然非常需要开发用于建立能扩增以满足当前临床需要，同时 又保持分化为胰岛素表达细胞的潜能的多能干细胞系的条件。本发明另辟途 径来改善使人胚胎干细胞分化成表达胰岛素的细胞的效率，其方法是在表达 胰内分泌谱系特征性标志物的细胞中增加NGN3和NKX6.1的表达。
总结
在一个实施例中，本发明提供了使表达胰内分泌谱系特征性标志物的 细胞群体中NGN3和NKX6.1的表达增加的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养多能干细胞，
b)使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细 胞，
c)使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内胚层谱 系特征性标志物的细胞，以选自H-9、H-89、GF109203X、HA- 1004、PP2、PP1、LY294002、渥曼青霉素、SB-203580、SB- 202190、酪氨酸磷酸化抑制剂25、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478、 酪氨酸磷酸化抑制剂46、GW5074、Kenpaullone、羟基-2-萘基甲 基膦酸(HNMPA)、AG490、Y27632和ML-7的化合物补充用来使 表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的培养基，以及
d)使表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内分泌谱系 特征性标志物的细胞。
在一个实施例中，用来使表达胰内胚层谱系特征性标记的细胞分化的 培养基补充有选自H-9、H-89、GF109203X、HA-1004、PP2、PP1、 LY294002、渥曼青霉素、SB-203580、SB-202190、酪氨酸磷酸化抑制剂 25、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478、酪氨酸磷酸化抑制剂46、GW5074、 Kenpaullone、HNMPA、AG490、Y27632和ML-7的化合物。
具体实施方式
为了以不受限制的方式清晰说明本公开，将本发明的具体实施方式分 成下列描述或阐明本发明某些特征、实施例或应用的小节。
定义
干细胞是由它们在单细胞水平上既自我更新又分化产生子代细胞的能 力来定义的未分化细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和末端分化细 胞。干细胞的特征还在于：其具有在体外由多种胚层(内胚层、中胚层和外 胚层)分化成各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多种胚层的组织和注 入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的话)组织形成的能力。
干细胞根据其发育潜能分类为：(1)全能性，意指能够产生全部胚胎细 胞和胚外细胞类型；(2)多能性，意指能够产生全部胚胎细胞类型；(3)多潜 能，意指能够产生细胞系的子类，但是均处于特定组织、器官或生理学系统 内部(例如，造血干细胞(HSC)可以产生子代，其包括(自我更新性)HSC、 血液细胞限制性寡能祖细胞和作为血液正常组分的全部细胞类型和要素(例 如，血小板)；(4)寡潜能，意指能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞 系的子类；和(5)单潜能，意指能够产生单一细胞系(例如，精子发生干细 胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞 (如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是 已经在细胞谱系中占据更特化的(“定向的”)位置的细胞。术语“定向的”当应用到分化的过程时，指在分化途径中已经进行到这么一种程度的细 胞：在正常环境下，它会继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，且在 正常环境下不能分化成另一细胞类型或回复到分化不足的细胞类型。去分化 指细胞回复到细胞的谱系当中特化(或定向)不足的地位的过程。本文所用 的“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么 细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特异性标志物 指与所关注谱系的细胞的表型明确相关的特征，可用来评估未定向细胞向所 关注谱系的分化。
如本文所用，“表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞”或“第1 阶段细胞”或“第1阶段”是指表达下列标志物中至少一种的细胞： SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、短尾蛋白、Mix 样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或OTX2。表达定形内胚层谱系特征性标 志物的细胞包括原条前体细胞、原条细胞、中内胚层细胞和定形内胚层细 胞。
如本文所用，“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”是指表达 下列标志物中至少一种的细胞：PDX1、HNF1β、PTF1α、HNF6、NKX6.1 或HB9。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞包括胰腺内胚层细胞、 原肠管细胞和后前肠细胞。
如本文所用，“定形内胚层”指具有在原肠胚形成过程中从上胚层产 生的细胞的特性并形成胃肠道及其衍生物的细胞。定形内胚层细胞表达下列 标志物：HNF3β、GATA4、SOX17、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、 CD99和MIXL1。
如本文所用，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分 子。关于这一点，差异表达意指阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水 平降低。标志物核酸或多肽的可检测水平，在所关注细胞中充分地高于或低 于在其他细胞中，使得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种将所关注 细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
如本文所用，“胰内分泌细胞”或“表达胰激素的细胞”是指能够表 达下列激素中至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞的表征
多能干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为 Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人， Science 282：1145，1998)。多能干细胞体外分化导致丧失SSEA-4、Tra 1-60 和Tra1-81的表达(如果存在的话)，并增加SSEA-1的表达。未分化的多 能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，该酶可通过用4％多聚甲醛固定细胞， 然后用Vector Red作为底物显影来检测，如生产商所描述(VectorLaboratories，Burlingame Calif)。未分化的多能干细胞通常也表达OCT4和 TERT，这可通过RT-PCR检测。
增殖的多能干细胞的另一期望表型是有潜能分化成所有三个胚层的细 胞：内胚层、中胚层和外胚层组织的细胞。多能干细胞的多能性可例如通过 这样来证实：将细胞注射进重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4％多聚甲 醛固定所形成的畸胎瘤，然后对它们进行组织学检验以确定是否存在来自三 个胚层的细胞类型。作为另外一种选择，可以通过产生胚状体并评估胚状体 中三个胚层相关的标志物的存在来确定多能性。
可以使用标准G带技术并与已公布的相应灵长类物种的核型相比较来 分析增殖的多能干细胞系的核型。希望获得具有“正常核型”的细胞，其意 指细胞为整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有明显的改变。
多能干细胞的来源
可使用的多能干细胞的类型包括从妊娠后形成的组织衍生而来的确立 多能细胞系，包括在妊娠期间任何时间取得的胚前组织(例如胚泡)、胚胎 组织或胎儿组织，所述时间通常是但不一定是在大约10-12周妊娠前。非限 制性例子是确立的人胚胎干细胞系或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞 系H1、H7和H9(WiCell)。也可设想的是，在此类细胞的初始建立或稳定 期间使用本公开的组合物，在此情况下，源细胞将是直接取自源组织的原代 多能细胞。另外合适的是取自己在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细 胞群体的细胞。同样合适的是突变型人胚胎干细胞系，例如BG01v (BresaGen，Athens，GA)。
在一个实施例中，人胚胎干细胞如Thomson等人所述制备(美国专利 No.5,843,780；Science(科学)282：1145，1998；Curr.Alzheimer Research(当 今阿尔茨海默氏症研究)1(3)：175-181(Steiner，Curr.Top.Dev.Biol.(当今 发育生物学论题))38：133 ff.，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(美国国家 科学院院报)92：7844，1995)。
多能干细胞的培养
在一个实施例中，通常在饲养细胞层上培养多能干细胞，饲养细胞可 以多种方式支持多能干细胞。作为另一种选择，在培养系统中培养多能干细 胞，所述培养系统基本上不含饲养细胞，但同样支持多能干细胞的增殖而不 会进行实质分化。使用通过此前培养另一细胞类型而调理过的培养基来支持 多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分化。作为另一种选择，用化 学成分确定的培养基来支持多能干细胞在无饲养细胞的培养物中生长而不分 化。
例如，Reubinoff等人(Nature Biotechnology(自然.生物技术)18：399- 404(2000))和Thompson等人(Science(科学)1998年11月6日：Vol. 282.no.5391，第1145-1147页)公开了使用小鼠胚成纤维细胞饲养细胞层 从人胚泡培养多能干细胞系。
Richards等人(Stem Cells(干细胞)21：546-556，2003)评价了一组11 种不同的成人、胎儿和新生儿饲养细胞层支持人多能干细胞培养物的能力。 Richards等人声称：“在成人皮肤成纤维细胞饲养细胞上培养的人胚胎干细 胞系可保持人胚胎干细胞形态并仍为多能性的”。
US20020072117公开了可产生支持灵长类多能干细胞在无饲养细胞的 培养物中生长的培养基的细胞系。所采用的细胞系是从胚胎组织获得或从胚 胎干细胞分化而来的间质细胞系和成纤维细胞样细胞系。US20020072117还 公开了所述细胞系作为原代饲养细胞层的用途。
在另一个实例中，Wang等人(Stem Cells(干细胞)23：1221-1227，2005) 公开了用于在源自人胚胎干细胞的饲养细胞层上长期培育人多能干细胞的方 法。
在另一个实例中，Stojkovic等人(Stem Cells(干细胞)200523：306- 314，2005)公开了一种源自人胚胎干细胞自发分化的饲养细胞系统。
在又一个实例中，Miyamoto等人(Stem Cells(干细胞)22：433-440， 2004)公开了从人胎盘获得的饲养细胞源。
Amit等人(Biol.Reprod(生殖生物学)68：2150-2156，2003)公开了源自 人包皮的饲养细胞层。
在另一个实例中，Inzunza等人(Stem Cells(干细胞)23：544-549， 2005)公开了来自人出生后包皮成纤维细胞的饲养细胞层。
US6642048公开了可支持灵长类多能干(pPS)细胞在无饲养细胞的培养 物中生长的培养基以及可用于产生这种培养基的细胞系。US6642048声称： “本发明包括从胚胎组织获得的或从胚胎干细胞分化的间质细胞系和成纤维 细胞样细胞系在本公开中描述并阐明了用于衍生这种细胞系、处理培养基以 及用该调理培养基培养干细胞的方法”。
又如，WO2005014799公开了用于哺乳动物细胞维持、增殖和分化的 条件培养基。WO2005014799声称：“根据本发明产生的培养基被鼠细胞 的、尤其是那些名为MMH(Met鼠肝细胞)的分化和永生化转基因肝细胞 的细胞分泌活性条件化”。
在另一个实例中，Xu等人(Stem Cells(干细胞)22：972-980，2004) 公开了一种从人胚胎干细胞衍生物获得的条件培养基，所述人胚胎干细胞衍 生物已被遗传修饰而过表达人端粒酶逆转录酶。
又如，US20070010011公开了一种用于维持多能干细胞的化学成分确 定的培养基。
一种备选的培养系统采用补充有能促进胚胎干细胞增殖的生长因子的 无血清培养基。例如，Cheon等人(BioReprod(生殖生物学) DOI：10.1095/biolreprod.105.046870，2005年10月19日)公开了一种无饲养 细胞的无血清培养系统，其中胚胎干细胞维持在补充有能引发胚胎干细胞自 我更新的不同生长因子的未经调理的血清替代(SR)培养基中。
在另一个实例中，Levenstein等人(Stem Cells(干细胞)24：568-574， 2006)公开了使用补充有bFGF的培养基，在不存在成纤维细胞或条件培养 基的情况下长期培养人胚胎干细胞的方法。
在另一个实例中，US20050148070公开了一种在无血清和无成纤维饲 养细胞的确定成分培养基中培养人胚胎干细胞的方法，所述方法包括：在含 有白蛋白、氨基酸、维生素、矿物质、至少一种转铁蛋白或转铁蛋白替代 物、至少一种胰岛素或胰岛素替代物的培养基中培养干细胞，该培养基基本 上不含哺乳动物胎血清，并且含有至少约100ng/ml能够激活成纤维细胞生 长因子信号传导受体的成纤维细胞生长因子，其中提供该生长因子的来源不 只是成纤维细胞饲养层，此培养基支持干细胞在无饲养细胞或条件培养基的 情况下以未分化状态增殖。
又如，US20050233446公开了一种可用于培养干细胞的成分确定的培 养基，所述干细胞包括未分化的灵长类原始干细胞。在溶液中，此培养基与 培养中的干细胞相比基本上是等渗的。在给定的培养物中，特定的培养基包 含基础培养基和各为一定量的bFGF、胰岛素和抗坏血酸，所述一定量的 bFGF、胰岛素和抗坏血酸为支持原始干细胞进行实质上非分化性生长所必 需的。
又如，US6800480声称：“在一个实施例中，提供了用于以基本上未 分化状态培养灵长类来源的原始干细胞的细胞培养基，其包括低渗透压、低 内毒素基础培养基，此培养基对于支持灵长类来源的原始干细胞的生长是有 效的。该基础培养基混合了有效支持灵长类来源的原始干细胞生长的营养血 清和选自饲养细胞和衍生自饲养细胞的胞外基质组分的基质。该培养基还包 含非必需氨基酸、抗氧化剂和选自核苷和丙酮酸盐的第一生长因子”。
在另一个实例中，US20050244962声称：“在一个方面，本发明提供 培养灵长类胚胎干细胞的方法”。在基本上不含哺乳动物胎血清(优选也基 本上不含任何动物血清)的培养物中，并在存在由不只是成纤维细胞饲养层 的来源提供的成纤维细胞生长因子情况下培养干细胞。在优选的形式中，通 过添加足量的成纤维细胞生长因子，使得之前为维持干细胞培养物所需的成 纤维细胞饲养层变为非必需的”。
在又一个实例中，WO2005065354公开了一种基本上不含饲养细胞和 血清的确定成分的等渗培养基，其包含：a.基础培养基；b.一定量的bFGF， 其足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长；c.一定量的胰岛素，其 足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长；和d.一定量的抗坏血酸， 其足以支持基本上未分化的哺乳动物干细胞的生长。
又如，WO2005086845公开了一种维持未分化的干细胞的方法，所述 方法包括使干细胞暴露于转化生长因子-β(TGF-β)蛋白家族的成员、成纤维 细胞生长因子(FGF)蛋白家族的成员或烟酰胺(NIC)，所述成员或烟酰胺的量 足以维持细胞处于未分化状态达足以实现所需结果的一段时间。
可将多能干细胞接种至合适的培养基质上。在一个实施例中，合适的 培养基质是胞外基质成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏着分子受 体-配体偶联物的一部分的成分。在一个实施例中，合适的培养基材是 (Becton Dickenson)。是来自Engelbreth-Holm Swarm肿瘤细胞的可溶性制剂，其在室温下胶凝而形成重构的基底膜。
其他的细胞外基质组分和组分混合物适合作为替代物。取决于所扩增 的细胞类型，这可包括单独的层粘连蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、 硫酸乙酰肝素等或者它们的各种组合。
可在存在可促进细胞存活、增殖和保持理想特性的培养基存在的情况 下，以合适的分布将多能干细胞接种于所述基质上。所有这些特性可得益于 对接种分布的认真考虑并可容易地由本领域技术人员确定。
合适的培养基可由下列组分制成，例如达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)，Gibco货号11965-092；敲除 达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Knockout Dulbecco′s modified Eagle′s medium， KO DMEM)，Gibco货号10829-018；Ham′s F12/50％DMEM基础培养基； 200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco 11140- 050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)，Gibco#13256-029。
形成NGN3和NKX6.1表达增加的表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体
在一个实施例中，本发明提供了使表达胰内分泌谱系特征性标志物的 细胞群体中NGN3和NKX6.1的表达增加的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养多能干细胞，
b)使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细 胞，
c)使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内胚层谱 系特征性标志物的细胞，以选自H-9、H-89、GF109203X、HA- 1004、PP2、PP1、LY294002、渥曼青霉素、SB-203580、SB- 202190、酪氨酸磷酸化抑制剂25、酪氨酸磷酸化抑制剂、 AG1478、酪氨酸磷酸化抑制剂46、GW5074、Kenpaullone、 HNMPA、AG490、Y27632和ML-7的化合物补充用来使表达定形 内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的培养基，和
d)使表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内分泌谱系 特征性标志物的细胞。
多能干细胞向表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的分化
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞的形成可通过在进行特定方 案之前或之后检测该标志物的存在来确定。多能干细胞通常不表达这类标志 物。因而，当细胞开始表达它们时即检测到多能细胞的分化。
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使多能干细 胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541 (2005)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标 志物的细胞。
例如，可根据Shinozaki等人，Development 131，1651-1662(2004)中公 开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细 胞。
例如，可根据McLean等人，Stem Cells 25，29-38(2007)中公开的方 法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，可根据D’Amour等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公开的方法，使多能干细胞可分化成表达定形内胚层谱系特征性标 志物的细胞。
例如，可通过将多能干细胞在含有活化素A的培养基中在不存在血清 的情况下培养，然后将所述细胞与活化素A和血清一起培养，再然后将所 述细胞与活化素A和另一浓度的血清一起培养，使多能干细胞分化成表达 定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。此方法的一个例子在Nature Biotechnology 23，1534-1541(2005)中进行了公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有活化素A的培养基中在不存在血清 的情况下培养，然后将所述细胞与活化素A和另一浓度的血清一起培养， 使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。这个方法的 一个例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2005中公开。
例如，可通过将多能干细胞在含有活化素A和Wnt配体的培养基中在 不存在血清的情况下培养，然后移除Wnt配体并将所述细胞与活化素A和 血清一起培养，使多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细 胞。此方法的一个例子在NatureBiotechnology 24，1392-1401(2006)中进行 了公开。
例如，根据No.11/736,908中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多 能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据No.11/779,311中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多 能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据No.60/990,529中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多 能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据No.61/076,889中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多 能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据No.61/076,900中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多 能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据No.61/076,908中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多 能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据No.61/076,915中公开的方法，通过处理多能干细胞来使多 能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。
表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞向表达胰腺内胚层谱系特征 性标志物
的细胞的分化
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使表达定形 内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的 细胞。
例如，可以根据D’Amour等人，Nature Biotechnol.(自然.生物技术) 24：1392-1401，2006中公开的方法，使表达定形内胚层谱系特征性标志物的 细胞分化成表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞。
可通过用成纤维细胞生长因子和刺猬蛋白信号传导途径抑制剂KAAD- 环巴胺处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，然后移除含有成纤维 细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基，并随后将所述细胞在含有视黄 酸、成纤维细胞生长因子和KAAD-环巴胺的培养基中进行培养，来使表达 定形内胚层谱系特征性标志物的细胞被进一步分化成表达胰腺内胚层谱系特 征性标志物的细胞。此方法的一个例子在Nature Biotechnology24，1392- 1401(2006)中进行了公开。
在本发明的一个方面，根据转让给美国理康公司(LifeScan，Inc.)的美 国专利申请系列号11/736,908中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤 维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来 使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞被进一步分化成表达胰腺内胚层 谱系特征性标志物的细胞.
在本发明的一个方面，根据转让给美国理康公司(LifeScan，Inc.)的美 国专利申请系列号11/779,311中公开的方法，通过用视黄酸和至少一种成纤 维细胞生长因子处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞一段时间，来 使表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞被进一步分化成表达胰腺内胚层 谱系特征性标志物的细胞。
在本发明的一个方面，根据序列号为No.60/990,529中公开的方法，通 过处理多能干细胞来使多能干细胞分化为表达定形内胚层谱系特征性标志物 的细胞。
可通过将处理过的细胞群体暴露于可特异性识别由表达定形内胚层谱 系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志物的试剂(如抗体)来确定分化效 率。
用于评估蛋白质标志物和核酸标志物在培养的或分离的细胞中的表达 的方法是本领域的标准方法。这些包括定量反转录聚合酶链式反应(RT- PCR)、Northern印迹、原位杂交(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，编辑，2001增补))以及免疫测定，例 如切片材料的免疫组织化学分析、西方墨点法和例如对于在完整细胞中可接 近的标志物的流式细胞术分析(FACS)(参见，例如，Harlow和Lane，UsingAntibodies：A Laboratory Manual(抗体实验室手册)，New York：Cold Spring HarborLaboratory Press(1998))。
多能干细胞的特征是本领域技术人员熟知的，并且其他特征有待继续 辨别。多能干细胞标志物包括(例如)一种或多种下列标志物的表达： ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、 SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60、Tra 1-81。
在用本发明方法处理多能干细胞后，可通过使处理过的细胞群体暴露 于特异性识别由表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞表达的蛋白质标志 物(如CXCR4)来纯化分化的细胞。
适用于本发明的多能干细胞包括(例如)人胚胎干细胞系H9(NIH代 码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系 H7(NIH代码：WA07)以及人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，Sweden)。表 达下列多能细胞特征性标志物中至少一种的细胞也适用于本发明： ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、 SOX2、Nanog、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60和Tra 1-81。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、 CER1、NODAL、FGF8、短尾蛋白、Mix样同源盒蛋白、FGF4CD48、脱中 胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和 OTX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层系特征性标志物的细胞为原条前 体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层 细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是定形内胚层 细胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、HNF1β、PTF1α、HNF6、 HB9和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标 志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层系特征性标志物的细胞 为胰腺内胚层细胞。
在一个实施例中，表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞被进一步分 化成表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞。本发明提供了使表达胰内分泌 谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6.1的表达增加的方法。
使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6.1的 表达增加可以通过用化合物处理表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞而 实现，所述化合物选自H-9、H-89、GF109203X、HA-1004、PP2、PP1、 LY294002、渥曼青霉素、SB-203580、SB-202190、酪氨酸磷酸化抑制剂 25、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478、酪氨酸磷酸化抑制剂46、GW5074、Kenpaullone、HNMPA、AG490、Y27632和ML-7。作为另外一种选择，使 表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6.1的表达增加 可以通过用化合物处理表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞而实现，所述 化合物选自H-9、H-89、GF109203X、HA-1004、PP2、PP1、LY294002、 渥曼青霉素、SB-203580、SB-202190、酪氨酸磷酸化抑制剂25、酪氨酸磷 酸化抑制剂AG1478、酪氨酸磷酸化抑制剂46、GW5074、Kenpaullone、 HNMPA、AG490、Y27632和ML-7。
在表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞用选自X、Y和Z的化合 物处理的情况下，细胞通过以下方式处理：以选自H-9、H-89、 GF109203X、HA-1004、PP2、PP1、LY294002、渥曼青霉素、SB-203580、 SB-202190、酪氨酸磷酸化抑制剂25、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478、酪氨 酸磷酸化抑制剂46、GW5074、Kenpaullone、HNMPA、AG490、Y27632和 ML-7的化合物补充用来使所述细胞分化成表达胰内胚层谱系特征性标志物 的细胞的培养基。
在表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞用选自X、Y和z的化合物 处理的情况下，细胞通过以下方式处理：以选自H-9、H-89、GF109203X、 HA-1004、PP2、PP1、LY294002、渥曼青霉素、SB-203580、SB-202190、 酪氨酸磷酸化抑制剂25、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478、酪氨酸磷酸化抑制 剂46、GW5074、Kenpaullone、HNMPA、AG490、Y27632和ML-7的化合 物补充用来使所述细胞分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞的培养 基。
表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成NGN3和NKX6.1表达增加的表达胰
内分泌谱系特征性标志物的细胞
可通过本领域的任何方法或通过本发明提出的任何方法，使表达胰腺 内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的 细胞。
例如，可通过将根据本发明的方法得到的表达胰腺内胚层谱系特征性 标志物的细胞在含有毒蜥外泌肽-4的培养基中进行培养，然后除去含有毒 蜥外泌肽-4的培养基，并随后将所述细胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-1和 HGF的培养基中进行培养，来使表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞 被进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例 子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，通过在含有DAPT(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，MO) 和毒蜥外泌肽4的培养基中培养表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，根 据本发明方法获得的表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞被进一步分化成 表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个例子在D’Amour等 人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，通在含有毒蜥外泌肽4的培养基中培养表达胰内胚层谱系特征 性标志物的细胞，根据本发明方法获得的表达胰内胚层谱系特征性标志物的 细胞被进一步分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞。该方法的一个 例子在D’Amour等人，NatureBiotechnology，2006中公开。
例如，根据转让给美国理康公司(LifeScan，Inc.)的美国专利申请Ser. No.11/736,908中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导通路的因子处理 表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，根据本发明的方法得到的表达胰内 胚层谱系特征性标志物的细胞被进一步分化成表达胰内分泌谱系特征性标志 物的细胞。
例如，根据转让给美国理康公司(LifeScan，Inc.)的美国专利申请Ser. No.11/779,311中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导通路的因子处理 表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，根据本发明的方法得到的表达胰内 胚层谱系特征性标志物的细胞被进一步分化成表达胰内分泌谱系特征性标志 物的细胞。
例如，根据转让给美国理康公司(LifeScan，Inc.)的美国专利申请Ser. No.60/953,178中公开的方法，通过用抑制Notch信号转导通路的因子处理 表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞，来使表达胰腺内胚层谱系特征性 标志物的细胞被进一步分化成表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。
例如，根据转让给美国理康公司(LifeScan，Inc.)的美国专利申请Ser. No.60/990,529中公开的方法，通过用抑制Notch信号传导通路的因子处理 表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，根据本发明的方法得到的表达胰内 胚层谱系特征性标志物的细胞被进一步分化成表达胰内分泌谱系特征性标志 物的细胞。
胰腺内分泌谱系特征性标志物选自NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、 NKX6.1、PAX4和PTF-1α。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达至 少一种以下激素：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明 的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方 面，表达胰内分泌系特征性标志物的细胞为胰内分泌细胞。胰内分泌细胞可 为表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰内分泌细胞可为分泌胰激素的细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志 物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达PDX1以及下列转录因 子中的至少一种：NGN3、NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、SL1、HNF3β、 MAFA、PAX4和PAX6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标 志物的细胞是b细胞。
本发明提供了使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3 和NKX6.1的表达增加的方法。
在一个实施例中，使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中 NGN3和NKX6.1的表达增加可以通过用化合物处理表达胰内胚层谱系特征 性标志物的细胞而实现，所述化合物选自H-9、H-89、GF109203X、HA- 1004、PP2、PP1、LY294002、渥曼青霉素、SB-203580、SB-202190、酪氨酸磷酸化抑制剂25、酪氨酸磷酸化抑制剂、AG1478、酪氨酸磷酸化抑制剂 46、GW5074、Kenpaullone、HNMPA、AG490、Y27632和ML-7。
在表达胰内胚层谱系特征性的标志物的细胞用选自H-9、H-89、 GF109203X、HA-1004、PP2、PP1、LY294002、渥曼青霉素、SB-203580、 SB-202190、酪氨酸磷酸化抑制剂25、酪氨酸磷酸化抑制剂、AG1478、酪 氨酸磷酸化抑制剂46、GW5074、Kenpaullone、HNMPA、AG490、Y27632 和ML-7化合物处理的情况下，细胞通过以下方式处理：以选自H-9、H- 89、GF109203X、HA-1004、PP2、PP1、LY294002、渥曼青霉素、SB- 203580、SB-202190、酪氨酸磷酸化抑制剂25、酪氨酸磷酸化抑制剂、 AG1478、酪氨酸磷酸化抑制剂46、GW5074、Kenpaullone、HNMPA、 AG490、Y27632和ML-7的化合物补充用来使所述细胞分化成表达胰内分 泌谱系特征性标志物的细胞的培养基。
本发明通过(但不限于)以下实例进一步说明。
实例
实例1
筛选介导NGN3表达的小分子类似物
在祖细胞向内分泌细胞发展的过程中需要转录因子NGN3的表达。理 想的结果是增强该过程的效率。小分子化合物的筛选基于以下假定进行：酶 抑制剂可以调节分化期间传输的细胞信号并且对关键转录因子(如NGN3) 的基因表达具有直接或间接影响。
测定用细胞的制备：人胚胎干细胞的贮存培养物(H1人胚胎干细胞 系)以未分化的多能状态在MEF条件培养基中在减少的生长因子 MATRIGEL(美国BD公司生物科学事业部(BD Biosciences)；目录号 356231)包被的平皿上维持，平均每四日传代。传代以如下方式进行：使细 胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶溶液(英杰生命技术公司(Invitrogen)，目录号：17105-041)5至7分钟，随后用MEF条件培养基 淋洗单层，并且轻柔地刮取来回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉 淀并除去残余的分散酶。细胞簇以1∶3或1∶4比率拆分用于常规维持培养。 将所有的人胚胎干细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评价核型是 否正常和支原体是否存在。为以最小化分析模式筛选，H1人胚胎干细胞簇 从用分散酶如所述那样处理的培养物中收获并且使用100ml/孔的体积，以 比率1∶2(表面积)在减少的生长因子MATRIGEL(美国BD公司生物科学 事业部(BDBiosciences)；目录号356231)包被的96孔黑色平板 (Packard ViewPlates；珀金埃尔默仪器公司(PerkinElmer)；目录号 6005182)上均匀分散铺展。允许细胞贴壁并随后经1至3日时间恢复对数 生长期，每日用补充有8ng/mL bFGF(R&D Systems；目录号233-FB)的 MEF条件培养基进行饲养。在整个分析期间，平板在37℃、5％CO2下保持 在加湿箱中。
化合物的制备：使用两个商用的小分子激酶抑制剂库(美国BioMol国 际库(BioMol Intl)；目录号2832A(V2.2)和EMD Biosciences：目录号 539745)实施筛选。表1和表2分别描述BioMol和EMD这两个激酶抑制 剂库中的化合物来自这两个库的化合物可作为96孔平板模式、在 100％DMSO中增溶并贮存在-80℃下的10mM母液获得。将库化合物在100％DMSO(Sigma；目录号D2650)中进一步稀释至中间浓度2.5mM，同 样贮存在-80℃下直至使用。在分析当日，化合物按1∶12.5稀释至高葡萄糖 DMEM培养基中，产生在8％DMSO中的200uM工作母液并且随后进一步 按1∶80稀释至每个分析试验孔中至终浓度2.5mM化合物和0.1％DMSO。
分化和筛选分析法：用三天进行该分化方案的步骤1，每日通过从每个 孔抽吸培养基并用新鲜等分试样替换(100ml)进行饲养。在分析的第一日， 各孔使用RPMI-1640培养基(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号： 22400)饲养，所述培养基含有2％牛白蛋白第V部分、游离脂肪酸(FAF BSA)(美国Proliant公司(Proliant Inc.)；目录号：SKU68700)、 100ng/mL激活素A(派普泰克公司(PeproTech)；目录号120-14)、 20ng/ml Wnt3a(安迪生物公司(R&D Systems)；目录号1324-WN/CF)和 8ng/ml bFGF(安迪生物公司(R&DSystems)；目录号233-FB)。在分析 的第二和第三日，各孔用相同的培养基饲养，只是Wnt3a被移除。全部孔 均按相同方式饲养和处理。
用两天进行该分化方案的步骤2。通过从每个孔抽吸培养基并替换成 DMEM:F12培养基(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号11330-032) 的新鲜等分试样(100ml)进行细胞的每日饲养，所述培养基含有2％FAF BSA、50ng/ml FGF7(派普泰克公司(PeproTech)；目录号100-19)和 250nM KAAD-环丙胺(美国Calbiochem公司(Calbiochem)；目录号239804)。全部孔均按相同方式饲养和处理。
用四天进行该分化方案的步骤3。通过以下方式隔日饲养细胞：从每个 孔抽吸培养基并替换成高葡萄糖DMEM(英杰生命技术公司 (Invitrogen)；目录号10569)的新鲜等分试样(200ul)，所述高葡萄糖 DMEM补充有0.1％Albumax(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号： 11020-021)、0.5x胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS-X；英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号51500056)、50ng/ml FGF7、100ng/ml成头蛋白 (R&D Systems；目录号3344-NG)、250nM KAAD-环丙胺、2mM全反式 视黄酸(RA)(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；目录号R2625)和 30ng/ml激活素A。在步骤3期间，将激酶抑制剂的试样添加至两块独立平 板(平板A和B)中的单孔内；留存第三块平板(平板C)不做处理。在每 块平板中，总计16个对照孔用等量0.1％DMSO而不用任何试验化合物处 理。
用三天进行该分化方案的步骤4。通过以下方式在第1和第2日饲养细 胞，不在第3日饲养饲养：从每个孔抽吸培养基并用高葡萄糖DMEM的新 鲜等分试样(200ul)替换，所述高葡萄糖DMEM补充有0.1％Albumax、0.5x 胰岛素-转铁蛋白-硒、100ng/ml成头蛋白和1mMAlk 5抑制剂(Axxora公 司；目录号ALX-270-445)。在步骤4期间，将激酶抑制剂的试样添加至两 块独立平板(平板B和C)中的单孔内；留存第三块平板(平板A)不做处 理。在每块平板中，总计16个对照孔用等量0.1％DMSO而不用任何试验化 合物处理。
高含量分析：在步骤4结束时，将培养基从全部分析平板吸出，随后 用4％多聚甲醛(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；目录号158127) 在室温下固定20分钟，所述多聚甲醛稀释于不含二价阳离子的PBS(英杰 生命技术公司(Invitrogen)；目录号14190)中，随后用PBS洗涤一次。样 品孔用0.5％Triton X-100(美国VWR公司(VWR)；目录号VW3929-2)在室温下透化20分钟，用PBS洗涤两次并且用PBS中的5％驴血清(美国 JacksonImmunoResearch公司(Jackson ImmunoResearch)；目录号017-000- 121)在室温下封闭30分钟。第一抗体(羊抗NGN3；迪生物公司(R&D Systems)；AF3444)按1∶300在5％驴血清中稀释并且添加至每个孔在室温 下保持1小时。在PBS中洗涤两次后，将Alexa Fluor 647驴抗羊第二抗体 (英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号A21448)按1∶100稀释并且添 加至每个样品孔在室温下保持30分钟，随后在PBS中两次洗涤。为复染细 胞核，添加4mg/mlHoechst 33342(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录 号H3570)在室温下保持10分钟。平板用PBS洗涤1次并且按100ml/孔留 存PBS用于成像。
用IN Cell Analyzer 1000(GE医疗集团生命科学部(GE Healthcare))进 行成像，对于以Hoechst 33342和Alexa Flour 647染色的细胞采用51008bs 二向分色镜。曝光时间优化自只用第二抗体染色的阳性对照孔。每孔从15 个视场获取图像，以补偿生物测定和后续染色程序中的任何细胞损失。用 IN Cell Developer Toolbox 1.7(GE医疗集团生命科学部(GE Healthcare))软 件从每个孔获得总细胞数和总NGN3强度的测量值。基于灰阶水平(基线 范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。总NGN3蛋白表达记录为 总强度或累积强度，该强度定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围 在200至3500之间的接受标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳 性对照的平均总强度，将总强度数据进行归一化。
表3中示出来自两个激酶抑制剂库的组合的筛选结果，所述激酶抑制 剂库用来在这个单一实验中处理六块分析平板。示出的数据是相对于仅含有 DMSO溶媒的孔中染色而言，各个化合物处理孔的NGN3染色强度的代表 性比率。示出了在单独阶段3或单独阶段4或联合阶段3和4期间给予的各 个化合物的强度比以及排序比较。将相对于溶媒处理的对照具有＞1.4比率 强度的化合物标记为命中以进行证实和额外评价。特别关注的是，如表4中所汇总，这些化合物似乎靶向若干可参与内分泌分化期间NGN3最佳表达 模式的细胞信号传导途径。
实例2
筛选介导NKX6.1和NGN3表达的小分子类似物
在祖细胞向内分泌细胞发展的过程中需要NKX6.1及NGN3的表达。 实施激酶抑制剂筛选以确定任何一种激酶抑制剂是否可能在分化期间上调一 种或两种标记的表达。在本实例中，分化方案中还包含HDAC抑制剂曲古 抑菌素A以调节染色质重建和可能地增强基因转录。
测定用细胞的制备：人胚胎干细胞的贮存培养物(H1人胚胎干细胞 系)以未分化的多能状态在MEF条件培养基中在减少的生长因子 MATRIGEL(美国BD公司生物科学事业部(BD Biosciences)；目录号 356231)包被的平皿上维持，平均每四日传代。传代以如下方式进行：使细 胞培养物在37℃暴露于1mg/ml分散酶溶液(英杰生命技术公司 (Invitrogen)，目录号：17105-041)5至7分钟，随后用MEF条件培养基 淋洗单层，并且轻柔地刮取来回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉 淀并除去残余的分散酶。细胞簇以1∶3或1∶4比率拆分用于常规维持培养。 将所有的人胚胎干细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评价核型是 否正常和支原体是否存在。为以最小化分析模式筛选，H1人胚胎干细胞簇 从用分散酶如所述那样处理的培养物中收获并且使用100ml/孔的体积，以 比率1∶2(表面积)在减少的生长因子MATRIGEL(美国BD公司生物科学 事业部(BD Biosciences)；目录号356231)包被的96孔黑色平板 (Packard ViewPlates；珀金埃尔默仪器公司(PerkinElmer)；目录号6005182)上均匀分散铺展。允许细胞贴壁并随后经1至3日时间恢复对数 生长期，每日用补充有8ng/mL bFGF(安迪生物公司(R&D Systems)；目 录号233-FB)的MEF条件培养基进行饲养。在整个分析期间，将平板在加 湿箱中在37℃、5％CO2下维持。
化合物的制备：使用如表1所定义的小分子激酶抑制剂单一商用库 (美国BioMol国际库(BioMol Intl)；目录号2832A(V2.2))实施筛选。该 库供应的化合物为96孔平板模式、在100％DMSO中增溶并贮存在-80℃下 的10mM母液。库化合物在100％DMSO(Sigma；目录号D2650)中进一步 稀释至中间浓度2.5mM，同样贮存在-80℃下直至使用。在分析当日，化合 物按1∶12.5稀释至高葡萄糖DMEM培养基中，产生在8％DMSO中的 200uM工作母液并且随后进一步按1∶80稀释至每个分析试验孔中至终浓度 2.5μM化合物和0.1％DMSO。
分化和筛选分析法：用三天进行该分化方案的步骤1，每日通过从每个 孔抽吸培养基并替换成新鲜等分试样(100μl)进行饲养。在分析的第一日，各 孔使用RPMI-1640培养基(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号： 22400)饲养，所述培养基含有2％牛白蛋白第V部分、游离脂肪酸(FAF BSA)(美国Proliant公司(Proliant Inc.)；目录号：SKU68700)、 100ng/mL激活素A(派普泰克公司(PeproTech)；目录号120-14)、 20ng/ml Wnt3a(安迪生物公司(R&D Systems)；目录号1324-WN/CF)和 8ng/ml bFGF(安迪生物公司(R&DSystems)；目录号233-FB)。在分析 的第二和第三日，各孔用相同的培养基饲养，只是Wnt3a被移除。全部孔 均按相同方式饲养和处理。
用两天进行该分化方案的步骤2。细胞从每个孔抽出培养基并替换成 DMEM:F12培养基(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号11330-032) 的新鲜等分试样(100ml)，所述培养基含有2％FAF BSA、50ng/mL FGF7(派 普泰克公司(PeproTech)；目录号100-19)和250nM KAAD-环丙胺(美国 Calbiochem公司(Calbiochem)；目录号239804)。全部孔均按相同方式饲 养和处理。
用五天进行该分化方案的步骤3。通过以下方式隔日饲养细胞：从每个 孔抽吸培养基并替换成高葡萄糖DMEM(英杰生命技术公司 (Invitrogen)；目录号10569)的新鲜等分试样(200μl)，所述高葡萄糖 DMEM补充有0.1％Albumax(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号： 11020-021)、0.5x胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS-X；英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号51500056)、50ng/ml FGF7、100ng/ml成头蛋白 (安迪生物公司(R&DSystems)；目录号3344-NG)、250nM KAAD-环丙 胺、2μM全反式视黄酸(RA)(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；目录 号R2625)、30ng/ml激活素A、和100nM曲古抑菌素A(TsA；美国SIGMA公司(Sigma)；目录号T8552)。在步骤3期间，激酶抑制剂的试 验样本在第2和第4日添加至单孔。在每块平板中，总计16个对照孔用等 量0.1％DMSO而不用任何试验化合物处理。
用三天进行该分化方案的步骤4。通过以下方式每日饲养细胞：从各孔 抽吸培养基并替换成高葡萄糖DMEM的新鲜等分试样(200μl)，所述高葡萄 糖DMEM补充有0.1％Albumax、0.5x胰岛素-转铁蛋白-硒、100ng/ml成头 蛋白和1μM Alk 5抑制剂(Axxora公司；目录号ALX-270-445)和1ug/ml DAPT(Sigma；目录号D5942)。在步骤4期间，在第一日将激酶抑制剂的 试验样本连同100nM曲古抑菌素A添加至单孔。随后在饲养期间在第2和 第3日缺省激酶抑制剂和TsA这二者的试验样本。在每块平板中，总计16 个对照孔用等量0.1％DMSO而不用任何试验化合物处理。
高含量分析：在步骤4结束时，将培养基从全部孔吸出，随后用4％多 聚甲醛(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；目录号158127)在室温 下固定20分钟，所述多聚甲醛稀释于不含二价阳离子的PBS(英杰生命技 术公司(Invitrogen)；目录号14190)中，随后用PBS洗涤一次。样品孔用 0.5％Triton X-100(美国VWR公司(VWR)；目录号VW3929-2)在室温下透化20分钟，用PBS洗涤两次并且用PBS中的5％驴血清(美国Jackson ImmunoResearch公司(Jackson ImmunoResearch)；目录号017-000-121)在 室温下封闭30分钟。第一抗体(羊抗NGN3；安迪生物公司(R&D Systems)；AF3444或小鼠抗NKX6.1；爱荷华大学(Universityof Iowa)； 目录号F55A12)(对于抗NGN3，1∶300；对于抗NKX6.1，1∶500)在5％ 驴血清中稀释并且添加至每个孔在室温下保持1小时在PBS中洗涤两次 后，将Alexa Fluor 647驴抗羊第二抗体(英杰生命技术公司(Invitrogen)； 目录号A21448)和Alexa Fluor 488驴抗小鼠第二抗体(英杰生命技术公司 (Invitrogen)；目录号A21202)1∶100稀释(均为第二抗体)并且添加至每个 样品孔在室温下保持30分钟，随后是在PBS中两次洗涤。为复染细胞核， 添加4mg/ml Hoechst 33342(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号 H3570)在室温下保持10分钟。平板用PBS洗涤1次并且按100ml/孔留存 PBS用于成像。
使用IN Cell Analyzer 1000(GE医疗集团生命科学部(GE Healthcare)) 进行成像，对于以Hoechst 33342和Alexa Fluor 488以及Alexa Fluor 647染 色的细胞使用51008bs二向分色镜。曝光时间优化自只用各第二抗体染色的 阳性对照孔。每孔从15个视场获取图像，以补偿生物测定和后续染色程序 中的任何细胞损失。用IN Cell DeveloperToolbox 1.7(GE医疗集团生命科学 部(GE Healthcare))软件从每个孔获得总细胞数和总NGN3或NKX6.1强 度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。将总NGN3蛋白表达报告为总强度或累积强度，该强度定义为细 胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受标准来去 除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总强度数据 进行归一化。
表5、表6和表7中汇总了得自该筛选的结果。表5中的数据示出了对 于仅含有DMSO溶媒的孔中的平均染色而言，用单个化合物处理过的各孔 的NGN3和NKX6.1染色的代表性比率。此外，还示出了各种化合物对于 NGN3或NKX6.1的蛋白质表达的影响的排序。表6列出对NGN3和/或 NKX6.1表达具有正影响的前16个命中的排序。表7总结了与这些最高命中 相对应的靶和信号转导途径。具有得自该筛选的多个命中的途径似乎对影响 这两个转录因子表达具有最大有效性，所述转录因子对内分泌命运决定是关 键的。
实例3
证实介导NGN3和NKX6.1表达的小分子类似物
在祖细胞向内分泌细胞发展的过程中需要NKX6.1及NGN3的表达。 重复激酶抑制剂的筛选以确定任何小分子化合物是否可在分化期间上调一种 或两种标记物的表达。在本实例中，分化方案中还包含HDAC抑制剂曲古 抑菌素A以调节染色质重建并可能地增强基因转录。
测定用细胞的制备：人胚胎干细胞的贮存培养物(H1人胚胎干细胞 系)以未分化的多能状态在MEF条件培养基中在减少的生长因子 MATRIGEL(美国BD公司生物科学事业部(BD Biosciences)；目录号 356231)包被的平皿上维持，平均每四日传代。传代以如下方式进行：使细 胞培养物在37℃下暴露于1mg/ml分散酶溶液(英杰生命技术公司(Invitrogen)，目录号：17105-041)5至7分钟，随后用MEF条件培养基 淋洗单层，并且轻柔地刮取来回收细胞簇。将细胞簇低速离心以收集细胞沉 淀并除去残余的分散酶。细胞簇以1∶3或1∶4比率拆分用于常规维持培养。 将所有的人胚胎干细胞系以小于50的传代数进行维持，并例行评价核型是 否正常和支原体是否存在。为以最小化分析模式筛选，H1人胚胎干细胞簇 从用分散酶如所述那样处理的培养物中收获并且使用100μl/孔的体积，以比 率1∶2(表面积)在减少的生长因子MATRIGEL(美国BD公司生物科学事 业部(BDBiosciences)；目录号356231)包被的96孔黑色平板(Packard ViewPlates；珀金埃尔默仪器公司(PerkinElmer)；目录号6005182)上均 匀分散铺展。允许细胞贴附并随后经1至3日时间恢复对数生长期，每日用 补充有8ng/ml bFGF(R&D Systems；目录号233-FB)的MEF条件培养基进 行培养。在整个分析期间，将平板在加湿箱中在37℃、5％CO2下维持。
化合物的制备：使用如表1所定义的小分子激酶抑制剂单一商用库 (美国BioMol国际库(BioMol Intl)；目录号2832A(V2.2))执行证实筛 选。来自这个库的目的化合物命中可作为96孔平板模式、在100％DMSO 中增溶并贮存在-80℃下的10mM母液获得。将单个库目的化合物在 100％DMSO(Sigma；目录号D2650)中进一步稀释至中间浓度2.5mM，同 样贮存在-80℃下直至使用。在分析当日，这些单个库的目的化合物按 1∶12.5稀释至高葡萄糖DMEM培养基中，产生在8％DMSO中的200μM工 作母液并且随后进一步按1∶80稀释至每个分析试验孔中至终浓度2.5μM化 合物和0.1％DMSO。
分化和筛选分析法：用三天进行该分化方案的步骤1，每日通过从每个 孔抽吸培养基并用新鲜等分试样(100ml)替换进行饲养。在分析的第一日， 各孔使用RPMI-1640培养基(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号： 22400)饲养，所述培养基含有2％牛白蛋白第V部分、游离脂肪酸(FAF BSA)(美国Proliant公司(Proliant Inc.)；目录号：SKU68700)、 100ng/mL激活素A(派普泰克公司(PeproTech)；目录号120-14)、 20ng/ml Wnt3a(安迪生物公司(R&D Systems)；目录号1324-WN/CF)和 8ng/ml bFGF(安迪生物公司(R&DSystems)；目录号233-FB)。在分析 的第二和第三日，各孔用相同的培养基饲养，只是Wnt3a被移除。全部孔 均按相同方式饲养和处理。
用两天进行该分化方案的步骤2。每日从每个孔抽出培养基并替换成 DMEM:F12培养基(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号11330-032)的 新鲜等分试样(100μl)进行细胞饲养，所述培养基含有2％FAF BSA、50ng/ml FGF7(派普泰克公司(PeproTech)；目录号100-19)和250nM KAAD-环 丙胺(美国Calbiochem公司(Calbiochem)；目录号239804)。全部孔均 按相同方式饲养和处理。
用四天进行该分化方案的步骤3。通过以下方式隔日饲养细胞：从每个 孔抽吸培养基并替换成高葡萄糖DMEM(英杰生命技术公司 (Invitrogen)；目录号10569)的新鲜等分试样(200μl)，所述高葡萄糖 DMEM补充有0.1％Albumax(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号： 11020-021)、0.5x胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS-X；英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号51500056)、50ng/ml FGF7、100ng/ml成头蛋白 (安迪生物公司(R&DSystems)；目录号3344-NG)、250nM KAAD-环 丙胺、2μM全反式视黄酸(RA)(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；目 录号R2625)和20ng/ml激活素A。在步骤3期间，激酶抑制剂的三倍试验 样本在第1和第3日饲养时添加至各孔。在每块平板中，总计16个对照孔 用等量0.1％DMSO而不用任何试验化合物处理。
用四天进行该分化方案的步骤4。通过以下方式隔日饲养细胞：从每个 孔抽吸培养基并替换成1高葡萄糖DMEM的新鲜等分试样(200ml)，所述高 葡萄糖DMEM补充有0.1％|Albumax、0.5x胰岛素-转铁蛋白-硒、100ng/ml 成头蛋白和1μM Alk 5抑制剂(Axxora公司；目录号ALX-270-445)。在步 骤4期间，激酶抑制剂的三倍试验样本在第1和第3日饲养时添加至各孔。 在每块平板中，总计16个对照孔用等量0.1％DMSO而不用任何试验化合物 处理。
高含量分析：在步骤4结束时，将培养基从全部孔吸出，随后用4％多 聚甲醛(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；目录号158127)在室温 下固定20分钟，所述多聚甲醛稀释于不含二价阳离子的PBS(英杰生命技 术公司(Invitrogen)；目录号14190)中，随后用PBS洗涤一次。样品孔用 0.5％Triton X-100(美国VWR公司(VWR)；目录号VW3929-2)在室温下透化20分钟，用PBS洗涤两次并且用PBS中的5％驴血清(美国Jackson ImmunoResearch公司(Jackson ImmunoResearch)；目录号017-000-121)在 室温下封闭30分钟。第一抗体(羊抗NGN3；安迪生物公司(R&D Systems)；AF3444或小鼠抗NKX6.1；爱荷华大学(Universityof Iowa)； 目录号F55A12)(对于抗NGN3，1∶300；对于抗NKX6.1，1∶500)在5％ 驴血清中稀释并且添加至每个孔在室温下保持1小时。在PBS中洗涤两次 后，将Alexa Fluor 647驴抗羊第二抗体(英杰生命技术公司(Invitrogen)； 目录号A21448)和Alexa Fluor 488驴抗小鼠第二抗体(英杰生命技术公司 (Invitrogen)；目录号A21202)按1∶100稀释(均为第二抗体)并且添加 至每个样品在室温下保持30分钟，随后是在PBS中两次洗涤。为复染细胞 核，添加4mg/ml Hoechst 33342(英杰生命技术公司(Invitrogen)；目录号 H3570)在室温下保持10分钟。平板用PBS洗涤1次并且按100μl/孔留存 PBS用于成像。
使用IN Cell Analyzer 1000(GE医疗集团生命科学部(GE Healthcare)) 进行成像，对于以Hoechst 33342和Alexa Fluor 488以及Alexa Fluor 647染 色的细胞使用51008bs二向分色镜。曝光时间优化自只用各第二抗体染色的 阳性对照孔。每孔从15个视场获取图像，以补偿生物测定和后续染色程序 中的任何细胞损失。用IN Cell DeveloperToolbox 1.7(GE医疗集团生命科学 部(GE Healthcare))软件从每个孔获得总细胞数和总NGN3或NKX6.1强 度的测量值。基于灰阶水平(基线范围100-300)和核大小确定细胞核的分裂情况。总NGN3或NKX6.1蛋白表达被记录为总强度或累积强度，该强度 定义为细胞总荧光乘以细胞面积。基于灰阶范围在200至3500之间的接受 标准来去除背景。通过将每个孔的总强度除以阳性对照的平均总强度，将总 强度数据进行归一化。
在表8中显示这些研究的结果。与对照处理相比，两种化合物 (Kenpaullon和BML-259)没有证实(且并非没有)对NGN3或NKX6.1表 达的增强作用。本分析中的其余化合物显示出对于一种或两种转录因子的正 影响，证实了可较早得到结果并且凸显这些相关信号传导途径的重要性。
表5：
表6：
| 排序 | NKX6.1排序 | NGN3排序 |
| 1 | H-9 | H-9 |
| 2 | LY 294002 | 金丝桃素 |
| 3 | H-89 | LY 294002 |
| 4 | SB-203580 | H-89 |
| 5 | 酪氨酸磷酸化抑制剂25 | PP2 |
| 6 | GF 109203X | SB-203580 |
| 7 | PP2 | 酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1478 |
| 8 | HA-1004 | GW 5074 |
| 9 | 渥曼青霉素 | 渥曼青霉素 |
| 10 | GW 5074 | HA-1004 |
| 11 | Kenpaullone | GF 109203X |
| 12 | ML-7 | PP1 |
| 13 | 酪氨酸磷酸化抑制剂46 | SB-202190 |
| 14 | 酪氨酸磷酸化抑制剂AG 1478 | Y-27632 |
| 15 | HNMPA | Kenpaullone |
| 16 | AG-490 | HNMPA |
表7：
表8：
在整篇文档中引用的出版物据此全文以引用方式并入。尽管上文已结 合实例和优选实施例描述了本发明的各个方面，但应当理解本发明的范围不 受上述具体实施方式的限定，而受以下在专利法原则下恰当理解的权利要求 书的限定。
Claims (2)
1.一种使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6.1的表达增加的方法，其包括以下步骤：
a) 培养多能干细胞，
b) 使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c) 使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，以选自H-9、H-89、GF109203X、HA-1004、PP2、PP1、SB-203580、SB-202190、酪氨酸磷酸化抑制剂25、酪氨酸磷酸化抑制剂AG1478、酪氨酸磷酸化抑制剂46、GW5074、HNMPA和AG490的化合物补充用来使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的培养基，以及
d) 使表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞，
其中相对于不用所述化合物处理的对照而言，使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6.1的表达增加。
2.一种使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6.1的表达增加的方法，其包括以下步骤：
a) 培养多能干细胞，
b) 使所述多能干细胞分化成表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞，
c) 使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞，以选自LY294002和渥曼青霉素的化合物补充用来使所述表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞分化的培养基，以及
d) 使表达胰内胚层谱系特征性标志物的细胞分化成表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞，
其中相对于不用所述化合物处理的对照而言，使表达胰内分泌谱系特征性标志物的细胞群体中NGN3和NKX6.1的表达增加。
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